CN102374981B - 用于分离在光学设备的光路中的检测信号的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于分离在光学设备的光路中的检测信号的方法，其中不同的信号按所限定的时间顺序形成，该方法的特征在于，基于已知的或者可测定的/可确定的时间顺序对信号进行抑制或者分隔。

Description

用于分离在光学设备的光路中的检测信号的方法

技术领域

本发明涉及一种用于分离在光学设备的光路中的检测信号的方法，其中不同的信号按所限定的时间顺序形成。

在此，完全一般地涉及一种用于分离在光学设备的光路中的检测信号的方法，而不管具体的应用/使用。在此重要的是，不同来源和品质的检测信号按时间顺序形成。光学设备例如可以是荧光显微镜、尤其是共焦的激光显微镜。为了使用荧光显微镜，利用相对应的颜料来标记生物样品。通常利用激光激励这些颜料来发射。出于摄像的目的而检测荧光。

不利的是如下反射：这些反射直接在样品表面上形成，并且在激励光从一种光学介质过渡到另一光学介质时（例如在从空气向玻璃过渡或者反之亦然时）形成。最终在此形成干扰性的杂散光。

此外有问题的是，荧光比进行激励的激光弱大约一百万倍。

因而为了进行成像基本的是，将所反射的激励光或杂散光与荧光或其信号尽可能有效地彼此分离。

在此处要说明的是，在这里基本上涉及分离在光学设备的光路中的检测信号，并且仅仅示例性地提及荧光显微镜。因此，当涉及分离“混合的”按所限定的时间顺序形成的检测信号时，始终能应用根据本发明的方法。

背景技术

从实践中公知不同的方法，以便在之前提及的例子中（即在荧光显微镜中）将激励光/杂散光与进行成像或者分析所需的荧光（即其信号）相分离。为此，在检测光路中使用分束器或者声光元件。激励光/杂散光与荧光的可区分性通过其相对于彼此偏移的波长来使用。在此重要的是，荧光通常具有比杂散光大的波长。

在实践中也已经常见的是，通过在光学部件、尤其是在玻璃上的抗反射涂层来使所不希望的反射最小化。通过这些（被动）措施能将所反射的光的比例从百分之几降低到百分之零点几。然而，这并不足够。

此外，在实践中公知，通过光学陷波滤波器抑制所不希望的反射光。该滤波器同样使用在反射光/杂散光和荧光情况下的波长偏移。在使用陷波分离滤器的情况下，对反射光/杂散光的抑制达到直至8和更高的光密度，其中为7的光密度对应于大约0.00001%的透射。同时荧光的透射可直至99%以上。

在上述实施方案的光中，在使用在实践中公知的方法的情况下可能的是，在固定的激励波长下将干扰性的反射光/杂散光与令人感兴趣的荧光有效地分离。然而，如果使用带有多个所限定的激光辐射线的系统，其中顺序地或甚至同时地利用多个波长来激励这些激光辐射线，则上面所提及的方法不足够。这归因于：反射信号可处于颜料的荧光带中。在该情况下，滤波或分离导致荧光信号的损失。此外，在此会需要陷波滤波器或分束器的组合。这完全极大地提高了相对应的设备的成本。此外，在紧邻的（eng zusammenliegend）线的情况下，效率通常不足够。

尤其是在应用所谓的白光激光器的情况下得到缺点，越来越多地采用所述白光激光器归因于：所述白光激光器的波长可以在确定的范围中（例如在470nm到670nm之间的范围中）任意调节。对反射光/杂散光的可变且在此有效的抑制根据目前的现有技术无法实现，尤其至今对于固定的或所限定的波长仅存在陷波滤波器。

发明内容

因而，本发明基于以下任务：给出一种用于分离在光学设备的光路中的检测信号的方法，据此能利用简单的有关仪器的（apparative）装置在令人感兴趣的部分信号的良好效率的情况下足够良好地分离可限定的检测信号或检测信号的可限定的区域。

上述任务通过权利要求1的特征来解决。此后，在特别的情形下构造形成前序部分的（gattungsbildende）方法，据此即在光学设备的光路中按所限定的时间顺序形成不同的信号。根据本发明的方法的特征在于，基于已知的或者可测定的（ermittelbar）/可确定的时间顺序对信号进行抑制或者分隔，使得可以以足够良好的效率将令人感兴趣的被分离的信号用于其它目的。

再次要说明的是，基于检测信号形成的时间序列，此处基本上涉及检测信号的分离。在此，该方法首先对于检测信号的时间序列由何引起不起作用。该方法对于出于何种目的对信号进行分离或分隔也不起作用。

与在实践中已知的方法相反，此处与时间有关地工作，即在了解不同信号的时间顺序的情况下或者通过测定不同信号的时间顺序来工作。

基本上，检测信号可以是任意类型的信号。存在大量具体应用，据此检测信号是荧光和反射光/杂散光，其中在那里在上述实施方案的光中的分隔的问题具有十分特别的意义。

相对应地，按照根据本发明的方法可以利用脉动的激励光激励适于发射荧光的样品，使得基于脉动的激励而要预期荧光和反射光/杂散光的所限定的时间序列。无论如何，荧光从样品中被发射，并且反射光/杂散光在样品上并且在光学系统上或在光学系统中被散射。不仅荧光信号而且反射信号都按相对于激励光的脉冲在时间上被限定的序列形成，使得荧光和激励光的分离可以基于信号的时间序列、即通过时间分隔来进行。

荧光信号能被用于极其不同的应用。这样，荧光信号可以用于测量，例如用于在荧光关联光谱学（FKS，Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie）的范围中的测量。在这种应用的范围中，从荧光强度的波动中获得信息。例如测量不同的扩散的样本之间的扩散常数、浓度和接合。共焦的荧光显微镜在此得到应用。

同样，可以将荧光信号用于荧光使用寿命显微镜学（FLIM（Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie）技术），即在使用离子敏感的荧光颜料的情况下使用荧光信号。在此，涉及测量样品中的细胞间的离子浓度。在此使用如下认知：荧光使用寿命（电子在被激励的状态下的平均停留持续时间）随着离子浓度而改变。

以十分特别有利的方式中可以将被分隔的或被清理的荧光信号用于进行成像，尤其是在优选的共焦的荧光显微镜的情况下用于进行成像。在此，涉及在使用掺杂有颜料的样品的发射能力的情况下的高分辨率的成像。

基本上可以为了应用根据本发明的方法而实现一种装置，尤其是在荧光显微镜的情况下实现，据此荧光和反射光在检测光路中（即从荧光样品通过光学系统到来）射到检测器上。撞击到那的光子被转换为电信号并且可以在连接在下游的积分器中被积分（aufintegrieren）或被合计并且为了进行成像而与像点相关。这样，根据本发明的方法与现有技术的区别在于：在检测器之后，尤其是在检测器和积分器之间，反射信号被分隔或被滤出。如上面已经介绍的那样，滤出或分隔以时间序列进行，即在了解荧光信号和反射信号/杂射光信号的时间序列的情况下进行。

以十分特别有利的方式，将反射信号从荧光信号滤出或与荧光信号分离可以通过门电路（Gate）进行，该门电路的运行与激励光的脉冲同步。换言之，激励光的脉冲用于驱动引起分离或滤出的部件，其中基本上可能的是，将不需要的或者干扰性的信号（例如反射信号）完全滤出，或者将不同的信号彼此分离，以便将这些信号输送给例如独立的积分器。

特别的同步信号可以用于同步，该特别的同步信号直接在激光驱动器上被截取。同样可考虑的是，直接或间接测定检测信号，例如通过检测器、尤其是通过快速光电二极管来测定。这直接在激励光上或在激励光的一小部分上发生。最后，在激励光上或在激励光中被测量。

以其它有利方式，门控信号在时间上被校准到荧光信号上，即以便可以实现明确的信号选择和随后的检测的相关。门控信号的校准可以以十分特别简单的方式通过适配激光器或光电二极管与门电路或者分向滤波器（Weiche）之间的线缆长度来进行。就这点而言，术语“门控信号”在最广泛的意义上被理解，即完全一般地关于对实现分离或滤除的设备进行驱动来理解。

也可考虑的是，门控信号通过同步信号的优选地可变的电子延迟来校准，即在使用相对应的电子设备的情况下来校准。门控信号的这种时间校准可以有关仪器地被单独调节，即在使用相对应的电子装置的情况下来调节。

附加地或者可替换地也可考虑的是，通过用户或者自动化地借助软件改变电子同步信号。这可以在优化的范围中进行。

基本上可考虑的是，利用唯一的同步信号驱动一个检测器或者两个或多个检测器。尤其是当应（以不同的途径）进一步处理不同的信号时，有利的是：提供至少两个同步信号，以便对带有不同的检测光的至少两个检测器进行供给或实际上将对于相应的检测器确定的信号（并且仅仅将这些信号）滤除或分离以及输送给检测器。

对于根据本发明的方法，相对于荧光显微镜有意义的是，光源以脉动方式工作。在此，另一有优点是：将交替脉动的光源用作光源，即以便可以产生不同类型和品质的检测信号。所需要的同步信号可以根据上述实施方案被截取或被产生。

在开头已经介绍的是，白光激光器的使用带来如下优点：波长在确定的范围中可以近乎任意地被调节。因此，白光激光器通过如下方式提供激励中的灵活性的巨大优点：即可以以不同的波长范围进行照明或激励。

此外有利的是，利用多个被限定的激光线顺序地或者同时地激励，使得就这点而言也保证使用该方法的设备的最大灵活性。

为了检测光信号，例如为了在荧光显微镜的情况下检测荧光信号，可以使用光子计数检测器。同样，能使用光电倍增器。任意类型的检测器可以根据具体需求被采用。

也可以将雪崩光电二极管（APD，Avalanche Photodiode）用作检测器。

门控信号的触发可以在光子计数信号的边沿上进行。

此外，使用恒定系数鉴别器（Constant Fraction Discriminator）是可能的，以便实现与信号大小无关的时间触发，尤其是在使用PMT的情况下实现。

门控持续时间的可变调节对于最优地适配相应的应用同样是可能的并且就这点而言特别有利。

不是门电路而是使用分向滤波器，即以便将信号分隔而不是抑制信号。这样能将反射信号与荧光信号分隔或者在交替的激励的情况下将不同颜色分隔。

附图说明

现在存在以有利的方式构造和改进本发明的教导的不同可能性。为此，一方面参考从属于权利要求1的权利要求，并且另一方面参考下面借助附图对本发明的优选扩展方案的阐述。结合借助附图对本发明的优选扩展方案的阐述，也阐述了本教导的一般优选的扩展方案和改进方案。在附图中，

图1以示意图示出了在共焦显微镜中的所检测的反射信号和荧光信号的周期性重复的时间序列，以及

图2以示意图自上而下地示出了根据图1的周期性重复的时间信号序列、用于门控和门电路的输出信号的控制信号的变化曲线，并且

图3以示意性视图示出了按照根据本发明的方法工作的光学设备的功能元件的共同作用。

具体实施方式

图1以示意图示出了分别检测到的反射信号/杂射光信号和荧光信号的周期性重复的时间序列，如这些信号在共焦的荧光显微镜中出现的那样。该图是无可置疑的。该图从来自样品的反射信号开始。此后接着是连续地超过持续时间展平的荧光信号，并且此后接着是来自显微镜的反射信号，其中该反射信号被理解为至下一主脉冲或反射信号的预脉冲（Vorpuls）。最后，此处涉及带有周期性复原的序列的连续图示。

对于图1中的图示重要的是，不仅荧光信号而且反射信号距激励激光脉冲都具有在时间上固定的间隔。因此可能的是，以根据本发明的方式基于相应的脉冲的已知的或者可测定的或可确定的时间顺序进行对相应信号的抑制或者分隔，并且更确切而言不管如下事实：在此是否具体地涉及在共焦的荧光显微镜情况下的反射信号和荧光信号或者另外涉及如所限定的在时间上能被分隔的不同信号。

图2在上部图示中示出了带有两个周期的根据图1的周期性重复的时间序列。最终涉及检测信号。由检测信号得到的电信号根据控制信号而被门控。负责门控的信号在其下的图示中示出。

根据所实现的门控，基于例如直接在激励光上测定的同步信号，可以在门电路上限定输出，如在下部图中示出那样，即据此仅仅还保留荧光分量或带有衰减的曲线的荧光信号。

在此处还要说明：除了通过门控抑制反射之外，与根据本发明的教导结合的其他应用也是可能的。这样，例如可以以出众的方式将交替的光源、例如带有轮流脉动工作的红色激光器和蓝色激光器的光源组合，其中相应的荧光信号彼此是可分离的。这样，可以利用仅仅一个检测器来彼此无关地检测两个信号。不是在确定的时间通过门控抑制信号，而是此处通过分向滤波器将信号在时间上相关地分布到两个积分器上。

串扰的信号被减小。这样，一定比例的例如蓝色的激光除了蓝色颜料之外附加地激励红色颜料，并且反之亦然。在确定的应用中，该效果对测量结果发生干扰作用。通过检测信号的时间门控而可能的是，检测器除了波长之外也与激光脉冲相关。这会意味着，负责红光的检测器在时间上对于如下荧光信号是“盲的”：这些荧光信号由在时间上错移地脉动的蓝色激光器产生，并且反之亦然。任意的其他应用是可考虑的。

图3以示意图示出了使用根据本发明的方法的光学设备的基本结构和作用方式。

用于进行荧光激励的激光1通过脉动的激光器2而可供使用。用作激励光/照明光的激光1通过合适的光学系统3到达样品4，其中在此可以涉及生物样品。样品4用发荧光的颜料来标记。相对应地，激光1激励位于样品4中的荧光颜料发光。返回的光（下面出于简化原因称为检测光5）一方面包括由荧光颜料的发射得到的荧光6而另一方面包括来自样品4的反射光7。检测光5穿过或者通过光学系统3，其中反射光7被补充了来自光学系统3的其他反射或散射。因此，补充了其他反射或散射的反射光7与荧光6共同到达检测器8。

不同于传统的光学设备，在检测器8与对检测器8的电信号进行积分或合计的积分器9之间设置有门电路10，该门电路10可以通过同步信号11将不同的信号按所限定的时间顺序从由检测光得到的总信号中滤出或者彼此分离。无论如何，门电路10与激励光的脉冲同步，其中同步信号11可以直接在激光驱动器上被截取。

由此，到达积分器9的仅仅还有通过门电路10被允许的或未被滤出的信号，在这里所选择的共焦的荧光显微镜的实施例中仅仅还有如下荧光信号，这些荧光信号在积分器9中被合计并且被用于紧接着的图像生成12。

在本发明的其他有利的扩展方案方面，为了避免重复而参考本说明书的发明内容部分以及随附的权利要求书。

最后要明确指出，上面的本发明的描述仅仅用于讨论所要求保护的教导，然而本发明不限于这些描述。

附图标记列表

1 激光

2 脉动的激光

3 光学系统

4 样品、生物样品

5 检测光

6 荧光（5的部分）

7 反射光（5的部分）

8 检测器

9 积分器

10 门电路、门控

11 同步信号

12 图像生成

Claims (22)

1.一种用于分离在光学设备的光路中的检测信号的方法，其中利用脉动的激励光激励适于发射荧光的样品，荧光从样品中被发射并且反射光在样品上和在光学系统上或在光学系统中被散射，并且其中不仅荧光信号而且反射信号都以相对于激励光的脉冲在时间上被限定的序列来形成，因此不仅荧光信号而且反射信号距激励激光脉冲都具有在时间上固定的间隔，其特征在于，荧光和激励光的分离基于信号的时间序列来进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，荧光和激励光的分离通过信号的时间分隔来进行。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，检测信号是由荧光和反射光/杂散光得到的信号。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，荧光信号用于测量，或者荧光信号被用于进行成像。

5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光信号用于在荧光关联光谱学或者荧光使用寿命显微镜学的范围中进行测量。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光信号在共焦的荧光显微镜的情况下被用于进行成像

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中荧光和反射光射到检测器上，并且由撞击到检测器上的光子得到的电信号在连接在下游的积分器中被积分或被合计并且与像点相关，其特征在于，在检测器和积分器之间滤出反射信号，其中滤出通过门电路进行。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，门电路的运行与激励光的脉冲同步。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，直接在激光驱动器上被截取的同步信号或者通过检测器在激励光测定的同步信号用于同步。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述检测器是快速光电二极管。

11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，门控信号在时间上被校准到荧光信号上。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，门控信号的校准通过适配激光器与门电路之间的或者激光器与分向滤波器之间的线缆长度来进行。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，门控信号的校准通过适配光电二极管与门电路之间的或者光电二极管与分向滤波器之间的线缆长度来进行。

14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，门控信号通过同步信号的电子延迟来校准。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述电子延迟是可变的电子延迟。

16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，同步信号的电子延迟借助软件来校准。

17.根据权利要求9至16之一所述的方法，其特征在于，提供至少两个同步信号，以便供给带有不同的检测光的至少两个检测器。

18.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，交替脉动的光源被用作光源。

19.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，激光光源被用作光源。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述激光光源是白光激光器。

21.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，利用多个被限定的激光线顺序地或者同时地来激励。

22.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，光子计数检测器和/或光电倍增器被用作检测器。