WO1999041407A1 - Method for developing a pharmaceutical active ingredient - Google Patents

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WO1999041407A1
WO1999041407A1 PCT/EP1999/000876 EP9900876W WO9941407A1 WO 1999041407 A1 WO1999041407 A1 WO 1999041407A1 EP 9900876 W EP9900876 W EP 9900876W WO 9941407 A1 WO9941407 A1 WO 9941407A1
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Christof Antz
J. Peter Ruppersberg
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Otogene Aktiengesellschaft
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Abstract

The invention relates to a method for developing an active ingredient capable of directly or indirectly influencing, preferably in an intracellular manner, the function of physiologically active peptides or proteins. The influence on the function of the peptides or proteins preferably takes the form of an inhibition of said function. According to the method, first a target peptide or target protein which is able to or does physiologically participate in a peptide-peptide or protein-protein interaction is identified and selected. Usually only the identification or selection or one or more fragments of said peptide or protein is necessary. Secondly an amino acid sequence is derived or screened which interacts with the target peptide or target protein or with fragments thereof with high affinity. The derived amino acid sequence interacts with the target peptide preferably at least as well as and especially better than with its physiological interaction partner.

Description

Beschreibung description
Verfahren zur Entwickluncf eines pharmazeutischen. WirkstoffesProcess for the development of a pharmaceutical. Active ingredient
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entwicklung eines Wirkstoffes, der, vorzugsweise intrazellulär, direkt oder indirekt zur Beeinflussung der Funktion von physiologisch aktiven Peptiden oder Proteinen in der Lage ist. Dabei sollen die entwickelten Wirkstoffe insbesondere mit Hilfe der sogenannten Gentherapie anwendbar sein, und die Beeinflussung der Funktion der Peptide/Proteine soll vorzugsweise in einer Inhibition dieser Funktion liegen.The invention relates to a method for the development of an active substance which, preferably intracellularly, is able, directly or indirectly, to influence the function of physiologically active peptides or proteins. The active substances developed should be applicable in particular with the aid of so-called gene therapy, and the function of the peptides / proteins should preferably be inhibited by this function.
Zur gentherapeutischen Inhibition von Genprodukten oder der Expression dieser Genprodukte wurden bisher im wesentlichen zwei verschiedene Wege eingeschlagen. Zum einen wurde versucht, die Inhibition durch kurze Antisense-Oligonukleotide zu bewirken, die in eine Zelle eingeschleust werden, um die sogenannte Messenger-RNA (mRNA) eines bestimmten Gens zu inhibieren. Dieses Konzept hat den Nachteil, daß einerseits eine hohe Konzentration der Oligonukleotide von den Zellen aufgenommen werden muß und andererseits trotzdem meist keine vollständige Inhibition des fraglichen Gens erreicht wird. Der andere vorgeschlagene Weg besteht darin, sogenannte Antisense-Gene, die in virale Vektoren verpackt sind, in die Zelle einzubringen. Diese Antisense-Gene führen zu einer Transkription von Antisense-RNA, welche dann ihrerseits das zu beeinflussende Gen inhibiert. Dieses zweite Konzept hat zwar unter Umständen den Vorteil einer hohen Effektivität, es läßt aber vor allem bei lokaler Applikation eine nicht kontrollierbare Ausbreitung des Vektors befürchten. Weiter sind sogenannte Peptidbibliotheken bekannt, in denen eine sehr große Anzahl, beispielsweise > 108 Rekombinante enthalten sind. Es bedarf jedoch sinnvoller Strategien, aus solchen Bibliotheken ein oder mehrere Peptide bzw. deren kodierende Nukleinsäuresequenzen auszuwählen. Grundsätzlich bereits bekannte Screening-Verfahren, die sich beispielsweise des sogenannten Yeast-Two-Hybrid-Systems bedienen, lassen sich nämlich vernünftigerweise nur einsetzen, wenn eine gewisse Vorauswahl über die Aminosäuresequenz getroffen ist. Bei üblicherweise 20 verwendbaren Aminosäuren entspricht die Variabilität bei einer Kettenlänge n der Sequenz einem Wert von 20n Möglichkeiten. In diesem Zusammenhang sei noch erwähnt, daß in neuerer Zeit Proteine auch durch Computersimulation (Computer-Molecular-Modelling) entworfen werden. Bei allen Vorgehensweisen kann die endgültige Strukturanalyse einer Peptid-Peptid-Wechselwirkung oder Protein-Protein- Wechselwirkung beispielsweise durch kernmagnetische Resonanz- Spektroskopie (NMR) durchgeführt werden.So far, essentially two different approaches have been taken for gene therapy inhibition of gene products or the expression of these gene products. On the one hand, attempts have been made to effect the inhibition by means of short antisense oligonucleotides which are introduced into a cell in order to inhibit the so-called messenger RNA (mRNA) of a specific gene. This concept has the disadvantage that, on the one hand, a high concentration of the oligonucleotides has to be taken up by the cells and, on the other hand, a complete inhibition of the gene in question is usually not achieved. The other proposed way is to introduce so-called antisense genes, which are packaged in viral vectors, into the cell. These antisense genes lead to transcription of antisense RNA, which in turn inhibits the gene to be influenced. This second concept may have the advantage of being highly effective, but it is unlikely that the vector will spread, especially when applied locally. So-called peptide libraries are also known which contain a very large number, for example> 10 8 recombinants. However, useful strategies are required to select one or more peptides or their coding nucleic acid sequences from such libraries. Basically already known screening methods, which use the so-called yeast two hybrid system, for example, can only reasonably be used if a certain preselection has been made via the amino acid sequence. With usually 20 usable amino acids, the variability with a chain length n of the sequence corresponds to a value of 20 n possibilities. In this context, it should also be mentioned that, more recently, proteins have also been designed by computer simulation (computer molecular modeling). In all procedures, the final structural analysis of a peptide-peptide interaction or protein-protein interaction can be carried out, for example, by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR).
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, die Nachteile des bisherigen Standes der Technik zu vermeiden. Es soll ein Verfahren zur Entwicklung eines oben definierten Wirkstoffs zur Verfügung gestellt werden, bei dem unter systematischer Anwendung bestimmter Verfahrensschritte eine optimierte Aminosäuresequenz mit vergleichsweise geringerem Aufwand erhalten wird. Diese Aminosäuresequenz bzw. der aus ihr resultierende Wirkstoff soll vorzugsweise zur Inhibition von physiologisch aktiven Peptiden/Proteinen geeignet sein. Weiter ist es das Ziel der Erfindung, die Beeinflussung, insbesondere Inhibition, der Funktion solcher Peptide/Proteine auf gentherapeutischem Wege zu erreichen. In diesem Zusammenhang soll eine möglichst einfache Applikation des Wirkstoffs bei gleichzeitig hoher Effektivität erreicht werden. Die nach dem Verfahren erhaltene Aminosäuresequenz soll dabei an dem physiologisch aktiven Zielpeptid/-protein vorzugsweise mindestens genauso gut wirken, wie dessen physiologischer Wechselwirkungspartner .The object of the invention is to avoid the disadvantages of the prior art. The aim is to provide a process for developing an active substance defined above, in which an optimized amino acid sequence is obtained with comparatively less effort using systematic use of certain process steps. This amino acid sequence or the active ingredient resulting from it should preferably be suitable for inhibiting physiologically active peptides / proteins. Furthermore, it is the aim of the invention to influence, in particular inhibit, the function of such peptides / proteins by gene therapy. In this context, the simplest possible application of the active ingredient with high effectiveness is to be achieved. The amino acid sequence obtained by the method should act on the physiologically active target peptide / protein preferably at least as well as its physiological interaction partner.
Die geschilderten Aufgaben werden gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 16 dargestellt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.The described objects are achieved by the method having the features of claim 1. Preferred embodiments are presented in the dependent claims 2 to 16. The wording of all claims is hereby incorporated by reference into the content of this description.
Das eingangs genannte Verfahren ist erfindungsgemäß im wesentlichen durch zwei Verfahrensschritte gekennzeichnet. Zum einen wird ein Zielpeptid oder Zielprotein, das physiologisch an einer Peptid-Peptid- bzw. Protein-Protein-Wechsel- Wirkung teilnimmt oder teilnehmen kann, identifiziert und ausgewählt. Bevorzugt wird dabei nur einer oder mehrere Teilabschnitte dieses Peptids/Proteins identifiziert oder ausgewählt, wobei an diesem Teilabschnitt oder diesen Teilabschnitten dann die entsprechenden Wechselwirkungen statt- finden. Zum anderen wird eine Aminosäuresequenz abgeleitet bzw. gescreent, die mit dem Zielpeptid/Zielprotein bzw. dessen Teilabschnitt oder Teilabschnitten mit hoher Affinität wechselwirkt. Diese Wechselwirkung ist vorzugsweise mindestens genauso gut, insbesondere besser als diejenige des Zielpeptids/ Zielproteins/Teilabschnitts mit seinem physiologischen Wechselwirkungspartner.The method mentioned at the outset is essentially characterized by two method steps. On the one hand, a target peptide or protein that physiologically participates or can participate in a peptide-peptide or protein-protein interaction is identified and selected. Preferably, only one or more sections of this peptide / protein are identified or selected, the corresponding interactions then taking place on this section or these sections. On the other hand, an amino acid sequence is derived or screened, which interacts with the target peptide / target protein or its section or sections with high affinity. This interaction is preferably at least as good, in particular better than that of the target peptide / target protein / section with its physiological interaction partner.
Die Ableitung der Aminosäuresequenz umfaßt vorzugsweise die Auswahl mindestens einer Startstruktur einer Aminosäure- sequenz, wobei diese Auswahl vorzugsweise zu Beginn desThe derivation of the amino acid sequence preferably comprises the selection of at least one starting structure of an amino acid sequence, this selection preferably at the beginning of the
Verfahrens oder zu Beginn eines Verfahrensdurchlaufes getroffen wird. Dies hat den Vorteil, daß nicht von einer willkürlichen Aminosäuresequenz ausgegangen werden muß. Bei der Startstruktur kann es sich insbesondere um die Aminosauresequenz eines physiologischen Wechselwirkungspartners des Zielpeptids/Zielproteins bzw. eines seiner Teilabschnitte oder um eine mit Hilfe von Molecular Modelling hergeleitete Aminosauresequenz handeln. Wenn die, Ableitung der Aminosäuresequenz in mehreren Verfahrensdurchläufen erfolgt, ist die Auswahl einer der beiden auf den genannten Wegen ermittelten Startstrukturen insbesondere beim ersten Verfahrensdurchlauf angebracht. Als Startstruktur für die weiteren Verfahrensdurchläufe können dann in diesen Fällen die aus dem jeweils vorhergehenden Verfahrensdurchlauf hervorgehenden (teiloptimierten) Aminosäuresequenzen eingesetzt werden.Procedure or at the beginning of a process run. This has the advantage that an arbitrary amino acid sequence does not have to be assumed. The starting structure can be, in particular, the amino acid sequence of a physiological interaction partner of the target peptide / target protein or one of its subsections or an amino acid sequence derived with the aid of molecular modeling. If the derivation of the amino acid sequence takes place in several process runs, the selection of one of the two start structures determined in the above-mentioned ways is particularly appropriate during the first process run. In these cases, the (partially optimized) amino acid sequences resulting from the previous process run can then be used as the starting structure for the further process runs.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß auf Basis der Startstruktur (en) eine Anzahl degenerierter Nukleinsäuresequenzen bestimmt und ausgewählt werden. Diese kodieren für die entsprechenden Variationen der als Startstruktur ausgewählten Aminosäuresequenz . Durch diese Vorgehensweise wird eine zumindest überschaubare Anzahl an Sequenzen vorgelegt, deren Untersuchung mit Hilfe eines Screening-Verfahrens praktisch möglich ist. Durch die Vorgabe der Startstruktur wird erreicht, daß die Nukleinsäuresequenz nicht vollständig degeneriert werden muß, sondern zumindest in Grenzen geplant werden kann. Die eingangs genannte Variabilität kann damit deutlich reduziert werden. Dabei wird man im Normalfall bei Auswahl der Aminosäuresequenz eines bekannten physiologischen Wechselwirkungspartners als Startstruktur mit niedriger Variabilität auskommen können als im Falle einer aus einem Molecular Modelling hervorgegangenen Aminosäuresequenz als Startstruktur.The method according to the invention is further characterized in that a number of degenerate nucleic acid sequences are determined and selected on the basis of the starting structure (s). These code for the corresponding variations of the amino acid sequence selected as the starting structure. This procedure provides an at least manageable number of sequences, the examination of which is practically possible with the aid of a screening method. By specifying the starting structure it is achieved that the nucleic acid sequence does not have to be completely degenerate, but can at least be planned within limits. The variability mentioned at the outset can thus be significantly reduced. Normally, selecting the amino acid sequence of a known physiological interaction partner as starting structure with low variability will be sufficient as in the case of an amino acid sequence resulting from molecular modeling as starting structure.
Die erhaltene degenerierte Nukleinsäuresequenz (ggf. auch mehrere) wird anschließend vorzugsweise einem bekannten Screening-Verfahren unterworfen, mit dessen Hilfe die Wechselwirkung zwischen Zielpeptid/ Zielprotein/Teilabschnitt und den Aminosäuresequenzen, die der einzelnen degenerierten Nukleinsäuresequenz entsprechen, bestimmbar ist. Aufgrund dieses Screening-Schritts wird eine bestimmte Anzahl anThe degenerate nucleic acid sequence obtained (possibly also several) is then preferably a known one Subject to screening methods with the aid of which the interaction between target peptide / target protein / partial section and the amino acid sequences which correspond to the individual degenerate nucleic acid sequence can be determined. Because of this screening step, a certain number will appear
Aminosäuresequenzen bzw. deren Nukleinsäuresequenzen ausgewählt, bei denen diese Wechselwirkung am stärksten bzw. besten ist.Amino acid sequences or their nucleic acid sequences selected in which this interaction is strongest or best.
Die verschiedenen grundsätzlich verwendbaren Screening- Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere ist hier die sogenannte Yeast-Two-Hybrid-Methode zu nennen, die in den letzten Jahren große Bedeutung erlangt hat. Als Literatur sei hier auf die Veröffentlichung von Fields et al., Nature 340, 245-247 (1989) verwiesen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Abwandlung dieser Methode, die unter dem Stichwort FRET- Yeast-Two-Hybrid-Methode zu nennen ist. Die wesentlichen Merkmale dieses Verfahrens werden im Zusammenhang mit dem Beispiel noch erläutert.The various screening methods that can be used in principle are known to the person skilled in the art. In particular, the so-called Yeast Two Hybrid method should be mentioned here, which has gained great importance in recent years. As literature, reference is made here to the publication by Fields et al., Nature 340, 245-247 (1989). According to the invention, a modification of this method is preferred, which is to be mentioned under the keyword FRET-Yeast-Two-Hybrid-Method. The essential features of this method are explained in connection with the example.
Die Nukleinsäuresequenzen, die die beste Wechselwirkung zeigen und dementsprechend ausgewählt wurden, d.h. bei einem üblichen Screening-Verfahren die entsprechenden Hefezellen, werden, üblicherweise nach einer Klonierung, sequenziert. Diese Sequenzierung ergibt dann zwangsläufig die zugehörigen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise werden die so erhaltenen Sequenzen untereinander und ggf. auch mit bereits vorhandenen Sequenzen verglichen, um Ähnlichkeiten oder gemeinsame Strukturmotive zu erhalten, die für eine mögliche weitere Optimierung der Aminosäuresequenz nützlich sein können.The nucleic acid sequences that show the best interaction and have been selected accordingly, i.e. in a conventional screening method, the corresponding yeast cells are usually sequenced after cloning. This sequencing then necessarily results in the associated amino acid sequences. The sequences obtained in this way are preferably compared with one another and possibly also with existing sequences in order to obtain similarities or common structural motifs that can be useful for a possible further optimization of the amino acid sequence.
Zu den ausgewählten sequenzierten Nukleinsäuremolekülen werden dann durch übliche Verfahren die zugehörigen Amino- säuresequenzen/Peptide/Proteine synthetisiert. Die Peptide können auch in Zellen quantitativ exprimiert werden. Von den so erhaltenen Aminosäuresequenzen wird dann die exakte Wechselwirkungsstruktur mit Hife von NMR-Spektroskopie bestimmt. Wie bereits ausgeführt, bildet sich diese Wechsel- Wirkungsstruktur zwischen Zielpeptid/Zielprotein/Teilabschnitt und der synthetisierten Aminosäuresequenz aus. Zur besseren Vergleichbarkeit der Ergebnisse kann für diesen oder einen anderen Verfahrensschritt einer oder mehrere der Teilabschnitte des Zielpeptids/Zielproteins ebenfalls synthe- tisch hergestellt werden.The associated amino acid sequences / peptides / proteins are then synthesized for the selected sequenced nucleic acid molecules by customary methods. The peptides can also be expressed quantitatively in cells. The exact interaction structure of the amino acid sequences obtained in this way is then determined using NMR spectroscopy. As already stated, this interaction structure is formed between the target peptide / target protein / partial section and the synthesized amino acid sequence. For better comparability of the results, one or more of the partial sections of the target peptide / target protein can also be produced synthetically for this or another process step.
In Weiterbildung kann das Gesamtverfahren, insbesondere jedoch die Ableitung der Aminosäuresequenz bzw. deren einzelne Verfahrensschritte mindestens zweimal, vorzugsweise mehrfach, durchgeführt werden. Wie bereits dargestellt, kann die gesuchte Aminosäuresequenz dabei schrittweise optimiert werden, bis entweder eine hinreichend hohe Affinität oder sogar eine bessere Affinität als diejenige des phyisiologi- schen Wechselwirkungspartners erreicht ist. Dem Nutzer des Verfahrens ist dabei freigestellt, die Verfahrensdurchläufe nach eigener Wahl zu einem bestimmten Zeitpunkt, d.h. bei einem bestimmten Optimierungsgrad der Aminosäuresequenz abzubrechen. In diesem Zusammenhang wird es sich anbieten, die aufgeführten Verfahrensschritte bei der Ableitung der Aminosäuresequenz zwischen drei- und zwanzigmal, vorzugsweise zwischen drei- und zehnmal, durchzuführen, bis eine Aminosäuresequenz ausreichender Affinität erhalten wird.In a further development, the overall process, but in particular the derivation of the amino acid sequence or its individual process steps, can be carried out at least twice, preferably several times. As already shown, the amino acid sequence sought can be gradually optimized until either a sufficiently high affinity or even a better affinity than that of the physiological interaction partner is reached. The user of the process is free to choose the process runs at a specific time, i.e. terminate at a certain degree of optimization of the amino acid sequence. In this connection, it will make sense to carry out the process steps listed in deriving the amino acid sequence between three and twenty times, preferably between three and ten times, until an amino acid sequence of sufficient affinity is obtained.
Weiter ist es bei der Erfindung bevorzugt, wenn eine aus früheren Verfahrensschritten erhaltene (vorläufig optimierte oder teiloptimierte) Aminosäuresequenz mit bereits guter Wechselwirkung/Affinität in weiteren Verfahrensschritten als sogenannter Ko petitor eingesetzt wird. Dies gilt insbesondere auch für die Durchführung des Screening-Verfahrens, bei dem dann die weiter optimierten Sequenzen mit dem Kompetitor direkt verglichen werden können.It is further preferred in the invention if an amino acid sequence obtained (previously optimized or partially optimized) from earlier process steps with already good interaction / affinity is used in further process steps as a so-called petitor. This applies in particular to the implementation of the screening process at which then the further optimized sequences can be compared directly with the competitor.
Schließlich kann das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Ableitung von Aminosäuresequenzen für mehrere Teilabschnitte eines Zielpeptids/Zielproteins durchgeführt werden. Damit kann die Gesamtaffinität und Spezifität der abgeleiteten Struktur weiter verbessert werden, wie dies im folgenden noch erläutert wird. Auch hier werden die erforder- liehen Verfahrensschritte zur Ableitung der Aminosäuresequenz pro Teilabschnitt mit der bereits genannten Häufigkeit von drei- bis zwanzigmal, vorzugsweise drei bis zehnmal, durchlaufen.Finally, the method according to the invention can be carried out in particular for the derivation of amino acid sequences for several subsections of a target peptide / target protein. The overall affinity and specificity of the derived structure can thus be further improved, as will be explained in the following. Here too, the required process steps for deriving the amino acid sequence per section are carried out with the abovementioned frequency of three to twenty times, preferably three to ten times.
Nach der Erfindung umfaßt die abgeleitete Aminosäuresequenz üblicherweise eine möglichst geringe Anzahl an Aminosäuren, um die Ableitung der Aminosäuresequenz nicht zu aufwendig werden zu lassen. Andererseits wird in den meisten Fällen eine Mindestzahl an Aminosäuren erforderlich sein, um die erforderliche Wechselwirkung mit dem Zielprotein/Zielpeptid/ Teilabschnitt zu gewährleisten. Es ist deshalb bevorzugt, daß die abgeleitete Aminosäuresequenz weniger als 30 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 15 Aminosäuren, umfaßt.According to the invention, the derived amino acid sequence usually comprises the smallest possible number of amino acids in order not to make the derivation of the amino acid sequence too complex. On the other hand, in most cases a minimum number of amino acids will be required to ensure the required interaction with the target protein / target peptide / section. It is therefore preferred that the deduced amino acid sequence comprise less than 30 amino acids, preferably less than 15 amino acids.
Bei der Identifizierung und Auswahl eines oder mehrererWhen identifying and selecting one or more
Teilabschnitte des Zielpeptids/Zielproteins können grundsätzlich beliebige Aminosäuresequenzen berücksichtigt werden, die an einer entsprechenden physiologischen Protein-Protein- bzw. Peptid-Peptid-Wechselwirkung beteiligt sind. Besonders geeignet sind hier jedoch sogenannte -Helix- oder ß-Falt- blatt-Strukturen. Wenn wie in vielen Fällen mehrere aktive Teilabschnitte innerhalb eines Zielpeptids/Zielproteins vorhanden sind, können deshalb bevorzugt diese genannten Strukturen ausgewählt und für diese Aminosäuresequenzen abgeleitet werden.Sub-sections of the target peptide / target protein can in principle be taken into account any amino acid sequences which are involved in a corresponding physiological protein-protein or peptide-peptide interaction. However, so-called helix or β-sheet structures are particularly suitable here. If, as in many cases, there are several active sections within a target peptide / protein, these can therefore preferably be mentioned Structures are selected and derived for these amino acid sequences.
Die wesentlichen Merkmale der Erfindung können dementspre- chend wie folgt zusammengefaßt werden:The essential features of the invention can accordingly be summarized as follows:
Die Erfindung beruht auf einer Identifizierung und Auswahl eines Zielpeptids/Zielproteins oder eines oder mehrerer seiner Teilabschnitte, die für eine physiologische Wechsel- Wirkung mit anderen Peptiden, Proteinen u.dgl. in Frage kommen. Die bei der Erfindung gewählten Ausdrücke "Peptid" und "Protein" sollen dabei im weitesten Sinn eine jede Aminosäure-Aneinanderreihung umfassen, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Zu dieser identifizierten und ausgewählten Aminosäuresequenz wird nach der Erfindung eine Aminosäuresequenz abgeleitet, die zu einer Wechselwirkung in der Lage ist, vorzugsweise zu einer mindestens genauso guten Wechselwirkung wie zwischen der vorgelegten Sequenz und deren physiologischem Wechselwirkungspartner .The invention is based on the identification and selection of a target peptide / target protein or one or more of its subsections which are suitable for a physiological interaction with other peptides, proteins and the like. come into question. The terms “peptide” and “protein” selected in the invention are intended to encompass in the broadest sense any amino acid sequence as known to the person skilled in the art. According to the invention, an amino acid sequence is derived from this identified and selected amino acid sequence that is capable of an interaction, preferably an interaction that is at least as good as that between the sequence presented and its physiological interaction partner.
Für die Ableitung der gesuchten Aminosauresequenz werden dann im einzelnen verschiedene Verfahren angewandt, wie sie bereits beschrieben wurden. Diese lassen sich unter den Stichworten Random-Peptid-Library-Screen, insbesondere Yeast- Two-Hybrid-System, NMR-based-Drug-Design und Computer-Various methods are then used to derive the amino acid sequence sought, as already described. These can be classified under the keywords random peptide library screen, in particular yeast two-hybrid system, NMR-based drug design and computer
Molecular-Modelling aufführen. Wie dargestellt ist dabei der Ausgangspunkt der Entwicklung eine bereits bekannte Peptid- Peptid-Wechselwirkung, eine aus einem früheren Verfahrensdurchgang resultierende Wechselwirkung oder eine rein compu- termodellierte Struktur. Hintergrund der Erfindung ist mit anderen Worten demzufolge auch eine Kombination aus einem weitgehend zufälligen Screening und einer deterministischen Modelling Strategie. Die Kombination dieser beiden Techniken macht es möglich, aus der unüberschaubaren Vielzahl von möglichen Sequenzen eine Reihe von beispielsweise 10 besonders guten Sequenzen auszuwählen.List molecular modeling. As shown, the starting point of the development is an already known peptide-peptide interaction, an interaction resulting from an earlier process or a purely computer-modeled structure. In other words, the background of the invention is therefore a combination of a largely random screening and a deterministic modeling strategy. The combination of these two techniques makes it possible to choose from the vast number of possible sequences to select a series of, for example, 10 particularly good sequences.
Die Vorteile der Erfindung zeigen sich zunächst vor allem bei der eingangs erwähnten Inhibition der Funktion vqn physiologisch aktiven Peptiden. So können im Vergleich zu einer Antisense-Strategie, welche bisher höchstens eine 60 bis 80 %-ige Inhibition erlaubt, durch die erfindungsgemäße Optimierung der Aminosäuresequenz eine im wesentlichen vollständige Blockierung der entsprechenden Peptid-Peptid- Wechselwirkungen bzw. des entsprechenden Rezeptors erreicht werden. Aufgrund seiner spezifischen Wirkung wird die erfindungsgemäß abgeleitete Aminosäuresequenz von den Erfindern als Intraactor © bezeichnet. Durch die so erreichbare hohe Effektivität kann die Situation eintreten, daß auf viraleThe advantages of the invention are first of all evident in the inhibition of the function of physiologically active peptides mentioned at the beginning. In comparison to an antisense strategy, which has hitherto permitted at most 60 to 80% inhibition, essentially complete blocking of the corresponding peptide-peptide interactions or of the corresponding receptor can be achieved by optimizing the amino acid sequence according to the invention. Because of its specific effect, the amino acid sequence derived according to the invention is referred to by the inventors as Intraactor ©. Because of the high effectiveness that can be achieved in this way, the situation can occur that on viral
Vektoren im Gegensatz zu den Methoden des Standes der Technik vollständig verzichtet werden kann. Dementsprechend wird die Halbwertszeit eines therapeutischen Effekts durch die Eigenschaften des Wirkstoffs und seines Zielmoleküls und nicht durch die des gentherapeutischen Vehikels bestimmt. In diesenIn contrast to the methods of the prior art, vectors can be completely dispensed with. Accordingly, the half-life of a therapeutic effect is determined by the properties of the active ingredient and its target molecule and not by that of the gene therapy vehicle. In these
Fällen kann die erforderliche, meist im nanomolaren Bereich liegende Konzentration des Wirkstoffs bzw. der Aminosäuresequenz bereits mit einer einzigen Kopie einer entsprechenden DNA in einer Zelle erreicht werden.In some cases, the required concentration of the active ingredient or the amino acid sequence, which is usually in the nanomolar range, can already be achieved with a single copy of a corresponding DNA in a cell.
Weiter umfaßt die Erfindung einen Wirkstoff, vorzugsweise einen intrazellulären Wirkstoff, der direkt oder indirekt zur Beeinflussung der Funktion von physiologisch aktiven Peptiden oder Proteinen in der Lage ist. Erfindungsgemäß resultiert dieser Wirkstoff aus dem bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren bzw. einem seiner Ausführungsformen. Eine direkte Beeinflussung durch den Wirkstoff liegt beispielsweise vor, wenn die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren abgeleitete Aminosäuresequenz eingesetzt wird, d.h. diese 10The invention further comprises an active substance, preferably an intracellular active substance, which is capable of influencing the function of physiologically active peptides or proteins directly or indirectly. According to the invention, this active ingredient results from the method according to the invention already described or from one of its embodiments. There is a direct influence by the active ingredient, for example, if the amino acid sequence derived by the method according to the invention is used, ie this 10
"direkt" die gewünschte Wechselwirkung eingeht. Eine indirekte Beeinflussung liegt beispielsweise in dem Fall vor, wenn als Wirkstoff ein für die gewünschte Aminosäuresequenz kodierendes Nukleinsäuremolekül verwendet wird, das einmal in die entsprechende Zelle eingeschleust, die optimierte Aminosäuresequenz exprimiert.the desired interaction occurs "directly". An indirect influence is present, for example, when a nucleic acid molecule coding for the desired amino acid sequence is used as the active ingredient, which is introduced into the corresponding cell and which expresses the optimized amino acid sequence.
Dementsprechend handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Wirkstoff insbesondere um eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren oder einem seiner Ausführungsformen erhältliche Aminosäuresequenz . Diese Aminosäuresequenz ist insbesondere ein Peptid, das vorzugsweise weniger als 15 Aminosäuren aufweist. In bevorzugter Weiterbildung kann der Wirkstoff mindestens zwei (optimierte) Aminosäuresequenzen enthalten. Grundsätzlich können diese unabhängig voneinander vorliegen und beispielsweise mit entsprechenden Teilabschnitten eines Zielpeptids wechselwirken. Es ist jedoch bevorzugt, wenn die mindestens zwei Aminosäuresequenzen über physiologisch weitgehend inaktive molekulare Zwischenglieder miteinander verbunden sind. Hierbei handelt es sich insbesondere um eine kovalente Verbindung zwischen den Aminosäuresequenzen und den Zwischengliedern. Durch den Einsatz solcher "kovalenter Linker" wird eine weitere Affinitätssteigerung erreicht. Hat eine der Aminosäuresequenzen ihre zugehörige Wechselwirkungs- stelle gefunden, so ist die Wahrscheinlichkeit, daß auch die zweite Aminosäuresequenz oder eine weitere ihre entsprechende Bindungsstelle findet, wesentlich erhöht. Die Länge der molekularen Zwischenglieder zwischen den Aminosäuresequenzen ist dabei dem Abstand der aktiven Teilabschnitte im Ziel- peptid oder unter Umständen auch zwischen verschiedenenAccordingly, the active ingredient according to the invention is in particular an amino acid sequence obtainable by the method according to the invention or one of its embodiments. This amino acid sequence is in particular a peptide which preferably has fewer than 15 amino acids. In a preferred development, the active substance can contain at least two (optimized) amino acid sequences. In principle, these can exist independently of one another and, for example, interact with corresponding subsections of a target peptide. However, it is preferred if the at least two amino acid sequences are linked to one another via physiologically largely inactive molecular intermediate members. This is in particular a covalent connection between the amino acid sequences and the pontics. A further increase in affinity is achieved by using such "covalent linkers". If one of the amino acid sequences has found its associated interaction site, the probability that the second amino acid sequence or another will also find its corresponding binding site is significantly increased. The length of the molecular links between the amino acid sequences is the distance between the active sections in the target peptide or, under certain circumstances, also between different ones
Zielpeptiden angepaßt. Diese Anpassung kann die biologischen Gegebenheiten berücksichtigen, so daß der Abstand unter Umständen größer sein kann als dies dem tatsächlichen Abstand entspricht. Letzteres ist allerdings bevorzugt. Das Linker- 11Adjusted target peptides. This adaptation can take into account the biological conditions, so that the distance can possibly be greater than the actual distance. However, the latter is preferred. The linker 11
Molekül läßt sich nach Strukturanalyse einzelner Rezeptorbereiche (Teilabschnitt) oder des gesamten Rezeptors (Zielpeptid) konstruieren. Wenn, wie im vorliegenden Fall, auf die Ableitung von Aminosäuresequenzen abgestellt ist, lassen sich in einfacher Weise Poly-Glycin- oder Poly-Alanin*-Ketten entsprechender Länge einfügen.Molecules can be constructed after structural analysis of individual receptor areas (partial section) or the entire receptor (target peptide). If, as in the present case, the derivation of amino acid sequences is used, poly-glycine or poly-alanine * chains of corresponding length can be inserted in a simple manner.
Als erfindungsgemäße Wirkstoffe lassen sich weiter Nukleinsauremolekule, vorzugsweise rekombinierte Nukleinsäuremole- küle, einsetzen, die für mindestens eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Aminosäuresequenz kodieren. Hierbei kann es sich um ein DNA-Molekül, cDNA-Molekül oder RNA-Molekül handeln. Im Falle der Verwendung molekularer Zwischenglieder als Linker zwischen mehreren Aminosäure- Sequenzen kodieren die Nukleinsauremolekule zusätzlich auch für diese Linker-Ketten.Further active substances according to the invention which can be used are nucleic acid molecules, preferably recombined nucleic acid molecules, which code for at least one amino acid sequence obtainable by the method according to the invention. This can be a DNA molecule, cDNA molecule or RNA molecule. If molecular links are used as a linker between several amino acid sequences, the nucleic acid molecules additionally code for these linker chains.
In Weiterbildung kann der erfindungsgemäße Wirkstoff in Form eines sogenannten Vektors oder Vehikels vorliegen, der mindestens eines der bereits beschriebenen Nukleinsauremolekule, die für die Aminosäuresequenz kodieren, trägt. Bei solchen Vektoren kann es sich um die üblichen viralen und nicht-viralen Vektoren handeln, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Bei Verwendung eines viralen Vektors kann ein Retro- virus, ein Adenovirus oder ein Adeno-assoziiertes Virus eingesetzt werden. Neben nicht-viralen Vektoren, in der keine virale DNA beteiligt ist, ist die Verpackung der Nukleinsauremolekule in die sogenannten Liposomen oder Lipoplexe hervorzuheben. Der Einsatz von nicht-viralen Vektoren oder Liposomen/Lipoplexen ist grundsätzlich bevorzugt, um die bekannten, eingangs teilweise geschilderten Nachteile viraler Vektoren zu vermeiden. Gemäß den Vorteilen der Erfindung können Wirkstoffe mit sehr hoher Effektivität zur Verfügung gestellt werden, die grundsätzlich ohne Verwendung viraler 12In a further development, the active substance according to the invention can be in the form of a so-called vector or vehicle which carries at least one of the nucleic acid molecules already described which code for the amino acid sequence. Such vectors can be the usual viral and non-viral vectors as are known to the person skilled in the art. If a viral vector is used, a retro virus, an adenovirus or an adeno-associated virus can be used. In addition to non-viral vectors in which no viral DNA is involved, the packaging of the nucleic acid molecules in the so-called liposomes or lipoplexes should be emphasized. In principle, the use of non-viral vectors or liposomes / lipoplexes is preferred in order to avoid the known disadvantages of viral vectors, some of which are described at the beginning. According to the advantages of the invention, active ingredients can be made available with very high effectiveness, which in principle are viral without use 12
Vektoren in eine Zelle eingeschleust werden können. Vorteil der Erfindung ist ganz grundsätzlich, daß Wirkstoffe, insbesondere Aminosäuresequenzen mit nanomolarer Affinität, zur Verfügung gestellt werden können.Vectors can be introduced into a cell. The advantage of the invention is quite fundamentally that active ingredients, in particular amino acid sequences with nanomolar affinity, can be made available.
Schließlich umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Medikament, daß mindestens einen der beschriebenen Wirkstoffe, d.h. eine optimierte Aminosäuresequenz , deren kodierendes Nukleinsäuremolekül oder ein das Nukleinsäuremolekül tragendes Vehikel enthält, sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.Finally, the invention comprises a pharmaceutical composition or a medicament that contains at least one of the described active ingredients, i.e. an optimized amino acid sequence containing the coding nucleic acid molecule or a vehicle carrying the nucleic acid molecule, and a pharmaceutically acceptable carrier.
Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzug- ten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen, Beispielen und den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.The described features and further features of the invention result from the following description of preferred embodiments in conjunction with the subclaims, examples and the drawings. The individual features can be implemented individually or in combination with one another.
In den Zeichnungen zeigen:The drawings show:
Fig. 1 die Proteinstruktur eines Komplexes aus der cyclin- abhängigen Kinase CDK2 , dem Cyclin A und ihremFig. 1 shows the protein structure of a complex of the cyclin-dependent kinase CDK2, the cyclin A and their
Inhibitor p27κiP1,Inhibitor p27 κi P 1 ,
Fig. 2 die Wechselwirkung zwischen einem Teilabschnitt des Cyclin A und einem Teilabschnitt von p27KlP1 undFig. 2 shows the interaction between a section of cyclin A and a section of p27 Kl P 1 and
Fig. 3 den Ablauf bestimmter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens in schematischer Darstellung. 13Fig. 3 shows the flow of certain embodiments of the method according to the invention in a schematic representation. 13
Beispielexample
Ausgehend von der bekannten Struktur eines Proteinkomplexes sollen die Einsatzmöglichkeiten der Erfindung dargestellt werden. Dazu wird der Komplex aus der cyclinabhängigen Kinase CDK2, dem Cyclin A und ihrem Inhibitor p27KlP1 gewählt. Diese Struktur ist in der Veröffentlichung von A.A. Russo et al in Nature, 382, 325-331 (1996) offenbart und in Fig. 1 dargestellt.Starting from the known structure of a protein complex, the possible uses of the invention are to be presented. The complex is selected from the cyclin-dependent kinase CDK2, cyclin A and its inhibitor p27 Kl P 1 . This structure is disclosed in the publication by AA Russo et al in Nature, 382, 325-331 (1996) and is shown in FIG. 1.
Ziel des Einsatzes des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, eine Wechselwirkung des p27^1P^- mit den beiden anderen Proteinen zu hemmen bzw. zu verhindern. Dazu soll eine Aminosäuresequenz abgeleitet werden, die vorzugsweise besser als das p27KlP1 mit den beiden übrigen Proteinen, vorzugsweise dem Cyclin A wechselwirkt.The aim of using the method according to the invention is to inhibit or prevent an interaction of the p27 ^ 1 P ^ - with the other two proteins. For this purpose, an amino acid sequence is to be derived which preferably interacts better than the p27 Kl P 1 with the other two proteins, preferably the cyclin A.
In Fig. 1 sind die Stellen, an denen Peptid-Peptid-Wechsel- wirkung zwischen p27KlP1 und CDK2 bzw. Cyclin A stattfindet, schwarz hervorgehoben. Bei der mit a bezeichneten Bindung/ Interaktion handelt es sich um eine Bindungsstelle, die vorerst als eine Bindungsstelle hoher Affinität identifiziert wurde. Weitere Bindungsstellen existieren zwischen einero^-Helix des Cyclin A und einero^-Helix von p27K;"-P1 (Bindung/Interaktion b) , einer ß-Faltblatt-Struktur von CDK2 und einem ß-Turn von p27KlP1 (Bindung/Interaktion c) , einem ß-Strang von CDK2 und einem ß-Strang von p27KlP1 (Bindung/Interaktion d) . Zusätzlich besetzt eine weitere Helix von p27KlP1 die sogenannte ATP-Bindungsstelle.In Fig. 1, the places where peptide-peptide interaction between p27 Kl P 1 and CDK2 or Cyclin A takes place are highlighted in black. The binding / interaction denoted by a is a binding site which was initially identified as a binding site with high affinity. Further binding sites exist between an o ^ -helix of cyclin A and an o ^ -helix of p27 K; "-P 1 (binding / interaction b), a β-sheet structure of CDK2 and a β-turn of p27 Kl P 1 (binding / interaction c), a β-strand of CDK2 and a β-strand of p27 Kl P 1 (binding / interaction d) In addition, another helix of p27 Kl P 1 occupies the so-called ATP binding site.
Ausgehend von Fig. 1 soll nun die Wechselwirkung der Bindung/Interaktion b zur Ableitung einer Aminosäuresequenz nach 14Based on FIG. 1, the interaction of the binding / interaction b to derive an amino acid sequence is now to be examined 14
der Erfindung herausgegriffen werden. Die entsprechende Bindungsstelle ist in Fig. 2 dargestellt. Sie zeigt die Wechselwirkung zwischen den beideno^-Helices des Cyclin A bzw. des p27KlP1, wobei auf Seiten des p27KlP1 die Amino- säuren 38 bis 49 und auf Seiten des Cyclins A dieo^-5-Helix involviert sind.be picked out of the invention. The corresponding binding site is shown in Fig. 2. It shows the interaction between the two o ^ helices of cyclin A and p27 Kl P 1 , the amino acids 38 to 49 being involved on the p27 Kl P 1 side and theo ^ -5 helix on the cycline A side .
Fig. 2 zeigt, daß die Passung zwischen den beiden wechselwirkenden Strukturen nicht perfekt ist und daher keine sehr hohe Affinität zwischen den beiden Wechselwirkungspartnern vorliegen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren soll nun eine der beiden Helices, insbesondere die Helix von p27KlP1 durch eine optimierte Peptidstruktur (Aminosäuresequenz) ersetzen, die dann die andere Helix, vorzugsweise diejenige des Cyclin A, mit hoher Affinität bindet. Diese optimierte Peptidstruktur wird dann als Peptid von beispiels- und vorzugsweise bis zu 15 Aminosäurenlänge durch ein künstlich eingebrachtes Gen intrazellulär exprimiert. Durch die hohe Affinität des Peptids wird dann die Wechselwirkung der physiologischen Peptidpartner gestört und mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Inhibition der Kinase durch das p27KlP1 verhindert. Aufgrund dieses Ansatzes müßte die Konzentration der Aminosäuresequenz in der Zelle nur etwa gleich hoch sein wie die Konzentration von p27κiP1, die auf 10 nM/1 oder etwa 1.000 bis 10.000 Moleküle pro Zelle geschätzt werden kann. Zum Erreichen einer solchen Konzentration könnte wie geschildert bereits eine einzige Kopie einer die Aminosäuresequenz kodierenden DNA pro Zelle ausreichen.Fig. 2 shows that the fit between the two interacting structures is not perfect and therefore there will not be a very high affinity between the two interacting partners. The method according to the invention is now intended to replace one of the two helices, in particular the helix of p27 Kl P 1, with an optimized peptide structure (amino acid sequence) which then binds the other helix, preferably that of cyclin A, with high affinity. This optimized peptide structure is then expressed intracellularly as a peptide of, for example, and preferably up to 15 amino acid length, by an artificially introduced gene. The high affinity of the peptide then interferes with the interaction of the physiological peptide partners and, with high probability, inhibition of the kinase by the p27 Kl P 1 is prevented. Because of this approach, the concentration of the amino acid sequence in the cell should only be approximately the same as the concentration of p27 κi P 1 , which can be estimated at 10 nM / 1 or approximately 1,000 to 10,000 molecules per cell. As described, a single copy of a DNA encoding the amino acid sequence per cell could be sufficient to achieve such a concentration.
In Fig. 3 sind der Verfahrensablauf bzw. die Verfahrensabläufe bei einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren schematisch dargestellt. 153 schematically shows the process sequence or the process sequences in a preferred method according to the invention. 15
Es wird entweder von der bekannten Wechselwirkung zwischen zwei Peptid-/Proteinmolekülen (linkes oberes Rechteck) oder von der bekannten Proteinstruktur eines intrazellulären Rezeptors bzw. Zielpeptids (rechtes oberes Rechteck) ausge- gangen. Auf dieser Grundlage werden im vorliegenden Fall geeignete Subdomänen (Teilabschnitte) ausgewählt, die der Ableitung der gesuchten Aminosäuresequenz zugrundegelegt werden sollen. Bei dem Proteinkomplex von Fig. 1 entspricht dies der Auswahl der Bindung/Interaktion an der Bindungs- stelle b.It is based either on the known interaction between two peptide / protein molecules (top left rectangle) or on the known protein structure of an intracellular receptor or target peptide (top right rectangle). On this basis, suitable subdomains (subsections) are selected in the present case, which are to be used as the basis for the derivation of the amino acid sequence sought. In the protein complex of FIG. 1, this corresponds to the selection of the binding / interaction at the binding site b.
Kann, wie im Falle des Proteinkomplexes der Fig. 1, von der realen Struktur eines physiologischen Wechselwirkungspartners des Zielproteins ausgegangen werden, in diesem Fall der Struktur des p27KlP1, dann stellt diese Struktur die Startstruktur für die Ableitung der Aminosäuresequenz dar. Es ist dann, wie in Fig. 3 dargestellt, vorteilhaft, wenn beide Wechselwirkungspartner zunächst als Peptid synthetisiert und die Wechselwirkung mittels NMR-Strukturanalyse vermessen wird. Üblicherweise wird hier keine vollständige Synthese der ganzen Peptide erforderlich sein, sondern es wird genügen, wenn die entsprechenden Teilabschnitte der Peptidsequenzen, die an der Bindungsstelle b wechselwirken, synthetisiert werden.If, as in the case of the protein complex of FIG. 1, the real structure of a physiological interaction partner of the target protein can be assumed, in this case the structure of p27 Kl P 1 , then this structure represents the starting structure for the derivation of the amino acid sequence. It is then, as shown in Fig. 3, advantageous if both interaction partners are first synthesized as a peptide and the interaction is measured by means of NMR structure analysis. Usually, a complete synthesis of the entire peptides will not be required here, but it will suffice if the corresponding subsections of the peptide sequences which interact at the binding site b are synthesized.
Zeigt die NMR-Strukturanalyse keine optimale Wechselwirkung (was grundsätzlich erwünscht ist, damit überhaupt eine besser wirkende Aminosäuresequenz erhalten werden kann) , so wird die Startstruktur mit Hilfe des sogenannten Molecular Modelling variiert. Dabei wird in an sich bekannter Weise bei mindestens einer, vorzugsweise vielen verschiedenen vorgegebenen Aminosäuresequenzen deren (räumliche) Peptidstruktur bestimmt und ihre Passung mit dem entsprechenden Teilabschnitt des Zielpeptids untersucht. Auf Basis des Molecular Modelling 16If the NMR structure analysis does not show an optimal interaction (which is generally desirable so that a better-functioning amino acid sequence can be obtained at all), the starting structure is varied with the help of molecular modeling. The (spatial) peptide structure of at least one, preferably many different, predetermined amino acid sequences is determined in a manner known per se and their fit with the corresponding subsection of the target peptide is examined. Based on molecular modeling 16
wird dann eine Anzahl degenerierter Sequenzen entworfen, aus denen eine oder mehrere für ein Screening-Verfahren ausgewählt werden. Im vorliegenden Fall handelt es sich bei dem Screening-Verfahren um das FRET-Yeast-Two-Hybrid-Verfahren. Hierbei werden aus ca. 108 bis 109 Hefezellen mit Klonen unterschiedlicher Sequenz eine Anzahl bester Zellen, vorzugsweise etwa 10, ausgewählt, bei denen die Wechselwirkung zwischen den Peptiden, gemessen durch Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer (FRET) am stärksten bzw. besten ist. Die Zellen mit der besten Wechselwirkung werden kloniert, und die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen bzw. die zugehörigen Aminosäuresequenzen werden durch Sequenzierung ermittelt. Vergleicht man nun, wie in Fig. 3 ebenfalls dargestellt, ob Ähnlichkeiten zwischen den ausgewählten Sequenzen erkennbar sind oder ob andere Ansatzpunkte für gemeinsame Strukturmotive vorliegen, so kann diese Information für die weitere Verfahrensführung genutzt werden. Gibt es Hinweise auf optimierbare Strukturmotive, so werden ausgewählten Sequenzen als Peptide hergestellt und ihre Wechselwirkungsstruktur mittels NMR-Spektroskopie vermessen. Ist die Wechselwirkung noch nicht ausreichend, entweder im Vergleich zu dem natürlichen Wechselwirkungspartner des Zielpeptids oder im Hinblick auf eine zu erreichende Affinität, wird der mit dem Verfahrensschritt des Molecular Modelling beginnende Verfah- rensdurchlauf erneut gestartet, um auf diese Weise zu verbesserten Affinitäten zu gelangen. Ist aus einem früheren Verfahrensdurchlauf bereits eine Aminosäuresequenz mit guter Wechselwirkung bekannt, so kann diese in den folgenden Verfahrensschritten, insbesondere beim Screening-Verfahren als Kompetitor eingesetzt werden, um auf diese Weise die noch besseren Aminosäuresequenzen zu erkennen. Wie bereits geschildert muß der in Fig. 3 dargestellte Zyklus der Ableitung der Aminosäuresequenz üblicherweise drei- bis zwanzigmal, vorzugsweise drei- bis zehnmal pro Rezeptordomäne (Teil- 17a number of degenerate sequences are then designed, from which one or more are selected for a screening process. In the present case, the screening process is the FRET yeast two hybrid process. From about 10 8 to 10 9 cells with clones of different sequences, a number of the best cells, preferably about 10, are selected in which the interaction between the peptides, measured by fluorescence resonance energy transfer (FRET), is strongest or is best. The cells with the best interaction are cloned and the corresponding nucleic acid sequences or the associated amino acid sequences are determined by sequencing. If one now compares, as also shown in FIG. 3, whether similarities between the selected sequences are recognizable or whether there are other starting points for common structural motifs, this information can be used for the further implementation of the method. If there are indications of structural motifs that can be optimized, selected sequences are produced as peptides and their interaction structure is measured by means of NMR spectroscopy. If the interaction is not yet sufficient, either in comparison to the natural interaction partner of the target peptide or with regard to an affinity to be achieved, the process run beginning with the molecular modeling process step is started again in order to achieve improved affinities in this way. If an amino acid sequence with good interaction is already known from an earlier process run, this can be used as a competitor in the following process steps, in particular in the screening process, in order to identify the even better amino acid sequences in this way. As already described, the cycle of deriving the amino acid sequence shown in FIG. 3 usually has to be carried out three to twenty times, preferably three to ten times per receptor domain (partial 17
abschnitt des Zielpeptids) durchlaufen werden, um Aminosäuresequenzen mit ausreichender Affinität zu erhalten. Diese gewünschte Affinität liegt normalerweise im nanomolaren Bereich, wie dies ebenfalls bereits dargestellt wurde.section of the target peptide) are run through in order to obtain amino acid sequences with sufficient affinity. This desired affinity is normally in the nanomolar range, as has also already been shown.
Eine Verfahrensführung gemäß Fig. 3, die nicht von der realen Struktur eines physiologischen Wechselwirkungspartners als Startstruktur ausgehen kann, unterscheidet sich im wesentlichen nur dadurch, daß nach Auswahl der entsprechenden Subdomäne (Teilabschnitt des Zielpeptids) direkt mit Hilfe des Molecular Modelling eine Aminosäuresequenz als Startstruktur ausgewählt werden muß. Es ist zwar grundsätzlich möglich, diese (simulierte) Startstruktur ebenfalls einer Peptidsynthese und NMR-Strukturanalyse zu unterwerfen, wie dies in Fig. 3 für den Fall des physiologischen Bindungspartners dargestellt ist. Dies wird jedoch in den meisten Fällen nicht sinnvoll sein, da die simulierte Startstruktur ohnehin mit großer Wahrscheinlichkeit keine optimale Wechselwirkung zeigen wird. Die simulierte Startstruktur wird deshalb lediglich zur Planung einer degenerierten Nukleinsäuresequenz herangezogen, die dann in das eigentliche Screening-Verfahren eingesetzt wird. Durch das Molecular Modelling wird jedoch erreicht, daß eine vollständige Degeneration der Nukleinsäuresequenz entfallen kann, was die Variabilität immerhin von Werten um 1020 auf etwa 1010 herabsetzen kann. Durch weitere Verfahrensdurchläufe kann in der bereits geschilderten Weise die Variabilität sukzessive weiter erniedrigt werden.A procedure according to FIG. 3, which cannot start from the real structure of a physiological interaction partner as the starting structure, differs essentially only in that, after selection of the corresponding subdomain (partial section of the target peptide), an amino acid sequence is selected as the starting structure with the help of molecular modeling must become. It is in principle possible to also subject this (simulated) start structure to peptide synthesis and NMR structure analysis, as shown in FIG. 3 for the case of the physiological binding partner. However, this will not make sense in most cases, since the simulated start structure will most likely not show an optimal interaction. The simulated starting structure is therefore only used to plan a degenerate nucleic acid sequence, which is then used in the actual screening process. Molecular modeling, however, ensures that a complete degeneration of the nucleic acid sequence can be omitted, which can reduce the variability from values around 10 20 to about 10 10 . The variability can be successively further reduced in the manner already described by further process runs.
Das gemäß Fig. 3 einsetzbare FRET-Yeast-Two-Hybrid-Verfahren beruht im wesentlichen darauf, daß die beiden Peptide, deren Wechselwirkung miteinander untersucht werden soll, an unterschiedliche fluoreszierende Komponenten gekoppelt sind. Dabei überlappen die Absorptions- und Emissionsspektren der fluo- 18The FRET yeast two hybrid method which can be used according to FIG. 3 is essentially based on the fact that the two peptides, the interaction of which is to be investigated with one another, are coupled to different fluorescent components. The absorption and emission spectra of the fluo- 18th
reszierenden Komponenten derart, daß ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) auftritt. Dieser Nachweis kann unter analoger Anwendung des bekannten Yeast-Two-Hybrid- Verfahrens ebenfalls in einer Wirtszelle wie einer Hefezelle durchgeführt werden, wobei das gemessene Fluoreszenzsignal einen unmittelbaren Aufschluß über die Affinität der Bindung bzw. Wechselwirkung zwischen den beiden Peptidbestandteilen gibt. Wie auch im vorliegenden Fall kann der Fluoreszenz- Resonanz-Energie-Transfer (FRET) durch bekannte fluoro- metrische Methoden, wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder durch Fluoreszenzmikroskopie erfolgen. Als fluoreszierende Komponenten können vorzugsweise fluoreszierende Peptide wie das Green Fluorescent Protein (GFP) und das Blue Fluorescent Protein (BFP) eingesetzt werden. Die Anregung der Fluoreszenz erfolgt bevorzugt durch Laser. In diesem Zusammenhang kann auf den einschlägigen Stand der Technik verwiesen werden.resected components such that fluorescence resonance energy transfer (FRET) occurs. This detection can also be carried out in a host cell such as a yeast cell using the known yeast two hybrid method, the fluorescence signal measured providing direct information about the affinity of the binding or interaction between the two peptide components. As in the present case, the fluorescence resonance energy transfer (FRET) can be carried out by known fluorometric methods, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by fluorescence microscopy. Fluorescent peptides such as the green fluorescent protein (GFP) and the blue fluorescent protein (BFP) can preferably be used as fluorescent components. The fluorescence is preferably excited by laser. In this context, reference can be made to the relevant prior art.
Wie aus Fig. 3 ebenfalls hervorgeht, erfolgt die endgültige Analyse der Proteinstrukturen und ihrer Wechselwirkung mit Hilfe eines NMR-Spektrometers . Grundsätzlich können auch andere Nachweismethoden verwendet werden, wie beispielsweise die Röntgenstrukturanalyse eines kristallisierten Peptid- oder Proteinkomplexes. Aufgrund der Tatsache, daß die Analyse der Peptidstruktur mit dem NMR-Spektrometer einen vergleichsweise hohen Zeitaufwand erfordert, nimmt der entsprechende Verfahrensschritt eine wichtige Stellung im Gesamtverfahren ein. Wie bereits ansatzweise ausgeführt, läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren als Kombination aus einem zufälli- gen Screening und einer deterministischen Modelling-Strategie verstehen. Diese hier angewandte Vorgehensweise ist an den mathematischen Ablauf bestimmter Fitting-Algorithmen angelehnt, bei denen ebenfalls abwechselnd eine zufällige Variation und eine gezielte Veränderung der Parameter erfolgt, um 19As can also be seen from FIG. 3, the final analysis of the protein structures and their interaction takes place with the aid of an NMR spectrometer. In principle, other detection methods can also be used, such as the X-ray structure analysis of a crystallized peptide or protein complex. Due to the fact that the analysis of the peptide structure with the NMR spectrometer requires a comparatively high expenditure of time, the corresponding process step occupies an important position in the overall process. As has already been started, the method according to the invention can be understood as a combination of a random screening and a deterministic modeling strategy. This procedure used here is based on the mathematical sequence of certain fitting algorithms, in which a random variation and a targeted change in the parameters also take place alternately 19
die beste Anpassung einer Gleichung mit zahlreichen Parametern an eine experimentelle Kurve zu erreichen. Auch hier muß wie im vorliegenden Fall aus einer vergleichbar großen Zahl von Möglichkeiten (hier: mögliche Aminosäuresequenzen) eine beste oder möglichst gute (hier: optimierte. Aminosäuresequenz) herausgesucht werden. Für diesen strategischen Ansatz ist wichtig, daß in jedem Verfahrenszyklus immer wieder die Abweichung errechnet wird, da sowohl die experimentellen Datenpunkte als auch die mathematische Gleichung exakt bekannt sind. Bei dieser Berechnung wird dann jedes Mal der Einfluß aller variablen Parameter auf diese Abweichung ausprobiert, um die sich anschließende nächste Phase der Variation (Verfahrensdurchlauf) zu planen. Übertragen auf die Erfindung bedeutet dies, daß die Messung mit dem NMR- Spektrometer diese Kontrolle und Festlegung der Abweichung erlaubt.to achieve the best fit of an equation with numerous parameters to an experimental curve. Here too, as in the present case, the best or as good as possible (here: optimized. Amino acid sequence) must be selected from a comparatively large number of possibilities (here: possible amino acid sequences). It is important for this strategic approach that the deviation is calculated again and again in each process cycle, since both the experimental data points and the mathematical equation are exactly known. During this calculation, the influence of all variable parameters on this deviation is then tried out each time in order to plan the subsequent next phase of the variation (process cycle). Applied to the invention, this means that the measurement with the NMR spectrometer allows this control and determination of the deviation.
Da jedoch beispielsweise bei einem 600 MHz-Spektrometer bei völlig unbekannten Strukturen (nach Ablauf mehrerer sogenann- ter TOCSY- und sogenannter NOESY-Protokolle) ca. 80 bis 120 Stunden reine Meßzeit erforderlich sind, läßt sich der Aufwand am besten durch die geschilderte Strategie erreichen, bei der immer nur bereits optimierte Aminosäuresequenzen in eine NMR-Strukturanalyse eingebracht werden. Selbst unter Anwendung dieser Strategie sind bei drei bis zehn Verfahrensdurchläufen und Untersuchung von vier Peptiddomänen (Teilabschnitten) eines Zielpeptids üblicherweise immer noch ca. 2.000 Stunden Meßzeit für die Entwicklung einer optimierten Aminosäuresequenz erforderlich. However, since, for example, with a 600 MHz spectrometer with completely unknown structures (after several so-called TOCSY and NOESY protocols have expired) approx. 80 to 120 hours of pure measurement time are required, the effort can best be achieved using the strategy described , in which only already optimized amino acid sequences are introduced into an NMR structure analysis. Even using this strategy, three to ten process runs and examination of four peptide domains (subsections) of a target peptide usually still require around 2,000 hours of measurement time for the development of an optimized amino acid sequence.

Claims

20Patentansprüche 20 patent claims
1. Verfahren zur Entwicklung eines Wirkstoffs, der, vor- zugsweise intrazellulär, direkt oder indirekt zur Beeinflussung der Funktion von physiologisch aktiven Peptiden oder Proteinen in der Lage ist, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte:1. A process for the development of an active substance which, preferably intracellularly, is able, directly or indirectly, to influence the function of physiologically active peptides or proteins, characterized by the process steps:
- Identifizierung und Auswahl eines Zielpeptids oder Zielproteins, insbesondere mindestens eines Teilabschnitts dieses Peptids oder Proteins, wobei das Zielpeptid/Zielprotein bzw. der Teilabschnitt physiologisch an einer Protein-Protein- bzw. Peptid-Peptid-Wechselwirkung teilnimmt oder teilnehmen kann;- Identification and selection of a target peptide or target protein, in particular at least a section of this peptide or protein, the target peptide / target protein or the section taking part or being able to participate physiologically in a protein-protein or peptide-peptide interaction;
Ableitung bzw. Screening einer Aminosäuresequenz, die mit dem Zielpeptid/Zielprotein bzw. dessen Teilabschnitt oder Teilabschnitten mit hoherDerivation or screening of an amino acid sequence with the target peptide / target protein or its section or sections with high
Affinität wechselwirkt, vorzugsweise mindestens genauso gut wie dessen physiologischer Wechselwirkungspartner .Affinity interacts, preferably at least as well as its physiological interaction partner.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ableitung der Aminosäuresequenz die Auswahl mindestens einer Startstruktur einer Aminosäuresequenz umfaßt, vorzugsweise mit einer solchen Auswahl beginnt.2. The method according to claim 1, characterized in that the derivation of the amino acid sequence comprises the selection of at least one starting structure of an amino acid sequence, preferably begins with such a selection.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Startstruktur um die Aminosäuresequenz eines physiologischen Wechselwirkungspartners des Zielpeptids/ Zielproteins bzw. eines seiner Teilabschnitte handelt, und/oder um eine aus einer mit Hilfe des 213. The method according to claim 2, characterized in that it is in the starting structure to the amino acid sequence of a physiological interaction partner of the target peptide / target protein or one of its subsections, and / or one of one with the help of 21
sogenannten Molecular Modelling computersimulierten Proteinstruktur abgeleitete Aminosäuresequenz .so-called molecular modeling computer-simulated protein structure derived amino acid sequence.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3 , dadurch gekennzeichnet, daß auf Basis der Startstruktur mindestens eine, vorzugsweise eine Anzahl, degenerierter Nukleinsäuresequenzen bestimmt und ausgewählt wird, die für Variationen der als Startstruktur ausgewählten Aminosäuresequenz kodiert.Method according to one of claims 2 or 3, characterized in that on the basis of the starting structure at least one, preferably a number, of degenerate nucleic acid sequences is determined and selected, which codes for variations in the amino acid sequence selected as the starting structure.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine degenerierte Nukleinsäuresequenz einem bekannten Screening-Verfahren unterworfen wird, mit dessen Hilfe die Wechselwirkung zwischen Zielpeptid/ Zielprotein bzw. dessen Teilabschnitt und den Aminosäuresequenzen, die der degenerierten Nukleinsäuresequenz entsprechen, bestimmbar ist, und Aminosäuresequenzen mit guter Wechselwirkung ausgewählt werden.5. The method according to claim 4, characterized in that at least one degenerate nucleic acid sequence is subjected to a known screening method, with the aid of which the interaction between target peptide / target protein or its portion and the amino acid sequences which correspond to the degenerate nucleic acid sequence can be determined, and Amino acid sequences with good interaction can be selected.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Screening-Verfahren um eine sogenannte Yeast-Two-Hybrid-Methode, vorzugsweise die sogenannte FRET-Yeast-Two-Hybrid-Methode handelt .6. The method according to claim 5, characterized in that the screening method is a so-called yeast two-hybrid method, preferably the so-called FRET yeast two-hybrid method.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß bestimmte Nukleinsäuresequenzen sequenziert werden, vorzugsweise das Screening-Verfahren eine Sequenzierung der Nukleinsäuresequenzen mit vergleichsweise guter Wechselwirkung umfaßt.7. The method according to any one of claims 4 to 6, characterized in that certain nucleic acid sequences are sequenced, preferably the screening method comprises a sequencing of the nucleic acid sequences with a comparatively good interaction.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise die Zellen, die diese Nukleinsäuresequenzen in einem Screening-Verfahren tragen, vor der Sequenzierung geklont werden. 22Method according to Claim 7, characterized in that the nucleic acid sequences, preferably the cells which carry these nucleic acid sequences in a screening process, are cloned before the sequencing. 22
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, daß mindestens teilweise die zu den sequenzierten Nukleinsäuremolekülen gehörenden Amino- säuresequenzen synthetisiert oder weitgehend quantitativ exprimiert werden.9. The method according to claim 7 or claim 8, characterized in that at least partially the amino acid sequences belonging to the sequenced nucleic acid molecules are synthesized or largely quantitatively expressed.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Wechselwirkungsstruktur zwischen Zielpeptid/Ziel- protein bzw. dessen Teilabschnitt und der synthetisierten Aminosäuresequenz NMR-spektroskopisch vermessen wird.10. The method according to claim 9, characterized in that the interaction structure between target peptide / target protein or its portion and the synthesized amino acid sequence is measured by NMR spectroscopy.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne oder mehrere11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that one or more
Verfahrensschritte zur Optimierung der Aminosäuresequenz mindestens zweimal, vorzugsweise mehrfach, durchgeführt werden.Process steps for optimizing the amino acid sequence are carried out at least twice, preferably several times.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine aus früheren Verfahrensschritten erhaltene Aminosäuresequenz mit guter Wechselwirkung in weiteren Verfahrensschritten als Kompetitor eingesetzt wird.12. The method according to claim 11, characterized in that at least one amino acid sequence obtained from previous process steps with good interaction is used in further process steps as a competitor.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Ableitung von Aminosäuresequenzen für mehrere Teilabschnitte eines Zielpeptids/Zielproteins durchgeführt wird.13. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the method for deriving amino acid sequences for several sections of a target peptide / protein is carried out.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die erforderlichen Verfah- rensschritte zur Ableitung einer Aminosauresequenz pro 2314. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the required process steps for deriving an amino acid sequence per 23
Teilabschnitt zwischen dreimal und zwanzigmal, vorzugsweise zwischen dreimal und zehnmal, durchlaufen werden.Section be run between three times and twenty times, preferably between three times and ten times.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die abgeleitete. minosäuresequenz weniger als 30 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 15 Aminosäuren, umfaßt.15. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the derived. amino acid sequence comprises less than 30 amino acids, preferably less than 15 amino acids.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei einem Teilabschnitt des Zielpeptids/Zielproteins um eine sogenannte c-Helix- oder eine sogenannte ß-Faltblatt-Struktur handelt.16. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a portion of the target peptide / target protein is a so-called c-helix or a so-called β-sheet structure.
17. Wirkstoff, der, vorzugsweise intrazellulär, direkt oder indirekt zur Beeinflussung der Funktion von physiologisch aktiven Peptiden oder Proteinen in der Lage ist, resultierend aus einem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16.17. Active ingredient which, preferably intracellularly, is able, directly or indirectly, to influence the function of physiologically active peptides or proteins, resulting from a method according to at least one of claims 1 to 16.
18. Wirkstoff nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16 erhältliche Aminosäuresequenz handelt.18. Active ingredient according to claim 17, characterized in that it is an amino acid sequence obtainable according to at least one of claims 1 to 16.
19. Wirkstoff nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Peptid, vorzugsweise um ein Peptid mit weniger als 15 Aminosäuren, handelt.19. Active ingredient according to claim 18, characterized in that it is a peptide, preferably a peptide with less than 15 amino acids.
20. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Aminosäuresequenzen über physiologisch weitgehend inaktive molekulare Zwischenglieder miteinander verbunden sind. 2420. Active ingredient according to one of claims 17 to 19, characterized in that at least two amino acid sequences are connected to one another via physiologically largely inactive molecular links. 24
21. Wirkstoff nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge der molekularen Zwischenglieder dem Abstand zwischen aktiven Teilabschnitten eines oder mehrerer Zielpeptide/Zielproteine angepaßt ist, vorzugsweise diesem Abstand entspricht.21. Active ingredient according to claim 20, characterized in that the length of the molecular intermediate members is adapted to the distance between active sections of one or more target peptides / target proteins, preferably corresponds to this distance.
22. Wirkstoff nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Zwischenglied um eine Poly-Glycin- oder Poly-Alanin-Kette handelt.22. Active ingredient according to claim 20 or claim 21, characterized in that the intermediate link is a poly-glycine or poly-alanine chain.
23. Wirkstoff nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise ein rekombiniertes Nukleinsäuremolekül, handelt, das für mindestens eine nach mindestens einem der Verfahrens- ansprüche 1 bis 16 erhältliche Aminosäuresequenz kodiert.23. Active ingredient according to claim 17, characterized in that it is a nucleic acid molecule, preferably a recombined nucleic acid molecule, which codes for at least one amino acid sequence obtainable according to at least one of process claims 1 to 16.
24. Wirkstoff nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuremolekül ein DNA-Molekül, cDNA-Molekül oder RNA-Molekül ist.24. Active ingredient according to claim 23, characterized in that the nucleic acid molecule is a DNA molecule, cDNA molecule or RNA molecule.
25. Wirkstoff nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er in Form eines sogenannten Vektors vorliegt, der ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 23 oder 24 trägt.25. Active ingredient according to claim 17, characterized in that it is in the form of a so-called vector which carries a nucleic acid molecule according to one of claims 23 or 24.
26. Wirkstoff nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vektor um einen viralen Vektor handelt.26. Active ingredient according to claim 25, characterized in that the vector is a viral vector.
27. Wirkstoff nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Virus um eine Retrovirus, ein Adenovirus oder ein Adeno-assoziiertes Virus handelt. 2527. Active ingredient according to claim 26, characterized in that the virus is a retrovirus, an adenovirus or an adeno-associated virus. 25th
28. Wirkstoff nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vektor um einen nicht-viralen Vektor handelt.28. Active ingredient according to claim 25, characterized in that the vector is a non-viral vector.
29. Wirkstoff nach Anspruch 23 oder Anspruch 24., dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein in ein Liposom oder einen Lipoplex verpacktes Nukleinsäuremolekül handelt.29. Active ingredient according to claim 23 or claim 24, characterized in that it is a nucleic acid molecule packaged in a liposome or a lipoplex.
30. Pharmazeutische Zusammensetzung oder Medikament, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen Wirkstoff nach einem der Ansprüche 17 bis 29 in einer wirksamen Menge und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält. 30. Pharmaceutical composition or medicament, characterized in that it contains at least one active ingredient according to one of claims 17 to 29 in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991019818A1 (en) * 1990-06-20 1991-12-26 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
WO1996023899A1 (en) * 1995-02-01 1996-08-08 University Of Massachusetts Medical Center Methods of selecting a random peptide that binds to a target protein
WO1997020078A1 (en) * 1995-11-30 1997-06-05 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
WO1997027212A1 (en) * 1996-01-23 1997-07-31 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods for screening for transdominant intracellular effector peptides and rna molecules

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5077195A (en) * 1985-03-01 1991-12-31 Board Of Reagents, The University Of Texas System Polypeptides complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known and methods of design therefor
JPH05506774A (en) * 1990-02-14 1993-10-07 リセプター　ラボラトリーズ　インコーポレーテッド Methods for producing and screening beneficial peptides
AU664385B2 (en) * 1991-08-21 1995-11-16 Receptor Laboratories, Inc. Method for generating and screening useful peptides
DE4343527A1 (en) * 1993-12-16 1995-06-22 Schering Ag Process for the identification of substances with potential herbicidal or growth-regulating effects by means of vegetable transporter proteins, use of the transporter proteins as well as substances with herbicidal and growth-regulating effects
JP2000508761A (en) * 1996-03-30 2000-07-11 メディカル、リサーチ、カウンシル Interaction of protein phosphatase-1 catalytic subunit

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991019818A1 (en) * 1990-06-20 1991-12-26 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
WO1996023899A1 (en) * 1995-02-01 1996-08-08 University Of Massachusetts Medical Center Methods of selecting a random peptide that binds to a target protein
WO1997020078A1 (en) * 1995-11-30 1997-06-05 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
WO1997027212A1 (en) * 1996-01-23 1997-07-31 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods for screening for transdominant intracellular effector peptides and rna molecules

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