WO1991016080A1 - Contrast medium, process for its preparation and application to imagery - Google Patents

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WO1991016080A1
WO1991016080A1 PCT/FR1991/000301 FR9100301W WO9116080A1 WO 1991016080 A1 WO1991016080 A1 WO 1991016080A1 FR 9100301 W FR9100301 W FR 9100301W WO 9116080 A1 WO9116080 A1 WO 9116080A1
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WO
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composition according
erythrocytes
contrast
encapsulated
contrast product
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Application number
PCT/FR1991/000301
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Catherine Chambon
Claude Ropars
Roger Kravtzoff
Original Assignee
Guerbet S.A.
Fondation Nationale De Transfusion Sanguine
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1896Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes not provided for elsewhere, e.g. cells, viruses, ghosts, red blood cells, virus capsides
    • AHUMAN NECESSITIES
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    • A61K49/0433X-ray contrast preparations containing an organic halogenated X-ray contrast-enhancing agent
    • A61K49/0447Physical forms of mixtures of two different X-ray contrast-enhancing agents, containing at least one X-ray contrast-enhancing agent which is a halogenated organic compound

Definitions

  • the present invention relates to a composition modifying the contrast in X-ray imaging, nuclear magnetic resonance (IR) or ultrasound.
  • composition also relates to a process for the preparation of this composition and to its application in angiography, in imaging of the volume and blood flow of organs, and in monitoring, for example, ischemia and infarction without reinjection.
  • X-ray imaging is based on differences in X-ray attenuation from one tissue to another.
  • the anatomical structures have different radiological opacities, which translate into radiological contrasts.
  • This contrast is due to differences in average density and anatomical composition. It can be produced artificially.
  • This is how a hollow organ can be made visible by filling it with a contrast product, or by replacing its liquid content with a product. of. contrast, for example air for cerebral ventriculography and iodine solutions for radiography of the vessels.
  • Some . Organs can also be visualized by the introduction into the circulation of a contrast agent which is concentrated in these regions. This is particularly the case for urography or cholecystography.
  • water-soluble iodinated contrast agents are used which, after injection by vascular route, are distributed in the vascular system and the interstitial space. They are not metabolized and are rapidly eliminated via the urine. These products are characterized by a strong extravascular diffusion which requires the bolus injection of the product and possibly re-injections at regular intervals to maintain the contrast at a sufficient level.
  • a homogeneous main magnetic field and a high frequency electromagnetic field perpendicular to the first are applied to the tissue examined.
  • the images formed are reconstructed from signals emitted by the atoms of the organism.
  • the second field is interrupted, the energy absorbed by the material during the excitation process is restored by the nuclei whose magnetic moment will again align with the direction of the main magnetic field.
  • the low energy emitted, called precession energy decreases according to a relaxation phenomenon. Relaxation is broken down into two processes:
  • the acquisition sequences of signals weighted in T1 or T2 make it possible to obtain information on the morphology and physiology of the organs studied but also on their composition.
  • the sample must contain a large number of nuclei having a magnetic moment, in particular the hydrogen (H), phosphorus- (31 P) and carbon (13 VS).
  • MRI therefore faces a problem of sensitivity and contrast.
  • Paramagnetic and superparat contrast agents. magnets are particularly suitable for locally modifying the relaxation times T1 and T2. They allow the diagnosis according to their location. Visualization of the circulatory system and organ perfusion rate can be particularly useful, especially in the phenomena of hypoperfusion and ischemia or in hyperperfusion of certain tumor processes.
  • DTPA gadolinium U.S. Patent 647,447
  • superparamagnetic colloids of the dextran iron oxide type These agents have a molecular weight (590 for Gd DTPA) which leads to their passage into the interstitial space and rapid renal elimination.
  • red blood cells marked with chromium Invest. Radiol., 1989, 2_4_, 742-753
  • the marking of red blood cells with Cr is conventionally used in nuclear medicine. Erythrocytes are incubated with Na ⁇ j CrO 2 at different concentrations, CrO. 2- after penetration through the membrane is reduced to Cr, with paramagnetic properties, which binds to the hemoglobin molecule.
  • the relaxation times of the red cells are markedly reduced '.
  • chromium is cytotoxic at doses useful in NMR, and the hemolysis of red cells labeled with chromium is greater. The half-life of these red cells is reduced by a factor of 4, compared to normal canine red cells, whose half-life is 19 days.
  • Ultrasound imaging is based on the fact that ultrasound waves propagate in a given medium with a speed depending on the nature of the latter. At the interface between two media of different natures, part of the wave is reflected and the other transmitted. By analyzing the reflected or transmitted signals, it is thus possible to obtain either images by transmission or images by reflection which make it possible to visualize the interfaces between the different media, the latter technique being used under the name of ultrasound ultrasound. It may therefore be advantageous to use a contrast product capable of modifying the transmission and reflection parameters of the ultrasonic wave, in order to obtain better visualization, for example of an organ or of the vascular system.
  • the present invention therefore relates to a contrast composition, characterized in that it comprises a hydrophilic or water-soluble or colloidal contrast product, for example a superparamagnetic colloid or a gas in the form of bubbles, encapsulated by a lysis / resealing technique. in erythrocytes, and in that it further comprises an acceptable carrier for administration by the enteral or parenteral route.
  • contrast product is meant any product capable of improving contrast in imaging, in particular in medical imaging, in particular in X-ray imaging, in magnetic resonance imaging, and in ultrasound imaging. For X-ray imaging, the product is opaque to rays
  • X It may in particular be a polyiodic acid salt.
  • the product modifying the contrast is a substance capable of locally influencing the magnetic field applied, preferably a paramagnetic complex or a biodegradable superparamagnetic colloid such as iron oxide particles coated with dextran.
  • the effect on the acceleration of proton relaxation is due to:
  • This complex can be chosen from complexes formed from a cyclic or acyclic ligand having coordination atoms chosen from oxygen, nitrogen, phosphorus, sulfur and a metal chosen from lanthanides or metals of transition, including gadolinium, dysprosium, manganese and iron.
  • Gd-DTPA diethylene triamine penta-acetic acid
  • Gd -DOTA 1,4,7,10 tetra-aza-cyclododecane-N-N'-N "-N '" - tetra-acetic acid
  • Gd-MCTA 2-methyl- 1,4,7,10 tetra-aza-cyclododecane-N-N'-N "-N "'tetra-acetic
  • Gd-D03A the gadolinium complex of 1,4,7,10 tetra-aza-cyclododecane-N- -N'-N "tri-acetic acid
  • Gd-HPD03A the gadolinium complex of 1,4,7,10 tetra-aza-cyclododecane N-2-hydroxy-propyl, N'-N ", N '" triacetic
  • Contrast media of the triode acid or paramagnetic complex salt type may also be used in ultrasound imaging.
  • the product encapsulated in the erythrocytes may also be a gas in the form of bubbles.
  • this gas may be air, nitrogen or carbon dioxide.
  • hydrophilic or water-soluble products is intended to denote both the contrast products having these characteristics and the products which have undergone this treatment making them hydrophilic and / or water-soluble.
  • This product is encapsulated in erythrocytes by a lysis / resealing technique.
  • erythrocyte encapsulation techniques There are three types of erythrocyte encapsulation techniques:
  • erythrocytes like all cells, can be lysed under certain conditions, in particular osmotic pressure. But the erythrocyte membrane can be reconstituted after lysis, ie resealing. It is therefore possible to introduce certain exogenous components into the erytrhocytes.
  • the red blood cells are directly diluted in a hypotonic medium.
  • the highly hematocrit erythrocyte suspension (70 to 80%) is kept in a dialysis bag and dialyzed against a hypotonic buffer. The hemolysis is then progressive and can easily be controlled by modifying the dialysis time.
  • This application describes a method of encapsulation in human or animal erythrocytes of a substance exhibiting a biological activity, by a dialysis technique suitable for continuous flow.
  • the present invention relates to a process for the preparation of a composition, characterized in that:
  • the erythrocytes are placed in a dialysis compartment, the other compartment containing an aqueous solution hypotonic with respect to the suspension of erythrocytes in order to lyse the erythrocytes.
  • the erythrocytes brought into contact with the contrast product are resealed by increasing the osmotic pressure by encapsulating said contrast product.
  • the erythrocytes are separated from the reaction medium,
  • the erythrocytes are placed in a support suitable for enteral or parenteral administration in order to obtain a contrast composition.
  • dialysis is carried out in a dialysis bag, against a hypotonic solution. The lysate is brought into contact with the active product and the resealing is carried out by adding a hypertonic solution.
  • the preferred encapsulation method is the continuous dialysis method.
  • the erythrocytes are separated from the plasma and washed and placed in aqueous suspension, then continuously feed the primary compartment of a dialyzer.
  • a dialysis buffer circulates against the current, hypotonic with respect to the suspension of erythrocytes.
  • the erythrocyte lysate is brought into contact with the product to be encapsulated, this substance being introduced before, during or after lysis.
  • the product enters the erythrocyte and the cell is resealed by increasing the osmotic pressure by adding a hypertonic solution.
  • the erythrocyte suspension is centrifuged to remove unencapsulated molecules and hemoglobin from the intercellular fluid. The erythrocytes are then washed and resuspended in plasma to a physiological hematocrit.
  • the intra-erythrocytic iodine concentration in the composition could be between 1 and 300 g of iodine per liter of packed red cells.
  • the intraerythrocytic concentration of complexed paramagnetic metal is between 0.02 mM and 0.5 M in the globular base.
  • the present invention relates to the application of the contrast composition defined above to imaging the circulatory system, the vascularized organs and small cavities, characterized in that the composition is injected enterally or parenterally, and in that these elements are visualized by an appropriate means, chosen from X-ray, nuclear magnetic resonance or ultrasound imaging.
  • the administration of the composition can be done enterally.
  • the composition can also be introduced into a small cavity in the body, the contrast of which is to be modified in imaging.
  • the composition according to the invention can be injected parenterally, in particular by intravenous or ' intraarterial route.
  • the pharmacokinetics of the product will be that of erythro ⁇ cytes. This application will therefore allow the imaging of all vascularized organs and situations of vascular pathology, rupture or vascular changes.
  • composition may be injected in doses ranging from 1 to
  • An application of this invention is characterized in that the erythrocytes are removed from a patient, in that they are treated so as to encapsulate a contrast product and in that they are reinjected into the patient.
  • the human erythrocytes are removed from an anticoagulant solution of citrate phosphate dextrose.
  • the plasma is decanted and the leukocytes, platelets and plasma are eliminated, by prewashing and centrifuging the erythrocytes.
  • the globular pellet is adjusted to the desired concentration and incubated for 30 min at 4 ° C.
  • the next step is to lyse / reseal the erythrocytes.
  • the erythrocytic solution and a hypotonic lysis solution, against the current, are circulated in a plate dialyzer. These steps are carried out at 4 ° C.
  • the erythrocytes swell and the pores open.
  • DOTA Gd is added to the erythrocyte lysate, continuously.
  • the properties of the erythrocyte are restored by warming the solution to 37 ° C. and adding a hypertonic resealing solution. Resealing is continued by incubation for 30 min at 37 ° C.
  • the erythrocyte suspension is then centrifuged to remove the non-encapsulated molecules and the hemoglobin.
  • the erythrocytes are resuspended in a physiological medium.
  • Figure 1 Stability of the encapsulated gadolinium at 4 ° C.
  • Figure 2 Stability of the encapsulated gadolinium at 37 ° C.
  • the units of blood used during this study are: - either units taken from citrate phosphate dextrose solution (CPD) at a concentration of 63 ml per 450 ml of blood collected, stored at 4 ° C for a week or more, - or globular concentrates stored in SAG.M at 4 ° C for a week at most.
  • CPD citrate phosphate dextrose solution
  • Citric acid 1 H_0 3.27 g
  • Glucose 23.20 g Water ppi qs 100 ml The plasma is decanted and the red cells prewashed in order to remove the leukocytes, platelets and plasma.
  • the blood pellet is adjusted to the desired concentration of cells and the hematological parameters are measured on a sample.
  • Lysis is carried out in a Gambro plate dialyzer
  • the lysis buffer consists of this solution diluted with
  • dialysis buffer 160 ml / min.
  • dialysis conditions vary depending on the blood flow and hematocrit.
  • the hematocrit of the blood cell must be high enough to avoid significant loss of the cytoplasmic content of red blood cells; however, it must remain low enough to allow significant swelling of the red blood cell during dialysis without inducing excessive pressure in the dialyzer. c) Introduction of the active ingredient
  • dialysable molecules it is preferable to add the active principle directly into the lysate continuously at the outlet of the dialyzer.
  • Restoration of the isotonicity of the lysed globular suspension is carried out after reheating to 37 ° C. by addition of a hypertonic resealing solution due to one volume per ten volumes of lysate. Resealing is continued for 30 minutes by incubating red blood cells in a water bath at 37 ° C.
  • the resealing solution consists of a 2 M NaCl ' mixture and PIGPA.
  • the erythrocyte suspension is centrifuged to remove the non-encapsulated molecules and the hemoglobin from the intercellular fluid.
  • mice used in this study are Swiss mice from livestock January or 'breeding laboratory. Whole blood is taken from heparin after anesthesia of the animals with ether, by incision in the lateral thoracic part, section of the brachial artery and collection with a pasteur pipette.
  • Washing operations are carried out in a tube.
  • Dialysis is carried out in a dialysis bag made of glycerolated cellulose (Poly lab).
  • the flat diameter is 2.54 cm while once inflated the diameter is 1.59 cm.
  • the membrane of these 20 ⁇ m thick bags has a permeability limit of 12,000 to 14,000. It is produced on 5 ml of 70% globular pellet in a dialysis bag placed in a 250 ml bottle containing the buffer. lysis. The bottle is fixed on a rotary shaker at 12 rpm maintained at 4 °.
  • Table 1 gives the hematological parameters and the DOTA encapsulation parameters. Gd in human red blood cells as a function of dialysis time. The encapsulation yields are calculated relative to the initial suspension of red blood cells (Yield encap / pool) or in relation to the concentration obtained in the lysate (Yield encap / lys).
  • VGM mean globular volume
  • TGMH average globular amount of hemoglobin
  • CCMH average globular hemoglobin concentration.
  • the suspension of red blood cells at 40% hematocrit in plasma is maintained at 4 ° C or 37 ° C.
  • an aliquot is taken, centrifuged at 1000 g, ten minutes at 4 ° C.
  • the gadolinium is then dosed on the globular pellet and on the supernatant.
  • the hematocrit of the pellet is measured to normalize all the dosages to the same hematocrit.
  • Figures 1 and 2 show the evolution, as a function of time, of the intraerythrocyte concentration of gadolinium after encapsulation of Dota-gadolinium for two intraerythrocyte concentrations.
  • GR 1 and GR2 are the intraerythrocytic concentrations of DOTA Gd
  • SP 1 and SP2 are the plasma concentrations of DOTA Gd, corresponding respectively to GR 1 and GR2.
  • the temperature has little impact on the release of DOTA Gd.
  • the relaxivity of DOTA Gd was measured in globular pellets (suspension of red blood cells with high hematocrit 80/90? O) washed after incorporation of DOTA Gd.
  • Gadolinium was assayed by atomic emission spectrophotometry (DCP).
  • the relaxation time Tl was determined on a Minispec BRUKER PC 20 at 20 MHz 0.5 T by inversion-recovery sequence at 37 ° C.
  • Table 8 gives the hematological parameters and the parameters for encapsulation of iopamidol in human red blood cells as a function of the dialysis time for an initial concentration of 10 mg / ml of erythrocyte suspension. It is possible to increase the final intraerythrocyte concentration by increasing the initial concentration of the erythrocyte suspension, thus for 60 minutes of dialysis and an initial concentration of 50 mg / ml, a concentration of 41.4 mg / ml at 100% of hematocrit can be obtained.
  • Table 8 Encapsulation of iopamidol in human red blood cells
  • Table 9 gives the encapsulation parameters and the hematological parameters for encapsulation of iopamidol in murine red blood cells.
  • the lifespan of the erythrocytes of mice containing iopamidol was made as in Example 6.
  • the iodine is measured by spectrophotometry in parallel with the gamma count of Cr.
  • Post-24 hour blood loss is monoexpo nneennttiieellllee aavveecc half-life of 12.9 to 7.9 days for Cr and iodine respectively

Abstract

A contrast medium characterized in that it comprises a hydrophilic or hydrosoluble or colloidal contrast product, for example, a superparamagnetic colloid, or a gas in bubbe form, encapsulated by a lysis resealing technique in erythrocytes, and in that it also includes an acceptable support for enteral or parenteral administration. The invention also relates to a process for the preparation of this composition. Application: imagery of the circulatory system, vascular organs and small cavities.

Description

COMPOSITION DE CONTRASTE , PROCEDE DE PREPARATION DE CETTE COMPOSITION ET APPLICATION A L ' IMAGERIE CONTRAST COMPOSITION, PROCESS FOR PREPARING THE COMPOSITION AND APPLICATION TO IMAGING
La présente invention se rapporte à une composition modifiant le contraste en imagerie aux rayons X, en résonance magnétique nucléaire (IR ) ou aux ultrasons.The present invention relates to a composition modifying the contrast in X-ray imaging, nuclear magnetic resonance (IR) or ultrasound.
Elle se rapporte également à un procédé de préparation de cette composition et en son application en angiographie, en imagerie du volume et du débit sanguin d'organes, et en suivi par exemple des ischémies et infarctus sans réinjection.It also relates to a process for the preparation of this composition and to its application in angiography, in imaging of the volume and blood flow of organs, and in monitoring, for example, ischemia and infarction without reinjection.
L'imagerie en rayons X repose sur des différences d'atténua¬ tions des rayons X d'un tissu à l'autre. Les structures anatomiques ont des opacités radiologiques différentes, qui se traduisent en contrastes radiologiques. Ce contraste est dû à des différences de densité moyenne et de composition anatomique. Il peut être produit artificiellement. C'est ainsi qu'un organe creux peut être rendu visible en le remplissant d'un produit de contraste, ou en remplaçant son contenu liquide par un produit . de. contraste, par exemple de l'air pour la ventriculographie cérébrale et des solutions iodées pour la radiographie des vaisseaux. Certains . organes peuvent aussi être visualisés par l'introduction dans la circulation d'un produit de contraste qui se concentre dans ces régions. C'est le cas notamment pour l'urographie ou la cholecystographie.X-ray imaging is based on differences in X-ray attenuation from one tissue to another. The anatomical structures have different radiological opacities, which translate into radiological contrasts. This contrast is due to differences in average density and anatomical composition. It can be produced artificially. This is how a hollow organ can be made visible by filling it with a contrast product, or by replacing its liquid content with a product. of. contrast, for example air for cerebral ventriculography and iodine solutions for radiography of the vessels. Some . Organs can also be visualized by the introduction into the circulation of a contrast agent which is concentrated in these regions. This is particularly the case for urography or cholecystography.
Pour la visualisation du système vasculaire en rayonsX, on utilise des produits de contraste iodés hydrosolubles, qui après injection par voie vasculaire, se répartissent dans le système vasculaire et l'espace interstitiel. Ils ne sont pas métabolisés et sont éliminés rapidement par voie urinaire. Ces produits sont caractérisés par une forte diffusion extravasculaire qui nécessite l'injection du produit en bolus et éventuel¬ lement des réinjections à intervalles réguliers pour maintenir le contraste à un niveau suffisant.For x-ray visualization of the vascular system, water-soluble iodinated contrast agents are used which, after injection by vascular route, are distributed in the vascular system and the interstitial space. They are not metabolized and are rapidly eliminated via the urine. These products are characterized by a strong extravascular diffusion which requires the bolus injection of the product and possibly re-injections at regular intervals to maintain the contrast at a sufficient level.
Dans l'imagerie en résonance magnétique, un champ magné¬ tique principal homogène et un champ électromagnétique à haute fréquence perpendiculaire au premier sont appliqués au tissu examiné. Les images formées sont reconstituées à partir de signaux émis par les atomes de l'organisme. Quand le second champ est interrompu, l'énergie absorbée par la matière lors du processus d'excitation est restituée par les noyaux dont le moment magnétique va à nouveau s'aligner avec la direction du champ magnétique principal. La faible énergie émise dite énergie de précession décroît selon un phénomène de relaxation. La relaxation se décompose en deux processus :In magnetic resonance imaging, a homogeneous main magnetic field and a high frequency electromagnetic field perpendicular to the first are applied to the tissue examined. The images formed are reconstructed from signals emitted by the atoms of the organism. When the second field is interrupted, the energy absorbed by the material during the excitation process is restored by the nuclei whose magnetic moment will again align with the direction of the main magnetic field. The low energy emitted, called precession energy, decreases according to a relaxation phenomenon. Relaxation is broken down into two processes:
- une relaxation spin-spin, caractérisée par une constante de temps T_,- spin-spin relaxation, characterized by a time constant T_,
- une relaxation spin-réseau, caractérisée par une constante de temps T . .- a spin-network relaxation, characterized by a time constant T. .
En IRM les séquences d'acquisition des signaux pondérés en Tl ou en T2 permettent d'obtenir des informations sur la morphologie et la physiologie des organes étudiés mais aussi sur leur composition.In MRI, the acquisition sequences of signals weighted in T1 or T2 make it possible to obtain information on the morphology and physiology of the organs studied but also on their composition.
Cependant, pour que le phénomène de R N soit observable, il faut que l'échantillon contienne un nombre important de noyaux ayant un moment magnétique, en particulier l'atome d'hydrogène ( H), phosphore- ( 31 P) et carbone ( 13 C). L'IRM se heurte donc à un problème de sensibilité et de contraste. Les agents de contraste paramagnétiques et superpara- t. magnétiques sont particulièrement adaptés pour modifier localement les temps de relaxation Tl et T2. Ils permettent le diagnostic en fonction de leur localisation. La visualisation du système circulatoire et du débit de perfusion des organes peut se révéler particulièrement utile, notamment dans les phénomènes d'hypoperfusion et d'ischémies ou dans les hyper- perfusions de certains processus tumoraux.However, for the phenomenon of RN to be observable, the sample must contain a large number of nuclei having a magnetic moment, in particular the hydrogen (H), phosphorus- (31 P) and carbon (13 VS). MRI therefore faces a problem of sensitivity and contrast. Paramagnetic and superparat contrast agents. magnets are particularly suitable for locally modifying the relaxation times T1 and T2. They allow the diagnosis according to their location. Visualization of the circulatory system and organ perfusion rate can be particularly useful, especially in the phenomena of hypoperfusion and ischemia or in hyperperfusion of certain tumor processes.
Du fait d'une élimination rénale ou hépatique et d'une diffusion extravascuiaire importantes, les agents de contraste classiques paramagnétiques et superparamagnetiques apparaissent inappropriés.Due to significant renal or hepatic elimination and extravascuarial diffusion, conventional paramagnetic and superparamagnetic contrast agents appear to be inappropriate.
Parmi les agents classiques, on peut citer les chélates de métaux comme le DTPA gadolinium (Brevet U.S. 647 447) ou des colloïdes superparamagnetiques de type dextran oxyde de fer. Ces agents ont un poids moléculaire (590 pour le Gd DTPA) qui entraîne leur passage dans l'espace interstitiel et une élimination rénale rapide.Among the conventional agents, mention may be made of metal chelates such as DTPA gadolinium (U.S. Patent 647,447) or superparamagnetic colloids of the dextran iron oxide type. These agents have a molecular weight (590 for Gd DTPA) which leads to their passage into the interstitial space and rapid renal elimination.
Les colloïdes sont rapidement captés par le système réticulo endothélial et fixés au niveau hépatique et splénique. Une autre voie d'amélioration des paramètres de relaxation du système vasculaire est l'utilisation d'hématies marquées au chrome (Invest. Radiol., 1989, 2_4_, 742-753). Le marquage des hématies au Cr est utilisé classiquement en médecine nucléaire. Des hématies sont incubées avec Na-jCrO^ 2- à différentes concentrations, CrO. 2- après pénétration à travers la membrane est réduit en Cr , aux propriétés paramagnétiques, qui se lie à la molécule d'hémoglobine. Les temps de relaxation des culots globulaires sont nettement diminués'. Cependant, le chrome est cytotoxique aux doses utiles en RMN, et l'hémolyse des hématies marquées au chrome est plus importante. La demie vie de ces hématies est diminuée d'un facteur 4, par rapport à des hématies canines normales, dont la demi-vie est de 19 jours.Colloids are quickly picked up by the reticuloendothelial system and fixed at the hepatic and splenic level. Another way of improving the parameters of relaxation of the vascular system is the use of red blood cells marked with chromium (Invest. Radiol., 1989, 2_4_, 742-753). The marking of red blood cells with Cr is conventionally used in nuclear medicine. Erythrocytes are incubated with Na ^ j CrO 2 at different concentrations, CrO. 2- after penetration through the membrane is reduced to Cr, with paramagnetic properties, which binds to the hemoglobin molecule. The relaxation times of the red cells are markedly reduced '. However, chromium is cytotoxic at doses useful in NMR, and the hemolysis of red cells labeled with chromium is greater. The half-life of these red cells is reduced by a factor of 4, compared to normal canine red cells, whose half-life is 19 days.
L'imagerie par ultra-sons repose sur le fait que les ondes ultra-sonores se propagent dans un milieu donné avec une vitesse dépendant- de la nature de ce dernier. A l'interface entre deux milieux de natures différentes, une partie de l'onde est réfléchie et l'autre transmise. En analysant les signaux réfléchis ou transmis, il est ainsi possible d'obtenir soit des images par transmission, soit des images par réflexion qui permettent de visualiser les interfaces entre les différents milieux, cette dernière technique étant utilisée sous le nom d'échographie ultrasonore. Il peut donc être intéressant d'employer un produit de contraste capable de modifier les paramètres de transmission et de réflexion de l'onde ultra-sonore, afin d'obtenir une meilleure visualisation par exemple d'un organe ou du système vasculaire. La présente invention se rapporte donc à une composition de contraste, caractérisée en ce qu'elle comprend un produit de contraste hydrophile ou hydrosoluble ou colloïdal, par exemple un colloïde superparamagnétique ou un gaz sous forme de bulles, encapsulé par une technique de lyse/ rescellement dans des erythrocytes, et en ce qu'elle comporte en outre un support acceptable pour l'administration par voie entéraie ou parentérale. Par produit contraste, on entend tout produit capable d'améliorer le contraste en imagerie notamment en imagerie médicale, en particulier en imagerie par RX, en imagerie par résonance magnétique, et en imagerie par ultra-sons. Pour l'imagerie en rayons X, le produit est opaque aux rayonsUltrasound imaging is based on the fact that ultrasound waves propagate in a given medium with a speed depending on the nature of the latter. At the interface between two media of different natures, part of the wave is reflected and the other transmitted. By analyzing the reflected or transmitted signals, it is thus possible to obtain either images by transmission or images by reflection which make it possible to visualize the interfaces between the different media, the latter technique being used under the name of ultrasound ultrasound. It may therefore be advantageous to use a contrast product capable of modifying the transmission and reflection parameters of the ultrasonic wave, in order to obtain better visualization, for example of an organ or of the vascular system. The present invention therefore relates to a contrast composition, characterized in that it comprises a hydrophilic or water-soluble or colloidal contrast product, for example a superparamagnetic colloid or a gas in the form of bubbles, encapsulated by a lysis / resealing technique. in erythrocytes, and in that it further comprises an acceptable carrier for administration by the enteral or parenteral route. By contrast product is meant any product capable of improving contrast in imaging, in particular in medical imaging, in particular in X-ray imaging, in magnetic resonance imaging, and in ultrasound imaging. For X-ray imaging, the product is opaque to rays
X. Il peut s'agir en particulier d'un sel d'acide polyiodé.X. It may in particular be a polyiodic acid salt.
Parmi les molécules préférées pouvant être encapsulées dans les erythrocytes, on peut citer les sels des acides polyiodés suivants :Among the preferred molecules which can be encapsulated in erythrocytes, mention may be made of the salts of the following polyiodic acids:
- l'acide acétrizoîque, - l'acide iothalamique,- acetrizoic acid, - iothalamic acid,
- l'acide ioxithalamique,- ioxithalamic acid,
- l'acide ioxaglique,- ioxaglic acid,
- et notamment leurs sels de sodium, lysine, N-méthyl-glucamine ou des composés non ioniques polyiodés : - le Iopamidol 1,3-benzenedicarboxamide, N-N'-bis [2-hydroxy-l-(hydroxy- méthyl)éthyl]-5-[(2-hydroxy-l-oxopropyl)amino]2,4,6-triiodo-- and in particular their sodium salts, lysine, N-methyl-glucamine or non-ionic polyiodinated compounds: - Iopamidol 1,3-benzenedicarboxamide, N-N'-bis [2-hydroxy-l- (hydroxy-methyl) ethyl ] -5 - [(2-hydroxy-1-oxopropyl) amino] 2,4,6-triiodo-
- le l,3-benzenedicarboxamide,5-[acétyl(2,3-dihydroxypropyl)amino]-N,N'- bis(2,3 dihydroxypropyI)2,4,6-triiodo-- 1,3-benzenedicarboxamide, 5- [acetyl (2,3-dihydroxypropyl) amino] -N, N'- bis (2,3 dihydroxypropyl) 2,4,6-triiodo-
- le Ioxilan l ,3-benzenedicarboxamide,5-[acetyl(2,3-dihydroxypropyl) -amino]-N-(2,3-dihydroxypropyl)-N'-(2-hydroxyethyl)2,4,6 -triiodo-- Ioxilan 1,3-benzenedicarboxamide, 5- [acetyl (2,3-dihydroxypropyl) -amino] -N- (2,3-dihydroxypropyl) -N '- (2-hydroxyethyl) 2,4,6 -triiodo-
- le lopromide 1,3-benzenedicarboxamide, N,N'-bis (2,3-dihydroxypropyl)] 2,4,6-triiodo-5-(methoxyacetyl)amino-N-méthyl-- lopromide 1,3-benzenedicarboxamide, N, N'-bis (2,3-dihydroxypropyl)] 2,4,6-triiodo-5- (methoxyacetyl) amino-N-methyl-
- le Iopentol l,3-benzenedicarboxamide,5-[acetyl(2-hydroxy-3-methoxy- propyl) amino-N-N'-bis (2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodo- - le Iotrolan l,3-benzenedicarboxamide,5,5'-[(l ,3-dioxo- l ,3-propanediyl) bis(methylimino)]bis[N,N'-bis[2,3-dihydroxy-l-(hydroxymethyl)propyl]-2,4, 6-triiodo- Iopentol 1,3-benzenedicarboxamide, 5- [acetyl (2-hydroxy-3-methoxy-propyl) amino-N-N'-bis (2,3-dihydroxypropyl) -2,4,6-triiodo- - Iotrolan 1,3-benzenedicarboxamide, 5,5 '- [(1,3-dioxo- 1,3-propanediyl) bis (methylimino)] bis [N, N'-bis [2,3-dihydroxy-l- (hydroxymethyl ) propyl] -2,4,6-triiodo
- le Iodixanol l,3-benzenedicarboxamide,5,5'-[(2-hydroxy-l,3-propan ediyDbis (acetylimino)]bis[N,N'-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodo- - le Ioversol 1,3 benzenedicarboxamide, N,N'-bis(2,3-dihydroxypropyl)-5-- Iodixanol 1,3-benzenedicarboxamide, 5,5 '- [(2-hydroxy-1,3-propan ediyDbis (acetylimino)] bis [N, N'-bis (2,3-dihydroxypropyl) -2,4, 6-triiodo- - Ioversol 1,3 benzenedicarboxamide, N, N'-bis (2,3-dihydroxypropyl) -5-
[(hydroxyacetyl) (2-hydroxyethyl)amino]-2,4,6-triiodo-. Pour l'IRM, le produit modifiant le contraste est une substance pouvant influencer localement le champ magnétique appliqué, de manière préférée un complexe paramagnetique ou un colloïde superparamagnétique biodégradable tel que des particules d'oxyde de fer enrobées par du dextran. L'effet sur l'accélération de la relaxation protonique est du :[(hydroxyacetyl) (2-hydroxyethyl) amino] -2,4,6-triiodo-. For MRI, the product modifying the contrast is a substance capable of locally influencing the magnetic field applied, preferably a paramagnetic complex or a biodegradable superparamagnetic colloid such as iron oxide particles coated with dextran. The effect on the acceleration of proton relaxation is due to:
- soit à une interaction dipolaire classique entre le spin nucléaire des protons des molécules d'eau et les électrons non appariés du métal (dans ce cas les complexes du manganèse n et du gadolinium Gd sont préférés) - soit à une différence de susceptibilité magnétique liée à la présence d'un complexe paramagnetique intraérythrocytaire (dans ce cas les complexes de dysprosium sont préférés).- either to a classic dipolar interaction between the nuclear spin of the protons of water molecules and the unpaired electrons of the metal (in this case the manganese n and gadolinium Gd complexes are preferred) - or to a difference in magnetic susceptibility linked the presence of an intraerythrocytic paramagnetic complex (in this case dysprosium complexes are preferred).
Ce complexe peut être choisi parmi les complexes formés à partir d'un ligand cyclique ou acyclique possédant des atomes de- coordination choisis parmi l'oxygène, l'azote, le phosphore, le soufre et un métal choisi parmi les lanthanides ou les métaux de transition, notamment le gadolinium, le dysprosium, le manganèse et le fer.This complex can be chosen from complexes formed from a cyclic or acyclic ligand having coordination atoms chosen from oxygen, nitrogen, phosphorus, sulfur and a metal chosen from lanthanides or metals of transition, including gadolinium, dysprosium, manganese and iron.
Parmi les complexes préférés encapsulables dans les erythrocytes humains, on peut citer : - le sel de N-méthyl-glucamine ou de sodium du complexe de gadolinium de l'acide diéthylène-triamine penta-acétique (Gd-DTPA),Among the preferred complexes which can be encapsulated in human erythrocytes, there may be mentioned: the N-methyl-glucamine or sodium salt of the gadolinium complex of diethylene triamine penta-acetic acid (Gd-DTPA),
- le sel de N-méthyl-glucamine ou de sodium du complexe de gadolinium de l'acide 1,4,7,10 tétra-aza-cyclododécane-N-N'-N"-N'"-tétra-acétique (Gd-DOTA), - le sel de N-methyl-glucamine ou de sodium du complexe de gadolinium de l'acide 2-méthyl- l ,4,7, 10 tétra-aza-cyclododécane-N-N'-N"-N"' tétra-acétique (Gd-MCTA)- the N-methyl-glucamine or sodium salt of the gadolinium complex of 1,4,7,10 tetra-aza-cyclododecane-N-N'-N "-N '" - tetra-acetic acid (Gd -DOTA), - the N-methyl-glucamine or sodium salt of the gadolinium complex of 2-methyl- 1,4,7,10 tetra-aza-cyclododecane-N-N'-N "-N "'tetra-acetic (Gd-MCTA)
- le complexe de gadolinium de l'acide 1,4,7,10 tétra-aza-cyclododécane-N- -N'-N" tri-acétique (Gd-D03A), - le complexe de gadolinium de l'acide 1,4,7, 10 tétra-aza-cyclododécane N-2-hydroxy-propyl, N'-N",N'" triacétique (Gd-HPD03A),- the gadolinium complex of 1,4,7,10 tetra-aza-cyclododecane-N- -N'-N "tri-acetic acid (Gd-D03A), the gadolinium complex of 1,4,7,10 tetra-aza-cyclododecane N-2-hydroxy-propyl, N'-N ", N '" triacetic (Gd-HPD03A),
- le complexe de gadolinium du N-N" bis-(méthyl-carbamoyl-méthyl)-dié- thylène triamine N,N', N" tri-acétique (Gd-DTPA-BMA). Ces complexes peuvent être neutres ou ioniques, en fonction des charges respectives du ligand et du métal complexé.- the gadolinium complex of N-N "bis- (methyl-carbamoyl-methyl) -diethylene triamine N, N ', N" tri-acetic (Gd-DTPA-BMA). These complexes can be neutral or ionic, depending on the respective charges of the ligand and the complexed metal.
Cette liste n'est pas limitée aux complexes neutres ni aux complexes salifiés avec le N-méthyl-glucamine et peut être étendue aux sels obtenus avec d'autres bases minérales (sodium, calcium) ou des bases organiques, notamment les amino-acides (lysine, arginine...). Les érythro-This list is not limited to neutral complexes or complexes salified with N-methyl-glucamine and can be extended to salts obtained with other mineral bases (sodium, calcium) or organic bases, in particular amino acids ( lysine, arginine ...). Erythro-
** cytes contenant des agents superparamagnetiques (particules d'oxyde de divers métaux enrobées par du dextran, notamment fer sous forme Fe, 0. et Fe_ O,) peuvent être également utilisés comme agents de contraste. Les produits de contraste du type sel d'acide triode ou- complexe paramagnetique pourront également être utilisés en imagerie ultrasonore. * * cytes containing superparamagnetic agents (oxide particles of various metals coated with dextran, in particular iron in the form Fe, O. and Fe_O,) can also be used as contrast agents. Contrast media of the triode acid or paramagnetic complex salt type may also be used in ultrasound imaging.
Le produit encapsulé dans les erythrocytes pourra également être un gaz sous forme de bulles. De préférence, ce gaz pourra être l'air, l'azote ou le gaz carbonique. Par produits hydrophiles ou hydrosolubles, on entend désigner aussi bien les produits de contraste présentant ces caractéristiques que les produits ayant subi ce traitement les rendant hydrophiles et/ou hydro¬ solubles.The product encapsulated in the erythrocytes may also be a gas in the form of bubbles. Preferably, this gas may be air, nitrogen or carbon dioxide. The term “hydrophilic or water-soluble products” is intended to denote both the contrast products having these characteristics and the products which have undergone this treatment making them hydrophilic and / or water-soluble.
Ce produit est encapsulé dans les erythrocytes par une technique de lyse/ rescellement. Les techniques d'encapsulation érythrocy- taires sont de trois types :This product is encapsulated in erythrocytes by a lysis / resealing technique. There are three types of erythrocyte encapsulation techniques:
- par chocs osmotiques,- by osmotic shocks,
- par chocs électriques,- by electric shock,
- par hémolyse isotonique. En effet, les erythrocytes, comme toutes les cellules, peuvent être lysés dans certaines conditions notamment de pression osmotique. Mais la membrane érythrocytaire peut être reconstituée après la lyse, c'est ie rescellement. Il est donc possible d'introduire certains composants exogènes dans les érytrhocytes.- by isotonic hemolysis. In fact, erythrocytes, like all cells, can be lysed under certain conditions, in particular osmotic pressure. But the erythrocyte membrane can be reconstituted after lysis, ie resealing. It is therefore possible to introduce certain exogenous components into the erytrhocytes.
La technique qu'on a décrite ci-après est celle de l'encapsu- lation par "chocs osmotiques".The technique which has been described below is that of encapsulation by "osmotic shocks".
Les différentes étapes de l'hémolyse et du rescellement ont été décrites par Schwoch G. et Passo H. (1973). Des globules rouges soumis à un abaissement de la force ionique, gonflent jusqu'à atteindre un volume critique (150 à 175 % de leur valeur initiale), où la membrane devient perméable aux macromolécules et aux ions.The different stages of hemolysis and resealing have been described by Schwoch G. and Passo H. (1973). Red blood cells subjected to a reduction in ionic strength, swell until reaching a critical volume (150 to 175% of their initial value), where the membrane becomes permeable to macromolecules and ions.
En restaurant l'isotonicité du milieu, les pores se referment et l'imperméabilité de la membrane aux macromolécules est restaurée.By restoring the isotonicity of the medium, the pores close and the impermeability of the membrane to the macromolecules is restored.
Cependant, la membrane reste perméable aux ions principalement alcalins. Une étape d'incubation à 37°C est nécessaire aux globules rouges pour retrouver des caractéristiques de perméabilité identiques aux globules rouges initiaux. Trois techniques différentes d'hémolyse hypotonique ont été proposées : Technique de dilutionHowever, the membrane remains permeable to mainly alkaline ions. An incubation step at 37 ° C is necessary for the red blood cells to find the same permeability characteristics as the initial red blood cells. Three different hypotonic hemolysis techniques have been proposed: Dilution technique
Les globules rouges sont directement dilués dans un milieu hypotonique. Les pores s'ouvrent immédiatement et l'équilibre entre le milieu extra et intracellulaire est obtenu en moins d'une minute.The red blood cells are directly diluted in a hypotonic medium. The pores open immediately and the balance between the extra and intracellular medium is obtained in less than a minute.
Cependant dans cette technique 60 à 70 % du contenu cytoplasmique des hématies est perdu, réduisant considérablement la viabilité des stromas obtenus. Technique de prégonflementHowever in this technique 60 to 70% of the cytoplasmic content of red cells is lost, considerably reducing the viability of the stromas obtained. Pre-swelling technique
Dans cette technique, proposée par Rechsteiner M. ( 1975), les globules rouges sont dilués dans un tampon hypotonique à 220 mos/kg et centrifugés. La lyse est alors obtenue par addition d'un faible volume d'eau. Cette procédure est rapide et permet de retenir davantage de petites molécules, comme l'ATP et d'enzymes cytoplasmiques. Technique de dialyseIn this technique, proposed by Rechsteiner M. (1975), the red blood cells are diluted in a hypotonic buffer at 220 mos / kg and centrifuged. Lysis is then obtained by adding a small volume of water. This procedure is quick and allows to retain more small molecules, such as ATP and cytoplasmic enzymes. Dialysis technique
Dans cette technique, proposée indépendamment par Dale G. et coll. (1977) et Deloach 3.P. et Coll. (1977), la suspension érythrocytaire à fort hématocrite (70 à 80 %) est maintenue dans un sac de dialyse et dialysée contre un tampon hypotonique. L'hémolyse est alors progressive et peut facilement être contrôlée en modifiant le temps de dialyse.In this technique, independently proposed by Dale G. et al. (1977) and Deloach 3.P. et al. (1977), the highly hematocrit erythrocyte suspension (70 to 80%) is kept in a dialysis bag and dialyzed against a hypotonic buffer. The hemolysis is then progressive and can easily be controlled by modifying the dialysis time.
Cette procédure offre plusieurs avantages. En comparant les rendements des diverses techniques d'encapsuiation, on note que dans la' majorité des cas, la dialyse conduit à un meilleur résultat. Ceci s'explique par une moindre dilution du produit à encapsuler. De plus, dans cette technique, les pertes du contenu cytoplasmique des globules rouges au cours de l'encapsulation, sont considérablement réduites. C'est celle qui est utilisée dans la présente invention. En particulier, une technique de dialyse fournissant d'excellents rendements est celle développée dans le brevet EPThis procedure offers several advantages. By comparing the yields of the various encapsulation techniques, it is noted that in the majority of cases, dialysis leads to a better result. This is explained by a lower dilution of the product to be encapsulated. In addition, in this technique, losses of the cytoplasmic content of red blood cells during encapsulation are considerably reduced. This is the one used in the present invention. In particular, a dialysis technique providing excellent yields is that developed in the EP patent.
101 341. Cette demande décrit un procédé d'encapsuiation dans des erythrocytes humains ou animaux d'une substance présentant une activité biologique, par une technique de dialyse adaptée en flux continu.101 341. This application describes a method of encapsulation in human or animal erythrocytes of a substance exhibiting a biological activity, by a dialysis technique suitable for continuous flow.
C'est pourquoi, la présente invention concerne un procédé de préparation d'une composition caractérisé en ce que :This is why the present invention relates to a process for the preparation of a composition, characterized in that:
-a) les erythrocytes sont placés dans un compartiment de dialyse, l'autre compartiment contenant une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes afin de lyser les erythrocytes.-a) the erythrocytes are placed in a dialysis compartment, the other compartment containing an aqueous solution hypotonic with respect to the suspension of erythrocytes in order to lyse the erythrocytes.
-b) les erythrocytes mis en contact avec le produit de contraste sont rescellés par augmentation de la pression osmotique en encapsulant ledit produit de contraste. -c) éventuellement les erythrocytes sont séparés du milieu de réaction, -d) les erythrocytes sont placés dans un support adapté à l'administration entérale ou parentérale pour obtenir une composition de contraste. Pour la technique la plus simple permettant i'encapsulation d'un produit de contraste dans des erythrocytes humains ou animaux, dans le cas de faibles volumes, la dialyse est effectuée dans un sac de dialyse, contre une solution hypotonique. Le lysat est mis en présence du produit actif et on effectue le rescellement par addition d'une solution hyper- tonique. La méthode d'encapsuiation préférée est le procédé par dialyse en flux continu. Pour cela, les erythrocytes sont séparés du plasma et lavés et mis en suspension aqueuse, puis alimentent en continu le compartiment primaire d'un dialyseur. Dans le compartiment secondaire, circule à contre courant un tampon de dialyse, hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes. Le lysat d'érythrocytes est mis en contact avec le produit à encapsuler, cette substance étant introduite avant, pendant ou après la lyse. Le produit pénètre dans l'érythrocyte et on procède au rescellement de la cellule en augmentant la pression osmotique par addition d'une solution hypertonique. Après rescellement, la suspension éry- throcytaire est centrifugée pour éliminer les molécules non encapsulées et l'hémoglobine du liquide intercellulaire. Les erythrocytes sont ensuite lavés et remis en suspension dans du plasma à un hématocrite physiologique.b) the erythrocytes brought into contact with the contrast product are resealed by increasing the osmotic pressure by encapsulating said contrast product. -c) optionally the erythrocytes are separated from the reaction medium, -d) the erythrocytes are placed in a support suitable for enteral or parenteral administration in order to obtain a contrast composition. For the simplest technique allowing the encapsulation of a contrast product in human or animal erythrocytes, in the case of low volumes, dialysis is carried out in a dialysis bag, against a hypotonic solution. The lysate is brought into contact with the active product and the resealing is carried out by adding a hypertonic solution. The preferred encapsulation method is the continuous dialysis method. For this, the erythrocytes are separated from the plasma and washed and placed in aqueous suspension, then continuously feed the primary compartment of a dialyzer. In the secondary compartment, a dialysis buffer circulates against the current, hypotonic with respect to the suspension of erythrocytes. The erythrocyte lysate is brought into contact with the product to be encapsulated, this substance being introduced before, during or after lysis. The product enters the erythrocyte and the cell is resealed by increasing the osmotic pressure by adding a hypertonic solution. After resealing, the erythrocyte suspension is centrifuged to remove unencapsulated molecules and hemoglobin from the intercellular fluid. The erythrocytes are then washed and resuspended in plasma to a physiological hematocrit.
Pour les produits iodés, encapsulés par cette méthode, la concentration intra-érythrocytaire en iode dans la composition pourrait être comprise entre 1 et 300 g d'iode par litre de culot globulaire.For iodized products, encapsulated by this method, the intra-erythrocytic iodine concentration in the composition could be between 1 and 300 g of iodine per liter of packed red cells.
Pour les compositions dans lesquelles un complexe para- magnétique est encapsulé par cette méthode, la concentration intra- érythrocytaire en métal paramagnetique complexé est comprise entre 0,02 mM et 0,5 M dans le culot globulaire. L'utilisation de produits de contraste encapsulés dans des hématies permet de cibler l'espace de distribution de ces produits, en les confinant strictement dans l'espace vasculaire.For the compositions in which a paramagnetic complex is encapsulated by this method, the intraerythrocytic concentration of complexed paramagnetic metal is between 0.02 mM and 0.5 M in the globular base. The use of contrast products encapsulated in red cells makes it possible to target the distribution space of these products, by confining them strictly in the vascular space.
C'est pourquoi la présente invention concerne l'application de là composition de contraste définie ci-dessus à l'imagerie du système circulatoire, des organes vascularisés et des petites cavités, caractérisée en ce que l'on injecte la composition par voie enterale ou parenterale, et en ce que l'on visualise ces éléments par un moyen approprié, choisi parmi l'imagerie par RX, par résonance magnétique nucléaire ou par ultrasons. L'administration de la composition peut se faire par voie enterale. La composition peut également être introduite dans une petite cavité de l'organisme, dont on souhaite modifier le contraste en imagerie. De manière préférée, la composition selon l'invention peut être injectée par voie parenterale, en particulier par voie intra veineuse ou' intra artérielle. La pharmacocinétique du produit sera celle des erythro¬ cytes. Cette application permettra donc l'imagerie de tous les organes vascularisés et des situations de pathologie vasculaire, rupture ou modifications vascuiaires.This is why the present invention relates to the application of the contrast composition defined above to imaging the circulatory system, the vascularized organs and small cavities, characterized in that the composition is injected enterally or parenterally, and in that these elements are visualized by an appropriate means, chosen from X-ray, nuclear magnetic resonance or ultrasound imaging. The administration of the composition can be done enterally. The composition can also be introduced into a small cavity in the body, the contrast of which is to be modified in imaging. Preferably, the composition according to the invention can be injected parenterally, in particular by intravenous or ' intraarterial route. The pharmacokinetics of the product will be that of erythro¬ cytes. This application will therefore allow the imaging of all vascularized organs and situations of vascular pathology, rupture or vascular changes.
On observera une amélioration très nette de l'imagerie anatomique des vaisseaux, grâce à la réduction d'une part de la fuite dans l'espace interstitiel et d'autre part de l'élimination urinaire, rencontrées avec les produits actuels, en particulier avec les produits iodés et les chélates de gadolinium.We will observe a very clear improvement in the anatomical imagery of the vessels, thanks to the reduction on the one hand of the leak in the interstitial space and on the other hand of the urinary elimination, encountered with current products, in particular with iodized products and gadolinium chelates.
On obtiendra également une amélioration de l'imagerie du volume et du débit sanguin local donc des anomalies de perfusion d'organe.There will also be an improvement in imaging of the volume and local blood flow, and therefore organ perfusion anomalies.
D'une part, on pourra mettre en évidence des phénomènes d'hypofusion ou ischémies, d'autre part des phénomènes d'hyperperfusions intervenant lors de certains processus tumoraux. L'encapsuiation de produits de contraste par cette méthode de lyse/resceliement ne modifie pas la durée de demie vie des erythrocytes. Après administration de la composition de contraste par voie parenterale, on observera une rémanence du produit de contraste dans la circulation, sa demie vie pouvant être égale, dans le cas d'érythrocytes humains, à 60 jours.On the one hand, we can highlight the phenomena of hypofusion or ischemia, on the other hand phenomena of hyperperfusion occurring during certain tumor processes. The encapsulation of contrast products by this lysis / resealing method does not modify the half-life of the erythrocytes. After administration of the contrast composition by the parenteral route, a remanence of the contrast product in the circulation will be observed, its half-life possibly being equal, in the case of human erythrocytes, to 60 days.
Il sera donc possible d'effectuer la visualisation à des temps différents, allant jusqu'à 60 jours. On pourra ainsi suivre sans réinjection des processus d'infarctus ou d'ischémies. La composition sera éliminée par destruction des erythrocytes dans la rate.It will therefore be possible to perform viewing at different times, up to 60 days. We can thus follow without reinjection of infarction or ischemia processes. The composition will be eliminated by destruction of erythrocytes in the spleen.
La composition pourra être injectée à des doses allant de 1 àThe composition may be injected in doses ranging from 1 to
500 cm de culot globulaire traité (avec un hématocrite compris entre 30 et 80 %). Une application de cette invention est caractérisée en ce qu'on prélève les erythrocytes d'un patient, en ce qu'on les traite de manière à encapsuler un produit de contraste et en ce qu'on les réinjecte au patient.500 cm of globular pellet treated (with a hematocrit between 30 and 80%). An application of this invention is characterized in that the erythrocytes are removed from a patient, in that they are treated so as to encapsulate a contrast product and in that they are reinjected into the patient.
Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, les erythrocytes humains sont prélevés sur une solution anticoagulante de citrate phosphate dextrose. Le plasma est décanté et on élimine les leucocytes, les plaquettes et le plasma, par prélavage et centrifugations des erythrocytes. Le culot globulaire est ajusté à la concentration voulue et incubé 30 mn à 4°C.In one embodiment of the method, the human erythrocytes are removed from an anticoagulant solution of citrate phosphate dextrose. The plasma is decanted and the leukocytes, platelets and plasma are eliminated, by prewashing and centrifuging the erythrocytes. The globular pellet is adjusted to the desired concentration and incubated for 30 min at 4 ° C.
On procède ensuite à l'étape de lyse/resceliement des erythrocytes. Pour cela, on fait circuler dans un dialyseur à plaques la solution erythrocytaire et une solution de lyse, hypotonique, à contre courant. Ces étapes sont menées à 4°C. Il y a gonflement des erythrocytes et ouverture des pores. A la sortie du dialyseur, on ajoute le DOTA Gd au lysat erythrocytaire, en continu. On doit s'assurer d'un temps de contact permettant la pénétration du principe actif dans les cellules. Les propriétés de l'érythrocyte sont restaurées, par réchauf¬ fement de la solution à 37°C et addition d'une solution de rescellement hypertonique. Le rescellement est poursuivi par incubation 30 mn à 37°C.The next step is to lyse / reseal the erythrocytes. For this, the erythrocytic solution and a hypotonic lysis solution, against the current, are circulated in a plate dialyzer. These steps are carried out at 4 ° C. The erythrocytes swell and the pores open. At the outlet of the dialyzer, DOTA Gd is added to the erythrocyte lysate, continuously. We must ensure a contact time allowing the penetration of the active ingredient into the cells. The properties of the erythrocyte are restored by warming the solution to 37 ° C. and adding a hypertonic resealing solution. Resealing is continued by incubation for 30 min at 37 ° C.
La suspension erythrocytaire est ensuite centrifugée pour éliminer les molécules non encapsulées et l'hémoglobine.The erythrocyte suspension is then centrifuged to remove the non-encapsulated molecules and the hemoglobin.
Après trois lavages successifs par NaCl 150 M, les erythrocytes sont remis en suspension dans un milieu physiologique.After three successive washes with 150 M NaCl, the erythrocytes are resuspended in a physiological medium.
Figure 1 : Stabilité du gadolinium encapsulé à 4° C. Figure 2 : Stabilité du gadolinium encapsulé à 37° C.Figure 1: Stability of the encapsulated gadolinium at 4 ° C. Figure 2: Stability of the encapsulated gadolinium at 37 ° C.
EXEMPLE 1EXAMPLE 1
Encapsulation de DOTA Gd dans des erythrocytes humains par dialyse en flux continu.Encapsulation of DOTA Gd in human erythrocytes by continuous flow dialysis.
a) Préparation des erythrocytes humainsa) Preparation of human erythrocytes
Les unités de sang utilisées au cours de cette étude sont : - soit des unités prélevées sur solution citrate phosphate dextrose (CPD) à une concentration de 63 ml pour 450 ml de sang prélevé, conservées à 4°C pendant une semaine ou plus, - soit des concentrés globulaires conservés en SAG.M à 4°C pendant une semaine au plus. CPD :The units of blood used during this study are: - either units taken from citrate phosphate dextrose solution (CPD) at a concentration of 63 ml per 450 ml of blood collected, stored at 4 ° C for a week or more, - or globular concentrates stored in SAG.M at 4 ° C for a week at most. CPD:
Acide citrique 1 H_0 3,27 gCitric acid 1 H_0 3.27 g
Citrate de sodium 2H-0 26,30 gSodium citrate 2H-0 26.30 g
Phosphate monosodique H-O 2,22 gMonosodium phosphate H-O 2.22 g
Glucose 23,20 g Eau ppi qsp 100 ml On procède à une décantation du plasma et au prélavage des globules rouges afin d'éliminer les leucocytes, les plaquettes et le plasma.Glucose 23.20 g Water ppi qs 100 ml The plasma is decanted and the red cells prewashed in order to remove the leukocytes, platelets and plasma.
Ces étapes sont réalisées au moyen de poches de transfert de 300 et 600 ml (Terumo). Les lavages des culots globulaires sont faits volume à volume , en NaCl 150 mM, avec des centrifugations de 15 mn à 1 000 g.These steps are carried out using 300 and 600 ml transfer bags (Terumo). The washings of the globular pellets are carried out volume by volume, in 150 mM NaCl, with centrifugations for 15 min at 1000 g.
Le culot globulaire est ajusté à la concentration voulue en cellules et on mesure les paramètres hématologiques sur un échantillon.The blood pellet is adjusted to the desired concentration of cells and the hematological parameters are measured on a sample.
Enfin le culot est incubé 30 mm à 4°C.Finally the pellet is incubated 30 mm at 4 ° C.
b) Lvse des érvthrocvtesb) Lvse of ervthrocvtes
La lyse est réalisée dans un dialyseur à plaques GambroLysis is carried out in a Gambro plate dialyzer
(Lundia 1C) dont la membrane (épaisseur 13,5μm et surface efficace 0,41' m 2 ) est un polymère d'acryla-butadiène styrène, de polyéthyiène haute et basse densité, cuprophan et de cellulose. On fait circuler à contre-courant la solution erythrocytaire et du tampon de lyse préparé comme suit :(Lundia 1C) whose membrane (thickness 13.5μm and effective area 0.41 ' m 2) is a polymer of acryla-butadiene styrene, high and low density polyethylene, cuprophan and cellulose. The erythrocyte solution and the lysis buffer prepared as follows are circulated against the current:
Solution mère :Stock solution:
Na2HP04 ; NaH2P04, pH 7,4 0,2 M C03H Na 0,2 MNa2HPO4; NaH2PO4, pH 7.4 0.2 M C03H Na 0.2 M
Glucose 0,04 M.0.04 M glucose.
Le tampon de lyse est constitué de cette solution diluée auThe lysis buffer consists of this solution diluted with
1 /20 en eau distillée, on obtient un tampon à 40 mos/kg et pH 7,4.1/20 in distilled water, a buffer is obtained at 40 mos / kg and pH 7.4.
Le flux du tampon de dialyse est constant : 160 ml/mn. Par contre, les conditions de dialyse varient en fonction du flux sanguin et de l'hématocrite.The flow of dialysis buffer is constant: 160 ml / min. However, dialysis conditions vary depending on the blood flow and hematocrit.
L'hématocrite du culot globulaire doit être suffisamment élevé pour éviter une perte importante du contenu cytoplasmique des globules rouges ; mais, il doit rester suffisamment faible pour permettre un gonflement important du globule rouge au cours de la dialyse sans induire une pression trop importante dans le dialyseur. c) Introduction du principe actifThe hematocrit of the blood cell must be high enough to avoid significant loss of the cytoplasmic content of red blood cells; however, it must remain low enough to allow significant swelling of the red blood cell during dialysis without inducing excessive pressure in the dialyzer. c) Introduction of the active ingredient
Dans le cas de molécules dialysables, il est préférable d'ajouter le principe actif directement dans le lysat en continu à la sortie du dialyseur.In the case of dialysable molecules, it is preferable to add the active principle directly into the lysate continuously at the outlet of the dialyzer.
d) Rescellement et regénération des globules rougesd) Resealing and regeneration of red blood cells
La restauration de l'isotonicité de la suspension globulaire lysée est effectuée après réchauffement à 37°C par addition d'une solution de rescellement hypertonique en raison d'un volume pour dix volumes de lysat. Le rescellement est poursuivi pendant 30 minutes par incubation des globules rouges dans un bain marie à 37°C.Restoration of the isotonicity of the lysed globular suspension is carried out after reheating to 37 ° C. by addition of a hypertonic resealing solution due to one volume per ten volumes of lysate. Resealing is continued for 30 minutes by incubating red blood cells in a water bath at 37 ° C.
La solution de rescellement est constituée d'un mélange NaCl' 2 M et de PIGPA.The resealing solution consists of a 2 M NaCl ' mixture and PIGPA.
PIGPA C (Laboratoire BRUNEAU)PIGPA C (BRUNEAU Laboratory)
Adenine 5 mMAdenine 5 mM
Inosine 100 mM100 mM inosine
Pyruvate de Na 100 mM Phosphate de Na 100 mM100 mM Na Pyruvate 100 mM Na Phosphate
Glucose 100 mM100 mM glucose
e) Lavages post rescellement des globules rougese) Post-resealing washing of red blood cells
Après rescellement, la suspension erythrocytaire est centri¬ fugée pour éliminer les molécules non encapsulées et l'hémoglobine du liquide intercellulaire.After resealing, the erythrocyte suspension is centrifuged to remove the non-encapsulated molecules and the hemoglobin from the intercellular fluid.
Les globules rouges sont ensuite lavées selon la même procédure que celle décrite pour les prélavages. Après ces trois lavages en NaCl 1 0 mM, un lavage en plasma est effectué pour remettre les globules rouges en milieu physiologique. EXEMPLE 2 :The red blood cells are then washed according to the same procedure as that described for the prewash. After these three washes in 10 mM NaCl, a plasma washing is carried out to return the red blood cells to a physiological medium. EXAMPLE 2:
Encapsulation de DOTA Gd dans des erythrocytes de souris par dialyse en discontinu. a) Préparation de globules rouges de sourisEncapsulation of DOTA Gd in mouse erythrocytes by batch dialysis. a) Preparation of mouse red blood cells
Les souris utilisées dans cette étude sont des souris swiss provenant de l'élevage Janvier ou de'l'élevage du laboratoire. Le sang total est prélevé sur héparine après anesthesie des animaux à l'éther, par incision dans la partie thoracique latérale, section de l'artère brachiale et prélèvement à la pipette pasteur.The mice used in this study are Swiss mice from livestock January or 'breeding laboratory. Whole blood is taken from heparin after anesthesia of the animals with ether, by incision in the lateral thoracic part, section of the brachial artery and collection with a pasteur pipette.
Les opérations de lavage sont effectuées en tube.Washing operations are carried out in a tube.
b) Lyseb) Lyse
La dialyse est effectuée dans un sac de dialyse en cellulose glycérinée (Poly labo). Le diamètre à plat est de 2,54 cm alors qu'une fois gonflé le diamètre est de 1,59 cm. La membrane de ces sacs de 20 μm d'épaisseur a une limite de perméabilité de 12 000 à 14 000. Elle est réalisée sur 5 ml de culot globulaire à 70 % dans un sac de dialyse placé dans un flacon de 250 ml contenant le tampon de lyse. Le flacon est fixé sur un agitateur rotatif à 12 rpm maintenu à 4°.Dialysis is carried out in a dialysis bag made of glycerolated cellulose (Poly lab). The flat diameter is 2.54 cm while once inflated the diameter is 1.59 cm. The membrane of these 20 μm thick bags has a permeability limit of 12,000 to 14,000. It is produced on 5 ml of 70% globular pellet in a dialysis bag placed in a 250 ml bottle containing the buffer. lysis. The bottle is fixed on a rotary shaker at 12 rpm maintained at 4 °.
c) Introduction du DOTA Gd et rescellement.c) Introduction of DOTA Gd and resealing.
Ces étapes sont réalisées en tube.These steps are carried out in a tube.
Le tableau 1 donne les paramètres hématologiques et les paramètres d'encapsuiation du DOTA. Gd dans les globules rouges humains en fonction du temps de dialyse. Les rendements d'encapsuiation sont calculés par rapport à la suspension de globules rouges initiale (Rdt encap/pool) ou par rapport à la concentration obtenue dans le lysat (Rdt encap/lys). Le tableau 2 représente les paramètres hématologiques et les paramètres d'encapsuiation du DOTA-Gd dans les globules rouges humains et murins pour un temps de dialyse de 45 mn (moyenne _-_ SD avec N = nombre d'expériences).Table 1 gives the hematological parameters and the DOTA encapsulation parameters. Gd in human red blood cells as a function of dialysis time. The encapsulation yields are calculated relative to the initial suspension of red blood cells (Yield encap / pool) or in relation to the concentration obtained in the lysate (Yield encap / lys). Table 2 represents the hematological parameters and the parameters of encapsulation of DOTA-Gd in human and murine red blood cells for a dialysis time of 45 min (mean _-_ SD with N = number of experiments).
Tableau ITable I
Encapsulation avec DOTA.Gd Globules rouges humainsEncapsulation with DOTA.Gd Human red blood cells
TemDS Témoins 30 min 45 min 60 minTemDS Witnesses 30 min 45 min 60 min
N=3 N=8 N= lN = 3 N = 8 N = l
ParamètresSettings
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Figure imgf000018_0001
* mg de DOTA Gd/ml à 100 % d'hematocrite normalisé pour 1 mg de DOTA Gd/mi dans la suspension erythrocytaire initiale.* mg of DOTA Gd / ml at 100% hematocrit normalized for 1 mg of DOTA Gd / mi in the initial erythrocyte suspension.
VGM : volume globulaire moyenVGM: mean globular volume
(volume moyen d'une hématie)(average volume of one red cell)
TGMH : quantité globulaire moyenne en hémoglobineTGMH: average globular amount of hemoglobin
CCMH : concentration moyenne globulaire en hémoglobine. Tableau 2CCMH: average globular hemoglobin concentration. Table 2
Erythrocytes murins Erythrocytes humains Paramètres Avant Après Avant AprèsMurine erythrocytes Human erythrocytes Parameters Before After Before After
Rdt cell (%) 65,0 +_ 2,6 73,2 +_ 3,5Cell yield (%) 65.0 + _ 2.6 73.2 + _ 3.5
Rdt encap/pool (%) 31 ,6 +_ 4,0 36,4 +_ 4, 1Yield encap / pool (%) 31, 6 + _ 4.0 36.4 + _ 4, 1
Rdt encap/lyse (%) 59, 1 +_ 5,7 65,0 _+ 4,6 mg/ml* , 0,67 +_ 0,09 0,70 +. 0,09 VGM (fl) 50,9 +_ 0,3 48,3 0,9 96,5 +_ 2,0 86,8 +_ 2,5Yield encap / lysis (%) 59, 1 + _ 5.7 65.0 _ + 4.6 mg / ml *, 0.67 + _ 0.09 0.70 +. 0.09 VGM (fl) 50.9 + _ 0.3 48.3 0.9 96.5 + _ 2.0 86.8 + _ 2.5
TGMH (pg) 17,5 + 0,9 16,2 + 0,7 30,2 + 0,2 25,7 +_ 1 ,0TGMH (pg) 17.5 + 0.9 16.2 + 0.7 30.2 + 0.2 25.7 + _ 1.0
CCMH (g/dl) 34,4 +_ 1,7 33,5 +_ 1,5 31 ,2 +_ 0,4 29,2 ± 0,7CCMH (g / dl) 34.4 + _ 1.7 33.5 + _ 1.5 31, 2 + _ 0.4 29.2 ± 0.7
* mg de DOTA Gd/ml à 100 % d'hematocrite normalisé pour 1 mg de DOTA- Gd/ml dans la suspension erythrocytaire initiale.* mg of DOTA Gd / ml at 100% hematocrit normalized for 1 mg of DOTA-Gd / ml in the initial erythrocyte suspension.
EXEMPLE 3EXAMPLE 3
Stabilité du DOTA Gd après encapsulation erythrocytaireStability of DOTA Gd after erythrocyte encapsulation
Après encapsulation erythrocytaire la suspension de globules rouges à 40 % d'hematocrite en plasma est maintenu à 4°C ou à 37°C. Pour différents temps d'incubation un aliquot est prélevé, centrifugé à 1 000 g, dix minutes à 4°C. Le gadolinium est ensuite dosé sur le culot globulaire et sur le surnageant. L'hématocrite du culot est mesuré pour normaliser tous les dosages à un même hématocrite.After erythrocyte encapsulation, the suspension of red blood cells at 40% hematocrit in plasma is maintained at 4 ° C or 37 ° C. For different incubation times, an aliquot is taken, centrifuged at 1000 g, ten minutes at 4 ° C. The gadolinium is then dosed on the globular pellet and on the supernatant. The hematocrit of the pellet is measured to normalize all the dosages to the same hematocrit.
Les figures 1 et 2 montrent l'évolution, en fonction du temps, de la concentration intraerythrocytaire en gadolinium après encapsulation du Dota-gadolinium pour deux concentrations intraérytrocytaires. GR 1 et GR2 sont les concentrations intraérythrocytaires en DOTA GdFigures 1 and 2 show the evolution, as a function of time, of the intraerythrocyte concentration of gadolinium after encapsulation of Dota-gadolinium for two intraerythrocyte concentrations. GR 1 and GR2 are the intraerythrocytic concentrations of DOTA Gd
SP 1 et SP2 sont les concentrations plasmatiques en DOTA Gd, correspon¬ dant respectivement à GR 1 et GR2. La température a peu d'impact sur le relargage de DOTA Gd.SP 1 and SP2 are the plasma concentrations of DOTA Gd, corresponding respectively to GR 1 and GR2. The temperature has little impact on the release of DOTA Gd.
Cette étude effectuée avec des globules humains montre une légère fuite du gadolinium avec une demi-vie de 9, 1 jours à 4°C et 7,5 jours à 37°C. En moyenne, la concentration intraerythrocytaire en gadolinium après 48 heures est égale à 81 % de la concentration initiale. EXEMPLE 4This study carried out with human globules shows a slight leakage of gadolinium with a half-life of 9.1 days at 4 ° C and 7.5 days at 37 ° C. On average, the intraerythrocyte concentration of gadolinium after 48 hours is equal to 81% of the initial concentration. EXAMPLE 4
Etude de la relaxivitéRelaxation study
La relaxivité du DOTA Gd a été mesurée dans des culots globulaires (suspension d'hématies à haut hematocrite 80/90 ?o) lavés après incorporation du DOTA Gd.The relaxivity of DOTA Gd was measured in globular pellets (suspension of red blood cells with high hematocrit 80/90? O) washed after incorporation of DOTA Gd.
Le gadolinium a été dosé par spectrophotométrie d'émission atomique (DCP). Le temps de relaxation Tl a été déterminé sur un Minispec BRUKER PC 20 à 20 MHz 0,5 T par séquence d'inversion-récupé¬ ration à 37° C.Gadolinium was assayed by atomic emission spectrophotometry (DCP). The relaxation time Tl was determined on a Minispec BRUKER PC 20 at 20 MHz 0.5 T by inversion-recovery sequence at 37 ° C.
Tableau 3Table 3
Hématies de sourisMouse red cells
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0001
* Ce résultat a été confirmé à différentes dilutions du culot.* This result was confirmed at different dilutions of the pellet.
On observe donc une majoration de la relaxivité du DOTA Gd dans le culot globulaire. Tableau 4There is therefore an increase in the relaxivity of DOTA Gd in the globular pellet. Table 4
Hématies humainesHuman red cells
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EXEMPLE 5EXAMPLE 5
Efficacité en imagerieImaging efficiency
L'imagerie des tubes contenant les culots globulaires humains après incorporation du DOTA Gd a été réalisée comparativement à des solutions aqueuses de DOTA Gd de concentration équivalente.The imaging of the tubes containing the human globular pellets after incorporation of DOTA Gd was carried out in comparison with aqueous solutions of DOTA Gd of equivalent concentration.
ImagerieImagery
. MR MAX 0,5 Tesla,. MR MAX 0.5 Tesla,
. séquences SE 300/20/1,. SE 300/20/1 sequences,
. épaisseur de coupe : 7 mm,. cutting thickness: 7 mm,
. réalisation de profils d'intensité en fonction de la concentration de gadolinium permettant une quantification relative des échantillons les uns par rapport aux autres.. realization of intensity profiles as a function of the gadolinium concentration allowing a relative quantification of the samples relative to each other.
Résultats : on constate une efficacité in vitro du même ordre de grandeur entre DOTA Gd et DOTA Gd encapsulé dans les erythrocytes Tableau 5Results: there is an in vitro efficacy of the same order of magnitude between DOTA Gd and DOTA Gd encapsulated in erythrocytes Table 5
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Figure imgf000022_0001
Le DOTA Gd incorporé dans les globules rouges entraine une modification nette de l'intensité en imagerie (multiplié par 4,6 pour uneDOTA Gd incorporated into red blood cells results in a clear change in imaging intensity (multiplied by 4.6 for a
_3 concentration de 0,93 mM) pour des concentration comprises entre 2.10 et 10 -4 M comme pour le DOTA Gd._3 concentration of 0.93 mM) for concentrations between 2.10 and 10 -4 M as for DOTA Gd.
EXEMPLE 6EXAMPLE 6
Durée de vie des hématies et pharmacocinétique du Gadolinium La durée de vie des hématies de souris contenant du Dota GdRed cell lifespan and pharmacokinetics of Gadolinium Red cell lifespan of mice containing Dota Gd
(9mM) a été suivie par marquage au Cr. Le gadolinium a été mesuré par SEA (spectrophotométrie d'émission atomique) parallèlement au comptage gamma du Cr chez la souris, et seul pour la pharmacocinétique chez le chien beagle. Résultats : Dans les 24 premières heures, on observe la disparition de 18 °o du 51 Cr et 22,5 % du Gd chez la souris et 25,5 % du Gd chez le chien beagle.(9mM) was followed by labeling with Cr. Gadolinium was measured by SEA (atomic emission spectrophotometry) parallel to the gamma count of Cr in mice, and only for pharmacokinetics in beagle dogs. Results: In the first 24 hours, we observe the disappearance of 18 ° o of 51 Cr and 22.5% of Gd in mice and 25.5% of Gd in beagle dogs.
Tableau 6Table 6
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* demi-vie du gadolinium mesuré par SEA (d) technique d'Eisenberg et coll (1989)* half-life of gadolinium measured by SEA (d) technique of Eisenberg et al (1989)
On peut constater qu'il n'y a ni reiargage de Dota Gd ni hémolyse importante due à l'incorporation.We can see that there is neither reiargage of Dota Gd nor significant hemolysis due to incorporation.
Exemple 7Example 7
Préparation de la composition DTPA-Gd sel de méthylglucamine - erythrocytesPreparation of the composition DTPA-Gd methylglucamine salt - erythrocytes
Cette composition a été préparée selon le procédé décrit dans l'exemple 1. Le tableau 7 donne les résultats d'encapsuiation de DTPA-Gd pour des globules rouges humains et pour une concentration initiale de 10 à 15 mg/ml. Tableau 7 Encapsulation de DTPA-Gd sels de méthylglutamine dans des globules rouges humainsThis composition was prepared according to the method described in Example 1. Table 7 gives the results of encapsulation of DTPA-Gd for human red blood cells and for an initial concentration of 10 to 15 mg / ml. Table 7 Encapsulation of DTPA-Gd methylglutamine salts in human red blood cells
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Figure imgf000024_0001
Exemple 8Example 8
Encapsulation de iopamidol dans des erythrocytes humains et murinsEncapsulation of iopamidol in human and murine erythrocytes
Les préparations sont effectuées selon le procédé décrit dans l'exemple 1 et 2.The preparations are carried out according to the method described in Example 1 and 2.
Le tableau 8 donne les paramètres hématologiques et les paramètres d'encapsuiation de l'iopamidol dans les globules rouges humains en fonction du temps de dialyse pour une concentration initiale de 10 mg/ml de suspension erythrocytaire. Il est possible d'augmenter la concentration intraerythrocytaire finale en augmentant la concentration initiale de la suspension erythrocytaire, ainsi pour 60 minutes de dialyse et une concentration initiale de 50 mg/ml, une concentration de 41,4 mg/ml à 100 % d'hematocrite peut être obtenue. Tableau 8 Encapsulation de l'iopamidol dans des globules rouges humainsTable 8 gives the hematological parameters and the parameters for encapsulation of iopamidol in human red blood cells as a function of the dialysis time for an initial concentration of 10 mg / ml of erythrocyte suspension. It is possible to increase the final intraerythrocyte concentration by increasing the initial concentration of the erythrocyte suspension, thus for 60 minutes of dialysis and an initial concentration of 50 mg / ml, a concentration of 41.4 mg / ml at 100% of hematocrit can be obtained. Table 8 Encapsulation of iopamidol in human red blood cells
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Figure imgf000025_0002
* mg/ml à 100 % d'hematocrite normalisé pour 1 mg/ml dans la suspension initiale. Le tableau 9 donne les paramètres d'encapsuiation et les paramètres hématologiques pour l'encapsulation d'iopamidol dans des globules rouges murins.* mg / ml at 100% hematocrit standardized for 1 mg / ml in the initial suspension. Table 9 gives the encapsulation parameters and the hematological parameters for encapsulation of iopamidol in murine red blood cells.
Figure imgf000025_0001
Tableau 9 Encapsulation de l'iopamidol dans des globules rouges murins
Figure imgf000025_0001
Table 9 Encapsulation of iopamidol in murine red blood cells
témoins iopamidoliopamidol cookies
N=4N = 4
ParamètresSettings
70,8-/-l , l 32,6+/-2,0
Figure imgf000026_0002
50,7+/-2,6
Figure imgf000026_0001
70.8 - / - l, l 32.6 +/- 2.0
Figure imgf000026_0002
50.7 +/- 2.6
Figure imgf000026_0001
VGM (fl) 53,5+1-2,2 48,8^-1 ,1 TG II (pg) 17,4+/-0,3 14,7~/-1,4 CCMH (%) 32,7+/-2,0 29,7+/-2,2VGM (fl) 53.5 + 1-2.2 48.8 ^ -1, 1 TG II (pg) 17.4 + / -0.3 14.7 ~ / -1.4 CCMH (%) 32, 7 +/- 2.0 29.7 + / -2.2
Exemple 9Example 9
Durée de vie des hématies après internalisation de l'iopamidolLifetime of red cells after internalization of iopamidol
La durée de vie des hématies de souris contenant de l'iopamidol a été faite comme dans l'exemple 6. L'iode est mesuré par spectropho- tométrie parallèlement au comptage gamma du Cr.The lifespan of the erythrocytes of mice containing iopamidol was made as in Example 6. The iodine is measured by spectrophotometry in parallel with the gamma count of Cr.
Résultats : La disparition sanguine post 24 heures est de type monoexpo nneennttiieellllee aavveecc une demie vie de 12,9 à 7,9 jours pour le Cr et l'iode respectivementResults: Post-24 hour blood loss is monoexpo nneennttiieellllee aavveecc half-life of 12.9 to 7.9 days for Cr and iodine respectively
Tableau 10Table 10
Figure imgf000026_0003
REFERENCES
Figure imgf000026_0003
REFERENCES
1. DALE G., VILLACORTE D. et BEUTLER E. : High-yiele entrapment of proteins into erythrocytes. Biochem. Med 1_8_. 220-225 (1977).1. DALE G., VILLACORTE D. and BEUTLER E.: High-yiele entrapment of proteins into erythrocytes. Biochem. Med 1_8_. 220-225 (1977).
2. DELOACH 3. et IHLER G. : A diaiysis procédure for loading erythrocytes with enzymes and lipids. Biochem. Biophys. Acta 496. 136-145 ( 1977).2. DELOACH 3. and IHLER G.: A diaiysis procedure for loading erythrocytes with enzymes and lipids. Biochem. Biophys. Acta 496. 136-145 (1977).
3. EISENBERG A.D., CONTURO T.E , PRICE R., HOLBURN G.E., PARTAIN C.L. et JAMES A.E. : MRl Enhancement of perfused tissues using chromium labeled red blood cells as an intravascular contrast agent. Invest. Radiol., 24. 742-753 (1989).3. EISENBERG A.D., CONTURO T.E, PRICE R., HOLBURN G.E., PARTAIN C.L. and JAMES A.E.: MRl Enhancement of perfused tissues using chromium labeled red blood cells as an intravascular contrast agent. Invest. Radiol., 24. 742-753 (1989).
4. SCHWOCH G. et PASSOW H. : Préparation and properties of human erythrocyte ghosts. Mol. Cell. Biochem. 2_. 197-218 ( 1973). 4. SCHWOCH G. and PASSOW H.: Preparation and properties of human erythrocyte ghosts. Mol. Cell. Biochem. 2_. 197-218 (1973).

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition de contraste caractérisée en ce qu'elle comprend un produit de contraste hydrophile ou hydrosoluble ou colloïdal par exemple un colloïde superparamagnétique, ou un gaz sous forme de bulles, encapsulé par une technique de lyse/resceliement dans des erythrocytes, et en ce qu'elle comporte en outre un support acceptable pour l'administration enterale ou parenterale.1. Contrast composition characterized in that it comprises a hydrophilic or water-soluble or colloidal contrast product, for example a superparamagnetic colloid, or a gas in the form of bubbles, encapsulated by a lysis / resealing technique in erythrocytes, and in this that it also includes an acceptable medium for enteral or parenteral administration.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le produit de contraste encapsulé est un agent de contraste polyiodé.2. Composition according to claim 1, characterized in that the encapsulated contrast product is a polyiodinated contrast agent.
3. Composition selon les revendications 1 et 2 caractérisée en ce que la concentration intra-érythrocytaire en iode est comprise entre 1 et 300 g d'iode par litre de culot globulaire.3. Composition according to claims 1 and 2 characterized in that the intra-erythrocytic iodine concentration is between 1 and 300 g of iodine per liter of globular pellet.
4. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce' que le produit de contraste encapsulé est un gaz sous forme de bulles.4. Composition according to claim 1, characterized in that the encapsulated contrast product is a gas in the form of bubbles.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le gaz encapsulé est choisi parmi l'air, l'azote et le gaz carbonique.5. Composition according to claim 4, characterized in that the encapsulated gas is chosen from air, nitrogen and carbon dioxide.
6. Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le produit de contraste encapsulé est un complexe paramagnetique. 6. Composition according to claim 1, characterized in that the encapsulated contrast product is a paramagnetic complex.
7. Composition selon la revendication 6 caractérisée en ce que le complexe est choisi parmi les complexes formés à partir d'un ligand cyclique ou acyciique possédant des atomes de coordination choisis parmi l'oxygène, l'azote, le phosphore, le soufre et un métal choisi parmi les lanthanides ou les métaux de transition, notamment le gadolinium, le dysprosium, le manganèse, le fer.7. Composition according to Claim 6, characterized in that the complex is chosen from complexes formed from a cyclic or acyclic ligand having coordination atoms chosen from oxygen, nitrogen, phosphorus, sulfur and a metal chosen from lanthanides or transition metals, in particular gadolinium, dysprosium, manganese, iron.
8. Composition selon l'une des revendications 6 ou 7 caractérisée en ce que la concentration intra-érythrocytaire en métal paramagnetique complexé est comprise entre 0,02 mM et 0,5 M dans le culot globulaire. 8. Composition according to one of claims 6 or 7 characterized in that the intra-erythrocytic concentration of complexed paramagnetic metal is between 0.02 mM and 0.5 M in the globular pellet.
9. Composition selon les revendications 1 et 6 à 8, caracté¬ risée en ce que le produit de contraste encapsulé est un sel de N méthyl- glucamine ou de sodium du complexe de gadolinium de l'acide diéthylène- triamine penta-acétique (Gd-DTPA). 1 0. Composition selon l'une des revendications 1 et 6 à S, caractérisée en ce que le produit de contraste est un sel de N méthyl- glucamine ou de sodium de complexe de gadolinium de l 'acide 1. 4, 7. 9. Composition according to Claims 1 and 6 to 8, characterized in that the encapsulated contrast product is an N methyl glucamine or sodium salt of the gadolinium complex of diethylene triamine penta-acetic acid (Gd -DTPA). 1 0. Composition according to one of claims 1 and 6 to S, characterized in that the contrast product is an N methyl glucamine or sodium salt of gadolinium complex of acid 1. 4, 7.
1 0 tetra-aza-cyclodécane N-N'-N"-N'" tétra-acétique (Gd-DOTA). 1 0 tetra-aza-cyclodecane N-N'-N "-N '" tetra-acetic (Gd-DOTA).
1 1. Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le produit de contraste encapsulé est un colloïde superparamagnétique.1 1. Composition according to claim 1, characterized in that the encapsulated contrast product is a superparamagnetic colloid.
12. Composition selon l'une des revendications 1 et 1 1 caractérisée en ce que le produit de contraste encapsulé est du dextran oxyde de fer. 12. Composition according to one of claims 1 and 1 1 characterized in that the encapsulated contrast product is dextran iron oxide.
1 3, Composition de contraste selon l'une des revendications 1 à 1 2 caractérisée en ce qu'elle est obtenue par un procédé de lyse/rescel¬ iement connu.1 3, Contrast composition according to one of claims 1 to 1 2 characterized in that it is obtained by a known lysis / rescel¬ iement process.
14. Composition selon l'une des revendications 1 à 1 3. caractérisée en ce qu'elle présente, après injection parenterale, une" demie-vie pouvant aller jusqu'à 60 jours.14. Composition according to one of claims 1 to 1 3. characterized in that it has, after parenteral injection, a " half-life of up to 60 days.
15. Procédé de préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que :15. Method for preparing a composition according to one of claims 1 to 14, characterized in that:
-a) les erythrocytes sont placés dans un compartiment de dialyse, l'autre compartiment contenant une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes afin de iyser les erythrocytes.-a) the erythrocytes are placed in a dialysis compartment, the other compartment containing a hypotonic aqueous solution relative to the suspension of erythrocytes in order to lyse the erythrocytes.
-b) les erythrocytes mis en contact avec le produit de contraste sont rescellés par augmentation de la pression osmotique en encapsulant ledit produit de contraste, -c) éventuellement les erythrocytes sont séparés du milieu de réaction. -d) les erythrocytes sont placés sont placés dans un support adapté à l'administration enterale ou parenterale pour obtenir une composition de contraste.-b) the erythrocytes brought into contact with the contrast product are resealed by increasing the osmotic pressure by encapsulating said contrast product, -c) optionally the erythrocytes are separated from the reaction medium. -d) the erythrocytes are placed and placed in a support suitable for enteral or parenteral administration in order to obtain a contrast composition.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la dialyse est réalisée en flux continu ou en semi-continu. 16. Method according to claim 15, characterized in that the dialysis is carried out in continuous or semi-continuous flow.
17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la dialyse est une dialyse en discontinu, réalisée dans un sac de dialyse. 17. The method of claim 15, characterized in that the dialysis is a discontinuous dialysis, carried out in a dialysis bag.
18. Application de la composition selon l'une des revendica¬ tions 1 à 14 à l'imagerie du système circulatoire, des organes vascularisés et des petites cavités, caractérisée en ce que l'on injecte la composition par voie enterale ou parenterale, et en ce que l'on visualise ces éléments par un moyen approprié, choisi parmi l'imagerie par RX, par résonance magnétique nucléaire ou par ultrasons.18. Application of the composition according to one of claims 1 to 14 for imaging the circulatory system, vascularized organs and small cavities, characterized in that the composition is injected enterally or parenterally, and in that these elements are visualized by an appropriate means, chosen from X-ray, nuclear magnetic resonance or ultrasound imaging.
19. Application selon la revendication 18, caractérisée en ce que l'on effectue la visualisation à des temps différents, allant jusqu'à 120 jours.19. Application according to claim 18, characterized in that the visualization is carried out at different times, up to 120 days.
20. Application selon les revendications 18 et 19, caractérisée en ce que l'on injecte la composition à des doses allant de 1 à 500cm3 de culot globulaire traité.20. Application according to claims 18 and 19, characterized in that the composition is injected in doses ranging from 1 to 500 cm 3 of treated globular pellet.
21. Application selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisée en ce que l'on prélève les erythrocytes d'un patient, en ce* qu'on les traite de manière à encapsuler un produit de contraste, et en ce qu'on les réinjecte. 21. Application according to one of claims 18 to 20, characterized in that the erythrocytes are removed from a patient, in * that they are treated so as to encapsulate a contrast product, and in that we re-inject them.
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