WO1999057150A2 - Multivalente antikörper-konstrukte - Google Patents

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WO1999057150A2
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Melvyn Little
Sergej Kipriyanov
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to multivalent F v antibody constructs, expression plasmids encoding them, and a method for producing the F v antibody constructs and their use.
  • Natural antibodies are dimers and are therefore called bivalent. They have four variable domains, namely two V H and two V L domains. The variable domains serve as binding sites for an antigen, a binding site being formed from a V H and a V L domain. Natural antibodies recognize an antigen, which is why they are also called monospecific. They also have constant domains. These contribute to the stability of the natural antibodies. On the other hand, they are also responsible for unwanted immune reactions that arise when natural antibodies from different animal species are administered reciprocally.
  • antibodies are constructed that lack the constant domains.
  • these are antibodies that only have the variable domains.
  • Such antibodies are referred to as F v antibody constructs. These are often in the form of single-chain, paired monomers.
  • F v -antibody constructs have little stability. Their usability for therapeutic purposes is therefore very limited.
  • the object of the present invention is therefore to provide an antibody with which undesired immune reactions can be avoided. Furthermore, it should have a stability that makes it suitable for therapeutic purposes makes it usable.
  • the present invention thus relates to a multivalent F v antibody construct which has great stability. Such is suitable for diagnostic and therapeutic purposes.
  • the present invention is based on the knowledge of the applicant that the stability of an F v -antibody construct can be increased if it is in the form of a single-chain dimer in which the four variable domains are connected to one another via three peptide linkers.
  • the applicant has also recognized that the F v antibody construct folds itself when the central peptide linker is about 10-30 amino acids in length.
  • the applicant has recognized that the F v antibody construct folds together with other F v antibody constructs when the middle peptide linker has a length of approximately up to 10 amino acids, whereby a multimeric, ie multivalent, F v Antibody construct is obtained.
  • the applicant has also recognized that the F v antibody construct can be multispecific.
  • the applicant's findings are used to provide a multivalent F v antibody construct which comprises at least four variable domains which are linked to one another via peptide linkers 1, 2 and 3.
  • F v antibody construct indicates an antibody that has variable domains, but not constant domains.
  • variable F v antibody construct indicates an F v antibody which has several variable domains, but at least four. This is achieved when the single-chain F v antibody construct folds with itself, resulting in four variable domains, or with other single domains. folds chain-like F v antibody constructs. In the latter case there is an F v antibody construct which has 8, 12, 16, etc. variable domains. It is favorable if the F v antibody construct has four or eight variable domains, ie it is bi- or tetravalent (cf. FIG. 1). Furthermore, the variable domains can be the same or different from one another, as a result of which the antibody construct recognizes one or more antigens.
  • the antibody construct preferably recognizes one or two antigens, ie it is mono- or bispecific. Examples of such antigens are the proteins CD19 and CD3.
  • peptide linker 1, 3 indicates a peptide linker which is suitable for connecting variable domains of an F v antibody construct to one another.
  • the peptide linker can contain any amino acids, with the amino acids glycine (G), serine (S) and proline (P) being preferred.
  • Peptide linkers 1 and 3 can be the same or different from one another.
  • the peptide linker can have a length of about 0-10 amino acids. In the former case, the peptide linker is only a peptide bond from the COOH residue of one of the variable domains and the NH 2 residue of another of the variable domains.
  • the peptide linker preferably has the amino acid sequence GG.
  • peptide linker 2 indicates a peptide linker which is suitable for linking variable domains of an F v antibody construct to one another.
  • the peptide linker can contain any amino acids, with the amino acids glycine (G), serine (S) and proline (P) being preferred. Further, the peptide linker may have a length of about 3 to 10 amino acids, preferably 5 amino acids, and especially the amino acid sequence GGPGS, have thereby achieved that the single chain F v antibody construct single chain F v with other anti-body constructs folds up.
  • the peptide linker can have a length of approximately 11-20 amino acids, in particular 15-20 amino acids, and very particularly the amino acid sequence (G 4 S) 4 , whereby the single-chain F v antibody construct is associated with it itself folds.
  • An F v antibody construct according to the invention can be produced by conventional methods. A method is favorable in which DNAs coding for peptide linkers 1, 2 and 3 are ligated with DNAs coding for the four variable domains of an F v -antibody construct in such a way that the peptide linkers connect the variable domains to one another, and the resultant DNA molecule is expressed in an expression plasmid. Reference is made to Examples 1-6.
  • DNAs which code for an F v antibody construct according to the invention are also the subject of the present invention.
  • Expression plasmids which contain such DNAs are also the subject of the present invention.
  • Preferred expression plasmids are pDISC3x19-LL, pDISC3x19-SL, pPIC-DISC-LL, pPIC-DISC-SL, pDISC5-LL and pDISC6-SL. The first four were deposited with the DSMZ (German Collection for Microorganisms and Cells) on April 30, 1998 under DSM 12150, DSM 12149, DSM 12152 and DSM 12151.
  • Another object of the present invention is a kit comprising:
  • One or more representatives of the individual components can be present.
  • the present invention provides a multivalent F v antibody construct in which the variable domains are linked to one another via peptide linkers.
  • Such an antibody construct is characterized in that it does not contain any parts that can lead to undesirable immune reactions. It also has great stability. Furthermore, it enables several antigens to be bound simultaneously.
  • the F v antibody construct according to the invention is therefore ideally suited not only for diagnostic but also for therapeutic purposes. Such purposes can be seen with respect to any disease, particularly viral, bacterial or tumor disease.
  • FIG. 1 shows the genetic organization of an F v antibody construct (A) according to the invention and schemes for forming a bivalent (B) or tetravalent F v antibody construct (C).
  • Ag antigen
  • His ⁇ six C-terminal histidine residues
  • Stop Stop Codon (TAA)
  • V H and V L variable region of the heavy and light chain.
  • Fig. 2 shows the scheme for the construction of the plasmids pDISC3x19-LL and pDISC3x19-SL.
  • c-myc sequence coding for an epitope recognized by the antibody 9E1, His ⁇ : sequence coding for six C-terminal histidine residues;
  • PelB signal peptide sequence of the bacterial pectate lyase (PelB leader); rbs: ribosome binding site; Stop: Stop Codon (TAA); V H and V L : variable region of the heavy and light chain.
  • FIG. 3 shows a diagram of the expression plasmid pDISC3x19-LL.
  • 6xHis sequence coding for six C-terminal histidine residues; bla: gene encoding jß-lactamase responsible for ampicillin resistance; bp: base pairs; c- myc.
  • 6xHis sequence coding for six C-terminal histidine residues
  • bla gene that for ß- Encodes lactamase, which is responsible for ampicillin resistance
  • bp base pairs
  • c- myc Sequence encoding an epitope recognized by antibody 9E10
  • ColE1 Origin of DNA Replication
  • f1-IG intergenic region of bacteriophage f1
  • Lac P / O wt / ac operon promoter / operator
  • Linker 1 Sequence coding for a GlyGly dipeptide that connects the V H and V L domains; Left S.
  • c- / 77 t epitope sequence coding for an epitope recognized by the antibody 9E10; CDR: complementarity determining region; Scaffold: scaffold region (framework region); His6 tail, sequence encoding six C-terminal histidine residues; PelB leader: signal peptide sequence of bacterial pectalyase; RBS: ribosome binding site; V H and V L : variable region of the heavy and light chain.
  • FIG. 6 shows the nucleotide and the derived amino acid sequence of the tetravalent F v antibody construct encoded by the expression piasmid pDISC3x19-SL.
  • c-myo-Ep Xop sequence coding for an epitope that is recognized by the antibody 9E10;
  • CDR region determining complementarity, framework: framework region (framework region);
  • His6 tail sequence encoding six C-terminal histidine residues;
  • PelB leader signal peptide sequence of bacterial pectalyase;
  • RBS ribosome binding site;
  • V H and V L variable region of the heavy and light chain.
  • Figure 7 shows the nucleotide and deduced amino acid sequence of a link between a gene coding for an ⁇ factor leader sequence and a gene coding for the tetravalent F v antibody construct in the Pichia expression plasmid pPIC- DISC-SL.
  • Figure 8 shows the nucleotide and deduced amino acid sequence of a link between a gene encoding an ⁇ factor leader sequence and a gene encoding the bivalent F v antibody construct in the Pichia expression plasmid pPIC- DISC-LL.
  • Alpha factor signal leader peptide sequence of the Saccharomyces ce eiz / s / äe- ⁇ factor secretion signal;
  • V H variable region of the heavy chain. Rhombuses indicate the signal gap points.
  • 6xHis sequence coding for six C-terminal histidine residues
  • bla gene coding for ⁇ -lactamase, which is responsible for ampicillin resistance
  • bp base pairs
  • c-myc gene coding for ⁇ -lactamase, which is responsible for ampicillin resistance
  • lacZ bacteriophage T7 gene 10 (T7g10) or from the E. coli skp gene (skp); skp: gene coding for the bacterial periplasmic factor Skp / OmpH; tHP: strong transcription terminator; TIP: transcription terminator; V H and V L : variable region of the heavy and light chain.
  • 10 shows a diagram of the expression plasmid pDISC6-SL.
  • 6xHis sequence coding for six C-terminal histidine residues
  • bla gene coding for ⁇ -lactamase, which is responsible for ampicillin resistance
  • bp base pairs
  • c-myc a diagram of the expression plasmid pDISC6-SL.
  • lacZ bacteriophage T7 gene 10 (T7g10) or from the E. coli skp gene (skp); skp: gene coding for the bacterial periplasmic factor Skp / OmpH; tHP: strong transcription terminator; TIP: transcription terminator; V H and V L : variable region of the heavy and light chain.
  • Example 1 Construction of the piasmids pDISC3x19-LL and pDISC3x19-SL for the expression of bivalent, bispecific or tetravalent, bispecific F v antibody constructs in bacteria
  • a PCR fragment 1 of the V H domain of anti-CD19 followed by a segment coding for a GlyGly linker was generated using the primers DP1, 5'-TCA-CACAOA ⁇ TICTTAGATCTATTAAAGAGGAGAAATTAACC, and DP2, 5'- AGCACACGATATCACCGCCAAGCTTGGGTGTTGTTTTGGC. generated (see Fig. 2).
  • the PCR fragment 1 was digested with Eco ⁇ and EcorN and ligated with the plasmid pHOG-dmOKT3 linearized with EcoRI / EcoRV, whereby the vector ⁇ HOG19-3 was generated.
  • PCR fragment 2 of the V L domain of anti-CD19, followed by a segment encoding a c-myc-Ep ' ftop and a hexahistidinyl tail was generated using primers DP3, 5'-AGCACA-CAAGC IGGCGGTGATATCTTGCTCACCCAAACTCCA, and DP4, 5'-AGCA-CACTCTAGAGACACACAGATCTTGTTGGGGAGTGTGTGGG.
  • the PCR fragment 2 was digested with H / ndll and Xba and ligated with the plasmid pHOG-dmOKT3 linearized by HindWjXba, whereby the vector pHOG3-19 was obtained (cf. FIG. 2).
  • Encoding the hybrid scFv-encoding gene in the plasmid 3-19 pHOG3-19 was amplified by PCR with primers Bi3sk, 5'CAGCCGGCCATGGCGCAGGTGCAACTGCAGCAG and either Li-1, 5'-TATA TACTGCAGCTGCACCTGGCTA CCACCAC - CACCGGAGCCGCCACCACCGCTACCACCGCCGCCAGAACCACCACCACC- AGCGGCCGCAGCATCAGCCCG, for generating a long flexible (Gly 4 Ser) 4 - inter-scFv linker (PCR fragment 3, see FIG.
  • Example 2 Construction of the plasmids pPIC-DISC-LL and pPIC-DISC-SL for the expression of bivalent, bispecific or tetravalent, bispecific F v antibody constructs in yeast
  • the vector pPICZ ⁇ A (Invitrogen BV, Leek, Netherlands) for the expression and secretion of recombinant proteins in the yeast Pichia pastoris was used as the starting material. It contains a gene that is responsible for the Saccharomyces cerevi s / äe ⁇ factor secretion signal encoded, followed by a polylinker. The secretion of this vector is based on the dominant selectable marker, Zeocin TM, which is bifunctional in both Pichia and E coli.
  • the gene coding for the tetravalent F v antibody construct was PCR-isolated from the template pDISC3x19-SL using the primers 5-PIC, 5'-CCGTGAAT-ICCAGGTGCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTC 'and pSEXGn 5' - GACGTTAACCGACAAACAACAGATAAAACG amplified.
  • the PCR product thus obtained was cleaved with EcoR ⁇ and Xba and ligated into pPICZ ⁇ A linearized with EcoRI / Xba.
  • the expression piasmid pPIC-DISC-SL was obtained.
  • the nucleotide and protein sequences of the tetravalent F v antibody construct are shown in FIG. 7.
  • pPIC-DISC-LL The construction of pPIC-DISC-LL was carried out on the basis of pPICZ ⁇ A (Invitrogen BV, Leek, Netherlands) and pDISC3x19-LL (see Fig. 3).
  • the plasmid DNA pPICZ ⁇ A was digested with EcoRI.
  • the protruding 5 'ends were filled in using a Klenow fragment of the E c ⁇ / ⁇ DNA polymerase I.
  • the DNA thus obtained was digested with Xba and the large fragment comprising the pPIC vector was isolated.
  • the DNA from pDISC3x19-LL was cleaved with Nc ⁇ and treated with a Klenow fragment.
  • Example 3 Expression of the tetravalent or bivalent F v -antibody construct in bacteria
  • the spheroplasts were centrifuged at 30,000 g for 30 min at 4 ° C., whereby the soluble periplasmic extract as a supernatant and the spheroplasts with the insoluble periplasmic material as a pellet were obtained.
  • the culture supernatant and the soluble periplasmic extract were combined and clarified by further centrifugation (30,000 g, 4 ° C., 40 min).
  • the recombinant product was concentrated by ammonium sulfate precipitation (final concentration 70% saturation).
  • the protein precipitate was collected by centrifugation (10,000 g, 4 ° C, 40 min) and dissolved in 10% of the initial volume of 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 7.0.
  • Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) was performed at 4 ° C using a 5 ml column of chelating Sepharose (Pharmacia) loaded with Cu 2+ and with 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCI, pH 7.0 (start buffer) had been equilibrated. The sample was charged by passing it over the column.
  • Protein concentrations were determined using the Bradford dye binding test (1976, Anal. Biochem., 72, 248-254) using the Bio-Rad (Munich, Germany) protein assay kit.
  • Example 4 Expression of the tetravalent or bivalent antibody construct in the yeast Pichia pasto s
  • Competent P. y ⁇ ⁇ 3s ⁇ ? / 7i? GS155 cells were electroporated in the presence of 10 ⁇ g plasmid DNA from pPIC-DISC-LL or pPIC-DISC-SL, which had been linearized with Sa ⁇ .
  • the transformants were selected for 3 days at 30 ° C. on YPD plates containing 100 ⁇ g / ml Zeocin TM.
  • the clones that secreted bivalent or tetravalent F v antibody constructs were selected by plate screening using an anti-c / 77 c mAb 9E10 (IC Chemicals, Ismaning, Germany).
  • the clones were grown in YPD medium in shake flasks for 2 days at 30 ° C. with stirring.
  • the cells were centrifuged, resuspended in the same volume of the medium containing methanol and incubated for a further 3 days at 30 ° C. with stirring.
  • the supernatants were collected after centrifugation.
  • the recombinant product was isolated by ammonium sulfate precipitation followed by IMAC as described above.
  • Analytical gel filtration of the F v antibody constructs was performed in PBS using a Superdex 200 HR10 / 30 column (Pharmacia).
  • the Sample volume and flow rate were 200 ⁇ l / min and 0.5 ml / min, respectively.
  • the column was calibrated with high and low molecular weight gel filtration calibration kits (Pharmacia).
  • the human CD3 + / CD19 " acute T cell leukemia line Jurkat and the CD19 + / - CD3 " B cell line JOK-1 were used for flow cytometry. 5 ⁇ 10 5 cells in 50 ⁇ l RPMI 1640 medium (GIBCO BRL, Eggestein, Germany), which was supplemented with 10% FCS and 0.1% sodium azide (referred to as complete medium), were treated with 100 ⁇ l of the F v antibodies - Incubated preparations for 45 min on ice. After washing with the complete medium, the cells were incubated with 100 ⁇ l 10 ⁇ g / ml anti-c- / 77j c-Mak 9E10 (IC chemicals) in the same buffer for 45 min on ice.
  • the cells were incubated with 100 ul of the FITC-labeled goat anti-mouse IgG (GIBCO BRL) under the same conditions as before. The cells were then washed again and resuspended in 100 ⁇ l of 1 ⁇ g / ml propidium iodide solution (Sigma, Deisenhofen, Germany) in complete medium with the exclusion of dead cells. The relative fluorescence of the stained cells was measured using a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
  • the CD19-expressing Burkitt lymphoma cell line Raji and Namalwa were used as target cells.
  • the cells were incubated in RPMI 1640 (GIBCO BRL) supplemented with 10% heat inactivated FCS (GIBCO BRL), 2 mM glutamine and 1 mM pyruvate at 37 ° C in a humidified atmosphere with 7.5% CO 2 .
  • the cytotoxic T cell tests were performed in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS, 10 mM HEPES, 2 mM glutamine, 1 mM pyruvate and 0.05 mM 2-ME.
  • Cytotoxic activity was assessed using a standard [ 51 Cr] release assay; 2 x 10 ⁇ target cells were with 200 ⁇ Ci Na [ 51 Cr] O 4 (Amersham-Buchler, Braunschweig, Germany) marked and washed 4 times and then resuspended in medium in a concentration of 2 ⁇ 10 5 / ml. The effector cells were adjusted to a concentration of 5 x 10 6 / ml. Increasing amounts of CTLs in 100 ⁇ l were titrated to 10 4 target cells / well in 50 ⁇ l. 50 ul antibody was added to each well. The entire test was run in triplicate and incubated for 4 h at 37 ° C.
  • Example 6 Construction of the plasmids pDISC5-LL and pDISC6-SL for the expression of bivalent, bispecific or tetravalent, bispecific F v -antibody constructs in bacteria by high cell density fermentation
  • Expression vectors containing the hok / sok plasmid-free cell "suicide" system and a gene encoding the Skp / OmpH periplasmic factor for greater production of recombinant antibodies were prepared.
  • the skp gene was PCR by means of the primers skp-1, 5'-CGA ATT CTT AAG ATA AGA AGG AGT TTA TTG TGA AAA AGT GGT TAT TAG CTG CAG G and skp-2, 5'-CGA ATT AAG CTT CAT TAT TTA ACC TGT TTC AGT ACG TCG G amplified using the plasmid pGAH317 (Holck and Kleppe, 1988, Gene 67, 117-124).
  • the resulting PCR fragment was digested with AflII and HindIII and inserted into the plasmid pHKK (Hörn et al., 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 524-532) linearized with AflII / HindIII, whereby the vector pSKK was obtained.
  • the genes contained in the plasmids pDISC3x19-LL and ⁇ DISC3x19-SL and coding for the scFv antibody constructs were determined by PCR using the primers. 1, 5'-CGA ATT TCT AGA TAA GAA GGA GAA ATT AAC CAT GAA ATA CC and
  • Multivalent F v antibody construct with at least four variable domains, which are connected to one another via peptide linkers 1, 2 and 3.
  • F v antibody construct according to claim 1 wherein the peptide linkers 1 and 3 have 0-10 amino acids.
  • F v antibody construct according to claim 4 wherein the peptide linker has 2 11-20 amino acids.
  • F v antibody construct according to claim 7 or 8 wherein the peptide linker 2 has the amino acid sequence GGPGS. 10. F v antibody construct according to any one of claims 1-9, wherein the F v antibody construct is multispecific.
  • F v -antibody construct according to claim 10 wherein the F v -antibody construct is bispecific.
  • F v antibody construct according to any one of claims 1-9, wherein the F v antibody construct is monospecific.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein multivalentes Fv-Antikörper-Konstrukt mit mindestens vier variablen Domänen, die über die Peptidlinker 1, 2 und 3 miteinander verbunden sind. Ferner betrifft die Erfindung Expressionsplasmide, die für ein solches Fv-Antikörper-Konstrukt codieren, und ein Verfahren zur Herstellung der Fv-Antikörper-Konstrukte sowie deren Verwendung.

Description

Multivalente Antikörper-Konstrukte
Die vorliegende Erfindung betrifft multivalente Fv-Antikörper-Konstrukte, sie kodierende Expressionsplasmide, und ein Verfahren zur Herstellung der Fv-Anti- körper-Konstrukte sowie ihre Verwendung.
Natürliche Antikörper sind Dimere und werden daher als bivalent bezeichnet. Sie weisen vier variable Domänen, nämlich zwei VH- und zwei VL-Domänen, auf. Die variablen Domänen dienen als Bindungsstellen für ein Antigen, wobei eine Bindungsstelle aus einer VH- und einer VL-Domäne ausgebildet ist. Natürliche Antikörper erkennen jeweils ein Antigen, wodurch sie auch als monospezifisch bezeichnet werden. Ferner weisen sie auch konstante Domänen auf. Diese tragen zur Stabilität der natürlichen Antikörper bei. Andererseits sind sie auch für unerwünschte Immunreaktionen mitverantwortlich, die entstehen, wenn natürliche Antikörper verschiedener Tierarten wechselseitig verabreicht werden.
Zur Vermeidung solcher Immunreaktionen werden Antikörper konstruiert, denen die konstanten Domänen fehlen. Insbesondere sind dies Antikörper, die nur noch die variablen Domänen aufweisen. Solche Antikörper werden mit Fv-Antikörper-Konstru- ten bezeichnet. Diese liegen häufig in Form einzelkettiger, sich miteinander gepaarter Monomere vor.
Es hat sich allerdings gezeigt, daß Fv-Antikörper-Konstrukte nur eine geringe Stabilität aufweisen. Ihre Verwendbarkeit für therapeutische Zwecke ist daher stark eingeschränkt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Antikörper bereitzustellen, mit dem unerwünschte Immunreaktionen vermieden werden können. Ferner soll er eine Stabilität aufweisen, die ihn für therapeutische Zwecke einsetzbar macht.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein multivalentes Fv-Antikörper- Konstrukt, das eine große Stabilität aufweist. Ein solches eignet sich für diagnostische und therapeutische Zwecke.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß die Stabilität eines Fv-Antikörper-Koπstruktes erhöht werden kann, wenn dieses in Form eines einzelkettigen Dimeres vorliegt, bei dem die vier variablen Domänen über drei Peptidlinker miteinander verbunden sind. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß sich das Fv-Antikörper-Konstrukt mit sich selbst faltet, wenn der mittlere Peptidlinker eine Länge von etwa 10 - 30 Aminosäuren aufweist. Des weiteren hat der Anmelder erkannt, daß sich das Fv-Antikörper-Konstrukt mit anderen Fv-Anti- körper-Konstrukten zusammenfaltet, wenn der mittlere Peptidlinker eine Länge von etwa bis zu 10 Aminosäuren aufweist, wodurch ein multimeres, d.h. multivalentes, Fv-Antikörper-Konstrukt erhalten wird. Auch hat der Anmelder erkannt, daß das Fv- Antikörper-Konstrukt multispezifisch sein kann.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein multivalentes Fv-Antikörper-Konstrukt bereitzustellen, das mindestens vier variable Domänen umfaßt, die über die Peptidlinker 1 , 2 und 3 miteinander verbunden sind.
Der Ausdruck "Fv-Antikörper-Konstrukt" weist auf einen Antikörper hin, der variable Domänen, nicht aber konstante Domänen aufweist.
Der Ausdruck "multivalentes Fv-Antikörper-Konstrukt" weist auf einen Fv-Antikörper hin, der mehrere variable Domänen, jedoch mindestens vier aufweist. Solches wird erreicht, wenn sich das einzelkettige Fv-Antikörper-Konstrukt mit sich selbst faltet, wodurch vier variable Domänen gegeben sind, oder sich mit anderen einzel- kettigen Fv-Antikörper-Konstrukten zusammenfaltet. In letzterem Fall liegt ein Fv- Antikörper-Konstrukt vor, das 8, 12, 16, etc. variable Domänen aufweist. Günstig ist es, wenn das Fv-Antikörper-Konstrukt vier oder acht variable Domänen aufweist, d.h. es ist bi- oder tetravalent (vgl. Fig. 1). Ferner können die variablen Domänen gleich oder verschieden voneinander sein, wodurch das Antikörper-Konstrukt ein oder mehrere Antigene erkennt. Vorzugsweise erkennt das Antikörper-Konstrukt ein oder zwei Antigene, d.h. es ist mono- bzw. bispezifisch. Beispiele solcher Antigene sind die Proteine CD19 und CD3.
Der Ausdruck "Peptidlinker 1, 3" weist auf einen Peptidlinker hin, der geeignet ist, variable Domänen eines Fv-Antikörper-Konstruktes miteinander zu verbinden. Der Peptidlinker kann jegliche Aminosäuren enthalten, wobei die Aminosäuren Glycin (G), Serin (S) und Prolin (P) bevorzugt sind. Die Peptidlinker 1 und 3 können gleich oder verschieden voneinander sein. Ferner kann der Peptidlinker eine Länge von etwa 0 - 10 Aminosäuren aufweisen. In ersterem Fall ist der Peptidlinker lediglich eine Peptidbindung aus dem COOH-Rest einer der variablen Domänen und dem NH2-Rest einer anderen der variablen Domänen. Vorzugsweise weist der Peptidlinker die Aminosäuresequenz GG auf.
Der Ausdruck "Peptidlinker 2" weist auf einen Peptidlinker hin, der geeignet ist, variable Domänen eines Fv-Antikörper-Konstruktes miteinander zu verbinden. Der Peptidlinker kann jegliche Aminosäuren enthalten, wobei die Aminosäuren Glycin (G), Serin (S) und Prolin (P) bevorzugt sind. Ferner kann der Peptidlinker eine Länge von etwa 3 -10 Aminosäuren, insbesondere 5 Aminosäuren, und ganz besonders die Aminosäuresequenz GGPGS, aufweisen, wodurch erreicht wird, daß sich das einzelkettige Fv-Antikörper-Konstrukt mit anderen einzelkettigen FvAnti- körper-Konstrukten zusammenfaltet. Des weiteren kann der Peptidlinker eine Länge von etwa 11 - 20 Aminosäuren, insbesondere 15 - 20 Aminosäuren, und ganz besonders die Aminosäuresequenz (G4S)4, aufweisen, wodurch erreicht wird, daß sich das einzelkettige Fv-Antikörper-Konstrukt mit sich selbst faltet. Ein erfindungsgemäßes Fv-Antikörper-Konstrukt kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, bei dem für die Peptidlinker 1 , 2 und 3 kodierende DNAs mit für die vier variablen Domänen eines Fv-Antikörper-Kon- struktes kodierenden DNAs ligiert werden derart, daß die Peptidlinker die variablen Domänen miteinander verbinden, und das erhaltene DNA-Molekül in einem Expres- sionsplasmid exprimiert wird. Es wird auf die Beispiele 1 - 6 verwiesen. Hinsichtlich der Ausdrücke "Fv-Antikörper-Konstrukt" und "Peptidlinker" wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Ergänzend wird auf Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, verwiesen.
DNAs, die für ein erfindungsgemäßes Fv-Antikörper-Konstrukt kodieren, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Expressionsplasmide, die solche DNAs enthalten, auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Bevorzugte Expressionsplasmide sind pDISC3x19-LL, pDISC3x19-SL, pPIC-DISC- LL, pPIC-DISC-SL, pDISC5-LL und pDISC6-SL. Die ersteren vier wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellen) am 30. April 1998 unter DSM 12150, DSM 12149, DSM 12152 bzw. DSM 12151 hinterlegt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, umfassend:
(a) ein erfindungsgemäßes Fv-Antikörper-Konstrukt, und/oder
(b) ein erfindungsgemäßes Expressionsplasmid, sowie
(c) übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel und Kontrollen.
Von den einzelnen Komponenten können ein oder mehrere Vertreter vorliegen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein multivalentes Fv-Antikörper-Konstrukt bereit, bei dem die variablen Domänen über Peptidlinker miteinander verbunden sind. Ein solches Antikörper-Konstrukt zeichnet sich dadurch aus, daß es keine Teile enthält, die zu unerwünschten Immunreaktionen führen können. Ferner weist es eine große Stabilität auf. Des weiteren ermöglicht es mehrere Antigene gleichzeitig zu binden. Das erfindungsgemäße Fv-Antikörper-Konstrukt eignet sich daher bestens nicht nur für diagnostische, sondern auch für therapeutische Zwecke verwendet zu werden. Solche Zwecke können hinsichtlich jeder Erkrankung, insbesondere einer viralen, bakteriellen oder Tumor-Erkrankung, gesehen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
Fig. 1 zeigt die genetische Organisation eines erfindungsgemäßen Fv-Antikörper- Konstruktes (A) und Schemata zur Bildung eines bivalenten (B) bzw. tetravalenten Fv-Antikörper-Konstruktes (C). Ag: Antigen; Hisβ: sechs C-terminale Histidinreste; Stop: Stoppcodon (TAA); VH und VL: variable Region der schweren und der leichten Kette.
Fig. 2 zeigt das Schema zur Konstruktion der Plasmide pDISC3x19-LL und pDISC3x19-SL. c-myc: Sequenz, kodierend für ein Epitop, das von dem Antikörper 9E1 erkannt wird, Hisβ: Sequenz, die für sechs C-terminale Histidinreste kodiert; PelB: Signalpeptidsequenz der bakteriellen Pectatlyase (PelB-Leader); rbs: Ribosomenbindungsstelle; Stop: Stoppcodon (TAA); VH und VL: variable Region der schweren und der leichten Kette.
Fig. 3 zeigt ein Diagramm des Expressionsplasmids pDISC3x19-LL. 6xHis: Sequenz, die für sechs C-terminale Histidinreste kodiert; bla: Gen, das für jß- Lactamase kodiert, die für Ampicillinresistenz verantwortlich ist; bp: Basenpaare; c- myc. Sequenz, kodierend für ein Epitop, das von dem Antikörper 9E10 erkannt wird; ColE1 : Origin der DNA-Replikation; f1-IG: intergenische Region des Bakte- riophagen f1 ; Lac P/O: wt /30-Operon-Promotor/Operator; Linker 1 : Sequenz, die für ein GlyGly-Dipeptid kodiert, das die VH- und VL-Domänen verknüpft; Linker 2: Sequenz, die für ein (Gly4Ser)4-Polypeptid kodiert, das die hybriden scFv-Frag- mente verknüpft; Pel-B-Leader: Signalpeptidsequenz der bakteriellen Pectatlyase; rbs: Ribosomenbindungsstelle; VH und VL: variable Region der schweren und der leichten Kette.
Fig. 4 zeigt ein Diagramm des Expressionsplasmids pDISC3x19-SL. 6xHis: Sequenz, die für sechs C-terminale Histidinreste codiert; bla: Gen, das für ß- Lactamase kodiert, die für Ampicillinresistenz verantwortlich ist; bp: Basenpaare; c- myc. Sequenz, kodierend für ein Epitop, das von dem Antikörper 9E10 erkannt wird; ColE1 : Origin der DNA-Replikation; f1-IG: intergenische Region des Bak- teriophagen f1 ; Lac P/O: wt /ac-Operon-Promotor/Operator; Linker 1 : Sequenz, die für ein GlyGly-Dipeptid codiert, das die VH- und VL-Domänen verknüpft; Linker S.¬ Sequenz, die für ein GlyGlyProGlySer-Oligopeptid codiert, das die hybriden scFv- Fragmente verknüpft; Pel-B-Leader: Signalpeptidsequenz der bakteriellen Pectatlyase; rbs: Ribosomenbindungsstelle; VH und VL: variable Region der schweren und der leichten Kette.
Fig. 5 zeigt die Nukleotid- und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des durch das Expressionspiasmid pDIS3x19-LL kodierten bivalenten Fv-Antikörper- Konstruktes. c-/77 t Epitop: Sequenz, kodierend für ein Epitop, das von dem Antikörper 9E10 erkannt wird; CDR: Komplementarität bestimmende Region; Gerüst: Gerüstregion (Framework-Region); His6-Schwanz, Sequenz, die für sechs C-terminale Histidinreste kodiert; PelB-Leader: Signalpeptidsequenz der bakteriellen Pectalyase; RBS: Ribosomenbindungsstelle; VH und VL: variable Region der schweren und der leichten Kette.
Fig. 6 zeigt die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz des durch das Expressionspiasmid pDISC3x19-SL kodierten tetravalenten Fv-Antikörper-Kon- struktes. c-myo-Ep Xop: Sequenz, kodierend für ein Epitop, das von dem Antikörper 9E10 erkannt wird; CDR: Komplementarität bestimmende Region, Gerüst: Gerüstregion (Framework-Region); His6-Schwanz, Sequenz, die für sechs C-terminale Histidinreste kodiert; PelB-Leader: Signalpeptidsequenz der bakteriellen Pectalyase; RBS: Ribosomenbindungsstelle; VH und VL: variable Region der schweren und der leichten Kette.
Fig. 7 zeigt die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer Verbindung zwischen einem Gen, das für eine α-Faktor-Leadersequenz kodiert, und einem Gen, das für das tetravalente Fv-Antikörper-Konstrukt codiert, in dem Pichia- Expressionsplasmid pPIC-DISC-SL. Alpha-Faktor-Signal: Leaderpeptidsequenz des Saccharomyces ce^eiz/s/äs-α-Faktor-Sekretionssignals; VH: variable Region der schweren Kette. Rauten zeigen die Signalspaltstellen an.
Fig. 8 zeigt die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz einer Verbindung zwischen einem Gen, das für eine α-Faktor-Leadersequenz kodiert, und einem Gen, das für das bivalente Fv-Antikörper-Konstrukt codiert, in dem Pichia- Expressionsplasmid pPIC-DISC-LL. Alpha-Faktor-Signal: Leaderpeptidsequenz des Saccharomyces ce eiz/s/äe-α-Faktor-Sekretionssignals; VH: variable Region der schweren Kette. Rauten zeigen die Signalspaltstellen an.
Fig. 9 zeigt ein Diagramm des Expressionsplasmids pDISC5-LL. 6xHis: Sequenz, die für sechs C-terminale Histidinreste kodiert; bla: Gen, das für ß-Lactamase kodiert, die für Ampicillinresistenz verantwortlich ist; bp: Basenpaare; c-myc. Sequenz, kodierend für ein Epitop, das von dem Antikörper 9E10 erkannt wird; hok-sok: Plasmid-stabilisierender DNA-Locus; Lad: Gen, das für den Lac-Re- pressor kodiert; Lac P/O: wt lac-Operon-Promotor/Operator; LacZ': Gen, das für dastf-Peptid von ß-Galactosidase kodiert; Linker 1 : Sequenz, die für ein GlyGly- Dipeptid kodiert, das die VH- und VL-Domänen verknüpft; Linker 2: Sequenz, die für ein (Gly4Ser)4-Polypeptid kodiert, das die hybriden scFv-Fragmente verknüpft; M13 IG: intergenische Region des Bakteriophagen M13; pBR322ori: Ursprung der DNA- Replikation; Pel-B-Leader: Signalpeptidsequenz der bakteriellen Pectatlyase; rbs: Ribosomenbindungsstelle, die von dem E. coli lacZ Gen (lacZ), von dem Bakteriophagen T7 Gen 10 (T7g10) oder von dem E. coli skp Gen (skp) stammt; skp: Gen, das für den bakteriellen periplasmatischen Faktor Skp/OmpH kodiert; tHP: starker Transkriptions-Terminator; tIPP: Transkriptions-Terminator; VH und VL: variable Region der schweren und der leichten Kette.
Fig. 10 zeigt ein Diagramm des Expressionsplasmids pDISC6-SL. 6xHis: Sequenz, die für sechs C-terminale Histidinreste codiert; bla: Gen, das für ß-Lactamase kodiert, die für Ampicillinresistenz verantwortlich ist; bp: Basenpaare; c-myc. Sequenz, kodierend für ein Epitop, das von dem Antikörper 9E10 erkannt wird; hok-sok: Plasmid-stabilisierender DNA-Locus; Lad: Gen, das für den Lac-Re- pressor kodiert; Lac P/O: wt lac-Operon-Promotor/Operator; LacZ': Gen, das für das oc-Peptid von ß-Galactosidase kodiert; Linker 1 : Sequenz, die für ein GlyGly- Dipeptid kodiert, das die VH- und VL-Domänen verknüpft; Linker 3: Sequenz, die für ein GlyGlyProGlySer-Oligopeptid kodiert, das die hybriden scFv-Fragmente verknüpft; M13 IG: intergenische Region des Bakteriophagen M13; pBR322ori: Ursprung der DNA-Replikation; Pel-B-Leader: Signalpeptidsequenz der bakteriellen Pectatlyase; rbs: Ribosomenbindungsstelle, die von dem E. coli lacZ Gen (lacZ), von dem Bakteriophagen T7 Gen 10 (T7g10) oder von dem E. coli skp Gen (skp) stammt; skp: Gen, das für den bakteriellen periplasmatischen Faktor Skp/OmpH kodiert; tHP: starker Transkriptions-Terminator; tIPP: Transkriptions-Terminator; VH und VL: variable Region der schweren und der leichten Kette.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1: Konstruktion der Piasmide pDISC3x19-LL und pDISC3x19-SL zur Expression von bivalenten, bispezifischen bzw. tetravalenten, bispezifischen Fv-Antikörper-Konstrukten in Bakterien
Die Plasmide pHOG-αCD19 und pHOG-dmOKT3, welche für die scFv-Fragmente kodieren, die von dem Hybridom HD37, das für menschliches CD19 (Kipriyanov et al., 1996, J. Immunol. Meth. 196, 51-62) spezifisch ist, bzw. von dem Hybridom OKT3, das für menschliches CD3 (Kipriyanov et al., 1997, Protein Eng. 10, 445- 453) spezifisch ist, abgeleitet sind, wurde zur Konstruktion von Expressions- plasmiden für ein einzelkettiges Fv-Antikörper-Konstrukt verwendet. Ein PCR- Fragment 1 der VH-Domäne von Anti-CD19, gefolgt von einem Segment, das für einen GlyGly-Linker codiert, wurde unter Verwendung der Primer DP1 , 5'-TCA- CACAOA^TICTTAGATCTATTAAAGAGGAGAAATTAACC, und DP2, 5'- AGCACACGATATCACCGCCAAGCTTGGGTGTTGTTTTGGC. erzeugt (vgl. Fig. 2). Das PCR-Fragment 1 wurde mit Eco \ und EcorN gespalten und mit dem mit EcoRl/EcoRV linearisierten Plasmid pHOG-dmOKT3 ligiert, wodurch der Vektor ρHOG19-3 erzeugt wurde. Das PCR-Fragment 2 der VL-Domäne von Anti-CD19, gefolgt von einem Segment, das für ein c-myc-Ep'ftop und einen Hexahistidinyl- schwanz codiert, wurde unter Verwendung der Primer DP3, 5'-AGCACA- CAAGC IGGCGGTGATATCTTGCTCACCCAAACTCCA, und DP4, 5'-AGCA- CACTCTAGAGACACACAGATCTTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGAGTTTAGG, erzeugt. Das PCR-Fragment 2 wurde mit H/ndll und Xbä gespalten und mit dem durch HindWjXbä linearisierten Plasmid pHOG-dmOKT3 ligiert, wodurch der Vektor pHOG3-19 erhalten wurde (vgl. Fig. 2). Das für das hybride scFv-3-19 codierende Gen in dem Plasmid pHOG3-19 wurde mittels PCR mit den Primern Bi3sk, 5'- CAGCCGGCCATGGCGCAGGTGCAACTGCAGCAG und entweder Li-1 , 5'-TATA- T A C T G C A G C T G C A C C T G G C T A C C A C C A C - CACCGGAGCCGCCACCACCGCTACCACCGCCGCCAGAACCACCACCACC- AGCGGCCGCAGCATCAGCCCG, zur Erzeugung eines langen flexiblen (Gly4Ser)4- inter-scFv-Linkers (PCR-Fragment 3, vgl. Fig. 2) oder Li-2, 5'-TATA- TACTGCAGCJGCACCTGCGACCCTGGGCCACCAGCGGCCGCAGCATCAGCCCG, zur Erzeugung eines kurzen, starren GGPGS-Linkers (PCR-Fragment 4, vgl. Fig. 2) amplifiziert. Die Expressionsplasmide pDISC3x19-LL und pDISC3x19-SL wurden durch Ligierung des Λ/cd/ Vdl-Restriktionsfragments aus pHOG19-3, umfassend das Vektorgerüst und die
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PCR-Fragmente 3 bzw. 4 konstruiert (vgl. Fig. 3, 4). Die vollständige Nukleotid- und Proteinsequenzen der bivalenten bzw. tetravalenten Fv-Antikörper-Konstrukte sind in den Figuren 5 bzw. 6 angegeben.
Beispiel 2: Konstruktion der Plasmide pPIC-DISC-LL und pPIC-DISC-SL zur Expression von bivalenten, bispezifischen bzw. tetravalenten, bispezifischen Fv-Antikörper-Konstrukten in Hefe
(A) Konstruktion von pPIC-DISC-SL
Der Vektor pPICZαA (Invitrogen BV, Leek, Niederlande) zur Expression und Sekretion von rekombinanten Proteinen in der Hefe Pichia pastoris wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Er enthält ein Gen, das für das Saccharomyces cerevi- s/äeα-Faktor-Sekretionssignal codiert, gefolgt von einem Polylinker. Die Sekretion dieses Vektors beruht auf dem dominanten selektierbaren Marker, Zeocin™, der sowohl in Pichia als auch in E coli bifunktionell ist. Das Gen, das für das tetravalente Fv-Antikörper-Konstrukt (scDia-SL) codiert, wurde mittels PCR von der Matrize pDISC3x19-SL unter Verwendung der Primer 5-PIC, 5'-CCGTGAAT- ICCAGGTGCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGC, und pSEXBn 5'-GGTC- GACGTTAACCGACAAACAACAGATAAAACG amplifiziert. Das so erhaltene PCR- Produkt wurde mit EcoR\ und Xbä gespalten und in mit EcoRl/Xbä linearisiertes pPICZαA ligiert. Es wurde das Expressionspiasmid pPIC-DISC-SL erhalten. Die Nukleotid- und Proteinsequenzen des tetravalenten Fv-Antikörper-Konstruktes sind in Fig. 7 gezeigt.
(B) Konstruktion von pPIC-DISC-LL
Die Konstruktion von pPIC-DISC-LL wurde auf der Grundlage von pPICZσA (Invitrogen BV, Leek, Niederlande) und pDISC3x19-LL (vgl. Fig. 3) durchgeführt. Die Plasmid-DNA pPICZαA wurde mit EcoRl gespalten. Die überstehenden 5'- Enden wurden unter Verwendung eines Klenow-Fragments der E cσ/ÄDNA-Poly- merase I aufgefüllt. Die so erhaltene DNA wurde mit Xbä gespalten, und das große Fragment, umfassend den pPIC-Vektor, wurde isoliert. Analog wurde die DNA von pDISC3x19-LL mit Ncά gespalten und mit einem Klenow-Fragment behandelt. Nach der Spaltung mit Xbä wurde ein kleines Fragment, umfassend ein für den bivalenten Fv-Antikörper kodierendes Gen, isoliert. Dessen Ligierung mit einer pPIC-abgeleiteten Vektor-DNA ergab das Plasmid pPIC-DISC-LL. Die Nukleotid- und Proteinsequenz des bivalenten Fv-Antikörper-Konstruktes sind in Fig. 8 gezeigt.
Beispiel 3: Expression des tetravalenten bzw. bivalenten Fv-Antikörper-Kon- struktes in Bakterien
£ co/ÄXL1-Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA), die mit den Expressions- plasmiden pDISC3x19-LL bzw. pDISC3x19-SL transformiert worden waren, wurden über Nacht in 2xYT-Medium mit 50 μg/ml Ampicillin und 100 mM Glucose (2xYTGa) bei 37°C gezüchtet. 1 :50-Verdünnungen der Übernachtkulturen in 2XYTQA wurden als Kolbenkulturen bei 37°C unter Schütteln mit 200 UpM gezüchtet. Als die Kulturen einen ODβ00-Wert von 0,8 erreicht hatten, wurden die Bakterien durch 10minütige Zentrifugation mit 1500 g bei 20°C pelletiert und in dem gleichen Volumen eines frischen 2xYT-Mediums, das 50 μg/ml Ampicillin und 0,4 M Saccharose enthielt, resuspendiert. IPTG wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugesetzt, und das Wachstum wurde bei Raumtemperatur (20-22°C) 18-20 h fortgesetzt. Die Zellen wurden durch 10minütige Zentrifugation mit 5000 g bei 4°C geerntet. Der Kulturüberstand wurde zurückgehalten und auf Eis gelagert. Um die löslichen periplasmatischen Proteine zu isolieren, wurden die pelletierten Bakterien in 5% des Anfangsvolumens an eiskalter 50 mM Tris-HCI, 20% Saccharose, 1 mM EDTA, pH 8,0, resuspendiert. Nach einer 1 stündigen Inkubation auf Eis unter gelegentlichem Rühren wurden die Sphäroplasten mit 30.000 g 30 min bei 4°C zentrifugiert, wobei der lösliche periplasmatische Extrakt als Überstand und die Sphäroplasten mit dem unlöslichen periplasmatischen Material als Pellet erhalten wurden. Der Kulturüberstand und der lösliche periplasmatische Extrakt wurden vereinigt, durch weitere Zentrifugation (30.000 g, 4°C, 40 min) geklärt. Das rekombinante Produkt wurde durch Ammoniumsulfatfällung (Endkonzentration 70% Sättigung) eingeengt. Das Proteinpräzipitat wurde durch Zentrifugation (10.000 g, 4°C, 40 min) gewonnen und in 10% des Anfangsvolumens an 50 mM Tris-HCI, 1 M NaCI, pH 7,0, aufgelöst. Eine immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) wurde bei 4°C unter Verwendung einer 5 ml Säule an chelatierender Sepharose (Pharmacia), die mit Cu2+ beladen war und mit 50 mM Tris-HCI, 1 M NaCI, pH 7,0 (Startpuffer) equilibriert worden war, durchgeführt. Die Probe wurde durch ihr Leiten über die Säule aufgeladen. Sie wurde dann mit zwanzig Säulenvolumina Startpuffer, gefolgt von Startpuffer mit 50 mM Imidazol, bis die Absorption bei 280 nm des Effluenten minimal war, gewaschen (etwa dreißig Säulenvolumina). Das absorbierte Material wurde mit 50 mM Tris-HCI, 1 M NaCI, 250 mM Imidazol, pH 7,0, eluiert.
Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bradford-Farbstoffbindungstest (1976, Anal. Biochem., 72, 248-254) unter Verwendung des Bio-Rad(München, Deutschland)-Proteinassaykits bestimmt. Die Konzentrationen der gereinigten tetravalenten bzw. bivalenten Fv-Antikörper-Konstrukte wurden aus den A280-Werten unter Verwendung der Extinktionskoeffizienten e1"^"11 = 1 ,96 bzw. 1 ,93 bestimmt.
Beispiel 4: Expression des tetravalenten bzw. bivalenten Antikörper- Konstruktes in der Hefe Pichia pasto s
Kompetente P. yσ<3sΛ?/7i?GS155-Zellen (Invitrogen) wurden in Gegenwart von 10 μg Plasmid-DNA von pPIC-DISC-LL bzw. pPIC-DISC-SL, die mit Saά iinearisiert worden war, elektroporiert. Die Transformanten wurden 3 Tage bei 30°C auf YPD- Platten, die 100 μg/ml Zeocin™ enthielten, selektiert. Die Klone, die bivalente bzw. tetravalente Fv-Antikörper-Konstrukte sezernierten, wurden durch Plattenscreening unter Verwendung eines anti-c-/77 c-mAk 9E10 (IC Chemikalien, Ismaning, Deutschland) selektiert.
Zur Expression der bivalenten bzw. tetravalenten Fv-Antikörper-Konstrukte wurden die Klone in YPD-Medium in Schüttelkolben 2 Tage bei 30°C unter Rühren gezüchtet. Die Zellen wurden zentrifugiert, in dem gleichen Volumen des Mediums, das Methanol enthielt, resuspendiert und weitere 3 Tage bei 30°C unter Rühren inkubiert. Die Überstände wurden nach der Zentrifugation gewonnen. Das rekombi- nante Produkt wurde durch Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von IMAC, wie vorstehend beschrieben, isoliert.
Beispiel 5: Charakterisierung des tetravalenten bzw. bivalenten Fv- Antikörper-Konstruktes
(A) Größenausschlußchromatographie
Eine analytische Gelfiltration der Fv-Antikörper-Konstrukte wurde in PBS unter Verwendung einer Superdex-200-HR10/30-Säule (Pharmacia) durchgeführt. Das Probenvolumen und die Fließgeschwindigkeit betrugen 200μl/min bzw. 0,5 ml/min. Die Säule wurde mit hoch- und niedermolekularen Gelfiltrations-Kalibrationskits (Pharmacia) kalibriert.
(B) Durchflußzytometrie
Die menschliche CD3+/CD19"-akute-T-Zell-Leukämielinie Jurkat und die CD19+/- CD3"-B-Zellinie JOK-1 wurden für die Durchflußzytometrie verwendet. 5 x 105 Zellen in 50 μl RPMI 1640-Medium (GIBCO BRL, Eggestein, Deutschland), das mit 10% FCS und 0,1% Natriumazid supplementiert war (als vollständiges Medium bezeichnet), wurden mit 100 μl der Fv-Antikörper-Präparate 45 min auf Eis inkubiert. Nach Waschen mit dem vollständigen Medium wurden die Zellen mit 100 μl 10 μg/ml anti-c-/77j c-Mak 9E10 (IC Chemikalien) in dem gleichen Puffer 45 min auf Eis inkubiert. Nach einem zweiten Waschzyklus wurden die Zellen mit 100 μl des FITC- markierten Ziege-anti-Maus-IgG (GIBCO BRL) unter den gleichen Bedingungen wie vorher inkubiert. Die Zellen wurden dann erneut gewaschen und in 100 μl 1 μg/ml- Propidiumiodid-Lösung (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) in vollständigem Medium unter Ausschluß von toten Zellen resuspendiert. Die relative Fluoreszens der gefärbten Zellen wurde unter Verwendung eines FACScan-Durchflußzytometers (Becton Dickinson, Mountain View, CA) gemessen.
(C) Cytotoxizitätstest
Die CD19-exprimierende Burkitt-Lymphoma-Zellinie Raji und Namalwa wurden als Zielzellen verwendet. Die Zellen wurden in RPMI 1640 (GIBCO BRL), das mit 10% hitzeinaktiviertem FCS (GIBCO BRL), 2 mM Glutamin und 1 mM Pyruvat supplementiert war, bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 7,5% C02 inkubiert. Die cytotoxischen T-Zell-Tests wurden in RPMI-1640-Medium, das mit 10% FCS, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat und 0,05 mM 2-ME supplementiert war, durchgeführt. Die cytotoxische Aktivität wurde unter Verwendung eines Standard [51Cr]-Freisetzungstests bewertet; 2 x 10β Zielzellen wurden mit 200 μCi Na[51Cr]O4 (Amersham-Buchler, Braunschweig, Deutschland) markiert und 4mal gewaschen und anschließend in Medium in einer Konzentration von 2 x 105/ml resuspendiert. Die Effektorzellen wurden auf eine Konzentration von 5 x 106/ml eingestellt. Zunehmende Mengen an CTLs in 100 μl wurden auf 104 Zielzellen/Vertiefung in 50 μl titriert. 50 μl Antikörper wurden jeder Vertiefung zugesetzt. Der gesamte Test wurde dreifach angesetzt und 4 h bei 37°C inkubiert. 100 μl des Überstands wurden gewonnen und auf [51Cr]-Freisetzung in einem gamma-Zähler (Cobra Auto Gamma; Canberra Packard, Dreieich, Deutschland) getestet. Die maximale Freisetzung wurde durch Inkubation der Zielzellen in 10% SDS bestimmt, und die spontane Freisetzung wurde durch Inkubation der Zellen in Medium allein bestimmt. Die spezifische Lyse (%) wurde berechnet als: (experimentelle Freisetzung - spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung - spontane Freisetzung) x 100.
Beispiel 6: Konstruktion der Plasmide pDISC5-LL und pDISC6-SL zur Expression von bivalenten, bispezifischen bzw. tetravalenten, bispezifischen Fv-Antikörper-Konstrukten in Bakterien durch Hoch-Zelldichte-Fermentation
Es wurden Expressionsvektoren hergestellt, die das hok/sok Plasmid-freie Zell- "suicide"-System und ein Gen enthielten, das für den Skp/OmpH periplasmatischen Faktor für eine größere Herstellung rekombinanter Antikörper kodiert. Das skp Gen wurde durch PCR mittels der Primer skp-1 , 5'-CGA ATT CTT AAG ATA AGA AGG AGT TTA TTG TGA AAA AGT GGT TAT TAG CTG CAG G und skp-2, 5'-CGA ATT AAG CTT CAT TAT TTA ACC TGT TTC AGT ACG TCG G unter Verwendung des Plasmids pGAH317 (Holck and Kleppe, 1988, Gene 67, 117-124) amplifiziert. Das erhaltene PCR-Fragment wurde mit Aflll und Hindlll gespalten und in das mit Aflll/Hindlll linearisierte Plasmid pHKK (Hörn et al., 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 524-532) inseriert, wodurch der Vektor pSKK erhalten wurde. Die in den Plasmiden pDISC3x19-LL und ρDISC3x19-SL enthaltenen und für die scFv- Antikörper-Konstrukte kodierenden Gene wurden durch PCR mittels der Primer fe- 1 , 5'-CGA ATT TCT AGA TAA GAA GGA GAA ATT AAC CAT GAA ATA CC und fe-
2, 5'-CGA ATT CTT AAG CTA TTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG TGA G amplifiziert. Die Xbal/Aflll gespaltenen PCR-Fragmente wurden in pSKK vor dem skp Insert inseriert, wodurch die Expressionsplasmide pDISC5-LL bzw. pDISC6-SL erhalten wurden, die tri-cistronische Operons unter der Kontrolle des lac Promotor/Operator-Systems enthalten (vgl. Fig. 9, 10).
K 2675
Patentansprüche
1. Multivalentes Fv-Antikörper-Konstrukt mit mindestens vier variablen Domänen, die über die Peptidlinker 1 , 2 und 3 miteinander verbunden sind.
2. Fv-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 1 , wobei die Peptidlinker 1 und 3 0 - 10 Aminosäuren aufweisen.
3. Fv-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 2, wobei die Peptidlinker 1 und 3 die Aminosäuresequenz GG aufweisen.
4. Fv-Antikörper-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Fv-Anti- körper-Konstrukt bivalent ist.
5. Fv-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 4, wobei der Peptidlinker 2 11-20 Aminosäuren aufweist.
6. Fv-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 4 oder 5, wobei der Peptidlinker 2 die Aminosäuresequenz (G4S)4 aufweist.
7. Fv-Antikörper-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Fv-Anti- körper-Konstrukt tetravalent ist.
8. Fv-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 7, wobei der Peptidlinker 2 3-10 Aminosäuren aufweist.
9. Fv-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Peptidlinker 2 die Aminosäuresequenz GGPGS aufweist. 10. Fv-Antikörper-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-9, wobei das Fv-Anti- körper-Konstrukt multispezifisch ist.
11. Fv-Antikörper-Koπstrukt nach Anspruch 10, wobei das Fv-Antikörper- Konstrukt bispezifisch ist.
12. Fv-Antikörper-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-9, wobei das Fv- Antikörper-Konstrukt monospezifisch ist.
13. Verfahren zur Herstellung des multivalenten Fv-Antikörper-Konstruktes nach einem der Ansprüche 1-12, wobei für die Peptidlinker 1 , 2 und 3 kodierende DNAs mit für die vier variablen Domänen eines Fv-Antikörper-Konstruktes kodierenden DNAs ligiert werden derart, daß die Peptidlinker die variablen Domänen miteinander verbinden, und das erhaltene DNA-Molekül in einem Expressionspiasmid exprimiert wird.
14. Expressionspiasmid, kodierend für das multivalente Fv-Antikörper-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-12.
15. Expressionspiasmid nach Anspruch 14, nämlich pDISC3x19-LL.
16. Expressionspiasmid nach Anspruch 14, nämlich pDISC3x19-SL.
17. Expressionspiasmid nach Anspruch 14, nämlich pPIC-DISC-LL.
18. Expressionspiasmid nach Anspruch 14, nämlich pPIC-DISC-SL.
19. Expressionspiasmid nach Anspruch 14, nämlich pDISC5-LL.
20. Expressionspiasmid nach Anspruch 14, nämlich pDISC6-SL. 21. Verwendung des multivalenten Fv-Antikörper-Konstruktes nach einem der Ansprüche 1-12 zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen.
22. Verwendung nach Anspruch 21 , wobei die Erkrankungen virale, bakterielle oder Tumor-Erkrankungen sind.
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