本発明は、植物のＲｓｖ４遺伝子に関連しており、植物へのポティウイルス抵抗性付与に有用な遺伝情報およびその用途に関する。 The present invention is related to the Rsv4 gene of the plant, on the usefulness of genetic information and its use in potyvirus resistance-conferring to the plant.

ポティウイルスとしては、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ（スイセン黄色条斑ウイルス）、Ｓｃａｌｌｉｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＴｕＭＶ、カブモザイクウイルス）、Ｊａｐａｎｅｓｅ ｙａｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ヤマノイモモザイクウイルス）、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｆｅａｔｈｅｒｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ（サツマイモ斑紋モザイクウイルス）、Ｐｌｕｍ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ（ウメ輪紋ウイルス）、Ｋｏｎｊａｃ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（コンニャクモザイクウイルス）、Ｌｅｔｔｕｃｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（レタスモザイクウイルス）、Ｙａｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｃｌｏｖｅｒ ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｖｉｒｕｓ（クローバ葉脈黄化ウイルス）、Ｂｅａｎ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（インゲンマメ黄班モザイクウイルス）、Ｌｅｅｋ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ、Ｔｈｕｎｂｅｒｇ ｆｒｉｔｉｌｌａｒｙ ｖｉｒｕｓ、Ｌｉｌｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ、Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ａ（ジャガイモＡウイルス）、Ｔｏｂａｃｃｏ ｖｅｉｎ ｍｏｔｔｌｉｎｇ ｖｉｒｕｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ、Ｗｉｌｄ ｐｏｔａｔｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｖ（ジャガイモＶウイルス）、Ｐｅｒｕ ｔｏｍａｔｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｐｅｐｐｅｒ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ（トウガラシ斑紋ウイルス）、Ｐｅｐｐｅｒ ｓｅｖｅｒｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ（ＰＶＹ，ジャガイモＹウイルス）、Ｖｅｒｂｅｎａ ｖｉｒｕｓ Ｙ、Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎａｌ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｉｌｌｉ ｖｅｉｎａｌ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ、Ｗｉｌｄ ｔｏｍａｔｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ ｖｅｉｎ ｂａｎｄｉｎｇ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（タバコ脈緑モザイクウイルス）、Ａｌｇｅｒｉａｎ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｐａｐａｙａ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ（パパイア輪点ウイルス）、Ｄａｐｈｎｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｐａｐａｙａ ｌｅａｆ－ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（パパイア奇形葉モザイクウイルス）、Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（スイカモザイクウイルス）、Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＳＭＶ、ダイズモザイクウイルス）、Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｙ ｖｉｒｕｓ Ｙ、Ｅａｓｔ Ａｓｉａｎ Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｖｉｒｕｓ（トケイソウ東アジアウイルス）、Ｔｅｌｏｓｍａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｂｅａｎ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＢＣＭＶ、インゲンマメモザイクウイルス）、Ｂｅａｎ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ ｍｉｌｄ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｄａｓｈｅｅｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（サトイモモザイクウイルス）、Ｚｕｃｃｈｉｎｉ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ズッキーニ黄斑モザイクウイルス）、Ｂａｓｅｌｌａ ｒｕｇｏｓｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｂｅｅｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｐｅａｎｕｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｂａｎａｎａ ｂｒａｃｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｐｅａ ｓｅｅｄ－ｂｏｒｎｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（エンドウ種子伝染モザイクウイルス）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ソルガムモザイクウイルス）、Ｍａｉｚｅ ｄｗａｒｆ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）、Ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（サトウキビモザイクウイルス）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎｇｒａｓｓ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ｃｏｃｋｓｆｏｏｔ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ、Ｓｈａｌｌｏｔ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ、Ｏｎｉｏｎ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ（タマネギ萎縮ウイルス）、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｖｉｒｕｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓが例示される。 The potyvirus, Narcissus yellow stripe virus (narcissus yellow streak virus), Scallion mosaic virus, Turnip mosaic virus (TuMV, turnip mosaic virus), Japanese yam mosaic virus (yam mosaic virus), Sweet potato feathery mottle virus (sweet potato mottle mosaic virus), plum pox virus (plum zonate spot virus), konjac mosaic virus (konjac mosaic virus), lettuce mosaic virus (lettuce mosaic virus), Yam mosaic virus, clover yellow vein virus (clover yellow vein virus), Bean yellow mosaic virus (Phaseolus vulgaris macular mosaic virus), Leek yellow stripe virus, Thunberg fritillary virus, Lily mottle virus, potato virus A (potato A virus), Tobacco vein mottling virus, Tobacco etch virus, Wild potato mosaic virus, potato virus V ( potato V virus), Peru tomato mosaic virus, pepper mottle virus (pepper mottle virus), pepper severe mosaic virus, potato virus Y (PVY, potato virus Y), Verbena virus Y, pepper veinal mottle virus, Chilli veinal mottle virus, Wild tomato mosaic virus, tobacco vein banding mosaic virus (tobacco pulse green mosaic virus), Algerian watermelon mosaic virus, papaya ringspot virus (papaya ringspot virus), Daphne mosaic virus, papaya leaf-distortion mosaic virus (papaya leaf-distortion mosaic virus), watermelon mosaic virus (watermelon mosaic virus), soybean mosaic virus (SMV, soybean mosaic virus), Wisteria vein mosaic virus, Fritillary virus Y, East Asian passiflora virus (passion flower east Asia virus), Telosma mosaic virus, Bean common mosaic virus (BCMV , kidney bean mosaic virus), Bean common mosaic necrosis virus, Zantedeschia mild mosaic virus, Dasheen mosaic virus (taro mosaic virus), zucchini yellow mosaic virus (zucchini yellow mosaic virus), Basella rugose mosaic virus, Beet mosaic virus, Peanut mosaic virus, Banana bract mosaic virus, pea seed-borne mosaic virus (pea seed borne mosaic virus), sorghum mosaic virus (sorghum mosaic virus), maize dwarf mosaic virus (corn atrophy mosaic virus), sugarcane mosaic virus (sugar cane mosaic virus), Pennisetum mosaic virus, Johnsongrass mosaic virus, Cocksfoot streak virus, Shallot yellow stripe virus, onion yellow dwarf virus (onion dwarf virus), Narcissus degeneration virus, Hordeum mosaic virus, Agropyron mosaic virus is exemplified.

〔ポリヌクレオチドおよびタンパク質〕 [Polynucleotides and proteins]
本発明のポリヌクレオチドは、植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。 The polynucleotide of the present invention is a polynucleotide encoding a protein capable of imparting potyvirus resistance to plants. ポリヌクレオチドとは、通常、ヌクレオチドの重合体を意味する場合があり、通常は単離されたポリヌクレオチドである。 The polynucleotide typically may mean a polymer of nucleotides, usually isolated polynucleotide. ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）であってもよい。 The polynucleotide can be DNA or RNA (such as mRNA). ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。 The DNA, genomic DNA, genomic DNA library, cDNA, cDNA library, and synthetic DNA and the like. ライブラリーに使用するベクターに特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが例示される。 There is no particular limitation on the vector used for the library, a bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like are exemplified. ＤＮＡおよびＲＮＡは、特に断らない限り、２本鎖及び１本鎖のいずれでもよい。 DNA and RNA unless otherwise specified, may be either double stranded or single stranded. １本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡは、特に断らない限り、コード鎖（センス鎖）でも、非コード鎖（アンチセンス鎖）でもよい。 Single-stranded DNA and RNA, unless otherwise specified, be the coding strand (sense strand) may be a non-coding strand (antisense strand).
本発明において、タンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、例えば以下を意味する。 In the present invention, a polynucleotide encoding a protein, refers to for example the following. 該ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合には、該ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含む発現ベクターを原核細胞又は細胞真核細胞、好ましくは植物細胞に導入したときに、該ＤＮＡが転写された結果提供されるｍＲＮＡが、又は該ＲＮＡの細胞内でのスプライシングの結果提供される成熟ｍＲＮＡが翻訳されることにより、該タンパク質が生産されるようなＤＮＡを意味する。 If the polynucleotide is DNA, the DNA or prokaryotic or eukaryotic cell expression vector comprising said DNA, mRNA preferably provided when introduced into a plant cell, results in which the DNA has been transferred but or mature mRNA that is provided splicing results in cells of the RNA is by being translated, it means DNA that said protein is produced. また、該ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合には、該ＲＮＡを細胞内に導入したときに、該ＲＮＡが、又は細胞内でのスプライシングの結果提供されたＲＮＡが翻訳されることにより該タンパク質が生産されるようなＲＮＡを意味する。 Further, when the polynucleotide is RNA, when the RNA is introduced into a cell, the RNA is, or the protein by results offered RNA splicing in a cell are translated production It refers to an RNA, such as those.
本発明において、「単離された」ポリヌクレオチドとは、天然において該ポリヌクレオチドと共存している他の細胞内構成成分、たとえば、リボゾーム、ポリメラーゼや他のゲノムＤＮＡと実質的に分離されたポリヌクレオチドをいう。 In the present invention, the term "isolated" polynucleotide, other intracellular components coexisting with the polynucleotide in nature, e.g., ribosomes, is substantially separated with a polymerase and other genomic DNA poly It refers to a nucleotide. また、「単離された」ポリヌクレオチドには、天然から分離されたポリヌクレオチドばかりでなく、組換えポリヌクレオチドや化学的に合成されたポリヌクレオチドが含まれる。 Further, the "isolated" polynucleotide is not only polynucleotide separated from nature include recombinant polynucleotides and chemically synthesized polynucleotides.

ポリヌクレオチドは、化学的に合成されたポリヌクレオチドであってもよい。 Polynucleotide may be chemically synthesized polynucleotides. 化学的な合成方法としては、リン酸トリエステル法を利用する化学的合成法、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を利用する方法が例示される。 The chemical synthesis methods, chemical synthesis method utilizing the phosphoric acid triester method, a method utilizing polymerase chain reaction (PCR) and the like. 市販のポリヌクレオチド改変キットとしては、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などが例示される。 Commercially available polynucleotide modification kits, QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit (Toyobo), etc. Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech) are exemplified.

本発明のポリヌクレオチドには、配列番号１４から１６に記載されたポティウイルス抵抗性ダイズ品種のＲｓｖ４ゲノム遺伝子の全体又はその一部であってＲｓｖ４タンパク質コーディング領域全体の配列を含むＤＮＡが含まれる。 Polynucleotides of the invention include DNA comprising a Rsv4 protein coding region overall sequence all or a part of the Rsv4 genomic gene of the potyvirus resistant soybean cultivars described in SEQ ID NO: 14 16.
本発明のポリヌクレオチドには、下記（ｃ）から（ｅ）に示すＤＮＡが含まれる： Polynucleotides of the invention include DNA shown from the following (c) to (e):
（ｃ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ (C) DNA comprising any one of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 3
（ｄ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質をコードするＤＮＡ (D) hybridizing SEQ ID NO: 1 by DNA under stringent conditions comprising any one of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of 3, and encodes a protein that can confer potyvirus resistance to plant DNA
（ｅ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列と９０％以上の同一性を有し、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質をコードするＤＮＡ (E) have any one of the nucleotide sequence identity of 90% or more from SEQ ID NO: 1 3, and encodes a protein that can confer potyvirus resistance to plant DNA

配列番号１の塩基配列は、ダイズ品種Ｐｅｋｉｎｇから得たＲｓｖ４遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。 Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of the coding region of Rsv4 gene obtained from soybean cultivar Peking. 配列番号２の塩基配列は、ダイズ品種ＢｙｏuｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１から得たＲｓｖ４遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。 Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence of the coding region of Rsv4 gene obtained from soybean cultivars ByoutouShushitou1. 配列番号３の塩基配列は、ダイズ品種Ｆｕｋｕｓｅｎｎａｒｉから得たＲｓｖ４遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。 Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is the nucleotide sequence of the coding region of Rsv4 gene obtained from soybean cultivars Fukusennari. よって、（ｄ）および（ｅ）は、（ｃ）の変異体、誘導体、バリアント、またはホモログを意味する。 Therefore, (d) and (e) means variant, derivative, variant or homolog of (c).

抵抗性ダイズ品種のＲｓｖ４ゲノム遺伝子のタンパク質コーディング領域には１つのイントロン領域が挿入されている。 One intron regions in the protein coding region of Rsv4 genomic gene resistant soybean cultivars are inserted. 配列番号１～３のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡは、抵抗性ダイズ品種のＲｓｖ４ゲノム遺伝子のタンパク質コーディング領域に挿入されているイントロン領域の配列を含まないため、ｃＤＮＡに対応する。 DNA comprising any of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1-3, because it does not contain the sequence of intron regions which are inserted into the protein coding region of Rsv4 genomic gene resistant soybean cultivars, corresponds to the cDNA. したがって、（ｃ）～（ｅ）は、天然に存在するポリヌクレオチドではない。 Thus, (c) ~ (e) is not a polynucleotide found in nature.

（ｄ）においてストリンジェントな条件とは、塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件を言う。 The stringent conditions in the step (d), the polynucleotide double-stranded specific for the nucleotide sequence is formed, it refers to conditions under which non-specific double-stranded polynucleotide is not formed. 換言すれば、同一性が高いポリヌクレオチド同士、例えば、完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃低い温度、好ましくは１０℃低い温度、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件とも言える。 In other words, identity is high polynucleotide to each other, for example, perfectly matched hybrid of the melting temperature (Tm value) from 15 ℃ low temperature, preferably at 10 ℃ low temperature, more preferably in the range of up to 5 ℃ low temperature also it can be said that the conditions that hybridizes under temperature. ストリンジェントな条件としては、以下の条件が挙げられる：６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件下でハイブリダイズする条件；及び、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＤＳの条件下で１６～２４時間ハイブリダイズする条件。 As the stringent conditions include the following conditions: 6M urea, 0.4% SDS, conditions hybridizes under conditions of 0.5 × SSC; and, 6M urea, 0.4% SDS, 0. 1 × conditions in 16 to 24 hours hybridizing conditions of SDS. 当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１０ Ｓｋｙｌｉｎｅ Ｄｒｉｖｅ Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９８９））等の文献を参照すれば、このような遺伝子を容易に取得できる。 Those skilled in the art, Molecular Cloning (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)) by reference to the literature such as if, such genes can be easily acquired. ポリヌクレオチドの塩基配列は、ジデオキシ法等の方法により決定され得る。 Nucleotide sequence of the polynucleotide may be determined by the method of dideoxy method.

（ｅ）において塩基配列の同一性は、塩基配列全体又は機能発現に必要な領域で９０％以上であり、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。 The identity of the nucleotide sequences in (e) is a in the region necessary for the nucleotide sequence all or functional expression of 90% or more, for example 91% or more, 92% or more, 93% or more, be 94% or more or 95% or more , preferably at least 96%, more is preferably 97% or more, still more preferably at least 98%, even more preferably 99% or more. 塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ［Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ． The identity of the nucleotide sequence, BLAST [Karlin, S. ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ． & Altschul, S. Ｆ． F. （１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅｓ． (1990) Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes. Ｐｒｏｃ． Proc. Ｎａｔｌ． Natl. Ａｃａｄ． Acad. Ｓｃｉ． Sci. ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ． USA 87: 2264-2268, Karlin, S. ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ． & Altschul, S. Ｆ． F. （１９９３）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ－ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．” Ｐｒｏｃ． (1993) "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences." Proc. Ｎａｔｌ． Natl. Ａｃａｄ． Acad. Ｓｃｉ． Sci. ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７］等のアルゴリズムを用いて決定でき、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ等のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）を利用しても決定できる。 USA 90:. 5873-5877] can be determined using an algorithm such as, BLASTN, BLASTX or the like on the program (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W & Lipman, D . ". Basic local alignment search tool" .J (1990) J.Mol.Biol.215: 403-410) can also be determined using. ＢＬＡＳＴＸを用いて配列を決定する際のパラメーターとしては、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３が例示される。 The parameters for determining the sequence using BLASTX, score = 50, wordlength = 3 is illustrated. ＢＬＡＳＴＮを用いて配列を決定する際に用いるパラメーターとしては、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２が例示される。 The parameters used in determining sequence using BLASTN, score = 100, wordlength = 12 is illustrated. ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いればよい。 When utilizing BLAST and Gapped BLAST programs may be used with default parameters of the respective programs.

本発明のタンパク質、すなわち、植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質は、その変異体、誘導体、バリアント又はホモログを含み、例えば以下の（ａ）から（ｂ）に示すタンパク質が挙げられる： Proteins of the present invention, i.e., proteins that can impart potyvirus resistance to plants, variants, derivatives, comprise variants or homologues include proteins that instance the following (a) to (b):
（ａ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質（ｂ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質 (A) having any of the amino acid sequence identity of 90% or more from the protein (b) SEQ ID NO: 6 8 comprising any of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 to 8, and a potyvirus resistance to plants It can grant protein

配列番号６のアミノ酸配列は、ダイズ品種Ｐｅｋｉｎｇから得たＲｓｖ４タンパク質のアミノ酸配列である。 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence of Rsv4 protein obtained from the soybean varieties Peking. 配列番号７の塩基配列は、ダイズ品種ＢｙｏuｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１から得たＲｓｖ４タンパク質のアミノ酸配列である。 The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of Rsv4 protein obtained from the soybean varieties ByoutouShushitou1. 配列番号８のアミノ酸配列は、ダイズ品種Ｆｕｋｕｓｅｎｎａｒｉから得たＲｓｖ４タンパク質のアミノ酸配列である。 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of Rsv4 protein obtained from the soybean varieties Fukusennari. よって、（ｂ）は（ａ）の変異体、誘導体、バリアントまたはホモログを意味している。 Therefore, (b) it is meant mutants, derivatives, variants or homologs of (a).

（ｂ）において、変異後のアミノ酸残基においては、変異前のアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが好ましい。 (B), the in the amino acid residues after the mutation, it is preferable that the properties of the amino acid side chains prior to mutation are stored. アミノ酸を側鎖の性質により分類すると、以下のとおりである：疎水性アミノ酸（アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、バリン（Ｖ）等）；親水性アミノ酸（アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）等）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）等）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）等）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）等）；カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）等）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）等）；酸含有側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）等）；β位分岐側鎖を有するアミノ酸（トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）等）；及び、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）等）。 If the amino acids classified by the nature of the side chain are as follows: hydrophobic amino acids (alanine (the A), substituting any of isoleucine (I), Leucine (L), Methionine (M), phenylalanine (F), proline (P), tyrosine (Y), tryptophan (W), valine (V), etc.); hydrophilic amino acids (arginine (R), asparagine (N), aspartic acid (D), cysteine ​​(C), glutamic acid (E), glutamine (Q ), glycine (G), histidine (H), lysine (K), serine (S), threonine (T), etc.); amino acids having aliphatic side chains (glycine (G), alanine (the a), isoleucine (I ), leucine (L), valine (V), proline (P), etc.); amino acids with hydroxyl-containing side chain (serine (S), threonine (T), tyrosine (Y), etc.); a sulfur atom-containing side chains amino acid (cysteine ​​(C), methionine (M) or the like) having; amino acids having carboxylic acid- and amide-containing side chains (aspartic acid (D), asparagine (N), glutamine (Q), glutamic acid (E), etc.); a base amino acids having containing side chain (arginine (R), histidine (H), lysine (K), etc.); amino acids with an acid-containing side chains (aspartic acid (D), glutamic acid (E), etc.); beta-position-branched side chains amino acids with (threonine (T), valine (V), isoleucine (I), etc.); and amino acids having aromatic-containing side chain (histidine (H), phenylalanine (F), tryptophan (W), tyrosine (Y )etc).

本発明においてアミノ酸残基は、３文字記号または１文字記号で表すものとする。 Amino acid residues in the present invention, it is assumed that represented by three letter symbols or the one-letter symbols. 例えばチロシンは、３文字記号の場合「Ｔｙｒ」、１文字記号の場合「Ｙ」である。 For example tyrosine case three letter symbol "Tyr" is where the one-letter symbols "Y".

（ｂ）において、アミノ酸配列の同一性は、アミノ酸配列全体又は機能発現に必要な領域で９０％以上であり、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。 (B), the identity of the amino acid sequence is at the region necessary for the entire amino acid sequence or a functional expression of 90% or more, for example 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more or 95% or more There, preferably at least 96%, more is preferably 97% or more, still more preferably at least 98%, even more preferably 99% or more. アミノ酸配列の同一性の解析は、先述のＢＬＡＳＴ等のアルゴリズム、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ等のプログラムを用いて行えばよい。 Analysis of amino acid sequence identity is the algorithm such as the foregoing BLAST, BLASTN, may be performed using a program such as BLASTX.

本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質、および本発明のタンパク質の変異体、誘導体、バリアントまたはホモログは、以下の（ｆ）であってもよい： Variants of the protein of polynucleotide proteins encoded, and the present invention of the present invention, the derivative, variant or homologue may be a less (f):
（ｆ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質 (F) In any one of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 to 8, one or several amino acid residues, deletion, substitution, insertion and / or added in the amino acid sequence, potyvirus resistance to plants protein can be granted

（ｆ）において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されていてもよいアミノ酸残基数は、例えば５０個以内、４０個以内、３０個以内、２９個以内、２８個以内、２７個以内、２６個以内、２５個以内、２４個以内、２３個以内、２２個以内、２１個以内、１５個以内、１０個以内であり、好ましくは５個以内であり、より好ましくは４個以内であり、更に好ましくは３個以内であり、更により好ましくは２個以内であり、とりわけ好ましくは１個である。 In (f), deletion, substitution, insertion and / or addition of a good number of amino acid residues even if, for example within 50, within 40, within 30, within 29, within 28, within 27 , within 26, within 25, within 24, within 23, within 22, within twenty-one, within 15, it is within 10, preferably within five, more preferably within four There, more preferably within three, and in further preferably within two more, especially preferably one.

本発明において「植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質」とは、植物体内で該タンパク質を発現させた場合に該植物がポティウイルス抵抗性を示すタンパク質、好ましくは、防御反応を介さずにポティウイルスの増殖を遅延させることができるタンパク質である。 A "protein which can confer potyvirus resistance to plants" in the present invention, proteins that plant is potyvirus resistance when expressed the protein in plants, preferably, potyvirus not through a protective response is a protein that is capable of delaying the growth of the virus. 該タンパク質が有する植物へのポティウイルス抵抗性の付与活性は、（ａ）のタンパク質のポティウイルス抵抗性の付与活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上であることが好ましい。 Potyvirus resistance imparting activity to the plant to which the protein has a, (a) 50% of potyvirus resistance imparting activity of the protein or more, 60%, 70%, 80%, 90% or it is preferred that 95% or more.

本発明のタンパク質の変異体、誘導体、バリアントまたはホモログのアミノ酸配列は、配列番号６から８に示すアミノ酸配列の、配列番号６に示すタンパク質のアミノ酸配列の９９～２２１番目のアミノ酸配列、配列番号７に示すタンパク質のアミノ酸配列の９５～２１７番目のアミノ酸配列又は配列番号８に示すタンパク質のアミノ酸配列の１１１～２３３番目のアミノ酸配列に変異を有さず保持されていることが好ましく、配列番号６に示すタンパク質のアミノ酸配列の９９番目のアミノ酸残基と配列番号７に示すタンパク質のアミノ酸配列の９５番目のアミノ酸残基と配列番号８に示すタンパク質のアミノ酸配列の１１１番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸、配列番号６に示すタンパク質のアミノ酸配列の１４３番目のアミノ酸残基と配列番号７に示すタンパク質のアミノ酸配列の１３９番目のアミノ酸残基と配列番号８に示すタンパク質のアミノ酸配列の１５５番目のアミノ酸残基のグルタミン酸、配列番号６に示すタンパク質のアミノ酸配列の１６９番目のアミノ酸残基と配列番号７に示すタンパク質のアミノ酸配列の１６５番目のアミノ酸残基と配列番号８に示すタンパク質のアミノ酸配列の１８１番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸及び配列番号６に示すタンパク質のアミノ酸配列の２２１番目のアミノ酸残基と配列番号７に示すタンパク質のアミノ酸配列の２１７番目のアミノ酸残基と配列番号８に示すタンパク質のアミノ酸配列の２３３番目のアミノ酸残基のアスパラギンに変異を有さず保持されていることがさらに好ましい。 Variants of the protein of the present invention, the derivative, the amino acid sequence of the variant or homologue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 8, 99-221 amino acid sequence of the amino acid sequence of the protein shown in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 it is preferable held not have a mutation in the 111-233 amino acid sequence of the amino acid sequence of the protein shown 95 to 217-position amino acid sequence or SEQ ID nO: 8 amino acid sequence of the protein shown in, in SEQ ID nO: 6 99th aspartic acid in 111 amino acid residue of the 95th amino acid residue with the amino acid sequence of the protein shown in SEQ ID NO: 8 amino acid sequence of a protein shown in the amino acid residue SEQ ID NO: 7 amino acid sequence of proteins that, 155 amino acid residues of the amino acid sequence of a protein shown in the 139 th amino acid residue SEQ ID NO: 8 amino acid sequence of a protein shown in the 143 th amino acid residue SEQ ID NO: 7 amino acid sequence of the protein shown in SEQ ID NO: 6 glutamate, the protein shown in SEQ ID NO: 6 of 169 amino acid sequence of a protein shown in the amino acid residue SEQ ID NO: 7 proteins that 165 th amino acid residue SEQ ID NO: 8 amino acid sequence of the amino acid sequence 181 th amino acid sequence of a protein shown in the 217 th amino acid residue SEQ ID NO: 8 amino acid sequence of a protein shown in the 221 th amino acid residue SEQ ID NO: 7 amino acid sequence of the protein shown in aspartic acid and SEQ ID NO: 6 amino acid residues and more preferably it held not have a 233-th asparagine mutation of amino acid residues. 後段の実施例のとおり、この部分はＲｓｖ４タンパク質が有するＲＮＡ分解酵素活性の活性中心部分と推定されるため（図２、図１４）、この部分が保持されるタンパク質は変異前の活性を維持する可能性が高いためである。 As subsequent examples, because this part is estimated as active center portion of an RNA degrading enzyme activities of the Rsv4 protein (FIG. 2, FIG. 14), this portion protein that is retained to maintain the activity prior to mutation possibly because high.

タンパク質が植物にポティウイルス抵抗性を付与できるか否かの確認は、例えば、ポティウイルスに感受性の植物組織（ダイズ品種Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２など）中でタンパク質を発現させ、これに各種ポティウイルスを感染させて増殖の可否を調べることにより確認できる。 Confirmation protein is whether it is possible to grant the potyvirus resistance in plants, for example, the sensitivity of the plant tissue to potyvirus (such as soybean varieties Williams82) proteins were expressed in, which were infected with various potyviruses to growth whether or not it can be confirmed by examining the. 植物組織中でのタンパク質の発現は、例えば、一過性発現系にて行うことができる。 Expression of proteins in plant tissue, for example, can be carried out by transient expression system. 一過性発現系としては例えば、実施例のように、適当な発現ベクター中にタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み込み、該組換えベクターをアグロバクテリウムに導入し、ポティウイルスに感受性の植物組織に該アグロバクテリウムを注入する発現系が挙げられる。 The transient expression system for example, as in Example incorporates a polynucleotide encoding a protein into an appropriate expression vector, introducing the recombinant vector into Agrobacterium, the sensitivity of the plant tissue to potyvirus expression system for injecting the Agrobacterium and the like. また別の態様として、ポティウイルス感受性植物のゲノムＤＮＡにポリヌクレオチドを導入する安定した発現系にて行うことができる。 As another embodiment, it is possible to perform in a stable expression system for introducing a polynucleotide into the genomic DNA of potyvirus sensitive plants. ポティウイルスの感染方法としては例えば、実施例のようにアグロバクテリウムを利用してポティウイルスのｃＤＮＡを植物組織中で発現させること、または、ポティウイルス粒子あるいは感染葉破砕液を常法により葉組織に接種することが挙げられる。 As a method of infection potyvirus, for example, to express the cDNA of potyviruses using Agrobacterium as in Example in plant tissues, or, leaf tissue by a conventional method potyviruses particles or infected leaf lysate and the like be inoculated to.

本発明のタンパク質がポティウイルス抵抗性を付与する対象となる植物は、ポティウイルスが感染する可能性のある植物であればよく、双子葉植物及び単子葉植物のいずれであってもよい。 Plant protein of the present invention are subject to impart potyvirus resistance may be any plant that might potyvirus is infected may be either dicotyledonous plants and monocotyledonous plants. 双子葉植物としては、ダイズ属植物（ダイズなど）、ナス属植物（ジャガイモ、ナス、トマトなど）、トウガラシ属植物（ピーマンなど）、タバコ属植物（タバコなど）、アブラナ属植物（カブ、カリフラワー、カラシナ、セイヨウナタネなど）スイセン属植物（ニホンズイセン、ラッパズイセンなど）、ヤマノイモ属植物（ヤマノイモなど）、サツマイモ属植物（サツマイモなど）、サクラ属植物（ウメ、アンズ、サクラなど）、コンニャク属植物（コンニャクなど）、アキノノゲシ属（レタスなど）、シャジクソウ属植物（クローバーなど）、インゲンマメ属植物（インゲンマメなど）、ネギ属植物（ネギ、タマネギなど）、ユリ属植物（ヤマユリ、オニユリなど）、パパイア属植物（パパイアなど）、スイカ属植物（スイカなど）、トケイソウ属植物（パッションフルーツなど）、ササゲ属植物（ササゲなど）、カボチャ属植物（カボチャ、ズッキーニなど）、ツルムラサキ属植物（ツルムラサキなど）、エンドウ属植物（エンドウなど）、ワタ属（ワタなど）、ウマゴヤシ属（アルファルファなど）、ナデシコ属（カーネーションなど）、バラ属（バラなど）、フダンソウ属（テンサイなど）が例示される。 The dicotyledonous plants (such as soy) soybean plant of the genus, Solanum plants (potatoes, eggplant, tomatoes, etc.), (such as pepper) Capsicum plants, (such as tobacco) tobacco plant of the genus, Brassica plant (turnip, cauliflower, mustard, oilseed such as rapeseed) Narcissus plant (Nihonzuisen, such as daffodil), such as yam plants of the genus (yam), such as the sweet potato plants of the genus (sweet potato), Prunus plant (plum, apricot, and cherry), konjac plant of the genus (konjac, etc. ), such as Lactuca (lettuce), such as Trifolium plants (clover), such as Phaseolus plant (Phaseolus vulgaris), Allium plants (green onion, onion, etc.), lily plants of the genus (gold-banded lily, such as Tiger), papaya plants of the genus (papaya etc.), watermelon plants of the genus (such as watermelon), such as passion flower plants of the genus (passion fruit), such as cowpea plants of the genus (cowpea), pumpkin plants of the genus (squash, such as zucchini), Malabar spinach plants of the genus (such as Malabar spinach), pea plants of the genus ( peas, etc.), such as the cotton genus (cotton), such as Medicago genus (alfalfa), such as Dianthus (carnation), such as the genus Rosa (rose), chard genus (such as sugar beet) are exemplified. 単子葉植物としては、オランダカイウ属植物（オランダカイウなど）、サトイモ属植物（サトイモなど）、トウモロコシ属植物（トウモロコシなど）、サトウキビ属植物（サトウキビなど）、チカラシバ属植物（チカラシバなど）、イネ属（イネなど）、コムギ属（コムギなど）、オオムギ属（オオムギなど）が例示される。 As monocots, calla plants of the genus (Calla Lilies, etc.), (such as taro) taro plant of the genus, corn plants of the genus (such as corn), (such as sugar cane) sugar cane plant of the genus, Pennisetum alopecuroides plants of the genus (such as Pennisetum alopecuroides), the genus Oryza (such as rice), (such as wheat) Triticum, barley genus (such as barley) are exemplified. このうち、双子葉植物が好ましく、ダイズ属植物、ナス属植物、アブラナ属植物、インゲンマメ属植物がより好ましく、ダイズ属植物がより好ましい。 Of these, preferably dicotyledonous plants, soybean plants of the genus, Solanum plant, Brassica plant, more preferably Phaseolus plants, soybean plants of the genus is more preferable.

本発明のタンパク質、および本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよい。 Proteins of the present invention, and proteins encoded by the polynucleotide of the present invention may be a coupled fusion protein via a heterologous moiety and peptide bonds. 異種部分としては、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（Ｎｕｓ－ｔａｇなど）、シャペロンとして働くペプチド成分（トリガーファクターなど）、他の機能を有するペプチド成分（全長タンパク質またはその一部など）およびリンカーが例示される。 The heterologous moiety, peptide component having a peptide component which facilitates purification of the target protein, a peptide component for improving the solubility of the target protein (Nus-tag, etc.), (such as the trigger factor) peptide component acting as a chaperone, other functions (such as the full length protein or a portion thereof) and linkers are exemplified. 目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分としては、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩなどのタグ部分；および、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などの目的タンパク質の精製に利用されるタンパク質が例示される。 As the peptide component that facilitates purification of the target protein, a histidine tag, a tag moiety such as Strep-tag II; and the proteins are exemplified utilized glutathione -S- transferase, the purification of the target protein such as maltose binding protein that.

本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、翻訳後修飾タンパク質、または翻訳後非修飾タンパク質であってもよい。 Proteins encoded by the polynucleotide of the present invention, post-translational modified proteins or may be a non-modified protein after translation,. これにより、宿主細胞の種類に応じて該タンパク質の産生を効率よく行うことができる。 Thus, it is possible to perform efficiently the production of the protein according to the type of host cell. 本発明のタンパク質は、真核生物であるダイズに由来するので、天然では翻訳後修飾（グリコシル化など）される可能性があると考えられる。 Proteins of the present invention, since derived from soy eukaryotic believed to naturally is likely to be post-translational modifications (such as glycosylation). 原核生物ではタンパク質が翻訳後修飾されないこと、および、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、下等真核生物などの生物では、タンパク質の翻訳後修飾が大きく異なることが一般に知られている。 That the protein in prokaryotes are not post-translationally modified, and, animal cells, plant cells, in insect cells, organisms, such as lower eukaryotes, the following proteins of the translational modifications differ greatly are generally known. したがって、天然で植物細胞に由来するタンパク質を、このような異種宿主細胞で産生させた場合、天然では生じ得ない、翻訳後非修飾タンパク質、または異なる翻訳後修飾を有するタンパク質を入手し得ると考えられる。 Therefore, considered that the proteins derived from the plant cell in nature, when produced in such a heterologous host cell, not occur in nature, may be obtained a protein having a non-modified protein or differential post-translational modification, post-translational It is.

本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質としては、ダイズに由来するタンパク質、天然に存在するそのホモログ、人為的に作出された変異タンパク質などが例示される。 The protein encoded by the polynucleotide of the present invention, proteins from soy and its homologs naturally occurring, such as artificially produced mutations protein is exemplified. 変異タンパク質は、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、得られる変異ＤＮＡを用いて変異タンパク質を産生させることにより、得ることができる。 Mutein, for example, introducing a mutation into the DNA encoding the desired protein, by the production of mutant proteins using the resulting mutant DNA, can be obtained. 変異導入法としては、部位特異的変異導入、および無作為変異導入処理（変異剤による処理、紫外線照射など）が例示される。 The mutagenesis, site-directed mutagenesis, and random mutagenesis treatment (treatment with a mutating agent, ultraviolet irradiation, etc.) are exemplified.

（ｃ）～（ｅ）において各ポリヌクレオチドを構成するコドンは、対応するアミノ酸をコードするコドンであればよい。 (C) codons constituting each polynucleotide in ~ (e) may be any codon encoding the corresponding amino acids. すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、以下の（ｇ）であってもよい： That is, polynucleotides of the present invention may be a less (g):
（ｇ）（ｃ）～（ｅ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。 (G) (c) ~ degenerate variant of a polynucleotide selected from the group consisting of (e).

「縮重変異体」とは、変異前のポリヌクレオチド中の所定のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンが、同一アミノ酸残基をコードする別のコドンに変更されたポリヌクレオチド変異体をいう。 By "degenerate variant", at least one codon encoding the predetermined amino acid residues in the polynucleotide before the mutation, refers to a polynucleotide variants that have changed to a different codon encoding the same amino acid residue . このような縮重変異体はサイレント変異に基づく変異体であることから、縮重変異体によりコードされるタンパク質は、変異前のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と同一である。 Such degenerate variants since it is a variant based on a silent mutation, the protein encoded by the degenerate variant is identical to the protein encoded by the polynucleotide before the mutation.

縮重変異体は、導入されるべき宿主細胞のコドン使用頻度に適合するようにコドンが変更されたポリヌクレオチド変異体であることが好ましい。 Degenerate variant is preferably a polynucleotide variant codon has been changed to fit the codon usage of the host cell to be introduced. これにより、遺伝子を異種宿主細胞（微生物など）で発現させる場合にも対応するｔＲＮＡ分子種が十分に供給され、翻訳効率および／または翻訳の正確さを維持または向上させることができる。 Accordingly, the genes are the corresponding tRNA species is sufficiently supplied even when expressed in a heterologous host cell (such as microorganisms), it is possible to maintain or improve the accuracy of the translation efficiency and / or translation.

縮重変異体がＲＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、縮重変異体がＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。 If a degenerate variant of RNA, but should nucleotide residue "U" is utilized, when the degenerate variant is DNA, to "T" is used in place of the nucleotide residues "U" it is. 宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、１～５００個、１～４００個、１～３００個、１～２００個、または１～１００個である。 Mutations number of nucleotide residues to adapt the codon usage of the host cell is not particularly limited so long as it encodes the same protein before and after mutation, for example, 1 to 500 1 to 400 1 to 300 , 1 to 200, or 1 to 100 pieces.

〔ベクター〕 〔vector〕
本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを有する。 Vectors of the present invention, comprising the polynucleotide of the present invention. ベクターは例えば、ポティウイルス抵抗性遺伝子を植物に導入するために利用することができる。 Vector, for example, a potyvirus resistance gene can be utilized for introduction into plants.

本発明のベクターは、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターのいずれであってもよく、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターおよび人工染色体のいずれであってもよい。 The vectors of the present invention, a cell-based vectors to express the protein in a host, and utilizing a protein translation system may be either a cell-free system vectors include plasmids, viral vectors, phage, embedded (integrative) vectors and artificial it may be any of a chromosome. 組込み型ベクターは、全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよく、その一部（本発明のポリヌクレオチドが発現するために必要な部分など）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。 Integrative vectors entirety may be a vector of the type that are incorporated into the genome of the host cell, only a portion thereof (such as portions necessary for the polynucleotide is expressed in the present invention) is integrated into the genome of the host cell it may be of a type vector. 発現ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。 Expression vector may be a DNA or RNA vector.

細胞系ベクターは、宿主に適した公知の発現ベクターであればよい。 Cell-based vector may be any known expression vector suitable for the host. 例えば、アグロバクテリウムのプラスミド（ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド）由来のバイナリーベクター、ｐＲＩ（ｐＲＩ１０１、ｐＲＩ２０１など）、ｐＵＣ（ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８など）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（ｐＢＲ３２２など）、ｐＨＳＧ（ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８など）、ＲＳＦ（ＲＳＦ１０１０など）、ｐＡＣＹＣ（ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４など）、ｐＭＷ（ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８など）、ｐＱＥ（ｐＱＥ３０など）およびそれらの誘導体が挙げられる。 For example, Agrobacterium plasmid (Ti plasmid or Ri plasmid) derived from the binary vector, (such as pRI101, pRI201) pRI, (such as pUC19, pUC18) pUC, pSTV, (such as pBR322) pBR, pHSG (pHSG299, pHSG298, pHSG399 , such as pHSG398), such as RSF (RSF1010), such as pACYC (pACYC177, pACYC184), such as pMW (pMW119, pMW118, pMW219, pMW218), such as pQE (pQE30) and their derivatives.

無細胞系ベクターとしては、Ｔ７またはＴ３プロモーターを有する発現ベクター、ＳＰ６プロモーターなどを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクターなどが例示される。 The cell-free system vectors, expression vectors having T7 or T3 promoters, such as wheat cell-free protein synthesis vector such as a pEU family plasmid having such SP6 promoter and the like.

ベクターには、転写を進める要素（プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、分泌シグナル配列、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）など）、選択マーカーなどの、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドが含まれていてもよい。 Vectors, elements to promote transcription (promoter, terminator, enhancer, a secretory signal sequence, splicing signal, polyadenylation signals, ribosome binding sequence (SD sequence)), such as selection markers, polynucleotides other than the polynucleotides of the present invention it may be included. 転写に必要な要素は、宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であればよく、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。 Necessary elements for the transcription may be any DNA sequence which shows transcriptional activity in the host cell, it can be appropriately selected depending on the type of host. 転写に必要な要素は、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結されていればよい。 Necessary elements for the transcription may if it is operably linked to a polynucleotide of the present invention.

プロモーターとしては、植物ウイルス由来プロモーター（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５ｓプロモーターなど）、植物由来プロモーター（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）アクチン２プロモーターなど）が挙げられる。 As a promoter, (such as the 35s promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV)) plant virus-derived promoters, plant-derived promoter (Arabidopsis thaliana (such as Arabidopsis thaliana) actin 2 promoter). プロモーターは、ダイズ以外の生物（微生物、動物、昆虫、植物、ウイルスなど）に由来するプロモーターであってもよい。 Promoter, other than the soybean organisms (microorganisms, animals, insects, plants, viruses, etc.) or may be a promoter from. このようなプロモーターとしては、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターなどが例示される。 Examples of such a promoter, PhoA promoter, PhoC promoter, T7 promoter, T5 promoter, T3 promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, PR promoter, PL promoter, SP6 promoter, arabinose inducible promoter, cold shock promoter , such as tetracycline-inducible promoter can be exemplified.

ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、エシェリヒア・コリｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターなどが例示される。 As the terminator, T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, terminator of tetracycline resistant gene, such as the terminator of Escherichia coli trpA gene is exemplified.

ポリアデニル化シグナルとしては、アグロバクテリウムＴｉプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のポリＡシグナル、カリフラワーモザイクウイルスのポリＡシグナル配列などが例示される。 The polyadenylation signal, a poly A signal of nopaline synthase gene derived from Agrobacterium Ti plasmid, such as poly (A) signal sequence of cauliflower mosaic virus is exemplified.

選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子（アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス、ビスピリバックソディウムなど）、蛍光タンパク質遺伝子（Ds-Red、EGFPなど）などが例示される。 The selection marker, drug resistance gene (ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, neomycin, hygromycin, bialaphos, bispyribac Soddy Umm, etc.), fluorescent protein gene (Ds-Red, EGFP, etc.), and the like. 本発明のベクターは、これらのポリヌクレオチドのうち１種有していてもよいし、２種以上有していてもよい。 Vectors of the present invention may have one of these polynucleotides may have two or more.

本発明のベクターの作成方法は特に限定されない。 Creating a vector of the present invention is not particularly limited. 例えば、挿入前のベクターに本発明のポリヌクレオチドおよび本発明のポリヌクレオチド以外の所望のポリヌクレオチドを作動可能に連結し挿入することにより得ればよい。 For example, it is if you get by a desired polynucleotide of a polynucleotide other than polynucleotides and the invention of the present invention operably linked to be inserted into the pre-insertion of the vector. 例えば、ポリヌクレオチドを制限酵素で切断し、ベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに連結または挿入することによりベクターを得る方法が挙げられる。 For example, cutting the polynucleotide with a restriction enzyme, a method may be mentioned of obtaining a vector by ligation or insertion into a restriction enzyme site or multicloning site of a vector. また、Ｇａｔｅｗａｙ ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）による組換えシステムを用いて所望のポリヌクレオチドが挿入されたベクターを得る方法が挙げられる。 Further, using recombinant system according to Gateway system (Invitrogen) desired polynucleotide include a method of obtaining the inserted vector.

〔形質転換体〕 [Transformants]
本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体である。 The transformant of the present invention is a transformant in which the polynucleotide of the present invention has been introduced.

ポリヌクレオチドが導入される宿主又は宿主細胞は、特に限定されない。 Host or host cell a polynucleotide is introduced is not particularly limited. 宿主または宿主細胞は、本発明のタンパク質および本発明のポリヌクレオチドが由来する生物と同種および異種のいずれでもよい。 Host or host cell may be any organism with homologous and heterologous derived polynucleotides protein and the invention of the present invention. 例えば、植物、細菌（大腸菌など）、酵母（サッカロミセス・セレビシエなど）、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられ、植物であることが好ましい。 For example, plants, bacteria (such as E. coli), (such as Saccharomyces cerevisiae) yeast, animal cells, insect cells and the like, preferably a plant. 植物の例および好ましい例は、ポリヌクレオチドの説明中における例および好ましい例と同様である。 Examples and preferred examples of plants are similar to the examples and preferable examples in the description of the polynucleotide. 植物は、植物の細胞、組織および植物体のいずれであってもよい。 Plants, plant cells, may be any one of the organization and the plant body.

本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを発現してタンパク質を産生できる宿主又は宿主細胞であればよく、例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを含む宿主、または宿主細胞が挙げられる。 The transformant of the present invention, the protein and expressing a polynucleotide of the present invention may be a host or host cell capable of producing, for example, the polynucleotide of the polynucleotide and operatively linked the present invention to that of the present invention host comprising a non-polynucleotide or host cell, and the like. 本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドの例および好ましい例は、本発明のベクターの説明にて示した例および好ましい例と同様である。 Examples and preferred examples of polynucleotides other than the polynucleotides of the present invention is the same as the examples and preferable examples shown in the description of the vectors of the present invention.

〔形質転換植物の作製方法〕 [Method for manufacturing a transgenic plant]
本発明の形質転換植物の作製方法は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを植物細胞内に導入することを含む。 Method for manufacturing a transgenic plant of the present invention, a polynucleotide or vector of the present invention of the present invention comprises introducing into a plant cell.

形質転換される植物としては、ポリヌクレオチドの説明中における例および好ましい例と同様である。 Examples of the plant to be transformed, the same as the examples and preferable examples in the description of the polynucleotide. 宿主又は宿主細胞への導入方法は特に限定されず、本発明のベクターを導入する方法、本発明のポリヌクレオチドをパーティクルガン法などで直接導入する方法が例示される。 Method of introducing into a host or host cell is not particularly limited, a method of introducing a vector of the present invention, a method for directly introducing a polynucleotide of the present invention or the like particle gun method and the like. 前者としては、本発明のベクターをエレクトロポレーション法などの方法によりアグロバクテリウム中に導入し、これを植物細胞と共培養して植物細胞に感染させる方法が例示される。 As the former, a vector of the present invention is introduced into Agrobacterium by a method such as electroporation method, which method of infecting and co-cultured with plant cells plant cells are exemplified.

〔マーカー〕 〔marker〕
本発明のポティウイルス抵抗性マーカーは、以下の（Ａ）～（Ｆ）である。 Potyvirus resistance marker of the present invention are the following (A) ~ (F).
（Ａ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７８２の塩基のＳＮＰマーカー（Ｂ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号９７７の塩基のＳＮＰマーカー（Ｃ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号１３９１から１７３０の塩基配列のＳＳＲマーカー（Ｄ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号６５９４のＳＮＰマーカー（Ｅ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７２７０のＳＮＰマーカー（Ｆ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号２００１から７５２９の塩基配列のＳＴＳマーカー From the base number 1391 of the nucleotide sequence of the base of the SNP markers (C) SEQ ID NO: 18 of the base number 977 of the base sequence of the base of the SNP markers (B) SEQ ID NO: 18 of the base number 782 of the base sequence of (A) SEQ ID NO: 18 SSR markers 1730 in the nucleotide sequence (D) of SEQ ID NO: 18 base sequence SNP markers of the nucleotide numbers 6594 of (E) SEQ ID NO: 18 base sequence SNP markers of the nucleotide numbers 7270 (F) of the base sequence of SEQ ID NO: 18 bases STS marker of the base sequence from the number 2001 7529

（Ａ）は、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカーであり、ダイレクトシークエンス法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、一塩基伸長法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ法、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法、ＬＡＭＰ法、ＤＮＡチップ、ビーズアレイ法、ＨＲＭ法等の方法で検出することができる。 (A) is a SNP (Single Nucleotide Polymorphism) markers, direct sequencing method, Invader method, TaqMan PCR method, single-base extension method, Pyrosequencing method, Exonuclease Cycling Assay method, PCR-RFLP method, LAMP method, DNA chip, bead array method can be detected by the method of HRM method. 後段の実施例の結果から明らかなとおり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合にはＴアレル、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合にはＣアレルである。 As it is clear from the results of subsequent embodiments, when the Rsv4 gene is expressed in T allele, if Rsv4 gene is not expressed is C allele. 従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。 Therefore, Rsv4 genetic marker, that is useful as a potyvirus resistance marker.

（Ｂ）は、ＳＮＰマーカーであり、（Ａ）で例示した方法により検出することができる。 (B) is a SNP markers can be detected by the method illustrated in (A). 後段の実施例の結果から明らかなとおり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合にはＡアレル、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合にはＧアレルである。 As is clear from the results of subsequent embodiments, when the Rsv4 gene is expressed in A allele, if Rsv4 gene is not expressed is G allele. 従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。 Therefore, Rsv4 genetic marker, that is useful as a potyvirus resistance marker.

（Ｃ）は、ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ）マーカーであり、該マーカーを含む部分を増幅することにより同定することができる。 (C) is a SSR (Simple Sequence Repeat) markers can be identified by amplifying a portion including the marker. 後段の実施例の結果から明らかなとおり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合には増幅断片長が３３６ｂｐ以下である。 As is clear from the results of the subsequent example, in the case of Rsv4 gene is expressed amplified fragment length is equal to or less than 336bp. 一方、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合には増幅断片長が３３７ｂｐ以上である。 On the other hand, if the Rsv4 gene is not expressed amplified fragment length is not less than 337 bp. 従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。 Therefore, Rsv4 genetic marker, that is useful as a potyvirus resistance marker.

（Ｄ）は、ＳＮＰマーカーであり、（Ａ）で例示した方法により検出することができる。 (D) is a SNP markers can be detected by the method illustrated in (A). 後段の実施例の結果から明らかなとおり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合にはＣアレル、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合にはＡアレルである。 As is clear from the results of the subsequent example, in the case of Rsv4 gene is expressed C allele, in the case of Rsv4 gene is not expressed is the A allele. 従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。 Therefore, Rsv4 genetic marker, that is useful as a potyvirus resistance marker.

（Ｅ）は、ＳＮＰマーカーであり、（Ａ）で例示した方法により検出することができる。 (E) is a SNP markers can be detected by the method illustrated in (A). 後段の実施例の結果から明らかなとおり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合にはＧアレル、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合にはＡアレルである。 As is clear from the results of the subsequent example, in the case of Rsv4 gene is expressed G allele, in the case of Rsv4 gene is not expressed is the A allele. 従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。 Therefore, Rsv4 genetic marker, that is useful as a potyvirus resistance marker.

（Ｆ）は、ＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｇｅｄ Ｓｉｔｅ）マーカーであり、該マーカーを含む部分の増幅により検出することができる。 (F) is an STS (Sequence Tagged Site) markers can be detected by amplification of the portion containing the marker. Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合には増幅断片長が３ｋｂｐ以下であり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合には増幅断片長が５ｋｂｐ以上である。 If the Rsv4 gene is expressed is the amplified fragment length 3kbp less, if the Rsv4 gene is not expressed amplified fragment length is not less than 5 kbp. 従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。 Therefore, Rsv4 genetic marker, that is useful as a potyvirus resistance marker.

〔プライマーセット〕 [Primer set]
本発明のプライマーセットは、上記マーカーを検出し得る２以上のポリヌクレオチドから構成される。 The primer set of the present invention is composed of two or more polynucleotides capable of detecting the marker.

本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ａ１）及び（Ａ２）を含むことが好ましい。 The primer set of the present invention preferably comprises the following polynucleotides (A1) and (A2). これにより（Ａ）マーカーを検出することができる。 Thereby it is possible to detect a (A) marker.
（Ａ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から７８１の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド （Ａ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号７８３から１６０８の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド (A1) a polynucleotide (A2) identical with the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 781 in the nucleotide sequence is at least part of specifically hybridizing nucleotide sequence is 90% or more of SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 18 at least a portion that specifically hybridizes to a polynucleotide of nucleotide sequence identity is 90% or more of the nucleotide sequence of nucleotide numbers 783 1608 of the nucleotide sequence

本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ｂ１）及び（Ｂ２）を含むことが好ましい。 The primer set of the present invention preferably comprises the following polynucleotides (B1) and (B2). これにより（Ｂ）マーカーを検出することができる。 Thus (B) a marker can be detected.
（Ｂ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から９７６の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド （Ｂ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号９７８から１９７７の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド (B1) a polynucleotide (B2) that identity with the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 976 in the nucleotide sequence is at least part of specifically hybridizing nucleotide sequence is 90% or more of SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 18 at least a portion that specifically hybridizes to a polynucleotide of nucleotide sequence identity is 90% or more of the nucleotide numbers 978 of the base sequence to the base sequence of 1977

本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ｃ１）及び（Ｃ２）を含むことが好ましい。 The primer set of the present invention preferably comprises the following polynucleotides (C1) and (C2). これにより（Ｃ）マーカーを検出することができる。 Thus (C) a marker can be detected.
（Ｃ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から１６１１の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド （Ｃ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１６５２から２６５１の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド (C1) a polynucleotide (C2) which identity with the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 1611 in the nucleotide sequence is at least part of specifically hybridizing nucleotide sequence is 90% or more of SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 18 at least a portion that specifically hybridizes to a polynucleotide of nucleotide sequence identity with the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1652 2651 of the nucleotide sequence is at least 90%

本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ｄ１）及び（Ｄ２）を含むことが好ましい。 The primer set of the present invention preferably comprises the following polynucleotides (D1) and (D2). これにより（Ｄ）マーカーを検出することができる。 Thus (D) a marker can be detected.
（Ｄ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号５５９４から６５９３の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド （Ｄ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号６５９５から７５９４の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド (D1) a polynucleotide (D2) that identity with the nucleotide sequence of nucleotide numbers 5594 6593 of the nucleotide sequence is at least part of specifically hybridizing nucleotide sequence is 90% or more of SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 18 at least a portion that specifically hybridizes to a polynucleotide of nucleotide sequence identity with the nucleotide sequence of nucleotide numbers 6595 7594 of the nucleotide sequence is at least 90%

本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ｅ１）及び（Ｅ２）を含むことが好ましい。 The primer set of the present invention preferably comprises the following polynucleotides (E1) and (E2). これにより（Ｅ）マーカーを検出することができる。 Thereby (E) markers can be detected.
（Ｅ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号６２７０から７２６９の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド （Ｅ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号７２７１から８２７０の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド (E1) a polynucleotide (E2) that identity with the nucleotide sequence of nucleotide numbers 6270 7269 of the nucleotide sequence is at least part of specifically hybridizing nucleotide sequence is 90% or more of SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 18 at least a portion that specifically hybridizes to a polynucleotide of nucleotide sequence identity with the nucleotide sequence of nucleotide numbers 7271 8270 of the nucleotide sequence is at least 90%

本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ｆ１）及び（Ｆ２）を含むことが好ましい。 The primer set of the present invention preferably comprises the following polynucleotides (F1) and (F2). これにより、（Ｆ）マーカーを検出することができる。 Thus, it is possible to detect a (F) marker.
（Ｆ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から２７２５の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド （Ｆ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号６３４１から９５２９の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド (F1) of the identity of nucleotide sequence is 90% or more of the 2725 nucleotide sequence from nucleotide numbers 1 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 at least a portion that specifically hybridizes to a polynucleotide (F2) SEQ ID NO: 18 at least a portion that specifically hybridizes to a polynucleotide of nucleotide sequence identity with the nucleotide sequence of nucleotide numbers 6341 9529 of the nucleotide sequence is at least 90%

配列番号１８の塩基配列は、ダイズのポティウイルス感受性品種であるＷｉｌｌｉａｍｓ８２のＲｓｖ４のゲノムＤＮＡである。 The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 is the genomic DNA of Rsv4 of a potyvirus-sensitive varieties of soybean Williams82. 配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号２７２６～６３４０の３．６１ｋｂｐの挿入配列は、配列番号１３の塩基配列に相当し、感受性品種には存在するが抵抗性品種には存在しない。 Insertion sequence of 3.61kbp of base numbers 2726-6340 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 corresponds to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, is susceptible varieties exist, but does not exist in the resistant varieties. 該挿入配列が存在すればＲｓｖ４遺伝子（配列番号１～３の塩基配列）が発現せず、存在しなければＲｓｖ４遺伝子は発現する。 If there is the insertion input array Rsv4 gene (the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 3) is not express, Rsv4 gene if it does not exist is expressed. 従って、この領域を増殖するか、あるいはこの挿入配列に特異的な遺伝子マーカーをタイピングすることにより、抵抗性又は感受性の判定が可能である。 Therefore, either growing the region, or by typing a specific gene markers for this insertion sequence, it is possible to determine the resistance or susceptibility.

「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイズの条件下において、対象である塩基配列とのみハイブリダイズし、その他とは実質的にハイブリダイズしないという意味である。 By "specifically hybridize" under conditions of normal hybridizing to hybridize only to the nucleotide sequence which is the subject, others and is substantially the sense that it does not hybridize. 通常のハイブリダイズの条件下とは、通常のＰＣＲのアニーリングやプローブによる検出に用いられる条件下を意味する。 The Under ordinary conditions of hybridizing, refers to conditions used for detection by conventional PCR annealing or probe. Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲの場合、一般的な緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ８．３～９．０)、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ ₂など）を用いて、適当なアニーリング温度（５４℃～６０℃程度）で反応を行なう条件が例示される。 For PCR with Taq polymerase, a general buffer (50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH8.3 ~ 9.0), 1.5mM MgCl, etc. ₂₎ using an appropriate annealing temperature (54 ° C. conditions under which the reaction is carried out in ~ 60 ℃ about) can be exemplified. ノーザンハイブリダイゼーションの場合、一般的なハイブリダイゼーション溶液（５ｘＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ'ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．１～０．５％ＳＤＳ）を用いて、適当なハイブリダイゼーション温度（４２℃～６５℃程度）で反応を行なう条件が例示される。 In the case of Northern hybridization, common hybridization solution (5xSSPE, 50% formamide, 5xDenhardt's solution, 0.1 ~ 0.5% SDS) using a suitable hybridization temperature (42 ℃ ~ 65 ℃ about conditions for the reaction is exemplified by). アニーリング温度およびハイブリダイゼーション温度は、プライマーとして用いるポリヌクレオチド（そのＴｍ値など）および／または実験者の経験則に基づいて適宜定めることができ、当業者であれば容易に定めることができる。 Annealing temperature and hybridization temperature may be appropriately determined on the basis of the polynucleotide (such as the Tm value) and / or the experimenter heuristics used as a primer, it can be readily determined by those skilled in the art.

「実質的にハイブリダイズしない」とは、全くハイブリダイズしないこと、またはハイブリダイズする量が対象領域にハイブリダイズする量よりも大幅に少ないもしくは相対的に無視できる程度の微量であることを意味する。 By "not substantially hybridize" means that a slight amount that can be substantially less or relatively ignored than the amount that completely not hybridize to or hybridizing amount, hybridizes to target region .

（Ａ１）～（Ｆ２）において、それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、植物、中でもダイズの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列を意味する。 In (A1) ~ (F2), and the nucleotide sequence identity is 90% or more of the respective nucleotide sequences, it means a plant, a nucleotide sequence corresponding to the variations of the nucleotide sequence between Of these soybean varieties. 同一性は、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。 Identity, for example 91% or more, 92% or more, 93% or more and 94% or more or 95% or more, preferably at least 96%, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more , and still more preferably 99% or more. とりわけ好ましくは、対象領域の塩基配列と同一の塩基配列である。 Especially preferred is a nucleotide sequence identical to the nucleotide sequence of the target region. 同一性の定義は、上記と同様である。 The identity of the definitions are the same as described above. また、それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、それぞれの塩基配列において数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入、付加など）を含む塩基配列であってもよい。 Further, the nucleotide sequence identity is 90% or more of the respective nucleotide sequences, several in each of the nucleotide sequences (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1, 2 or 3 base modifications of pieces) (substitution, deletion, insertion, addition, etc.) it may be a nucleotide sequence comprising a. このようなダイズの各品種における対応箇所の塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかである。 Nucleotide sequence of the corresponding portion of each kind of such soy will be apparent to those skilled in the art. 例えば、ダイズの品種における上記挿入領域周辺の塩基配列を解読することにより、またはダイズの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、決定できる。 For example, by referring to the database that have registered the genetic information or soybean varieties, by deciphering the base sequence around the insertion region in the varieties of soybeans, it can be determined.

（Ａ１）～（Ｆ２）において、「配列番号１８の塩基配列のうちの所定の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列」は、その相補的な塩基配列も含む意味である。 In (A1) ~ (F2), "nucleotide sequence identity with the given nucleotide sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 is 90% or more" is meant to include also its complementary nucleotide sequence.

「少なくとも一部」とは、塩基配列中の一部の領域を意味し、通常は連続する領域であることが好ましい。 The term "at least part" means a part of the region of the nucleotide sequence, but is preferably a continuous area. 該領域の塩基数は、通常は１０塩基以上であり、好ましくは１５塩基以上であり、より好ましくは２０塩基以上であり、さらに好ましくは２５塩基以上である。 Number of bases of the region is usually 10 bases or more, preferably at 15 bases or more, more preferably 20 bases or more, still more preferably 25 or more bases. 上限は、通常は５０塩基以下であり、好ましくは４５塩基以下であり、より好ましくは４０塩基以下であり、さらに好ましくは３５塩基以下である。 The upper limit is usually 50 bases or less, preferably 45 bases or less, more preferably 40 bases or less, more preferably 35 bases or less. プライマーとして用いる場合、通常は１０塩基以上であり好ましくは１５塩基以上であり、さらに好ましくは２０塩基以上である。 When used as a primer, usually 10 bases or more is preferably 15 bases or more, more preferably 20 bases or more. 例えば、（Ｆ１）における該領域は、通常は配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から２７２５の塩基配列の少なくとも一部を含む領域であり、塩基番号１～２７２５の少なくとも一部の塩基配列を含む領域であることが好ましく、塩基番号１６４５～２７２５の少なくとも一部を含む領域であることがより好ましく、塩基番号２００１～２７２５の少なくとも一部を含む領域であることがさらに好ましい。 For example, the region in (F1) is an area typically includes at least part of the nucleotide sequence of the 2725 nucleotide numbers 1 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18, at least a portion of the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 2725 it is preferably a region including the, more preferably a region comprising at least part of the nucleotide numbers 1645-2725, and more preferably a region including at least part of the nucleotide numbers 2001-2725. （Ｆ２）における該領域は、通常は配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号６３４１から９５２９の塩基配列の少なくとも一部を含む領域であり、塩基番号６３４１～９５２９の少なくとも一部の塩基配列を含む領域であることが好ましく、塩基番号６３４１～８１８９の少なくとも一部の塩基配列を含む領域であることがより好ましく、塩基番号６３４１～７５２９の少なくとも一部の塩基配列を含む領域であることがさらに好ましい。 The region in (F2) is usually a region including at least part of the nucleotide sequence of the 9529 nucleotide numbers 6341 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18, comprising at least part of the nucleotide sequence of nucleotide numbers 6341 ~ 9529 preferably a region, more preferably a region including at least part of the nucleotide sequence of nucleotide numbers 6341-8189, and more preferably a region including at least part of the nucleotide sequence of nucleotide numbers 6341-7529 .

（Ａ１）～（Ｆ２）の各ポリヌクレオチドは、その一部（末端など）に対象とハイブリダイズしない領域を含んでいてもよい。 (A1) each polynucleotide of ~ (F2) is partially (the terminus, etc.) may include a region that does not target hybridize. 例えば、（Ａ１）は、ハイブリダイズする領域がプライマー全体のおよそ半分以上を占めかつ３'末端側にあることが好ましい。 For example, (A1) is preferably hybridizing region are in the account for over about half of the entire primer and 3 'end. （Ｂ１）、（Ｃ１）、（Ｄ１）、（Ｅ１）及び（Ｆ１）も同様である。 (B1), (C1), (D1), the same (E1) and (F1) also. 例えば、（Ａ２）は、ハイブリダイズする領域がプライマー全体のおよそ半分以上を占めかつ５'末端側にあることが好ましい。 For example, (A2) is preferably hybridizing region are in the account for over about half of the entire primer and 5 'end. （Ｂ２）、（Ｃ２）、（Ｄ２）、（Ｅ２）及び（Ｆ２）も同様である。 (B2), (C2), (D2), the same (E2) and (F2) also. これにより、任意の付加配列があっても正常にアニーリングして伸長反応を生じることができる。 As a result, even if there is any additional sequence it can result in an extension reaction by annealing normally. ハイブリダイズしない領域としては、制限酵素認識配列などが例示される。 As no hybridizing region, such as restriction enzyme recognition sequences are exemplified. 制限酵素認識配列は通常、プライマーの５'側に付加される。 Restriction enzyme recognition sequences are typically added to the 5 'end of the primer. なお、各ポリヌクレオチドの末端に対象とハイブリダイズしない領域が含まれている場合、同一性の算出は、ハイブリダイズしない末端の領域は考慮せず、ハイブリダイズする領域のみに着目して行うことが好ましい。 Incidentally, if it contains a region terminus does not target hybridize to each polynucleotide, identity calculation, the area of ​​the terminal which does not hybridize without considering, be performed by focusing only on the hybridizing region preferable.

（Ａ１）～（Ｆ２）の各ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド残基の数は、プライマーが標的部位にアニーリングして、目的産物を特異的に増幅できる限り特に限定されず、例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、または２０個以上であってもよく、好ましくは２５個以上である。 (A1) the number of nucleotide residues constituting each polynucleotide of ~ (F2), the primer is annealed to the target site is not particularly limited as long as it can specifically amplify the target product, for example, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, or may be 20 or more, preferably 25 or more. また、プライマーを構成するヌクレオチド残基の数は、例えば、５０個以下、４０個以下、または３０個以下であってもよい。 The number of nucleotide residues constituting the primer, for example, 50 or less, 40 or less, or may be 30 or less.

（Ａ１）～（Ｆ２）は、当業者であればＰｒｉｍｅｒ３などのソフトウェアを用いて設計することができ、その中から適切な塩基配列を選択すればよい。 (A1) ~ (F2) is the skilled artisan can be designed using software such as Primer3, may be selected appropriate base sequences among them.
プライマーは、増幅産物の検出を容易に行うため標識物質で標識されていてもよい。 Primers may be labeled with a labeling substance for the detection of the amplification product easily. 蛍光物質としては、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＨＥＸなどの蛍光物質が例示される。 As the fluorescent substance, 6-FAM, VIC, NED, PET, fluorescent material, such as HEX is exemplified. 一方、プライマーは、標識されていなくてもよく、ゲル電気泳動などの方法で増幅産物のサイズの差異を確認してもよい。 On the other hand, the primers may not be labeled may verify the differences in size of the amplified product by a method such as gel electrophoresis.

（Ａ１）としては、配列番号８５の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 The (A1), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 85 is illustrated. （Ａ２）としては、配列番号８６の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 The (A2), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 86 is illustrated. 本発明のプライマーセットは、配列番号８５の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号８６の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。 The primer set of the present invention preferably contains at least one of a polynucleotide comprising a polynucleotide and nucleotide sequence of SEQ ID NO: 86 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 85, and more preferably contains both.

（Ｂ１）としては、配列番号８５の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 The (B1), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 85 is illustrated. （Ｂ２）としては、配列番号８６の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 The (B2), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 86 is illustrated. 本発明のプライマーセットは、配列番号８５の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号８６の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。 The primer set of the present invention preferably contains at least one of a polynucleotide comprising a polynucleotide and nucleotide sequence of SEQ ID NO: 86 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 85, and more preferably contains both.

（Ｃ１）としては、配列番号５３の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 As the (C1), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53 is illustrated. （Ｃ２）としては、配列番号５４の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 The (C2), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54 is illustrated. 本発明のプライマーセットは、配列番号５３の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号５４の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。 The primer set of the present invention preferably contains at least one of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the polynucleotide and SEQ ID NO: 54 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53, and more preferably contains both.

（Ｄ１）としては、配列番号８３の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 The (D1), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 83 is illustrated. （Ｄ２）としては、配列番号８４の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 The (D2), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 84 is illustrated. 本発明のプライマーセットは、配列番号８３の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号８４の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。 The primer set of the present invention preferably contains at least one of a polynucleotide comprising a polynucleotide and nucleotide sequence of SEQ ID NO: 84 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 83, and more preferably contains both.

（Ｅ１）としては、配列番号８１の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 As the (E1), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 81 is illustrated. （Ｅ２）としては、配列番号８２の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 The (E2), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 82 is illustrated. 本発明のプライマーセットは、配列番号８１の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号８２の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。 The primer set of the present invention preferably contains at least one of a polynucleotide comprising a polynucleotide and nucleotide sequence of SEQ ID NO: 82 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 81, and more preferably contains both.

（Ｆ１）としては、配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 The (F1), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 is illustrated. （Ｆ２）としては、配列番号１２の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 (F2) as the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 is illustrated. 本発明のプライマーセットは、配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号１２の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。 The primer set of the present invention preferably contains at least one of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the polynucleotide and SEQ ID NO: 12 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, and more preferably contains both.
また、（Ｆ１）としては、配列番号９１の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 As the (F 1), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 91 is illustrated. （Ｆ２）としては、配列番号９２の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。 As the (F2), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 92 is illustrated. 本発明のプライマーセットは、配列番号９１の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号９２の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。 The primer set of the present invention preferably contains at least one of a polynucleotide comprising a polynucleotide and nucleotide sequence of SEQ ID NO: 92 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 91, and more preferably contains both.

本発明のプライマーセットは、植物のポティウイルス抵抗性の判別に用いることができる。 The primer set of the present invention can be used to determine the potyvirus resistance of plants. 植物、ポティウイルスの例および好ましい例は、先述したとおりである。 Plants, examples and preferred examples of potyvirus are as previously described.

〔キット〕 〔kit〕
本発明のキットは、上述した各種プライマーセットを含むキットに関する。 The kit of the present invention relates to a kit containing various primer set described above.

本発明のキットは、プライマーセットの他に、増幅反応で用いられるタンパク質、蛍光試薬、基質（ｄＮＴＰｓなど）、補酵素（ＡＴＰなど）をさらに含んでいてもよい。 The kit of the present invention, in addition to the primer set, the protein used in the amplification reaction, fluorescent reagent, (such as dNTPs) substrate may further include a coenzyme (such as ATP). 増幅反応で用いられるタンパク質としては、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、制限酵素、リボヌクレアーゼＨ、リガーゼ、ヘリカーゼおよびリコンビナーゼが例示される。 As the protein used in the amplification reaction, DNA polymerase, reverse transcriptase, restriction enzymes, RNase H, ligases, helicase and the recombinase is exemplified. 本発明のキットは、ポジティブコントロール（ＰｅｋｉｎｇのゲノムＤＮＡ、ＦｕｋｕｓｅｎｎａｒｉのゲノムＤＮＡ、ＢｙｏｕｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１のゲノムＤＮＡなど）および／またはネガティブコントロール（Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２のゲノムＤＮＡ、ＥｎｒｅｉのゲノムＤＮＡなど）を含んでいてもよい。 The kit of the present invention, positive control (Peking genomic DNA, genomic DNA Fukusennari, such ByoutouShushitou1 genomic DNA) and / or negative controls (Williams82 genomic DNA, such as genomic DNA Enrei) may contain.

本発明のキットは、個々の容器（チューブなど）に隔離された形態で各成分を含んでいてもよいが、２種以上の成分が同一容器中で予め混合されていてもよい。 The kit of the present invention is in an isolated form individual containers (such as a tube) may contain each component, but two or more components may be premixed in the same vessel.

〔抵抗性の判定方法〕 [Resistance of the determination method]
本発明のダイズのポティウイルス抵抗性の判定方法は、植物の核酸試料中の配列番号１３の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列の挿入の有無を検出し、当該挿入配列の挿入があればポティウイルスへの抵抗性なしと判断し、当該挿入配列の挿入がなければポティウイルスへの抵抗性ありと判断する方法である。 Method of determining potyvirus resistance of soybean of the present invention detects the presence or absence of insertion of a nucleotide sequence having a nucleotide sequence or which at least 90% identity with SEQ ID NO: 13 in a nucleic acid sample of a plant, the inserted sequence if there is an insertion of determines that there is no resistance to potyvirus, it is a method to determine that there is resistance to potyvirus if there is no insertion of the insertion sequence.

植物の核酸試料は、植物の核酸を含む、又は含む可能性がある試料である。 Nucleic acid sample of plants is a sample that may contain nucleic acids of a plant, or a. 核酸は、通常はＤＮＡであり、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡのいずれであってもよい。 The nucleic acid, usually a DNA, genomic DNA, may be any of the cDNA. 植物がダイズである場合、核酸試料は、第２染色体の核酸の一部を含むことが好ましく、配列番号１４～１８の塩基配列またはこれらのいずれかと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むことがより好ましい。 If the plant is soybean, the nucleic acid sample comprises a nucleotide sequence having preferably includes a portion of a nucleic acid of the second chromosome, the nucleotide sequence, or any at least 90% identity with those of SEQ ID NOS: 14-18 it is more preferable. 配列番号１４の塩基配列は、ＰｅｋｉｎｇのＲｓｖ４遺伝子のゲノムＤＮＡ（上記挿入配列なし）の塩基配列であり、配列番号１５の塩基配列は、ＢｙｏｕｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１のＲｓｖ４遺伝子のゲノムＤＮＡ（上記挿入配列なし）の塩基配列であり、配列番号１６の塩基配列は、ＦｕｋｕｓｅｎｎａｒｉのＲｓｖ４遺伝子のゲノムＤＮＡ（上記挿入配列なし）の塩基配列であり、配列番号１７は、ＥｎｒｅｉのＲｓｖ４遺伝子のゲノムＤＮＡ（上記挿入配列あり）の塩基配列であり、配列番号１８は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２のＲｓｖ４遺伝子のゲノムＤＮＡ（上記挿入配列あり）の塩基配列である。 The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 is the nucleotide sequence of the genomic DNA of Rsv4 gene Peking (without the insertion sequences), the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, bases Rsv4 gene of genomic DNA ByoutouShushitou1 (without the insertion sequence) It is an array, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, a nucleotide sequence of the genomic DNA of Rsv4 gene of Fukusennari (without the insertion sequence), SEQ ID NO: 17, of genomic DNA of Rsv4 gene of Enrei (located above insertion sequence) a nucleotide sequence, SEQ ID NO: 18 is the nucleotide sequence of Rsv4 gene of genomic DNA Williams82 (there the insertion sequence).

配列番号１４～１８のいずれかと９０％以上の同一性を有する塩基配列とは、植物、中でもダイズの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列を意味する。 SEQ ID NO: 14-18 or with the nucleotide sequence having 90% or more of identity, meaning plant, a nucleotide sequence that corresponds to the variation of the base sequence in between Above all soybean varieties. 同一性は、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。 Identity, for example 91% or more, 92% or more, 93% or more and 94% or more or 95% or more, preferably at least 96%, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more , and still more preferably 99% or more. とりわけ好ましくは、対象領域の塩基配列と同一の塩基配列である。 Especially preferred is a nucleotide sequence identical to the nucleotide sequence of the target region. 同一性の定義は、上記と同様である。 The identity of the definitions are the same as described above. また、それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、それぞれの塩基配列において数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入、付加など）を含む塩基配列であってもよい。 Further, the nucleotide sequence identity is 90% or more of the respective nucleotide sequences, several in each of the nucleotide sequences (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1, 2 or 3 base modifications of pieces) (substitution, deletion, insertion, addition, etc.) it may be a nucleotide sequence comprising a. このようなダイズの各品種における対応箇所の塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかである。 Nucleotide sequence of the corresponding portion of each kind of such soy will be apparent to those skilled in the art. 例えば、ダイズの品種における上記挿入領域周辺の塩基配列を解読することにより、またはダイズの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、決定できる。 For example, by referring to the database that have registered the genetic information or soybean varieties, by deciphering the base sequence around the insertion region in the varieties of soybeans, it can be determined.

本発明の方法においては、配列番号１３の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列の挿入の有無を検出する。 In the method of the present invention, to detect the presence or absence of insertion of a nucleotide sequence having a nucleotide sequence or which at least 90% identity with SEQ ID NO: 13. 配列番号１３の塩基配列は、Ｒｓｖ４遺伝子における挿入配列であり、挿入配列が挿入されていると活性を有するＲｓｖ４タンパク質は生産されず、挿入配列が挿入されていないと活性を有するＲｓｖ４タンパク質が生産される。 Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 is the insertion sequence in RSV4 gene, RSV4 protein having the activity when the insertion sequence is inserted is not produced, RSV4 protein having the activity when the insertion sequence is not inserted is produced that. 配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列は、植物、中でもダイズの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列を意味する。 Nucleotide sequence and nucleotide sequences having 90% or more identity of SEQ ID NO: 13 refers to a plant, a nucleotide sequence corresponding to the variations of the nucleotide sequence between Of these soybean varieties. 同一性は、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。 Identity, for example 91% or more, 92% or more, 93% or more and 94% or more or 95% or more, preferably at least 96%, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more , and still more preferably 99% or more. 同一性の定義は、上記と同様である。 The identity of the definitions are the same as described above. また、それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、それぞれの塩基配列において数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入、付加など）を含む塩基配列であってもよい。 Further, the nucleotide sequence identity is 90% or more of the respective nucleotide sequences, several in each of the nucleotide sequences (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1, 2 or 3 base modifications of pieces) (substitution, deletion, insertion, addition, etc.) it may be a nucleotide sequence comprising a. このようなダイズの各品種における対応箇所の塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかである。 Nucleotide sequence of the corresponding portion of each kind of such soy will be apparent to those skilled in the art. 例えば、ダイズの品種における上記挿入領域周辺の塩基配列を解読することにより、またはダイズの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、決定できる。 For example, by referring to the database that have registered the genetic information or soybean varieties, by deciphering the base sequence around the insertion region in the varieties of soybeans, it can be determined.

配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列の挿入位置は、配列番号４または配列番号５の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列中、塩基番号１６９（アデニン）と１７０（グアニン）との間であることが好ましい。 Inserting position of the base sequence having a nucleotide sequence identity of 90% or more of SEQ ID NO: 13, the base sequence having the nucleotide sequence or which at least 90% identity with SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, nucleotide numbers 169 it is preferably between (adenine) and 170 (guanine). 配列番号４または配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列は、植物、中でもダイズの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列を意味する。 Nucleotide sequence and nucleotide sequences having 90% or more identity with SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, which means a plant, a nucleotide sequence corresponding to the variations of the nucleotide sequence between Of these soybean varieties. 同一性は、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。 Identity, for example 91% or more, 92% or more, 93% or more and 94% or more or 95% or more, preferably at least 96%, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more , and still more preferably 99% or more. 同一性の定義は、上記と同様である。 The identity of the definitions are the same as described above. また、それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、それぞれの塩基配列において数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入、付加など）を含む塩基配列であってもよい。 Further, the nucleotide sequence identity is 90% or more of the respective nucleotide sequences, several in each of the nucleotide sequences (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1, 2 or 3 base modifications of pieces) (substitution, deletion, insertion, addition, etc.) it may be a nucleotide sequence comprising a. このようなダイズの各品種における対応箇所の塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかである。 Nucleotide sequence of the corresponding portion of each kind of such soy will be apparent to those skilled in the art. 例えば、ダイズの品種における上記挿入領域周辺の塩基配列を解読することにより、またはダイズの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、決定できる。 For example, by referring to the database that have registered the genetic information or soybean varieties, by deciphering the base sequence around the insertion region in the varieties of soybeans, it can be determined.

塩基配列の挿入の有無の検出は、本発明のマーカーのタイピングにより行うことが好ましい。 Detection of the presence or absence of insertion of the nucleotide sequence is preferably carried out by typing the markers of the present invention. その際、本発明のプライマーセットまたはキットを用いて行うことが好ましい。 At that time, it is preferably carried out using a primer set or kit of the present invention. 検出手段としては、核酸増幅法（ＰＣＲ法など）が例示される。 As the detecting means, a nucleic acid amplification method (PCR method or the like) are exemplified.

以下、本発明を実施例により説明する。 Below, it will be described with reference to the present invention embodiment. なお、以下の実施例の説明においては、結果と考察を先に記載し、実験方法は実施例８の結果及び考察の後段にて説明する。 In the description of the following examples, describe the results and discussion above, the experimental method will be described in subsequent Results and Discussion of Example 8.

実施例１ Ｒｓｖ４のポジショナルクローニング エンレイ（ＳＭＶ感受性）×Ｐｅｋｉｎｇ（ＳＭＶ抵抗性）の戻し交雑後代９，３２０個体の遺伝子型を解析し、Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域を第２染色体上の約９．８ｋｂｐの領域まで絞り込んだ（図１）。 Positional cloning Enrei of Example 1 Rsv4 analyzes the backcross progeny 9,450 individual genotype of (SMV sensitivity) × Peking (SMV resistance), about 9.8kbp of the Rsv4 locus candidate region on chromosome 2 narrowed to the region (Fig. 1). この領域は、別のグループによって既に報告されているＲｓｖ４遺伝子座候補領域（Ｓａｇｈａｉ Ｍａｒｏｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ２０１０（非特許文献３）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ２０１１（非特許文献４））と異なっていた。 This region may be another has already been reported by the group Rsv4 locus candidate region (Saghai Maroof et al, Plant Genome 2010 (Non-Patent Document 3);.. Wang et al, Theor Appl Genet 2011 (Non-Patent Document 4) ) and it was different. 既に解読されているＷｉｌｌｉａｍｓ８２（ＳＭＶ感受性）ゲノムＤＮＡ塩基配列における、上記約９．８ｋｂｐのＲｓｖ４遺伝子座候補領域に対応する領域の塩基配列にはタンパク質コード領域の存在は予測されず、レトロトランスポゾンらしき約３．６ｋｂｐの配列（配列番号１３）が存在した。 In already has been deciphered Williams82 (SMV sensitivity) genomic DNA base sequence, the presence of the protein coding region is not predicted in the nucleotide sequence of the region corresponding to the Rsv4 locus candidate region above about 9.8kbp, about Rashiki retrotransposon array of 3.6kbp (SEQ ID NO: 13) was present.

一方、ＰｅｋｉｎｇゲノムＤＮＡにおける上記Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域に対応する領域の塩基配列を解読したところ、この約３．６ｋｂｐの配列（配列番号１３）が存在せず、２５９アミノ酸残基からなるタンパク質をコードするタンパク質コード領域が存在していた。 Code On the other hand, when the decrypted nucleotide sequence of the region corresponding to the Rsv4 locus candidate regions in Peking genomic DNA, there is no sequence of the about 3.6 kbp (SEQ ID NO: 13), a protein of 259 amino acid residues protein coding region was present. ＰｅｋｉｎｇゲノムＤＮＡにおける当該タンパク質コード領域の塩基配列を配列番号１に示す。 This shows the base sequence of the protein coding region in SEQ ID NO: 1 in Peking genomic DNA. このタンパク質コード領域の塩基配列から予測されるタンパク質（配列番号６）はＲＮａｓｅ Ｈファミリーの属するタンパク質に共通して含まれるドメインをもつと予測された（図２）。 The protein-encoding proteins that are predicted from the nucleotide sequence of a region (SEQ ID NO: 6) was predicted to have a domain commonly included in the proteins to which the RNase H family (Figure 2).

Ｐｅｋｉｎｇと同様にＳＭＶ抵抗性品種であるＢｙｏｕｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１及びＦｕｋｕｓｅｎｎａｒｉのゲノムＤＮＡにおける上記Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域に対応する領域の塩基配列を解読したところ、これらの塩基配列中にはＰｅｋｉｎｇの場合と同様に約３．６ｋｂｐの配列（配列番号１３）が存在せず、これによりそれぞれ２５５及び２７１アミノ酸残基からなるタンパク質をコードするタンパク質コード領域が存在していることがわかった（配列番号２、３、７および８、図１４）。 Similar to Peking a SMV resistant varieties ByoutouShushitou1 and were decipher the base sequence of the region corresponding to the Rsv4 locus candidate regions in the genomic DNA of Fukusennari, about 3 as in the case of Peking during these nucleotide sequences there is no sequence of .6Kbp (SEQ ID nO: 13), thereby it was found that the protein coding region encoding a protein consisting of 255 and 271 amino acid residues respectively is present (SEQ ID nO: 2, 3, 7 and 8, FIG. 14). 一方、ＳＭＶ感受性品種であるＥｎｒｅｉのゲノムＤＮＡにおける上記Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域に対応する領域においてはＷｉｌｌｉａｍｓ８２の場合と同様にタンパク質コード領域の存在は予測されず、約３．６ｋｂｐの配列（配列番号１３）が存在した。 On the other hand, the presence of as in the case the protein coding region of Williams82 in the region corresponding to the Rsv4 locus candidate regions in Enrei of genomic DNA is a SMV susceptible cultivar is not predicted, the sequence of about 3.6 kbp (SEQ ID NO: 13 ) was present. さらに、ＥｎｒｅｉおよびＷｉｌｌｉａｍｓ８２の当該領域の塩基配列から約３．６ｋｂｐの配列（配列番号１３）を除くと、ＰｅｋｉｎｇゲノムＤＮＡにおける上記タンパク質コード領域の塩基配列と高い同一性を有するタンパク質コード領域の配列を再構成することができた（配列番号４、５、９および１０）。 Further, except for the sequence of about 3.6kbp from the nucleotide sequence of the region of Enrei and Williams82 (SEQ ID NO: 13), the sequence of the protein coding region having the nucleotide sequence with high identity with the protein coding regions in Peking genomic DNA could be reconstructed (SEQ ID NO: 4, 5, 9 and 10).

実施例２ Ｒｓｖ４遺伝子によるＳＭＶの増殖抑制効果 ＰｅｋｉｎｇゲノムＤＮＡにおける上記Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域に存在するタンパク質コード領域によってコードされるタンパク質（Ｒｓｖ４タンパク質）を恒常的に発現する形質転換ダイズを作製し、ＳＭＶ接種後１０日目の非接種上位葉におけるＳＭＶの外被タンパク質（ＳＭＶ ＣＰ）の蓄積をウェスタンブロット法により検出した。 To produce a transformed soybean expressing the protein (Rsv4 protein) encoded by the protein coding regions present in the Rsv4 locus candidate region in the growth inhibitory effect Peking genomic DNA of SMV according to Example 2 Rsv4 gene constitutively, SMV the accumulation outside the SMV in uninoculated upper leaves 10 days after inoculation coat protein (SMV CP) were detected by Western blotting. このとき、Ｒｓｖ４タンパク質の蓄積を、特異的抗体を用いて同時に検出した。 At this time, the accumulation of Rsv4 protein was detected simultaneously using a specific antibody. 非形質転換ダイズ（Ｊａｃｋ）と比べて、Ｒｓｖ４タンパク質を発現するダイズ（２７ｃ－１）ではＳＭＶのＣＰの蓄積が低く、ＳＭＶの増殖が抑制されたことを示している（図３）。 Compared to non-transformed soybean (Jack), soybean expressing the Rsv4 protein (27c-1) in a low accumulation of CP of SMV, shows that the growth of SMV was suppressed (FIG. 3).

実施例３ Ｒｓｖ４タンパク質の活性中心のＳＭＶの増殖抑制効果への影響 アグロインフィルトレーション法によるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ一過的発現系を用いてＲｓｖ４タンパク質のＳＭＶ増殖抑制能を調べた。 It examined the SMV ability to suppress proliferation of Rsv4 protein using Example 3 Nicotiana benthamiana transient expression system according to the active center of Rsv4 protein to the growth inhibitory effect of SMV impact agroinfiltration method. Ｒｓｖ４タンパク質を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウム、ＲＮａｓｅ Ｈドメインの活性中心を破壊した変異型Ｒｓｖ４タンパク質（Ｄ９９Ｎ変異体）を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウム、およびネガティブコントロールとしてβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウムを、それぞれＮ． Agrobacterium carrying a plasmid expressing the Rsv4 protein, Agrobacterium carrying a plasmid expressing the mutant Rsv4 protein (D99N variant) that destroyed the active center of the RNase H domain, and as a negative control β- glucuronidase ( Agrobacterium carrying a plasmid expressing GUS), respectively N. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に接種した。 They were inoculated in benthamiana leaf. １日後にそれらの葉に感染性ＳＭＶ ｃＤＮＡプラスミドを保有するアグロバクテリウムを接種した後、５日後に、感染性ＳＭＶ ｃＤＮＡプラスミドを保有するアグロバクテリウムが接種された葉におけるＳＭＶのＣＰおよびＲｓｖ４タンパク質の蓄積をウェスタンブロット法により検出した。 After inoculation with Agrobacterium harboring infectious SMV cDNA plasmid into their leaves after 1 day, 5 days later, the infectious SMV cDNA plasmid SMV in leaves Agrobacterium was inoculated carrying CP and Rsv4 protein accumulation of was detected by Western blotting. ＧＵＳおよびＤ９９Ｎ変異型Ｒｓｖ４タンパク質を発現する葉ではＳＭＶのＣＰが蓄積したが、Ｒｓｖ４タンパク質を発現する葉ではＣＰの蓄積は検出されなかった（図４）。 Although the leaves expressing GUS and D99N mutant Rsv4 protein CP of SMV has accumulated in the leaves expressing Rsv4 protein accumulation of CP was not detected (Fig. 4). 本実施例の結果は、Ｒｓｖ４タンパク質がダイズ以外の植物において発現した場合にもＳＭＶの増殖を抑制する活性を有すること、及び、Ｒｓｖ４タンパク質の活性中心に存在すると考えられる９９番目のアスパラギン酸残基は、ＳＭＶの増殖抑制活性にとって重要であることを示している（図４）。 Results of this example, to have activity of inhibiting the proliferation of SMV even if the Rsv4 protein was expressed in plants other than soybean and 99th aspartic acid residue that is considered to be present in the active center of Rsv4 protein indicates that it is important for the growth inhibitory activity of SMV (FIG. 4).

実施例４ Ｒｓｖ４遺伝子による抵抗性打破ＳＭＶ変異株の増殖抑制効果 Ｒｓｖ４遺伝子座によるＳＭＶ抵抗性は、ＳＭＶが有するＰ３タンパク質における特定のアミノ酸置換により打破されることが知られている（Ｃｈｏｗｄａ－Ｒｅｄｄｙ，Ｒ． Ｖ．Ｓｕｎ Ｈ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｐｏｙｓａ Ｖ，Ｌｉｎｇ Ｈ，Ｇｉｊｚｅｎ Ｍ，＆ Ｗａｎｇ Ａ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐ３ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ Ｇ２ Ｉｓｏｌａｔｅｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｎ Ｒｓｖ４－Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｓｏｙｂｅａｎ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ－Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２４，３７－４３（２０１１）．Ａｈａｎｇａｒａｎ，Ａ．，Ｈａｂｉｂｉ，Ｍ．Ｋ．，Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｇ．－Ｈ．Ｍ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｓ．＆ Ｇａｒｃｉａ－Ａｒｅｎａｌ，Ｆ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｉｒａｎ ａｌｌｏｗｓ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ Ｒｓｖ４－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９４，２５５７－２５６８（２０１３）．Ｋｈａｔａｂｉ，Ｂ．，Ｆａｊｏｌｕ，Ｏ．Ｌ．，Ｗｅｎ，Ｒ．Ｈ．＆ Ｈａｊｉｍｏｒａｄ，Ｍ．Ｒ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｇａｉｎ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｎ Ｒｓｖ－ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｓｏｙｂｅａｎｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－ｂｒｅａｋｉｎｇ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｎ Ｒｓｖ４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３，１０７７－１０８８（２０１２）．）。 Example 4 SMV resistance by growth inhibitory effect Rsv4 loci resistant breaking SMV mutant according Rsv4 gene, SMV is known to be overcome by the specific amino acid substitutions in the P3 protein having it (Chowda-Reddy, R. V.Sun H, Chen H, Poysa V, Ling H, Gijzen M, & Wang A.Mutations in the P3 Protein of Soybean mosaic virus G2 Isolates Determine Virulence on Rsv4-Genotype Soybean.Mol.Plant-Microbe Interact.24 , 37-43 (2011) .Ahangaran, A., Habibi, M.K., Mohammadi, G.-H.M., Winter, S. & Garcia-Arenal, F.Analysis of Soybean mosaic virus genetic diversity in Iran allows the characterization of a new mutation resulting in overcoming Rsv4-resistance.J.Gen.Virol.94,2557-2568 (2013) .Khatabi, B., Fajolu, O.L., Wen, R.H. & Hajimorad, M.R.Evaluation of North American isolates of Soybean mosaic virus for gain of virulence on Rsv-genotype soybeans with special emphasis on resistance-breaking determinants on Rsv4.Molecular Plant Pathology 13,1077-1088 (2012).). そこで、上記アミノ酸置換を有する抵抗性打破ＳＭＶ変異株（ＳＭＶ－Ｌ（Ｑ１０３３Ｋ））の増殖が、Ｒｓｖ４タンパク質を発現するＮ． Therefore, the growth of the resistance break SMV mutant strain having the amino acid substitution (SMV-L (Q1033K)) express the Rsv4 protein N. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉で抑制されるか調べた。 It was examined or are suppressed by benthamiana leaf.

本実施例では、ＳＭＶ感染性プラスミドを有するアグロバクテリウムをＯＤ ₆₀₀ ＝０．００５で接種した。 In this embodiment, the Agrobacterium having SMV infectious plasmids were inoculated with _OD 600 = 0.005. これに、Ｒｓｖ４を発現させるプラスミドをもつアグロバクテリウムをＯＤ ₆₀₀ ＝０．５で接種したときにはＳＭＶ－Ｃ（ｗｔ）およびＳＭＶ－Ｌ（Ｑ１０３３Ｋ）ともに増殖が阻害された（図５）。 This, when the Agrobacterium with plasmid expressing the Rsv4 were seeded at _{OD 600 = 0.5 SMV-C (} wt) and SMV-L (Q1033K) both proliferation was inhibited (FIG. 5). 一方、それよりも低い濃度のＯＤ ₆₀₀ ＝０．０５で接種したときにはＳＭＶ－Ｃ（ｗｔ）の増殖は阻害されたが、抵抗性打破系統のＳＭＶ－Ｌ（Ｑ１０３３Ｋ）は増殖した（図５）。 On the other hand, when inoculated with _OD 600 = 0.05 of lower concentration than that although growth of SMV-C (wt) was inhibited, SMV-L resistant breaking line (Q1033K) were grown (Figure 5) .

以上より、上記Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域に存在する上記タンパク質コード領域を含む遺伝子がＲｓｖ４遺伝子座の責任遺伝子であると結論付けた。 From the above, the gene containing the protein coding region present in the Rsv4 locus candidate region has concluded that it is the responsibility of gene Rsv4 locus. またこの結果から、植物内でＲｓｖ４タンパク質を過剰発現することにより、抵抗性打破変異ウイルスの増殖も抑制可能であり、当該植物に対しより強力な抵抗性を付与できるものと考えられた。 Also from these results, by overexpressing the Rsv4 proteins in plants, the growth of resistant break mutant viruses also can be suppressed, it was believed to be imparted a stronger resistance to the plant.

実施例５ Ｒｓｖ４遺伝子によるＳＭＶ以外のポティウイルスの増殖抑制効果 ポティウイルス属は１４６種が正式に登録されており（Ｎｉｎｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ．（２０１２）Ｅｄ：Ｋｉｎｇ，Ａ．Ｍ．Ｑ．，Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｃａｒｓｔｅｎｓ，Ｅ．Ｂ．ａｎｄ Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｅ．Ｊ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、未決定のものも含めると約２００種にも上る。 Example 5 Rsv4 gene growth inhibitory effect potyviruses genus potyviruses other than SMV by are 146 species officially registered (Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2012) Ed:. King, A.M . climb Elsevier Academic Press), it is also to be included, about 200 species of those undecided: .Q, Adams, M.J., Carstens, E.B.and Lefkowitz, E.J.San Diego. 農作物に甚大な被害を与えるウイルスも多い。 Virus that gives extensive damage to agricultural crops often. Ｒｓｖ４がＳＭＶ以外のポティウイルスの増殖も阻害し得るか調べるため、Ｒｓｖ４を一過的に発現するＮ． Rsv4 is to see if can also inhibited proliferation of potyviruses other than SMV, expressing Rsv4 transiently N. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉にカブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）、ジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＣＭＶ）、ジャガイモＡウイルス（ＰＶＡ）、ラッカセイ斑紋ウイルス（ＰｅＭｏＶ）を接種し、７～１４日後の非接種上位葉におけるウイルスＲＮＡの蓄積をＲＴ－ＰＣＲ法により調べた。 benthamiana leaves turnip mosaic virus (TuMV), potato virus Y (PVY), kidney bean mosaic virus (BCMV), potato A virus (PVA), inoculated with peanut mottle virus (PeMoV), non-inoculated upper leaves after 7 to 14 days the accumulation of viral RNA in was investigated by RT-PCR method. コントロールとして用いた活性中心を破壊した変異型Ｒｓｖ４タンパク質（Ｄ９９Ｎ）を発現する植物と比較して、Ｒｓｖ４タンパク質発現植物ではウイルスＲＮＡの蓄積が著しく抑制されていた（図６の左図）。 As compared to plants expressing the mutant Rsv4 protein (D99N) that destroyed active center which was used as a control, the accumulation of viral RNA was significantly suppressed in the Rsv4 protein expressing plants (left side of FIG. 6). このとき、ＴｕＭＶを接種したＮ． In this case, N. inoculated with TuMV ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａは激しい病徴を示したが、Ｒｓｖ４タンパク質発現葉にＴｕＭＶを接種した植物は病徴が著しく遅延あるいは全く示さなかった（図６の右図）。 benthamiana showed a severe disease symptoms, plants were inoculated with TuMV to Rsv4 protein expression leaves symptoms did not show significantly delay or no (right diagram of FIG. 6).

本実施例の結果は、Ｒｓｖ４タンパク質がＳＭＶ以外のポティウイルスに対しても増殖抑制効果を発揮し得ることを示す。 The results of this example shows that Rsv4 protein can exhibit a growth inhibitory effect against potyvirus non SMV.

実施例６ Ｒｓｖ４タンパク質が二本鎖ＲＮＡ分解酵素であることの確認 Ｒｓｖ４のアミノ酸配列から予想されるＲＮａｓｅ Ｈは、一般にＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断するエンドヌクレアーゼであるが、ポティウイルスを含むプラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムは、相補鎖ＲＮＡを介して複製され、その過程ではＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖は生じないことから、Ｒｓｖ４とポティウイルスの増殖抑制効果との間に明瞭な関係が見いだせない。 RNase H expected from the amino acid sequence of confirmed RSV4 that Example. 6 RSV4 protein is a double stranded RNA degradation enzyme is generally an endonuclease which cleaves the RNA strand of DNA-RNA duplexes, potyvirus the genome of positive strand RNA viruses, including, replicated via complementary strand RNA, in the process from that does not occur DNA-RNA duplexes, the clear relationship between the growth inhibitory effect of Rsv4 and potyvirus undiscoverable. そこでＲｓｖ４タンパク質がどのような生化学的特性をもつか解析した。 Therefore Rsv4 protein was analyzed whether with any biochemical properties.

Ｃ末端にＦＬＡＧタグを融合したＲｓｖ４タンパク質を、アグロインフィルトレーション法を用いてＮ． The Rsv4 protein fused with FLAG tag to the C-terminus, using agroinfiltration method N. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉で発現し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降により精製タンパク質を得た。 Expressed in benthamiana leaves, to give a purified protein by immunoprecipitation with anti-FLAG antibody. この精製タンパク質、すなわちＦＬＡＧタグ融合Ｒｓｖ４タンパク質がＳＭＶ増殖抑制能をもつことは、Ｎ． This purified protein, ie FLAG that the tag fusion Rsv4 protein has a SMV growth suppression ability, N. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａを用いた一過的発現実験により確認された。 It was confirmed by transient expression experiments using benthamiana. この精製タンパク質を用いて、 ³² Ｐで標識したＲＮＡが分解されるかを調べた。 Using this purified protein, labeled RNA was examined or be broken down in the ^{32 P.} 反応のコントロールとして大腸菌由来のＲＮａｓｅ ＨおよびＳ１ヌクレアーゼを使用した。 Using RNase H and S1 nuclease derived from E. coli as a control of the reaction. Ｒｓｖ４タンパク質は一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖を切断しなかったが、マンガン依存的に二本鎖ＲＮＡを分解した（図７）。 Rsv4 protein did not cleave single-stranded RNA and DNA-RNA duplexes, to decompose the manganese-dependent manner double-stranded RNA (Figure 7). この二本鎖ＲＮＡ分解活性はＤ９９Ｎ変異体では見られなかった。 The double-stranded RNA degradation activity was observed in the D99N mutant.

本実施例の結果は、Ｒｓｖ４タンパク質が二本鎖ＲＮＡ分解酵素であることを示すとともに、９９番目のアスパラギン酸残基が当該タンパク質の活性に必要であることを裏付けている。 Results of this example, it shows that Rsv4 protein is a double stranded RNA degrading enzymes, confirms that the 99 th aspartic acid residue is required for activity of the protein.

実施例７ Ｒｓｖ４とＳＭＶ Ｐ３との相互作用の確認 ＲＮＡウイルスは相補鎖ＲＮＡを介して複製することから、ウイルス複製時に生じる二本鎖ＲＮＡはウイルス特異的分子パターン物質として宿主の防御機構の標的となる（Ｋａｒｐａｌａ ＡＪ，Ｄｏｒａｎ ＴＪ，Ｂｅａｎ ＡＧＤ：Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｄｓＲＮＡ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８３，２１１－２１６（２００５）．ＤｅＷｉｔｔｅ－Ｏｒｒ，Ｓ．Ｊ．＆ Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｋ．Ｌ．ｄｓＲＮＡ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｆｕｔｕｒｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５，３２５－３４１（２０１０）．）。 Check RNA virus interaction with the Example. 7 RSV4 and SMV P3 from that replicate through a complementary strand RNA, double stranded RNA generated during viral replication and targets of host defense mechanisms as a virus-specific molecular pattern material consisting of (Karpala AJ, Doran TJ, Bean AGD: Immune responses to dsRNA:. implications for gene silencing technologies.Immunology and Cell Biology 83,211-216 (2005) .DeWitte-Orr, S.J & Mossman, K.L. dsRNA and the innate antiviral immune response.Future Virology 5,325-341 (2010).). 多くの真核生物は、この二本鎖ＲＮＡを分解する酵素（例えばＲＮａｓｅ ＩＩＩファミリーのＤｉｃｅｒなど）をもつが、プラス鎖ＲＮＡウイルスはこれに感染することができる。 Many eukaryotes, but with an enzyme that degrades the double-stranded RNA (e.g. RNase III family of Dicer, etc.), positive strand RNA viruses are able to infect it. プラス鎖ＲＮＡウイルスは、二本鎖ＲＮＡを隠すために、細胞質から隔離された場を作り、そこでのみ複製を行うので、このような分解酵素を有する真核生物にも感染することができる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｊａｎｄａ Ｍ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ Ｍ，ｄｅｎ Ｂｏｏｎ Ｊ，Ａｈｌｑｕｉｓｔ Ｐ，Ａ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ－Ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｐａｒａｌｌｅｌｓ Ｆｏｒｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，９（３），５０５－５１４（２００２）．）。 Positive strand RNA viruses, in order to hide the double-stranded RNA, make a place isolated from the cytoplasm, since only to replicate therein, can also infect eukaryotes having the above enzyme (Schwartz M, Chen J, Janda M, Sullivan M, den Boon J, Ahlquist P, A Positive-Strand RNA Virus Replication Complex Parallels Form and Function of Retrovirus Capsids, Molecular Cell, 9 (3), 505-514 (2002).) . Ｒｓｖ４は、複製時に生じるウイルス二本鎖ＲＮＡを分解していると考えるのが最も単純な作用機構の仮説となるが、このときに上の事情を勘案すると、二本鎖ＲＮＡ分解活性をもつことだけではＳＭＶに対する増殖抑制効果を十分説明できたとは言えない。 Rsv4 is to assume that decomposes the viral double-stranded RNA produced during replication is the simplest mechanism of action hypothesis, when considering the situation above in this case, have a double-stranded RNA degradation activity just it can not be said to be was able to fully explain the growth inhibitory effect on SMV.

細胞質から隔離された複製の場においてＲｓｖ４がウイルス二本鎖ＲＮＡを分解するにはウイルスの近くにＲｓｖ４が存在しなければならない。 The Rsv4 in place of replication isolated from the cytoplasm degrades viral double-stranded RNA must be present Rsv4 near the virus. ＳＭＶのＰ３タンパク質の機能は不明であるが、膜貫通領域をもつと予測され、いくつかのポティウイルス属ウイルスにおいては、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Pol）と相互作用することが報告されている（Ｍｅｒｉｔｓ，Ａ．，Ｇｕｏ，Ｄ．，Ｊａｒｖｅｋｕｌｇ，Ｌ．＆ Ｓａａｒｍａ，Ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｏｔａｔｏ Ａ Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ－Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐ１ ａｎｄ Ｐ３ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６３，１５－２２（１９９９）．Ｇｕｏ，Ｄ．，Ｒａｊａｍａｋｉ，Ｍ．－Ｌ．，Ｓａａｒｍａ，Ｍ．＆ Ｖａｌｋｏｎｅｎ，Ｊ．Ｐ．Ｔ．Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍａｐ ｏｆ ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｘｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２，９３５－９３９（２００１）．Ｓｈｅｎ ＷＴ，Ｗａｎｇ ＭＱ，Ｙａｎ Ｐ，Ｇａｏ Ｌ，Ｚｈｏｕ Ｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ ｏｆ Ｐａｐａｙａ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｐ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ．Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ，５４（１）：４９－５４（２０１０）．）。 Function of P3 proteins of SMV is unknown, is predicted to have a transmembrane region, in some potyvirus genus virus, has been reported to interact with the viral RNA polymerase (Pol) (Merits, A., Guo, D., Jarvekulg, L. & Saarma, M.Biochemical and Genetic Evidence for Interactions between Potato A Potyvirus-Encoded Proteins P1 and P3 and Proteins of the Putative Replication Complex.Virology 263,15-22 (1999) . .Guo, D., Rajamaki, M.-L., Saarma, M & Valkonen, J.P.T.Towards a protein interaction map of potyviruses: protein interaction matrixes of two potyviruses based on the yeast two-hybrid system. J.Gen.Virol.82,935-939 (2001) .Shen WT, Wang MQ, Yan P, Gao L, Zhou P.Protein interaction matrix of Papaya ringspot virus type P based on a yeast two-hybrid system.Acta Virol , 54 (1): 49-54 (2010)).. したがって、Ｐ３は複製の場に存在することが予想され、Ｒｓｖ４がＰ３と相互作用するならば、本来細胞質から隔離された複製の場であっても、Ｒｓｖ４が潜り込んでウイルス二本鎖ＲＮＡを分解することで増殖を抑制する可能性がある。 Thus, P3 is expected to be present in duplicate field, if interact with Rsv4 is P3, even a place of replication that is isolated from the original cytoplasm, degrade viral double-stranded RNA sunk is Rsv4 there is a possibility to suppress the growth by. そこで、Ｒｓｖ４とＳＭＶ Ｐ３の相互作用を調べた。 Therefore, we examined the interaction of Rsv4 and SMV P3.

ＦＬＡＧタグ融合Ｒｓｖ４とＭｙｃタグ融合Ｐ３（Ｐ３－Ｍｙｃ）を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウムをＮ． N. Agrobacterium carrying the FLAG tag fusion Rsv4 and Myc-tagged fusion P3 (P3-Myc) plasmid expressing ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に接種し、３日後に葉を破砕して遠心により調製した膜画分をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で可溶化した後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降を行った。 It was inoculated into benthamiana leaves, a membrane fraction prepared by centrifugation and disrupted leaves after 3 days after solubilized with Triton X-100, immunoprecipitation was performed with anti-FLAG antibody. すると免疫沈降画分（ＦＬＡＧ―ＩＰ）にＲｓｖ４－ＦＬＡＧとともにＰ３－Ｍｙｃが検出された。 Then P3-Myc with Rsv4-FLAG has been detected in immunoprecipitation fraction (FLAG-IP). このことから、Ｒｓｖ４とＳＭＶ Ｐ３との相互作用が確認された（図８）。 Therefore, interaction between Rsv4 and SMV P3 was observed (FIG. 8). この相互作用は、Ｄ９９Ｎ変異体においても維持された。 This interaction was maintained even in the D99N mutant.

以上の結果より、Ｒｓｖ４はＰ３との相互作用を介してＳＭＶの複製の場に潜り込み、そこでウイルスの複製により生じた二本鎖ＲＮＡを分解することによって抵抗性を示すという作用機構のモデルが考えられた（図９）。 These results, RSV4 is penetration into play replication SMV via interaction with P3, where the model of the mechanism of action of exhibiting resistance by breaking the double-stranded RNA produced is contemplated by the replication of the virus obtained (Figure 9).

実施例８ Ｒｓｖ４遺伝子の連鎖マーカーの特定 Ｒｓｖ４連鎖マーカー（Ｒｓｖ４＿４４６およびＲｓｖ４＿３２０、２マーカーの物理距離は１２６ｋｂ）を用いて「エンレイ」を反復親とする「エンレイ」×「Ｐｅｋｉｎｇ」の戻し交雑後代合計９，３２０個体（表１）の遺伝子型を解析し、２つのＲｓｖ４連鎖マーカー間で乗り換えを生じていた３９個体を選抜した（表１）。 Example 8 Rsv4 specific Rsv4 chain marker of chain marker of gene (physical distance of Rsv4_446 and Rsv4_320,2 markers 126kb) backcross progeny total of "Enrei" × "Peking" to the recurrent parent to "Enrei" using the 9 , 320 individuals were analyzed genotypes (Table 1), were selected 39 individuals which was resulted in transfer between two Rsv4 linked markers (Table 1). さらに、１２６ｋｂの候補領域内に存在するＳＳＲ、エンレイ－Ｐｅｋｉｎｇの塩基配列比較によって見出されたＳＮＰおよびＩｎｄｅｌの変異を解析し、６箇所のＳＳＲ、２箇所のＳＴＳ、５箇所のＳＮＰの遺伝子型を決定した（図１３）。 In addition, SSR that exists within the candidate area of ​​126kb, to analyze the SNP and Indel of mutations have been found by the base sequence comparison of Enrei -Peking, of six SSR, of two places STS, 5 places SNP genotypes of It was determined (Figure 13). 乗り換え個体から得られた種子を用いてＳＭＶ－Ｃ系統の後代検定を行った結果、Ｒｓｖ４遺伝子を９．８ｋｂｐの領域（図１３中の両矢印）に絞り込んだ。 Using a seed obtained from the transfer individuals results of the progeny test SMV-C strain, narrowed down Rsv4 gene region (double arrow in FIG. 13) of 9.8kbp. この領域には、表６及び図１２に示す連鎖マーカーが含まれていた。 This region contained a linked markers shown in Table 6 and FIG. 12. 約１万個体を調べても、ＳＭＶ抵抗性と完全に一致していることから、表６及び図１２に記載した連鎖マーカーは高精度の選抜が可能なマーカーと言える。 Also examine the approximately 10,000 individuals, since it is fully consistent with SMV resistance, linked markers described in Table 6 and 12 it can be said that the selection is marker of high precision.

以下に、各実施例で用いられた実験方法を記載する。 The following describes the experimental method used in each example.
各ウイルス株は農業生物資源研究所ジーンバンクより入手した。 Each virus strain was obtained from the National Institute of Agrobiological Sciences Gene bank. 各ウイルスの登録番号は、以下のとおりである。 Registration number of each virus is as follows. ＳＭＶ－Ｃ：ＭＡＦＦ １０４０６５，ＴｕＭＶ：ＭＡＦＦ ７１５０６２，ＰＶＹ：ＭＡＦＦ ３０７０２４，ＢＣＭＶ：ＭＡＦＦ ７１５０４９，ＰＶＡ：ＭＡＦＦ ３０７０２８，ＰｅＭｏＶ：３０７０４４。 SMV-C: MAFF 104065, TuMV: MAFF 715062, PVY: MAFF 307024, BCMV: MAFF 715049, PVA: MAFF 307028, PeMoV: 307044. ウイルスの機械接種には、感染葉を１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で破砕したものを感染源として使用した。 The machine inoculation of the virus, was used to infected leaves were crushed with 10mM sodium phosphate pH7.0 as the source of infection. ウェスタンブロッティングには、大腸菌で発現した組換えＳＭＶ ＣＰ及びＲｓｖ４（配列番号６）の残基番号７８～２５９を含む断片を抗原としたウサギ抗血清を使用した。 The Western blotting, a fragment comprising residues numbered 78-259 of the recombinant SMV CP and Rsv4 were expressed in E. coli (SEQ ID NO: 6) were used rabbit antiserum to the antigen. ウイルスを検出するためのＲＴ－ＰＣＲは、表５に記載のプライマー（配列番号９７～１０６）のうち各ウイルスに対応したものを選択して用いるとともに、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔを用いて行った。 RT-PCR for detection of viruses, together with selected and used corresponding to each virus of the primers (SEQ ID NO: 97-106) described in Table 5, using the QIAGEN, QIAGEN OneStep RT-PCR Kit and I went.

Ｒｓｖ４のポジショナルクローニングに用いた材料のうち、ＳＭＶ全系統抵抗性品種「Ｐｅｋｉｎｇ」および感受性品種「エンレイ」は２００６年に長野県中信農業試験場（現長野県野菜花き試験場）より入手した。 Among the materials used in the positional cloning of Rsv4, SMV all strains resistant varieties "Peking" and susceptible variety "Enrei" was obtained from Nagano Prefecture CITIC Agricultural Experiment Station (now Nagano Prefecture vegetables flowers Experiment Station) in 2006. ＳＭＶ抵抗性遺伝子Ｒｓｖ４周辺におけるＳＳＲマーカーの開発には、「エンレイ」×「Ｐｅｋｉｎｇ」のＦ２雑種集団を用いた。 To the development of SSR markers in SMV resistance gene Rsv4 around, using the F2 hybrid population of "Enrei" × "Peking". また、Ｒｓｖ４のファインマッピングには、「エンレイ」×「Ｐｅｋｉｎｇ」のＦ１雑種に反復親の「エンレイ」を戻し交雑したＢＣ１Ｆ１個体をはじめ、さらに戻し交雑を進めた種々の世代の戻し交雑後代を使用した（表１）。 In addition, the fine mapping of Rsv4, using a variety of generation of the backcross progeny beginning, advanced a further backcrossing the BC1F1 individuals backcross the "Enrei" of recurrent parent to F1 hybrid of "Enrei" × "Peking" and (Table 1).

ＳＭＶの接種検定は、以下に説明するＳＳＲマーカー解析、ＳＴＳマーカー解析、ＳＮＰマーカーのうちのいずれかの遺伝子型解析方法により選ばれた植物を用いて行った。 SMV inoculation assay, SSR marker analysis as described below, STS marker analysis was performed using the selected plants by either genotyping method of the SNP markers. まず、植物体の遺伝子型を決定し、その植物体から得た自殖種子を播種し、初生葉が展開した約２週間後の次世代の実生株をＳＭＶの接種検定に用いた。 First, to determine the genotype of the plant, that were seeded the self-fertilized seeds obtained from a plant, using the seedlings strain of the next generation of about two weeks after the primary leaf was developed in the inoculated test of SMV. ＳＭＶの接種は、あらかじめＳＭＶを増殖させた感受性品種「Ｊａｃｋ」の感染葉を１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で破砕し、カーボランダムを用いた汁液接種法により初生葉に接種することにより行った。 Inoculation of SMV was performed by pre-infected leaves of susceptible varieties were grown SMV "Jack" was crushed in 10mM sodium phosphate pH7.0, to inoculate the primary leaf by sap inoculation method using a carborundum. 接種後、約１週間から１０日の上位葉における病徴を観察することにより抵抗性を判定した。 After inoculation, it was determined resistance by observing the symptoms in the upper leaves of about 1 week 10 day. 系統あたり１５株～３０株を調査し、全く病徴が現れなかった系統を抵抗性、８割以上が発病したものを罹病性、それらの中間をヘテロとしてそれぞれ判定した。 To investigate the 15 shares and 30 shares per system, completely resistant to strains that did not appear symptom, susceptibility those that more than 80% became ill, was determined respectively those of intermediate as a hetero.

ダイズのゲノムＤＮＡは、グアニジン塩酸塩とプロテイナーゼＫを用いたＫｈｏｓｌａ ｅｔ ａｌ． Soybean genomic DNA, Khosla et al using guanidine hydrochloride and proteinase K. の方法（Ｋｈｏｓｌａ Ｓ，Ａｕｇｕｓｔｕｓ Ｍ、Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｉ Ｖ （１９９９）．Ｓｅｘ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｄｄｌｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅａｌｙｂｕｇ Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：３７４５－３７５１）に従い、凍結乾燥させた未展開葉３小葉、またはドリルで削りとった約１００ｍｇの種子粉末より抽出した。 Of how (Khosla S, Augustus M, Brahmachari V (1999) .Sex-specific organisation of middle repetitive DNA sequences in the mealybug Planococcus lilacinus.Nucleic Acids Res.27: 3745-3751) in accordance with, the non-deployment leaves 3 freeze-dried extracted from the seed powder of about 100mg of O'been cut with small leaves or drill,. Ｔｏｔａｌ ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて未展開の第２あるいは第３本葉３枚より抽出した。 Total RNA was extracted from the second or three third true leaf of non-deployed using the QIAGEN Inc. RNeasy Plant Mini Kit of.

Ｒｓｖ４遺伝子の染色体上の座乗位置を大まかに絞り込むため、近傍に座乗すると予想された５種類のＳＳＲマーカー（表２）を用いてＦ２雑種集団のＳＳＲマーカー解析を実施した。 To narrow down the Zajo position on the chromosome of Rsv4 gene roughly, were carried out SSR marker analysis of F2 hybrid populations using five types of SSR markers it was expected to Zajo in the vicinity (Table 2). Ｒｓｖ４遺伝子と最も近接していたＳＳＲマーカーのＧＭＥＳ０７７７の塩基配列情報を用いて、米国ＤＯＥ－ＪＧＩ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ'ｓ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって２００９年に公開されたダイズゲノムアッセンブリ“Ｇｌｙｍａ０”の塩基配列情報をＢｌａｓｔ検索し、ＧＭＥＳ０７７７を含む塩基配列情報を取得した。 Using a base sequence information of GMES0777 of SSR markers that had been most closely with Rsv4 gene, US DOE-JGI (Department of Energy's Joint Genome Institute) by soybean genome assembly was published in 2009, "Glyma0" nucleotide sequence of the and Blast searches the information was acquired nucleotide sequence information including GMES0777. さらにＲｓｖ４遺伝子に近接したＳＳＲマーカーを設計し、Ｆ２雑種集団のＳＳＲマーカー解析を実施するために、反復配列抽出ソフトのｒｅａｄ２Ｍａｒｋｅｒ（Ｆｕｋｕｏｋａ Ｈ，Ｎｕｎｏｍｅ Ｔ，Ｍｉｎａｍｉｙａｍａ Ｙ，Ｋｏｎｏ Ｉ，Ｎａｍｉｋｉ Ｎ，Ｋｏｊｉｍａ Ａ（２００５）．Ｒｅａｄ２Ｍａｒｋｅｒ：ａ ｄａｔａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅｍ ｄａｔａ ｓｅｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３９：４７２－４７６．）を用いて、取得した“Ｇｌｙｍａ０”に含まれるＳＳＲ配列および位置情報を抽出し、それを挟みかつ百数十塩基の配列を増幅させるようにプライマー設計ソフトＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ Ｓ，Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ ＨＪ（２０００）Ｐｒｉｍｅｒ３ ｏｎ ｔｈｅ ＷＷＷ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｕｓｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ．Ｉｎ：Ｋｒａｗｅｔｚ Ｓ，Ｍｉｓｅｎｅｒ Ｓ（ｅｄｓ）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ ３６５－３８６．）を用いて２５種類のＳＳＲプライマーを設計した（配列番号２９～７８：表２～３の「Ｒｓｖ４のマッピングに使用したプライマー（新たに設計したもの）」参照）。 In addition to designing the SSR markers in close proximity to the Rsv4 gene, in order to implement the SSR marker analysis of F2 hybrid population, read2Marker of repeat sequences extraction software (Fukuoka H, ​​Nunome T, Minamiyama Y, Kono I, Namiki N, Kojima A ( 2005) .Read2Marker: a data processing tool for microsatellite marker development from a largem data set.Biotechniques 39:. 472-476) was used to extract the SSR sequence and position information is included in the acquired "Glyma0", it scissors and hundred primer design software so as to amplify the sequence of a few tens of base Primer3 (Rozen S, Skaletsky HJ (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.In:Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols:. Methods in Molecular Biology.Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386) were designed 25 types of SSR primers (SEQ ID NO: 29 to 78: used to map the "Rsv4 of tables 2-3 primers (new ones were designed) "reference). フォワードプライマーの５'末端はＡＢＩ社の蛍光色素で標識した。 5 'end of the forward primer was labeled with ABI Co. fluorescent dye. ＳＳＲプライマー（配列番号１９～７８：表２～３の「Ｒｓｖ４のマッピングに使用したプライマー」及び「Ｒｓｖ４のマッピングに使用したプライマー（新たに設計したもの）」参照）、ゲノムＤＮＡ、およびＱＩＡＧＥＮ社のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔを混合してＰＣＲを行い、蛍光化されたＰＣＲ産物を増幅した。 SSR primer (SEQ ID NO: 19 ~ 78: see Table 2 "primers were used to map the Rsv4" to 3 and "primers used to Rsv4 of mapping (new ones were designed)"), genomic DNA, and QIAGEN Inc. PCR was carried out by mixing the Multiplex PCR Kit, it was amplified fluorescence of PCR products. これをＡＢＩ社のＡＢＩ３７００もしくはＡＢＩ３７３０ ＤＮＡシーケンサーを用いて電気泳動し、ＡＢＩ社のフラグメント解析ソフトＧｅｎｅｍａｐｐｅｒを用いて、ＳＳＲマーカーの両親間多型および雑種後代の遺伝子型を解析した。 This was electrophoresis using an ABI, Inc. ABI3700 or ABI3730 DNA sequencer, using the ABI's fragment analysis software Genemapper, the analysis of the polymorphism and hybrid progeny of genotype between the parents of SSR markers. ＳＳＲマーカーをはじめとする各種のマーカーとＲｓｖ４遺伝子との連鎖解析には連鎖解析ソフトＪｏｉｎＭａｐ ４．０（Ｖａｎ Ｏｏｉｊｅｎ，ＪＷ（２００６）ＪｏｉｎＭａｐ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０，Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐｓ．Ｋｙａｚｍａ Ｂ．Ｖ．，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ, ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いた。 Linkage analysis in linkage analysis with a variety of markers and Rsv4 gene, including the SSR markers soft JoinMap 4.0 (Van Ooijen, JW (2006) JoinMap Version 4.0, Software for the calculation of genetic linkage maps.Kyazma B .V., Wageningen, was used the Netherlands).

イルミナ社の次世代型シーケンサーＨｉｓｅｑ２０００を用いてダイズ品種「エンレイ」および「Ｐｅｋｉｎｇ」のそれぞれについて１３．１Ｇｂｐおよび９．１Ｇｂｐの塩基配列解読データを取得した。 Illumina, Inc. has acquired the base sequencing data of 13.1Gbp and 9.1Gbp for each of the soybean varieties "Enrei" and "Peking" by using the next-generation sequencer Hiseq2000 of. この塩基配列解読データをＣＬＣ社の次世代型塩基配列用解析ソフトＣＬＣ－Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈのマッピングモジュールを用いて、ダイズゲノムのリファレンス配列“Ｇｌｙｍａ１”（米国ＤＯＥ－ＪＧＩによって２０１０年に公開）にマップした。 The base sequencing data by using the CLC, Inc. analysis software CLC-Genomic Workbench mapping module for next-generation base sequence of, was mapped to the reference sequence "Glyma1" of the soybean genome (published in 2010 by the US DOE-JGI) . ＳＮＰマーカー解析を実施するため、リファレンス配列の供与親である感受性品種「Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２」の塩基配列（配列番号１８）と、「エンレイ」および「Ｐｅｋｉｎｇ」の塩基配列情報（配列番号１７および１４）を比較して、Ｒｓｖ４遺伝子座に連鎖したＳＳＲマーカーに挟まれたＲｓｖ４遺伝子座候補領域内のエンレイ－Ｐｅｋｉｎｇ間のＳＮＰ（配列番号１３）を抽出し、その周辺配列に上記のプライマー設計ソフトを用いて１０種類（配列番号７９～８８：表４の「ダイレクトシーケンスによるＳＮＰマーカー解析に使用したプライマー」参照）のプライマーを設計し、ダイレクトシーケンス法による塩基配列解読を行い、７種類のＳＮＰマーカー（Ｒｓｖ４－ｓ０４－０７－０１、Ｒｓｖ４－ｓ０４－０７－０２、Ｒｓｖ４－ｓ０３５－６＿７１、Ｒｓｖ４－８６１０５ｓｎｐ＿４２、Ｒｓｖ４－ＲＣ－１＿９３＿１、Ｒｓｖ４－ＲＣ－１＿９３＿２、Ｒｓｖ４－ＲＣ－３＿５５）の遺伝子型を判定した。 For carrying out the SNP marker analysis, the nucleotide sequence of the susceptible cultivar "Williams 82" is the donor parent of the reference sequence (SEQ ID NO: 18), the nucleotide sequence information of "Enrei" and "Peking" (SEQ ID NO: 17 and 14) in comparison, extracts SNPs (SEQ ID NO: 13) between Enrei -Peking of Rsv4 locus candidate area between the SSR markers linked to Rsv4 locus, using the above primer design software to its surrounding sequence 10 type: a primer (SEQ ID NO: 79 to 88 see Table "primer was used for the SNP marker analysis by direct sequence" of 4) design, performs a base sequencing by direct sequencing method, seven types of SNP markers (Rsv4- s04-07-01, Rsv4-s04-07-02, Rsv4-s035-6_71, Rsv4-86105snp_42, Rsv4-RC-1_93_1, Rsv4-RC-1_93_2, to determine the genotype of Rsv4-RC-3_55).

Ｒｓｖ４遺伝子近傍では、感受性品種の「Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２」のリファレンス配列と上記の感受性品種「エンレイ」の塩基配列解読データは類似していたが、「Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２」のリファレンス配列には、抵抗性品種「Ｐｅｋｉｎｇ」の解読データの存在しない約３．６ｋｂの配列が見つかった。 In Rsv4 gene neighborhood, but base sequencing data of the reference sequence and the above-sensitive variety "Enrei" of the "Williams 82" of sensitive varieties were similar, to the reference sequence of the "Williams 82", resistant varieties, "Peking that does not exist about 3.6kb array of decoding data of "is found. そこで、その配列が存在するか否かを判定するためのＳＴＳマーカー解析を実施した。 Therefore, we carried out the STS marker analysis to determine whether the sequence is present. 上記のプライマー設計ソフトを用いて、その周辺配列にＳＴＳプライマーを設計し（Ｒｓｖ４－Ｓｅｑ０３、配列番号１１および１２：表３の「ＩｎＤｅｌを検出するためのＳＴＳプライマー」参照）、当該領域をＴａｋａｒａ社のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬを用いたＰＣＲにより増幅し、１％のアガロース電気泳動によってＰＣＲ産物を検出した。 Using the above primer design software to design STS primers surrounding sequence (Rsv4-Seq03, SEQ ID NO: 11 and 12: see "STS primer for detecting InDel" in Table 3), Takara Co. the region of it was amplified by PCR using PrimeSTAR GXL, to detect PCR product by 1% agarose electrophoresis. ＳＴＳマーカーの遺伝子型はＰＣＲ産物のサイズにより判定した。 Genotype of STS markers was determined by the size of the PCR product.

Ｒｓｖ４遺伝子座を挟む２つのＳＳＲマーカー（Ｒｓｖ４－４４６およびＲｓｖ４－３２０）を用いて、計９，３２０個体の雑種後代のＳＳＲマーカー解析を実施し、２つのＳＳＲマーカー間で乗換えを生じた３９個体の雑種後代を選出した（表１）。 Using two SSR markers flanking the Rsv4 locus (Rsv4-446 and Rsv4-320), we conducted a SSR marker analysis of hybrid progeny of a total of 9,450 individuals, 39 individuals that resulted in a transfer between the two SSR markers He was elected the hybrid progeny (Table 1). これらの乗換え個体から得られた種子を用いてＳＭＶの接種検定を行い、ＳＭＶに対する表現型を決定したとともに、Ｒｓｖ４遺伝子座近傍の各種マーカーの遺伝子型を解析した。 Performed inoculation test SMV using a seed obtained from these transfer individuals, together to determine the phenotype for SMV, we analyzed the genotype of Rsv4 locus near the various markers. ＳＭＶ抵抗性の表現型と強連鎖するマーカーを検索したところ、６種類のＳＮＰマーカー（Ｒｓｖ４－ｓ０３５－６＿７１、Ｒｓｖ４－８６１０５ｓｎｐ＿４２、Ｒｓｖ４ －ｓｅｑ－０３、Ｒｓｖ４＿３５５、Ｒｓｖ４－ＲＣ－１＿９３＿１、Ｒｓｖ４－ＲＣ－１＿９３＿２）の遺伝子型が表現型と一致し、それらが座乗する約９．８ｋｂｐの領域がＲｓｖ４遺伝子座候補領域であると考えられた。 A search of the marker to phenotype and a strong chain of SMV resistance, six types of SNP markers (Rsv4-s035-6_71, Rsv4-86105snp_42, Rsv4 -seq-03, Rsv4_355, Rsv4-RC-1_93_1, Rsv4-RC- genotype 1_93_2) matches the phenotype region of about 9.8kbp which they Zajo was considered Rsv4 locus candidate region. また、これらのマーカーは表６に記載されている基準に基づけば、機能を有するＲｓｖ４遺伝子の有無を高精度に判定できる。 Furthermore, these markers Based on the criteria listed in Table 6 can determine whether Rsv4 gene having a function with high accuracy. これらのマーカーの検出に用いるプライマーセット及びその配列は、表３、表４及び配列表に記載した。 Primer set and the sequence used for the detection of these markers, Table 3, set forth in Table 4 and the sequence listing.
上記リファレンス配列上では、この上流に２つの遺伝子（Ｇｌｙｍａ０２ｇ１３４６０およびＧｌｙｍａ０２ｇ１３４７０）が予測されているが、それらの機能はＲｓｖ４遺伝子が有する特徴的な抵抗性を説明できるものではなかった。 On the above reference sequence, but the two genes upstream (Glyma02g13460 and Glyma02g13470) is predicted, and their functions were not able to explain the characteristic resistance possessed by the Rsv4 gene.

・Ｒｓｖ４遺伝子の塩基配列解読 ゲノム増幅用のプライマーペアｒｓｖ４Ｌ１５＿Ｌ＿４９５７（配列番号８９および９０：表４の「Ｒｓｖ４を含むゲノム領域(１６ｋｂ)の塩基配列を決定するために使用したプライマー」参照）およびＴａｋａｒａ社のＰｒｉｍｅＳＴＡＲを用いて、抵抗性品種の「Ｐｅｋｉｎｇ」から上記の約９．８ｋｂｐの候補領域を含む約１６ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を増幅した。 · RSV4 gene primer pairs rsv4L15_L_4957 (SEQ ID NO: 89 and 90: see "primer was used to determine the nucleotide sequence of the genomic region containing the RSV4 (16 kb)" in Table 4) for base sequencing genomic amplification of and Takara Co. using the PrimeSTAR, was amplified genomic DNA fragment of about 16kbp comprising a candidate region of about 9.8kbp of the from "Peking" of resistant varieties. さらに、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社のＥＺ－Ｔｎ５（登録商標）＜ＫＡＮ－２＞Ｔｎｐ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ（登録商標） Ｋｉｔを用いてランダムライブラリーを作製した。 In addition, to prepare a random library by using the EZ-Tn5 (registered trademark) <KAN-2> Tnp Transposome (registered trademark) Kit of Epicentre company. これらの塩基配列をサンガー法により解読し、Ｇｅｎｅｃｏｄｅ社のＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒを用いてアッセンブルし、ＰｅｋｉｎｇのＲｓｖ４遺伝子座候補領域の塩基配列を決定した。 These base sequences were decoded by the Sanger method, and assembled using a Genecode's Sequencher, to determine the nucleotide sequence of Rsv4 locus candidate region of Peking. 上記リファレンス配列が由来する感受性品種「Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８２」や感受性品種の「エンレイ」では、この領域内にはレトロトランスポゾン様配列を含む約３．６ｋｂの断片が挿入されていたのに対し、抵抗性品種の「Ｐｅｋｉｎｇ」ではオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が２箇所存在することがわかった。 In "Enrei" susceptible cultivar "Williams 82" and susceptible varieties in which the reference sequence is derived, in this area while the fragment of about 3.6kb, including retrotransposon-like sequence has been inserted, resistant varieties the "Peking" in open reading frame (ORF) was found to be present at two positions.

タンパク質がコードされている可能性のあるＯＲＦにＲＴ－ＰＣＲ用のプライマー（ＯＲＦ２：配列番号９１および９２、表５の「ＲＴ－ＰＣＲ用プライマー」参照）を設計し、実生の本葉から抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡおよびＴａｋａｒａ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。 Proteins can be encoded resistant there primer for RT-PCR to ORF (ORF2: SEQ ID NO: 91 and 92, see Table "for RT-PCR primer" 5) were designed, extracted from the leaves of the seedlings RT-PCR was performed using the PrimeScript One Step RT-PCR Kit of Total RNA and Takara Company. ＴＯＹＯＢＯ社のＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ｍＲＮＡ－を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡよりｍＲＮＡを精製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）のＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標） ＫｉｔおよびＲｓｖ４候補遺伝子の５'末端および３'末端の読み枠に設計した４種類のネストプライマー（ｒｓｖ４－５－１、ｒｓｖ４－５－２、ｒｓｖ４－３－１、ｒｓｖ４－３－２：配列番号９３～９６、表５の「ＧｅｎｅＲａｃｅｒに使用したプライマー」参照）を用いて、５'末端配列および３'末端配列を取得した。 mRNA was purified from the Total RNA using MagExtractor-mRNA-of TOYOBO Co., Invitrogen (TM) of GeneRacer (TM) Kit and RSV4 5 of 5 'end and a 3' four types were designed reading frame of the end of the candidate gene nested primers (rsv4-5-1, rsv4-5-2, rsv4-3-1, rsv4-3-2: SEQ ID NO: 93-96, see "primers were used to GeneRacer" in Table 5) was used, 5 were obtained 'and 3' end sequences.

・ダイズ形質転換体の作出 カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子の５'制御領域、Ｒｓｖ４タンパク質コード領域およびＡ． - 5 'regulatory region of the producing cauliflower mosaic virus CaMV 35S RNA gene of soybean transformants, Rsv4 protein coding region and A. ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｎｏｓ遺伝子のポリＡ付加配列を連結したコンストラクト（配列番号１１２）をｐＵＨＲベクター（ＳＫ）（Ｋ Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ Ｋｉｔａ，Ｍ Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｍ Ｉｓｈｉｍｏｔｏ（２００６）Ａ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤｓＲｅｄ２，ａｓ ａ ｖｉｓｕａｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２５（１２），１３５５－１３６１．）のＳｐｅＩ－ＸｈｏＩサイトに組み込んでＲｓｖ４遺伝子過剰発現コンストラクトを作製した（図１１）。 tumefaciens Nos construct that is the concatenation of poly A addition sequence of the gene (SEQ ID NO: 112) the pUHR vector (SK) (K Nishizawa, Y Kita, M Kitayama, M Ishimoto (2006) A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean.Plant Cell Reports, 25 (12), 1355-1361. the Rsv4 gene overexpression construct incorporated into the SpeI-XhoI sites) were produced (Figure 11). 高木らのダイズの形質転換プロトコール（高木恭子・山田哲也・石本政男：形質転換プロトコール（植物編）（２０１２）田部井豊 編、化学同人．４０－５７）に従い、Ｒｓｖ４遺伝子過剰発現コンストラクトをパーティクルガン法によりＳＭＶ感受性のダイズ品種「Ｊａｃｋ」に導入した。 Takagi et al., Soybean transformation protocols (Kyoko Takagi Tetsuya Yamada Masao Ishimoto: transformation protocol (plant ed.) (2012) Yutaka Tabei, eds., Kagakudojin .40-57) in accordance with, the particle gun method Rsv4 gene overexpression construct It was introduced into soybean varieties of SMV-sensitive "Jack" by the.

・プラスミドの構築 Ｎ． - Construction of Plasmid N. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの一過的発現実験では以下のプラスミドを使用した。 It was used the following plasmids in transient expression experiments benthamiana. ｐＭＬＨ７１３３（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ａ，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ Ｙ，Ｏｎｏｄｅｒａ Ｈ，Ｔａｂｅｉ Ｙ，Ｔｏｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｒｉｃｅ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒｓ，Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ．Ｅｎｔｏｍｏｌ Ｅｘｐ Ａｐｐｌ ９３：１７３－１７８．）のＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ切断部位の間にＲｓｖ４ ｃＤＮＡ（配列番号１）を挿入してＲｓｖ４タンパク質を発現するプラスミド（ｐＭＬＨＲｓｖ４）を作製した。 pMLH7133 (Mochizuki A, Nishizawa Y, Onodera H, Tabei Y, Toki S, et al (1999) Transgenic rice plants expressing a trypsin inhibitor are resistant against rice stem borers, Chilo suppressalis.Entomol Exp Appl 93:. 173-178.) to prepare a plasmid (pMLHRsv4) expressing the Rsv4 protein by inserting a Rsv4 cDNA (SEQ ID NO: 1) between the BamHI and SacI cleavage site. Ｒｓｖ４タンパク質の活性中心を破壊した変異型Ｒｓｖ４タンパク質を発現するプラスミドは、ｐＭＬＨＲｓｖ４中のＲｓｖ４ ｃＤＮＡにおけるＲｓｖ４タンパク質の９９番目のアスパラギン酸残基をコードするコドン（ＧＡＴ）をアスパラギンのコドン（ＡＡＴ）に置換して作製した。 Plasmid expressing the disrupted mutant Rsv4 protein the active center of Rsv4 protein, replace the codon (GAT) which encodes the 99th aspartic acid residue of Rsv4 protein in Rsv4 cDNA in pMLHRsv4 to asparagine codon (AAT) It was produced. ＦＬＡＧタグが付加されたＲｓｖ４タンパク質を発現するプラスミドは、ｐＭＬＨＲｓｖ４中のＲｓｖ４ ｃＤＮＡにおけるＲｓｖ４タンパク質の２５９番目のアスパラギン残基をコードするコドン（ＡＡＴ）と終止コドン（ＴＧＡ）の間に５'－ｇｇａｇｇｔｇｇａｇａｔｔａｔａａｇｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔａａｇ－３'（配列番号１０７）を挿入して作製した。 Plasmid expressing Rsv4 protein FLAG tag is added is, 5'-ggaggtggagattataaggatgatgatgataag- between the codon encoding the 259 th of an asparagine residue of Rsv4 protein in Rsv4 cDNA in pMLHRsv4 (AAT) and the stop codon (TGA) 3 'was prepared by inserting (SEQ ID NO: 107).

感染性ＳＭＶ ｃＤＮＡクローンは、ＲＴ－ＰＣＲにより増幅したＳＭＶ ｃＤＮＡをｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にクローニングすることにより作製した（図１０）。 Infectious SMV cDNA clone was generated by cloning the SMV cDNA amplified by RT-PCR in pBI121 (Clontech Inc.) (Figure 10). ＳＭＶ－Ｌ（Ｑ１０３３Ｋ）はＧｅｎｂａｎｋに登録されたＳＭＶ－Ｌの配列（ＥＵ８７１７２４）を基に、ＳＭＶ ｃＤＮＡの１０３３番目のグルタミン酸残基のコドン（ＣＡＧ）をリシン残基のコドン（ＡＡＧ）に置換した配列をもつ全長ｃＤＮＡを合成することにより作製した。 SMV-L (Q1033K) is based on the SMV-L sequence of which has been registered in Genbank (EU871724), to replace the codon (CAG) of the 1033 th glutamic acid residue of SMV cDNA in codon (AAG) of lysine residues It was prepared by synthesizing full-length cDNA having the sequence. Ｍｙｃタグが付加したＰ３を発現するプラスミドは、上記ＳＭＶ ｃＤＮＡに対して、ＳＭＶ－Ｃポリプロテインの７６６番目のグリシン残基から１１１２番目のグルタミン残基までをコードする領域の５'側にａｔｇを、３'側に５'－ｇｇａａｇａｔｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｔａｔｔｔｃｔｇａｇｇａｇｇａｔｃｔｔｔｇａ－３'（配列番号１０８）を付加したのち、それをｐＭＬＨ７１３３にクローニングすることにより作製した。 Plasmid expressing a P3 that Myc tag has been added is, with respect to the SMV cDNA, the atg the 5 'side of the region encoding the 766 th glycine residue of SMV-C polyprotein until 1112 th glutamine residue , 3 are added with (SEQ ID NO: 108) '5'-ggaagatctgagcagaagcttatttctgaggaggatctttga-3' side, was produced by cloning it in pMLH7133. トマトブッシースタントウイルスのｐ１９を発現するプラスミドは、人工合成したｐ１９遺伝子配列をｐＲＩ１０１－ＡＮ（タカラバイオ社）にクローニングして作製した。 Plasmids expressing p19 of tomato bushy stunt virus was produced by cloning the p19 gene sequence artificially synthesized pRI101-AN (Takara Bio Inc.).

ＲＮＡ分解活性の評価に用いる基質ＲＮＡを合成する際の転写鋳型となるプラスミド（ｐＧＥＭ－ＳＭＶ－７６１０－７９６０）は、ＳＭＶ－Ｃ感染性クローンを鋳型に、５'－ｃｃｃｇｇａｔｃｇａｔＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＣ－３'（配列番号１０９）と５'－ｃｃｃｇｇｇｇａｔｃｃＴＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＣＣＣＡＣ－３'（配列番号１１０）をプライマーに用いたＰＣＲによって増幅した３５０ｂｐのＤＮＡ断片を、プロメガ社ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）のＣｌａＩおよびＢａｍＨＩサイトの間にクローニングすることにより作製した。 Plasmids the transcription template in the synthesis of substrate RNA used for evaluation of the RNA degradation activity (pGEM-SMV-7610-7960) is a SMV-C infectious clone as a template, 5'-cccggatcgatGTTTGTGTTGATGATTTCAACAACC-3 '(SEQ ID NO: the DNA fragment of 350bp was amplified by PCR using 109) and 5'-cccggggatccTCCACAACTGTAGATGGTTGCCCAC-3 '(SEQ ID NO: 110) as primers, by cloning between the ClaI and BamHI sites of Promega pGEM-7Zf (+) It was produced.

・アグロインフィルトレーション 各プラスミドを導入したアグロバクテリウムＣ５８Ｃ１株の菌体をバッファー（１０ｍＭ ＭＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ５．８，１０ｍＭ ＭｇＣｌ ₂ ，２００μＭ アセトシリンゴン）に懸濁した。 · Agroinfiltration buffer Agrobacterium C58C1 strain was introduced each plasmid _{(10mM MES-KOH pH5.8,10mM MgCl 2} , 200μM acetosyringone) were suspended in. 特に表記が無い場合にはＲｓｖ４タンパク質及びその誘導体あるいはＰ３－Ｍｙｃを発現するプラスミドを導入したアグロバクテリウム懸濁液は最終濃度ＯＤ ₆₀₀ ＝０．５に、感染性ＳＭＶ ｃＤＮＡを含むプラスミドを導入したアグロバクテリウム懸濁液は最終濃度ＯＤ ₆₀₀ ＝０．１に希釈してＮ． In particular Agrobacterium suspension introduced plasmids expressing Rsv4 proteins and derivatives, or P3-Myc when notation is not a final concentration _OD 600 = 0.5, was introduced into a plasmid containing infectious SMV cDNA Agrobacterium suspension is diluted to a final concentration _OD 600 = 0.1 N. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に対するインフィルトレーションに用いた（Ｖａｇｈｃｈｈｉｐａｗａｌａ Ｚ， Ｒｏｊａｓ ＣＭ， Ｓｅｎｔｈｉｌ－Ｋｕｍａｒ Ｍ， Ｍｙｓｏｒｅ ＫＳ（２０１１）Ａｇｒｏｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ： Ｓｉｍｐｌｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， ６７８， ６５－７６）。 It was used for the infiltration against benthamiana leaves (Vaghchhipawala Z, Rojas CM, Senthil-Kumar M, Mysore KS (2011) Agroinoculation and Agroinfiltration:. Simple Tools for Complex Gene Function Analyses Methods in Molecular biology, 678, 65-76). 全ての実験において、上記アグロバクテリウム懸濁液に、強力なＲＮＡサイレンシングサプレッサーであるトマトブッシースタントウイルスのｐ１９を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウムを最終濃度ＯＤ ₆₀₀ ＝０．５となるように加えた。 In all experiments, the above Agrobacterium suspension, strong tomato bushy stunt virus, a RNA silencing suppressors Agrobacterium harboring plasmids expressing p19 to a final concentration _OD 600 = 0.5 It was added to the. ウイルス増殖抑制能の評価には、Ｒｓｖ４タンパク質あるいはその誘導体を発現するアグロバクテリウムをインフィルトレーションした１日後に、ＳＭＶ感染性プラスミドを保有するアグロバクテリウムをインフィルトレーションあるいはウイルスを機械接種した。 The evaluation of the virus ability to suppress proliferation, after a day that was infiltrated with Agrobacterium expressing Rsv4 protein or its derivative, Agrobacterium harboring the SMV infectious plasmid was mechanically inoculated with infiltration or virus.

・ＲＮＡ分解活性の評価 Ｒｓｖ４－ＦＬＡＧあるいはＤ９９Ｎ－ＦＬＡＧを発現するＮ． - Expressing the evaluation Rsv4-FLAG or D99N-FLAG of RNA degradation activity N. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉（アグロ感染後３日目）を、乳鉢を用いてｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））中で破砕した。 Crushing benthamiana leaves (3 days after agro-infection), in homogenize buffer using a mortar (30mM HEPES-KOH pH7.4,100mM KCl, 2mM EDTA, 2mM DTT, Complete EDTA-free protease inhibitor (Roche, Inc.)) did. 破砕液を８００ｘｇで３分間遠心した上清を１６，０００ｘｇで１５分間遠心し、沈殿を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。 The homogenate was centrifuged for 3 min at 800xg the supernatant was centrifuged 15 min at 16,000 xg, and the precipitate was suspended in homogenize buffer containing 1% Triton X-100. 次に懸濁液を１６，０００ｘｇで１５分間遠心し、上清をａｎｔｉ－ＦＬＡＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）と混合して４℃で２時間インキュベートした後、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＤＴＴ，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，０．０００３％ ＢＳＡ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））で４回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌの３ｘＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅを含むＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで溶出した。 The suspension is then centrifuged for 15 minutes at 16,000xg, incubated for 2 hours and the supernatant is mixed with anti-FLAG antibody conjugated agarose (SIGMA, Inc.) and at 4 ℃, Wash buffer (30mM HEPES-KOH pH7. 4,100mM KCl, 2mM DTT, and washed 4 times with 0.2% Triton X-100,0.0003% BSA, Complete EDTA-free protease inhibitor (Roche, Inc.)), including the 3xFLAG peptide of 0.1 mg / ml and eluted with Wash buffer. 溶出液を等体積のグリセロールと混合し、精製タンパク質として－３０℃で保存した。 The eluate was mixed with an equal volume of glycerol and stored at -30 ℃ as a purified protein. 大腸菌由来のＲＮａｓｅ ＨおよびＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅはタカラバイオ社より購入した。 RNase H and S1 nuclease from E. coli were purchased from Takara Bio.

ｐＧＥＭ－ＳＭＶ－７６１０－７９６０をＢａｍＨＩで切断したＤＮＡを鋳型に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写によって［α－ ³² Ｐ］ＣＴＰを取り込んだＲＮＡを作製し、これをＲＮＡ基質とした。 pGEM-SMV-7610-7960 was digested with BamHI DNA as a template, the transcription with T7 RNA polymerase to produce a captured RNA was ^[α- 32 P] CTP, which was used as a RNA substrate. ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドは、合成された一本鎖ＲＮＡに合成ＤＮＡ（５'－ＧＧＴＴＣＴＣＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＡＣＣＣＡＣＣＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡ－３'：配列番号１１１）をアニールさせて作製した。 DNA-RNA hybrids, synthetic DNA into the synthesized single-stranded RNA: were prepared by annealing (5'-GGTTCTCTAACATTTCTCTTCCAACCCACCAGTCTTCCATGAAAA-3 'SEQ ID NO: 111). 二本鎖ＲＮＡは、ｐＧＥＭ－ＳＭＶ－７６１０－７９６０をＣｌａＩで切断したＤＮＡを鋳型にＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写により合成したＲＮＡとアニールさせることにより作製した。 Double-stranded RNA was prepared by synthesized RNA annealed by transcription with SP6 RNA polymerase The DNA was cleaved pGEM-SMV-7610-7960 with ClaI a template.

切断反応は、以下の通り行った。 Cleavage reaction was carried out as follows. Ｒｓｖ４－ＦＬＡＧあるいはＤ９９Ｎ－ＦＬＡＧを発現するＮ． Rsv4-FLAG or N. expressing the D99N-FLAG ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉（アグロ感染後３日目）を、乳鉢を用いてｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））中で破砕した。 Crushing benthamiana leaves (3 days after agro-infection), in homogenize buffer using a mortar (30mM HEPES-KOH pH7.4,100mM KCl, 2mM EDTA, 2mM DTT, Complete EDTA-free protease inhibitor (Roche, Inc.)) did. 破砕液を８００ｘｇで３分間遠心した上清を１６，０００ｘｇで１５分間遠心し、沈殿を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。 The homogenate was centrifuged for 3 min at 800xg the supernatant was centrifuged 15 min at 16,000 xg, and the precipitate was suspended in homogenize buffer containing 1% Triton X-100. 次に懸濁液を１６，０００ｘｇで１５分間遠心し、上清をａｎｔｉ－ＦＬＡＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）と混合して４℃で２時間インキュベートした後、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＤＴＴ，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，０．０００３％ ＢＳＡ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））で４回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌの３ｘＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅを含むＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで溶出した。 The suspension is then centrifuged for 15 minutes at 16,000xg, incubated for 2 hours and the supernatant is mixed with anti-FLAG antibody conjugated agarose (SIGMA, Inc.) and at 4 ℃, Wash buffer (30mM HEPES-KOH pH7. 4,100mM KCl, 2mM DTT, and washed 4 times with 0.2% Triton X-100,0.0003% BSA, Complete EDTA-free protease inhibitor (Roche, Inc.)), including the 3xFLAG peptide of 0.1 mg / ml and eluted with Wash buffer. この溶出液を酵素液とした。 The eluted solution was an enzyme solution. 大腸菌由来のＲＮａｓｅ ＨおよびＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅはタカラバイオ社より購入した。 RNase H and S1 nuclease from E. coli were purchased from Takara Bio. 当該酵素液を適宜切断用バッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．４，５０ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＤＴＴ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で希釈して、ＭｇＣｌ ₂あるいはＭｎＣｌ ₂を加えて、ＲＮＡ基質と２５℃で３０分間インキュベートした。 The enzyme solution appropriately cutting buffer (30mM HEPES-KOH pH7.4,50mM KCl, 2mM DTT, 0.1% Triton X-100) was diluted with, in addition to MgCl ₂ or MnCl _2, RNA substrate and 25 and incubated for 30 min at ° C.. 反応後ＲＮＡを７Ｍ Ｕｒｅａ－１０％ ＰＡＧＥで分離して、オートラジオグラフィーにより検出した。 After the reaction, RNA was separated by 7M Urea-10% PAGE, and detected by autoradiography.

・Ｒｓｖ４－ＦＬＡＧとＰ３－Ｍｙｃの相互作用解析 Ｒｓｖ４－ＦＬＡＧとＰ３－Ｍｙｃを発現するアグロバクテリウムを同時にＮ． · Rsv4-FLAG and at the same time N. Agrobacterium expressing the interaction analysis Rsv4-FLAG and P3-Myc of P3-Myc ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉にインフィルトレーションし、３日後に葉を乳鉢を用いてＴＲ ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．４，８０ｍＭ ＫＯＡｃ，１．８ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ） ₂ ，２ｍＭ ＤＴＴ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））中で破砕した。 and infiltrated into benthamiana leaf, using a mortar leaves after 3 days TR buffer (30mM HEPES-KOH pH7.4,80mM KOAc, 1.8mM Mg (OAc) 2, 2mM DTT, Complete EDTA-free protease inhibitor ( It was crushed by Roche)) in. 破砕液を８００ｘｇで３分間遠心した上清をさらに１６，０００ｘｇで１５分間遠心して得た沈殿を、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＴＲ ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。 The lysate precipitate centrifuged supernatant 3 minutes was obtained and further centrifuged for 15 minutes at 16,000xg at 800xg was suspended in TR buffer containing 1% Triton X-100. 次に懸濁液を１６，０００ｘｇで１５分間遠心して得た上清を、ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）と混合して４℃で２時間インキュベートした。 The The suspension obtained was centrifuged for 15 minutes at 16,000xg the supernatant was incubated anti-FLAG antibody conjugated agarose (SIGMA Co.) mixed to 2 hours at 4 ° C.. その後、Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＤＴＴ，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））で４回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌの３ｘＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅを含むＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで溶出した。 Then, Wash buffer washed four times with (30mM HEPES-KOH pH7.4,100mM NaCl, 2mM DTT, 0.2% Triton X-100, Complete EDTA-free protease inhibitor (Roche, Inc.)), 0.1mg / ml and eluted with Wash buffer containing the 3xFLAG peptide. 溶出液およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で可溶化後の遠心上清を抗ｍｙｃ抗体（コスモバイオ社）および抗ＤＹＫＤＤＤＤＹタグ抗体（Ｗａｋｏ社）を用いたウェスタンブロットに供した。 The elution solution and Triton X-100 centrifuge supernatant after solubilization were subjected to Western blot using anti-myc antibody (Cosmo Bio Co.) and anti DYKDDDDY tag antibody (Wako Co.).