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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberDE60224684 T2
Publication typeGrant
Application numberDE2002624684
PCT numberPCT/GB2002/004019
Publication date8 Jan 2009
Filing date5 Sep 2002
Priority date7 Sep 2001
Also published asCA2459666A1, DE60224684D1, EP1423680A1, EP1423680B1, US7585624, US20050014171, US20100032568, WO2003023376A1
Publication number02624684, 2002624684, DE 60224684 T2, DE 60224684T2, DE-T2-60224684, DE02624684, DE2002624684, DE60224684 T2, DE60224684T2, PCT/2002/4019, PCT/GB/2/004019, PCT/GB/2/04019, PCT/GB/2002/004019, PCT/GB/2002/04019, PCT/GB2/004019, PCT/GB2/04019, PCT/GB2002/004019, PCT/GB2002/04019, PCT/GB2002004019, PCT/GB200204019, PCT/GB2004019, PCT/GB204019
InventorsGeorge William Fraser, John Seymour Heslop-Harrison, Andrew David Holland, Gertrude Maria Schwarzacher
ApplicantUniversity Of Leicester
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: DPMA, Espacenet
Energiemessung von photonen von biologischen assays Measurement of photon energy of biological assays translated from German
DE 60224684 T2
Abstract  available in
Claims(20)  translated from German
  1. Anwendung eines supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektors zum Nachweis von Photonen in einem Bioassay, wobei Licht von dem Assay mit einem Lichtleiter zu dem Detektor übertragen wird. Application of a superconducting cryogenic photon detector for detection of photons in a bioassay, wherein light is provided by the assay with a light guide to the detector.
  2. Anwendung nach Anspruch 1, wobei der supraleitende Tieftemperatur-Photonendetektor ein supraleitender Tunnelübergang (STJ) ist. Use according to claim 1, wherein the superconducting cryogenic photon detector is a superconducting tunnel junction (STJ).
  3. Anwendung nach Anspruch 1, wobei der Detektor Fluoreszenz nachweist und das Licht Fluoreszenzlicht ist. Use according to claim 1, wherein the detector detects fluorescence and the light is fluorescent light.
  4. Anwendung nach Anspruch 3, wobei das Bioassay Chemilumineszenz beinhaltet. Use according to claim 3, wherein said bioassay comprises chemiluminescence.
  5. Anwendung nach Anspruch 3, wobei die Fluoreszenz Röntgenfluoreszenz ist. Use according to claim 3, wherein the fluorescence is X-ray fluorescence.
  6. Anwendung nach Anspruch 1, wobei der Detektor stimulierte Emission nachweist. Use according to claim 1, wherein the detector detects stimulated emission.
  7. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Photonen von einem Marker herrühren. Use according to one of the preceding claims, wherein said photon originating from a marker.
  8. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Photonen über ein Spektrum erfaßt werden. Use according to one of the preceding claims, wherein the photons are detected across a spectrum.
  9. Anwendung nach Anspruch 8, wobei Fluoreszenz von Ultraviolett bis Infrarot erfaßt wird. Use according to claim 8, wherein fluorescence is detected from ultraviolet to infrared.
  10. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bioassay Hybridisierung beinhaltet. Use according to one of the preceding claims, wherein the hybridization involves bioassay.
  11. Anwendung nach Anspruch 10, wobei die Hybridisierung zwischen einem immobilisierten Nukleinsäure-Bindungspartner und einer markierten Sonde erfolgt. Use according to claim 10, wherein the hybridization between an immobilized nucleic acid binding partner and a labeled probe is carried out.
  12. Anwendung nach Anspruch 1, wobei der Detektor die Lichtextinktion erfaßt. Use according to claim 1, wherein the detector detects light absorbance.
  13. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Detektor ein einziges Element aufweist. Use according to one of the preceding claims, wherein the detector comprises a single element.
  14. Anwendung nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Detektor aus zwei oder mehreren Detektorelementen besteht. Use according to any one of claims 1 to 12, wherein the detector consists of two or more detector elements.
  15. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche mit Nachweis von mehreren Fluoreszenzfarben oder mehreren Absorptionsfarben der Probe. Use according to one of the preceding claims with detection of multiple colors of fluorescence or multiple colors of absorption of the sample.
  16. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche mit Nachweis einer Änderung zwischen der ungebundenen Sonde und der gebundenen Sonde, die von einer Änderung der Konformation oder der lokalen Umgebung bei der Bindung der Sonde an das Target herrührt. Use according to one of the preceding claims with the detection of a change between unbound probe and bound probe arising from a change in conformation or local environment on binding of probe to the target.
  17. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei am warmen Ende des Lichtleiters ein Eichsignal erzeugt wird. Use according to one of the preceding claims, wherein at the warm end of the light guide, a calibration signal is generated.
  18. Anwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mit einem vernetzten Lichtleiter von mehr als einem Bioassay oder diagnostischen Assay Licht zu dem Tieftemperaturdetektor übertragen wird. Use according to any preceding claim, wherein transmitted light with a crosslinked fibers of more than a bioassay or diagnostic assay light to the cryogenic detector.
  19. Bioimaging-Verfahren, das den Nachweis von Photonen mit einem supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektor zur Erfassung von Photonendaten umfasst, wobei Licht von einem Bioassay mit einem Lichtleiter zu dem Detektor übertragen wird, und die Auswertung der Daten aufweist. Bio-imaging method which comprises the detection of photons having a superconducting cryogenic photon detector for detecting photon data, wherein light is transmitted by a bioassay with a light guide to the detector, and the evaluation of the data has.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Verfahren zum quantitativen Bioimaging von mehreren Fluoreszenzfarbstoffen bzw. Fluorochromen dient und den Nachweis von Fluoreszenz aufweist. The method of claim 19, wherein the method for quantitatively Bioimaging serves several fluorescent dyes or fluorochromes, and comprises the detection of fluorescence.
Description  translated from German
  • [0001] [0001]
    Die Erfindung betrifft den Nachweis der Energie von Photonen aus biologischen Assays, einschließlich derjenigen, die charakteristische Transmissions-, Reflexions- und Absorptionsspektren verursachen. The invention relates to the detection of the energy of photons from biological assays, including those that cause the characteristic transmission, reflection and absorption spectra. Besonders, aber nicht ausschließlich, betrifft die vorliegende Erfindung den Nachweis von Fluoreszenz, und speziell den Nachweis von fluoreszenzmarkierten biologischen Proben. Particularly, but not exclusively, the present invention relates to the detection of fluorescence, and especially the detection of fluorescence-labeled biological samples. In einem wichtigen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung den Nachweis von Fluoreszenz in Nucleinsäurehybridisierungs-Chips. In an important aspect, the present invention relates to the detection of fluorescence in nucleic acid hybridization chips.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG BACKGROUND OF THE INVENTION
  • [0002] [0002]
    Die Abbildung der Hybridisierung von Nucleinsäuresonden einschließlich Sonden an Nucleinsäuretargets, zu denen DNA-Targets gehören, ist eine Schlüsseltechnologie der modernen Biologie, welche die Grundlage von molekularen, genomischen und Nucleinsaure/DNA-Diagnoseverfabren bildet. The mapping of the hybridization of nucleic acid probes, including probes to nucleic acid targets, which include DNA targets, is a key technology of modern biology, which forms the basis of molecular, genomic nucleic acid and / DNA Diagnoseverfabren.
  • [0003] [0003]
    Die radioaktive Markierung ist eine Option, wie z. B. für die Membranhybridisierung, aber die Gewinnung von quantitativen Ergebnissen und die Unterscheidung zwischen mehreren Markierungen ist schwierig. Radiolabelling is one option, such as. For example, membrane hybridisation, but the extraction of quantitative results and to distinguish between a plurality of marks is difficult. Fluorochromverfahren bieten Vorteile, besonders bei Systemen mit Anwendung optischer Linsen, zu denen Mikroarrays, Mikroskope und Durchflußzytometer gehören. Fluorochromverfahren offer advantages especially for systems with application of optical lenses, including microarrays, microscopes and flow cytometers are. In der Biologie sind verschiedene Technologien für den Fluoreszenz-Wellenlängennachweis angewandt worden, zu denen dichroitische Emissionsbandfilter, Emissionsprismensysteme, Gitterverfahren und Raman-Spektroskopie gehören. In biology, various technologies have been applied for the fluorescence wavelength detection, including dichroic emission band filters, emission prism systems, grating methods and Raman spectroscopy include. Zumindest die ersten drei sind auf Mikroarray-Auslesesysteme angewandt worden. At least the first three have been applied to microarray readout systems.
  • [0004] [0004]
    Zur Erläuterung wird auf For explanation on US 5784162 US 5784162 verwiesen, die spektrale Bio-Imaging-Verfahren (bildgebende Verfahren in der Biologie) für biologische Forschung, medizinische Diagnostik und Therapie beschreibt. referenced, the spectral bio-imaging method (imaging methods in biology) for biological research, medical diagnostics and therapy describes. Das System besteht aus einer Anregungslichtquelle, einem mit zwei oder mehr Fluorochromen markierten biologischen Target (das ein Mikroarray sein könnte); The system consists of an excitation light source, having two or more fluorochromes labeled biological target (which could be a microarray); einer Sammeloptik; collection optics; einem Interferometer; an interferometer; einer Austrittsoptik und einer zweidimensionalen Anordnung von Detektorsystemen. an exit optics and a two-dimensional array of detector systems. Für ein Mikroarray-Experiment mit zwei Fluorochromen mit Emissionsmaxima bei den Wellenlängen L 1 und L 2 und charakteristischen Anregungs- und Emissionsspektren kann das Ergebnis des Experiments zum Beispiel ein Intensitätsunterschied sein; For a microarray experiment with two fluorochromes, with emission maxima at wavelengths of L 1 and L 2 and characteristic excitation and emission spectra, the result of the experiment, for example, may be a intensity difference; D = I(L 1 ) – I(L 2 ) D = I (L 1) - I (L 2)
  • [0005] [0005]
    Die Spektrometerelemente können so angeordnet werden, daß das in jedem Pixel ankommende Signal des Ausgangsdetektors proportional zu der von einem gegebenen Punkt in der Probe emittierten (optischen) Intensitätsdifferenz D ist. The spectrometer elements can be arranged so that the incoming signal in each pixel of the output detector is proportional to the light emitted from a given point in the sample (optical) intensity difference D. Die D-Intensitätsskala wird dann zur Wiedergabe auf eine Falschfarbenskala abgebildet, so daß zum Beispiel ein Punkt, für den I(L 1 ) >> I(L 2 ) ist, rot erscheint, und so weiter. The D-intensity scale is then ready for playback on a false color scale, so that, for example, a point for which I (L 1) >> I (L 2), appears red, and so on. Das System ist auf die Verwendung des Interferometers angewiesen, um Linearkombinationen von Intensitäten zu konstruieren, die bei bestimmten Wellenlängen emittiert werden. The system relies on using the interferometer to construct linear combinations of intensities emitted at specific wavelengths.
  • [0006] [0006]
    US 5994694 US 5994694 offenbart die Verwendung von Tieftemperaturdetektoren bei der Messung der Masse von großen Spezies. discloses the use of cryogenic detectors for the measurement of the mass of large species. US 5784162 US 5784162 offenbart spektrale Bio-Imaging-Verfahren für biologische Forschung, medizinische Diagnostik und Therapie. reveals spectral bio-imaging method for biological research, medical diagnostics and therapy. US 6211519 US 6211519 betrifft einen Supraleitungsübergangssensor mit elektrothermischer Rückkopplungsschaltung. relates to a superconducting transition with sensor electrothermal feedback circuit. Rande et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A370 (1996), 85–87, offenbaren den Nachweis von Photonen unter Anwendung supraleitender Tunnelübergangsdetektoren. Edge et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A370 (1996), 85-87, disclose the detection of photons using superconducting tunnel junction detectors. GB 2315131 GB 2315131 und and US 4922092 US 4922092 lehren die Anwendung ladungsgekoppelter Bauelemente (CCDs) beim Nachweis von Fluoreszenz. teach the use of charge-coupled devices (CCDs) in the detection of fluorescence.
  • [0007] [0007]
    Die vorliegende Erfindung bietet eine Neuentwicklung bei Nachweissystemen für biologische Assays. The present invention provides a new development in detection systems for biological assays.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG SUMMARY OF THE INVENTION
  • [0008] [0008]
    Gemäß der vorliegenden Erfindung verwenden wir einen supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektor in einem biologischen bzw. Bioassay, wobei Licht von dem Assay mit einem Lichtleiter zu dem Detektor übertragen wird. According to the present invention we use a superconducting cryogenic photon detector in a biological or bioassay, wherein light is provided by the assay with a light guide to the detector. Ein supraleitender Tieftemperatur-Photonendetektor arbeitet bei einer Temperatur, wo das Photoneneinfangelement nahe bei oder unterhalb der Temperatur arbeitet, bei der es supraleitende Eigenschaften aufweist. A superconducting cryogenic photon detector operates at a temperature where the Photoneneinfangelement operates near or below the temperature at which it exhibits superconducting properties. Ein solcher Detektor kann die Energie von Photonen von Bioassays erfassen, besonders von denjenigen, die Fluoreszenzänderungen verursachen. Such a detector can detect the energy of photons of bioassays, particularly from those that cause changes in fluorescence.
  • [0009] [0009]
    Die Erfindung ist nicht auf Fluoreszenz beschränkt, und supraleitende Tieftemperatur-Photonendetektoren können allgemeiner in Bioassays genutzt werden, die charakteristische Transmissions-, Reflexions- und Absorptionsspektren hervorrufen. The invention is not limited to fluorescence, and superconducting cryogenic photon detectors can be used more generally in bioassays, causing characteristic transmission, reflection and absorption spectra.
  • [0010] [0010]
    Ein supraleitender Tieftemperatur-Photonendetektor arbeitet bei einer Temperatur unter 1 K und kann optische Photonen zählen und ihre Energie auflösen. A superconducting cryogenic photon detector operating at a temperature below 1 K and can include optical photons and resolve their energy. Derartige Tieftemperatur-Photonendetektoren sind für die Anwendung in der Astronomie bekannt. Such cryogenic photon detectors are known for use in astronomy. Es wird zum Beispiel auf N. Rando et al., Experimental Astronomy 10 (4) (200) 499–517 verwiesen. It is, for example, to N. Rando et al., Experimental Astronomy 10 (4) (200) referenced 499-517. Wie nutzen jetzt einen solchen supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektor, um jedes Photon von einer Fluorochrom- oder anderen Quelle zu markieren, typischerweise durch Protokollieren der Ankunftszeit, der Energie sowie der x- und y-Koordinaten. As now use such a superconducting cryogenic photon detector to tag each photon from a fluorochrome to or other source, typically by logging time of arrival, energy, as well as the x and y coordinates.
  • [0011] [0011]
    Die Erfindung bietet hohe Empfindlichkeit und genaue Quantifizierung für Bio-Imaging, besonders für die parallele Registrierung der Fluoreszenz von mehreren unterschiedlichen Sonden in Hybridisierungsassays, wie sie zum Beispiel bei Genchips oder -arrays auftritt, sowie für Membranhybridisierung, Gewebe und Zellen. The invention provides high sensitivity and accurate quantification for bio-imaging, particularly for the parallel registration of the fluorescence of several different probes in hybridization assays, as occurs for example in gene chips or arrays, as well as for membrane hybridization, tissues and cells.
  • [0012] [0012]
    Ein erfindungsgemäßes biologisches bzw. Bioassay erfordert typischerweise eine spezifische Bindung eines Analyten an einen Bindungspartner und den Nachweis von Photonen, die das Bindungsereignis anzeigen. An inventive biological or bioassay typically requires a specific binding of an analyte to a binding partner and the detection of photons, indicating the binding event. Einer der Bindungspartner kann durch Bindung an einen Träger immobilisiert werden. One of the binding partners can be immobilized by binding to a carrier. Einer der Bindungspartner kann mit einem Fluorochrom oder einem anderen Photonenemitter markiert werden. One of the binding partners can be labeled with a fluorochrome or another photon emitters.
  • DETAILS DER ERFINDUNG DETAILS OF THE INVENTION
  • [0013] [0013]
    Die Zählung optischer Photonen mit supraleitenden Tunnelübergängen (STJ) wurde zuerst von A. Peacock et al., Nature 381 (1996) 135, beschrieben. The count optical photons with superconducting tunnel junctions (STJ) was first described by A. Peacock et al., Nature 381 (1996) 135 will be described. Der gegenwärtige Stand der Technik (6 × 6-Matrix von Tantal-Bauelementen) wird in der Arbeit von Rando et al., Experimental Astronomy 10(4) (200) 499–517, angegeben. The current state of the art (6 × 6 matrix of tantalum devices) is in the work by Rando et al., Experimental Astronomy 10 (4) (200) 499-517 indicated.
  • [0014] [0014]
    Die letzte Figur dieser Arbeit veranschaulicht die mögliche Leistungsverbesserung beim Übergang zu Systemen auf Hafnium- oder Molybdänbasis. The last figure of this work illustrates the potential performance improvement in the transition to systems hafnium or molybdenum base.
  • [0015] [0015]
    Supraleitende Tunnelübergänge sind nicht die einzige Art supraleitender Tieftemperatur-Photonendetektoren, die wir für eine gegebene Wellenlängenauflösung im optischen Bereich verwenden können. Superconducting tunnel junctions are not the only type of superconducting cryogenic photon detectors, which we can use in the optical range for a given wavelength resolution. Ein weiterer Anwärter ist der Übergangskantensensor (TES), dessen Anwendung im optischen Bereich von B. Cabrera et al., Applied Physics Letters 73 (6) (1998) 735, beschrieben wird. Another candidate is the Transition Edge Sensor (TES), whose application in the optical domain by B. Cabrera et al., Applied Physics Letters 73 (6) (1998) 735, will be described.
  • [0016] [0016]
    Gemäß der vorliegenden Erfindung arbeitet ein supraleitender Tieftemperatur-Photonendetektor, der auf herkömmlichen Metallsupraleitern basiert, geeigneterweise bei einer Temperatur, die typischerweise unter 1 K liegt, gewöhnlich unter 500 mK, und möglicherweise unter 300 mK oder 100 mK oder sogar 10 mK. According to the present invention operates, a superconducting cryogenic photon detector based on conventional metal superconductors suitably carried out at a temperature which is typically below 1 K, usually below 500 mK, and possibly 300 mK or 100 mK or even 10 mK.
  • [0017] [0017]
    Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Fluoreszenzlicht mit einem Lichtleiter zu dem supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektor übertragen. According to the present invention, fluorescent light is transmitted with a light conductor to the superconducting cryogenic photon detector. Der Lichtleiter ist wärmer als der Kryostat, mit einer Effektivtemperatur am warmen Ende von ungefähr 293 K. Der Lichtleiter ist dadurch ein schwarzer Körper bzw. Hohlraumstrahler mit einer präzisen Spektralform, die ein Eichsignal liefert. The optical fiber is warmer than the cryostat, with an effective temperature at the warm end of about 293 K. The optical fiber is thereby a black body radiator or cavity with a precise spectral form that provides a calibration signal. Das System ist folglich selbsteichend. The system is thus self-calibrating.
  • [0018] [0018]
    Grobe Berechnungen lassen darauf schließen, daß einer supraleitende Tieftemperatur-Tunnelübergangsdetektor (STJ-Detektor) annähernd 150 bis 200 mal empfindlicher ist als ein existierender optischer photonenzählender (aber nicht energieauflösender) Detektor mit Verwendung einer Durchstrahlungsphotokathode, wie z. B. der Multialkali-Antimond S20-Kathode. Rough calculations make it likely that a superconducting cryogenic tunnel junction detector (STJ detector) is approximately 150 to 200 times more sensitive than an existing optical photon counting (but not energy-resolving) detector using a radiographic photocathode such. As the multi-alkali Anti Moon S20 cathode.
  • [0019] [0019]
    Derzeitige STJ-Detektoren auf Tantalbasis bieten Auflösungsvermögen λ/δλ von etwa 10 im optischen Bereich. Current STJ detectors tantalum-based offer resolution of λ / δλ of about 10 in the optical domain. Dies würde die gleichzeitige Abbildung von etwa 3 oder 4 Fluorochromen ermöglichen, vorausgesetzt, daß sie sorgfältig so ausgewählt werden, daß sie eine maximale spektrale Trennung aufweisen. This would allow the simultaneous imaging of about 3 or 4 fluorochromes, provided that they are carefully selected so that they have maximum spectral separation. Verbesserte Datenanalyse, Ereignisunterscheidung und besonders Bauelemente der nächsten Generation, die (zum Beispiel) auf dem Supraleiter Hafnium basieren, könnten Auflösungsvermögen λ/δλ in der Größenordnung von 50 und eine daraus folgende Zunahme der Fluorochrome von 3 oder 4 auf etwa 10 bis 15 oder mehr liefern. Improved data analysis, event discrimination and particularly next generation devices which (for example) based on the superconductor hafnium, resolving power could λ / δλ of the order of 50 and a consequent increase in fluorochromes from 3 or 4 to about 10 to 15 or more . provide
  • [0020] [0020]
    Daher ermöglichen supraleitende Tieftemperatur-Photonendetektoren die gleichzeitige Auflösung mehrerer verschiedener Fluorochrome oder anderer Fluoreszenzquellen, so daß in kürzerer Zeit mehr Informationen gewonnen werden können. Therefore superconducting cryogenic photon detectors allow the simultaneous resolution of several different fluorochromes or other fluorescent sources, so that in less time, more information can be obtained. Die verschiedenen Fluorochrome können durch eines oder mehrere der folgenden Mittel voneinander unterschieden werden: (a) das Anregungsspektrum, (b) das Emissionsspektrum, (c) die Zeit zwischen Anregung und Emission. The different fluorochromes can be prepared by one or more of the following agents are distinguished from one another: (a) excitation spectrum, (b) emission spectrum, (c) the time between excitation and emission. Die Anwendung der Zeitauflösung (des zeitlichen Abstands zwischen Anregung und Emission) als Methode zur Unterscheidung von Fluorochromen und als Methode zur Unterscheidung der Probenfluoreszenz von der Substrat- oder endogenen (umgangssprachlich als "Hintergrund" bezeichneten) Fluoreszenz/Lumineszenz eignet sich besonders für die Auflösung multipler Fluorochrome. The application of the time resolution (the interval between excitation and emission) as a method for distinguishing fluorochromes and as a method for distinguishing the sample fluorescence of the substrate or endogenous (colloquially known as "background" hereinafter) fluorescence / luminescence is multiple especially for the resolution fluorochromes.
  • [0021] [0021]
    Es gibt viele bekannte Fluorochrome, die gegenwärtig wegen eines zu kleinen Abstands zwischen Anregungswellenlänge und Emissionswellenlänge (Stokes-Verschiebung) oder wegen zu niedriger Fluoreszenzausbeute (dh niedrigem Helligkeitsgrad) oder dem Schmalbandcharakter von Fluorochromen nicht routinemäßig verwendet werden, aber dies sind für die neuen Detektorfähigkeiten keine Probleme. There are many known fluorochromes present because of small distance between the excitation wavelength and emission wavelength (Stokes shift) or due to low fluorescence yield (ie, low brightness level) or the narrowband nature of fluorochromes are not routinely used, but these are for the new detector capabilities do not problems. Daher verwendet die vorliegende Erfindung nach einem Aspekt mehrere Fluorochrome, die für herkömmliche Detektionssysteme ungeeignet sind, die zum Beispiel Photomultiplier (PMT) und Bildverstärker nutzen, die aber für Tieftemperatur-Detektion geeignet sind. Therefore, the present invention employs in one aspect a plurality of fluorochromes unsuited for conventional detection systems using for example photomultiplier (PMT) and image intensifiers but which are suited for cryogenic detection.
  • [0022] [0022]
    Die Zeitauflösung (zeitgesteuerte Detektion) der Fluoreszenz ist ein sehr wichtiges Merkmal, um den Hintergrund zu minimieren und eine Auswahl bei Substraten, Aufbereitungs- und Hybridisierungsverfahren zu ermöglichen. The time resolution (time-triggered detection) of the fluorescence is a very important feature, in order to minimize background and allow choice in substrates, preparation and hybridisation methods. Ebenso wie Anregungs- und Emissionswellenlängen weist jedes fluoreszierende Molekül eine charakteristische Zeit zwischen Anregung und Emission auf, und diese könnte genutzt werden, um weitere Fluorochrome aufzulösen. As well as excitation and emission wavelengths, each fluorescent molecule has a characteristic time between excitation and emission, and these could be used to dissolve more fluorochromes. Der größte Teil der (Eigen-)Fluoreszenz von Substraten und Proben weist eine Zeitverzögerung auf, die sich von den Proben-Fluorochromen unterscheidet, und diese kann ausgesteuert werden. Most of the (self-) fluorescent substrates and sample has a time delay, which is different from the sample fluorochromes, and this can be controlled. Die Zeitauflösung vereinfacht auch Filter im Lichtweg, da kein reflektiertes Lichtsignal von der Probe in den Detektorweg gelangt. The time resolution also simplifies filter in the light path, since no reflected light signal from the sample enters the detector path. Die Zeiten variieren in der Größenordnung von ps (Pikosekunden) bis zu einigen hundert ns, typischerweise von 10 bis 100 ns. The times vary in the order of ps (picoseconds) to a few hundred ns, typically from 10 to 100 ns. Relativ große Bandbreiten von Signalen können bewältigt werden; Relatively large bandwidth signals can be handled; gegenwärtige Kameras sind mit 12 Bit ausgelegt, obwohl es selten notwendig ist, mehr als 8 Bit zu nutzen. current cameras are designed with 12 bit, although it is seldom necessary to use more than 8 bits. Unterschiedliche Fluorochrome auf einem Objektträger können jedoch in der Helligkeit über einen 14-Bit-Bereich variieren, und dann wird ein geeigneter Detektor benötigt. However, different fluorochromes on one slide may vary in brightness over a 14 bit range, and then a suitable detector is needed.
  • [0023] [0023]
    Fluorochrome sind gegenwärtig so konstruiert, daß sie eine hohe Helligkeit (Fluoreszenzausbeute), große Stokes-Verschiebung (Wellenlängenabstand zwischen Anregung und Emission), Anregung bei Quecksilberlampen- und Laser-Hauptwellenlängen und hohe Stabilität unter Beleuchtung aufweisen. Fluorochromes are currently designed such that they have a high brightness (yield fluorescence), large Stokes-shift (wavelength gap between excitation and emission), excitation at major Quecksilberlampen- and laser wavelengths, and high stability under illumination. Bei unserer Technologie können sich diese Überlegungen ändern. With our technology, these thoughts can change. Bei Photonenzählung spielt die Helligkeit unter Umständen keine Rolle, die Zeitauflösung kann bedeuten, daß kleine Verschiebungen nutzbar sind, und es kann hilfreich sein, eine ganze Familie von Fluorochromen mit einer einzigen Anregungsquelle zu konstruieren, gleichgültig ob ein Laser oder eine Lampe mit oder ohne eingebaute Filter verwendet wird. In photon counting the brightness plays may not matter, the time resolution can mean that small shifts are available, and it may be helpful to have a whole family of fluorochromes with a single excitation source to construct, whether a laser or a lamp with or without built-in filter is used.
  • [0024] [0024]
    Tieftemperaturdetektoren ermöglichen eine hochempfindliche, quantitative Analyse der Informationen von Genchips bzw. -arrays oder anderen Hybridisierungssystemen, auf eine Weise, die eine ganze Menge mehr Informationen analysiert, als dies gegenwärtig zu irgendeinem gegebenen Zeitpunkt möglich ist. Cryogenic detectors enable highly sensitive, quantitative analysis of information from gene chips and arrays or other hybridization systems in a way that analyzes a whole lot more information than is presently at any given time is possible. Wir stellen uns die Verwendung von mehr als einem Fluorochrom vor, vielleicht von mindestens 3, 4 oder 5, vorzugsweise mindestens 10, und stärker bevorzugt mindestens 15 verschiedenen Fluorochromen. We ask the use of more than one fluorochrome before, perhaps at least 3, 4 or 5, preferably at least 10, and more preferably at least 15 different fluorochromes.
  • [0025] [0025]
    Beispiele bestimmter Fluorochrome, die verwendet werden könnten, sind unter anderem die Cyaninfarbstoffe (zum Beispiel Cy3, Cy3.5, Cy5 von der Amersham Company, obwohl Cyanin eine generische Gruppe von Fluorophoren etwa aus den 1950er Jahren ist), die Alexa-Reihe von Farbstoffen von der Molecular Probes Company, oder die Spectrum-Farbstoffe von der Vysis Company. Examples of certain fluorochromes that might be employed include the cyanine dyes (for example Cy3, Cy3.5, Cy5 by the Amersham Company, although cyanine is a generic group of fluorophores from around the 1950s), the Alexa series of dyes from Molecular Probes company, or the Spectrum dyes from Vysis company. Weitere, ältere Fluorochrome sind unter anderem Texas Red und Fluorescein. Further, older fluorochromes include fluorescein and Texas Red.
  • [0026] [0026]
    Die Fluorochrommoleküle sind typischerweise in einer zu einem Nucleotid (DNA-Komponente) konjugierten Form im Handel erhältlich und werden unter Verwendung von Enzymen in die Sonden-DNA eingebaut. The fluorochrome molecules are typically available in a nucleotide (DNA component) conjugated form commercially and are built using enzymes in the probe DNA. Einige nichtenzymatische Verfahren sind gleichfalls für den Einbau verfügbar und besonders für diagnostische Anwendungen kann die markierte Sonde verwendet werden. Some non-enzymatic methods are also available for the installation, and especially for diagnostic applications, the labeled probe may be used.
  • [0027] [0027]
    Abgesehen von der parallelen Registrierung der Fluoreszenz von mehreren Proben in Hybridisierungsassays (Genchips oder -arrays), eignet sich die vorliegende Erfindung für die Abbildung von entwickelten Versionen von Membran-(Southern-)Hybridisierungen und anderen Hybridisierungsverfahren. Apart from parallel registration of fluorescence from multiple samples in hybridization assays (gene chips or arrays), the present invention is suitable for imaging of developed versions of membrane (Southern) hybridisations and other hybridisation procedures. Überdies können supraleitende Tieftemperatur-Photonendetektoren zur Quantifizierung von anderen Fluoreszenzmarkern als denjenigen für die Hybridisierung von DNA-Sonden verwendet werden. Moreover, superconducting cryogenic photon detectors for the quantification of other fluorescent markers can be used as those for hybridization of DNA probes. Weitere Beispiele sind unter anderem: Further examples include:
    • 1) Moleküle, die ihre Konformation und daher Fluoreszenz verändern, wenn sie sich an das Target (z. B. DNA, Proteine, Cellulose) binden. 1) molecules that change their conformation and therefore fluorescence when at the target (eg., DNA, proteins that bind cellulose). In der DNA-Array-Situation kann die DNA-Menge auf jedem Spot unter Verwendung von Fluorochromen wie z. B. DAPI, Hoechst 33258, Paraosanilin, Chromomycin A3 oder der PoPo, BoBo, ToTo-Serie von Molecular Probes quantifiziert werden; In the DNA array situation, the amount of DNA on each spot using fluorochromes such as DAPI, Hoechst 33258, Paraosanilin, chromomycin A3, or PoPo, Bobo, TOTO series from Molecular Probes be quantified.
    • 2) Fluoreszenzindikatoren (verändern die Fluoreszenz in Gegenwart von Ionen, z. B. Wasserstoffionen zur pH-Messung, oder von Calcium); 2) fluorescent indicators (change the fluorescence in the presence of ions, such as hydrogen ions for pH measurement, or calcium).
    • 3) biologische Moleküle oder Strukturen, die selbst fluoreszieren – rote Blutkörperchen oder Chloroplasten sind Beispiele, wobei die Fluoreszenz von beiden durch Krankheit beeinflußt wird; 3) biological molecules or structures that fluoresce itself - red blood cells or chloroplasts are examples in which the fluorescence is affected by both a disease;
    • 4) Paralleltechnologien zu den DNA-Arrays unter Verwendung von Protein-Arrays und fluoreszierend markierten Antikörpern; 4) parallel technologies to the DNA arrays using protein arrays and fluorescently labeled antibodies;
    • 5) Charakterisieren von Fluoreszenzemissionsspektren von Markierungen und biologischen Molekülen; 5) Characterization of Fluorescence emission spectra of biological molecules and markers;
    • 6) Messen des Lichtabsorptionsvermögens durch biologische Moleküle und Strukturen (z. B. DNA und RNA). 6) measuring the light absorbance by biological molecules and structures (eg., DNA and RNA).
  • [0028] [0028]
    Für membrangestützes (Southern- und verwandte) Hybridisierung könnte eine Mikrotechnologie entwickelt werden, um auf einer Fläche von wenigen Quadratzentimetern zu arbeiten. For membrangestützes (Southern and related) hybridizing a micro technology could be developed to work in an area of a few square centimeters. Da Roboterladesysteme allgemein verfügbar werden, ist das Beladen von Bahnen auf einem kleinflächigen Gel wenig problematisch, und dünne Substrate und kurze Durchlaufe sind sehr vorteilhaft. Since robot loading systems are widely available, the loading of lanes on a small scale gel is very problematic, and thin substrates and short course are very beneficial. Mit der Möglichkeit von mehrfachen Fluoreszenzsonden wird das Austreiben von radioaktiven Sonden unnötig, und sogar die Hybridisierung zu DNA, die in getrockneten Gelen immobilisiert ist, ist brauchbar, oder tatsächlich eine Echtzeit-Abbildung beim Durchgang von Fluoreszenzbanden durch den Detektor, wie in ABI DNA-Sequenzierungsanlagen. With the possibility of multiple fluorescent probes the expulsion of radioactive probes becomes unnecessary, and even hybridisation to DNA immobilized in dried gels is usable, or indeed real-time imaging during the passage of fluorescence bands by the detector, as in ABI DNA sequencing facilities.
  • [0029] [0029]
    In ihrer elementarsten Form beinhaltet die vorliegende Erfindung in einem Aspekt die Bereitstellung eines Nucleinsäurebindungspartners auf einer Matrix, dessen Hybridisierung mit einer fluorochrommarkierten Sonde, anschließendes Beleuchten mit Anregungslicht (angepaßt an das Fluorochrom, das so gewählt werden kann, daß es nach Bedarf typischerweise zwischen UV und Gelb angeregt wird), und Messen des Emissionsspektrums. In its most basic form, the present invention includes in one aspect to provide a Nucleinsäurebindungspartners on a matrix whose hybridization with a fluorochrome-labeled probe, then illuminating with an excitation light (matched to the fluorochrome, which can be selected so that it and as required, typically between UV Yellow is picked up) and measuring the emission spectrum. Im wesentlichen würde dafür das System als Spektrophotometer benutzt. In essence, it would be used as a spectrophotometer system. In einer anderen Betriebsart kann eine sehr kleine Zahl von Photonen analysiert werden, die nicht ausreichen, um ein Spektrum zu liefern, deren von dem supraleitenden Tieftemperatur-Photonendetektor gelieferten Eigenschaften aber die Bestimmung der molekularen Quelle der Photonen ermöglichen. In another mode, a very small number of photons are analyzed which are not sufficient to provide a spectrum, but allow their delivered from the superconducting cryogenic photon detector to determine characteristics of the molecular source of the photons.
  • [0030] [0030]
    Für hohen Durchsatz wird gegenwärtig ein kontinuierliches System gegenüber einem chargenorientierten System bevorzugt. For high throughput currently a continuous system is compared with a batch-oriented system preferred. Für diesen Aspekt der Erfindung könnte das Substrat mit der immobilisierten DNA ein flexibler/rollfähiger Substratstreifen (wie z. B. eine Nylonmembran) von vielen Metern Länge mit auf einer oder wenigen Seiten darauf angeordneten Targets sein (und beispielsweise mit einem Strichcode entlang der Seite, um jede Probe zu kennzeichnen). For this aspect of the invention, the substrate with the immobilized DNA (such. As a nylon membrane) could be a flexible / rollable substrate strips of many meters length on one or a few pages arranged thereon targets (and for example with a barcode along the side, to mark each sample). Ein solcher Ansatz würde die Robotertechnik zum Anordnen der Proben und zum Vorbeibewegen der Oberfläche am Detektor enorm vereinfachen. Such an approach would simplify the robot technology for disposing of the samples and to move past the surface of the detector enormous. Es ist sorgfältig auf die Kompatibilität mit den Verfahren zur Herstellung synthetischer Sonden auf der Substratoberfläche zu achten (typischerweise lichtempfindliche/Photolithographieverfahren). It is carefully selected to be compatible with the process for producing synthetic probes on the substrate surface are correct (typically photosensitive / photolithography process). Noch besser wäre es, alles in Fluiden auszuführen, da die Abscheidung und Trocknung von DNA auf Substraten ein unangenehmer Prozeß mit Targetverlusten ist und fließende Lösungen über dem immobilisierten Target schwer automatisch zu steuern sind. Better yet, everything run in fluids, since the deposition and drying of DNA on substrates is an unpleasant process with target losses and flowing solutions over the immobilized target are difficult to control automatically would be. Systeme von Ventilen und Pumpen wären am leichtesten machbar: vielleicht könnten große Moleküle in einem Gel gehalten werden, während kleine Moleküle (Sonden) eindiffundiert und ausgewaschen werden könnten und die sich bildenden Hybride in einem Format zurücklassen würden, das durch Detektoren und rundumgepumpt werden kann. Systems of valves and pumps would be most easily feasible: possibly large molecules could be held in a gel, while small molecules (probes) could be diffused and washed out and the forming hybrids would leave in a format that can by detectors and be completely pumped.
  • [0031] [0031]
    Als Erläuterung einer möglichen Anwendung der vorliegenden Erfindung können Anordnungen in Form von Chips krebsspezifische Gene in einer Gruppe von Patienten identifizieren. As an illustration of a possible application of the present invention arrangements may identify a group of patients in the form of chips cancer-specific genes. Eine große Auswahl krebsspezifischer Gene werden an dem Chip fixiert, und DNA-Proben von etwa 20 Patienten auf einmal können alle zur Analyse auf einen Chip aufgebracht werden, wobei jede DNA-Probe ihr eigenes Fluorochrom aufweist, das von allen anderen unterscheidbar ist. A wide range of cancer-specific genes are fixed on the chip, and DNA samples from 20 patients at a time can all be applied to a chip for analysis, each DNA sample has its own fluorochrome that is distinguishable from all others. Alle Patienten können daher unter Verwendung des gleichen Chips gleichzeitig analysiert werden. All patients can therefore be analyzed using the same chips simultaneously. Diese Fähigkeit für Targets mit mehreren Sonden, mehrere Fluorochrome zu verwenden, ist ein bedeutender Vorteil gegenüber allem, was bereits getan wird. This ability for targets with multiple probes to use multiple fluorochromes, is a major advantage over all that is already being done.
  • [0032] [0032]
    Ferner ist eines der entscheidenden Erfordernisse für mehr Farben die Einbeziehung von Kontrollen, dh von Proben mit bekanntem Ergebnis. Furthermore, one of the key requirements for more colors is the inclusion of controls, ie. Of samples of known result Zum Beispiel könnte man, statt 20 Patienten zu prüfen, mehrere (4 bis 6) Proben von dem in Frage kommenden Tumor eines Patienten, irgendeine tumorfreie DNA von dem gleichen Patienten und dann verschiedene Typen/Stadien von Tumor-DNA von diagnostizierten Fällen einbeziehen. For example, you could, instead of 20 patients to consider several (4 to 6) samples of the candidate tumor of a patient, any tumor-free DNA from the same patient and then include various types / stages of tumor DNA of diagnosed cases. Mit mehr Farben können dann zusätzliche reale Proben hinzugefühgt werden, wodurch die Kontrollen effizienter genutzt werden. With more colors then additional real samples can be hinzugefühgt which make checks are used more efficiently.
  • [0033] [0033]
    In einer Ausführungsform beinhaltet die vorliegende Erfindung ein System zur Abbildung von Fluoreszenz von der Hybridisierung mehrfacher DNA-Sonden auf einem Mikroskop-Objektträger, in typischerweise 10 nm breiten Kanälen quer über die sichtbaren Wellenlängen, die Wellenlängen im nahen Infrarot und im nahen Ultraviolett, in einem pixelbasierten System mit hoher Geschwindigkeit, Zeitauflösung und Pixelgrößen bis hinab zu etwa 10 μm (Mikrometer) im Quadrat oder weniger. In one embodiment, the present invention involves a system to image fluorescence from hybridisation of multiple DNA probes on a microscope slide, in typically 10 nm wide channels across the visible wavelengths, the wavelengths in the near infrared and in the near ultraviolet, in a pixel-based system with high speed, time resolution and pixel sizes down to about 10 microns (micrometers) square or less. Die für die Abtastung erforderliche Größe könnte eine Fläche von 22 mm × 44 mm auf einem 1 Zoll × 3 Zoll großen Standard-Mikroskopobjektträgerformat sein. The time required for the sample size could be an area of 22 mm × 44 mm on a 1 inch x 3 inch standard microscope slide format. Es sind verschiedene Anregungsstrategien möglich. There are several possible strategies excitation. Mehrphotonenanregung, wie z. B. Zweiphotonenanregung von Fluorochromen, wie in konfokalen Mikroskopen, ermöglicht Laserdioden. Multi-photon excitation, such. As two-photon excitation of fluorochromes, such as in confocal microscopes allow laser diodes. In einem typischen Chip kann der Detektor statisch sein und mit dem Licht von Probenzellen zeilenweise auf einen linearen Chip von supraleitenden Tunnelübergängen gerastert werden. In a typical chip, the detector can be static and line by line scanned with the light of sample cells to a linear chip superconducting tunnel junctions. In einem typischen Chip führt zu jedem Element der Matrix im wesentlichen ihr eigener Lichtleiter, und der Chip kann eindimensional (linear) oder zweidimensional (planar) sein. In a typical chip leading to each element of the matrix essentially its own fiber optic cable, and the chip can be one-dimensional (linear) or two-dimensional (planar). Lichtleiter von defekten Matrixelementen ('Pixeln') können weggelassen werden. Light guide of defective matrix elements ('pixels') can be omitted. Alternativ kann es möglich sein, das gesamte Bild auf eine Matrix zu fokussieren (wie in einer herkömmlichen Kamera). Alternatively, it may be possible to focus the whole image onto an array (as in a conventional camera). Die Lichtleitkabel können in großen Abständen vom Lesegerät angeordnet sein und sind nicht darauf beschränkt, von einem einzigen Gerät auszugehen, und könnten gleichzeitig mit unterschiedlichen Gerätetypen verbunden sein und sich sogar in verschiedenen Labors oder Gebäuden befinden. The fiber optic cable can be located at large distances from the reader and are not limited to start from a single device, and may be connected simultaneously to different device types and may even be located in different laboratories or buildings.
  • [0034] [0034]
    Die Auflösung beträgt vorzugsweise mindestens 5 μm (dh 200 × 200 pro mm 2 ), wobei eine Erhöhung auf vielleicht 0,2 μm ideal ist (dh auf den theoretischen Grenzwert der Lichtmikroskopie). The resolution is preferably at least 5 microns (ie 200 × 200 per mm 2), with an increase to perhaps 0.2 microns is ideal (ie the theoretical limit of light microscopy). Um die Probe auf dem Objektträger zu finden, ist eine Abtastung mit 100 μm Auflösung und dann mit 30–40 μm zur vorläufigen Analyse erforderlich. To find the sample on the slide, a scan with 100 micron resolution and then with 30-40 microns for preliminary analysis is required. Eine Gestaltungsmöglichkeit bei einem Sensor mit linearer oder flächenhafter Anordnung ist, mit einer Matrix von 256 Elementen zu beginnen und dann eine Vergrößerung um das 8- oder 16-fache zu erwägen. A design option for a sensor with linear or areal arrangement is to start with a matrix of 256 elements and then considering an increase by 8- or 16-fold.
  • [0035] [0035]
    In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird der supraleitende Tieftemperatur-Photonendetektor auf Fluoreszenz- oder konfokale Mikroskope oder als Detektor für Fluoreszenz, Rückstreuung, Seitenstreuung und Absorptionsvermögen an einem Durchflußzytometer angewandt, das die Eigenschaften von Zellen oder Zellkomponenten in Suspension analysiert. In other embodiments of the invention, the superconducting cryogenic photon detector is applied to fluorescence or confocal microscopes, or as the detector of fluorescence, backscatter, side scatter and absorbance on a flow cytometer analyzing properties of cells or cellular components in suspension.
  • [0036] [0036]
    Das Ausgangssignal von der bildgebenden Vorrichtung ist im wesentlichen ein Spektrum, eine Wellenlänge oder ein Photonenenergie-Histogramm für jedes Pixel bei jeder Anregungswellenlänge (das sind folglich mindestens 5 Dimensionen; X und Y des Pixels, Anregungswellenlänge, Emissionswellenlänge und Zeit zwischen Anregung und Emission). The output signal from the imaging device is essentially a spectrum, wavelength, or photon energy histogram for each pixel at each excitation wavelength (which are therefore at least 5 dimensions X and Y of the pixel, excitation wavelength, emission wavelength and time between excitation and emission). Die Software kann dann den Beitrag jedes Fluorochroms berechnen. The software can then calculate the contribution of each fluorochrome.
  • [0037] [0037]
    Hierin wird ein System zur Durchführung von biologischen Tests bzw. Bioassays beschrieben, das eine Datenerfassungseinrichtung und Datenverarbeitungssoftware einschließt. Herein is a system for performing biological assays or bioassays is described which includes a data acquisition means and data processing software. Das System kann ferner eine Einrichtung zur Erzeugung einer Sichtanzeige oder eines Ausdrucks enthalten, welche die Ergebnisse des Assays anzeigen. The system may further include means for generating a visual display or an expression indicating the results of the assay.
  • [0038] [0038]
    Bei der vorliegenden Erfindung wird typischerweise ein supraleitender Tieftemperatur-Photonendetektor zum Nachweis von Fluoreszenz verwendet, wie sie etwa bei der Sondenhybridisierung unter Verwendung von Fluorochrom-Markern auftreten kann, obwohl die Erfindung nicht an Fluoreszenz gebunden ist, die von Markern herrührt, da wir auch die Erfassung des Transmissions-/Reflexions-/Autofluoreszenz-/Absorptionsspektrums in Betracht ziehen ("Farbe"). In the present invention, typically a superconducting cryogenic photon detector for detecting fluorescence is used, as may occur for example in the probe hybridisation using fluorochrome labels, though the invention is not tied to fluorescence arising from labels, since we also detection of the transmission / reflection / auto-fluorescence / absorption spectrum taking into account ("color"). Die Erfindung erstreckt sich auch auf andere stimulierte Emissionsspektren als Fluoreszenzspektren und schließt die Photonenemission von Elektronenchromophoren ein, wie z. B. denjenigen, die auf Polymeren oder Dendrimeren basieren. The invention also extends to stimulated emission spectra other than fluorescence, and includes photon emission spectra of a Elektronenchromophoren such. As those based on polymers or dendrimers. Diese Elektronenchromophore emittieren sichtbare Photonen als Reaktion auf die Zufuhr elektrischer Energie, gegenwärtig die Basis einer neuen Flachbildschirmtechnologie. This Elektronenchromophore emit visible photons in response to the supply of electric energy, currently the basis of new flat panel display technology. Fertigungsverfahren, die für diese Produkte entwickelt wurden, die auf herkömmlichen Genchips angewend werden, können Bauelemente liefern, bei denen das emittierte Licht mit der angelegten Spannung variiert und damit ein Maß der biologischen Targets liefert, mit denen der Chromophor verbunden ist. Manufacturing methods have been developed for these products, which are applicable to conventional gene chips can provide devices where the light emitted varies with applied voltage and thus provides a measure of the biological targets with which is connected to the chromophore.
  • ZEICHNUNGEN DER ERFINDUNG DRAWINGS OF THE INVENTION
  • [0039] [0039]
    In den beigefügten Zeichnungen zeigen: In the accompanying drawings:
  • [0040] [0040]
    1 1 ein Nachweissystem gemäß der vorliegenden Erfindung; a detection system according to the present invention;
  • [0041] [0041]
    2 2 Fluoreszenzemissionsspektren, die durch einen Tieftemperaturdetektor von einer Anzahl markierter Nucleotide und Fluorochrome aufgenommen wurden, die zu anderen Komponenten konjugiert waren; Fluorescence emission spectra were collected by a cryogenic detector from a number of labeled nucleotides and fluorochromes conjugated to other components;
  • [0042] [0042]
    3 3 weitere derartige Fluoreszenzemissionsspektren; Another such fluorescence emission spectra;
  • [0043] [0043]
    4 4 Fluoreszenzemissionsspektren, die von einer Papierprobe aufgenommen wurden; Fluorescence emission spectra recorded from a sample of paper;
  • [0044] [0044]
    5 5 das STJ-Impulshöhenspektrum (logarithmische Skala) eines Alexa 594 Leica I3-Filtersatzes. the STJ pulse height spectrum (logarithmic scale) of an Alexa 594 Leica I3 filter set. Gestrichelte Kurve-Gausssche Anpassung an IR-Maximum. Dashed curve-Gaussian adaptation of IR maximum. Oberes Nebenbild-Funktionsschema des supraleitenden Tunnelübergangs (STJ). Upper inset function diagram of the superconducting tunnel junction (STJ). Unteres Nebenbild-Nomaski-Mikroskopbild eines STJ-Chips von 10 × 32 Pixeln; Lower inset-Nomaski microscope image of a STJ chips of 10 × 32 pixels;
  • [0045] [0045]
    6 6 liefert übereinander gezeichnete Alexa 594 und 488-Spektren (individuelle Symbole). provides one above the other drawn Alexa 594 and 488 spectra (individual symbols). Leica I3-Filtersatz. Leica I3 filter set. Ausgezogene Kurven – Emissionsspektren des Herstellers, korrigiert für Lichtleiter-Übertragung und STJ-Quantenwirkungsgrad. Unbroken curves - emission spectra of the manufacturer, corrected for fiber optics transmission and STJ quantum efficiency. Das endliche Auflösungsvermögen des Detektors wird durch Halbwertsbreiten-Energieauflösungs-"Fehlerbalken" angezeigt; The finite resolution of the detector is shown by full-width half-Energieauflösungs- "error bars";
  • [0046] [0046]
    7 7 gibt die STJ-Impulshöheneichung an und läßt auf eine hervorragende Linearität des Detektors schließen; indicates the STJ Impulshöheneichung and suggests an excellent linearity of the detector;
  • [0047] [0047]
    8 8 liefert übereinander gezeichnete Alexa 594 und 488-Spektren. provides one above the other drawn Alexa 594 and 488 spectra. Angepaßter Omega-Filtersatz; Adapted Omega filter set;
  • [0048] [0048]
    9 9 zeigt eine Analyse eines zusammengesetzten Fluoreszenzspektrums von genetischem Material, das an drei Sonden hybridisiert wurde. shows an analysis of composite fluorescence spectrum from genetic material hybridised to three probes.
  • [0049] [0049]
    Für For 1 1 gilt der folgende Schlüssel: the following key applies:
  • 1 1
    Anregungslichtquelle Excitation light source
    2 2
    Eingangsfilter (wenn erforderlich) Input filter (if required)
    3 3
    einfallender Lichtstrahl incident light beam
    4 4
    Mikroarray auf Substrat von Standardformat Microarray substrate-standard format
    5 5
    (Nebenbild) hybridisierte DNA in einer Mikroarrayzelle; (Inset) hybridized DNA microarray in a cell; die Sondenstränge tragen (zur Erläuterung) zwei Fluorochrome the probe strands contribute (to explain) two fluorochromes
    6 6
    Fluoreszenzemission von Fluorochromen, Emissionsmaxima-Wellenlängen λ 1 und λ 2 Fluorescence emission of fluorochromes emission maxima wavelengths λ 1 and λ 2
    7 7
    Ausgangsoptik Output optics
    8 8
    wellenlängenauflösende Photonenzähldetektoranordnung wavelength resolution Photonenzähldetektoranordnung
    9 9
    Kryostat Cryostat
    10 10
    Verstärkung und Signalverarbeitung Amplification and signal processing
    11 11
    Spektralverarbeitung, Anpassung und Anzeige Spectral processing, adjustment and display
    12 12
    (Nebenbild) Intensität in Abhängigkeit vom Wellenlängenspektrum, zeigt die Auflösung von Fluorochrom-Emissionen (Inset) intensity as a function of wavelength spectrum, showing the dissolution of fluorochrome emissions
  • BEISPIELE DER ERFINDUNG EXAMPLES OF THE INVENTION
  • [0050] [0050]
    Wir übernehmen die folgende Terminologie: We accept the following terminology:
    • Träger: Das Material, an welches das Target gebunden ist Carrier: The material to which the target is bound
    • Target: nicht markierte Moleküle, die an den Träger gebunden sind Target: unlabelled molecules that are bound to the support
    • Sonde: markierte Moleküle in der Lösung, die mit dem Target hybridisieren oder daran binden. Probe: labeled molecules in the solution which hybridize with the target or bind.
  • [0051] [0051]
    Einige Forscher kehren die Definitionen von Sonde und Target um. Some researchers reverse the definitions of probe and target.
  • [0052] [0052]
    Das Target kann irgendein biologisches Molekül, DNA, RNA, ein synthetisches Oligonucleotid, Peptid oder Protein sein. The target can be any biological molecule, DNA, RNA, a synthetic oligonucleotide, peptide or protein. DNA kann cDNA (das heißt, Gene wie RNA, die enzymatisch in die DNA-Form kopiert sind), genomische DNA oder RNA, Klone in irgendeinem Vektor, wie z. B. Plasmide, Lambda, BACs oder YACs), Teilmengen der gesamten genomischen DNA sein, die von einem oder mehreren Chromosomen herrühren. DNA can be cDNA (that is, genes as RNA copied enzymatically to the DNA form), genomic DNA or RNA, clones in any vector such. As plasmids, lambda, BACs or YACs), subsets of total genomic be DNA, resulting from one or more chromosomes. RNA und DNA können von irgendeinem Organismus (Pflanzen, Tiere, Viren, Bakterien, Pilze oder irgendeiner ihrer Teilmengen) und von irgendeinem Gewebe stammen. RNA and DNA can be from any organism (plants, animals, viruses, bacteria, fungi, or any of its subsets) and derived from any tissue. Synthetische Oligonucleotide sollten mindestens 15 bp (Basenpaare) lang sein und können eine Länge bis zu 100 bp haben, basierend auf einer bekannten DNA- oder RNA-Sequenz, die statistisch verteilt ist oder in irgendeiner Position modifizierte Nucleotide aufweist. Synthetic oligonucleotides should be at least 15 bp (base pairs) long and may have a length up to 100 bp, based on a known DNA or RNA sequence, which is randomly distributed or comprises modified nucleotides at any position.
  • [0053] [0053]
    Die Sonde kann irgendeine RNA oder DNA oder ein Antikörper sein und ist zur Erkennung besonders markiert. The probe can be any RNA or DNA, or an antibody to be labeled for detection and is especially. In irgendeinem gegebenen Experiment werden vorzugsweise 3–10 oder mehr verschiedene Sonden verwendet und müssen unterschiedlich markiert werden. In any given experiment, preferably 3-10 or more different probes are used and must be labeled differently. In den meisten Fällen umfaßt die Sonde die Gesamtmenge oder eine geeignete Teilmenge der RNA oder DNA von zwei oder mehr verschiedenen Arten, Varietäten oder Populationen oder von Individuen in unterschiedlichen Umweltbedingungen, Entwicklungsstadien usw. In most cases, the probe comprises all or a suitable subset of RNA or DNA from two or more different species, varieties or populations, or individuals at different environmental conditions, developmental stages, etc.
  • [0054] [0054]
    Der Träger kann aus irgendeinem Material bestehen, an das sich das Target bindet. The carrier may be made of any material to which binds the target. Der Träger kann zweckmäßigerweise ein normaler Mikroskop-Objektträger sein, typischerweise mit Abmessungen von 76 × 26 mm. The support may conveniently be a standard microscope slide, typically having dimensions of 76 × 26 mm. Der Träger kann jedoch auch ein Chip von geeigneter Größe sein. However, the carrier can also be a chip of a suitable size. Geeignete Materialien für den Objektträger oder Chip sind Glas oder Metall. Suitable materials for the slide or chip are glass or metal. Der Träger wird gewöhnlich beschichtet oder aufgeladen, um die Bindung des Targets zu erleichtern. The carrier will usually be coated or charged in order to facilitate the binding of the target. Beispiele geeigneter Beschichtungen sind Poly-L-lysin, Aminosilane, Cellulose und andere biologische Moleküle. Examples of suitable coatings are poly-L-lysine, amino silanes, cellulose, and other biological molecules.
  • BEISPIEL 1 EXAMPLE 1
  • [0055] [0055]
    Bei vielen Krebsbiopsien müssen mehreren Biopsien eines Gewebes ausgeführt werden, um die Krebszellen zu finden. Many cancer biopsies multiple biopsies of tissue must be performed in order to find the cancer cells. Gegenwärtig wird von jeder Biopsie ein Präparat auf einem Mikroskop-Objektträger hergestellt und von qualifizierten Beobachtern untersucht, um den Zustand jeder Biopsie zu ermitteln. At present, a product is manufactured on a microscope slide and examined by skilled observers to determine the state of each biopsy of each biopsy. Mit dem Chip und der Detektortechnologie gemäß der vorliegenden Erfindung werden genetisches DNA-Material oder exprimierte RNA-Gene von jeweils etwa fünf Biopsien zusammen mit fünf Kontrollproben – von bekannten Karzinomen unterschiedlicher Stadien oder Typen, und normale Proben von unbeeinflußten Kontrollen und dem Patienten – isoliert (automatisch), mit verschiedenen Fluorochromen markiert und an den Chip hybridisiert. With the chip and detector technology of the present invention are genetic DNA material or expressed RNA genes of approximately five biopsies along with five control samples - of known cancers of different stages or types, and normal samples from unaffected controls and the patient - isolated ( automatically) labeled with different fluorochromes and hybridised to the Chip. Wenn irgendwelche Proben Anomalien aufweisen, ist dies sofort durch das unterschiedliche Verhältnis der Hybridisierung der Sonden an das unterschiedliche Target auf den Objektträgern nachweisbar. If any samples show abnormalities, this is immediately by the different ratio of hybridisation of the probes to the different target on the slides detectable. Gegenwärtige Technologien weisen eine schlechte Quantifizierung auf und können die Anzahl von Sonden nicht unterscheiden, die für eine sorgfältige Kontrolle und unterschiedliche Krebsarten erforderlich sind. Current technologies have poor quantification, and are unable to distinguish, which are required for careful control and different types of cancer, the number of probes.
  • BEISPIEL 2 EXAMPLE 2
  • [0056] [0056]
    Eine anomale Expression von fünf bis zehn Genen tritt bei vielen Erkrankungen auf. Aberrant expression of five to ten genes occurs in many diseases. DNA oder RNA von individuellen Proben wird als Target auf die Trägeroberfläche aufgebracht und dann mit fünf Gensequenzen hybridisiert, die in unterschiedlichen Farben markiert sind. DNA or RNA from individual samples is placed onto the support surface as target and then hybridised with five gene sequences labeled in different colors. Die Hybridisierung jedes Punkts auf dem Chip wird dann untersucht, und Unterschiede gegenüber der Kontrolle zeigen an, daß eine Probe anomal ist. The hybridisation of each spot on the chip is then examined and differences from the control indicate that a sample is abnormal.
  • BEISPIEL 3 EXAMPLE 3
  • [0057] [0057]
    Einige (aber nicht alle) wilden Arten, die mit Kulturpflanzen verwandt sind, z. B. Bananen, sind resistent gegen Krankheiten wie z. B. Pilzerkrankungen, aber diese unterscheiden sich sehr voneinander und von empfindlichen kommerziellen Kulturvarietäten. Some (but not all) wild species that are related to crops, eg. As bananas, are resistant to diseases such. As fungal diseases, but these are very different and sensitive commercial cultivars. Wir bringen viele Tausende von Pflanzengenen oder anderen DNA-Sequenzen auf den Chip auf und hybridisieren mit DNA oder RNA von resistenten und anfälligen Pflanzen, wobei wir 10 auf einmal verwenden, die jeweils mit einem anderen Fluorochrom markiert sind. We bring many thousands of plant genes or other DNA sequences on the chip and hybridize with DNA or RNA of resistant and susceptible plants, whereby we use 10 at a time, which are each labeled with a different fluorochrome. Falls ein Target ausschließlich mit Sonden von allen resistenten Akzessionen hybridisiert, ist es ein Resistenzkandidatengen. If a target only hybridized with probes from all accessions resistant, it is a candidate gene resistance. Diejenigen, die ausschließlich mit Sonden von wenigen resistenten Akzessionen hybridisieren, sind wahrscheinlich Gene, die eine Variabilität zwischen Akzessionen aufweisen; Those which hybridize only with probes from a few resistant accessions are probably genes which have a variability between accessions; daher ist die Verwendung mehrerer Sonden wesentlich, um derartige falsche Ergebnisse zu entfernen. Therefore, the use of multiple probes is essential to remove such false results.
  • BEISPIEL 4 EXAMPLE 4
  • [0058] [0058]
    Viele Erkrankungen rühren von der Unfähigkeit des Körpers her, eine bestimmte Chemikalie zu erzeugen, aber das Fehlen der Chemikalie kann durch den Ausfall eines Schritts in einem mehrstufigen Biosyntheseprozeß entstehen. Many diseases result from the inability of the body manufactures to produce a particular chemical, but the absence of the chemical may result from the failure of a step in a multistep biosynthetic process. Obwohl die Krankheitssymptome die gleichen sind, könnte in Abhängigkeit von dem fehlgeschlagenen Schritt eine unterschiedliche pharmazeutische Behandlung angewandt werden. Although the disease symptoms are the same, a different pharmaceutical treatment might be used depending on the failed step. DNA (oder RNA/cDNA) von Patienten, die an dem Syndrom leiden, könnte extrahiert und als Target aufgebracht werden, das dann mit Sonden für jedes der an der Biosynthese beteiligten Gene (und Kontrollgene) hybridisiert wird. DNA (or RNA / cDNA) from patients suffering from the syndrome might be extracted and placed as a target, which then with probes for each of the genes involved in the biosynthesis (and control genes) is hybridized. Die Sonde, bei der keine Hybridisierung festgestellt wird, stellt das Gen dar, das in dem Patienten fehlt. The probe, at which no hybridization is detected, is the gene which is lacking in the patient.
  • BEISPIEL 5 EXAMPLE 5
  • [0059] [0059]
    Gegenwärtige Technologien erfordern eine hohe Reinheit der DNA/RNA-Probe für Hybridisierungsanalysen. Current technologies require high purity of the DNA / RNA hybridization sample for analysis. Wegen der hohen Empfindlichkeit und der hohen Hintergrundunterscheidung des vorgeschlagenen Systems, der Anzahl von Kontrollen der Hybridisierung, die einbezogen werden können, und der Möglichkeit der Verwendung zusätzlicher Nachweiskanäle, um vorhandene Targetmengen zu quantifizieren, können rohe oder minimal präparierte Zellpräparate (z. B. Anquetschen des Gewebes an das Substrat, mit oder ohne weitere Lösungsbehandlungen) verwendet werden, um hochwertige Daten zu erhalten. Because of the high sensitivity and high background discrimination of the proposed system, the number of inspections of hybridization that may be involved and the possibility of using additional detection channels to quantify existing target amounts, can raw or minimally prepared cell preparations (z. B. crimping of the fabric to the substrate, can be used with or without further solution treatments) in order to obtain high quality data. So könnten ganze Zellen an den Träger angequetscht werden und mit mehreren DNA-Sonden und Farbstoffen sondiert werden, um die Menge des gebundenen Zellmaterials zu messen und die Expression eines Gens zu diagnostizieren, das mit einer Krankheit verbunden ist. Thus whole cells could be squashed on the support, and probed with multiple DNA probes and dyes in order to measure the amount of bound cellular material and to diagnose expression of a gene associated with a disease.
  • BEISPIEL 6 EXAMPLE 6
  • [0060] [0060]
    Auf den Chip können Proteine aufgebracht und gegen markierte Antikörper hybridisiert werden. On the chip proteins can be applied and hybridized to labeled antibodies. Es könnte auch sein, daß unmarkierte Proteine eine genügend charakteristische Fluoreszenz oder sogar ein charakteristisches Transmissions-/Reflexions-/Autofluoreszenz-/Absorptionsspektrum ("Farbe") aufweisen, so daß sie in Proteinproben identifiziert werden können. It could also be that unlabeled proteins sufficiently characteristic fluorescence or even a characteristic transmission / reflection / auto-fluorescence / absorption spectrum ("color"), so that they can be identified in protein samples.
  • BEISPIEL 7 EXAMPLE 7
  • [0061] [0061]
    Das System kann verwendet werden, um die Verteilung bestimmter repetitiver DNA unter einer Gruppe von Pflanzenspezies auf ihre Diversität und Verteilung zu prüfen: z. B. Retroelement-Klone, die aus einer Auswahl verwandter oder nicht verwandter Spezies als Targets isoliert werden; The system can be used to examine the distribution of certain repetitive DNA among a group of plant species on their diversity and distribution: eg retroelement clones isolated from a variety of related or unrelated species as targets;. gesamtgenomische DNA von verschiedenen verwandten oder nicht verwandten Pflanzenspezies, z. B. Koniferen oder Brassica-Spezies, als Sonden. total genomic DNA from various related or unrelated plant species, z. B. conifer or Brassica species, as probes. Dies zeigt den evolutionären Abstand zwischen Spezies und die Möglichkeiten ihrer Verwendung in Züchtungsprogrammen. This shows the evolutionary distance between species and their possible use in breeding programs.
  • BEISPIEL 8 EXAMPLE 8
  • [0062] [0062]
    Das System kann verwendet werden, um die Allelvariabilität von DNA-Sequenzen oder Genen zu prüfen z. B. synthetische Oligonucleotide, die alle möglichen Nucleotidänderungen in einer definierten Region einer repetitiven DNA-Sequenz oder einer DNA-Sequenz mit niedriger Kopienzahl als Targets darstellen, z. B. einer repetitiven DNA-Familie, Centromer-DNA, einer multigenen Familie, rDNA, von krankheitsassoziierten oder Resistenzproteinen, Speicherproteinen. The system can be used to test the allelic variability of DNA sequences or genes eg., Synthetic oligonucleotides representing all possible nucleotide changes in defined region of a repetitive DNA sequence or a DNA sequence with a low copy number as a target, e.g. . as a repetitive DNA family, centromeric DNA, a multigene family, rDNA, disease-associated proteins or resistance, storage proteins. Gesamtgenomische DNA von Spezies, Varietäten, Populationen oder Individuen von verwandten oder nicht verwandten Individuen oder Spezies als Sonden. Total genomic DNA from species, varieties, populations or individuals from related or unrelated individuals or species as probes.
  • BEISPIEL 9 EXAMPLE 9
  • [0063] [0063]
    Das System kann verwendet werden, um die Existenz, Variabilität und Expression von krankheitserzeugenden Organismen in einer Auswahl von Wirtsspezies zu prüfen; The system can be used to test the existence, variability and expression of disease generating organisms in a range of host species; z. B. Virus-DNA (Klone oder Oligonucleotide) als Targets, gesamtgenomische DNA von verschiedenen Individuen als Sonden. z. B. virus DNA (clones or oligonucleotides) as targets, total genomic DNA from different individuals as probes.
  • BEISPIEL 10 EXAMPLE 10
  • [0064] [0064]
    In einer Übersicht möchte man die Häufigkeit ermitteln, mit der unterschiedliche Formen eines bestimmten Gens (Allele) in einer Population auftreten. An overview of one would like to determine the frequency with which different forms of a particular gene (alleles) occurs in a population. Die DNA von tausenden Individuen wird extrahiert und auf einen Chip aufgebracht. The DNA of thousands of individuals will be extracted and applied to a chip.
  • BEISPIEL 11 EXAMPLE 11
  • [0065] [0065]
    Eine Zelle enthält ein bestimmtes Enzym, das charakteristisch für ihren Zustand nach einer bestimmten Behandlung ist. A cell contains a particular enzyme which is characteristic of its state according to a particular treatment. Auf die Zelle wird ein Substrat aufgebracht, das die Eigenschaft der Chemilumineszenz aufweist. To the cell a substrate is applied, which has the property of chemiluminescence. Diese Lichtemission wird mit einem Tieftemperaturdetektor nachgewiesen. This light emission is detected using a low-temperature detector.
  • BEISPIELE 12 BIS 14 EXAMPLES 12 TO 14
  • [0066] [0066]
    Die Beispiele 12 bis 14 sind Modellversuche, die den Nutzen der vorliegenden Erfindung an Modellsystemen zeigen, die Fluorochrome (Sonden) aufweisen, die an biologische Moleküle (Targets) gebunden sind. Examples 12 to 14 are pilot projects that demonstrate the utility of the present invention in model systems, the fluorochromes (probes) that to biological molecules (targets) are attached. In jedem dieser Beispiele war der Tieftemperaturdetektor derjenige am Forschungs- und Technologiezentrum für die Europäische Raumfahrtagentur, ESTEC, Noordwijk, Holland, der ein Tieftemperatur-Supraleitungstunnelübergangs-(STJ-)Detektor ist, der bei einer Temperatur von etwa 300 mK (Millikelvin) mit einem Detektor von 30 μm × 30 μm betrieben wird. In each of these examples the cryogenic detector was the one on the research and technology center for the European Space Agency, ESTEC, Noordwijk, Holland, a low-temperature Supraleitungstunnelübergangs- (STJ-) is detector at a temperature of about 300 mK (mK) with a detector of 30 microns × 30 microns is operated.
  • BEISPIEL 12 EXAMPLE 12
  • [0067] [0067]
    Der Tieftemperaturdetektor wurde benutzt, um Fluoreszenzemissionsspektren von einer Anzahl verschiedener, im Handel erhältlicher, markierter Nucleotide und Fluorochrome zu erfassen, die zu anderen Komponenten konjugiert sind, nämlich: The cryogenic detector was used to collect fluorescence emission spectra from a number of different, commercially available, labeled nucleotides and fluorochromes conjugated to other components, namely:
    • LR_C: Fluorored (Fluorrot) (Rhodamin-4-dUTP, RPN2122), Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK LR_C: Fluorored (Fluorrot) (rhodamine-4-dUTP, RPN2122), Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK
    • FG_C: Fluorogreen (Fluorgrün) (Fluorescein-11-dUTP, RPN2121), Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK FG_C: Fluorogreen (fluoro green) (fluorescein-11-dUTP, RPN2121), Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK
    • A48_C: Chromatid Alexa Fluor (488-5-dUTP), Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA A48_C: chromatid Alexa Fluor (488-5-dUTP), Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA
    • A59_C: Chromatid Alexa Fluor (594-5-dUTP), Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA Fluorochrom-konjugierte Komponenten: A59_C: chromatid Alexa Fluor (594-5-dUTP), Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA Fluorochrome-conjugated components:
    • TR_C Texas Red-Avidin D (A-2006), Vector Laboratories, Burlingame, Californien, USA TR_C Texas Red-avidin D (A-2006), Vector Laboratories, Burlingame, California, USA
    • FI_C: Fluorescein Streptavidin (FITC; SA-5001), Vector Laboratories, Burlingame, Californien, USA FI_C: fluorescein streptavidin (FITC; SA-5001), Vector Laboratories, Burlingame, California, USA
  • [0068] [0068]
    Die obigen Proben wurden von Hand auf einen normalen Glas-Mikroskopobjektträger getüpfelt. The above samples were spotted by hand on a normal glass microscope slide.
  • [0069] [0069]
    Das Fluoreszenzemissionsspektrum wurde außerdem von einer Probe von Whatman-Filterpapier Nr. 1 (FIL-C) aufgenommen, die fluoreszierende Aufheller enthält. The fluorescence emission spectrum was also taken of a sample of Whatman filter paper no. 1 (FIL-C), which contains fluorescent brightening agents.
  • [0070] [0070]
    Ein Leica-Fluoreszenzmikroskop und eine Quecksilberlampe (W100) als Fluoreszenzlichtquelle sowie ein Filtersatz mit 340–380 nm (Nah-UV) Anregungsfilter und 425 nm-Langpaßemissionsfilter (Leica-Satz A) wurden für die Anregung der Fluorochrome verwendet. A Leica fluorescence microscope and a mercury lamp (W100) as a fluorescent light source and a filter set with 340-380 nm (near-UV) excitation filter and 425 nm Langpaßemissionsfilter (Leica-set A) were used for the excitation of fluorochromes. Die erhaltenen Spektren sind in The spectra obtained are in 2 2 dargestellt. shown. Wenn auch die Anregung vom Maximum weit entfernt war, erhielt man gute Spektren von Fluorochromen, die im roten Bereich emittieren (Alexa 594, Fluorored und Texas red), während starke Spektren im grünen Bereich von den Fluorochromen mit besser geeigneten Eigenschaften aufgenommen wurden (Fluorogreen, FITC und Alexa 488). If the excitation maximum was from far away, you got good spectra of fluorochromes that emit in the red zone (Alexa 594, Fluorored and Texas red), while strong spectra were recorded in the green area of the fluorochromes with more suitable properties (Fluorogreen, FITC and Alexa 488). Alle Spektren hatten charakteristische Formen, Maxima und Flächen. All spectra were characteristic forms, maxima and surfaces. Gezahlte Photonenwerte, die nicht von den Fluorochromen herrühten und deren Wellenlänge unter 1 μm lag, waren nicht nachweisbar, und bei der Erfassung von Spektren ohne eingeschaltete Fluoreszenzlichtquelle wurden etwa 4 Photonen pro Minute erfaßt (einschließlich des Elektronenrauschens, das eine andere Impulscharakteristik aufweist und daher herausgefiltert werden kann), im Vergleich zu Zäh raten von 5000 bis 50000 pro Minute, die man typischerweise von den Fluorochromen erhielt. Paid photons values that do not herrühten of the fluorochromes and lay their wavelength below 1 micron were not detectable, and in the detection of spectra without switched fluorescent light source about 4 photons were per minute detected (including the electron-noise, which has a different pulse pattern and therefore filtered out may be), compared to Hardy advise from 5,000 to 50,000 per minute that are typically received by the fluorochromes.
  • [0071] [0071]
    Der Versuch zeigt: 1) der Tieftemperaturdetektor kann charakteristische Fluoreszenzemissionsspektren von Fluorochromen nachweisen, die gewöhnlich in der Biologie verwendet werden. The experiment shows 1) the cryogenic detector can detect characteristic fluorescent emission spectra from fluorochromes commonly used in biology. 2) Der Detektor weist minimale Hintergrundpegel auf (typischerweise 0,01%) und liefert äußerst saubere Spektren. 2) The detector has minimal background level (typically 0.01%) and delivers extremely clean spectra. 3) Die Form der Emissionsspektren, sogar mit einzelnen Anregungswellenlängenbereichen, ermöglicht die Trennung von einzelnen Fluorochromen. 3) The shape of the emission spectra, even with single excitation wavelength bands, allows separation of individual fluorochromes. 4) Die Helligkeit kann durch Photonenzählungen exakt quantifiziert werden. 4) The brightness can be accurately quantified by photon counts. 5) Es können extrem niedrige Niveaus von Fluorochromen gemessen werden. 5) It can be measured extremely low levels of fluorochromes.
  • BEISPIEL 13 EXAMPLE 13
  • [0072] [0072]
    Es wurden Spektren von vier von den in Beispiel 11 verwendeten Fluorochromen aufgenommen, wobei mit Ausnahme der Verwendung des Filters Leica 13 die gleichen Bedingungen angewandt wurden. There were recorded spectra of four of the fluorochromes used in Example 11, wherein except for the use of the filter Leica 13 The same conditions were applied. Die Spektren sind in The spectra are shown in 3 3 dargestellt. shown.
  • BEISPIEL 14 EXAMPLE 14
  • [0073] [0073]
    Der Tieftemperaturdetektor wurde verwendet, um Fluoreszenzemissionsspektren von einer Papierprobe aufzunehmen, die Fluoreszenzaufheller enthielt, nämlich der weißen Fläche eines selbstklebenden Adreßetiketts, das von Abel-Label, Northampton, UK, gedruckt wurde. The cryogenic detector was used to record the fluorescence emission spectra of a paper sample containing fluorescent whitening agent, namely the white area of a self-adhesive Adreßetiketts that has been printed by Abel-Label, Northampton, UK.
  • [0074] [0074]
    Dies zeigt die Charakterisierung der Färbung von Cellulose und anderen Zellenbestandteilen durch Farbstoffe der Fluoreszenzaufhellerklasse. This shows the characterization of the dyeing of cellulose and other cell constituents by dyes of Fluoreszenzaufhellerklasse. Die Spektren wurden mit UV-Anregung und Langpaß(-filter)-Blauanregung (Linie SL_D, Leica-Filtersatz A), Blauanregung, Langpaß-Grünanregung (SL_C, Leica-Filtersatz I3) und mit Dreifachbandfilter (SL_T, Omega Optical XF56-Filtersatz) aufgenommen. The spectra were obtained with UV excitation and long pass (-filter) -Blauanregung (line SL_D, Leica filters set A), blue excitation, long-pass green excitation (SL_C, Leica filter set I3) and triple-band filter (SL_T, Omega Optical XF56 filter set) was added. Die Spektren sind in The spectra are shown in 4 4 dargestellt. shown. Dieser Versuch demonstriert den Nutzen des Verfahrens für 1) die Charakterisierung der Natur unbekannter Fluorochrome, die als Farbstoffe verwendet werden; This experiment demonstrates the utility of the method for 1) characterizing the nature of unknown fluorochromes used as dyes; 2) den Nachweis der Natur oder Zusammensetzung von gefärbten Objekten biologischen oder anderen Ursprungs unter Verwendung von Farbstoffen von bekannter Spezifität; 2) proof of the nature or composition of colored objects of biological origin or otherwise using dyes of known specificity; 3) den Nachweis der Menge gefärbter Objekte biologischen oder anderen Ursprungs. 3) proof of the amount of colored objects of biological origin or otherwise.
  • BEISPIEL 15 EXAMPLE 15
  • [0075] [0075]
    Eine ausführlichere experimentelle Untersuchung wurde ausgeführt, wie nachstehend berichtet: A detailed experimental study was carried out as reported below:
  • Nachweis mehrerer Fluoreszenzmarkierungen unter Anwendung supraleitender Tunnelübergangsdetektoren Detection of multiple fluorescent labels using superconducting tunnel junction detectors
  • [0076] [0076]
    Die gleichzeitige Messung der optischen Emission von zusammen angeordneten Fluorochromen ist ein häufiges Problem in der Biologie. The simultaneous measurement of the optical emission from collocated fluorochromes is a common problem in biology. Die Abbildung von Zellenkomponenten erfordert die zeitliche Registrierung mehrerer Fluoreszenzmarkierungen, wie z. B. von Varianten von Grün-Fluoreszenzprotein (GFP). The mapping of cell components requires the temporal registration of multiple fluorescent labels such. As variants of green fluorescent protein (GFP). Bei der resonanten Fluoreszenzenergieübertragung (FREI) zeigen Änderungen im Emissionsspektren die physikalische Trennung zwischen Donator- und Akzeptorfarbstoffmolekülen an. In the fluorescence resonance energy transfer (FRET) show changes in emission spectra to the physical separation between donor and Akzeptorfarbstoffmolekülen. Die quantitative Bestimmung der Hybridisierung von markierten Nucleinsäuren (Sonden) an immobilisierte Targetmoleküle im Mikroarrayformat oder in Zellen in situ erfordert idealerweise die gleichzeitige effiziente, artefaktfreie Messung von Fluoreszenzspektren, siehe Dokument 1. Quantitative determination of the hybridisation of labeled nucleic acids (probes) to immobilized target molecules in microarray format or in cells in situ ideally requires the simultaneous efficient, artefact-free measurement of fluorescence spectra, see document first
  • [0077] [0077]
    Auf Tieftemperatur gekühlte supraleitende Tunnelübergangsdetektoren (STJ-Detektoren), siehe Dokumente 2–6, die für die Astronomie entwickelt wurden, messen die Energien von individuellen optischen Photonen bei sehr niedrigen internen Hintergrundniveaus. At low temperature cooled superconducting tunnel junction detectors (STJ) detectors, see Documents 2-6, which were developed for astronomy, measure the energies of individual optical photons at very low internal background levels. Hier zeigen wir, daß STJ-Detektoren für die empfindliche Registrierung von mehreren biologischen Fluorochromen eingesetzt werden können. Here we show that STJ detectors for sensitive registration of multiple biological fluorochromes can be used. Unter Verwendung eines einzigen Nah-UV-Anregungsfilters und normaler dichroitischer und Langpaßfilter konnten die Emissionsspektren gewöhnlicher Fluorochrome leicht unterschieden werden – voneinander und von einer Breitband-Substratfluoreszenz. Using a single near-UV excitation filter, and a normal dichroic long pass filter and the emission spectra of common fluorochromes could be easily distinguished - from each other and from broadband substrate fluorescence.
  • [0078] [0078]
    Tieftemperaturdetektoren haben das Potential, die quantitative Abbildung von mehreren Fluorochromen in der Biologie zu revolutionieren. Cryogenic detectors have the potential to revolutionize the quantitative illustration of several fluorochromes in biology.
  • [0079] [0079]
    Photomultiplier bzw. Sekundärelektronenvervielfacher (SEV) und Bildverstärker sind die Photonenzähldetektoren, die am häufigsten benutzt werden, um schwach fluoreszierende biologische Proben abzubilden. Photomultiplier and secondary electron multiplier (SEM) and image intensifier are the Photonenzähldetektoren that are used most frequently to reflect weakly fluorescent biological samples. Diese Detektoren liefern nur dann Informationen über die Photonenfarbe (Energie oder Wellenlänge), wenn sie zusammen mit Schmalband-Ausgangsfiltern oder Dispersionsgittern eingesetzt werden. These detectors provide only information about the color photon (energy or wavelength), when used together with narrowband output filters or dispersion gratings. Ihr Wirkungsgrad ist durch die Quantenausbeute Q (Elektronen/Photon) der SEV-Photokathode begrenzt. Their efficiency is limited by the quantum efficiency Q (electron / photon) SEV photocathode. Für eine Photokathode wie z. B. S20 (CsKNaSb), siehe Dokument 7, ist Q < 20% im optischen Bereich. For a photocathode such. As S20 (CsKNaSb), see Document 7, Q is <20% in the optical domain. Systeme auf Gitterbasis bieten jetzt bis zu 32 parallele Energiekanäle, siehe Dokument 8, die jeweils durch einen unabhängigen SEV ausgelesen werden, aber die Empfindlichkeit des Geräts bleibt durch die mit dem Dunkelstromrauschen verbundene Zählrate der Photokathode beschränkt – B ≥ 10 Zählimpulse·cm –2 ·s –1 bei Raumtemperatur, siehe Dokument 9. Häufiger werden die Fluorochrome nacheinander angesprochen, wobei die Probe wiederholt abgetastet und die Fluoreszenz über eine Serie von Schmalband-Ausgangsfiltern registriert wird. Systems on lattice basis are now offering up to 32 parallel energy channels, see Document 8, which are respectively read by an independent SEV, but the sensitivity of the device remains the connected to the dark current noise count rate of the photocathode limited - B ≥ 10 counts · cm -2 · s -1 at room temperature, see document 9. More commonly, the fluorochromes are addressed sequentially, wherein the sample is repeatedly scanned and the fluorescence is recorded by a series of narrow band output filters. Die mehrfache Abtastung erhöht die Möglichkeit der Photobleichung. Multiple sampling increases the possibility of photobleaching.
  • [0080] [0080]
    Der niedrige Durchsatz von Dispersionsspektrometern war in den 1990-er Jahren einer der Anreize für die Entwicklung von energieauflösenden Tieftemperaturdetektoren in der Astronomie, wie z. B. des STJ und des Übergangskantensensors (TES), siehe Dokument 10. Ein STJ besteht aus zwei supraleitenden Schichten, die auf einer Temperatur T gehalten werden, die weit unter ihrer Übergangstemperatur Tc vom supraleitenden zum Normalzustand liegt, und die durch eine isolierende Oxidschicht getrennt sind (siehe oberes Nebenbild zu The low rate of dispersion spectrometers was in the 1990s, one of the incentives for the development of energy-resolution low-temperature detectors in astronomy, such. As the STJ and the transition edge sensor (TES), see document 10. A STJ consists of two superconducting layers which are maintained at a temperature T, which under their transition temperature Tc is far from the superconducting to the normal state, and which are separated by an insulating oxide layer (see upper inset to 5 5 ). ). Für T ~ Tc/10 ist der thermisch induzierte Tunnelstrom vernachlässigbar, und die Absorption eines Photons der Wellenlänge λ (nm) führt zu einer Zahl N o ~ 7 × 105/λΔ(T) von überschüssigen freien Ladungen (Quasiteilchen), wobei Δ (meV) der Supraleitungs-Energieabstand ist, siehe Dokument 4. Das Eigenauflösungsvermögen (oder "tunnelbegrenzte" Auflösungsvermögen) R = λ/Δλ eines symmetrischen STJ ist dann: For T ~ Tc / 10 of the thermally induced tunneling current is negligible, and the absorption of a photon of wavelength λ (nm) leads to a number N o ~ 7 × 105 / λΔ (T) of excess free charges (quasiparticles), where Δ ( meV) the superconducting energy gap is, see Document 4. The intrinsic resolution (or "tunnel-limited" resolution) R = λ / Δλ of a symmetric STJ is then: R = 357[λΔ] –1/2 [1 + F + 1/<n>] –1/2 (1) Gl. R = 357 [λΔ] -1/2 [1 + F + 1 / <n>] -1/2 (1) Eq. wobei F der Fano-Faktor ist (~ 0,22 für Übergangsmetall-Supraleiter, siehe Dokument 6) und <n> angibt, wie oft jedes Quasiteilchen im Mittel die Potentialbarriere durchtunnelt. where F is the Fano factor (~ 0.22 for transition metal superconductors, see Document 6) and <n> is the number of times each quasiparticles tunnel through the potential barrier on the average.
  • [0081] [0081]
    Der in unserer Anfangsuntersuchung der biologischen Fluoreszenz verwendete Detektor war ein einzelner STJ von 30 × 30 μm 2 mit 100 nm dicken Ta-Schichten und 30 nm dicken Al-Schichten auf beiden Seiten der Tunnelbarriere. The detector used in our initial study of biological fluorescence was a single STJ of 30 × 30 microns 2 with 100 nm thick Ta layers and 30 nm thick Al layers on both sides of the tunnel barrier. Die Übergangstemperatur für massives Tantal beträgt 4,5 K, und der Energieabstand Δ(0) beträgt 0,69 meV. The transition temperature for solid tantalum is 4.5 K and the energy gap Δ (0) is 0.69 meV. Der Detektor wurde unter Anwendung von photolitographischen Verfahren aus einer Ta/Al-Mehrfachschicht hergestellt, die auf einem polierten Saphirsubstrat abgeschieden wurde. The detector was fabricated using photolithographic methods from a Ta / Al multilayer deposited on a polished sapphire substrate. Der niedrige Leckstrom (< 0,1 pA/μm 2 ) ergab einen vernachlässigbaren Beitrag zum Grundlinienstörpegel, während die hohe Durchlässigkeit der Barriere zu hohen Signalamplituden führte. The low leakage current (<0.1 pA / 2 micron) gave a negligible contribution to Grundlinienstörpegel, while the high transparency of the barrier resulted in high signal amplitudes.
  • [0082] [0082]
    Der Detektor hatte eine Empfindlichkeit von <n>N o ~ 40000 getunnelten Elektronen pro eV Photonenenergie und eine Impulsabfallzeit von ~ 20 μs. The detector had a sensitivity of <n> N o ~ 40000 tunneled electrons per eV photon energy and a pulse fall time of ~ 20 microseconds. Gl. Eq. (1) gibt dann das Auflösungsvermögen von 16,0 und 8,8 bei Wellenlängen von 600 nm und 2000 nm an. (1) then specifies the resolution of 16.0 and 8.8 at wavelengths of 600 nm and 2000 nm. Die Eichung mit monochromatischer Strahlung ergab R (600 nm) ~ 13,3. Calibration with monochromatic radiation yielded R (600 nm) ~ 13.3. Durch Abkühlung auf 300 mK in einem 3He-Kryostat (dh T ~ Tc/15) wurde der thermisch angeregte Quasiteilchenstrom weit unter der Leckstromstärke gehalten. By cooling down to 300 mK in a 3He cryostat (ie T ~ Tc / 15) of the thermally excited quasiparticle was kept well below the leakage current. Wir würden dann erwarten, daß die dominierende Störpegelquelle in dem STJ Myonen aus kosmischer Strahlung sind, die auf komplexe Weise mit dem Saphirsubstrat in Wechselwirkung treten, um bei einer oberen Grenzrate B ~ 0,01 cm –1 s –1 paarspaltende Phononen zu erzeugen. We would then expect that the dominant Störpegelquelle are in the STJ muons from cosmic rays, which interact with the sapphire substrate interact in complex ways to produce s -1 at a top marginal rate B ~ 0.01 cm -1 splitting few phonons.
  • [0083] [0083]
    Bei gegebenem STJ-Quantenwirkungsgrad Q (600 nm) von 75%, siehe Dokument 4, gelangen wir dann zu dem Empfindlichkeitsvorteil des Tieftemperaturdetektors gegenüber einem System auf SEV-Basis: For a given STJ quantum efficiency Q (600nm) of 75%, see Document 4, we then arrive at the sensitivity advantage of the cryogenic detector over a system on ETS-base: {Q STJ /√JB STJ }/{Q SEV /√B SEV } = 120 mal Gl.(2) {Q STJ / √JB STJ} / {Q SEV / SEV √B} = 120 times Eq. (2)
  • [0084] [0084]
    Licht von einem Leica Aristoplan-Auflichtfluoreszenzmikroskop mit einer 100 W Osram HBO Quecksilberlampen-Anregungquelle wurde über eine 6 Meter langen Oriel 77530 Quarzglaslichtleiter von UV-Qualität und ein Bandfilter mit λ ~ 200–2000 nm in den rückseitig beleuchteten STJ eingekoppelt. Light from a Leica Aristoplan Auflichtfluoreszenzmikroskop with a 100 W Osram HBO mercury lamp excitation source was coupled with a 6-meter Oriel 77530 quartz light guide of UV quality and a bandpass filter with λ ~ 200-2000 nm in the retroillumination STJ. Der STJ-Quantenwirkungsgrad ist höher als 50% für λ-Werte zwischen 150 und 700 nm. Es wurde nicht versucht, das Licht von der Probe auf den Lichtleiter oder von dem Lichtleiter auf den Detektor zu fokussieren. The STJ quantum efficiency exceeds 50% for λ-values from 150 to 700 nm. No attempt was made to focus the light from the sample on the optical waveguide or of the optical fiber onto the detector. Der Kopplungswirkungsgrad war daher extrem niedrig (< 0,01%). Therefore, the coupling efficiency was extremely low (<0.01%). Der Detektor wurde innerhalb einer lichtdichten Abschirmung auf der Systembasistemperatur von 300 mK gehalten. The detector was kept in a light-proof shield on the system base temperature of 300 mK. Das warme Ende der Lichtleitfaser bildet jedoch einen schwarzen Strahler bei 300 K, der in Verbindung mit der Faserübertragung in allen STJ-Spektren bei einer Wellenlänge von 2 μm ein effektives Bezugssignal liefert (siehe The warm end of the optical fiber, however, a black body at 300 K is formed, which at a wavelength of 2 microns, in conjunction with the transmission fiber in all STJ spectra an effective reference signal (see 5 5 , . 7 7 ). ).
  • [0085] [0085]
    Die warme Ausleseelektronik bestand aus einem ladungsempfimdlichen Vorverstärker, der in einem Abstand von ~ 1m vom Detektor angeordnet war, einem Verstärker (10 μs Impulsformungszeit) und einem Analog-Digital-Wandler (AD-Wandler), dessen Ausgang optisch an einen PC gekoppelt wurde, in dem die Impulsamplitude und die Abfallzeit für jedes erfaßte Photon aufgezeichnet wurde. The warm readout electronics consisted of a ladungsempfimdlichen preamplifier, which was located at a distance of ~ 1 m from the detector, an amplifier (10 microseconds pulse shaping time) and an analog-to-digital converter (AD) converter whose output was optically coupled to a PC, in which the pulse amplitude and decay time was recorded for each detected photon. Zur Auswahl gültiger Ereignisse wurde ein Impulsanstiegszeitfenster angewandt. To select a valid events pulse rise time window was used.
  • [0086] [0086]
    Fluoreszenzspektren wurden von elf verschiedenen, im Handel erhältlichen, markierten Uridin-Nucleotiden gemessen. Fluorescence spectra were measured from eleven different, commercially available, labeled uridine nucleotides. Es wurden auch sechs verschiedene Substrate untersucht. It also six different substrates were studied. Vier Anregungsfilter wurden verwendet: die hier dargestellten Spektren wurden mit den folgenden zwei Filtersätzen aufgenommen: Four excitation filters were used: the spectra shown here were taken with the following two sets of filters:
    Leica-Filtersatz I3; Leica filter set I3; Anregung 450–490 nm, dichroitische Grenzwellenlänge 510 nm, und 515 nm-Langpaßfilter Excitation 450-490 nm, dichroic cutoff wavelength of 510 nm, and 515 nm long-pass filter-
    Omega Optics Inc. 11 XF56-Dreifachanregungsfilter, mit auf 457, 528 und 633 nm zentrierten Durchlaßbereichen, seinem zugeordnetem dichroitischen Spiegel und einem Omega 580-Langpaßemissionsfilter. Omega Optics Inc. 11 XF56 triple excitation filter, with centered at 457, 528 and 633 nm passbands its associated dichroic mirror and a 580-Omega Langpaßemissionsfilter.
  • [0087] [0087]
    Die Durchgangswerte der aktuell verwendeten Filter wurden im Nachhinein unter Verwendung eines Spektrophotometers bestätigt. The passage of the values currently used filters were subsequently confirmed using a spectrophotometer.
  • [0088] [0088]
    Obwohl die Anregung weit entfernt vom maximalen Absorptionsmaß angeregt erfolgte, wurden Spektren von Fluorochromen aufgenommen, die im roten (Alexa 594, Fluorored und Texas Red) und grünen Bereich (Fluorogreen, Avidin FITC und Alexa 488) emittierten. Although the excitation was excited far from the maximum absorbance, spectra of fluorochromes were included in the red (Alexa 594, Fluorored and Texas Red) and green area (Fluorogreen, avidin FITC and Alexa 488) emitted. Wir veranschaulichen die Möglichkeiten des STJ für die Fluoreszenzbilderzeugung unter besonderer Bezugnahme auf die Farbstoffe Alexa 488 und Alexa 594 12. We illustrate the capabilities of the STJ for fluorescence imaging with particular reference to the dyes Alexa 488 and Alexa 594 12th 5 5 zeigt das Impulshöhenspektrum des letzteren Fluorochroms bei dem Leica-I3-Filtersatz. shows the pulse height spectrum of the latter fluorochrome at the Leica I3 filter set. Das Spektrum wird bei 2,4 eV (515 nm) durch das Langpaßfilter abgeschnitten. The spectrum is cut off at 2.4 eV (515 nm) through the long pass filter. Selbst bei dem mit nur ~ 3% des maximalen Absorptionsvermögens angeregten Fluorochrom beträgt das Signal-Untergrundverhältnis (maximaler Kanalzählwert, dividiert durch den mittleren Kanalzählwert bei Energien unmittelbar über dem IR-Peak) mindestens 275:1. Even with the excited with only ~ 3% of maximum absorbance, the signal-to-background fluorochrome ratio (maximum channel count divided by average channel count at energies to just above the IR peak) is at least 275: first Die Anpassung einer Normalverteilung (der gestrichelten Kurve) an den IR-Peak läßt erkennen, daß R(2000 nm) = 4,0 ist. The adjustment of a normal distribution (the broken curve) to the IR peak indicates that R (2000 nm) = 4.0.
  • [0089] [0089]
    Durch Injektion einer bekannten Ladung in den warmen STJ-Vorverstärker von einem elektronischen Impulsgeber wurde eine Peakbreite von 0,084 eV Halbwertsbreite erzeugt. A peak width of 0.084 eV half-width was produced by injecting a known charge in the warm STJ preamp of an electronic impulse. Die Quadratursumme des Tunnelgrenzwerts und elektronischer Störbeiträge läßt dann auf ein 2 μm-Auflösungsvermögen von R = 5,7 schließen, das etwas besser als das beobachtete ist. The quadrature sum of the tunneling limit and electronic interference contributions can then connect to a 2 micron resolution of R = 5.7, which is slightly better than the observed.
  • [0090] [0090]
    Für jedes Fluorochrom wurde der Brennpunkt des Mikroskops so eingestellt, daß eine Ausgangszählrate von 800 Hz erzeugt wurde – die maximale Rate, bevor die Impulsanhäufung die spektrale Auflösung gefährdete. For each fluorochrome, the focal point of the microscope was adjusted so that an output count generated by 800 Hz - the maximum rate before pulse accumulation endangered the spectral resolution. Die "Dunkel-"Zählrate, die man durch Schließen des Mikroskopverschlusses zwischen Glühlampe und Filter erhielt war gleich 0,09 s –1 . The "dark" count rate was obtained by closing the microscope closure between bulb and filter was equal to 0.09 s -1. Da einzelne Spektren nicht mit konstanter Intensität aufgenommen wurden, stellt die Überlagerung von zwei STJ-Spektren nicht unbedingt den spektralen Zerlegungsgrad für das entsprechende Gemisch von Fluorochromen dar. Nichtsdestoweniger läßt Because individual spectra were shot with a constant intensity represents the superposition of two spectra STJ not necessarily the spectral decomposition level for the corresponding mixture of fluorochromes is. Nonetheless leaves 6 6 erkennen, daß der spektrale Überlappungsgrad zwar signifikant ist, die relativen Intensitätsbeiträge von gemischten Alexa 488- und -594-Sonden aber einfach zerlegt werden können. seen that the spectral overlap degree, while significant, the relative intensity contributions of mixed Alexa 488 and -594 probes can be easily dismantled but.
  • [0091] [0091]
    Wir stellen fest, daß maximale Emissionsenergien und Spektralbreiten für beide Sonden siginifkant von den durch den Hersteller veröffentlichten Vorlagen abweichen, siehe Dokument 12. Da die STJ- Eichung jede "Nullverschiebung" in der Detektorcharakteristik ausschließt (siehe We note that the maximum emission energies and spectral widths for both probes siginifkant from documents published by the manufacturer vary, see Document 12. Since the STJ- each calibration "zero offset" excludes the detector characteristic (see 7 7 ), folgern wir, daß diese Messungen den Nachweis für den Einfluß der lokalen Umgebung auf die Fluorochrom-Emission liefern. ), We conclude that these measurements provide evidence for the influence of local environment on fluorochrome emission. Hier trockneten die Farbstoffe aus der Lösung aus, die auf mit Chromsäure gereinigtes Glas getupft wurde. Here, the dyes dried out from solution that was spotted onto glass cleaned with chromic acid.
  • [0092] [0092]
    8 8 zeigt die Alexa 594- und -488-Spektren, die mit dem Omega-Dreifachfiltersatz aufgenommen wurden; shows the Alexa 594 and -488 spectra were recorded with the Omega triple filter set; die "haubenförmigen" Durchlaßbereiche des Ausgangsfilters sind durch vertikale gestrichelte Linien angedeutet. the "dome-shaped" passbands of the output filter are indicated by vertical dashed lines. Diese Figur zeigt, daß die spektroskopische Fähigkeit des STJ mit geeigneten Auswahlen von Eingangs- und Ausgangsfiltern kombiniert werden kann, um eine stark bevorzugte Registrierung eines Fluorochroms zu liefern. This figure shows that the spectroscopic capability of the STJ can be combined with suitable choices of input and output filters to provide a highly preferred registration of a fluorochrome.
  • [0093] [0093]
    9 9 veranschaulicht die Anwendung des STJ auf die Untersuchung von genetischem Material, das auf einem Arrayit TM -Substrat, siehe Dokument 13, mit Mehrfachsonden hybridisiert wurde (Alexa 568, Alexa 594 und Bodipy 630/650 – alle hergestellt von Molecular Probes Inc., siehe Dokument 12). illustrates the application of the STJ to the study of genetic material on an Arrayit TM substrate, see document 13, was hybridized with multiple probes (Alexa 568, Alexa 594 and Bodipy 630/650 - all produced by Molecular Probes Inc., see document 12). Der Datensatz 1 stellt das gemessene Probenspektrum dar, während die Kurven The data set 1 represents the measured sample spectrum, while curves 2 2 , . 4 4 , . 5 5 , . 6 6 die Komponentenspektren sind, die getrennt für die drei Fluorochrome und für das Substrat gemessen wurden. the component spectra are measured separately for the three fluorochromes and for the substrate. Kurve Curve 3 3 läßt erkennen, daß eine lineare Summe der Komponentenintensitäten mit den Gewichten: Alexa 568:Bodipy:Substrat:Alexa 594 = 10:10:4:3 eine ausgezeichnete Anpassung an die Daten im Bereich von 1,9–2,4 eV (515–652 nm) liefert. indicates that a linear sum of the component intensities with weights: Alexa 568: Bodipy: Substrate: Alexa 594 = 10: 10: 4: 3 an excellent fit to the data in the range of 1.9-2.4 eV (515- 652 nm) returns.
  • [0094] [0094]
    Wir können die zu hohe Intensität bei niedrigeren Energien nicht auf die Gegenwart von nichthybridisierter DNA in der Probe zurückführen, da die Eigenfluoreszenz der DNA bekanntlich im UV-Bereich ihren Höchstwert erreicht. We can see the intensity too high at lower energies can not be attributed to the presence of unhybridized DNA in the sample, since the intrinsic fluorescence of DNA known reaches its peak in the UV range. Eine alternative Erklärung ist eine Excimer-Emission (eines angeregten Dimers), die als Ergebnis der hohen Konzentrationen der Fluorochromsonden in der Probe entsteht. An alternative explanation is excimer emission (an excited dimer), which arises as a result of high concentrations of the Fluorochromsonden in the sample.
  • [0095] [0095]
    Zusammenfassend haben wir gezeigt, daß ein Tieftemperaturdetektor quantitativ und mit einem sehr hohen Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zum herkömmlichen System charakteristische Emissionsspektren von Fluorochromen erfassen kann, die gewöhnlich in der Biologie eingesetzt werden. In summary, we have shown that a low temperature detector quantitatively and with a very high signal-to-noise ratio compared to the conventional system can detect characteristic emission spectra of fluorochromes that are commonly used in biology. Selbst bei einzelnen Anregungswellenlängenbereichen ermöglicht die Aufnahme des vollständigen Spektrums die Trennung von Mehrfachfluorochromen. Even with single excitation wavelength regions, the inclusion of the full spectrum allows the separation of Mehrfachfluorochromen. Bemerkenswerterweise haben wir festgestellt, daß nichtfokussierte, niedrige Intensitäten der peripheren Probenbeleuchtung mit Philips TLD 36W/83-Leuchtstoffröhren (dh normale Laborbeleuchtung) Zählraten von mehr als 1000 Hz anregen konnten. Remarkably, we have found that non-focused, low intensities of the peripheral sample illumination with Philips TLD 36W / 83 fluorescent tubes (ie normal laboratory lighting) could stimulate count rates greater than 1000 Hz.
  • [0096] [0096]
    Die gegenwärtige Ta-Technologie (R ~ 10–20) ist mit mindestens vier gleichzeitigen Markierungen mit einem einzigen Anregungsfilter kompatibel; The current Ta technology (R ~ 10-20) is compatible with at least four simultaneous labeling with a single excitation filter; die Möglichkeiten von Hf (Δ(0) = 0,02 meV; R ~ 80) und Mo (Δ(0) = 0,14 meV; R ~ 40) für bessere Auflösung (bei niedrigeren Betriebstemperaturen) sind gut dokumentiert, siehe Dokument 4. Im Zusammenhang mit dem Auslesen von Mikroarrays ist jede Erhöhung der Anzahl von Markierungen wichtig, die ohne Störung gemessen werden können, da entweder die Anzahlen von einbeziehbaren internen Kontrollen erhöht werden können oder mehr Proben gleichzeitig getestet werden können. the possibilities of Hf (Δ (0) = 0.02 meV; R ~ 80) and Mo (Δ (0) = 0.14 meV; R ~ 40) for better resolution (at lower operating temperatures) are well documented, see document 4. In connection with the read-out of microarrays any increase in the number of markings is important, which can be measured without interference, either because the numbers of internal controls can be increased einbeziehbaren or more samples can be tested simultaneously. Die bescheidene Zählratenbeschränkung eines einzelnen STJ-Pixels kann durch Verwendung paralleler Arrays überwunden werden; The modest Zählratenbeschränkung of a single STJ pixel can be overcome by using parallel arrays; Ta-STJ-Matrizen von 6 × 6 Elementen sind gefertigt worden, und die Entwicklung von 10 × 32 Mo-Arrays ist von der ESTEC-Gruppe untersucht worden (siehe unteres Nebenbild zu Ta-STJ-matrices of 6 × 6 elements have been made, and the development of 10 × 32 Mo arrays has been investigated by the ESTEC group (see lower inset to 5 5 ). ). Diese Entwicklungen und die Herstellung von geschlossenen Kühlsystemen für den Bereich mit T < 100 mK wird einen wichtigen Einfluß auf den Endnutzen optischer STJs in den Biowissenschaften haben. These developments and the production of closed cooling systems for the range T <100 mK will have an important impact on the end use of optical STJs in the biosciences.
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Citing PatentFiling datePublication dateApplicantTitle
DE102010047237A1 *4 Oct 201016 Feb 2012Leica Microsystems Cms GmbhVerfahren zum Trennen von Detektionssignalen im Strahlengang einer optischen Einrichtung
US965176512 Aug 201116 May 2017Leica Microsystems Cms GmbhMethod for separating detection signals in the beam path of an optical device
Classifications
International ClassificationG01N21/64, H01J49/02
Cooperative ClassificationG01N21/6456, G01N2021/6441
European ClassificationG01N21/64P4