WO1996005227A1 - Peptides inhibiting the cholesterol ester transfer protein and therapeutic uses thereof - Google Patents

Peptides inhibiting the cholesterol ester transfer protein and therapeutic uses thereof Download PDF

Info

Publication number
WO1996005227A1
WO1996005227A1 PCT/FR1995/001076 FR9501076W WO9605227A1 WO 1996005227 A1 WO1996005227 A1 WO 1996005227A1 FR 9501076 W FR9501076 W FR 9501076W WO 9605227 A1 WO9605227 A1 WO 9605227A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
pep
amino acids
seq
cetp
Prior art date
Application number
PCT/FR1995/001076
Other languages
French (fr)
Inventor
Klaus Büttner
Jean-Louis Dasseux
Original Assignee
Laboratoires Fournier S.C.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratoires Fournier S.C.A. filed Critical Laboratoires Fournier S.C.A.
Publication of WO1996005227A1 publication Critical patent/WO1996005227A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates, as new products, to peptides, fragments of the apoprotein AU (apoAII), and to their use in therapy, in particular for the treatment of dyslipidemias and the prevention of cardiovascular diseases.
  • apoAII apoprotein AU
  • cardiovascular diseases represent the main cause of mortality and constitute a major problem, both clinical and economic, in public health.
  • HDL plays an important role in "Reverse Cholesterol Transport” (RCT), that is to say, in the excretion of peripheral cellular cholesterol by promoting the transfer of this to the liver for elimination.
  • RCT Reverse Cholesterol Transport
  • Apoprotein AI is the major protein in HDL, it combines with phospholipids to form a soluble complex capable of hosting lipids and in particular cholesterol. Most of the apoproteins (including apoAI) and phospholipids constituting HDL are derived from lipoproteins rich in triglycerides (TG). During their stay in the plasma compartment, the HDLs will incorporate apoproteins (apoAI, apoAII, apo C's, ...) originating from the metabolism of lipoproteins rich in TG and phos ⁇ pholipids (PL) resulting from the lipolysis of VLDL (lipoproteins very low density) and chylomicrons.
  • TG triglycerides
  • LCAT Lecithin Cholesterol Acyl Transferase
  • CETP cholesterol ester transfer protein
  • VLDLs are catabolized, the remaining particle can be recycled to promote the efflux of cellular cholesterol or else be degraded via a binding site in the liver (the hypothetical HDL receptor to date has not been characterized).
  • VLDLs are metabolized into smaller particles, "remnant VLDLs" whose composition in phospho ⁇ lipids (PL), in TG and in apoproteins is modified following the different exchanges between lipoproteins. . Either these particles are eliminated after interaction with specific receptors, or they continue to accumulate CE, deplete in TG and become denser particles: low density lipoproteins (LDL).
  • LDL is characterized by the majority presence of a single apoprotein (apo B) and a CE-rich nucleus surrounded by a layer of phospholipids and cholesterol. LDL is eliminated from plasma by two routes, one regulated by a receptor, the other independent of a receptor. In a normal subject, one third of LDL is eliminated daily via a high affinity receptor, while about two thirds is eliminated by non-specific mechanisms. After interacting with a specific receptor recognizing apo B, LDL is internalized and degraded in the liver or other tissues.
  • apo B apoprotein
  • LDL is susceptible to oxidation. These oxidized LDLs (ox-LDL) are then recognized by a receptor on the surface of endothelial cells and macrophages. The internalization of these oxidized LDLs leads to the formation of cells rich in CE, the foam cells which participate in the formation of atheroma plaques.
  • animals with low CETP activity are resistant to atherosclerosis induced by a fatty diet.
  • apoAI and apoAII have been the subject of various publications such as Ohnishi (Biochemistry, 1993, 32, 5029-5035) which attributes an activating character to apoAI and apoAII in the transfer of plasma lipids, while Rye (J . Lipid Res., 1992, _3_, 215-224) and Lagrost (J. Biol. Che., 1994, 2 £ 9_, 3189-3197) seem to demonstrate an inhibitory role of apoAII on the activity of CETP.
  • the determination of the role of apoAII has been attempted using transgenic mice which express human apoAII in significant quantities and which develop atherosclerotic plaques when they are subjected to a fatty or high cholesterol diet (Nature, 1993, 365. 762-764). However, it should be noted that the presence of CETP has never been demonstrated in mice.
  • Patent application JP-A-63-237,795 which describes a process for manufacturing apoAII also suggests its use in the study and therapy of hyperlipidemias.
  • PCT patent application WO 87/02062 suggests using the amphiphylic portions of apoproteins to promote the reverse transport of cholesterol.
  • the present invention provides, as new products, fragments of the apoprotein AU (apoAII) which have the property of inhibiting the activity of CETP and which, because of this property, can be used to manufacture medicaments allowing to fight against dyslipidemia and the consequences which are linked to it, such as atherosclerosis and its vascular complications, in particular coronary.
  • apoAII fragments of the apoprotein AU
  • the present invention relates to peptides whose structure corresponds to the general formula:
  • - Pep represents the fragment 27-77, of the apoprotein AU (obtained by the action of cyanogen bromide on the apoprotein AU) and corresponds to the sequence:
  • - ⁇ Cy represents a deletion of the y C-terminal amino acids.
  • - y represents an integer between 0 and 4 (these values being included).
  • ⁇ N10 Pep means that it is the fragment corresponding to a deletion of the 10 N-terminal amino acids of the sequence SEQ ID No. 1, the C-terminal end not having been modified; this peptide therefore corresponds to fragment 37-77 of the primary structure of apo AH.
  • the peptides according to the invention are CETP inhibitors. Another object of the invention is the use of at least one of these peptides for the manufacture of a medicament useful for the treatment or prevention of hypercholesterolemia and the effects which are linked to it such as for example atherosclerosis and its complications, including cardiovascular accidents. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the peptides according to the invention can be synthesized using most of the peptide synthesis techniques available today. In general, these techniques involve a synthesis, step by step, allowing the successive addition of each amino acid to the polypep ⁇ dique chain which is gradually growing. Peptide synthesis can also be carried out by condensing several peptide fragments and / or using enzymes under specific conditions (such as proteases in an organic medium).
  • the amino acids are linked together by condensation between the carbonyl group of one amino acid and the amm group of the other amino acid, to form the peptide bond.
  • the protective groups are chosen so as to be easily eliminated and so as not to have a negative influence (in particular racemization or hydrolysis of the peptide bonds formed) on the synthesis of the polypeptides.
  • Certain amino acids have other functional groups on a side chain, such as for example the hydroxyl group of tyrosine. It is usually necessary to block these functional groups with protective groups, which are easy to eliminate once the synthesis of the polypeptide is complete, in such a way that they do not interfere during the formation of the peptide bonds.
  • the preferred method in this invention is that of pep- tide synthesis in solid phase described by R.B. Merrifield adapted so as to use amino acids protected in position N. ⁇ . by a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc).
  • SPPS is based on the sequential addition of protected amino acids N. ⁇ , having if necessary the side chains protected by appropriate groups, on an insoluble polymeric support (the resin) in order to obtain a peptide having its C end -terminal attached to the support by means of an arm.
  • the Fmoc strategy employs an orthogonal system where the protective group of the amine in ⁇ is labile under basic conditions and the peptide - resin bond, as well as the protective groups of the side chains, are labile under acid conditions.
  • Fmoc synthesis begins from the C-terminus towards the N-terminus.
  • the amino acids have their ⁇ -amino group protected by a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc) and the side chains by another group such as for example in the case of tyrosine a t-butyl group. Since all the peptides of this invention have a free terminal carboxyl group, a Wang resin is used as a solid support for each synthesis. Wang's resin makes it possible to obtain, after cutting in acidic medium, the peptide with a free terminal carboxylic group. In addition, she is commercially available (Novabiochem or Saxon Biochemicals) with the first amino acid in the C-terminal position already attached.
  • Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group
  • the first step is the deprotection of the protective group of the amine in ⁇ with a dilute solution (20%) of piperidine in N-methyl-pyrrolidone (NMP). This results in obtaining an ⁇ -amino group which is deprotected.
  • the second step is the coupling reaction which makes it possible to introduce an amino acid whose amino function ⁇ is protected by an Fmoc group.
  • Different coupling methods are possible, among which the use of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) is preferred in order to form the activated ester of the amino acid to be coupled.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • HOBT 1-hydroxybenzotriazole
  • the synthesis is carried out by repeating this cycle for the addition of each amino acid to the peptide.
  • the final separation of the peptide from the resin and the elimination of protective groups from the side chains (deprotection) are carried out at room temperature for three hours in a solution containing 90% trifluoroacetic acid and protective molecules or scavengers, (5% anisol, 2% water, 3% dodecanethiol), for example to prevent / evr-butylation caused by the generation of / e / r-butyl cations.
  • the detailed protocol is given in the experimental part which follows. EXPERIMENTAL PART
  • the second amino acid is a threonine.
  • An L-threomne protected on the amino function by an Fmoc group and on the alcohol function by a t-butyl group is used here.
  • the condensation of the free acid function on the free amino function of glutamine carried by the Wang resin is made after activation of the acid function in the presence of DCC (dicyclohexycarbodnmide) and of HOBT (1-hydroxy-benzot ⁇ azole).
  • the resin After treatment with the reaction mixture, the resin is washed with N-methylpyrrolidone. To ensure a good condensation yield, the resin is brought into contact with the reactive mixture again and then washed again.
  • the coupling mixture is renewed with a fresh mixture. This method makes it possible to obtain very high coupling yields, which is necessary during the synthesis of long peptides.
  • the different amino acids used are all protected by an Fmoc group on the amino at ⁇ of the acid.
  • the side chains are protected by groups resistant to basic agents: t-butyl ether for the alcohol functions of the se ⁇ ne, threonine and tyrosine, t-butyl ester for the side acid functions of the aspartic and glutamic acids, Boc ( t-butyloxycarbonyl) for the lateral amm function of lysine, and t ⁇ tyle for the amide tones of asparagine and glutamine.
  • the crude peptide is dissolved in a mixture of acetonitrile and an aqueous solution of guanidine hydrochloride 8M and then purified by reverse phase chromatography under pressure on grafted silica gel type RP18, eluting with a gradient consisting of water at 0 , 1% trifluoroacetic acid (A) and acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (B), the composition varying from 20 to 70% B over a period of 50 min.
  • A trifluoroacetic acid
  • B acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid
  • the fixing of said first amino acid on the WANG type resin can be carried out as follows: ⁇ ) coupling of the first amino acid on the WANG type resin is produced in the presence of an esterification catalyst, dimethylaminopyridine (DMAP) of the condensing agent dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and hydroxybenzotriazole HOBT: or, ⁇ ) a mixture of 1 equivalent in amino acid, 1 equivalent in 2- (1H- benzotriazole-1-yl) -l, l, 3,3-tetramethyluroniurn hexafluorophosphate
  • DMAP dimethylaminopyridine
  • DCC condensing agent dicyclohexylcarbodiimide
  • HOBT hydroxybenzotriazole HOBT
  • fragment 17-30 and fragment 51-60 are fragments of apoAII described in WO87-02062 as being agents favorable to the reverse transport of cholesterol.
  • fragment 1-38 apoCl is a fragment of the apo Cl of baboon, described as a CETP inhibitor by RS Kushwaha (J. Lipid Res., 1993. 3A 1285-1297).
  • the peptides according to SEQ ID No. 1 are all new, except those for which the couple (x, y) has the following values (0.0); (13.0); (20.0); (23.0); (25.0); (27.0); (28.0); (29.0); (30.0) and (31.0).
  • the peptides according to the invention can also be prepared by other techniques known in chemistry or by genetic engineering methods.
  • the peptides can be synthesized and produced by cultures of bacteria, yeasts or animal cells containing a DNA fragment coding for the peptide and the DNA sequences necessary for its expression. BIOLOGICAL ACTIVITY
  • the peptides according to the invention were evaluated as to their therapeutic potential for the treatment of hypercholesterolemias, by a measurement of their inhibitory power vis-à-vis the activity of CETP.
  • HDLs are used combined with tritium-labeled cholesterol esters ( ⁇ H-CE-HDL) which are incubated in the presence of LDL, CETP and peptides according to the invention.
  • ⁇ H-CE-HDL tritium-labeled cholesterol esters
  • the transfer of cholesterol esters from HDL to LDL is measured by counting the radioactivity in the supernatant. This method makes it possible to evaluate the inhibitory power of the various peptides with respect to the activity of CETP.
  • Identical measurements were made with apoAII and the products known from the prior art.
  • the inhibitory power was first evaluated for apoAII at different concentrations: the measurement shows that the inhibition increases with the concentration and that an almost total inhibition is reached beyond a concentration of 20 ⁇ M.
  • the values obtained are given in FIG. 1 in which the inhibition is shown on the ordinate (0% represents an absence of inhibition, that is to say that the activity of the CETP is not disturbed and 100 % represents a total inhibition of CETP, that is to say that the values obtained are found in the absence of CETP), as a function of the concentration of apoAII in the incubation medium.
  • the peptides according to the invention were evaluated at a concentration of 20 ⁇ M, ie the concentration at which apoAII reaches its maximum activity.
  • the concentration of each of the peptides is determined by absorption spectrometry at 276 nm using the molar extinction coefficients of 1450 M "lcm ⁇ l for the peptides comprising a tyrosine, 2900 M ' ⁇ c " ⁇ for the peptides with 2 Tyrosine remains. 5945 M ' ⁇ cm ' l for apoAII of human origin, and 5400 M ' ⁇ cm' ⁇ for the baboon apoCl fragment known from the prior art. The concentration of fragments 17-30 and 51-60 of apoAII (known products) is determined by weighing. b) Preparation of the CETP
  • LPDS Human serum lacking in lipoprotein
  • LPDS Human serum lacking in lipoprotein
  • a fraction enriched in CETP is obtained from the LPDS by different successive chromatographies: hydrophobic interaction chromatography (PHENYL SEPHAROSE®, Pharmacia), adsorption chromatography (HYDROXYLAPATITE®, HA, Biorad) and ion exchange chromatography ( MONO Q ION EXCHANGE®, Pharmacia).
  • the LPDS is saturated with solid NaCl, then deposited on a column of
  • the aqueous fraction after chromatography on PHENYL SEPHAROSE® is concentrated on a YM 30 membrane (Amicon) to obtain a volume of 250 ml and then NaCl is added so as to obtain a concentration of 2 M.
  • This fraction is chromatographed on a column of 50 ml of PHENYL SUPEROSE® (Pharmacia) at a flow rate of 5 ml / minute.
  • CETP is then eluted with pure water (as above).
  • the specific activity of CETP is from 3.0 to 3.4 ⁇ 10 ⁇ 7 mole of CE transferred per milligram of protein per hour.
  • Apoprotein AU is purified from a preparation containing proteins extracted from HDL.
  • HDLs are isolated from 1 liter of fresh human plasma by two consecutive ultracentrifugations (45 Ti rotor, 40,000 ⁇ m, 20 ° C), one at a density of 1.07 for at least 24 hours, the other at a density of 1.25 for 48 hours (the densities are adjusted by the addition of solid KBr).
  • the fraction containing the HDLs is then chromatographed on a column of 40 ml of CONCANAVALIN® A (Pharmacia) in order to remove the Apoprotein E and the contaminating traces of apoprotein B.
  • the proteins in solution in approximately 50 ml of water are extracted from HDL by three successive delipidatio ⁇ s using ethanol / ether mixtures (at the rate of two liters of mixture for HDL from a liter of plasma for the first two and a liter of mixture for the HDLs coming from a liter of plasma in the last) whose ether concentration increases (3/1, 1/1, 1/3. V / V).
  • the organic phase is removed by decantation; during the other two it is removed by centrifugation.
  • the proteins are washed with pure ether.
  • the HDL labeled with cholesterol esters t ⁇ ties are prepared by incubating the purified HDL in the presence of vesicles of phosphatidylcho ne egg yolk (EPC) containing ⁇ H-CE.
  • EPC phosphatidylcho ne egg yolk
  • 8 mg of EPC are dissolved in 20 ml of p-xylene to which 9.25 MBq of ⁇ H-CE (Amersham-Buchler) are added in 250 ⁇ l of toluene. After freezing the mixture is lyophilized.
  • the EPC - ⁇ H-CE mixture is dispersed in 4 ml of 10 mM buffer
  • T ⁇ s, 150 mM NaCl at pH 7 4 then treated with an ultrasonic probe for 5 minutes at 10 ° C. The ultrasonic treatment is repeated 6 times until the mixture becomes clear.
  • preservatives (1 mM pCMB (p-chloromercurobenzoic acid), 10 mM DTNB (5,5'-d ⁇ th ⁇ o-b ⁇ s- (2-n ⁇ trobenzo ⁇ que) acid), 10 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid
  • the transfer reaction of the cholesterol esters between the lipoproteins is stopped by adding 500 ⁇ l of a solution of magnesium phosphotungstate (PTA) (final concentration: 0.048% PTA, 12 mM Mg2 + ).
  • PTA magnesium phosphotungstate
  • the precipitated LDLs are removed by centrifugation and the radioactivity of the supernatant is measured using a liquid scintillation counter (10 ml of scintillation liquid is added to the supernatant and the counting is carried out for 10 min). Under these conditions, the activity of CETP alone corresponds to 1.89 ⁇ 10 ⁇ 10 mol of CE transferred from HDL to LDL per hour.
  • the first measurement S represents the radioactivity in dpm measured in the supernatant of the test containing the lipoproteins, the CETP and the peptide (modified activity of the CETP).
  • the second measurement S represents the radioactivity in dpm measured in the supernatant of the test containing the lipoproteins and the CETP (normal activity of the CETP).
  • the third measure B represents the radioactivity in dpm measured in the supernatant of the test containing only the lipoproteins
  • the fourth measurement B2 represents the radioactivity in dpm measured in the supernatant of the test containing the lipoproteins and the peptide (blank control in the presence of the peptide).
  • the normal activity of CETP is represented by the difference B ] -S t
  • the modified activity of CETP in the presence of the peptide is represented by the difference B2-S 1 (this value is directly proportional to the modified activity of CETP and suppresses any activity which could be due to the peptide alone).
  • a non-inhibitory peptide will allow a transfer of CE identical to that which is observed in the presence of CETP alone and the relative value will be 100%.
  • a highly inhibitory peptide completely suppresses the transfer (all the radioactivity is retained in the supernatant) and a relative value of 0% is obtained.
  • results of these measurements are represented in the form of a graph in FIG. 1 which indicates on the ordinate the inhibitory activity obtained as a function of the concentration of apoAII.
  • the tests carried out with the peptides according to the invention were carried out at a concentration of 20 ⁇ M.
  • the results obtained are reported in Table II in which the peptides according to the invention indicated in examples appear and the three prior art products mentioned previously.
  • the IN value has been indicated (activity inhibiting power CETP) and the INR value which expresses the inhibitory power of peptides compared to the inhibitory power of apoAII at a concentration of 20 ⁇ M.
  • the peptides according to the invention are CETP inhibitors and therefore their ability to slow down or inhibit the transfer of cholesterol, glycosides, esters of retinol or phospholipids can be used to make active p ⁇ ncipes of drugs.
  • compositions containing one or more peptides according to the invention in a therapeutically effective amount and in association with a physiologically acceptable excipient.
  • compositions are preferably intended for the preventive or curative treatment of conditions linked to hypercholesterolemia.
  • compositions find their preferred use in the prophylaxis of atheroma plaques. the regression of atherosclerotic plaques and the reduction of the risks of cardiovascular accidents.
  • NAME LABORATOIRES FOURNIER S.C.A.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

The invention discloses a peptide which is a fragment of apoprotein AII, having the formula ΔNx Pep ΔCy, wherein Pep is the 27-77 fragment of apoprotein AII (monomeric form) and corresponds to the sequence EKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSY FVELGTQPAT Q, ΔNx is a deletion of x N-terminal amino acids of the Pep peptide as defined above, ΔCy is a deletion of y C-terminal amino acids of the Pep peptide as defined above, x is an integer of 0 to 31 inclusive, and y is an integer of 0 to 4 inclusive. The peptide of the invention is useful for example in the treatment of dyslipidemias.

Description

PEPTIDES INHIBITEURS DE LA PROTEINE DE TRANSFERT DES ESTERS DE CHOLESTEROL ET LEUR UTILISATION EN THERAPEUTIQUE.PEPTIDES INHIBITORS OF CHOLESTEROL ESTER TRANSFER PROTEIN AND THEIR USE IN THERAPEUTICS.
DOMAINE DE L 'INVENTIONFIELD OF THE INVENTION
La présente invention concerne en tant que produits nouveaux des peptides, fragments de l'apoprotéine AU (apoAII), et leur utilisation en thérapeutique, notamment pour le traitement des dyslipidémies et la prévention des maladies cardio-vasculaires. ART ANTERIEURThe present invention relates, as new products, to peptides, fragments of the apoprotein AU (apoAII), and to their use in therapy, in particular for the treatment of dyslipidemias and the prevention of cardiovascular diseases. PRIOR ART
Dans les pays industrialisés, les maladies cardio-vasculaires repré¬ sentent la principale cause de mortalité et constituent un problème majeur, à la fois clinique et économique, en santé publique.In industrialized countries, cardiovascular diseases represent the main cause of mortality and constitute a major problem, both clinical and economic, in public health.
Plusieurs études épidémiologiques montrent que l'un des principaux facteurs de risque est une concentration sérique élevée en cholestérol associé aux lipoprotéines de faible densité (LDL-chol). Elles indiquent aussi que le risque de développer une maladie cardio-vasculaire est inversement proportionnel à la con¬ centration sérique en lipoprotéines de forte densité (les HDL). Cependant, il est difficile de déterminer si les concentrations élevées de HDL sont la conséquence d'une activité métabolique anti-athérogène ou si les HDL sont directement impliquées dans la prévention de l'athérome.Several epidemiological studies show that one of the main risk factors is a high serum cholesterol concentration associated with low density lipoproteins (LDL-chol). They also indicate that the risk of developing a cardiovascular disease is inversely proportional to the serum concentration in high density lipoproteins (HDL). However, it is difficult to determine whether the high concentrations of HDL are the consequence of an anti-atherogenic metabolic activity or whether HDL is directly involved in the prevention of atheroma.
Les HDL joueraient un rôle important dans le "Reverse Cholestérol Transport" (RCT), c'est à dire, dans l'excrétion du cholestérol cellulaire périphérique en favorisant le transfert de celui-ci vers le foie pour élimination. Les cellules intestinales et hépatiques sécrètent dans le flux sanguin desHDL plays an important role in "Reverse Cholesterol Transport" (RCT), that is to say, in the excretion of peripheral cellular cholesterol by promoting the transfer of this to the liver for elimination. Intestinal and liver cells secrete into the bloodstream of
HDL naissantes. L'apoprotéine AI (apoAI) est la protéine majoritaire des HDL, elle s'associe aux phospholipides pour former un complexe soluble susceptible d'accueillir des lipides et en particulier du cholestérol. La majeure partie des apoprotéines (dont l'apoAI) et des phospholipides constituant les HDL est issue des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Durant leur séjour dans le compartiment plasmatique, les HDL vont incorporer des apoprotéines (apoAI, apoAII, apo C's,...) provenant du métabolisme des lipoprotéines riches en TG et des phos¬ pholipides (PL) résultant de la lipolyse des VLDL (lipoprotéines de très faible densité) et des chylomicrons. Elles vont aussi acquérir du cholestérol provenant des cellules des tissus extrahépatiques et d'autres lipoprotéines. L'efflux du cholestérol des cellules périphériques (non hépatiques) vers les HDL est la première étape du RCT. C'est une étape critique dans l'homéostasie du cholestérol puisque la plupart des cellules ne peuvent pas catabohser le cholestérol exogène qu'elles accumulent. Au sein des HDL, la "Lecithin Cholestérol Acyl Transferase" (LCAT) catalyse l'estérification du cholestérol. Cette réaction génère un potentiel de gra¬ dient de concentration en cholestérol entre les cellules extrahépatiques et les HDL qui favorise l'efflux cellulaire du cholestérol. La LCAT est responsable de la formation de la majorité des esters de cholestérol présents dans le plasma. Ces esters constituent la forme principale sous laquelle le cholestérol est transporté dans le plasma.Emerging HDL. Apoprotein AI (apoAI) is the major protein in HDL, it combines with phospholipids to form a soluble complex capable of hosting lipids and in particular cholesterol. Most of the apoproteins (including apoAI) and phospholipids constituting HDL are derived from lipoproteins rich in triglycerides (TG). During their stay in the plasma compartment, the HDLs will incorporate apoproteins (apoAI, apoAII, apo C's, ...) originating from the metabolism of lipoproteins rich in TG and phos¬ pholipids (PL) resulting from the lipolysis of VLDL (lipoproteins very low density) and chylomicrons. They will also acquire cholesterol from extrahepatic tissue cells and other lipoproteins. The efflux of cholesterol from peripheral (non-liver) cells to HDL is the first step in RCT. This is a critical step in cholesterol homeostasis since most cells cannot catabolize the exogenous cholesterol they accumulate. Within HDL, "Lecithin Cholesterol Acyl Transferase" (LCAT) catalyzes the esterification of cholesterol. This reaction generates a potential of cholesterol concentration between the extrahepatic cells and the HDL which promotes the cellular efflux of cholesterol. LCAT is responsible for the formation of the majority of cholesterol esters found in plasma. These esters are the main form in which cholesterol is transported in the plasma.
Ceci va conduire à la formation de HDL matures, sphériques et ayant une taille accrue. Les HDL subissent alors l'action de différentes protéines comme la lipase hépatique et la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP). La CETP est une glycoprotéine de 74000 Da responsable du transfert des esters de cholestérol (CE), formés par la LCAT au sein des HDL, vers les lipoprotéines contenant l'apoprotéine B, comme les lipoprotéines riches en TG, les VLDL et les chylomicrons. Comme le transfert des CE se fait en échange du transfert des TG, les HDL se retrouvent enrichies en TG. Elles deviennent un substrat pour des enzymes lipolytiques comme la lipase hépatique qui métabohse les TG en acide gras.This will lead to the formation of mature, spherical and heightened HDLs. HDL then undergoes the action of various proteins such as hepatic lipase and the cholesterol ester transfer protein (CETP). CETP is a 74,000 Da glycoprotein responsible for the transfer of cholesterol esters (CE), formed by LCAT within HDL, to lipoproteins containing apoprotein B, such as lipoproteins rich in TG, VLDL and chylomicrons. As the transfer of CE is done in exchange for the transfer of TG, HDLs are enriched in TG. They become a substrate for lipolytic enzymes like hepatic lipase which metabolizes TG into fatty acid.
Alors que les lipides des HDL sont catabolisés, la particule restante peut être recyclée pour favoriser l'efflux du cholestérol cellulaire ou bien être dégradée via un site de fixation au niveau du foie (l'hypothétique récepteur des HDL n'ayant à ce jour pas été caractérisé). Sous l'action de la CETP et des lipases, les VLDL sont métabolisées en particules plus petites, les "VLDL remnants" dont la composition en phospho¬ lipides (PL), en TG et en apoprotéines est modifiée suite aux différents échanges entre les lipoprotéines. Soit ces particules sont éliminées après interaction avec des récepteurs spécifiques, soit elles continuent à accumuler du CE, à s'appauvrir en TG et deviennent des particules plus denses : les lipoprotéines de faible densité (les LDL).While the HDL lipids are catabolized, the remaining particle can be recycled to promote the efflux of cellular cholesterol or else be degraded via a binding site in the liver (the hypothetical HDL receptor to date has not been characterized). Under the action of CETP and lipases, VLDLs are metabolized into smaller particles, "remnant VLDLs" whose composition in phospho¬ lipids (PL), in TG and in apoproteins is modified following the different exchanges between lipoproteins. . Either these particles are eliminated after interaction with specific receptors, or they continue to accumulate CE, deplete in TG and become denser particles: low density lipoproteins (LDL).
Les LDL se caractérisent par la présence majoritaire d'une seule apoprotéine, (l'apo B) et d'un noyau riche en CE entouré par une couche de phospholipides et de cholestérol. Les LDL sont éliminées du plasma par deux voies, l'une régulée par un récepteur, l'autre indépendante d'un récepteur. Chez un sujet normal, chaque jour, un tiers des LDL est éliminé par l'intermédiaire d'un récepteur à haute affinité, tandis que les deux tiers environ sont éliminés par des mécanismes non-spécifiques. Après avoir interagi avec un récepteur spécifique reconnaissant l'apo B, les LDL sont internalisées et dégradées au niveau du foie ou d'autres tissus.LDL is characterized by the majority presence of a single apoprotein (apo B) and a CE-rich nucleus surrounded by a layer of phospholipids and cholesterol. LDL is eliminated from plasma by two routes, one regulated by a receptor, the other independent of a receptor. In a normal subject, one third of LDL is eliminated daily via a high affinity receptor, while about two thirds is eliminated by non-specific mechanisms. After interacting with a specific receptor recognizing apo B, LDL is internalized and degraded in the liver or other tissues.
Les LDL sont susceptibles d'être oxydées. Ces LDL oxydées (ox-LDL) sont alors reconnues par un récepteur à la surface des cellules endothéliales et des macrophages. L'intemalisation de ces LDL oxydées conduit à la formation de cellules riches en CE, les cellules spumeuses qui participent à la formation des plaques d'athérome.LDL is susceptible to oxidation. These oxidized LDLs (ox-LDL) are then recognized by a receptor on the surface of endothelial cells and macrophages. The internalization of these oxidized LDLs leads to the formation of cells rich in CE, the foam cells which participate in the formation of atheroma plaques.
Les modifications du profil lipoprotéique résultant de l'activité de la CETP suggèrent que celle-ci pourrait être impliquée dans l'athérogénèse. Cette analyse est renforcée par plusieurs observations :The changes in the lipoprotein profile resulting from the activity of CETP suggest that it may be involved in atherogenesis. This analysis is reinforced by several observations:
A l'exception du cochon, les animaux ayant une activité CETP faible sont résistants à l'athérosclérose induite par un régime alimentaire gras.With the exception of pigs, animals with low CETP activity are resistant to atherosclerosis induced by a fatty diet.
L'injection d'anticorps neutralisants dirigés contre la CETP chez le lapin augmente les CE dans les HDL et diminue les TG dans les HDL. Les souris transgéniques exprimant la CETP ont un profil lipoprotéique modifié, associé avec le développement de plaques d'athérome. Plusieurs observations cliniques tendent à montrer que, chez l'homme, une activité CETP élevée est corrélée avec un risque athérogène accru. Enfin, les personnes déficientes en CETP sont caractérisées par un profil peu athérogène, c'est à dire des concentrations faibles en LDL et élevées en HDL. Pour plus de détails concernant le rôle de la CETP, on pourra se reporter à des articles tels que Swenson (Current. Opin. Lipid., 1992, 3_, 67-74 ) ou Tall (J. Lipid Res., 1993, 14, 1255-1274).The injection of neutralizing antibodies against CETP in rabbits increases the EC in HDL and decreases the TG in HDL. The transgenic mice expressing CETP have a modified lipoprotein profile, associated with the development of atheroma plaques. Several clinical observations tend to show that, in humans, a high CETP activity is correlated with an increased atherogenic risk. Finally, people deficient in CETP are characterized by a low atherogenic profile, that is to say low LDL and high HDL concentrations. For more details concerning the role of the CETP, one can refer to articles such as Swenson (Current. Opin. Lipid., 1992, 3_, 67-74) or Tall (J. Lipid Res., 1993, 14, 1255-1274).
L'identification des facteurs régulant l'activité de la CETP présente un grand intérêt afin de développer des médicaments pour lutter contre les maladies cardio-vasculaires et 1 ' athérosclérose .The identification of factors regulating the activity of CETP is of great interest in order to develop medicaments for combating cardiovascular diseases and atherosclerosis.
En particulier, l'inhibition de l'activité de la CETP semble être un élément favorable au traitement ou à la prévention de l'athérosclérose. Par exemple il a été suggéré dans le brevet US-A-5279540 d'éliminer la CETP du flux sanguin afin de réduire le risque athéromateux. Une autre voie d'approche est proposée dans la demande PCT WO 93/11782 qui préconise l'administration de peptides dérivés de la fraction N-terminale de l'apolipoprotéine Cl de babouin pour inhiber l'activité de la CETP et ainsi diminuer le risque d'athérosclérose, ou dans la demande PCT WO 93/ 15198 qui utilise des polypeptides dérivés de l'apoprotéine AIV pour le traitement des hypercholestérolémies ou pour diminuer les risques d'accidents coronariens, sans toutefois préciser un mode d'action lié à la CETP.In particular, inhibition of the activity of CETP seems to be a favorable element for the treatment or prevention of atherosclerosis. For example, it has been suggested in US Pat. No. 5,279,540 to eliminate CETP from the blood stream in order to reduce the risk of atherosclerosis. Another approach is proposed in PCT application WO 93/11782 which recommends the administration of peptides derived from the N-terminal fraction of baboon apolipoprotein C1 to inhibit the activity of CETP and thus reduce the risk of atherosclerosis, or in PCT application WO 93/15198 which uses polypeptides derived from the apoprotein AIV for the treatment of hypercholesterolaemia or to reduce the risk of coronary accidents, without however specifying a mode of action linked to CETP.
Le rôle des apoAI et apoAII a fait l'objet de diverses publications comme par exemple Ohnishi (Biochemistry, 1993, 32, 5029-5035) qui attribue un caractère activateur aux apoAI et apoAII dans le transfert des lipides plasmatiques, alors que Rye (J. Lipid Res., 1992, _3_, 215-224) et Lagrost (J. Biol. Che ., 1994, 2£9_, 3189-3197) semblent démontrer un rôle inhibiteur de l'apoAII sur l'activité de la CETP. La détermination du rôle de l'apoAII a été tentée à l'aide de souris transgéniques qui expriment l'apoAII humaine en quantité importante et qui développent des plaques d'athérosclérose quand elles sont soumises à un régime gras ou riche en cholestérol (Nature, 1993, 365. 762-764). Toutefois, il est à souligner que la présence de CETP n'a jamais été démontrée chez la souris.The role of apoAI and apoAII has been the subject of various publications such as Ohnishi (Biochemistry, 1993, 32, 5029-5035) which attributes an activating character to apoAI and apoAII in the transfer of plasma lipids, while Rye (J . Lipid Res., 1992, _3_, 215-224) and Lagrost (J. Biol. Che., 1994, 2 £ 9_, 3189-3197) seem to demonstrate an inhibitory role of apoAII on the activity of CETP. The determination of the role of apoAII has been attempted using transgenic mice which express human apoAII in significant quantities and which develop atherosclerotic plaques when they are subjected to a fatty or high cholesterol diet (Nature, 1993, 365. 762-764). However, it should be noted that the presence of CETP has never been demonstrated in mice.
La demande de brevet JP-A-63-237 795, qui décrit un procédé de fabrication de l'apoAII suggère également son utilisation dans l'étude et la thérapie des hyperlipidémies. D'une façon générale, la demande de brevet PCT WO 87/02062 suggère d'utiliser les portions amphiphyles d'apoprotéines pour favoriser le transport reverse du cholestérol.Patent application JP-A-63-237,795, which describes a process for manufacturing apoAII also suggests its use in the study and therapy of hyperlipidemias. In general, PCT patent application WO 87/02062 suggests using the amphiphylic portions of apoproteins to promote the reverse transport of cholesterol.
Par ailleurs, l'étude de l'apoAII a conduit certains auteurs comme S.J.T. Mao (Biochemistry, 1977, 16, 4150-4156 ; Biochemistry, 1981 , 2 , 1676- 1680 et Peptides, 1983, 4, 343-349) à préparer des fragments de l' apoAII afin d'identifier les sites d'interaction de l'apoAII avec les phospholipides. OBJET DE L 'INVENTIONIn addition, the study of apoAII has led certain authors such as S.J.T. Mao (Biochemistry, 1977, 16, 4150-4156; Biochemistry, 1981, 2, 1676-1680 and Peptides, 1983, 4, 343-349) to prepare fragments of apoAII in order to identify the interaction sites of apoAII with phospholipids. OBJECT OF THE INVENTION
La présente invention propose en tant que produits nouveaux, des fragments de l'apoprotéine AU (apoAII) qui ont la propriété d'inhiber l'activité de la CETP et qui, du fait de cette propriété, peuvent être utilisés pour fabriquer des médicaments permettant de lutter contre les dyslipidémies et les conséquences qui y sont liées, telles que l'athérosclérose et ses complications vasculaires notamment coronariennes.The present invention provides, as new products, fragments of the apoprotein AU (apoAII) which have the property of inhibiting the activity of CETP and which, because of this property, can be used to manufacture medicaments allowing to fight against dyslipidemia and the consequences which are linked to it, such as atherosclerosis and its vascular complications, in particular coronary.
La présente invention concerne les peptides dont la structure répond à la formule générale :The present invention relates to peptides whose structure corresponds to the general formula:
ΔNx Pep ΔCy (I) dans laquelle :ΔNx Pep ΔCy (I) in which :
- Pep représente le fragment 27-77, de l'apoprotéine AU (obtenu par action du bromure de cyanogène sur l'apoprotéine AU) et correspond à la séquence :- Pep represents the fragment 27-77, of the apoprotein AU (obtained by the action of cyanogen bromide on the apoprotein AU) and corresponds to the sequence:
EKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSYEKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSY
FVELGTQPAT QFVELGTQPAT Q
(SEQ ID No. 1) - ΔNx représente une délétion des x acides aminés N-terminaux(SEQ ID No. 1) - ΔNx represents a deletion of the X N-terminal amino acids
- ΔCy représente une délétion des y acides aminés C-terminaux.- ΔCy represents a deletion of the y C-terminal amino acids.
- x représente un nombre entier compris entre 0 et 31 (ces valeurs étant incluses),- x represents an integer between 0 and 31 (these values being included),
- y représente un nombre entier compris entre 0 et 4 (ces valeurs étant incluses).- y represents an integer between 0 and 4 (these values being included).
Dans la suite du texte, un produit noté par exemple "ΔN10 Pep" signifie qu'il s'agit du fragment correspondant à une délétion des 10 acides aminés N-terminaux de la séquence SEQ ID No. 1 , l'extrémité C-terminale n'ayant pas été modifiée ; ce peptide correspond donc au fragment 37-77 de la structure primaire de l'apo AH.In the following text, a product noted for example "ΔN10 Pep" means that it is the fragment corresponding to a deletion of the 10 N-terminal amino acids of the sequence SEQ ID No. 1, the C-terminal end not having been modified; this peptide therefore corresponds to fragment 37-77 of the primary structure of apo AH.
Les peptides selon l'invention sont des inhibiteurs de la CETP. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'un au moins de ces peptides pour la fabrication d'un médicament utile pour le traitement ou la prévention des hyper- cholestérolémies et des effets qui y sont liés comme par exemple l'athérosclérose et ses complications, notamment les accidents cardio-vasculaires. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les peptides selon l'invention peuvent être synthétisés en utilisant la plupart des techniques de synthèse peptidique aujourd'hui disponibles. D'une manière générale ces techniques impliquent une synthèse, étape par étape, permet¬ tant l'addition successive de chaque acide aminé à la chaîne polypepπdique qui croit progressivement. La synthèse peptidique peut aussi être réalisée par con- densation de plusieurs fragments peptidiques et/ou en utilisant des enzymes dans des conditions particulières (comme les protéases en milieu organique).The peptides according to the invention are CETP inhibitors. Another object of the invention is the use of at least one of these peptides for the manufacture of a medicament useful for the treatment or prevention of hypercholesterolemia and the effects which are linked to it such as for example atherosclerosis and its complications, including cardiovascular accidents. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The peptides according to the invention can be synthesized using most of the peptide synthesis techniques available today. In general, these techniques involve a synthesis, step by step, allowing the successive addition of each amino acid to the polypepπdique chain which is gradually growing. Peptide synthesis can also be carried out by condensing several peptide fragments and / or using enzymes under specific conditions (such as proteases in an organic medium).
Les acides aminés sont liés entre eux par condensation entre le groupement carbonyle d'un acide aminé et le groupement amme de l'autre acide aminé, pour former la liaison peptidique. Les groupements protecteurs sont choisis afin d'être éliminés facilement et pour ne pas influer négativement (notamment racémisation ou hydrolyse des liaisons peptidiques formées) sur la synthèse des polypeptides. Certains acides aminés ont d'autres groupements fonctionnels sur une chaîne latérale, comme par exemple le groupement hydroxyle de la tyrosine. Il est d'habitude nécessaire de bloquer ces groupements fonctionnels avec des grou- pements de protection, faciles à éliminer une fois la synthèse du polypeptide terminée, de telle manière qu'ils n'interfèrent pas lors de la formation des liaisons peptidiques.The amino acids are linked together by condensation between the carbonyl group of one amino acid and the amm group of the other amino acid, to form the peptide bond. The protective groups are chosen so as to be easily eliminated and so as not to have a negative influence (in particular racemization or hydrolysis of the peptide bonds formed) on the synthesis of the polypeptides. Certain amino acids have other functional groups on a side chain, such as for example the hydroxyl group of tyrosine. It is usually necessary to block these functional groups with protective groups, which are easy to eliminate once the synthesis of the polypeptide is complete, in such a way that they do not interfere during the formation of the peptide bonds.
Plusieurs méthodes ont été développées pour la synthèse peptidique.Several methods have been developed for peptide synthesis.
Elles sont caractérisées par différents protocoles d'activation et de coupure, ou par utilisation de différents groupements de protection, etc. Un grand nombre de groupements de protection ont été créés et optimisés en fonction des protocoles de synthèse.They are characterized by different activation and disconnection protocols, or by the use of different protection groups, etc. A large number of protection groups have been created and optimized according to synthesis protocols.
La plupart des techniques de synthèse peptidique sont applicables à cette invention. La méthode préférée dans cette invention est celle de la synthèse pep- tidique en phase solide décrite par R.B. Merrifield adaptée de manière à utiliser des acides aminés protégés en position N.α. par un groupement 9-fluorènyl- méthyloxycarbonyle (Fmoc).Most of the peptide synthesis techniques are applicable to this invention. The preferred method in this invention is that of pep- tide synthesis in solid phase described by R.B. Merrifield adapted so as to use amino acids protected in position N.α. by a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc).
Le concept fondamental de la synthèse peptidique en phase solideThe fundamental concept of solid phase peptide synthesis
(SPPS) est basé sur l'addition séquentielle d'acides aminés N.α protégés, ayant si nécessaire les chaînes latérales protégées par des groupements appropriés, sur un support polymérique insoluble (la résine) afin d'obtenir un peptide ayant son extrémité C-terminale attachée au support par l'intermédiaire d'un bras.(SPPS) is based on the sequential addition of protected amino acids N.α, having if necessary the side chains protected by appropriate groups, on an insoluble polymeric support (the resin) in order to obtain a peptide having its C end -terminal attached to the support by means of an arm.
La stratégie Fmoc emploie un système orthogonal où le groupement protecteur de l'aminé en α est labile en conditions basiques et la liaison peptide - résine, ainsi que les groupements protecteurs des chaînes latérales, sont labiles en conditions acides.The Fmoc strategy employs an orthogonal system where the protective group of the amine in α is labile under basic conditions and the peptide - resin bond, as well as the protective groups of the side chains, are labile under acid conditions.
La synthèse Fmoc commence de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale.Fmoc synthesis begins from the C-terminus towards the N-terminus.
Les acides aminés ont leur groupement α-aminé protégé par un groupement 9-fluorènylméthyloxycarbonyle (Fmoc) et les chaînes latérales par un autre groupement comme par exemple dans le cas de la tyrosine un groupement t- butyle. Comme tous les peptides de cette invention ont un groupement carboxy- lique terminal libre, une résine de Wang est utilisée comme support solide pour chaque synthèse. La résine de Wang, permet d'obtenir, après coupure en milieu acide, le peptide avec un groupement carboxvlique terminal libre. De plus, elle est disponible dans le commerce (Novabiochem ou Saxon Biochemicals) avec le premier acide aminé en position C-terminale déjà attaché.The amino acids have their α-amino group protected by a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc) and the side chains by another group such as for example in the case of tyrosine a t-butyl group. Since all the peptides of this invention have a free terminal carboxyl group, a Wang resin is used as a solid support for each synthesis. Wang's resin makes it possible to obtain, after cutting in acidic medium, the peptide with a free terminal carboxylic group. In addition, she is commercially available (Novabiochem or Saxon Biochemicals) with the first amino acid in the C-terminal position already attached.
Durant la synthèse, l'addition des acides aminés subséquents s'effectue selon un protocole répétitif en deux étapes. La première étape est la déprotection du groupement protecteur de l'aminé en α par une solution diluée (20 %) de piperidine dans de la N-méthyl-pyrrolidone (NMP). Ceci résulte dans l'obtention d'un groupement α-aminé qui est déprotégé. La deuxième étape est la réaction de couplage qui permet d'introduire un acide aminé dont la fonction aminé α est protégée par un groupement Fmoc. Différentes méthodes de couplage sont possibles, parmi lesquelles on préfère l'utilisation de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) en présence de 1 -hydroxybenzotriazole (HOBT) afin de former l'ester activé de l'acide aminé à coupler.During synthesis, the addition of subsequent amino acids is carried out according to a repetitive two-step protocol. The first step is the deprotection of the protective group of the amine in α with a dilute solution (20%) of piperidine in N-methyl-pyrrolidone (NMP). This results in obtaining an α-amino group which is deprotected. The second step is the coupling reaction which makes it possible to introduce an amino acid whose amino function α is protected by an Fmoc group. Different coupling methods are possible, among which the use of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) is preferred in order to form the activated ester of the amino acid to be coupled.
La synthèse s'effectue en répétant ce cycle pour l'addition de chaque acide aminé au peptide. La séparation finale du peptide de la résine et l'élimination des grou¬ pements protecteurs des chaînes latérales (déprotection) sont réalisées à température ambiante pendant trois heures dans une solution contenant 90 % d'acide trifluoro- acétique et des molécules protectrices ou scavengers, (5 % d'anisol, 2 % d'eau, 3 % de dodecanethiol), afin par exemple d'empêcher la /evr-butylation causée par la génération de cations /e/r-butyle . Le protocole détaillé est donné dans la partie expérimentale qui suit. PARTIE EXPERIMENTALEThe synthesis is carried out by repeating this cycle for the addition of each amino acid to the peptide. The final separation of the peptide from the resin and the elimination of protective groups from the side chains (deprotection) are carried out at room temperature for three hours in a solution containing 90% trifluoroacetic acid and protective molecules or scavengers, (5% anisol, 2% water, 3% dodecanethiol), for example to prevent / evr-butylation caused by the generation of / e / r-butyl cations. The detailed protocol is given in the experimental part which follows. EXPERIMENTAL PART
Toutes les synthèses de peptides sont conduites à l'aide d'un système automatisé Modèle 430 de Applied Biosystems, en utilisant la méthodologie de protection "Fmoc" pour l'aminé en position α des acides aminés. Pour plus de détails on peut se reporter au manuel utilisateur de ce type d'appareil qui décrit les protocoles de synthèse.All peptide syntheses are carried out using an automated Model 430 system from Applied Biosystems, using the "Fmoc" protection methodology for the amine in the α position of the amino acids. For more details, refer to the user manual for this type of device which describes the synthesis protocols.
Les synthèses réalisées sur le synthétiseur automatique sont en général conduites à partir de 0,25. 10"^ mole d'acide aminé supporté. a) Libération de l'aminé de la résine de WangThe syntheses carried out on the automatic synthesizer are generally carried out starting from 0.25. 10 "^ mole of amino acid supported. A) Release of the amine from the Wang resin
Pour la synthèse des peptides selon l'invention pour lesquels, dans la formule I, y = o, l'acide aminé C-terminal sera une glutamine. On choisit donc comme produit de départ une résine selon Wang (JACS, 1973, 9_5_,.1328) à base de polystyrène réticulé avec 1 % de divinylbenzène, fonctionnalisée avec un bras de liaison du type alcool 4-alcoxy-benzylique, portant déjà une glutamine protégée estéπfiée sur le bras de liaison. Cette résine, ainsi substituée, est disponible dans le commerce (Novabiochem). La fonction aminé, protégée par un groupement Fmoc, est libérée par action d'une solution de pipéπdine à 20% dans la N-méthyl- pyrrohdone. La résine est ensuite lavée avec de la N-méthylpyrrolidone. b) Condensation du second acide aminéFor the synthesis of peptides according to the invention for which, in formula I, y = o, the C-terminal amino acid will be a glutamine. We therefore choose as a starting material a resin according to Wang (JACS, 1973, 9_5 _ ,. 1328) based on polystyrene crosslinked with 1% divinylbenzene, functionalized with a binding arm of the 4-alkoxy-benzyl alcohol type, already carrying protected glutamine estéπfié on the link arm. This resin, thus substituted, is commercially available (Novabiochem). The amino function, protected by an Fmoc group, is released by the action of a 20% pipéπdine solution in N-methylpyrrohdone. The resin is then washed with N-methylpyrrolidone. b) Condensation of the second amino acid
Le second acide aminé est une thréonine. On utilise ici une L-thréomne protégée sur la fonction aminé par un groupement Fmoc et sur la fonction alcool par un groupement t-butyle. La condensation de la fonction acide libre sur la fonction aminé libre de la glutamine portée par la résine de Wang est faite après activation de la fonction acide en présence de DCC (dicyclohexycarbodnmide) et de HOBT (1-hydroxy-benzotπazole).The second amino acid is a threonine. An L-threomne protected on the amino function by an Fmoc group and on the alcohol function by a t-butyl group is used here. The condensation of the free acid function on the free amino function of glutamine carried by the Wang resin is made after activation of the acid function in the presence of DCC (dicyclohexycarbodnmide) and of HOBT (1-hydroxy-benzotπazole).
Après traitement avec le mélange réactionnel la résine est lavée avec de la N-méthylpyrrolidone. Afin d'assurer un bon rendement de condensation, la résine est mise une nouvelle fois en contact avec le mélange réactif puis à nouveau lavée.After treatment with the reaction mixture, the resin is washed with N-methylpyrrolidone. To ensure a good condensation yield, the resin is brought into contact with the reactive mixture again and then washed again.
On ajoute ensuite une solution de pipéπdine à 20% dans la N-méthyl- pyrrohdone, afin d'éliminer le groupement Fmoc protégeant la fonction aminé de la thréonine, puis on lave la résine avec de la N-méthylpyrrolidone.A 20% pipéπdine solution in N-methylpyrrohdone is then added in order to eliminate the Fmoc group protecting the amino function of threonine, then the resin is washed with N-methylpyrrolidone.
De façon analogue, on condense les acides aminés suivants par une suite de réactions semblables, en utilisant chaque fois 4 équivalents d'acide aminé à greffer pour 1 équivalent de peptide supporté par la résine.Similarly, the following amino acids are condensed by a series of similar reactions, each time using 4 equivalents of amino acid to be grafted for 1 equivalent of peptide supported by the resin.
Dans le cas de la synthèse de peptides comportant plus de 25 acides aminés, le couplage de la plupart des acides aminés est réalisé deux fois de suite.In the case of the synthesis of peptides comprising more than 25 amino acids, the coupling of most amino acids is carried out twice in a row.
Le mélange de couplage est renouvelé par un mélange frais. Cette méthode permet d'obtenir des rendements de couplage très élevés, ce qui est nécessaire lors de la synthèse de longs peptides.The coupling mixture is renewed with a fresh mixture. This method makes it possible to obtain very high coupling yields, which is necessary during the synthesis of long peptides.
Les différents acides aminés utilisés sont tous protégés par un groupement Fmoc sur l'aminé en α de l'acide. Les chaînes latérales sont protégées par des groupements résistants aux agents basiques : t-butyl éther pour les fonctions alcool de la séπne, de la thréonine et de la tyrosine, t-butyl ester pour les fonctions acides latérales des acides aspartique et glutamique, Boc (t-butyloxycarbonyl) pour la fonction amme latérale de la lysine, et tπtyle pour les tonctions amide de l'asparagine et de la glutamine.The different amino acids used are all protected by an Fmoc group on the amino at α of the acid. The side chains are protected by groups resistant to basic agents: t-butyl ether for the alcohol functions of the seπne, threonine and tyrosine, t-butyl ester for the side acid functions of the aspartic and glutamic acids, Boc ( t-butyloxycarbonyl) for the lateral amm function of lysine, and tπtyle for the amide tones of asparagine and glutamine.
Après la réaction de condensation d'un nouvel acide aminé protégé par un groupement Fmoc, le contrôle de la réaction est fait sur un échantillon de résine 96/05227 PCÏYFR95/01076After the condensation reaction of a new amino acid protected by an Fmoc group, the reaction is checked on a resin sample 96/05227 PCÏYFR95 / 01076
avant la réaction de déprotection : pour effectuer ce contrôle, on lave l'échantillon avec du dichlorométhane. on le sèche et on le pèse, puis on fait agir un mélange composé de 50% de pipéridine et 50% de dichlorométhane pendant 20 mn. On filtre la résine et on concentre le filtrat pour le reprendre avec un volume précis de dichlorométhane. On détermine sur cette solution la teneur en dibenzofulvène par dosage par spectrométrie d'absorption U.V à 301 nm. On détermine ainsi le taux de substitution de la résine. c) Libération du peptidebefore the deprotection reaction: to carry out this control, the sample is washed with dichloromethane. it is dried and weighed, then a mixture of 50% piperidine and 50% dichloromethane is made to act for 20 minutes. The resin is filtered and the filtrate is concentrated to take it up with a precise volume of dichloromethane. The dibenzofulvene content is determined on this solution by assay by U.V absorption spectrometry at 301 nm. The rate of substitution of the resin is thus determined. c) Release of the peptide
Lorsque tous les acides aminés ont été condensés en répétant autant de fois que nécessaire des réactions analogues à l'exemple b), la résine est mise en présence d'un mélange composé de 90% d'acide trifluoroacétique, 5% d'anisole, 3% de dodécanethioi et 2% d'eau pendant 3 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est filtré et le filtrat est mélangé à de l'éther diéthylique pour précipiter le peptide. Celui-ci est séparé par centrifugation et on obtient ainsi après séchage le peptide brut. d) PurificationWhen all the amino acids have been condensed by repeating reactions analogous to Example b) as many times as necessary, the resin is brought into contact with a mixture composed of 90% trifluoroacetic acid, 5% anisole, 3% dodecanethioi and 2% water for 3 hours at room temperature. The reaction medium is filtered and the filtrate is mixed with diethyl ether to precipitate the peptide. This is separated by centrifugation and the crude peptide is thus obtained after drying. d) Purification
Le peptide brut est dissous dans un mélange d'acétonitrile et d'une solution aqueuse de chlorohydrate de guanidine 8M puis purifié par chromatographie en phase inverse sous pression sur gel de silice greffée de type RP18 en éluant avec un gradient composé d'eau à 0, 1 % d'acide trifluoroacétique (A) et d'acétonitrile contenant 0, 1 % d'acide trifluoroacétique (B), la composition variant de 20 à 70% de B sur une durée de 50 mn.The crude peptide is dissolved in a mixture of acetonitrile and an aqueous solution of guanidine hydrochloride 8M and then purified by reverse phase chromatography under pressure on grafted silica gel type RP18, eluting with a gradient consisting of water at 0 , 1% trifluoroacetic acid (A) and acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid (B), the composition varying from 20 to 70% B over a period of 50 min.
Les fractions contenant le peptide pur sont lyophilisées et on obtient le produit sous forme d'un solide blanc floconneux. En variante, avant le stade b), quand il est nécessaire de fixer le premier acide aminé sur le bras de liaison de la résine, la fixation dudit premier acide aminé sur la résine de type WANG peut être réalisée comme suit : α) le couplage du premier acide aminé sur la résine de type WANG est réalisé en présence d'un catalyseur d'esterification, la diméthylaminopyridine (DMAP) de l'agent de condensation dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et de l'hydroxybenzotriazole HOBT : ou encore, β) un mélange de 1 équivalent en acide aminé, 1 équivalent en 2-(lH- benzotriazole-l-yl)-l , l ,3,3-tétraméthyluroniurn hexafluorophosphateThe fractions containing the pure peptide are lyophilized and the product is obtained in the form of a fluffy white solid. As a variant, before stage b), when it is necessary to fix the first amino acid on the resin linking arm, the fixing of said first amino acid on the WANG type resin can be carried out as follows: α) coupling of the first amino acid on the WANG type resin is produced in the presence of an esterification catalyst, dimethylaminopyridine (DMAP) of the condensing agent dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and hydroxybenzotriazole HOBT: or, β) a mixture of 1 equivalent in amino acid, 1 equivalent in 2- (1H- benzotriazole-1-yl) -l, l, 3,3-tetramethyluroniurn hexafluorophosphate
(HBTU), et 2,2 équivalents de diisopropyléthylamine et 0, 1 à 0,2 équivalent de 4-diméthylaminopyridine. Les produits obtenus après la purification du stade d) sont contrôlés par analyse séquentielle (sur un analyseur automatique utilisant la dégradation d'EDMAN), par HPLC analytique et par spectrométrie de masse (appareil MATT FINNIGAN TSQ 700 . triple quadrupole avec système d'ionisation ESI). Les valeurs obtenues par spectrométrie de masse sont regroupées dans le tableau I, dans lequel figurent également des peptides connus qui ont été testés en comparaison avec les produits selon l 'invention. Dans ce tableau, les peptides selon l'invention sont les exemples, identifiés par les valeurs x et y correspondant à la formule I et les produits indiqués "fragment 17-30". fragment "51-60" et fragment " 1-38 apoC l " sont des produits connus, décrits dans les demandes de brevet ou publication de l'art antérieur :(HBTU), and 2.2 equivalents of diisopropylethylamine and 0.1 to 0.2 equivalents of 4-dimethylaminopyridine. The products obtained after the purification of stage d) are checked by sequential analysis (on an automatic analyzer using the degradation of EDMAN), by analytical HPLC and by mass spectrometry (MATT FINNIGAN TSQ 700 apparatus. Triple quadrupole with ionization system ESI). The values obtained by mass spectrometry are collated in Table I, in which also appear known peptides which have been tested in comparison with the products according to the invention. In this table, the peptides according to the invention are the examples, identified by the values x and y corresponding to formula I and the products indicated "fragment 17-30". fragment "51-60" and fragment "1-38 apoC l" are known products, described in patent applications or prior art publications:
- "fragment 17-30" et "fragment 51-60" sont des fragments de l'apoAII décrits dans WO87-02062 comme étant des agents favorables au transport reverse du cholestérol. - "fragment 1-38 apoCl est un fragment de l'apo Cl de babouin, décrit comme inhibiteur de la CETP par R.S. Kushwaha (J. Lipid Res., 1993. 3A 1285-1297). En bref, les peptides selon SEQ ID No. 1 sont tous nouveaux, à l'exception de ceux pour lesquels le couple (x, y) a les valeurs suivantes (0,0) ; (13,0) ; (20,0) ; (23,0) ; (25,0) ; (27,0) ; (28,0) ; (29,0) ; (30,0) et (31 ,0).- "fragment 17-30" and "fragment 51-60" are fragments of apoAII described in WO87-02062 as being agents favorable to the reverse transport of cholesterol. - "fragment 1-38 apoCl is a fragment of the apo Cl of baboon, described as a CETP inhibitor by RS Kushwaha (J. Lipid Res., 1993. 3A 1285-1297). In short, the peptides according to SEQ ID No. 1 are all new, except those for which the couple (x, y) has the following values (0.0); (13.0); (20.0); (23.0); (25.0); (27.0); (28.0); (29.0); (30.0) and (31.0).
En revanche, l'utilisation thérapeutique selon l'invention de tous les peptides selon SEQ ID No. 1 , qu'ils soient connus ou nouveaux, est nouvelle.On the other hand, the therapeutic use according to the invention of all the peptides according to SEQ ID No. 1, whether known or new, is new.
Les peptides selon l'invention peuvent aussi être préparés par d'autres techniques connues de la chimie ou par les méthodes de génie génétique. Les peptides peuvent être synthétisés et produits par des cultures de bactéries, de levures ou de cellules animales contenant un fragment d'ADN codant pour le peptide et les séquences d'ADN nécessaires à son expression. ACTIVITE BIOLOGIQUEThe peptides according to the invention can also be prepared by other techniques known in chemistry or by genetic engineering methods. The peptides can be synthesized and produced by cultures of bacteria, yeasts or animal cells containing a DNA fragment coding for the peptide and the DNA sequences necessary for its expression. BIOLOGICAL ACTIVITY
Les peptides selon l'invention ont été évalués quant à leur potentiel thérapeutique pour le traitement des hypercholesterolemies, par une mesure de leur pouvoir inhibiteur vis-à-vis de l'activité de la CETP.The peptides according to the invention were evaluated as to their therapeutic potential for the treatment of hypercholesterolemias, by a measurement of their inhibitory power vis-à-vis the activity of CETP.
On sait que pour augmenter l'élimination du cholestérol par les cellules hépatiques, il est important de favoriser le transport des esters de cholestérol par les HDL, et de limiter le transfert des esters de cholestérol des HDL vers le LDL. Les produits selon l'invention ont été évalués en mesurant leur capacité à inhiber le transfert des esters de cholestérol des HDL vers les LDL résultant de l'activité CETP.We know that to increase the elimination of cholesterol by liver cells, it is important to promote the transport of cholesterol esters by HDL, and to limit the transfer of cholesterol esters from HDL to LDL. The products according to the invention were evaluated by measuring their capacity to inhibit the transfer of cholesterol esters from HDL to LDL resulting from the CETP activity.
Pour effectuer ces mesures, on utilise des HDL associées à des esters de cholestérol marqués au tritium (^H-CE-HDL) que l'on incube en présence de LDL, de CETP et des peptides selon l'invention. Après séparation des HDL et des LDL par précipitation puis centrifugation des LDL, le transfert des esters de cholestérol des HDL vers les LDL est mesuré par comptage de la radioactivité dans le surnageant. Cette méthode permet d'évaluer le pouvoir inhibiteur des différents peptides vis-à-vis de l'activité de la CETP. Des mesures identiques ont été faites avec l'apoAII et les produits connus de l 'art antérieur.To carry out these measurements, HDLs are used combined with tritium-labeled cholesterol esters (^ H-CE-HDL) which are incubated in the presence of LDL, CETP and peptides according to the invention. After separation of HDL and LDL by precipitation and then centrifugation of LDL, the transfer of cholesterol esters from HDL to LDL is measured by counting the radioactivity in the supernatant. This method makes it possible to evaluate the inhibitory power of the various peptides with respect to the activity of CETP. Identical measurements were made with apoAII and the products known from the prior art.
A fin de comparaison, le pouvoir inhibiteur a d'abord été évalué pour l'apoAII à différentes concentrations : la mesure montre que l'inhibition augmente avec la concentration et que l'on atteint une inhibition presque totale au delà d'un concentration de 20 μM. Les valeurs obtenues sont reportées sur la figure 1 dans laquelle on a représenté l'inhibition en ordonnée (0% représente une absence d'inhibition, c'est-à-dire que l'activité de la CETP n'est pas perturbée et 100% représente une inhibition totale de la CETP c'est-à-dire que l'on retrouve les valeurs obtenues en l'absence de CETP), en fonction de la concentration en apoAII dans le milieu d'incubation. Les peptides selon l'invention ont été évalués à une concentration de 20 μM, soit la concentration à laquelle l'apoAII atteint son activité maximale. PARTIE EXPERIMENTALE a) Préparation des solutions de peptides Après purification par HPLC (partie expérimentale de la synthèse), les peptides sont lyophilisés et conservés à -20° C.At the end of the comparison, the inhibitory power was first evaluated for apoAII at different concentrations: the measurement shows that the inhibition increases with the concentration and that an almost total inhibition is reached beyond a concentration of 20 μM. The values obtained are given in FIG. 1 in which the inhibition is shown on the ordinate (0% represents an absence of inhibition, that is to say that the activity of the CETP is not disturbed and 100 % represents a total inhibition of CETP, that is to say that the values obtained are found in the absence of CETP), as a function of the concentration of apoAII in the incubation medium. The peptides according to the invention were evaluated at a concentration of 20 μM, ie the concentration at which apoAII reaches its maximum activity. EXPERIMENTAL PART a) Preparation of the peptide solutions After purification by HPLC (experimental part of the synthesis), the peptides are lyophilized and stored at -20 ° C.
Préalablement aux essais, les peptides sont dissous dans une solution de chlorure de guanidine 6 M pour obtenir une solution contenant 10 mg de peptide par ml. La solution est ensuite diluée deux fois avec du tampon 10 mM Tris, 150 mM NaCl à pH = 7,4 et chromatographiée par FPLC ("Fast Protein Liquid Chromatography") en utilisant une phase SUPERDEX® 30 (Pharmacia) et une solution de chlorure de guadinine 1 M, 10 mM Tris, pH = 7.4 comme éluant. Si nécessaire, les fractions obtenues sont concentrées sur membrane YM3 (A icon) pour obtenir une concentration supérieure à 300 μM. Enfin, les sels résiduels de guadinine sont éliminés par chromatographie en utilisant une phase SEPHADEX® 25 Superfine, en éluant avec une solution contenant 500 mM NaCl, 10 mM Tris, 0,2% d'azoture de sodium. pH = 7.4. Les fractions contenant le peptide sont rassemblées et utilisées directement.Prior to the tests, the peptides are dissolved in a 6 M guanidine chloride solution to obtain a solution containing 10 mg of peptide per ml. The solution is then diluted twice with 10 mM Tris buffer, 150 mM NaCl at pH = 7.4 and chromatographed by FPLC ("Fast Protein Liquid Chromatography") using a SUPERDEX® 30 phase (Pharmacia) and a chloride solution. 1 M guadinine, 10 mM Tris, pH = 7.4 as eluent. If necessary, the fractions obtained are concentrated on a YM3 membrane (A icon) to obtain a concentration greater than 300 μM. Finally, the residual guadinine salts are eliminated by chromatography using a SEPHADEX® phase 25 Superfine, eluting with a solution containing 500 mM NaCl, 10 mM Tris, 0.2% sodium azide. pH = 7.4. The fractions containing the peptide are collected and used directly.
La concentration de chacun des peptides est déterminée par spectro- métrie d'absoφtion à 276 nm en utilisant les coefficients d'extinction molaire de 1450 M"lcm~l pour les peptides comportant une tyrosine, 2900 M'^c "^ pour les peptides comportant 2 restes Tyrosines. 5945 M'^cm'l pour l'apoAII d'origine humaine, et 5400 M'^cm' ^ pour le fragment d'apoCl de babouin connu de l'art antérieur. La concentration des fragments 17-30 et 51-60 de l'apoAII (produits connus) est déterminée par pesée. b) Préparation de la CETPThe concentration of each of the peptides is determined by absorption spectrometry at 276 nm using the molar extinction coefficients of 1450 M "lcm ~ l for the peptides comprising a tyrosine, 2900 M ' ^ c " ^ for the peptides with 2 Tyrosine remains. 5945 M ' ^ cm ' l for apoAII of human origin, and 5400 M '^ cm' ^ for the baboon apoCl fragment known from the prior art. The concentration of fragments 17-30 and 51-60 of apoAII (known products) is determined by weighing. b) Preparation of the CETP
Du sérum humain dépourvu en lipoprotéine (LPDS) est obtenu par centrifugation (70 heures) de plasma frais (250 ml) dont la densité est ajustée à d = 1.25 par addition de KBr solide. Une fraction enrichie en CETP est obtenue à partir du LPDS par différentes chromatographies successives : chromatographie d'interactions hydro- phobes (PHENYL SEPHAROSE®, Pharmacia), chromatographie d'adsorption (HYDROXYLAPATITE®, HA, Biorad) et chromatographie échangeuse d'ions (MONO Q ION EXCHANGE®, Pharmacia). Le LPDS est saturé par du NaCl solide, puis déposé sur une colonne deHuman serum lacking in lipoprotein (LPDS) is obtained by centrifugation (70 hours) of fresh plasma (250 ml) whose density is adjusted to d = 1.25 by addition of solid KBr. A fraction enriched in CETP is obtained from the LPDS by different successive chromatographies: hydrophobic interaction chromatography (PHENYL SEPHAROSE®, Pharmacia), adsorption chromatography (HYDROXYLAPATITE®, HA, Biorad) and ion exchange chromatography ( MONO Q ION EXCHANGE®, Pharmacia). The LPDS is saturated with solid NaCl, then deposited on a column of
900 ml de PHENYL SEPHAROSE® HS (Pharmacia) équilibrée par une solution de NaCl 4M. La colonne est éluée par environ deux litres d'un tampon Tris 10 mM, NaCl 150 mM à pH = 7,4, puis la CETP retenue est éluée par de l'eau pure.900 ml of PHENYL SEPHAROSE® HS (Pharmacia) balanced with a 4M NaCl solution. The column is eluted with approximately two liters of 10 mM Tris buffer, 150 mM NaCl at pH = 7.4, then the retained CETP is eluted with pure water.
La fraction aqueuse après chromatographie sur PHENYL SEPHAROSE® est concentrée sur membrane YM 30 (Amicon) pour obtenir un volume de 250 ml puis on ajoute du NaCl de façon à obtenir une concentration de 2 M. Cette fraction est chromatographiée sur une colonne de 50 ml de PHENYL SUPEROSE® (Pharmacia) à un débit de 5 ml/minute. La colonne est éluée par 50 ml d'une solution aqueuse de NaCl à 2 M, puis par un gradient linéaire de 500 ml allant de 2 M en NaCl à du tampon Tris 10 mM, 150 mM NaCl pH = 7,4 et pour terminer par 200 ml du même tampon Tris. La CETP retenue est ensuite éluée par de l'eau pure (comme précédemment). La fraction contenant la CETP, ajustée à 50 mM en NaCl, 10 mM Tris, 0.2% en azoture de sodium et pH = 7,4, est ensuite concentrée sur membrane YM30 (Amicon) pour obtenir environ 16 ml de solution. L'activité spécifique de la CETP est de 3,0 à 3,4.10"7 mole de CE transférée par milligramme de protéine et par heure. c) Préparation de l'apoprotéine AUThe aqueous fraction after chromatography on PHENYL SEPHAROSE® is concentrated on a YM 30 membrane (Amicon) to obtain a volume of 250 ml and then NaCl is added so as to obtain a concentration of 2 M. This fraction is chromatographed on a column of 50 ml of PHENYL SUPEROSE® (Pharmacia) at a flow rate of 5 ml / minute. The column is eluted with 50 ml of a 2 M aqueous NaCl solution, then with a linear gradient of 500 ml ranging from 2 M in NaCl to 10 mM Tris buffer, 150 mM NaCl pH = 7.4 and finally per 200 ml of the same Tris buffer. The retained CETP is then eluted with pure water (as above). The fraction containing CETP, adjusted to 50 mM in NaCl, 10 mM Tris, 0.2% in sodium azide and pH = 7.4, is then concentrated on a YM30 membrane (Amicon) to obtain approximately 16 ml of solution. The specific activity of CETP is from 3.0 to 3.4 × 10 −7 mole of CE transferred per milligram of protein per hour. C) Preparation of the apoprotein AU
L'apoprotéine AU est purifiée à partir d'une préparation contenant les protéines extraites des HDL. Les HDL sont isolées à partir de 1 litre de plasma humain frais par deux ultracentrifugations consécutives (rotor 45 Ti, 40.000 φm, 20 °C), l'une à une densité de 1 ,07 pendant au moins 24 heures, l'autre à une densité de 1 ,25 pendant 48 heures (les densités sont ajustées par addition -de KBr solide). La fraction contenant les HDL est ensuite chromatographiée sur une colonne de 40 ml de CONCANAVALIN® A (Pharmacia) afin d'éliminer l'Apoprotéine E et les traces contaminantes d'apoprotéine B.Apoprotein AU is purified from a preparation containing proteins extracted from HDL. HDLs are isolated from 1 liter of fresh human plasma by two consecutive ultracentrifugations (45 Ti rotor, 40,000 φm, 20 ° C), one at a density of 1.07 for at least 24 hours, the other at a density of 1.25 for 48 hours (the densities are adjusted by the addition of solid KBr). The fraction containing the HDLs is then chromatographed on a column of 40 ml of CONCANAVALIN® A (Pharmacia) in order to remove the Apoprotein E and the contaminating traces of apoprotein B.
La fraction contenant les HDL (environ 50 ml) est ensuite dialysée trois fois contre 1 litre de tampon Tris 10 mM, NaCl 150 mM à pH = 7,4 pendant une heure. Les protéines en solution dans environ 50 ml d'eau sont extraites des HDL par trois délipidatioπs successives à l'aide de mélanges ethanol/ether (à raison de deux litres de mélange pour les HDL issues d'un litre de plasma pour les deux premières et un litre de mélange pour les HDL issues d'un litre de plasma dans la dernière) dont la concentration en éther augmente (3/ 1 , 1/ 1 , 1/3. V/V). Lors de la première delipidation la phase organique est éliminée par décantation; lors des deux autres elle est éliminée par centrifugation. Pour terminer, les protéines sont lavées avec de l' éther pur.The fraction containing the HDLs (approximately 50 ml) is then dialyzed three times against 1 liter of 10 mM Tris buffer, 150 mM NaCl at pH = 7.4 for one hour. The proteins in solution in approximately 50 ml of water are extracted from HDL by three successive delipidatioπs using ethanol / ether mixtures (at the rate of two liters of mixture for HDL from a liter of plasma for the first two and a liter of mixture for the HDLs coming from a liter of plasma in the last) whose ether concentration increases (3/1, 1/1, 1/3. V / V). During the first delipidation the organic phase is removed by decantation; during the other two it is removed by centrifugation. Finally, the proteins are washed with pure ether.
Les protéines (apo HDL) extraites des HDL sont dissoutes dans 20 ml d'une solution 6 M en chlorure de guadinine sous agitation pendant une nuit. Après dilution par 20 ml de tampon Tris 10 mM, NaCl 150 mM à pH = 7,4, la fraction protéique est centrifugée pour éliminer les agrégats inso¬ lubles puis chromatographiée (gel filtration) sur une colonne de 300 ml de SUPERDEX® 75 (Pharmacia) avec un Tampon Tris 10 mM, 1 M en chlorure de guadinine, pH = 7,4 comme solvant d'élution. Dans ces conditions non réduc- trices, l'apoAII est éluée après le pic correspondant à l'apoprotéine AI. Les fractions contenant l'apoAII sont rassemblées et incubées pendant une heure en présence de DTT (dithiothréitol) à 6.5 mM. La solution est finalement chroma¬ tographiée à nouveau sur colonne de Sephadex 75. Dans ces conditions, l'apoAII, présente en solution sous sa forme monomère, est séparée de l'apoAI ; les fractions sont rassemblées et stockées a 4 °C pour une utilisation ultérieure (la teneur en apoAII est déterminée par dosage en spectrométrie U.V.). d) Préparation des lipoprotéines marquées aux esters de cholestérol tritiésThe proteins (apo HDL) extracted from HDL are dissolved in 20 ml of a 6 M solution of guadinine chloride with stirring overnight. After dilution with 20 ml of 10 mM Tris buffer, 150 mM NaCl at pH = 7.4, the protein fraction is centrifuged to remove the insoluble aggregates and then chromatographed (gel filtration) on a 300 ml column of SUPERDEX® 75 ( Pharmacia) with a 10 mM Tris Buffer, 1 M guadinine chloride, pH = 7.4 as elution solvent. Under these non-reducing conditions, apoAII is eluted after the peak corresponding to apoprotein AI. The fractions containing apoAII are combined and incubated for one hour in the presence of DTT (dithiothreitol) at 6.5 mM. The solution is finally chroma¬ tographed again on a Sephadex 75 column. Under these conditions, apoAII, present in solution in its monomeric form, is separated from apoAI; fractions are collected and stored at 4 ° C for later use (the apoAII content is determined by assay in UV spectrometry). d) Preparation of lipoproteins labeled with tritiated cholesterol esters
Les HDL marquées aux esters de cholestérol tπties (^H-CE) sont préparées en incubant les HDL purifiées en présence de vésicules de phospha- tidylcho ne de jaune d'oeuf (EPC) contenant du ^H-CE. Pour préparer les vésicules d'EPC - ^H-CE, 8 mg d'EPC sont dissous dans 20 ml de p-xylène auquel on rajoute 9,25 MBq de ^H-CE (Amersham-Buchler) dans 250 μl de toluène. Après congélation le mélange est lyophilisé. Le mélange EPC - ^H-CE est dispersé dans 4 ml de tampon 10 mMThe HDL labeled with cholesterol esters tπties (^ H-CE) are prepared by incubating the purified HDL in the presence of vesicles of phosphatidylcho ne egg yolk (EPC) containing ^ H-CE. To prepare the EPC - ^ H-CE vesicles, 8 mg of EPC are dissolved in 20 ml of p-xylene to which 9.25 MBq of ^ H-CE (Amersham-Buchler) are added in 250 μl of toluene. After freezing the mixture is lyophilized. The EPC - ^ H-CE mixture is dispersed in 4 ml of 10 mM buffer
Tπs, 150 mM NaCl à pH = 7 4 puis traité par une sonde à ultrasons pendant 5 minutes à 10 °C Le traitement aux ultrasons est repété 6 tois jusqu'à obtenir un éclaircissement du mélange.Tπs, 150 mM NaCl at pH = 7 4 then treated with an ultrasonic probe for 5 minutes at 10 ° C. The ultrasonic treatment is repeated 6 times until the mixture becomes clear.
Les HDL sont purifiées par ultracentπfugation dans un rotor 45 Ti (Beckman) à 40.000 tr/mn pendant 24 heures à partir de 250 ml de plasma frais, auxquels sont ajoutés des conservateurs ( 1 mM pCMB (acide p-chloromercuro- benzoïque), 10 mM DTNB (acide 5,5'-dιthιo-bιs-(2-nιtrobenzoιque)), 10 mM EDTA (acide éthylènediaminetétracétique), 0,02% NaN ), dont le pH est ajusté à pH = 7,4 et la densité est ajustée à 1 ,07 par du KBr solide. Le surnageant contenant les lipoprotéines autres que les HDL est éliminé. Les 4 ml de vésicules d'EPC marquées au ^H-CE (vés ^H-CE-EPC) sont rajoutés à la fraction contenant les HDL puis celle-ci est incubée 70 heures à 37 °C. La fraction est centrifugée dans un rotor 70 Ti à 50.000 tr/mn pendant 24 heures, le surnageant contenant les lipides est éliminé. La densité est ajustée à 1 ,25 par du KBr solide, puis la fraction est centrifugée dans un rotor 70 Ti 50.000 tr/mn pendant 48 heures. La fraction contenant les HDL marquées purifiées est stockée à 4 °C. e) Essais d'inhibition de l'activité CETP :The HDLs are purified by ultracentπfugation in a 45 Ti rotor (Beckman) at 40,000 rpm for 24 hours from 250 ml of fresh plasma, to which are added preservatives (1 mM pCMB (p-chloromercurobenzoic acid), 10 mM DTNB (5,5'-dιthιo-bιs- (2-nιtrobenzoιque) acid), 10 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.02% NaN), the pH of which is adjusted to pH = 7.4 and the density is adjusted to 1.07 with solid KBr. The supernatant containing lipoproteins other than HDL is eliminated. The 4 ml of EPC vesicles labeled with ^ H-CE (vés ^ H-CE-EPC) are added to the fraction containing the HDLs then this is incubated for 70 hours at 37 ° C. The fraction is centrifuged in a 70 Ti rotor at 50,000 rpm for 24 hours, the supernatant containing the lipids is removed. The density is adjusted to 1.25 with solid KBr, then the fraction is centrifuged in a 70 Ti rotor 50,000 rpm for 48 hours. The fraction containing the purified labeled HDLs is stored at 4 ° C. e) CETP activity inhibition tests:
Comme indiqué précédemment, l'activité de la CETP est déterminée en mesurant le transfert des esters de cholestérol tritiés portés par les HDL vers les LDL. Pour effectuer cette mesure, 35 à 40 μl de la fraction enπchie en CETP sont incubés en présence de HDL associées au ^H-CE (équivalent à 10 μg de choles¬ térol) et de LDL (équivalent à 100 μg de cholestérol), en présence ou non du peptide dont on veut déterminer l'activité. Le mélange est complété à 500 μl par une solution 25 mM de phosphate de sodium 150 mM NaCl, 1.4 mM EDTA, 2,5 mM DTNB, 1 % d'albumine de sérum de bovin et pH = 7,4. L'incubation dure 3 heures à 37 °C.As previously indicated, the activity of CETP is determined by measuring the transfer of tritiated cholesterol esters carried by HDL to LDL. To carry out this measurement, 35 to 40 μl of the fraction enπchie in CETP are incubated in the presence of HDL associated with ^ H-CE (equivalent to 10 μg of cholesterol) and of LDL (equivalent to 100 μg of cholesterol), in presence or absence of the peptide whose activity is to be determined. The mixture is made up to 500 μl with a 25 mM solution of sodium phosphate 150 mM NaCl, 1.4 mM EDTA, 2.5 mM DTNB, 1% bovine serum albumin and pH = 7.4. The incubation lasts 3 hours at 37 ° C.
A la fin de l'incubation, la réaction de transfert des esters de cholestérol entre les lipoprotéines est arrêtée par addition de 500 μl d'une solution de phospho- tungstate de magnésium (PTA) (concentration finale : 0,048 % PTA, 12 mM Mg2+). Les LDL précipitées sont éliminées par centrifugation et la radioactivité du surnageant est mesurée à l'aide d'un compteur à scintillation liquide (on ajoute 10 ml de liquide à scintillation au surnageant et le comptage s'effectue pendant 10 mn). Dans ces conditions, l'activité de la CETP seule correspond à 1 ,89.10"^ mole de CE transféré des HDL vers les LDL par heure.At the end of the incubation, the transfer reaction of the cholesterol esters between the lipoproteins is stopped by adding 500 μl of a solution of magnesium phosphotungstate (PTA) (final concentration: 0.048% PTA, 12 mM Mg2 + ). The precipitated LDLs are removed by centrifugation and the radioactivity of the supernatant is measured using a liquid scintillation counter (10 ml of scintillation liquid is added to the supernatant and the counting is carried out for 10 min). Under these conditions, the activity of CETP alone corresponds to 1.89 × 10 −10 mol of CE transferred from HDL to LDL per hour.
Pour évaluer le pouvoir inhibiteur d'un peptide sur l'activité de la CETP, on effectue simultanément 4 mesures dans les conditions suivantes :To evaluate the inhibitory power of a peptide on the activity of CETP, 4 measurements are carried out simultaneously under the following conditions:
- la première mesure S | représente la radioactivité en dpm mesurée dans le surnageant de l'essai contenant les lipoprotéines, la CETP et le peptide (activité modifiée de la CETP).- the first measurement S | represents the radioactivity in dpm measured in the supernatant of the test containing the lipoproteins, the CETP and the peptide (modified activity of the CETP).
- la second mesure S( représente la radioactivité en dpm mesurée dans le surnageant de l'essai contenant les lipoprotéines et la CETP (activité normale de la CETP).- the second measurement S (represents the radioactivity in dpm measured in the supernatant of the test containing the lipoproteins and the CETP (normal activity of the CETP).
- la troisième mesure B| représente la radioactivité en dpm mesurée dans le surnageant de l'essai contenant seulement les lipoprotéines- the third measure B | represents the radioactivity in dpm measured in the supernatant of the test containing only the lipoproteins
(contrôle "à blanc"). la quatrième mesure B2 représente la radioactivité en dpm mesurée dans le surnageant de l'essai contenant les lipoprotéines et le peptide (contrôle à blanc en présence du peptide). L'activité normale de la CETP est représentée par la différence B]-St ("blank" control). the fourth measurement B2 represents the radioactivity in dpm measured in the supernatant of the test containing the lipoproteins and the peptide (blank control in the presence of the peptide). The normal activity of CETP is represented by the difference B ] -S t
(cette valeur est directement proportionnelle à l'activité de la CETP).(this value is directly proportional to the activity of the CETP).
L'activité modifiée de la CETP en présence du peptide est représentée par la différence B2-S 1 (cette valeur est directement proportionnelle à l'activité modifiée de la CETP et supprime une éventuelle activité qui pourrait être due au peptide seul).The modified activity of CETP in the presence of the peptide is represented by the difference B2-S 1 (this value is directly proportional to the modified activity of CETP and suppresses any activity which could be due to the peptide alone).
On peut exprimer l'activité inhibitrice du peptide en fonction de la quantité relative des esters de cholestérol transférés en 3 heures en l'absence ou en présence du peptide par la valeur : B2"s l % CE = x 100The inhibitory activity of the peptide can be expressed as a function of the relative amount of cholesterol esters transferred in 3 hours in the absence or in the presence of the peptide by the value: B 2 " s l% CE = x 100
Bl-St Bl-S t
Ainsi, un peptide non inhibiteur autorisera un transfert de CE identique à celui qui est observe en présence de la CETP seule et la valeur relative sera de 100%. Inversement, un peptide très inhibiteur supprime totalement le transfert (toute la radioactivité est conservée dans le surnageant) et on obtient une valeur relative de 0% . Pour obtenir une valeur représentative de l' inhibition IN proportion¬ nelle au pouvoir inhibiteur du peptide vis-a-vis de la CETP on utilise la formule :Thus, a non-inhibitory peptide will allow a transfer of CE identical to that which is observed in the presence of CETP alone and the relative value will be 100%. Conversely, a highly inhibitory peptide completely suppresses the transfer (all the radioactivity is retained in the supernatant) and a relative value of 0% is obtained. To obtain a value representative of IN inhibition proportional to the inhibitory power of the peptide vis-à-vis CETP, the formula is used:
(B1-St) - (B2-S 1 )(B 1 -S t ) - (B 2 -S 1 )
IN(expπme en %) = x 100 Bj-St IN (expπme in%) = x 100 Bj-S t
Suivant cette expression, un peptide totalement inhibiteur de l'activité CETP conduit à une valeur IN = 100%. Inversement, un peptide inactif conduit à une valeur IN = 0% et un peptide possédant une action stimulatπce de la CETP fera apparaître une valeur IN négative.According to this expression, a peptide totally inhibiting the CETP activity leads to an IN value = 100%. Conversely, an inactive peptide leads to an IN value = 0% and a peptide having a stimulating action of CETP will cause a negative IN value to appear.
Les essais décrits ci-dessus ont ete conduits avec l 'apoprotéine AH à différentes concentrations afin de déterminer une concentration minimale permettant une inhibition importante de l'activité de la CETPThe tests described above were carried out with the apoprotein AH at different concentrations in order to determine a minimum concentration allowing a significant inhibition of the activity of CETP.
Les résultats de ces mesures sont représentés sous forme de graphe dans la figure 1 qui indique en ordonnée l'activité inhibitπce obtenue en fonction de la concentration de l'apoAII. Compte tenu des valeurs obtenues pour l'apoAII, les essais faits avec les peptides selon l'invention ont été conduits à une concentration 20 μM. Les résultats obtenus sont reportes dans le tableau II dans lequel figurent les peptides selon l'invention indiqués en exemples et les trois produits de l'art antéπeur mentionnes précédemment Pour chaque produit testé, on a indiqué la valeur IN (pouvoir inhibiteur de l'activité de la CETP) et la valeur INR qui expπme le pouvoir inhibiteur des peptides par rapport au pouvoir inhibiteur de l 'apoAII à une concentration 20 μM.The results of these measurements are represented in the form of a graph in FIG. 1 which indicates on the ordinate the inhibitory activity obtained as a function of the concentration of apoAII. Given the values obtained for apoAII, the tests carried out with the peptides according to the invention were carried out at a concentration of 20 μM. The results obtained are reported in Table II in which the peptides according to the invention indicated in examples appear and the three prior art products mentioned previously. For each product tested, the IN value has been indicated (activity inhibiting power CETP) and the INR value which expresses the inhibitory power of peptides compared to the inhibitory power of apoAII at a concentration of 20 μM.
Les peptides selon l'invention sont des inhibiteurs de la CETP et de ce fait, leur aptitude à ralentir ou inhiber le transfert du cholestérol, des tπglycéπdes, des esters de rétinol ou des phospholipides peut être mise à profit pour en faire des pπncipes actifs de médicaments.The peptides according to the invention are CETP inhibitors and therefore their ability to slow down or inhibit the transfer of cholesterol, glycosides, esters of retinol or phospholipids can be used to make active pπncipes of drugs.
Conviennent notamment les peptides de formule I ci-dessus où x est compris entre 8 et 15. d'une part, et entre 20 et 23, d'autre part. Un autre objet de l'invention concerne donc des compositions phar¬ maceutiques contenant un ou plusieurs peptides selon l'invention en quantité théra- peutiquement efficace et en association avec un excipient physiologiquement acceptable.Particularly suitable are the peptides of formula I above where x is between 8 and 15. on the one hand, and between 20 and 23, on the other hand. Another subject of the invention therefore relates to pharmaceutical compositions containing one or more peptides according to the invention in a therapeutically effective amount and in association with a physiologically acceptable excipient.
De telles compositions pharmaceutiques sont, de préférence, destinées au traitement préventif ou curatif des affections liées aux hypercholesterolemies.Such pharmaceutical compositions are preferably intended for the preventive or curative treatment of conditions linked to hypercholesterolemia.
En particulier ces compositions pharmaceutiques trouvent leur utilisation préférée dans la prophylaxie des plaques d'athérome. la régression des plaques d'athérome et la diminution des risques d'accidents cardio-vasculaires. In particular, these pharmaceutical compositions find their preferred use in the prophylaxis of atheroma plaques. the regression of atherosclerotic plaques and the reduction of the risks of cardiovascular accidents.
TABLEAU ITABLE I
Figure imgf000020_0001
TABLEAU II
Figure imgf000020_0001
TABLE II
Figure imgf000021_0001
LISTE DE SEQUENCES
Figure imgf000021_0001
LIST OF SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE :(1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSANT:(i) DEPOSITOR:
(A) NOM: LABORATOIRES FOURNIER S.C.A.(A) NAME: LABORATOIRES FOURNIER S.C.A.
(B) RUE: 9, rue Petitot(B) STREET: 9, rue Petitot
(C) VILLE: DIJON(C) CITY: DIJON
(E) PAYS: FRANCE(E) COUNTRY: FRANCE
(F) CODE POSTAL (ZIP) : 21000(F) POSTAL CODE (ZIP): 21000
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Peptides inhibiteurs de la protéine de transfert des esters de cholestérol et leur utilisation en thérapeutique(ii) TITLE OF THE INVENTION: Peptides that inhibit the cholesterol ester transfer protein and their use in therapy
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 20(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 20
(iv) FORME LISIBLE SUR ORDINATEUR:(iv) COMPUTER-READABLE FORM:
(A) TYPE DE MEDIUM: Disquette(A) TYPE OF MEDIUM: Diskette
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) SYSTEME DE TRAITEMENT: PC-DOS/MS-DOS(C) PROCESSING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO)(D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0, Version # 1.25 (EPO)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:(vi) DATA FROM THE PREVIOUS APPLICATION:
(A) NUMERO DE DEPOT: FR 9410037(A) DEPOSIT NUMBER: FR 9410037
(B) DATE DE DEPOT: 16-AOUT-1994(B) DEPOSIT DATE: AUGUST 16, 1994
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 1:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 51 acides aminés(A) LENGTH: 51 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:(Xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Glu Lys Val Lys Ser Pro Glu Leu Gin Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe 1 5 10 15Glu Lys Val Lys Ser Pro Glu Leu Gin Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe 1 5 10 15
Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr 20 25 30Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr 20 25 30
Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro 35 40 45Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro 35 40 45
Ala Thr Gin 50Ala Thr Gin 50
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO:12:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 43 acides aminés(A) LENGTH: 43 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Gin Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr 1 5 10 15Gin Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr 1 5 10 15
Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr 20 25 30Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr 20 25 30
Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 35 40Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 35 40
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 3:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 acides aminés(A) LENGTH: 42 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:(Xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro 1 5 10 15Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro 1 5 10 15
Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe 20 25 30Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe 20 25 30
Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 35 40Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 35 40
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 4:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 41 acides aminés(A) LENGTH: 41 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:(Xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu 1 5 10 15Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu 1 5 10 15
Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val 20 25 30Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val 20 25 30
Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 35 40Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 35 40
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 5:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 40 acides aminés(A) LENGTH: 40 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile 1 5 10 15Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile 1 5 10 15
Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu 20 25 30Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu 20 25 30
Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 35 40Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 35 40
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 6:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 acides aminés(A) LENGTH: 39 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys 1 5 10 15Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys 1 5 10 15
Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu 20 25 30Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu 20 25 30
Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 35Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 35
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 7:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 acides aminés(A) LENGTH: 37 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala 1 5 10 15Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala 1 5 10 15
Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr 20 25 30Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr 20 25 30
Gin Pro Ala Thr Gin 35Gin Pro Ala Thr Gin 35
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 8:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 35 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE: (A) LENGTH: 35 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr 1 - 5 10 15Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr 1 - 5 10 15
Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro 20 25 30Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro 20 25 30
Ala Thr Gin 35Ala Thr Gin 35
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 9:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUE DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 acides aminés(A) LENGTH: 33 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu 1 5 10 15Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu 1 5 10 15
Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr 20 25 30Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr 20 25 30
GinGin
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 10:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 acides aminés(A) LENGTH: 31 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:(Xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val AsnGlu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn
1 5 10 151 5 10 15
Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 20 25 30Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 20 25 30
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 11:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 acides aminés(A) LENGTH: 29 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu 1 5 10 15Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu 1 5 10 15
Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 20 25Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 20 25
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 12:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 acides aminés(A) LENGTH: 27 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:(Xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr 1 5 10 15Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr 1 5 10 15
Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 20 25Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 20 25
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 13:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés(A) LENGTH: 25 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val 1 5 10 15Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val 1 5 10 15
Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 20 25Glu Leu Gly Thr Gin Pro Ala Thr Gin 20 25
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 14:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 acides aminés(A) LENGTH: 23 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu LeuLys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu
1 5 10 151 5 10 15
Gly Thr Gin Pro Ala Thr GinGly Thr Gin Pro Ala Thr Gin
2020
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 15:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 acides aminés(A) LENGTH: 21 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly ThrGly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr
1 5 10 151 5 10 15
Gin Pro Ala Thr Gin 20Gin Pro Ala Thr Gin 20
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 16:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 acides aminés(A) LENGTH: 38 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr ProAla Glu Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro
1 5 10 151 5 10 15
Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe 20 25 30Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe 20 25 30
Val Glu Leu Gly Thr Gin 35Val Glu Leu Gly Thr Gin 35
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 17:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 acides aminés(A) LENGTH: 36 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile(Xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: Ala Lys Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile
1 5 10 151 5 10 15
Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu 20 25 30Lys Lys Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu 20 25 30
Leu Gly Thr Gin 35Leu Gly Thr Gin 35
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 18:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 acides aminés(A) LENGTH: 34 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:(Xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
Ser Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys LysSer Tyr Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys
1 5 10 151 5 10 15
Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly 20 25 30Ala Gly Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly 20 25 30
Thr GinThr gin
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 19:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 acides aminés(A) LENGTH: 32 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala GlyPhe Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly
1 5 10 151 5 10 15
Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin 20 25 30Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin 20 25 30
(2) INFORMATION POUR SEQ ID NO: 20:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUE DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 47 acides aminés(A) LENGTH: 47 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) TOPOLOGIE: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:(ii) TYPE OF MOLECULE: peptide (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
Glu Lys Val Lys Ser Pro Glu Leu Gin Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe 1 5 10 15Glu Lys Val Lys Ser Pro Glu Leu Gin Ala Glu Ala Lys Ser Tyr Phe 1 5 10 15
Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr 20 25 30Glu Lys Ser Lys Glu Gin Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr 20 25 30
Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin 35 40 45 Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gin 35 40 45

Claims

REVENDICATIONS
1. Peptide. fragment de l'apoprotéine AU, caractérisé en ce qu'il répond à la formule :1. Peptide. fragment of the apoprotein AU, characterized in that it corresponds to the formula:
ΔNx Pep ΔCy (I)ΔNx Pep ΔCy (I)
dans laquelle :in which :
Pep est le fragment 27-77 de l'apoprotéine AU (forme monomère) et correspond à la séquence :Pep is the 27-77 fragment of the apoprotein AU (monomeric form) and corresponds to the sequence:
EKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSYEKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSY
FVELGTQPAT QFVELGTQPAT Q
(SEQ. ID. No 1)(SEQ. ID. No 1)
ΔNx correspond à une délétion des x acides aminés N-terminaux du peptide Pep défini ci-dessus.ΔNx corresponds to a deletion of the x N-terminal amino acids of the Pep peptide defined above.
ΔCy correspond à une délétion des y acides aminés C-terminaux du peptideΔCy corresponds to a deletion of the y C-terminal amino acids of the peptide
Pep défini ci-dessus, x est un nombre entier compris entre 0 et 31 (ces valeurs étant incluses), y est un nombre entier compris entre 0 et 4 (ces valeurs étant incluses), à l'exclusion des peptides pour lesquels les valeurs du couple (x, y) sont respectivement : (0,0) ; ( 13,0) ; (20.0) ; (23.0) ; (25,0) ; (27.0) ; (28,0) ; (29,0) ; (30,0) et (31 ,0).Pep defined above, x is an integer between 0 and 31 (these values being included), y is an integer between 0 and 4 (these values being included), excluding peptides for which the values of the couple (x, y) are respectively: (0,0); (13.0); (20.0); (23.0); (25.0); (27.0); (28.0); (29.0); (30.0) and (31.0).
2. Peptide selon la revendication 1 , caractérisé en ce que dans la formule I, x est compris entre 8 et 15. 2. Peptide according to claim 1, characterized in that in formula I, x is between 8 and 15.
3. Peptide selon la revendication 1 , caractérisé en ce que dans la formule3. Peptide according to claim 1, characterized in that in the formula
I, x est compris entre 20 et 23.I, x is between 20 and 23.
4. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient, en association avec un excipient physiologiquement acceptable, au moins un peptide de formule : ΔNx Pep ΔCy (I)4. Pharmaceutical composition, characterized in that it contains, in association with a physiologically acceptable excipient, at least one peptide of formula: ΔNx Pep ΔCy (I)
dans laquelle :in which :
Pep est le fragment 27-77 de l 'apoprotéine Ail (forme monomère) et correspond à la séquence :Pep is fragment 27-77 of the apoprotein Ail (monomeric form) and corresponds to the sequence:
EKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSYEKVKSPELQA EAKSYFEKSK EQLTPLIKKA GTELVNFLSY
FVELGTQPAT QFVELGTQPAT Q
(SEQ. ID No l)(SEQ. ID No l)
ΔNx correspond à une délétion des x acides aminés N-terminaux du peptideΔNx corresponds to a deletion of the x N-terminal amino acids of the peptide
Pep défini ci-dessus.Pep defined above.
ΔCy correspond à une délétion des y acides aminés C-terminaux du peptideΔCy corresponds to a deletion of the y C-terminal amino acids of the peptide
Pep défini ci-dessus, - x est un nombre entier compris entre 0 et 31 (ces valeurs étant incluses), y est un nombre entier compris entre 0 et 4 (ces valeurs étant incluses), selon une quantité thérapeutiquement efficace.Pep defined above, - x is an integer between 0 and 31 (these values being included), y is an integer between 0 and 4 (these values being included), in a therapeutically effective amount.
5. Composition pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est destinée au traitement ou à la prévention des affections liées aux hypercholesterolemies.5. Pharmaceutical composition according to claim 4, characterized in that it is intended for the treatment or prevention of conditions linked to hypercholesterolemia.
6. Composition pharmaceutique selon la revendication 4. caractérisée en ce qu'elle est destinée à la prophylaxie ou la régression des plaques d'athérome et/ou la diminution des risques d'accidents cardio-vasculaires. 6. Pharmaceutical composition according to claim 4. characterized in that it is intended for the prophylaxis or the regression of atheroma plaques and / or the reduction of the risks of cardiovascular accidents.
PCT/FR1995/001076 1994-08-16 1995-08-10 Peptides inhibiting the cholesterol ester transfer protein and therapeutic uses thereof WO1996005227A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9410037A FR2723741A1 (en) 1994-08-16 1994-08-16 PEPTIDES INHIBITORS OF CHOLESTEROL ESTER TRANSFER PROTEIN AND THEIR USE IN THERAPEUTICS
FR94/10037 1994-08-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1996005227A1 true WO1996005227A1 (en) 1996-02-22

Family

ID=9466321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1995/001076 WO1996005227A1 (en) 1994-08-16 1995-08-10 Peptides inhibiting the cholesterol ester transfer protein and therapeutic uses thereof

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2723741A1 (en)
WO (1) WO1996005227A1 (en)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999016458A1 (en) * 1997-09-29 1999-04-08 Dasseux Jean Louis Apolipoprotein a-i agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
WO1999016459A1 (en) * 1997-09-29 1999-04-08 Dasseux Jean Louis Apolipoprotein a-i agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
EP1019010A1 (en) * 1997-09-29 2000-07-19 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein a-i agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US7994120B2 (en) 2002-05-17 2011-08-09 Pfizer, Inc. Method of treating dyslipidemic disorder
WO2012027331A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome and related diseases and disorders
US20180031574A1 (en) * 2015-03-02 2018-02-01 Toray Industries, Inc. Method and kit for the detection of pancreatic dysfunction
CN109096390A (en) * 2018-07-12 2018-12-28 安陆恩彼饲料有限公司 A kind of manufacturing method of human blood high density lipoprotein

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993011782A1 (en) * 1991-12-19 1993-06-24 Southwest Foundation For Biomedical Research Cetp inhibitor polypeptide, antibodies against the synthetic polypeptide and prophylactic and therapeutic anti-atherosclerosis treatments

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993011782A1 (en) * 1991-12-19 1993-06-24 Southwest Foundation For Biomedical Research Cetp inhibitor polypeptide, antibodies against the synthetic polypeptide and prophylactic and therapeutic anti-atherosclerosis treatments

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHATNAGAR, PRADIP K. ET AL: "The application of an improved solid phase synthetic technique to the delineation of an antigenic site of apolipoprotein A-II", PEPTIDES (FAYETTEVILLE, N. Y.) (1983), 4(3), 343-9 CODEN: PPTDD5;ISSN: 0196-9781 *
K.-A. RYE ET AL.: "Changes in the size of reconstituted high density lipoproteins during incubation with cholesteryl ester transfer protein: the role of apolipoproteins", JOURNAL OF LIPID RESEARCH, vol. 33, no. 2, pages 215 - 224 *
L. LAGROST ET AL.: "Influence of Apolipoprotein Composition of High Density Lipoprotein Particles on Cholesteryl Ester Transfer Protein Activity", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 269, no. 5, 4 February 1994 (1994-02-04), BALTIMORE, MD US, pages 3189 - 3197 *
MAO, S. J. T. ET AL: "Mechanism of lipid-protein interaction in the plasma lipoproteins: lipid-binding properties of synthetic fragments of apolipoprotein A-II", BIOCHEMISTRY (1977), 16(19), 4150-6 CODEN: BICHAW *
MAO, SIMON J. T. ET AL: "Mechanism of lipid-protein interaction in the plasma lipoproteins: identification of a lipid-binding site in apolipoprotein A-II", BIOCHEMISTRY (1981), 20(6), 1676-80 CODEN: BICHAW;ISSN: 0006-2960 *
ZHONG, SHAOBIN ET AL: "Human apoA-II inhibits the hydrolysis of HDL triglyceride and the decrease of HDL size induced by hypertriglyceridemia and cholesteryl ester transfer protein in transgenic mice", J. CLIN. INVEST. (1994), 94(6), 2457-67 CODEN: JCINAO;ISSN: 0021-9738 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1854471A1 (en) * 1997-09-29 2007-11-14 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6716816B1 (en) 1997-09-29 2004-04-06 Jean-Louis Dasseux Multimeric Apo A-I agonist compounds
WO1999016458A1 (en) * 1997-09-29 1999-04-08 Dasseux Jean Louis Apolipoprotein a-i agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
EP1019010A4 (en) * 1997-09-29 2003-07-23 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein a-i agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US7312190B2 (en) 1997-09-29 2007-12-25 Jean-Louis Dasseux Pharmaceutical compositions of apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6753313B1 (en) 1997-09-29 2004-06-22 Jean-Louis Dasseux Multimeric Apoa-I agonist compounds
US6900177B1 (en) 1997-09-29 2005-05-31 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US7566695B2 (en) 1997-09-29 2009-07-28 Pfizer Inc. Multimeric apoprotein agonists
EP1019010A1 (en) * 1997-09-29 2000-07-19 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein a-i agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
WO1999016459A1 (en) * 1997-09-29 1999-04-08 Dasseux Jean Louis Apolipoprotein a-i agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US7273848B2 (en) 1997-09-29 2007-09-25 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US7994120B2 (en) 2002-05-17 2011-08-09 Pfizer, Inc. Method of treating dyslipidemic disorder
WO2012027331A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing metabolic syndrome and related diseases and disorders
US20180031574A1 (en) * 2015-03-02 2018-02-01 Toray Industries, Inc. Method and kit for the detection of pancreatic dysfunction
US11162956B2 (en) * 2015-03-02 2021-11-02 Toray Industries, Inc. Method and kit for the detection of pancreatic dysfunction
US11733250B2 (en) 2015-03-02 2023-08-22 Toray Industries, Inc. Method and kit for the detection of pancreatic dysfunction
CN109096390A (en) * 2018-07-12 2018-12-28 安陆恩彼饲料有限公司 A kind of manufacturing method of human blood high density lipoprotein

Also Published As

Publication number Publication date
FR2723741A1 (en) 1996-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3754072B2 (en) Antifeedant peptide
DE69837809T2 (en) APOLIPOPROTEIN A-I AGONISTS AND THEIR USE FOR THE TREATMENT OF DISLIPIDEMIC ILLNESSES
DE69837855T2 (en) APOLIPOPROTEIN A-I AGONISTS AND THEIR APPLICATION FOR THE TREATMENT OF DYSLIPIDARY DISEASE
US5238920A (en) Pulmonary surfactant protein fragments
EP0093652B1 (en) Synthetic toxin st, process for its preparation and its use as a vaccination agent
EP0293357B1 (en) Expression of human proapolipoprotein a-1
DE69839014T2 (en) APOLIPOPROTEIN A-I AGONISTS AND THEIR USE FOR THE TREATMENT OF DYSLIPIDARY DISEASES
WO1990012806A1 (en) Synthetic peptides of the conjugate of ubiquitine and histone h2a
EP0314576B1 (en) Tetra and pentapeptides with the sequence lysyl-arginyl-aspartyl, and their use as antithrombotics
KR100204738B1 (en) Inhibiting peptide of cholesteryl ester transfer protein and preventing and treating agents for atherosclerosis containing the same
FR2671086A1 (en) OPIOUID PEPTIDES, THEIR PREPARATION METHOD, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THESE PEPTIDES.
WO1996005227A1 (en) Peptides inhibiting the cholesterol ester transfer protein and therapeutic uses thereof
EP0750508B1 (en) RETROPEPTIDES, ANTIBODIES THERETO, AND USES THEREOF FOR VACCINATION AND $i(IN VITRO) DIAGNOSIS
EP0538352B1 (en) IMMUNOGENIC PEPTIDE SEQUENCE FROM $i(ECHINOCOCCUS GRANULOSUS), DNA SEQUENCE CODING FOR SAID PEPTIDE SEQUENCE, AND DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES THEREOF
JP3944083B2 (en) High density lipoprotein reactive peptide
JPS60501710A (en) Novel peptide hormone with calcitonin-like activity
JP2673659B2 (en) peptide
JPH04266899A (en) Synthetic peptide derived from human lipocortin and use thereof
FR2532850A1 (en) Immunogenic conjugates between a hapten and a carrier molecule derived from a toxin, vaccines comprising them and method for obtaining them
JP3770659B2 (en) Novel peptide and method for producing the same
CA2315294C (en) Use of citrulline peptides derived from filaggrin for treating autoimmune diseases
EP0348399B1 (en) Sorbin and peptide derivatives which increase aborption by the mucous membranes
Jaffe Biochemical analysis of the ligand binding domain of the LDL receptor
JP2965682B2 (en) New peptides, their production methods and applications
JPH05331190A (en) New peptide and its production

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA FI JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase