DE10224963A1

DE10224963A1 - Diagnostic method for chromosomal abnormalities, useful for detecting e.g. trisomy or alterations in sex chromosomes, uses at least two oligonucleotide probes for each target chromosome

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Publication number: DE10224963A1
Application number: DE2002124963
Authority: DE
Inventors: Uwe Prof Dr Institut Claussen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2002-06-05
Publication date: 2003-12-24

Abstract

Diagnostic method for representation of chromosome-specific signals or chromosomal abberations in which interphase chromosomes are characterized by in situ hybridization with at least one of the locus-specific marker probes: (a) for each of chromosomes X, Y and 18, probes specific for the long and short arms; and/or (b) for each of chromosomes 13 and 21, two probes for the long arms. Independent claims are also included for the following: (1) diagnostic kit for the method containing at least 10 probes, as specified; and (2) nucleic acid probes as defined.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Diagnoseverfahren zur Darstellung von chromosomenregionspezifischen Signalen oder Chromosomenabberationen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass einzelne Chromosomen im Interphasekern durch in situ- Hybridisierung mit mindestens zwei, vorzugsweise mit unterschiedlichen Fluorochromen markierten lokusspezifischen Nukleinsäuresonden pro Chromosom charakterisiert werden, die jeweils an die langen und kurzen Arme der Chromosomen X, Y und 18 bzw. die langen Arme der Chromosomen 13 und 21 hybridisieren. The present invention relates to a diagnostic method for Representation of chromosome region specific signals or Chromosome aberrations, which is characterized in that individual chromosomes in the interphase nucleus through in situ Hybridization with at least two, preferably with different fluorochromes marked location-specific Nucleic acid probes can be characterized per chromosome on the long and short arms of chromosomes X, Y and 18 or the long arms of chromosomes 13 and 21 hybridize.

Jedes 200. Kind wird mit einer Chromosomenveränderung geboren. Die häufigsten chromosomalen Anomalien sind die Trisomie 21 (Down Syndrom), Trisomie 13 (Pätau Syndrom), Trisomie 18 (Edwards Syndrom) und die zahlenmäßigen Veränderungen der Geschlechtschromosomen (z. B. Turner Syndrom). Um diese und andere Chromosomenanomalien auszuschließen bzw. frühzeitig erkennen zu können, wird eine Chromosomenanalyse aus einer Fruchtwasserzellkultur durchgeführt, wobei die Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung (FISH) es erlaubt, bereits 12 bis 48 Stunden nach der Amniozentese zumindest einen Teilbefund über numerische Aberrationen der Chromosomen 13/18/21/X/Y zu erstellen. Every 200th child is born with a chromosome change. The most common chromosomal abnormalities are trisomy 21 (Down syndrome), trisomy 13 (Pätau syndrome), trisomy 18 (Edwards Syndrome) and the numerical changes in the Sex chromosomes (e.g. Turner syndrome). To this and others Exclude chromosomal abnormalities or recognize them early can, a chromosome analysis from a Amniotic fluid cell culture performed, the fluorescence in situ Hybridization (FISH) already allows 12 to 48 hours after amniocentesis at least a partial finding on create numerical aberrations of chromosomes 13/18/21 / X / Y.

Der Interphase-FISH-Test ist eine inzwischen in den meisten Chromosomenlabors etablierte Methode, welche die diagnostischen Möglichkeiten der konventionellen Zytogenetik beträchtlich erweitert hat. Seit einigen Jahren wird sie auch bei spezifischen diagnostischen Fragestellungen an Interphasezellen eingesetzt. Der Verzicht auf eine konventionelle Chromosomenpräparation und/oder Zellkultur spart dabei Zeit und Kosten. Beispiele sind die Translokationsdiagnostik in der Tumorzytogenetik oder die bereits vorstehend erwähnte pränatale Aneuploidiediagnostik. Eine begrenzte Zahl numerischer Chromosomenanomalien kann heute mit relativ hoher Zuverlässigkeit an Interphasezellen (z. B. unkultivierten Amnion- bzw. Chorionzellen) mit Hilfe der FISH innerhalb kürzester Zeit ausgeschlossen werden. Diese Methode bedeutet eindeutig eine deutliche Verbesserung der diagnostischen Möglichkeiten. The Interphase FISH test is now one in most Chromosome laboratories established method which the diagnostic The possibilities of conventional cytogenetics are considerable has expanded. For a few years now she has also been with specific diagnostic questions on interphase cells used. The abandonment of a conventional one Chromosome preparation and / or cell culture saves time and Costs. Examples are translocation diagnostics in the Tumor cytogenetics or the prenatal one mentioned above Aneuploidy diagnosis. A limited number numeric Chromosomal abnormalities can be relatively high today Reliability on interphase cells (e.g. uncultivated amniotic or Chorion cells) with the help of the FISH within a very short time be excluded. This method clearly means one significant improvement in diagnostic options.

Bei der FISH-Technik werden chromosomenspezifiscche, fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden benutzt, die sich auch in Interphasezellen an spezifische Chromosomenregionen binden. Die Auszählung der je nach Sonde und verwendetem Fluorochrom verschiedenfarbigen Signale erlaubt es, die Kopienzahl der untersuchten Chromosomen im Präparat unter dem Fluoreszenzmikroskop zu bestimmen. Zur Zeit werden in der Routineanwendung Sonden für die Chromosomen 13, 18, 21, X und Y verwendet. Andere Chromosomen können in begrenzter Zahl untersucht werden. Die Hybridisierung erfolgt an unkultivierten Zellen, so dass ein Ergebnis in kurzer Zeit vorliegen kann. Bei der Auswertung werden die Signale für jedes der untersuchten Chromosomen an mindestens 50 Zellen ausgewertet. Zwei Fluoreszenzsignale findet man bei normaler Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms im Zellkern. Drei Signale einer Sonde in einem hohen Prozentsatz aller untersuchten Zellen sprechen mit hoher Wahrscheinlichkeit für eine Trisomie des betreffenden Chromosoms. Vorteil der Methode bei adäquatem Untersuchungsmaterial ist eine rasche Diagnostik ausgewählter numerischer Chromosomenanomalien. The FISH technique uses chromosome-specific, fluorescence-labeled DNA probes are used, which are also in Bind interphase cells to specific chromosome regions. The Counting of fluorochrome depending on the probe and used different colored signals allow the number of copies of the examined chromosomes in the preparation under the fluorescence microscope to determine. Currently, probes are being used in routine applications used for chromosomes 13, 18, 21, X and Y. Other Chromosomes can be examined in limited numbers. The Hybridization takes place on uncultivated cells, so that a Result can be available in a short time. When evaluating will display the signals for each of the chromosomes examined evaluated at least 50 cells. Two fluorescence signals can be found with a normal number of copies of the corresponding Chromosome in the cell nucleus. Three signals from one probe in one high Percentage of all cells examined speak high Probability of trisomy for the chromosome in question. The advantage of the method with adequate test material is a quick diagnosis of selected numerical Chromosomal abnormalities.

Bisher wurde in der Diagnostik pro Chromosom nur eine Nukleinsäuresonde verwendet, die z. B. bezüglich der Chromosomen X, Y und 18 Zentromer-spezifisch war, also mit einem Bereich hybridisiert, der keine Gene enthält. Bei Verwendung nur einer Sonde pro Chromosom sind allerdings keine Aussagen über partielle Deletionen in einem der großen Chromosomenarme möglich. Außerdem können in den Zentromersequenzen Polymorphismen auftreten, welche zu falsch-positiven bzw. -negativen Resultaten führen können. Somit ist die Zuverlässigkeit des FISH-Tests, wie er bisher durchgeführt wurde, nicht in ausreichendem Maß gewährleistet. So far, only one has been used in diagnostics per chromosome Nucleic acid probe used, the z. B. with respect to chromosomes X, Y and 18 was centromere-specific, i.e. with one area hybridizes that contains no genes. When using only one probe however, there are no statements about partial chromosomes Deletions possible in one of the large chromosome arms. In addition, polymorphisms can be found in the centromere sequences occur, which leads to false positive or negative results being able to lead. So the reliability of the FISH test, as it has been done so far, not to a sufficient extent guaranteed.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, einen auf in-situ-Hybridisierung basierenden Test zur Verfügung zu stellen, der die vorstehend geschilderten Nachteile nicht aufweist, d. h., zu diagnostisch zuverlässigen Aussagen führt. Thus, the present invention has a technical problem based on an in situ hybridization test for To make available to those described above Does not have disadvantages, d. i.e., diagnostically reliable Statements.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt. Es zeigte sich, dass die bisherigen Nachteile des FISH-Tests dadurch beseitigt werden können, dass zur Charakterisierung von Chromosomen bzw. Chromosomenaberrationen pro Chromosom mindestens zwei lokusspezifische Nukleinsäuresonden verwendet werden, die jeweils an den kurzen und den langen Arm der Chromosomen X, Y und 18 hybridisieren. Da die Chromosomen 13 und 21 keine "genhaltigen" kurzen Arme aufweisen, sind hier die beiden Sonden so gestaltet, dass sie an den langen Chromosomenarm hybridisieren. The solution to this technical problem is provided by Provision of those identified in the claims Embodiments achieved. It turned out that the previous ones Disadvantages of the FISH test can be eliminated by that for the characterization of chromosomes or Chromosome aberrations per chromosome at least two location-specific Nucleic acid probes are used, each on the short and the hybridize long arm of chromosomes X, Y and 18. Since the Chromosomes 13 and 21 have no "genetically" short arms have, the two probes are designed so that they hybridize to the long chromosome arm.

Brief description of the drawing Fig. 1 (A) Results of a FISH rapid test on uncultivated amniocytes

Der FISH-Test an nicht-kultivierten Amniocyten im Fall 1 zeigte nach Anwendung der Aneuvision-Sonden LSI 13 und LSI21 (Vysis), ein normales Muster für die Sonde, die für Chromosom 21 spezifisch war (rot). 15 von 102 bzw. 87 von 102 analysierten Zellkernen zeigten zwei bzw. drei spezifische grüne Signale für die Sonde LSI 13. In 71 von 102 Interphase-Zellkernen waren zwei der drei Signale co-lokalisiert (2+1) und in 16 Zellkernen tauchten sie als drei klar getrennte Signale (3) auf. Die GTG- Bandierung ergab, dass in diesem Fall eine Duplikation des Bereichs 13q14-q21 (Pfeilkopf) der Grund für die drei für Chromosom 13 spezifischen Signale war und nicht etwa eine freie Trisomie 12. The FISH test on uncultured amniocytes in case 1 showed after using the Aneuvision probes LSI 13 and LSI21 (Vysis), a normal pattern for the probe used for chromosome 21 was specific (red). 15 out of 102 and 87 out of 102 analyzed Nuclei showed two and three specific green signals for the probe LSI 13. There were 71 out of 102 interphase nuclei two of the three signals co-localized (2 + 1) and in 16 cell nuclei they appeared as three clearly separated signals (3). The GTG Banding showed that in this case a duplication of the Area 13q14-q21 (arrow head) the reason for the three for Chromosome 13 was specific signals and not a free one Trisomy 12.

(B) Obtained with an X centromere specific probe Results

Die für das X-Zentromer spezifische Sonde (cep X; Vysis) ergab im Fall 2 an nicht-kultivierten Amniocyten die folgenden Ergebnisse: Keine Signale in 2 von 76 untersuchten Interphase- Zellkernen, ein Signal in 56 von 76, zwei Signale in 12 von 76, drei Signale in 5 von 76 und vier Signale in 1 von 76. Der Verdacht, dass diese Ergebnisse von einem Heteromorphismus herrührten, konnte durch die Analyse kultivierter Amniocyten bestätigt werden. Dabei ergaben sich ungewöhnlich starke Kreuzhybridisierungen an den Chromosomen 1, 12 und 17. The probe specific for the X centromer (cep X; Vysis) showed in case 2 on uncultured amniocytes, the following Results: No signals in 2 of 76 interphase examined Nuclei, one signal in 56 out of 76, two signals in 12 out of 76, three signals in 5 of 76 and four signals in 1 of 76. The Suspected that these results from a heteromorphism by analyzing cultured amniocytes beeing confirmed. The results were unusually strong Cross hybridizations on chromosomes 1, 12 and 17.

(C) Probe set according to the invention

Beispiel für einen auf jeweils mindestens zwei Sonden beruhenden Sondensatzes, bei dem für die Chromosomen X, Y, 13, 18 und 21 für einen pränatalen FISH-Schnelltest jeweils mindestens zwei lokusspezifische Einzelkopie-Sonden verwendet werden. Die verwendeten Sonden sind als schwarze Balken auf der rechten Seite jedes Chromosoms dargestellt. Dieser (oder ein ähnlicher) Probensatz, bei dem vorzugsweise 5 unterschiedliche Fluorochrome gleichzeitig verwendet werden, vermeidet alle bisher aufgetauchten Probleme hinsichtlich diagnostischer Zuverlässigkeit. Example for one on at least two probes based set of probes, for the chromosomes X, Y, 13, 18 and 21 for a prenatal FISH rapid test, respectively at least two location-specific single copy probes are used become. The probes used are shown as black bars on the shown on the right side of each chromosome. This (or a similar) sample set, in which preferably 5 different Fluorochrome used at the same time avoids all Problems with diagnostic problems that have arisen so far Reliability.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Diagnoseverfahren zur Darstellung von chromosomenspezifischen Signalen oder Chromosomenabberationen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Chromosomen im Interphasekern durch in situ-Hybridisierung mindestens mit folgenden lokusspezifischen markierten Nukleinsäuresonden charakterisiert werden:

a) für die Chromosomen X, Y und 18 je eine oder mehr lokusspezifische Nukleinsäuresonde für den langen und kurzen Chromosomenarm; und/oder
b) für die Chromosomen 13 und 21 jeweils zwei oder mehr lokusspezifische Nukleinsäuresonden für den langen Chromosomenarm.

The present invention thus relates to a diagnostic method for displaying chromosome-specific signals or chromosome aberrations, which is characterized in that chromosomes in the interphase nucleus are characterized by in situ hybridization using at least the following locus-specific labeled nucleic acid probes:

a) for chromosomes X, Y and 18 one or more location-specific nucleic acid probes for the long and short arm; and or
b) for chromosomes 13 and 21, two or more locus-specific nucleic acid probes for the long chromosome arm.

Der Fachmann kennt geeignete Verfahren zur Durchführung einer in situ-Hybridisierung an Interphasekernen und diese sind z. B. beschrieben in den folgenden Literaturstellen: Raff, R. and Schwanitz G., (2001) Int. J. Hum. Genet., 1, 65-75. Review; Liehr, T. et al, Prenat Diagn 21: 419-421; Weremowicz, S. et al., Prenat Diagn 21: 262-269; Tepperberg, J. et al., Prenat Diagn 21: 293-301; Lier, T. et al., Int J Mol Med 3: 11-14. Der Fachmann kennt auch geeignete Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuresonden. Zu diesen Markierungen zählen Markierungen, die den Nachweis einer stattgefundenen Hybridisierung über ein radioaktives, fluoreszenzabhängiges, magnetisches, spektroskopisches, massenspektrometisches, biosensorisches, photometrisches Verfahren oder konfokale Lasermikroskopie erlauben. The person skilled in the art knows suitable methods for carrying out a in situ hybridization on interphase cores and these are e.g. B. described in the following references: Raff, R. and Schwanitz G., (2001) Int. J. Hum. Genet., 1, 65-75. Review; Liehr, T. et al, Prenat Diagn 21: 419-421; Weremowicz, S. et al., Prenat Diagn 21: 262-269; Tepperberg, J. et al., Prenat Diagn 21: 293-301; Lier, T. et al., Int J Mol Med 3: 11-14. The person skilled in the art also knows suitable methods for marking Nucleic acid probes. These markings include markings, which provide evidence of a hybridization that has taken place radioactive, fluorescence-dependent, magnetic, spectroscopic, mass spectrometric, biosensory, Allow photometric method or confocal laser microscopy.

Der hier verwendete Ausdruck "lokusspezifische Nukleinsäuresonde" bezieht sich auf Nukleinsäuresonden, die mit einem Bereich eines Chromosoms hybridisieren, der einem Gen, vorzugsweise einem in Einzelkopie vorliegenden Gen entsprechen kann. The term "locus-specific." Nucleic Acid Probe "refers to nucleic acid probes that use a Hybridize a region of a chromosome that corresponds to a gene preferably correspond to a single copy of the gene can.

Der Fachmann kennt auch geeignete Chromosomen-Bereiche, die zur Entwicklung von Sonden geeignet sind, die die vorstehenden Bedingungen erfüllen; siehe dazu auch Verlinsky und Kuliev (2000), An Atlas of Preimplantation Genetic Diagnosis: An illustrated teaxtbook and reference for clinicians (The Encyclopedia of Visual Medicine Series), Parthenon Pub Group); Fung et al., Hum. Genet. 107 (2000), 615-622. Zur Gewährleistung einer eindeutigen Hybridisierung weisen die Nukleinsäuresonden vorzugsweise eine Länge von mindestens etwa 10 Kilobasen, mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Kilobasen und am meisten bevorzugt etwa 20-30 Kilobasen auf. The person skilled in the art also knows suitable chromosome regions which are used for Development of probes suitable for the above Satisfy conditions; see also Verlinsky and Kuliev (2000), An Atlas of Preimplantation Genetic Diagnosis: An illustrated teaxtbook and reference for clinicians (The Encyclopedia of Visual Medicine Series), Parthenon Pub Group); Fung et al., Hum. Genet. 107: 615-622 (2000). To guarantee the nucleic acid probes show a clear hybridization preferably a length of at least about 10 kilobases, more preferably at least about 20 kilobases and most preferred about 20-30 kilobases.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Diagnsoseverfahrens werden Nukleinsäuresonden verwendet, die mit folgenden Chromosomen-Bereichen hybridisieren:

a) für das Chromosom X mit dem Bereich Xp11.2-Xpter und/oder Xq12-Xqter hybridisieren; und/oder
b) für das Chromosom Y mit dem Bereich Yp11.2-Ypter und/oder Yq11.2-Yq11.23; und/oder
c) für das Chromosom 13 mit dem Bereich 13p12-13q21 und/oder 13q21-13qter; und/oder
d) für das Chromosom 18 mit dem Bereich 18p11.2-18pter und/oder 18q11.2-18qter; und/oder
e) für das Chromosom 21 mit dem Bereich 21q11.2-21q21 und/oder 21q21-21qter.

In a preferred embodiment of the diagnosis method according to the invention, nucleic acid probes are used which hybridize with the following chromosome regions:

a) hybridize for the region Xp11.2-Xpter and / or Xq12-Xqter for chromosome X; and or
b) for the chromosome Y with the region Yp11.2-Ypter and / or Yq11.2-Yq11.23; and or
c) for chromosome 13 with the range 13p12-13q21 and / or 13q21-13qter; and or
d) for chromosome 18 with the range 18p11.2-18pter and / or 18q11.2-18qter; and or
e) for chromosome 21 with the range 21q11.2-21q21 and / or 21q21-21qter.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), das dem Fachmann bekannt ist. Der Fachmann kennt auch geeignete Fluorochrome (z. B. Aminomethylkumarinessigsäure (blau), Tetramethyl-rhodaminisothiocyanat (rot), Fluoresceinisothiocyanat (grün), Cyanin 5 (gelborange) und Cyanin 5.5 (nahe infrarot), sowie Verfahren zur Fluorochrom- Markierung der Nukleinsäuresonden und diese sind auch z. B. in Nederlof et al., Cytometry 10 (1989), 20-27, Henegariu et al., Nat Biotechnol 18 (2000), 345-348, Nimmakayalu et al., Biotechniques 28 (2000), 518-522, Tanke et al., Cytometry 33 (1998), 453-459 beschrieben. Schließlich sind Fluorochrommarkierte Nukleinsäuresonden auch kommerziell erhältlich und dazu zählen z. B. die Sonden des "MultiVision"-Kit von Vysis (Vysis Inc., 3100 Woodcreek Drive, Downers Grove IL 60515-5400, U.S.A.). In a further preferred embodiment, this is based inventive method on a Fluorescence in situ hybridization (FISH) known to those skilled in the art. The expert also knows suitable fluorochromes (e.g. Aminomethylcoumarin acetic acid (blue), tetramethyl rhodamine isothiocyanate (red), Fluorescein isothiocyanate (green), cyanine 5 (yellow orange) and Cyanine 5.5 (near infrared), and methods for fluorochrome Labeling of the nucleic acid probes and these are also e.g. B. in Nederlof et al., 1989 Cytometry 10, 20-27, Henegariu et al., Nat Biotechnol 18 (2000), 345-348, Nimmakayalu et al., Biotechniques 28 (2000), 518-522, Tanke et al., Cytometry 33 (1998), 453-459. Finally are Fluorochrome-labeled nucleic acid probes are also commercially available and these include e.g. B. the probes of the "MultiVision" kit from Vysis (Vysis Inc., 3100 Woodcreek Drive, Downers Grove IL 60515-5400, UNITED STATES.).

Am meisten bevorzugt ist eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens, bei dem die FISH als Mehrfarben- FISH (mFISH) durchgeführt wird, wobei vorzugsweise mindestens 3, mehr bevorzugt mindestens fünf unterschiedliche Fluorochrome bzw. Liganden zur spezifischen DNA-Markierung verwendet werden (Speicher und Eils, BIOspektrum 2 (1998), 84-86; Speicher, ECA Newsletter 7 (2001), 3-7). Most preferred is an embodiment of the Diagnostic method according to the invention, in which the FISH as a multi-color FISH (mFISH) is carried out, preferably at least 3, more preferably at least five different fluorochromes or ligands can be used for specific DNA labeling (Speicher und Eils, BIOspektrum 2 (1998), 84-86; Speicher, ECA Newsletter 7 (2001), 3-7).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der mindestens 10 erfindungsgemäße Nukleinsäuresonden enthält. Der Kit kann weiterhin geeignete Reagenzien zum Nachweis von Markierungen oder zur Markierung positiver und negativer Kontrollen, Waschlösungen, Verdünnungspuffer etc. enthalten. The present invention also relates to a kit for Implementation of the method according to the invention, the at least 10 contains nucleic acid probes according to the invention. The kit can furthermore suitable reagents for the detection of markings or to mark positive and negative controls, Wash solutions, dilution buffers etc. included.

Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren eignet sich für eine Reihe von zytogenetischen Untersuchen, z. B. für die Translokationsdiagnostik in der Tumorzytogenetik, die pränatale Schnelldiagnostik, für die Translokations- und Aneuploidie- Diagnostik in der Tumorzytogenetik (sowohl an archivierten und frischen Schnittpäperaten als auch an Suspensionspräperaten), die pränatale Schnelldiagnostik sowie jegliche Art von Interphase-Analysen, wobei dessen Verwendung für die pränatale Schnelldiagnostik bevorzugt ist. Der Fachmann kennt die Indikationen für einen pränatalen Schnelltest (z. B. erhöhtes Alter der Schwangeren, d. h. 38 Jahre oder älter, vorangegangene Schwangerschaft mit einer numerischen Chromosomenanomalie, bei einem Triple-Test ermitteltes erhöhtes Risiko für Trisomie 18 oder 21, bei einer Amniozentese erst nach der 18. Schwangerschaftwoche, bei einem auffälligen Ultraschallbefund mit Hinweis auf Chromosomenanomalie, etc.) und ist mit der Durchführung eines pränatalen Schnelltests bzw. der Probengewinnung (ausreichende Fruchtwassermenge, Verwerfung eines kleines Teils des Fruchtwassers zur Vermeidung von Kontamination mit mütterlichen Zellen, Vermeidung blutiger Proben etc.) vertraut. The diagnostic method according to the invention is suitable for a Series of cytogenetic studies, e.g. B. for the Translocation diagnostics in tumor cytogenetics, the prenatal Rapid diagnostics, for translocation and aneuploidy Diagnostics in tumor cytogenetics (both on archived and fresh cut and suspension preparations), prenatal rapid diagnosis as well as any kind of Interphase analyzes, using it for prenatal Rapid diagnosis is preferred. The expert knows that Indications for a prenatal rapid test (e.g. increased Age of pregnant women, d. H. 38 years or older, previous Pregnancy with a numeric chromosomal abnormality, at an increased risk of trisomy 18 determined using a triple test or 21, for amniocentesis only after the 18th Week of pregnancy, if there is an abnormal ultrasound finding with reference to chromosomal abnormality, etc.) and is associated with the Carrying out a prenatal rapid test or the Sampling (sufficient amniotic fluid, warping a small part of the amniotic fluid to avoid Contamination with maternal cells, avoidance of bloody ones Samples etc.).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. The following examples illustrate the invention.

example 1 Results from a usual prenatal Routine FISH rapid diagnostic (A) Case 1

Es wurde eine pränatale Diagnose an einer 23 Jahre alten Frau durchgeführt, bei der der Verdacht auf Turner-Syndrom aufgrund einer Hyposomie und des Karyotyps 45,X[2]/46,XX[78] bestand, der 15 Jahre zuvor diagnostiziert worden war. Die Amniozentese wurde 16 Wochen + 1 Tag nach Gestation durchgeführt. Die in Fig. 1 (A + B) dargestellten Aufnahmen wurden mit einem Zeiss- Axioplan-Mikroskop (Zeiss Jena, Jena, Deutschland) mittels des digitalen "IKAROS"- und "ISIS" FISH-Aufnahmesystems (MetaSystems, Altlussheim, Deutschland) unter Verwendung einer XC77 CCD-Kamera von Sony mit Ein-Chip-Integration erstellt. A prenatal diagnosis was made to a 23 year old woman suspected of having Turner syndrome due to hyposomy and karyotype 45, X [2] / 46, XX [78] who had been diagnosed 15 years earlier. Amniocentesis was performed 16 weeks + 1 day after gestation. The images shown in Fig. 1 (A + B) were taken with a Zeiss Axioplan microscope (Zeiss Jena, Jena, Germany) using the digital "IKAROS" and "ISIS" FISH recording systems (MetaSystems, Altlussheim, Germany) Using an XC77 CCD camera created by Sony with one-chip integration.

Die Interphase-FISH in kultivierten Amnionzellen ergab drei Signale für die Sonde LSI13 (lokalisiert in 13q14) (LSI13 ist kommerziell erhältlich bei Vysis, vorst.) in 86 von 102 Zellkernen (84%), was ein Indiz für Trisomie 13 ist (Fig. 1A). Die GTG-Bandierung an den kultivierten Zellen aus der Amnionflüssigkeit ergab zwar keinen Hinweis auf vollständige Trisomie 13, erbrachte aber für Chromosom 13 den Nachweis für eine Duplikation des Bereichs 13q14-q21 (Fig. 1A). Bei der erneuten Analyse des Objektträgers mit den nicht-kultivierten Amnionzellen konnte in 83% der Zellkerne mit drei Signalen eine Co-Lokalisation von zweien der drei für Chromosom 13 spezifischen Signale nachgewiesen werden. Dies ist in Übereinstimmung mit einer Rate von etwa 80% für Co-Lokalisation der LSI21-Sonde (lokalisiert in 21q 22.13-q22.2) bei einer Translokations-Trisomie 21, während bei einer freien Trisomie 21 die Rate einer zufälligen Co-Lokalisation mit etwa 40% bestimmt werden konnte. Da die gleiche Duplikation auch bei der Mutter der Patientin nachgewiesen werden konnte, die, bis auf die Hyposomie, klinisch unauffällig war, wurde die Schwangerschaft nicht abgebrochen. Interphase FISH in cultured amniotic cells gave three signals for the probe LSI13 (localized in 13q14) (LSI13 is commercially available from Vysis, sup.) In 86 out of 102 cell nuclei (84%), which is an indication of trisomy 13 ( FIG. 1A). The GTG banding on the cultured cells from the amniotic fluid did not indicate complete trisomy 13, but provided evidence for a duplication of the region 13q14-q21 for chromosome 13 ( FIG. 1A). When the slide with the uncultured amnion cells was analyzed again, 83 signals of the cell nuclei were able to detect a co-localization of two of the three signals specific for chromosome 13 with three signals. This is in agreement with a rate of approximately 80% for co-localization of the LSI21 probe (localized in 21q 22.13-q22.2) with a translocation trisomy 21, while with a free trisomy 21 the rate of random co-localization with about 40% could be determined. Since the same duplication could also be demonstrated in the patient's mother, who, except for the hyposomy, was clinically normal, the pregnancy was not terminated.

(B) Case 2

Einer 35 Jahre alten Frau wurde aufgrund ihres Alters in der 15. Schwangerschaftswoche (+ 2 Tage) eine Amniozentese angeraten. Die pränatale Schnelldiagnose der Interphasen-Nuklei ergab für jede analysierte Zelle (n = 76) für die Chromosomen 13, 18 und 21 jeweils zwei Signale und ein für das Y-Chromosom spezifisches Signal. Die für das X-Zentromer spezifische Sonde CEPX (lokalisiert in Xp11.1-q11.1) ergab jedoch folgendes verdächtiges Ergebnis: Kein Signal in 3%, 1 Signal in 74%, 2 Signale in 7% und 4 Signale in 1% der Zellen (Fig. 1B). Da aufgrund zusätzlicher schwacher grüner Signale in allen analysierten Zellen von einem Heteromorphismus ausgegangen wurde, wurde der Frau das Ergebnis für das X-Chromosom nicht mitgeteilt. Wie erwartet konnten bei der GTG-Bandierung keine Zellen mit mehr als einem X-Chromosom nachgewiesen werden. Zur Klärung des Ursprungs der zusätzlichen grünen Signale in den Interphasen-Nuklei wurde die gleiche für das X-Chromosom spezifische Sonde mit Metaphasen-Chromosomen der kultivierten Amniocyten hybridisiert. In jedem Metaphase-Nukleus und in vielen Interphase-Nuklei konnten an den Chromosomen 12 und 17 Signale beobachtet werden, die stärker als üblich waren, und ungewöhnlicherweise Signale an einem Chromosom 1 (Fig. 1B). A 35-year-old woman was advised to undergo amniocentesis due to her age in the 15th week of pregnancy (+ 2 days). Prenatal rapid diagnosis of the interphase nuclei resulted in two signals and one signal specific to the Y chromosome for each cell analyzed (n = 76) for chromosomes 13, 18 and 21. The CEPX probe specific for the X centromere (localized in Xp11.1-q11.1), however, gave the following suspicious result: no signal in 3%, 1 signal in 74%, 2 signals in 7% and 4 signals in 1% of the Cells ( Fig. 1B). Because heteromorphism was assumed in all analyzed cells due to additional weak green signals, the woman was not informed of the result for the X chromosome. As expected, no cells with more than one X chromosome could be detected in the GTG banding. To clarify the origin of the additional green signals in the interphase nuclei, the same probe specific for the X chromosome was hybridized with metaphase chromosomes of the cultured amniocytes. In each metaphase nucleus and in many interphase nuclei, signals that were stronger than usual were observed on chromosomes 12 and 17, and unusually signals on chromosome 1 ( FIG. 1B).

(C) conclusion

Beide Fälle zeigen, dass die mit den bisherigen Sonden durchgeführte pränatale Interphasen-FISH-Schnelldiagnose nicht zuverlässig ist. Both cases show that with the previous probes Prenatal interphase FISH rapid diagnosis was not carried out is reliable.

Example 2 With the FISH test according to the invention results obtained

Aufgrund der in Beispiel 1 beschriebenen und weiteren in der Literatur beschriebenen falsch-positiven oder falsch-negativen FISH-Befunde wurde geschlossen, dass bei einer pränatalen FISH- Schnelldiagnose die Verwendung von jeweils nur einer Sonde für die fünf fraglichen Chromosomen nicht ausreichend ist, sondern mit einem anderen Sondensatz, so wie er beispielsweise in Fig. 1C dargestellt ist, gearbeitet werden sollte. Somit wurden bei der Verwendung zweier lokusspezifischer Einzelkopie-Sonden pro Chromosom, z. B. die in Fig. 1C gezeigten Sonden, sämtliche Probleme vermieden, die sonst bei der Verwendung alphoider Sonden (Heteromorphismusn) oder lediglich einer lokusspezifischen Sonde pro Chromosom auftraten. On the basis of the false-positive or false-negative FISH findings described in Example 1 and further described in the literature, it was concluded that in the case of rapid prenatal FISH diagnosis, the use of only one probe for the five chromosomes in question is not sufficient, but rather with another set of probes, such as shown in FIG. 1C, should be used. Thus, when using two location-specific single copy probes per chromosome, e.g. B. the probes shown in Fig. 1C, avoided all problems that otherwise occurred when using alphoid probes (heteromorphisms) or only one location-specific probe per chromosome.

Claims

1. Diagnostic method for displaying chromosome-specific signals or chromosome aberrations, characterized in that chromosomes in the interphase nucleus are characterized by in situ hybridization with at least the following locus-specific labeled nucleic acid probes:

a) for the chromosomes X, Y and 18 each a locus-specific nucleic acid probe for the long and short chromosome arm and / or

b) for the chromosomes 13 and 21 each two location-specific nucleic acid probes for the long chromosome arm.

2. Diagnostic method according to claim 1, wherein for the chromosome X nucleic acid probes are used that match the area Hybridize Xp11.2-Xpter and / or Xq12-Xqter.

3. Diagnostic method according to claim 1 or 2, wherein for the Chromosome Y nucleic acid probes used with the Hybridize area Yp11.2-Ypter and / or Yq11.2-Yq11.23.

4. Diagnostic method according to one of claims 1 to 3, wherein 13 nucleic acid probes can be used for the chromosome with the range 13p12-13q21 and / or 13q21-13qter hybridize.

5. Diagnostic method according to one of claims 1 to 4, wherein 18 nucleic acid probes can be used for the chromosome with the range 18p11.2-18pter and / or 18q11.2-18qter hybridize.

6. Diagnostic method according to one of claims 1 to 5, wherein can be used for chromosome 21 nucleic acid probes that with the range 21q11.2-21q21 and / or 21q21-21qter hybridize.

7. Diagnostic method according to one of claims 1 to 6, the Fluorescence in situ hybridization (FISH) based.

9. The diagnostic method of claim 7, wherein the FISH is a Multicolor FISH (mFISH) is.

9. Diagnostic kit for performing the procedure according to one of claims 1 to 9, the at least 10 Nucleic acid probes as defined in the preceding claims contains.

10. Use of those defined in claims 1 to 8 Nucleic acid probes or the kit according to claim 9 for one prenatal rapid test.