WO2005119256A1 - 蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び／又は測定法 - Google Patents

蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び／又は測定法 Download PDF

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antigen
antibody
measurement
fluorescence
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Masataka Kinjo
Motohiro Horiuchi
Fumihiko Fujii
Hiroshi Sakata
Mamoru Tamura
Masayoshi Ueno
Takayuki Yanagiya
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Japan Science And Technology Agency
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    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the present invention uses fluorescence correlation spectroscopy to rapidly detect and Z or measure antigens such as pathogenic proteins such as abnormal prions or antigenic proteins such as harmful proteins contained in food materials. It relates to rapid detection of antigen and Z or assay.
  • the harmful proteins include, for example, allergen proteins, which are contained in food materials such as buckwheat, wheat, rice, etc.
  • the pathogenic proteins include, for example, raw materials for meat, meat-and-bone meal.
  • Inclusion problems include pathogenic proteins such as abnormal prions (infectious forms).
  • abnormal prions which are a typical example of a pathogenic protein that has recently become a problem, are proteins that cause prion disease, such as bovine spongiform encephalopathy (BSE). is there.
  • Normal prion protein which normally exists on the surface of animal brain and nerve cell membranes, is a glycoprotein with a molecular weight of about 3.3 to 350,000 (33 to 35 kDa). (Lait, 76: 571-578,1996) o When an abnormal prion enters an animal body, it converts normal prions produced at specific sites in the body into abnormal prions. As a result, abnormal prions accumulate at those specific sites. When abnormal prions accumulate in the brain, the brain sponges and the animal dies.
  • ELISA fixed
  • Immunoassays such as phase enzyme immunoassay
  • Western blotting immunoblot
  • ELISA is performed on a solid phase, in which an antigen or antibody is labeled with an enzyme, and the presence of the antibody or antigen is detected using enzyme activity.
  • prion immobilized on a microtiter plate Is bound by a Mab 3F4 antibody and detected by a second antibody that catalyzes a color reaction by an enzyme that couples the antibody to the antibody (US Pat. No. 4,806,627).
  • Western blotting is a method in which proteins separated by electrophoresis are immobilized on a hydrophobic membrane and the target protein is detected using an antibody specific to the antigen. It is performed in such a manner that aberrant prions are detected by Western blotting using the lonal anti-prion protein antibody Mab 13A5 (J. Infect. Dis. 154: 518-521, 1986).
  • the sample after proteinase K treatment is denatured with guadindinocyanic acid, and the primary denaturation treatment with SDS and methanol are performed before the aggregation state of the prion protein is released. It is necessary to carry out a protein concentration operation by treatment, it is necessary to carry out centrifugation before the methanol treatment and before the guanidine thiocyanate treatment, respectively, and the centrifugation operation takes time. Since such complicated processing must be performed, there is a problem that it is suitable for testing a large number of samples in a short time!
  • Japanese Patent Publication No. 10-267928 discloses that in order to detect abnormal prion protein with high sensitivity, ELISA is applied, an anti-prion protein antibody is used, and the antibody is converted into an arbitrary DNA fragment.
  • An immuno-PCR method in which the DNA fragment is labeled and detected by PCR is disclosed.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-130880 discloses a method for immunologically measuring abnormal prions with high sensitivity without the time-consuming electrophoresis or centrifugation of conventional ELISA or Western blotting.
  • centrifugation by ELISA or Western blotting can be performed.
  • a method has been disclosed in which a separation operation—abnormal prion is measured without performing electrophoresis so that a large number of samples can be detected in a short time.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-215131 discloses that a prion protein is reacted with a chemical substance to form a covalent bond in a body fluid sample, whereby the prion protein is chemically modified, whereby a pathogenic prion is present. Then, an analysis method using a mass spectrum of a prion protein in which at least one peak is observed in the mass spectrum is disclosed! These must be subjected to various treatments to improve conventional ELISA and Western blotting methods, and are necessary for simple and rapid detection and measurement of antigen proteins such as prions. Is not always enough. In addition, these detection and measurement methods are not suitable for performing the detection and measurement processing steps automatically or semi-automatically to measure a large number of samples.
  • FCS Fluorescence correlation spectroscopy
  • FCS Fluorescence Correlation Spectyoscopy. Theory and Applications, Springer, Berlin, 2001.
  • the FCS captures the Brownian motion of a target molecule labeled with fluorescence in a medium in a very small area using a laser confocal microscope, and analyzes the fluctuation power of the fluorescence intensity and the diffusion time to determine the physical quantity of the target molecule (number and size of molecules). ), which is performed by measuring the molecular fluctuations in such a small area. Is an effective means for detecting intermolecular interactions with high sensitivity and specificity.
  • FCS Fluorescence-labeled target molecule
  • a fluorescence-labeled antibody molecule is used, and the fluorescence-labeled antibody is used to detect the fluorescence by utilizing an antigen-antibody reaction between the fluorescence-labeled antibody and the antigen protein.
  • Analysis is carried out by utilizing the difference in the diffusion rate depending on the shape and the molecular weight of the labeled antibody and the antigen-antibody complex molecule formed by the antigen-antibody reaction between the fluorescently labeled antibody and the antigen protein. Is performed.
  • the diffusion rate diffusion constant or D refers to the area where molecules freely diffuse in unit time.
  • the diffusion time Diffusion Time: (DT) or ⁇ D
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-267928.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-272404.
  • Patent Document 3 JP-A-2003-130880.
  • Patent Document 4 JP-A-2003-215131.
  • Patent Document 5 Japanese Patent No. 3517241.
  • Non-patent Document 1 J. Infect. Dis. 154: 518-521, 1986.
  • Non-Patent Document 2 Chem. Phys., 4,390-401, 1974.
  • Non-Patent Document 3 Biopolymers, 13, l-27, 1974.
  • Non-Patent Document 4 Physical Rev. A, 10: 1938-1945, 1974.
  • Non-Patent Document 6 R. Rigler, E.S.Elson (Eds., Fluorescence Correlation Spectyos copy. Theory and Applications, Springer, Berlin, 2001.
  • An object of the present invention is to widely apply to the detection and Z or measurement of antigens such as pathogenic proteins such as abnormal prions or antigenic proteins such as harmful proteins contained in food materials, and to simplify the use of the antigens.
  • An object of the present invention is to provide a method for rapid detection and Z or measurement of an antigen which can be quickly and accurately detected and Z or measured by a simple operation.
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
  • the antigen-antibody reaction between a fluorescently-labeled antibody fragment that has not bound to the antigen and a fluorescently-labeled antibody fragment or an antigen non-fluorescently labeled complete antibody can be performed.
  • a fluorescently-labeled antibody fragment that has not bound to the antigen and a fluorescently-labeled antibody fragment or an antigen non-fluorescently labeled complete antibody can be performed.
  • the complex that is, its can cause significant differences in the diffusion rate, therefore, without depending on the shape or molecular weight of the antigen, relatively small molecular weight antigens.
  • the detection and measurement of the antigens can be performed using FCS, and that a wide range of antigens can be measured.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention provides a fluorescently labeled fluorescently-labeled antibody fragment that targets an epitope of an antigen such as an antigen protein, and a non-fluorescently labeled complete form that targets another epitope of the antigen.
  • An antibody is used to form an antigen-antibody complex of the antigen, a fluorescently labeled antibody fragment and a non-fluorescently labeled intact antibody, and the formed antigen-antibody complex is detected and analyzed by fluorescence correlation spectroscopy to identify the antigen. Consisting of detection and Z or method of measurement.
  • the detection and Z or measurement method of the present invention can be widely applied to the detection and Z or measurement of pathogenic proteins such as abnormal prions or antigenic proteins such as harmful proteins contained in food materials. Can be quickly and accurately detected and Z or determined by a simple operation.
  • the present invention relates to different epitopes (antigens) of antigens such as antigen proteins (eg, pathogenic proteins such as abnormal prions and harmful proteins such as allergen proteins).
  • antigen proteins eg, pathogenic proteins such as abnormal prions and harmful proteins such as allergen proteins.
  • Antigen-antibody reaction by mixing a fluorescent-labeled antibody fragment targeting the determinant) and a complete antibody (or a mixture thereof (the antigen detection reagent provided by the present invention)) with an antigen, and performing FCS measurement on the mixture.
  • fluorescent-labeled antibody fragments and non-fluorescent-labeled intact antibody form a complex via the antigen when an antigen such as an antigen protein is present in the detection and Z or measurement samples (FIG. 1).
  • a solution of only ⁇ Fab647 (mouse IgG antibody) and a mixture of Fab ⁇ complete antibody Fab647 were applied to a 384-well plate (Olympus) blocked with N101 (Nippon Oil & Fats), and MF20 (Olympus) was used. Measured. The measurement was performed at a laser power of 100 W and measurement was performed three times for 30 seconds. Each parameter including the diffusion time was derived using the MF20 processing software.
  • the present invention relates to (1) a fluorescently labeled fluorescent antibody fragment targeting an epitope of an antigen, and a non-fluorescently labeled antibody fragment targeting an epitope of another antigen.
  • an antibody an antigen-antibody complex is formed between the antigen, a fluorescent-labeled antibody fragment and a non-fluorescent-labeled intact antibody, and the formed antigen-antibody complex is detected and analyzed by fluorescence correlation spectroscopy.
  • Detection of antigen by fluorescence correlation spectroscopy and Z or measurement method and (2) the method for rapid detection and Z or measurement of the antigen by fluorescence correlation spectroscopy according to (1), wherein the antigen is an antigen protein; and (3) the formed antigen-antibody complex.
  • Detection and analysis by fluorescence correlation spectroscopy are based on the detection of antigens using the discrimination based on the difference in diffusion rate between the fluorescently labeled fluorescently labeled antibody fragment and the formed labeled antigen-antibody complex.
  • the rapid detection and Z or measurement method of the antigen by the fluorescence correlation spectroscopy according to the above (1) or (2), which is characterized by the analysis, or (4) the rapid detection and the Z or measurement of the antigen, Detection of the antigen-antibody complex by fluorescence correlation spectroscopy, presence of antigen based on analysis, detection of antigen concentration, antigen size, or antigen shape, and detection or Z or measurement Rapid detection of antigen by fluorescence correlation spectroscopy described in (1) to (3) Assays and (5) Fluorescence-labeled fluorescent antibody fragments targeting the epitope of the antigen were prepared from monoclonal antibodies prepared using the antigen as an immunogen.
  • the non-fluorescent-labeled complete antibody targeting the probe is a monoclonal antibody prepared using an antigen as an immunogen. Rapid detection of antigen by spectroscopy and Z or assay power.
  • the present invention also provides (6) a test sample comprising: a fluorescently labeled fluorescently-labeled antibody fragment that targets an epitope of an antigen; and a non-fluorescently labeled antibody-directed type that targets another epitope of an antigen.
  • the antigen-antibody reaction is performed by adding an antibody, and the antigen-antibody complex of the formed antigen and the fluorescent-labeled antibody fragment and the non-fluorescent-labeled intact antibody is detected and analyzed by fluorescence correlation spectroscopy.
  • the antigen is an antigen protein;
  • the antigen is an antigen protein; and (6) the antigen is rapidly detected and detected by the fluorescence correlation spectroscopy.
  • the present invention further provides (11) a method for rapid detection and Z or measurement of an antigen by fluorescence correlation spectroscopy according to (10), wherein the pathogenic protein antigen is an abnormal prion; 12) The fluorescence correlation spectroscopy described in any one of (6) to (9) above, wherein the test sample is a food material, and the antigen is a harmful protein antigen contained in the food material. (13) Fluorescently labeled fluorescently-labeled antibody fragments that target the epitopes of the antigens to be detected and Z or measured, and (13) Target other epitopes of the antigens.
  • Fluorescence correlation spectroscopy equipped with a detection reagent for rapid detection and Z or measurement of an antigen by fluorescence correlation spectroscopy, which also provides a non-fluorescent labeled antibody, and a detection reagent according to (12).
  • Figure consisting of a kit for rapid detection of antigen and Z or measurement A brief description of the
  • FIG. 1 is a view showing an outline of a method for rapid detection and Z or measurement of an antigen by the FCS of the present invention.
  • FIG. 2 In order to prove the function of rapid detection and Z or measurement method of antigen by FCS of the present invention, the case of only a fluorescently labeled antibody fragment and the case of a complex of a fluorescently labeled antibody fragment and a complete antibody It is a figure which shows the outline
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of a test on the difference between the diffusion speeds of FIG.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing an FCS measuring device used in the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing an outline of rapid detection of an antigen by the FCS of the present invention and preparation of a fluorescently labeled antibody fragment used in the Z or assay method.
  • FIG. 6 In an example of the present invention, a fluorescent-labeled antibody fragment and a complete antibody
  • FIG. 8 is a view showing the results of a test on a difference in diffusion time due to formation of a complex between a body and an antigen protein.
  • the rapid detection and Z or measurement method of the antigen by the fluorescence correlation spectroscopy of the present invention can be performed by using a fluorescently labeled fluorescently-labeled antibody fragment targeting the epitope of the antigen, and other epitopes of the antigen.
  • An antigen-antibody complex of the antigen, the fluorescent-labeled antibody fragment and the non-fluorescent-labeled complete antibody is formed using the target non-fluorescent-labeled complete antibody, and the resulting antigen-antibody complex is subjected to fluorescence correlation spectroscopy.
  • Method (FCS) for detection and analysis.
  • a test sample is prepared by adding a fluorescent-labeled fluorescently-labeled antibody fragment targeting an epitope of an antigen and a non-fluorescent antibody targeting another epitope of an antigen to a test sample.
  • An antigen-antibody reaction is performed by adding a labeled complete antibody and mixing the sample to which the antibody has been added, and an antigen-antibody complex of the formed antigen and a fluorescent-labeled antibody fragment and a non-fluorescent-labeled complete antibody Is detected and analyzed by fluorescence correlation spectroscopy, and the presence, size, concentration, and the like of the antigen in the sample are promptly detected and Z or measured.
  • the processing operation for detection and Z or measurement by FCS of the present invention comprises a sample that does not undergo a physical separation process of the antigen contained in the test sample, a fluorescently labeled antibody fragment and a non-fluorescently labeled complete antibody. Since the steps are performed only by adding and mixing with the detection reagent, the step of detecting and measuring the antigen can be performed automatically or semi-automatically.
  • an antibody that specifically binds to an antigen is prepared in order to prepare a fluorescent-labeled antibody fragment used as a detection reagent and a non-fluorescent-labeled complete antibody.
  • Antibodies that specifically bind to an antigen used in the present invention include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and among them, monoclonal antibodies are more preferable in terms of their specificities.
  • To prepare an antibody against a strong antigen first, the antigen to be detected is purified and obtained.
  • the antigen can be isolated and purified from the source using known purification means, and can be prepared.If the antigen is an antigen protein and the amino acid sequence of the antigen protein is known, it can be genetically engineered.
  • the antigen protein can be produced using microorganisms, animal cells, or the like, and then purified and obtained.
  • Protoproteins can be prepared by chemical peptide synthesis.
  • known synthesis means can be employed. For example, azide method, acid chloride method, acid anhydride method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, carboimidazole method, redox method and the like can be mentioned.
  • the antigen is sensitized to an animal or plant using a conventional protocol, and then prepared.
  • monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method (Nature 256, 495-497, 1975), the trioma method, the human B cell hybridoma method (Immunology), resulting in antibodies produced by continuous cell line cultures. Any method can be used, such as Today 4, 72, 1983) and the EBV-hybridoma method (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
  • the antigen protein is administered as an antigen to mammals such as rats, mice, and egrets to sensitize the same.
  • adjuvants such as Freund's complete adjuvant (FCA) and Freund's incomplete adjuvant (FIA) can be used.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization is mainly performed by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunization interval is not particularly limited, and 1 to 10 immunizations are performed at intervals of several days to several weeks.
  • the antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the last immunization.
  • Antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, and the like.
  • cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed.
  • myeloma cells to be fused with the antibody-producing cells generally available cell lines can be used.
  • the cell line used has drug selectivity, cannot survive in HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused to antibody-producing cells. Is used.
  • the desired hybridoma is selected from the cells after the cell fusion treatment.
  • Established Hybridoma Force As a method for collecting a monoclonal antibody, a usual cell culture method, ascites formation method, or the like can be employed. When antibody purification is required in the above antibody collection method, a known method such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, or the like is appropriately selected or used. Combine And can be purified.
  • the antibody of the antigen protein used in the present invention in addition to those prepared as described above, when there is a commercially available antibody that has already been prepared, the antibody can be used.
  • a fluorescently labeled antibody fragment whose antigenicity is also adjusted is used as a detection reagent for performing an antigen-antibody reaction with the antigen.
  • an antibody having a different epitope from the antigen to be bound is selected from the non-fluorescent-labeled complete antibody used in the present invention.
  • the fluorescent-labeled antibody fragment the complete antibody of the antigen is fragmented with an enzyme such as pepsin or papain, and reduced with 2-mercaptomethylamine or 2-mercaptoethanol to obtain a monomer. After that, it is prepared by labeling.
  • a fluorescent dye is used, for example, a fluorescent dye such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or Alexa532.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FCS Fluorescence-Activated Cell Sorting
  • Fig. 4 shows the basic structure of the device used for detection and measurement by FCS.
  • the figure (A) shows a schematic diagram of an FCS (fluorescence correlation spectroscopy) device.
  • the excitation light from the laser is guided to the sample solution on the cover glass via the dichroic mirror (DM) and the objective lens.
  • Fluorescent light passes through a long-pass filter or band-pass filter (F) and removes background light other than the confocal plane with a pinhole on the confocal plane, and uses an avalanche photodiode detector (APD) or a photomultiplier tube (PMT).
  • APD avalanche photodiode detector
  • PMT photomultiplier tube
  • the signal is further analyzed by a digital correlator.
  • (B) shows an enlarged schematic diagram of the observation area.
  • This figure shows a state in which a confocal region narrowed down to the limit by an objective lens performs Brownian motion and fluorescent molecules pass therethrough.
  • (C) shows a correlation curve after the fluorescence correlation analysis.
  • microfine region (linear diameter 400 nm, the axial length of about volume to 10-16 1) of the sample solution is detected force also in fluorescence (Fig. 4).
  • Olympus MF20 was used as the FCS measuring device. The measurement was performed at a wavelength of 543, 633 nm for 30 seconds three times.
  • the autocorrelation function is used to derive the signal power information of the fluctuation.
  • the autocorrelation function used in FCS is shown in equation (1).
  • ⁇ is
  • dispersion time (or correlation time) and indicates the average time for a fluorescent molecule to pass through the observation area by diffusion.
  • ⁇ indicates the average number of molecules existing in the observation area within a certain time.
  • the diffusion time ⁇ obtained by the equation (1) has a relationship between the diffusion constant D and the equation (2).
  • the diffusion constant D has a relationship shown in equation (3) with the radius r of the molecule by the Einstein-Stokes equation when the molecule is assumed to be a sphere.
  • K, T, and 7? are Boltzmann's constant, absolute temperature, and solvent viscosity, respectively.
  • the detection and / or Z or measurement operation of the antigen protein by the FCS of the present invention and the required time are shown in comparison with the case of the detection and / or measurement method of the antigen protein using the conventional ELISA.
  • Table 2 shows the time required for each step of the rapid detection and Z or measurement method of the antigen protein by the FCS of the present invention.
  • a fluorescently labeled antibody fragment of an anti-prion antibody (Fab'-Alexa532) was taken as an example.
  • Fab'-Alexa532 fluorescently labeled antibody fragment
  • prion protein antiigen protein
  • 384-well plate Olympus Optical Co., Ltd.
  • N101 Nippon Oil & Fat
  • 12E-8M the complete antibody
  • anti-peg recombinant prion antibody 8.76E-7M
  • the theoretical diffusion times of the fluorescently labeled antibody fragment and the complex are about 600 s and 900 s, respectively, which are significant differences.
  • the diffusion times of the fluorescently labeled antibody fragment and the complex were about 600 s and 950 s, respectively, which were the theoretical values. ( Figure 6). Therefore, this example proved that an antigen having a small molecular weight, which could otherwise be detected using the method of the present invention, could be detected using the present method.
  • the method of detecting and Z or measuring an antigen by fluorescence correlation spectroscopy (FCS) of the present invention does not depend on the shape or molecular weight of the antigen such as the antigen to be detected and Z or measured, and the abnormal prion can be detected. It is possible to detect and measure even pathogenic proteins and antigen proteins with relatively small molecular weights such as harmful proteins contained in food materials, and to detect and Z or measure a wide range of antigens. Can be used.
  • the detection and Z or measurement method of the present invention since detection and Z or measurement are performed by FCS, the physical quantity such as the number, size, or shape of the antigen molecule to be detected is determined by the physical separation process of the sample. Thus, it is possible to detect and measure in almost real time without passing through, and it is possible to quickly and accurately detect and Z or measure the antigen by a simple operation.
  • the processing operation for detection and measurement by FCS includes a test sample (including an antigen), a fluorescent-labeled antibody fragment and a non-fluorescent label. It is only an operation that mixes a detection reagent consisting of an intact antibody and performs an antigen-antibody reaction, and the measurement results can be monitored almost in real time. It is suitable for automatically or semi-automatically mixing and reacting detection reagents from the reaction to the display of measurement results.
  • the number of steps involved in the analysis procedure is smaller for samples with several to several tens / z Since measurement is possible, a large amount of test sample can be measured economically, and it can be expected to be used as a practical antigen protein measurement means.

Abstract

　異常型プリオン或いは食品素材中に含まれる有害タンパク質のような抗原タンパク質等の抗原を簡便な操作で、迅速かつ正確に検出及び／又は測定することができる検出及び／又は測定法を提供するものである。蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いた抗原分子の検出、測定に、蛍光標識抗体断片と、該蛍光標識抗体断片と抗原を介して結合する非蛍光標識化完全抗体を用いることにより、抗原と結合していない蛍光標識抗体断片と、蛍光標識抗体断片－抗原－非蛍光標識化完全抗体との抗原抗体反応によって形成される複合体との間に、拡散速度において有意な差を生じさせ、抗原の形状や分子量に依存せず、比較的分子量の小さい抗原タンパク質のような抗原の場合でもＦＣＳを用いて抗原の検出測定が可能となり、広い範囲の抗原を迅速に測定することができる。

Description

明 細 書
蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法
技術分野
[0001] 本発明は、蛍光相関分光法を用い、異常型プリオンのような病原性タンパク質或い は食品素材中に含まれる有害タンパク質等の抗原タンパク質等の抗原を迅速に検出 及び Z又は測定する抗原の迅速検出及び Z又は測定法に関する。
背景技術
[0002] 近年、天然物由来の食品素材や飼料素材の利用に際して、それらの素材中に含ま れる有害タンパク質や、病原性タンパク質等の存在が問題となっている。有害タンパ ク質としては、例えば、ソバ、小麦、米等の食品素材に含有され問題となっているァレ ルゲンタンパク質等が挙げられ、病原性タンパク質としては、例えば、食肉、肉骨粉 の原料に含まれ問題となって 、る異常型プリオン (感染型)のような病原性タンパク質 等が挙げられる。例示して説明すれば、近年問題となっている病原性タンパク質の代 表的な例として挙げられる異常型プリオンは、牛海綿状脳症 (BSE)に代表されるプリ オン病の原因となるタンパク質である。動物の脳や神経細胞膜表面に通常存在する 正常型のプリオンタンパク質は分子量約 3. 3〜3. 5万（33〜35kDa)の糖タンパク 質であり、感染型プリオン蛋白として脳内の細胞内に蓄積されているものである（Lait, 76:571-578,1996) o異常型プリオンは、動物体内に侵入すると、体内の特定部位で 生産される正常型プリオンを異常型プリオンに変換し、その結果、それらの特定部位 において異常型プリオンが蓄積する。脳に異常型プリオンが蓄積すると、脳がスポン ジ状になり、動物は死に至る。
[0003] このような食品素材や飼料素材の利用に際して、それらの素材中に含まれるアレル ゲンタンパク質のような有害タンパク質や、病原性タンパク質を、ヒトゃ動物が摂取す ることを防止するためには、該食品素材や飼料素材に含まれるアレルゲンタンパク質 のような有害タンパク質や、病原性タンパク質を検知、測定し、それらの有害タンパク 質や、病原性タンパク質を含むものの利用を防止する必要がある。
[0004] 従来より、プリオン (異常型）のような天然の生体タンパク質の測定には、 ELISA (固 相酵素免疫検定法)やウェスタンプロット法 (ィムノブロット法)のような免疫測定法が 用いられている。 ELISAは、固相で行われ、抗原又は抗体を酵素で標識し、抗体又 は抗原の存在を酵素活性を利用して検出する方法であるが、例えば、マイクロタイタ 一プレート上に固定されたプリオンを Mab 3F4抗体によって結合し、この抗体をこ れにカップリングする酵素による着色反応を触媒する第二の抗体によって検出するよ うな方法で行われる（米国特許第 4806627号明細書)。また、ウェスタンプロット法は 、電気泳動で分離したタンパク質を疎水性の膜に固定し、抗原に特異的な抗体を用 いて目的のタンパク質を検出する方法である力 プリオンの検出には、例えば、モノク ローナル抗プリオンタンパク質抗体 Mab 13A5を用い、ウェスタンブロットを行って 異常型プリオンを検出するような方法で行われる（J. Infect. Dis. 154:518-521,1986)
[0005] し力し、例えば、 ELISAやウェスタンブロット法のような従来法でプリオンの検出、測 定を行うには、従来法では正常型プリオンと異常型プリオンを区別して検出するため に、まず、被検試料カゝら予め正常型プリオンをプロテインァーゼ Kで処理し、分解、除 去しておくような処理を行っておく必要がある。また、ウェスタンブロット法は、電気泳 動を行う必要があり、煩雑で時間が力かるので、多数の試料を短時間に検査しようと するためには適していないという問題がある。更に、 ELISAは、必要な感度を達成す るために、プロテインァーゼ K処理後の試料をグァ-ジンチォシアン酸で変性処理し 、プリオンタンパク質の凝集状態を解除する前に、 SDSによる一次変性処理及びメタ ノール処理によるタンパク質濃縮操作を行う必要があり、該メタノール処理の前及び グァ-ジンチォシアン酸処理の前にはそれぞれ遠心分離を行う必要があり、そして、 該遠心分離操作は時間がかかり、該方法はこのような煩雑な処理を行わなければな らな 、ことから、多数の試料を短時間に検査しょうとするためには適して!/ヽな ヽと 、う 問題がある。
[0006] そこで、これらのプリオンの検出、測定に用いられて 、る ELISAやウェスタンブロッ ト法の問題を改善するために、最近、いくつかの方法が提案されている。例えば、特 開平 10— 267928号公報には、異常プリオンタンパク質を高感度に検出するために 、 ELISAを応用し、抗プリオンタンパク質抗体を用い、該抗体を任意の DNA断片で 標識して、該 DNA断片を PCRにより検出するィムノ PCR法が開示されている。また、 特開 2003— 130880号公報には、従来法の ELISAやウェスタンブロット法の時間 のカゝかる電気泳動操作や遠心分離操作を行うことなく高感度に異常型プリオンを免 疫測定する方法として、磁性粒子に、変性剤処理した異常型プリオンと抗原抗体反 応する第 1抗体又はその抗原結合性フラッグメントを不動化して異常型プリオン免疫 測定試薬として用いることにより、 ELISAやウェスタンプロット法の遠心分離操作ゃ電 気泳動を行わずに異常型プリオンの測定を行い、多数の検体について短時間に検 查を行うことが可能なようにした方法が開示されて 、る。
[0007] 更に、特開 2003— 215131号公報には、体液サンプルにおいて、プリオンタンパ ク質を化学物質と反応させて共有結合を形成させ、それにより化学的に修飾され、病 原性プリオンが存在するとマススペクトルに少なくても更に 1個のピークが観察される ようにしたプリオンタンパク質のマススペクトルを用いた分析方法が開示されて!、る。 これらは、従来法の ELISAやウェスタンブロット法を改良するものである力 依然とし て、各種の処理を経なければならず、プリオンのような抗原タンパク質を、簡便かつ迅 速に検出、測定するには必ずしも十分なものではない。また、これらの検出、測定方 法は、該検出、測定のための処理工程を、自動或いは半自動的に行い、大量の試 料の測定を行うには適した方法とは 、えな 、。
[0008] 一方、近年、特に生物由来の分子の解析等に多く用いられ、例えば、タンパク質分 子の数や、大きさ、或いは形等の物理量を、試料の物理的な分離過程を経ずに、し 力もほぼ実時間で検出、測定できる分析法として蛍光相関分光法 (FCS： Fluorescen ce Correlation Spectroscopy)が知られている（Chem. Phys., 4,390— 401,1974; Biopoly mers, 13,l-27,1974;Physical Rev. A, 10: 1938— 1945, 1974; in Topics in Fluorescence
Spectyoscopy ,1, pp.337— 378, Plenum Press, New York and London, 1991; R.Rigler.E.
S. lson(Eds.), Fluorescence Correlation Spectyoscopy.Theory and Applications, Spri nger, Berlin, 2001)。 FCSは、蛍光で標識した標的分子の媒質中におけるブラウン 運動をレーザー共焦点顕微鏡系により微小領域で捉えることによって、蛍光強度の ゆらぎ力 拡散時間を解析し、標的分子の物理量 (分子の数、大きさ）を測定すること により実行されるもので、このような微小な領域で分子ゆらぎを捕える FCSによる解析 は、高感度、特異的に分子間相互作用を検出する上で有効な手段となっている。
[0009] FCSを、生体試料中に含まれるタンパク質等の検出、測定に用いた場合の特徴と しては、溶液に含まれる蛍光で標識した標的分子の濃度や分子間相互作用を物理 的な分離過程を経ずにほぼ実時間でモニタできることにある。そのため、 FCSを用い た検出系では、これまで生体分子の検出系の主流として用いられてきた ELISAなど の分析手段で必要であった煩雑な BoundZFree分離過程を省くことができ、したがつ て、短時間に多量のサンプルを高感度で測定することが可能であり、自動化測定に も向いている。
[0010] ところで、 FCSを用いて、抗原タンパク質等の検出を行うには、蛍光標識化した抗 体分子を用い、該蛍光標識化抗体と抗原タンパク質との抗原抗体反応を利用して、 該蛍光標識化抗体と、該蛍光標識化抗体と抗原タンパク質との抗原抗体反応によつ て形成された抗原抗体複合体分子の有する形状及びその分子量に依存する拡散速 度の差を利用して、分析が行われる。ここで、拡散速度 (拡散定数又は D)とは、単位 時間に分子が自由拡散する面積のことをいう。他方、拡散時間（Diffusion Time : (DT )または τ D)とは、装置によって決まる焦点領域内を分子が通過するのに要する時 間のことをいう。
[0011] 従って、 FCSによって、試料中の抗原タンパク質等の正確な測定を行うためには、 標識化抗体の拡散速度と、該標識化抗体と抗原タンパク質との抗原抗体反応によつ て形成される抗原抗体複合体の拡散速度との間に有意な差を生じさせるような抗原 と抗体の組み合わせを用いる必要がある。したがって、従来、この必要性のため、 FC Sにより検出できる抗原タンパク質等の種類は非常に限られていた。この問題を解決 する手段として、従来、抗原と抗体との形状及び分子量を考慮して抗原抗体複合体 に対して種々の修飾を施し、拡散速度に有意な差を設けると ヽうことが行われて ヽた (特開 2001— 272404号公報、特許第 3517241号公報)。しかし、これらの方法を 用いても、 FCSの検出方法を適用検出対象には限度があった。
[0012] 特許文献 1：特開平 10— 267928号公報。
特許文献 2：特開 2001— 272404号公報。
特許文献 3 :特開 2003— 130880号公報。 特許文献 4：特開 2003— 215131号公報。
特許文献 5 :特許第 3517241号公報。
非特許文献 1 :J. Infect. Dis. 154:518-521, 1986。
非特許文献 2： Chem. Phys. ,4,390- 401 , 1974。
非特許文献 3 : Biopolymers, 13,l- 27,1974。
非特許文献 4 : Physical Rev. A, 10: 1938- 1945 ,1974。
特干文献 5 : in Topics in Fluorescence bpectyoscopy , 1 , pp.337-^78, Plenum Pr ess, New York and London, 1991。
非特許文献 6 : R.Rigler, E.S.Elson(Eds. , Fluorescence Correlation Spectyos copy. Theory and Applications, Springer, Berlin, 2001。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明の課題は、異常型プリオンのような病原性タンパク質或いは食品素材中に 含まれる有害タンパク質のような抗原タンパク質等の抗原の検出及び Z又は測定に 広く適用でき、該抗原を簡便な操作で、迅速かつ正確に検出及び Z又は測定するこ とができる抗原の迅速検出及び Z又は測定法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、近年、特に生物由来の分 子の解析等に多く用いられ、タンパク質分子の数や、大きさ、或いは形等の物理量を 、試料の物理的な分離過程を経ずに、しかもほぼ実時間で検出、測定できる分析法 として知られている蛍光相関分光法（FCS : Fluorescence Correlation Spectroscopy) に着目し、該 FCSを用いたタンパク質分子等の検出、測定に、抗原抗体反応による 検出する抗原分子の蛍光標識化を利用し、そして、該抗原抗体反応による蛍光標識 ィ匕に際して、蛍光標識抗体断片と、該蛍光標識抗体断片と抗原を介して結合する非 蛍光標識ィ匕完全抗体を用いることにより、抗原と結合していない蛍光標識抗体断片 と、蛍光標識抗体断片 抗原 非蛍光標識化完全抗体との抗原抗体反応によって 形成される複合体との間に、その拡散速度における有意な差を生じさせることができ 、したがって、抗原の形状や分子量に依存せず、比較的分子量の小さい抗原タンパ ク質のような抗原の場合でも FCSを用いて抗原の検出測定が可能であり、広い範囲 の抗原を測定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
[0015] すなわち、本発明は、抗原タンパク質のような抗原のェピトープを標的とする蛍光標 識化された蛍光標識抗体断片、及び、該抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光 標識化完全型抗体を用い、抗原と蛍光標識抗体断片及び非蛍光標識化完全型抗 体との抗原抗体複合体を形成させ、形成された抗原抗体複合体を蛍光相関分光法 により検出、解析することにより抗原を検出及び Z又は測定する方法よりなる。本発 明の検出及び Z又は測定法は、異常型プリオンのような病原性タンパク質或いは食 品素材中に含まれる有害タンパク質のような抗原タンパク質の検出及び Z又は測定 に広く適用でき、該抗原タンパク質を簡便な操作で、迅速かつ正確に検出及び Z又 は 定することができる。
[0016] 本発明の機能について更に説明すると、本発明は、抗原タンパク質のような抗原（ 例えば、異常型プリオンのような病原性タンパク質やアレルゲンタンパク質のような有 害タンパク質)のそれぞれ異なるェピトープ (抗原決定基)を標的とする蛍光標識抗 体断片、及び完全型の抗体 (又はその混合物 (本発明の提供する抗原検出試薬) ) を抗原と混合することで抗原抗体反応させ、その混合物を FCS測定することから成る
。これらの蛍光標識抗体断片、非蛍光標識化完全型抗体は、検出及び Z又は測定 試料中に抗原タンパク質のような抗原が存在すると、該抗原を介して複合体を形成 する（図 1)。
[0017] FCSによる抗原の検出及び Z又は測定において、非蛍光標識化完全型抗体を用 いた場合の抗原抗体複合体分子のブラウン運動における拡散速度への影響を検証 するために、複合体の中心に位置する抗原を用いず、完全型抗体とそれを直接認識 する標識ィ匕抗体断片とを用いて FCS測定を行った (図 2)。測定の結果、標識化抗体 断片のみの拡散速度と標識化抗体断片 抗体複合体の拡散速度との間に有意な 差が得られた（図 3)。すなわち、図 3に示される如ぐ非蛍光標識化完全型抗体 (図 3 、 Ab)の Fc部分 (図 2、ェピトープ C)を認識する蛍光標識抗体断片と非蛍光標識ィ匕 完全型抗体との抗原抗体反応を行い、 FCSによる測定を行った結果、標識化抗体 断片のみ (Ab (—））の拡散時間と、蛍光標識抗体断片と非蛍光標識化完全型抗体 との複合体 (Ab ( + ) )の拡散時間は、理論的には、約 600 s、 900 sとなるのに対 して、測定値も約 600 s、 950 sとなり標識ィ匕抗体断片のみの拡散速度と標識ィ匕 抗体断片 抗体複合体の拡散速度との間に有意な差が示された。
[0018] このことは、抗原抗体複合体の中心に位置する抗原が存在して蛍光標識抗体断片 抗原 非蛍光標識化完全型抗体の複合体が形成された場合には、必ずそれらの 蛍光標識分子の拡散速度に有意差が生じることを意味している。従って、この組み合 わせを用いれば、抗原の分子量に拠らず FCS測定による抗原タンパク質のような抗 原の検出が可能であることが明らかとなった。本発明の方法においては、用いる蛍光 標識抗体断片を調製するための抗体及び非蛍光標識ィ匕完全型抗体は、 IgGクラス のモノクローナル抗体を用いるのが好まし 、。
[0019] なお、上記図 2及び 3に示す実験例は、以下の操作によった：
(使用した材料）：
Alexa Fluorり 47 (Zenon One Mouse Igul Labeling Kit)
Fab647 (Zenon One IgGl Labeling Reagent)
抗体（図 2中 Abと表示とした）（Zenon One Blocking Reagent (mouse IgG) )
(FCS測定装置）
MF - 20 (分子間相互作用解析システム：ォリンパス光学工業株式会社）
(操作）
ΙΟηΜの Fab647 (マウス IgG抗体）のみの溶液と、 ΙΟΟηΜの完全型抗体と混合した Fab647混合物を、 N101 (日本油脂）でブロッキング処理した 384穴プレート（ォリン パス）に供し、 MF20 (ォリンパス）を用いて測定した。測定はレーザーパワー 100 Wとし、 30秒間 X 3回の測定を行った。 MF20の処理ソフトフェアを用いて拡散時間 をはじめとする各パラメータを導 、た。
[0020] すなわち具体的には本発明は、（1)抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化され た蛍光標識抗体断片、及び、抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全 型抗体を用い、抗原と蛍光標識抗体断片及び非蛍光標識化完全型抗体との抗原抗 体複合体を形成させ、形成された抗原抗体複合体を蛍光相関分光法により検出、解 析することを特徴とする蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法 や、（2)抗原が、抗原タンパク質であることを特徴とする前記（1)記載の蛍光相関分 光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法や、 (3)形成された抗原抗体複合体 の蛍光相関分光法による検出、解析が、蛍光標識化された蛍光標識抗体断片と形 成された標識化された抗原抗体複合体との拡散速度の差に基く識別を利用した抗 原の検出、解析であることを特徴とする前記（1)又は（2)記載の蛍光相関分光法によ る抗原の迅速検出及び Z又は測定法や、（4)抗原の迅速検出及び Z又は測定が、 形成された抗原抗体複合体の蛍光相関分光法による検出、解析に基ぐ抗原の存 在、抗原の濃度、抗原の大きさ、又は、抗原の形の検出及び Z又は測定であることを 特徴とする前記（1)〜（3)の 、ずれか記載の蛍光相関分光法による抗原の迅速検 出及び Z又は測定法や、（5)抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光 標識抗体断片が、抗原を免疫原として作製されたモノクローナル抗体から調製され たものであり、抗原タンパク質の他のェピト—プを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型抗 体が、抗原を免疫原として作製されたモノクローナル抗体であることを特徴とする前 記（1)〜 (4)の 、ずれか記載の蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は 測定法力 なる。
また本発明は、（6)被検試料に、抗原のェピト—プを標的とする蛍光標識化された 蛍光標識抗体断片、及び、抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型 抗体を添加して、抗原抗体反応を行わせ、形成された抗原と蛍光標識抗体断片及 び非蛍光標識化完全型抗体との抗原抗体複合体を、蛍光相関分光法により検出、 解析することを特徴とする蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定 法や、（7)抗原が、抗原タンパク質であることを特徴とする前記 (6)記載の蛍光相関 分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法や、（8)蛍光相関分光法による抗 原の検出及び Z又は測定が、被検試料に含まれる抗原の物理的な分離過程を経る ことなく行われることを特徴とする前記（6)又は（7)記載の蛍光相関分光法による抗 原の迅速検出及び Z又は測定法や、（9)被検試料へ、抗原のェピトープを標的とす る蛍光標識化された蛍光標識抗体断片、及び、抗原の他のェピトープを標的とする 非蛍光標識化完全型抗体を添加する工程、該被検試料、蛍光標識抗体断片及び 非蛍光標識化完全型抗体により抗原抗体反応を行う工程、及び、該抗原抗体反応 を行った被検試料を蛍光相関分光法により検出、解析を行う工程を、自動的又は半 自動的に行うことを特徴とする前記 (6)〜（8)の 、ずれか記載の蛍光相関分光法に よる抗原の迅速検出及び Z又は測定法や、（10)被検試料が、生体タンパク質試料 であり、抗原が病原性タンパク質抗原であることを特徴とする前記 (6)〜（9)の 、ず れか記載の蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法力もなる。
[0022] さらに本発明は、（11)病原性タンパク質抗原が、異常型プリオンであることを特徴 とする前記（10)記載の蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法 や、（12)被検試料が、食品素材であり、抗原が食品素材中に含まれる有害タンパク 質抗原であることを特徴とする前記 (6)〜（9)の ヽずれか記載の蛍光相関分光法に よる抗原の迅速検出及び Z又は測定法や、（13)検出及び Z又は測定する抗原の ェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識抗体断片、及び、抗原の他のェ ピトープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型抗体力もなる、蛍光相関分光法による抗 原の迅速検出及び Z又は測定用の検出試薬や、（ 14)前記（ 12)記載の検出試薬を 装備した、蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定用キットからなる 図面の簡単な説明
[0023] [図 1]本発明の FCSによる抗原の迅速検出及び Z又は測定法の概略を示す図であ る。
[図 2]本発明の FCSによる抗原の迅速検出及び Z又は測定法の機能を証明するた めに、蛍光標識抗体断片のみの場合と、蛍光標識抗体断片と完全型抗体との複合 体の場合との拡散速度の相違についての試験の概略を示す図である。
[図 3]本発明の FCSによる抗原の迅速検出及び Z又は測定法の機能を証明するた めに、蛍光標識抗体断片のみの場合と、蛍光標識抗体断片と完全型抗体との複合 体の場合との拡散速度の相違についての試験の結果を示す図である。
[図 4]本発明において使用される FCS測定装置の概略を示す図である。
[図 5]本発明の FCSによる抗原の迅速検出及び Z又は測定法において用いられる 蛍光標識抗体断片の調製の概略を示す図である。
[図 6]本発明の実施例において、蛍光標識抗体断片及び完全型抗体を用いて、該抗 体と抗原タンパク質との複合体の形成による拡散時間の差について試験した結果を 示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0024] 本発明の蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法は、抗原のェ ピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識抗体断片、及び、抗原の他のェピ トープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型抗体を用い、抗原と蛍光標識抗体断片及 び非蛍光標識化完全型抗体との抗原抗体複合体を形成させ、形成された抗原抗体 複合体を蛍光相関分光法 (FCS)により検出、解析することよりなる。
[0025] すなわち、本発明を実施するには、被検試料に、抗原のェピトープを標的とする蛍 光標識化された蛍光標識抗体断片、及び、抗原の他のェピトープを標的とする非蛍 光標識化完全型抗体を添加し、該抗体を添加した試料を混合して抗原抗体反応を 行わせ、形成された抗原と蛍光標識抗体断片及び非蛍光標識化完全型抗体との抗 原抗体複合体を、蛍光相関分光法により検出、解析して、試料中の抗原の存在、大 きさ、濃度等を迅速に検出及び Z又は測定することにより行われる。本発明の FCS による検出及び Z又は測定における処理操作は、被検試料に含まれる抗原の物理 的な分離過程を経ることなぐ試料と、蛍光標識抗体断片及び非蛍光標識化完全型 抗体とからなる検出試薬とを添加、混合するだけの操作で行われることから、抗原の 検出、測定を行う工程を、自動的又は半自動的に行うことができる。
[0026] (抗タンパク質抗体の調製）
本発明においては、検出試薬として用いる蛍光標識抗体断片及び非蛍光標識化完 全型抗体を調製するために抗原に特異的に結合する抗体を調製する。本発明にお いて用いられる、抗原に特異的に結合する抗体としては、ポリクローナル抗体及びモ ノクローナル抗体等を挙げることができる力 S、その中でもモノクローナル抗体がその特 異性の点でより好ましい。力かる抗原に対する抗体を調製するには、まず、検出する 抗原を精製し、取得する。該抗原は、公知の精製手段を用いて供与源から単離'精 製して調製することができ、また、抗原が抗原タンパク質で該抗原タンパク質のァミノ 酸配列が公知であれば、遺伝子工学的手法により、微生物や動物細胞等を用いて 該抗原タンパク質を産生させ、精製して取得することもできる。可能な場合は、該抗 原タンパク質を、ペプチドの化学合成法により調製することができる。ペプチドの化学 合成は公知の合成手段を採用することができる。例えば、アジド法、酸クロライド法、 酸無水物法、混合酸無水物法、 DCC法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、 酸化還元法等が挙げられる。
[0027] 該抗原に対する抗体を調製するには、該抗原を用い、慣用のプロトコールを用いて 、動物又は植物に感作させ、調製する。例えばモノクローナル抗体の調製には、連 続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイプリドーマ法 (Nature 256, 495-497, 1975)、トリオ一マ法、ヒト B細胞ハイプリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983)及び EBV—ハイプリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCE R THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985)など任意の方法を用いることができ る。
[0028] 抗原タンパク質のような抗原のモノクローナル抗体を調製するには、例えば、該抗 原タンパク質を抗原として、ラット、マウス、ゥサギなどの哺乳動物に投与し、感作する 。必要に応じてフロイント完全アジュバント (FCA)、フロイント不完全アジュバント (FIA )等のアジュバントを用いることもできる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注 入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間 隔で、 1〜10回の免疫を行う。そして、最終の免疫日から 1〜60日後に抗体産生細 胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が 挙げられる。ノ、イブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、一般に入手可能な株化細 胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の 状態では HAT選択培地 (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存でき ず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。
[0029] 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する。榭立したハイブ リドーマ力 モノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水 形成法等を採用することができる。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要 とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ァフィ-ティ 一クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせるこ とにより精製することができる。
本発明においては、本発明において用いる抗原タンパク質の抗体としては、上記の ようにして調製されるものの他、既に調製されている市販の抗体がある場合には、該 抗体を用いることができる。
[0030] (蛍光標識抗体断片の調製）
本発明の抗原の迅速検出及び Z又は測定法においては、抗原と抗原抗体反応を行 い検出するための検出試薬として、該抗原力も調製された蛍光標識抗体断片が用い られる。本発明において、蛍光標識抗体断片の調製に用いられる抗体は、同じく本 発明において用いられる非蛍光標識ィ匕完全型抗体とはその結合する抗原のェピトー プが異なる抗体が選択される。該蛍光標識抗体断片の調製には、抗原の完全型抗 体をペプシンやパパインのような酵素で断片化し、これを 2—メルカプトメチルァミン 或いは 2—メルカプトエタノール等で還元して単量体とした後、標識化して調製する。 該標識ィ匕には、蛍光色素が用いられ、例えばフルォレセインイソチオシァネート (FIT C)、 Alexa532のような蛍光色素が用いられる。
[0031] (FCSによる検出、測定）
本発明の抗原の迅速検出及び Z又は測定法においては、被検試料に、検出試薬と して蛍光標識抗体断片及び非蛍光標識化完全型抗体を添加し、混合して、抗原抗 体反応を行った被検試料を、 FCS (蛍光相関分光法）により抗原の検出及び Z又は 測定を行う。 FCSは、溶液中の蛍光分子のブラウン運動を利用し、分子の「大きさ」 や「数」と 、つた物理量を得る方法である。
FCSの特徴は、溶液に含まれる蛍光分子の濃度や分子間相互作用を物理的な分 離過程を経ずにほぼ実時間でモニタできることにある。そのため、 FCSを用いた検出 系では、これまで主流となっていた生体分子検出系（例えば ELISAなど)で必要であ つた煩雑な Bound/Free分離過程を省くことができる。従って、短時間に多量のサン プルを高感度に、かつ自動的に測定することが可能となる。 FCSは、各種のものが知 られている力 本発明においては、本発明の検出、測定対象の検出、測定のために 障害となることがない限り、いずれの方法も用いることができる（蛋白質 核酸 酵素、 Vol. 44、 No.9、 1431— 1438、 1999 ;バイオインダストリ一 4月号、 p. 52-59、 2003 ;特 開 2001— 272404号公報；特許第 3517241号公報)。
[0032] (FCS測定装置）
FCSによる検出及び測定に用いられる装置の基本構造を、図 4に示す。図により概 説すると、（A)は FCS (蛍光相関分光)装置の模式図を示す。レーザーからの励起 光はダイクロイツクミラー (DM)と対物レンズを経由してカバーガラス上の試料溶液に 導かれる。蛍光発光はロングパスフィルター又はバンドパスフィルター (F)を通り、共 焦点上のピンホールで共焦点面以外のバックグラウンド光を取り除き、アバランシェフ オトダイオード検出器 (APD)、又は光電子増幅管 (PMT)へと導かれ、その信号はさ らにデジタル相関器で解析される。（B)は観測領域の拡大模式図を示す。対物レン ズによって極限まで絞られた共焦点領域を、ブラウン運動して 、る蛍光分子が通過 する様子を示す。（C)は、蛍光相関解析後の相関曲線を示す。観測される蛍光強度 のゆらぎを式を用いて解析することで、分子の「数」や「大きさ」 t 、つた物理量が得ら れる。
FCSによる測定では、共焦点光学系を用いることにより、試料溶液の極微小領域 (直 径約 400nm,軸長 約 体積 〜10— 161)力もの蛍光を検出している（図 4)。本 発明の実施例では、 FCS測定装置として、ォリンパス社製の MF20を用いた。測定 は、波長 543, 633nmで 30秒間の測定を 3回行う方式で実施した。
[0033] (観測される蛍光強度の揺らぎ）
FCSによる測定では、観測領域は開放系であるため、蛍光分子はブラウン運動にし たがい領域内を出入りする。すると、観測領域中の分子の数はある値を中心に変動 し、数の揺らぎが生じる。そして、この数の揺らぎに起因した蛍光強度の揺らぎが観 測される（蛋白質 核酸 酵素、 Vol. 44、 No.9、 1431— 1438、 1999)。
[0034] (揺らぎの解析）
観測される蛍光強度のゆらぎを、次の式（1)〜(4)を用いて解析することで、分子の「 数」や「大きさ」 t 、つた物理量が得られる。
すなわち、揺らぎの信号力 情報を引き出すために自己相関関数を用いる。 FCSで 用いる自己相関関数は式（1)で示される。
式 1 [0035]
Figure imgf000016_0001
[0036] ここで、 sは s = z/wであり、観測領域の半径 (w)と半長軸（z)の比を示す。 τ は拡
D
散時間 (又は相関時間）と呼ばれ、蛍光分子が拡散によって観測領域を通過する平 均の時間を示す。 Νは一定時間内に観測領域内に存在する分子の平均の数を示 す。
[0037] 揺らぎを式 (1)により解析すると図 4 (C)に示すような曲線が得られ、そこから分子の 「動き易さ」を示す拡散時間 τ と分子の「数」 Νが得られる。相関曲線は、蛍光分子
D
が他の分子と会合するなどして分子のサイズ (大きさ）が大きくなると右にシフトし、反 対に解離するなどしてサイズが小さくなると左にシフトする。
式（1)で得られる拡散時間 τ は、拡散定数 Dと式 (2)の関係にある。
D
式 2
[0038]
[0039] 更に、拡散定数 Dは、分子を球と仮定した場合のアインシユタイン-スト一タス (Einste in-Stokes)式により、分子の半径 rと式（3)に示される関係にある。
式 3
[0040]
Figure imgf000016_0002
[0041] ：で、 K 、 T、および 7?はそれぞれボルツマン定数、絶対温度、および溶媒の粘性
Β である。従って、拡散時間て は式 (2)と (3)より分子の「大きさ」（サイズ)に当たる分子
D
半径 rと式 (4)のように関係付けられる。
式 4
[0042] て D a 1/D « r
[0043] このように蛍光強度の揺らぎを式（1)及び (4)を用いて解析することで、観測領域内 に存在する分子の「数」や「大きさ」を得ることができる。揺らぎと自己相関関数に関し ての詳しい説明は解説書に解説されている（武者利光著「ブルーバックス ゆらぎの 世界」、講談社、 1980 ;D.アイゼンバーグ他 1名著「生命科学のための物理学 (下)」 培風館、 p596-600、 1988 ;日野幹雄著「スペクトル解析」朝倉書店、 p25-39, 1977) 0 [0044] (FCS測定を用いた場合の操作、所要時間）
本発明の FCSによる抗原タンパク質の検出及び Z又は測定の操作、所要時間につ いて、従来法である ELISAを用いた抗原タンパク質の検出及び/又は測定法の場 合と比較して表示した。
(1)操作の比較 (簡便性の比較）
本発明の FCSによる抗原タンパク質の迅速検出及び 又は測定法の各ステップに おける操作を表 1に示した。
[0045] [表 1]
1.操作の比較 (簡便性の比較)
Figure imgf000017_0001
[0046] (2)所要時間の比較 (迅速性の比較) 本発明の FCSによる抗原タンパク質の迅速検出及び Z又は測定法の各ステップに おける所要時間を表 2に示した。
[表 2]
2.所要時間の比較 （迅速性の比較)
Figure imgf000018_0001
[0048] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
[0049] [FCSを用いた抗原 (抗原タンパク質)の検出、測定]
(装置及び材料）
(1) 装置
FCS装置
分子間相互作用解析システム (MF— 20、ォリンパス光学工業株式会社製）
(2)材料
蛍光標識抗体断片の調製
この実施例では、抗プリオン抗体の蛍光標識抗体断片 (Fab' -Alexa532)を例にし た。
Fab'— Alexa532の調製の概略を図 5に示した。抗 PrP抗体溶液を PD— 10カラム（ フアルマシア）を使ってクェン酸溶液 (pH6. 3)に平衡ィ匕した後、ペプシン（1% (WZ w) )を添加し（37°C、約 30分間）、 F (ab')を調製した。消化の程度は HPLC (カラム ； G300SWXL)で確認した。その後、 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 3)を用いて FPLC (カラム; Superdex 200 (16/60) )で精製した後、濃縮保存した。更に、 2—メルカプ トメチルァミン (0. 01M)を添カ卩して還元し（37°C、約 1. 5時間）、 Fab'を調製した。
[0050] 還元の程度は HPLC (カラム； G300SWXL)で確認した。溶液を PD— 10カラム（ファ ルマシア）を使ってクェン酸溶液 (pH3. 5)に平衡化した後、速やかに 2当量の Alexa 532マレイミド (Molecular Probe)をカ卩え、 4°Cでー晚放置してカップリングを行った。 その後、 0, 05Mリン酸緩衝液（pH7. 8、0. 05%NH3)を用いて FPLC (カラム； Sup erdex 200 (16/60) )で精製し、— 80°Cで凍結保存した。 2種類の抗 PrP抗体（上 記標識断片化したもの、完全型抗体として使用するもの)、及び組換え牛 PrP (抗原） は、共に富士レビォ (株)から提供された。
[0051] (抗原タンパク質の検出、測定実験操作）
N101 (日本油脂）でブロッキング処理した 384穴プレート (ォリンパス光学工業株式 会社）に、 Fab'— Alexa532 (蛍光標識抗体断片） (6. 86E— 10M)、プリオンタンパ ク質 (抗原タンパク質）（6. 12E— 8M)、完全型抗体 (抗ゥシ組換えプリオン抗体）（8 . 76E— 7M)の順に入れ、ピペットでよく攪拌した。 37°Cで 1時間放置した後、 MF2 0 (FCS測定装置：ォリンパス光学工業株式会社)を用いて測定した。測定時のレー ザ一パワーは 150 /z Wとし、 30秒間 X 3回の測定を行った。 MF20の処理ソフトフエ ァを用いて拡散時間をはじめとする各パラメータを導いた。
[0052] (実験結果）
実験結果を、図 6に示す。この実施例において、プリオン蛋白質の分子量が約 30kD aであることから、完全型抗体を使用しな 、場合は拡散時間に有意な差が生じな！/、可 能性がある。具体的には、蛍光標識抗体断片と複合体 (蛍光標識抗体断片 +プリオン 蛋白質)の理論的な拡散時間はそれぞれ約 600 s、 650 sとなる。実験において も、蛍光標識抗体断片と複合体 (蛍光標識抗体断片 +プリオン蛋白質)の拡散時間は それぞれ約 600 s、 sとなり、有意な差が生じなかった（図 6)。一方、蛍光標 識抗体断片と複合体 (蛍光標識抗体断片 +完全型抗体 +プリオン蛋白質)の理論的 な拡散時間はそれぞれ約 600 s、 900 sとなり、有意な差が生じる。実験において も、蛍光標識抗体断片と複合体の拡散時間はそれぞれ約 600 s、 950 sと理論値 に近ぐ有意な差を生じた（図 6)。したがって、この実施例により、本発明の方法を用 V、なければ検出できな 、分子量の小さな抗原を、本方法を用いて検出し得ることが 立証された。
産業上の利用可能性
[0053] 本発明の蛍光相関分光法 (FCS)による抗原の検出及び Z又は測定法は、検出及 び Z又は測定する抗原タンパク質のような抗原の形状や分子量に依存せず、異常型 プリオンのような病原性タンパク質や、食品素材中に含まれる有害タンパク質のような 比較的分子量の小さい抗原タンパク質のようなものでも、検出及び測定が可能であり 、広い範囲の抗原の検出及び Z又は測定に用いることができる。また、本発明の検 出及び Z又は測定法は、 FCSにより検出及び Z又は測定を行うので、検出する抗原 分子の数や、大きさ、或いは形等の物理量を、試料の物理的な分離過程を経ずに、 しかもほぼ実時間で検出、測定することが可能であり、抗原を簡便な操作で、迅速か つ正確に検出及び Z又は測定することが可能である。
[0054] 更に、 FCSによる検出及び Z又は測定を行う本発明の方法は、 FCSで検出及び 測定するための処理操作は、被検試料 (抗原を含む)と、蛍光標識抗体断片及び非 蛍光標識化完全型抗体とからなる検出試薬を混合し、抗原抗体反応を行うだけの操 作であり、し力も、その測定結果はほぼ実時間でモニタすることが可能であることから 、被検試料への検出試薬の混合、反応から測定結果の表示までを自動的或いは半 自動的に行うことに向いている。また、従来プリオンのような抗原タンパク質の測定に 用いられていた ELISAやウェスタンブロット法のような方法に比較して、分析操作に 係わるステップ数が少なぐサンプルも数 1〜数十/ z 1で測定可能であることから、経 済的にかつ大量の被検試料の測定を行うことができ、実用的な抗原タンパク質の測 定手段としての利用が期待できる。

Claims

請求の範囲
[1] 抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識抗体断片、及び、抗原の 他のェピトープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型抗体を用い、抗原と蛍光標識抗体 断片及び非蛍光標識化完全型抗体との抗原抗体複合体を形成させ、形成された抗 原抗体複合体を蛍光相関分光法により検出、解析することを特徴とする蛍光相関分 光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法。
[2] 抗原が、抗原タンパク質であることを特徴とする請求項 1記載の蛍光相関分光法によ る抗原の迅速検出及び Z又は測定法。
[3] 形成された抗原抗体複合体の蛍光相関分光法による検出、解析が、蛍光標識化さ れた蛍光標識抗体断片と形成された標識化された抗原抗体複合体との拡散速度の 差に基く識別を利用した抗原の検出、解析であることを特徴とする請求項 1又は 2記 載の蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法。
[4] 抗原の迅速検出及び Z又は測定が、形成された抗原抗体複合体の蛍光相関分光 法による検出、解析に基ぐ抗原の存在、抗原の濃度、抗原の大きさ、又は、抗原の 形の検出及び Z又は測定であることを特徴とする請求項 1〜3のいずれか記載の蛍 光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法。
[5] 抗原のェピト—プを標的とする蛍光標識化された蛍光標識抗体断片が、抗原を免疫 原として作製されたモノクローナル抗体カゝら調製されたものであり、抗原タンパク質の 他のェピトープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型抗体が、抗原を免疫原として作製 されたモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 1〜4のいずれか記載の蛍 光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法。
[6] 被検試料に、抗原のェピト—プを標的とする蛍光標識化された蛍光標識抗体断片、 及び、抗原の他のェピト—プを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型抗体を添加して、抗 原抗体反応を行わせ、形成された抗原と蛍光標識抗体断片及び非蛍光標識化完全 型抗体との抗原抗体複合体を、蛍光相関分光法により検出、解析することを特徴と する蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法。
[7] 抗原が、抗原タンパク質であることを特徴とする請求項 6記載の蛍光相関分光法によ る抗原の迅速検出及び Z又は測定法。
[8] 蛍光相関分光法による抗原の検出及び Z又は測定が、被検試料に含まれる抗原の 物理的な分離過程を経ることなく行われることを特徴とする請求項 6又は 7記載の蛍 光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法。
[9] 被検試料へ、抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識抗体断片、 及び、抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識ィヒ完全型抗体を添加する工程 、該被検試料、蛍光標識抗体断片及び非蛍光標識化完全型抗体により抗原抗体反 応を行う工程、及び、該抗原抗体反応を行った被検試料を蛍光相関分光法により検 出、解析を行う工程を、自動的又は半自動的に行うことを特徴とする請求項 6〜8の いずれか記載の蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法。
[10] 被検試料が、生体タンパク質試料であり、抗原が病原性タンパク質抗原であることを 特徴とする請求項 6〜9のいずれか記載の蛍光相関分光法による抗原の迅速検出 及び Z又は測定法。
[11] 病原性タンパク質抗原が、異常型プリオンであることを特徴とする請求項 10記載の蛍 光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定法。
[12] 被検試料が、食品素材であり、抗原が食品素材中に含まれる有害タンパク質抗原で あることを特徴とする請求項 6〜9のいずれか記載の蛍光相関分光法による抗原の 迅速検出及び Z又は測定法。
[13] 検出及び Z又は測定する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標 識抗体断片、及び、抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型抗体か らなる、蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び Z又は測定用の検出試薬。
[14] 請求項 12記載の検出試薬を装備した、蛍光相関分光法による抗原の迅速検出及び
Z又は測定用キット。
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