WO1986002380A1 - Cloning or expression vectors comprising the genome of the virus of fowl erythroblastosis and cells transfected by said vectors - Google Patents

Cloning or expression vectors comprising the genome of the virus of fowl erythroblastosis and cells transfected by said vectors Download PDF

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WO1986002380A1
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virus
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Inventor
Jacques Samarut
Gérard Verdier
Miloud Benchaibi
Pierre Savatier
Didier Poncet
Frédéric Flamant
Jiao-Hao Xiao
Pierrick Thoraval
Frédérique Chambonnet
Victor Nigon
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inr
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the stable introduction of genetic material into organisms generally implies that this transfer takes place in precursor cells whose potential for multiplication and differentiation is high.
  • precursor cells can either be representative of a very specific differentiation pathway, such as for example hematopoietic stem cells, or totipotent like germ cells.
  • the target cell population for transfer is very small in the tissues considered.
  • the use of compound vectors comprising viral genomes has enabled a marked improvement in the incorporation of an exogenous sequence into a cell in culture.
  • the present invention relates to new vectors of this type and in particular to gene transfer vectors derived from retroviruses, in particular from avian erythroblastosis retroviruses.
  • Retroviruses owe to their particular structure the ability to integrate easily in the form of proviruses into the genomic DNA of the cells they infect.
  • the structural elements which ensure this integration are carried at the two ends of the provirus and are called "Long Terminal Repeat" or LTR.
  • AEV contains two onc genes called v-erbA and v-erbB and whose expressions are responsible for the oncogenic power of this retrovirus.
  • the oncogenic power of the AEV virus was used as a selection marker and its ability to insert for the transfer into cultured cells of an exogenous gene inserted into this retrovirus.
  • the oncogenic power of the AEV virus is deleted and the marker gene is a foreign gene, for example of resistance to an antibiotic such as G418.
  • RNA molecule with a short sequence in the direction of transcription (5 ' ⁇ 3') identical to each end and called R ( between 21 and 80 bases). It is followed, in order, by a unique sequence called U5 (from 70 to 80 bases), by a tRNA binding site (TBS, approximately 20 bases), and by a non-coding sequence ( "leader" sequence).
  • the RNA molecule is continued by a region coding for three genes whose translation products are essential for the replication of the virus and which are gag (structural proteins of virions), pol (reverse polymerase), env (envelope).
  • PU purines
  • U3 unique sequence
  • R unique sequences
  • U5 and U3 unique sequence specific to retroviruses seem to be fairly well preserved in this group of viruses and contain the signals involved in controlling the expression of the viral genome.
  • retroviruses such as AEV, responsible for neoplastic transformations resulting in leukemias or tumors, owe their transforming power to the presence of particular "onc" sequences in their genome.
  • onc sequences have a cellular origin and have been integrated into the viral genome following recombinations with the genome of the host cells of the virus. In most of these viruses, this integration is accompanied by the total or partial loss of the gag, pol and env genes. These viruses are therefore defective for replication. To replicate, these viruses require the presence in the same host cell of a functional helper virus. Helper viruses are able to replicate. Their genome contains only the functional genes gag, pol and env.
  • the retrovirus infection cycle begins with the adsorption of virions on the cell surface, followed by penetration into the cytoplasm.
  • the steps representing the replication and the viral cycle of a retrovirus are summarized in FIG. 1.
  • the single-stranded viral RNA (a) is transcribed by the reverse polymerase, present in the virion, into a linear copy of double stranded DNA (b).
  • the DNA copy resulting from this reverse transcription is slightly longer than the viral RNA molecule which served as its template. This difference is the result of the addition of a U3 sequence at the 5 'end and a U5 sequence at the 3' end.
  • LTR Long Terminal Repeat
  • Copies of viral DNA containing one or two LTR sequences are sent to the nucleus where they are converted into molecules of circular shapes (c). Some circular molecules have only one LTR. These molecules are then integrated into cellular genomic DNA (d).
  • the viral DNA is integrated into the cellular DNA so that it is surrounded by an LTR at each end and then bears the name of proviral DNA or provirus. Thereafter, we will call "left LTR" of a provirus the LTR located upstream of the gag gene and "right LTR" the LTR located downstream of the env gene.
  • RNAs obtained after transcription of the provirus are like the mRNAs of eukaryotic cells, "wrapped" by a 7mG residue terminal at the 5 'end, and provided with a polyadenylated sequence at their 3' terminal end.
  • RNA molecules associate in dimers via hydrogen bonds at their 5 ′ end and are encapsidated in the viral protein envelope.
  • the viral particles form a whole which sediments at 7OS. They are rejected outside the producer cell and will infect neighboring cells. This release of viral particles is not accompanied by cell death.
  • AEV vector as a vector for cloning or for expression of a foreign gene (hereinafter AEV vector) can take various forms, taking into account its development process.
  • the description below refers more particularly to the AEV virus, but the invention relates generally to retroviruses, and more particularly to avian retroviruses.
  • the invention is more particularly advantageous for retroviruses in which two genes can be expressed simultaneously from the same promoter, in particular the promoter contained in the LTRs and which depend on two genomic and subgenomic RNAs.
  • the vector AEV When the vector AEV is used under conditions allowing its replication and the formation of virions, that is to say with an assistant virus, the infection of cell culture in vitro can be carried out with considerable efficiency. given the multiplication of infectious virions.
  • the present invention therefore relates to the use of avian retroviruses, in particular AEV, as vectors for cloning or expression of a foreign gene.
  • cloning or expression vector are known in the field of genetic engineering.
  • viruses may sometimes refer to the viral genome in the form of DNA, just as in certain cases the foreign "gene” may be in the form of 'RNA, especially when inserted into the genome of a virion.
  • the techniques for passing from a DNA form to the RNA form and vice versa are known and are transcription and reverse transcription.
  • the term “foreign gene” is intended to denote a gene which is not found in the genome of the natural AEV and preferably which is not found in the genome of a virus.
  • the recombinant virus can be used as such in the form of an RNA virion, but the viral genome in the form of DNA comprising the insertion of a foreign gene. also in the form of DNA and corresponding to the reverse transcription of the RNA of the virus, can be integrated into a DNA vector such as a plasmid, a cosmid or a phage for example.
  • a DNA vector such as a plasmid, a cosmid or a phage for example.
  • the essential characteristic of these vectors is that the foreign gene is inserted between the two LTR sequences of the retrovirus, in particular of the AEV.
  • the retroviruses in question are, most often, defective, this is why when the vector in question must be replicated, it will be used in the presence of a functional assistant virus which will contain at least the functional genes missing for the replication of the AEV, that is to say in general the genes gag, pol and env.
  • the foreign gene or genes must therefore be inserted so as to preserve the initiation and the stop of transcription, the site of polyA addition in the LTR and the splicing signals.
  • this type of vector can be used in two essential forms depending on the nature of the marker gene used.
  • the marker gene can take advantage of the oncogenic properties of AEV, there will then be oncogenic vectors more particularly usable for cell cultures, or else the oncogenic activity will have been deleted and replaced by a marker gene for resistance to a drug analogous to a. antibiotic such as G418, we will then have a non-oncogenic vector usable for example for certain gene transfers "in vivo".
  • the AEV genome shown schematically in Figure 2, b, consists of a "leader" sequence located immediately downstream of the U5 region. This sequence is followed by a gag gene truncated in its 3 'half. The pol gene is absent. The onc v-erbA and v-erbB genes cover approximately 3 kb. These two genes are separated by a junction sequence containing a splice acceptor site.
  • the AEV genome is therefore completely devoid of the pol gene and partially of the env and gag genes. Replication of the virus therefore requires simultaneous infection with a helper virus.
  • the assistant virus is RAV-2, the genome of which is represented in FIG. 3.
  • the v-erbB gene alone ensures the transformation of fibroblasts "in vitro” and the induction of sarcomas "in vivo";
  • This oncogenic power of AEV located mainly on erbB, can be used as a means of controlling the transformation of cells exposed to this virus.
  • the transforming character of retroviruses in general and of AEV in particular is to be compared to that resulting from genes coding for the expression of dominant markers (xgprt gene or Neo r gene) which are used in
  • the advantage of this oncogenic transformation induced by a retrovirus is that it brings about physiological changes which give the transformed cells a increased multiplicative power.
  • the particular ability of transformed fibroblasts to develop in soft agar offers a method of selecting cells that have incorporated and expressed the viral genome.
  • foreign genes are inserted either in the v-erbA gene or downstream of the v-erbB gene and before the right LTR sequence.
  • the experiments carried out showed that the foreign gene could be oriented in one or the other direction relative to the direction of reading of the viral genome.
  • the insertion of the foreign gene into the EcoRI site (2) of AEV has led to two active vectors, AEVdelta (28) and AEVdelta (17), incorporating the gene for human globin delta, which can be used by replacing the globin gene by another gene.
  • this plasmid can comprise a part of bacterial plasmid with, for example, an origin of replication in prokaryotes and for example a resistance to an antibiotic, as is known, but it can also be a phage or a cosmid.
  • Chicken fibroblasts in culture transfected with the recombinant viruses in the form of DNA clones gave rise to production of infectious viral particles with very high titers.
  • the globin genes in particular human delta globin, have been used, because it can be imagined that it can easily be detected after its incorporation into the genome of chicken cells.
  • the particular choice of the globin delta gene is based on various criteria:
  • the size of the deltaPst fragment does not exceed 2.3 kb, a fragment of much larger size would cause an increase in the size of the viral genome which could inhibit its encapsidation in the viral particles;
  • this sequence finally presents a restriction map which facilitates its insertion into the AEV genome.
  • Non-oncogenic vectors In this second type of vector, the v-erbB gene is no longer expressed, preferably because it has been at least partially deleted.
  • the 1.6 kb of nucleotide sequences of origin of the erbB gene are eliminated and replaced by the Neo r structural gene of the Tn5 prokaryotic transposon.
  • the result is three recombinant DNAs pXJ1, pXJ2 and pXJ3.
  • Neo r structural gene is only described by way of example, it is of course possible to use other resistance genes as a marker gene.
  • the pXJ1 clone contains a single copy of the Neo s Orienting gene in the same transcriptional direction as that of the AEV.
  • the heterologous sequences introduced are 1.2 kb long. They consist of a sequence derived from a phage mp11 cloning "polylinker”, nucleotides derived from a BglII "linker”, from a BglII-HincII fragment from the bacterial transposon Tn5 in which the Neo r gene is located, and of a short sequence of the HSV tk gene carrying in particular the site of addition of polyA sequences.
  • Neo gene two copies of the Neo gene are introduced at the location of the deleted erbB gene. These two identical genes are arranged in tandem in the same transcriptional orientation as that of the deleted erbB gene.
  • heterologous sequences introduced are 2.4 kb.
  • the junctions between the heterologous sequences and the retroviral vector are the same as in the case of pXJ1.
  • the only difference between wild-type AEV and the constructed retroviral vectors is that the viral oncogene v-erbB is replaced by the prokaryotic gene Neo.
  • the bacterial cells transformed by pXJ1 and pXJ3 show a growth 10 times higher than that of the cells transformed by pXJ2.
  • the pXJ5 clone lacking the Neo r gene does not induce any resistance to kanamycin in the transformed bacteria.
  • the LTR of the AEV contains sequences playing a role of prokaryotic promoter.
  • the possibility cannot be excluded that the Neo r gene is activated by potential promoters present in the conserved sequences of pBR322.
  • Neo r gene in addition to its use as a marker, must be considered as an example of the expression of a foreign gene in a vector according to the invention.
  • the Neo r gene will be used as a marker and another foreign gene will be incorporated into the vector.
  • Other non-oncogenic vectors originate from AEV in which the two oncogenes v-erbA and v-erbB are inactivated by partial or total deletion.
  • the insertion of the Neo r gene was carried out first in a sequence leaving several initiation codons remaining in different reading phases, then in a construction comprising only initiation codons in the same phase of reading. It turns out that this latter construction influences the production ratio of genomic RNA / subgenomic RNA in a direction favorable to the production of genomic RNA, that is to say to the expression of the gene carried by the site placed in 5 '.
  • the use of this vector has involved the development of a specific titration method for avian viruses carrying the Neo gene.
  • the particularly advantageous vectors according to the invention are those in which a unique restriction site has been inserted between the two acceptor and splice donor sites and a unique restriction site downstream of these splice sites; under these conditions, it is possible to insert into these sites foreign genes which will correspond to a genomic RNA and a subgenomic RNA during transcription.
  • these sites will be placed so that the inserted genes can be in phase in the reading frame, it is said that the genes are synchronized.
  • genes will preferably be placed to be dependent on the promoter of the LTR 5 ′.
  • One of the genes in question could, for example, be a selection gene such as Neo or the like.
  • the foreign genes inserted into the vectors according to the invention have often been expressed by means of expression elements found in the genome of the virus, it is of course possible to insert upstream of the gene foreign specific expression elements which provide increased expression of the foreign protein; these expression elements may be, for example, promoters of viruses, in particular of avian viruses.
  • the vector when it is a plasmid, a cosmid or a phage, it will also contain the elements necessary for the replication of the latter in prokaryotic cells, as well as the elements characteristic of this type of vector such as the cos ends in the cosmid.
  • the present invention further relates to cells transfected with the vectors according to the invention, whether in the form of viruses or of plasmids.
  • the primary transfection will generally be carried out with plasmid type vectors, that is to say that the AEV will be in the form of the DNA of its genome; but, in the presence of the DNA of the helper virus, transfected avian cells will in this case transform and release recombinant viruses which will be able to transfect other cells.
  • This process makes it possible to have a very high cell transformation yield which will be particularly valuable in "in vitro" cell cultures.
  • This type of process also makes it possible to build up stocks of vector viruses which can subsequently be used in place of the plasmid vectors.
  • the culture should be carried out in the presence of said antibiotic.
  • the cells in question can be diverse but are preferably avian cells, in particular hematopoletic, germinal or fibroblastic type cells.
  • the preferred cells for the implementation of the vectors of the invention are the chicken embryo fibroblasts.
  • the invention relates to the process for the preparation of a specific protein, a process in which cells modified with an AEV vector according to the invention are cultivated in which the foreign gene codes for said protein and in that the cell culture protein.
  • the cells in which the virus has integrated in the form of proviruses can constitute cell lines, it can also be avian or non-avian cells.
  • the infection is carried out at the level of the germ cells, in particular at the level of the egg, one can obtain transformed animals.
  • FIG. 1 is a diagram of the various stages of development of a retrovirus
  • FIG. 2 represents the structure of the genome of AEVwt and of AEVPst124
  • FIG. 3 represents the genome of RAV2 helper virus in the form of double-stranded DNA
  • FIG. 5 represents the construction of an AEV DNA genome comprising LTR sequences at each end (pAEV2LTR)
  • FIG. 6 represents the map of the recombinant plasmid pBRdeltaPst and of the various fragments of the human delta globin gene used in the experiments for the construction of transfer vectors.
  • FIG. 7 represents the construction of recombinant vectors of the pAEV2LTRdelta type
  • FIG. 8 represents the structure of AEVdelta (28)
  • FIG. 9 represents cloned DNA fragments used as probes
  • FIG. 10 represents the theoretical genome restriction maps wild type provirals (a), AEVdelta mutant (28) (b), AEVdelta mutant (17) (c),
  • Figure 11 shows the cloning of Bal31 fragments in mpll
  • Figure 12 shows the construction of the AEV mutant pAEV ⁇ erbB (pXJ4)
  • FIG. 13 represents the introduction of the Neo gene of the transposon Tn5 into the retroviral vector pXJ5
  • FIG. 14 represents the structures of the clones pAEV ⁇ erbB
  • FIG. 15 represents the genome structure of the AEV cloned in pBR313
  • FIG. 16 represents the cloning of the HincII-BamHI fragment (1.2 kb) containing the junction between v- erbA and v-erbB in bacteriophages mp8 and mp11 in the form of double-stranded DNA
  • FIG. 17 is a comparison of the nucleotide sequences between the v-erbB gene of AEV and that of AEV-H (YAMAMOTO et al. ., 1983), —-: identical nucleotides, the different nucleotides are indicated in the sequence of the AEV, the BamHI site in the 5 ′ region of v-erbB is underlined, FIG.
  • FIG. 18 represents the nucleotide sequence of the selected Bal31 fragments, the non-coding sequence inserted between the erbA gene and the erbB gene is numbered; the limits of the sequences of the v-erbA and v-erbB genes and that of the mp11 cloning vector are indicated by vertical lines; the horizontal lines represent the sequences of the v-erbB gene conserved after digestion with Bal31; restriction sites in mp11 sequences are underlined; p15-16, p15-21, p15-25, p15-28: names of the CAG clones: suspected splice acceptor site; Figure 19 shows the structure of the pXJ1 clone and the restriction site map; Figure 20 shows the restriction site map and structure of pXJ2; Figure 21 shows the restriction site map and structure of pXJ3; FIG.
  • FIG. 22 represents the junction sequences between the Neo gene and the retroviral vectors in the clones pXJ1 and pXJ3.
  • Figure 23 shows the preparation of the mJS21 erb- clone;
  • FIG. 24 represents the preparation of the mp11 -gag clone;
  • Figure 25 shows the preparation of the mp10-J clone;
  • FIG. 22 represents the junction sequences between the Neo gene and the retroviral vectors in the clones pXJ1 and pXJ3.
  • Figure 23 shows the preparation of the mJS21 erb- clone;
  • FIG. 24 represents the preparation of the mp11 -gag clone;
  • Figure 25 shows the preparation of the mp10-J clone;
  • FIG. 26 represents the preparation of the pBRgag-2,7 ⁇ clone;
  • Figure 27 shows the preparation of the pBRgag-J clone;
  • Figure 28 shows the preparation of the pBRgag-J-env LTR clone;
  • Figure 29 shows the preparation of the clone pBRgag-J-env 2LTF
  • Figure 30 shows the preparation of the clone pXJ11;
  • Figure 31 shows schematically the structure of pXJ12.
  • L cells are maintained in culture at 37 ° C. and at 5% CO 2 .
  • the cells are subcultured regularly every 3 or 4 days.
  • the culture medium is composed of DMEM (Gibco) supplemented with 10% of fetal calf serum, 2 mM of glutamine, 2.2 mg / ml of sodium bicarbonate, 100 ug / ml of streptomycin, 100 ui / ml of penicillin .
  • Chicken fibroblasts are obtained after subculturing of primary cultures prepared from 10 to 11 day embryos and maintained in culture in HAM F10 medium (Gibco) supplemented with 10% tryptose phosphate broth (Gibco), 2 ⁇ g / ml polybrene, 5% calf serum, 1% inactivated chicken serum, 2 mg / ml sodium bicarbonate, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 100 ui / ml penicillin and 60 mg / ml fungizone.
  • HAM F10 medium Gibco
  • tryptose phosphate broth Gibco
  • 2 ⁇ g / ml polybrene 5% calf serum
  • 1% inactivated chicken serum 2 mg / ml sodium bicarbonate
  • 100 ⁇ g / ml streptomycin 100 ui / ml penicillin and 60 mg / ml fungizone.
  • Bacterial strains of E. coli HB101 or C600RS harboring the plasmids used are cultured on L. broth medium (10 g / 1 bacterotryptone, 5 g / 1 yeast extracts, 5 g / 1 NaCl) supplemented with 5 ml / 1 of a glucose solution at 20 % and with appropriate antibiotics.
  • the plasmids are isolated by the clarified lysate technique according to EL-GEWELY and HELLING (1980), and purified on a cesium chloride gradient.
  • the purified plasmid DNAs are resuspended in double-distilled water and stored at + 4 ° C.
  • b) Preparation of DNA from Chicken Fibroblasts The DNA from chicken fibroblasts is obtained after homogenization of the cells in 100 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM EdtaNa 2 , 100 mM NaCl, 0.5% SDS. Pronase is added to 0.5 mg / ml and the mixture is incubated at 37oC for 8 to 12 hours.
  • the DNA is extracted with phenol chloroform and chloroform-isoamyl alcohol.
  • the solution is adjusted to 200 mM NaCl and precipitated a first time with isopropanol then 2 times with ethanol.
  • the pellet resuspended in TE buffer (Tris 10 mM pH 7.4, Edta 1 mM), is treated with RNase (50 ⁇ g / ml) for 1 hour at 37 ° C., then with pronase (100 ⁇ g / ml) for 1 hour at 37 ° C.
  • the DNA solution is extracted once with phenol, twice with chloroform-isoamyl alcohol and finally the DNA is precipitated with two volumes of ethanol.
  • the DNA residue thus purified is resuspended in TE buffer and kept at + 4oC. 2) Digestion by restriction enzymes
  • the restriction enzymes come from Boehringer and are used under the incubation conditions given by the manufacturer. Generally, 1 to 4 units of enzyme are used to digest 1 ⁇ g of DNA for 2 hours at 37 ° C. The enzymatic reaction is stopped by incubation at 65 ° C for 5 to 10 minutes. 3) Preparation of RNAs
  • RNA is previously sterilized by heating in a pasteur oven for at least 2 hours.
  • the tubes used for extraction are further treated with 1% diethylpyrocarbonate. (Sigma).
  • the pads are sterilized at 120 ° C for 30 to 40 minutes.
  • Total cellular RNA is extracted from eukaryotic cells according to the technique of AUFFRAY and ROUGEON (1980) from 20.10 6 to 50.10 6 chicken fibroblasts infected with retroviruses.
  • the cell pellets are frozen in liquid nitrogen 10 to 15 minutes and resuspended in a denaturing buffer (3M LiCl, 6 M urea, 0.01 M sodium acetate pH 5, 0.01 M vanadyl ribonucleic complex (BRL)).
  • a denaturing buffer 3M LiCl, 6 M urea, 0.01 M sodium acetate pH 5, 0.01 M vanadyl ribonucleic complex (BRL)
  • the solution is adjusted to 0.01% SDS and stored overnight at + 4 ° C.
  • the RNA is recovered after centrifugation at 10,000 rpm for 20 minutes at 4oC.
  • the pellet is washed ⁇ with an 8 M urea solution, 4 M LiCl, then resuspended in double-distilled water.
  • the RNA solution is extracted once with phenol, once with phenol-chloroform, and finally the RNA is precipitated with 2 volumes of ethanol in the presence of 0.2 M sodium acetate pH 5.
  • the polyA RNAs are prepared according to the technique described by LONCAGRE and RUTTER (1977), by column filtration.
  • RNA virions 200 to 500 ⁇ g of total RNA are deposited on a column containing 200 to 300 mg of oligodT cellulose type 3 (Collaborative Research). The filtration of RNA is carried out in a buffer containing 10 mM Tris pH 7.4 and 500 mM KCl. The eluate is recycled twice on the column. The polyA RNA is released by the elution buffer (Tris 10 mM pH 7.4). The polyA RNA solutions are adjusted to 200 mM sodium acetate pH 5 and the polyA RNA are precipitated with two volumes of ethanol. The pellets are resuspended in double distilled water and stored at - 20 ° C. c) Prégarâtign of RNA virions
  • the virions are recovered in the culture supernatants of chicken fibroblasts infected with the virus.
  • the culture medium is changed by fresh medium.
  • the virions are then collected 24 hours later.
  • the supernatants are then centrifuged for the first time at 2000 rpm for 10 minutes to remove cellular debris.
  • Virions are then sedimented by ultracentrifugation in a 50.2 Ti rotor at 16,000 - 18,000 rpm for 2 hours at 4oC.
  • the pellets containing the virions are resuspended in 10 mM Tris pH 7.4 containing 10 mM Edta, 100 mM NaCl and the 10 mM vanadyl-ribonucleic complex. 0.1% SDS and proteinase K (0.5 mg / ml) are added and the suspension is incubated for 1 hour at 37 ° C. then extracted twice with phenol, twice with chloroform, and the RNA is precipitated with 2 volumes of ethanol.
  • RNAs 15 to 20 ⁇ g of total RNA or of polyA + RNA or 2 to 5 ⁇ g of polyA RNA are denatured with formaldehyde according to LEHRACH et al. (1977).
  • the RNAs are balanced with MOPS buffer (20 mM morpholinopropane sulfonic acid pH 7, 5 mM sodium acetate, 1 mM Edta) and denatured in the presence of 6% formaldehyde and 50% formamide at 65 ° C, for 5 to 10 minutes, then quickly cooled in ice.
  • the fractionation of the denatured RNA is carried out on a horizontal gel of 1% to 1.5% of agarose, containing 6% of formaldehyde, in MOPS buffer.
  • RNA from the gel to a nitrocellulose filter is carried out according to the technique of SOUTHERN (1975) modified by THOMAS (1980).
  • the nitrocellulose filter rinsed with double distilled water is balanced for 5 to 10 minutes in SSC x 20 before being applied to the gel.
  • the transfer lasts one night at + 4 ° C.
  • the filter is then collected, dried under a lamp for 5-10 minutes.
  • the mixture is incubated for 2 hours at 15oC.
  • the reaction is stopped by adding 50 ⁇ l of 250 mM Edta, and the labeled DNA is separated from the nucleotides not incorporated on a column of Sephadex G.50 or biogel (Bio-Rad A. 1.5 m).
  • the filters are dried at 70-80 ° C for 2 hours, treated with a prehybridization buffer (50 mM Tris-HCl pH 7, SSC x 3, RNA 20 ⁇ g / ml, salmon sperm DNA 20 ⁇ g / ml, Denhardtslx, 50% formamide for 8 to 20 hours at 42 ° C.
  • a prehybridization buffer 50 mM Tris-HCl pH 7, SSC x 3, RNA 20 ⁇ g / ml, salmon sperm DNA 20 ⁇ g / ml, Denhardtslx, 50% formamide for 8 to 20 hours at 42 ° C.
  • L hybridization is carried out in the same buffer containing 5-10 ⁇ 10 6 cpm of the radioactive probe for 24 to 48 hours at 42 ° C.
  • the filters are washed once in 2x SSC for one hour at 42 ° C then twice in 0.1x SSC, 0.1% SDS for 45 minutes at 50 ° C, and finally rinsed 4 times in 0.1x SSC for 5 minutes.
  • Hybrid filters for the first time with a 32 P-labeled probe are dehybridized in SSC
  • DNA is extracted from agarose by either of the following two techniques: a) Electroelution technique
  • the cut region of the gel, and containing the fragment to be isolated, is placed in a dialysis bag containing E-T buffer (Tris 40 mM pH 7.5, 20 mM sodium acetate, 2 mM Edta).
  • E-T buffer Tris 40 mM pH 7.5, 20 mM sodium acetate, 2 mM Edta.
  • the bag is subjected to an electric field (30-40 volts) in a tank containing E-T buffer.
  • the piece of gel containing the fragment to be isolated is balanced in 10 times its volume of a solution containing 300 mM sodium acetate pH 7, and 1 mM EDTA, with stirring for 30 to 45 minutes at shelter from light.
  • the gel piece is placed in a 0.6 ml Eppendorf tube, pierced at the bottom and capped with glass wool, and the whole is frozen in liquid nitrogen.
  • the tube containing the gel piece is placed in a 1.5 ml Eppendorf tube and then centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at room temperature.
  • the recovered solution containing the fragment to be isolated is adjusted with a solution containing 1 mM MgCl 2 and 10% acetic acid, then precipitated with 2.5 volumes of ethanol.
  • the pellet is rinsed successively with a mixture containing 70% ethanol.
  • the pellet is dried briefly, then resuspended in TE buffer. 2) Sucrose gradient
  • the DNAs are dialyzed in T-E buffer overnight then purified with phenol and chloroform and finally precipitated with ethanol.
  • the DNA is incubated in the presence of bacterial alkaline phosphatase or BAP (BRL) for one hour at 65 ° C. Generally, 10 units of BAP are used per mole of 3 'end of DNA to be dephosphorylated. The enzyme is then eliminated by two successive extractions with phenolchloroform and the DNA is recovered by precipitation with ethanol.
  • BAP bacterial alkaline phosphatase
  • the DNA fragments are ligated in a buffer composed of Tris 600 mM pH 7.6, MgCl 2 66 mM,
  • the PstI "linkers” were used for the construction of the pAEVdelta ⁇ Hpa recombinants. In this particular case, the "linkers” are added to the Hpal site of the human globin delta gene.
  • 0.5 ⁇ g of PstI linkers (BRL) are phosphorylated in a mixture containing 60 mM Tris HCl pH 7.8, 10 mM MgCl 2 , 15 mM beta-mercaptoethanol, 4 units of polynucleotide kinase (Boehringer), ATP 50 ⁇ M and 10 ⁇ Ci ATP gamma 32 P. The reaction is incubated at 37oC for 30 minutes.
  • the mixture of phosphorylated PstI "linkers" is added to 5 ⁇ g of plasmid pBRdeltaPst previously opened at the Hpal site and dephosphorylated.
  • the mixture is subjected to the action of T4 ligase overnight at 15oC.
  • the DNAs of recombinant plasmids are introduced into C-600 RS bacteria made competent according to the technique of MANIATIS et al. (1982). The transformed bacteria are then spread on an agar dish containing the appropriate antibiotics.
  • the colonies containing the desired recombinants are identified by hybridization of the filter with a DNA probe labeled with dCTPalpha 32 P by cut translation.
  • the filters are prehybridized in a mixture of 50% formamide and SSC5x for 2 hours at 37-42 ° C.
  • Hybridization is carried out in the same mixture in the presence of appropriate specific probes for 24 to 48 hours at 42 ° C.
  • the filters are washed respectively 30 minutes in 50% formamide and SSC5x at 37-42 ° C and 4 times 30 minutes in SSC2x at room temperature.
  • the filters are finally rinsed in ethanol then dried in air and exposed for autoradiography for 2 to 4 hours.
  • the colonies containing the DNA fragment sought are identified after revelation of the autoradiography, then isolated and analyzed by rapid preparation. of plasmids. 2) Rapid preparation of the plasmid DNAs
  • the plasmids are prepared from 1.5 ml of culture according to the alkaline lysis method of BIRNBOIM and DOLY (1979) modified by MANIATIS et al. (1982).
  • Plasmid DNAs are analyzed by digestion using restriction enzymes and fractionation on agarose gels.
  • the quantity of DNA transfected per culture dish with a diameter of 60 mm is 10 to 15 ⁇ g.
  • This DNA is made up of salmon sperm DNA (3 to 4 ⁇ g) and viral DNA.
  • the viral DNA itself consists of the plasmid containing the modified AZV genome and of the plasmid containing the DNA of the RAV-2 helper virus in a molar ratio of 5/1 to 10/1.
  • the DNA mixture is suspended in a volume of buffer A (25 mM HEPES, 250 mM CaCl 2 , pH 7.15).
  • Phosphocalcic precipitation is carried out by adding a volume of buffer B (25 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.15) with rapid stirring (10 to 15 seconds). A very fine precipitate is observed in the mixture after 20 to 30 minutes at room temperature.
  • 6.10 secondary fibroblasts from chicken embryos are seeded in 60 mm diameter petri dishes, 16 hours before transfection.
  • the precipitated DNA mixture is placed in each culture dish and the cells are incubated for 5 to 6 hours at 37 ° C.
  • the transfection medium is then replaced with fresh medium and the cells are subcultured in a 100 mm diameter petri dish. Every 3 to 4 days, each culture dish is then distributed into three dishes 100 mm in diameter.
  • the RAV-2 helper virus genome was obtained from BOONE and SKALKA (1981). It consists of an 8 kb sequence inserted at the SalI site of the DNA of phage lambda.
  • pRAV2 DNA In order to produce RAV-2 virions, pRAV2 DNA must be transfected into chicken fibroblasts.
  • the viral DNA must be introduced into the receptor cells in the form of a genome framed by LTR and in which the arrangement of the genes corresponds to that existing in the viral RNA.
  • This arrangement can be carried out "in vitro" after digestion of the plasmid pRAV2 with Sali and religation of the fragments obtained in order to create concatemers (FIG. 4). Concatemerization by ligation makes it possible to generate a certain number of molecules which can be integrated into the genome of the host cells and transcribe genomic RNA which can generate infectious virions. It will be noted that only a proportion of the concatemers is capable of giving birth to virions.
  • the starting clone consists of the plasmid pAEV11 isolated by VENNSTROM et al. (1980) and which is shown in Figure 2, a.
  • This clone consists of the plasmid pBR313 into which the AEV genome of about 5.4 kb has been inserted at the unique EcoRI site.
  • the viral genome presents a permutation due to the presence of the EcoRI site located at
  • this clone contains a double LTR structure.
  • the production of virions from pAEV11 involves the transfection, on chicken fibroblasts, of concaterers reconstituting an integral genome. In this case also the proportion of concaterers having the favorable arrangement is low.
  • a clone is recreated by genetic recombination "in vitro" in which the viral genome is reconstituted in a form identical to the provirus.
  • the rearrangement carried out consists in isolating the 1.8 kb EcoRI-BamHI viral fragment (FIG. 5) covering the end of the v-erbB, the 3 ′ terminal residue of the env gene ( ⁇ env), the LTR sequences and the start of the gag gene. .
  • This fragment was inserted and cloned into pBR322, deleted from its minor EcoRI-BamHI fragment.
  • the plasmid obtained is called pJS21.
  • the entire AEV genome is isolated from pBR313 after digestion of the plasmid pAEV11 with EcoRI.
  • the fragment carrying the AEV genome is ligated to the plasmid pJS21 priora openly open to the unique EcoRI site.
  • One of the recombinants obtained, called pAEV2LTR has the structure of a provirus with an LTR copy at each end.
  • PAEV2LTR DNA can be transfected into chicken fibroblasts without prior digestion. After cotransfection with DNA carrying the sequences of the RAV2 helper virus, the fibroblasts produce virions of the AEV type and undergo a detectable oncogenic transformation approximately 15 days after the transfection. It is noted that transfection with pAEV2LTR very clearly increases the efficiency of viral production compared to transfection with concatimerized pAEV11.
  • the globin delta fragment is obtained after digestion of the plasmid pBRdeltaPst (FIG. 6) with EcoRI and isolation on a sucrose gradient. This DNA fragment begins upstream with a sequence derived from the plasmid pBR322 (EcoRI-PstI of approximately 0.750 kb). The pBR fragment is maintained essentially for the purpose of retaining an EcoRI site at the 5 'end of the delta fragment.
  • the specific structure of the delta region extends from the PstI site to the EcoRI site.
  • the delta gene proper begins at 460 bp downstream from the PstI site.
  • This site called “cap” is the initiation point for the transcription of delta messenger RNAs.
  • 30 bp upstream of the "cap” site is the CATAAAAG sequence, which is the counterpart of the "TATA” sequence.
  • the homolog of the second consensus sequence "CAT” encountered in the majority of eukaryotic genes between 70 and 80 bp upstream of the cap site seems modified in the case of the delta gene (AACCAAC).
  • the two consensus sequences TATA and CAT are involved in the regulation of the transcription of eukaryotic genes transcribed by RNA polymerase II.
  • the transcribed region includes respectively going from the cap site from 5 'to 3': - a "leader" sequence covering 50 bp,
  • the 3 'end of the gene is shortened from the EcoRI site.
  • the consequence of this deletion is the elimination of 75 bp of the 3rd exon and of all the 3 'non-coding region carrying inter alia the polydenylation signal (AAUAAA) located at 18 bp having the transcription termination site.
  • the pAEV2LTRdelta clones therefore have 3 EcoRI sites which we will identify from left to right respectively under the names: EcoRI (1), EcoRI (2), EcoRI (3).
  • c) Structure of the pAEV2LTRdelta plamide (28) The insertion of the fragment carrying the delta gene at the unique EcoRI site of the AEV interrupts the normal structure of the v-erbB gene (FIG. 8, a). The result of this insertion results in the creation of a new termination codon (UGA) for the ErbB protein, located 1 bp downstream of the EcoRI site (2). Consequently, the erbB protein of the AEVdelta mutant (28) must have 12 fewer amino acids in the C-terminal region.
  • the viral strand which transcribes the genomic RNA (strand +) carries the anti-coding strand of the delta gene.
  • the anti-coding strand of the delta gene reveals two sequences which recall polyadenylation signals (AAUAAA) at 93 bp and 800 bp downstream of the EcoRI site (2) (FIG. 9b).
  • the promoter proper to the gene located upstream of the cap site is no longer carried on the viral strand transcribed.
  • plasmids obtained by "in vitro" recombination are characterized by restriction mapping and hybridization with a probe specific for the globin delta gene.
  • the plasmid DNAs of the different clones selected, pAEV2LTR, pAEV2LTRdelta (28), pAEV2LTRdelta (17), are prepared by the alkaline lysis technique (MANIATIS et al. 1982), digested respectively by the following 4 restriction enzymes: EcoRI, BamHI, PstI and Sali. The digestion fragments are separated on an agarose gel and visualized in UV light.
  • the DNA is then denatured in the gel and then transferred to a filter.
  • the filter is hybrid with a deltaPst probe labeled with 32 P by cut translation.
  • the bands corresponding to the fragments carrying the gene are revealed by exposure in autoradiography. For each recombinant, the sizes of the fragments resulting from the 4 digestion (EcoRI, BamHI,
  • PstI and Sali are deduced from the sizes of the fragments of the molecular weight marker used (lambda phage DNA digested with HindIII).
  • the cells were maintained in a liquid medium and transplanted regularly.
  • the morphological change characteristic of the transformation of fibroblasts by AEV appeared from the 4th passage (2nd week) for the three viruses. After seeding in soft agar, these cells produce colonies of transformed fibroblasts. The supernatants of the transformed cultures were collected in order to constitute stocks of virus and used to infect fresh secondary fibroblasts whose visible oncogenic transformation they induce after approximately one week.
  • the viruses produced from the plasmids pAEV2LTRdelta (17) and pAEV2LTRdelta (28) will be called AEVdelta (17) and AEVdelta (28).
  • the stocks of AEVdelta (17) and AEVdelta (28) viruses were titrated for their transforming power according to the technique of counting processing foci. For this, 1 ml of diluted viral suspension was inoculated on cultures of fresh fibroblasts. The cultures are then covered with agar in order to allow the development of processing centers. The titer of the virus is given by the number of foci of transformation per dish multiplied by the dilution of the suspension of inoculated virus. The titer is expressed in FFU (Focus Forming Unit) per ml.
  • the AEVdelta virus (28) recovered from the transfected cells had a titer of 5.10 4 FFU / ml, higher than that of the AEVdelta virus (17) (2.10 4 FFU / ml).
  • the wild-type AEVwt virus produced under similar conditions, generally has a titer close to 5.10 5 FFU / ml.
  • the viruses are maintained on cultures of chicken fibroblasts for variable durations.
  • the original stocks derived from the transfected cultures, were inoculated into cultures of fresh fibroblasts which then underwent two subcultures at the end of which the culture supernatants were collected to constitute the viral stocks II.
  • the viruses of stocks II were then propagated again on fresh fibroblasts during two subcultures, at the end of which the viral stock III was collected.
  • Chicken embryonic fibroblasts have been infected with the AEVwt, AEVdelta (17) and AEVdelta (28) viruses. When the cultures had a majority of transformed cells, the culture supernatants and the cells were recovered separately.
  • virions are collected by centrifugation.
  • the RNAs were extracted from virions and cells respectively.
  • the cellular RNAs were separated on oligodT cellulose into polyA and polyA- RNA.
  • the cellular polyA RNAs and the total RNAs of the virions were fractionated by electrophoresis on agarose and transferred to a nitrocellulose filter. Filters have were successively hybridized with different probes shown in FIG. 9. After exposure to autoradiography and revelation, the sizes of the bands observed were summarized in Table II.
  • the table gives the sizes of the bands identified by the different probes, in the fibroblasts infected with AEVwt, AEVdelta (17) and AEVdelta (28).
  • the values indicated by an asterisk (*) correspond to transcripts present both in cellular polyA RNA and in RNA of virions.
  • proviral DNA represents a perfect copy of the genomic RNA from which it is synthesized.
  • the analysis of the provirus must therefore provide information on the structure of the viral genome transferred into these cells.
  • This analysis applied to the AEVdelta (17) and AEVdelta (28) mutants should make it possible to verify whether these viruses are capable of transferring, into the DNA of the infected cells, the genes which have been grafted into their genome. It also makes it possible to know whether these genes are transmitted in full or whether structural changes have occurred during the different development cycles of viruses.
  • Cultures of chicken embryonic fibroblasts were infected separately with AEVwt, AEVdelta (17) and AEVdelta (28). After the appearance of the transformed phenotype, the cells are trypsinized and lysed to extract the total DNA therefrom. The DNA is purified and digested with the restriction enzymes EcoRI or BamHI. The digestion products were separated on agarose gel, denatured and then transferred to filters. The filters were successively hybridized with the erbB and deltaPst probes. The tapes were revealed after exposure in autoradiography from 5 to 10 days. The bands relating to the proviral genomes AEVdelta (17) and AEVdelta (28) are identified by comparison with the DNA diagrams from cells infected with AEVwt.
  • an AEV genome was therefore constructed by genetic recombination "in vitro" containing sequences of the human gene for globin delta. After transfection of the recombinant viral DNA into cultured chicken fibroblasts, infectious virions are obtained which contain a viral genome carrying the human delta sequences. After infection of fresh chicken fibroblasts with these virions, it is observed that the cells integrate into their genome new genetic information represented by the human gene for globin delta.
  • the AEVdelta virions (28) can encapsulate a genome of 7 kb while the genome of AEVwt represents only 5.4 kb. This experiment demonstrates that it is possible to transfer using this vector sequences of at least 1.6 kb. It is noted that in the AEVdelta (17) virions the 8 kb genomic RNA is not detectable. This lack of packaging can result either from an excessively large size of the viral genome, or from a modification of the secondary structure of the viral genome due to the presence of the delta gene.
  • the erbB protein produced by AEVdelta (28) does not contain the 12 C-terminal amino acids normally observed in the wild-type protein. If AEVdelta (28) is capable of transforming fibroblasts "in vitro", it must be concluded that these 12 C-terminal amino acids do not play an essential role in the transforming power of the erbB protein.
  • the delta gene is associated with its own sequences, in particular containing the transcription control signals. In both types of proviruses, no transcription initiation is observed at the level of the gene promoter. All the transcripts seem to be initiated at the level of the viral promoter located in the LTR on the left.
  • the globin delta gene is little expressed in human erythrocytic cells and one can imagine that its promoter is not very active. 2) Transcription from proviruses has been analyzed in fibroblasts in which the endogenous globin genes are not normally transcribed.
  • the clone pJS21 results from the cloning of an EcoRI-BamHI fragment (1.8 kb) which covers the 5 ′ viral region of pAEV11, between the EcoRI and BamHI sites of pBR322 (FIG. 12)
  • the recombinant pAG50 was constructed by COLBERE-GARAPIN et al. (nineteen eighty one). It contains a BglII-HincII fragment (1.1 kb) derived from the prnaryotic transposon Tn5 in which is found the structural gene for resistance to neomycin, Neo r , devoid of its own promoter (FIG. 13) (BECK et al., 1982 ).
  • Digestion of DNA by restriction enzymes is carried out as described above.
  • the digested DNAs are purified by extraction with phenol-chloroform and then with a chloroform / isoamyl alcohol mixture and then precipitated with ethanol.
  • the Bal31 nuclease gradually degrades linear double-stranded DNA from the 5 'and 3' ends of each strand. Given a defined amount of DNA, the rate of digestion can be controlled as a function of the concentration of Bal31, the reaction temperature and the incubation time. The specificity of Bal31 allows us to successively eliminate the nucleotide sequence within which the usable restriction sites are absent. 12 ⁇ g of perbl DNA linearized with BamHI are incubated at 30 ° C.
  • the mixture of DNA fragments of variable sizes is first redissolved in double-distilled water so as to obtain a concentration of 100 ⁇ g of DNA per ml.
  • the electrophoretic separation is then carried out at 30 volts overnight (16 hours) on a horizontal preparative agarose gel, the concentration of which varies from 0.8 to 1.6% depending on the sizes of the fragments to be separated.
  • Molecular weight markers in general either of the DNA of the bacteriophage lambda digested by the restriction endonuclease HindIII or of the DNA of the plasmid pBR322 digested by the restriction endonuclease AluI, are subjected to electrophoresis in parallel with the samples. Staining of the gel with ethidium bromide makes it possible to visualize the DNA bands under ultraviolet illumination. The region of the gel containing the band of DNA fragments of determined sizes is cut out.
  • DNAs are then elected by the "Freeze Squeeze” method. This operation leads to obtaining the DNAs ready to be subjected to ligation or digestion by restriction enzymes. 5) LIGATION OF DNA FRAGMENTS AND CLONING VECTORS
  • the ligation of the isolated DNA fragments and of the vector DNA is carried out according to the technique described above.
  • the plasmid DNAs are isolated on a cesium chloride gradient as described above.
  • these DNAs are subsequently purified on an NaCl cushion in order to remove the contaminating oligoribonucleotides (MANIATIS, 1982).
  • the ligation reaction medium is then incubated in the presence of the restriction e BglII.
  • the linearized DNAs are then subjected to two precipitations at -80 ° C. for 30 minutes in the presence of a mixture of ethanol and 1.5 M of ammonium acetate. These two precipitations allow DNA of high molecular weights (vectors) to be recovered by centrifugation, while the free and digested "linkers" remain in the supernatant.
  • the vectors thus modified are then religated and cloned in the C600 bacteria.
  • the introduction of a BglII site is identified by restriction mapping. 10) TRANSFECTION OF EUKARYOTIC CELLS 10.1) Culture of cells
  • the cells used for the transfection are the following: mouse L cells (continuous line), quail cells QT6 (continuous line), and fibroblasts from CEF chicken embryos.
  • mouse L cells continuous line
  • quail cells QT6 continuous line
  • fibroblasts from CEF chicken embryos.
  • Mouse and L cell cultures. chicken embryo fibroblasts are produced according to the techniques described above.
  • the quail QT6 cells are cultured at 37 ° C. in MEM medium (Gibco) containing 2.5 mg / ml TPB
  • These cells are cultured at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% CO 2 .
  • the principle of this method is based on the fact that the presence of polycations (polybrene) leads to the attachment of DNA on cell membranes.
  • polycations polybrene
  • the penetration of DNA into cells is facilitated by treatment of cells with DMSO (dimethyl sulfoxide) which increases the permeability of cell membranes (KAWAI et al. 1984).
  • mice L cells are seeded in a Petri dish whose diameter is 60 mm. After a 16 hour incubation, the cells are brought into contact with 4 ⁇ g of transforming DNA and incubated at 37 ° C. in the presence of a ml of fresh culture medium containing 25 ⁇ g of polybrene. After 6 hours, the cells are treated with 2 ml of fresh culture medium containing 25% DMSO at 37 ° C for 4 minutes.
  • EXAMPLE 8 LOCALIZATION OF THE 5 'REGION OF THE AEB-R erbB GENE
  • the two viral oncogenes v-erbA and v-erbB occupy most of the coding regions (FIG. 15).
  • a HincII-BamHI fragment (1.2 kb) contains the 3 'region of the erbA gene, a non-coding sequence inserted between the v-erbA gene and the v-erbB gene, and the 5' region of the v-erbB gene.
  • the HincII-BamHI fragment is first cloned into the vectors derived from the bacteriophage M13, mp8 and mp11 (FIG. 16). In single-stranded state, the "plus" strand of the studied fragment is present in the clone p42 derived from mp8, while the "minus" strand is found in the clone p314 derived from mp11.
  • the sequencing carried out on the clone p42 makes it possible to determine a part of the sequence of the 5 ′ region of the v-erbB gene from the BamHI site (FIG. 17).
  • the comparison of the sequence of the v-erbB gene of AEV and that of the v-erbB gene of the variant AEV-H provided by YAMAMOTO et al., 1983 reveals a homology of 276 nucleotides out of 279.
  • the Bal31 nuclease was used for the elimination of this region from the BamHI site.
  • the perbl clone containing the junction sequences between v-erbA and v-erbB (FIG. 11) is digested with the restriction enzyme BamHI then by the nuclease Bal31 which operates a progressive degradation of the 5 'region of the v-erbB gene to from the BamHI site.
  • the digestion is controlled in such a way that a nucleotide sequence of approximately 0.45 kb is eliminated upstream from the BamHI site.
  • the separation of the shortened viral fragments from the vector pBR322 is carried out by digestion with the restriction enzyme SalI, followed by electrophoresis on a preparative agarose gel.
  • Bal31 are first cloned between the SalI and Smal sites of mp11 ( Figure 11).
  • the termination codon "TAG" of the v-erbA gene is located 188 nucleotides upstream of the codon "ATG" of the v-erbB gene.
  • the non-coding sequence is characterized by a high frequency of doublets and triplets of nucleotides A and nucleotides T respectively.
  • Neo r gene derived from the bacterial transposon Tn5 has been inserted into the modified genome of the AEV.
  • the strategy adapted in this construction is shown diagrammatically in Figure 12.
  • the clone p15-16 is firstly digested with the restriction enzymes EcoRI and Sali.
  • a SalI-EcoRI fragment (0.75 kb), which covers the 5 ′ region of the v-erbA gene, the non-coding sequence containing the splice acceptor site, the first 13 nucleotides of the v-erbB gene and 11 nucleotides derived from the polylinker of mp11, is isolated by agarose gel electrophoresis.
  • plasmid pJS21 which provides the 3 'viral sequences.
  • the final plasmid containing a reconstituted viral genome lacking the v-erbB gene is called pXJ4.
  • the structure of the plasmid pXJ4 is confirmed by the results of digestion with SalI, Sac1, PstI, BamHI and SalI + EcoRI.
  • Obtaining the retroviral vector pXJ4 offers the possibility of inserting a selection gene at the location of the deleted v-erbB gene without increasing the total size of the vector relative to the wild type AEV.
  • the plasmid pAG50 contains the structural gene for resistance to the antibiotic neomycin (Neo r gene) limited by BglII sites (COLBERE-GARAPIN et al., 1981). Digestion of pAG50 with BglII makes it possible to isolate a 1.2 kb fragment containing the Neo r gene. To introduce this fragment into the plasmid pXJ4 at the location of the deleted v-erbB gene, a BglII restriction site had to be created in the plasmid pXJ4 at the EcoRI site located downstream of the splice acceptor site.
  • the plasmid pXJ4 was subjected to a partial digestion with EcoRI, the linearized molecules of 9.7 kb were then isolated, on a preparative agarose gel, resulting from a single cut by EcoRI. The ends of the isolated fragments were then repaired into straight ends and then linked to BglII "linkers".
  • the Neo r gene is inserted into the pXJ5 vector by the following operation:
  • the plasmid pXJ5 is first linearized at the BglII site and then linked with the BglII-BglII fragment containing the Neo gene isolated from pAG50.
  • Analysis of the recombinant clones shows that the pXJ1 clone has a single copy of the Neo r gene inserted in the same transcriptional orientation as that of the retroviral vector (FIG. 19).
  • the clone pXJ2 (FIG. 20) carries a single copy of the Neo r gene whose orientation is opposite to that of the vector.
  • the clone pXJ3 (FIG.
  • Neo r gene 21 has two copies of the Neo r gene associated in tandem, both oriented in the direction transcription of the viral genome.
  • the insertion sites, the number and the orientation of the Neo genes in the plasmids pXJ1, pXJ2 and pXJ3, were determined by digestion of the plasmids with each of the enzymes BglII, EcoRI, HincII and PstI.
  • the junction sequences between the Neo r gene and the retroviral vectors in the clones pXJ1 and pXJ3 are presented in FIG. 22.
  • Kan s type bacteria (sensitive to kanamycin) transformed by pXJ1, pXJ2 and pXJ3 are cultured at 37 ° C. for 16 hours in the presence of a nutritive liquid medium containing kanamycin, the concentration varies from 0 to 600 ⁇ g / ml of culture.
  • the bacteria transformed by the clone pXJ5 without the Neor gene are also tested as a control.
  • mice L cells are subjected to a transfection of 15 ⁇ g of DNA from each of the vectors pXJ1, pXJ2 or pXJ3.
  • the plasmid pAG50 in which the Neo r gene is under the command of the elements of transcription control of the tk gene of the Herpes simplex virus is chosen as a control (COLBERE-GARAPIN et al., 1981).
  • the cells are selected in a liquid medium in the presence of 800 ⁇ g of G418 per ml of culture.
  • the cells not having undergone transfection as well as the cells transfected with the plasmid pXJ2 all died.
  • cells transfected with pXJ1 and pXJ3 survive and begin to form colonies.
  • the numbers of resistant colonies are counted after 19 days of selection.
  • the transformation efficiency shown by the clone pXJ3 carrying two copies of the Neo r gene is lower than that of the clone pXJ1 comprising a single copy.
  • the pXJ1 clone containing a copy of the Neo r gene provides approximately twice as many resistant colonies as the pXJ3 clone.
  • the fibroblasts transformed by the vectors pXJ1 and pXJ3 have a morphology identical to that of normal cells.
  • mice L cells are transfected with 4 ⁇ g of each of the transforming DNAs pXJ1, pXJ2, pXJ3 and pAG50. 48 hours after transfection, the cells are cultured in a liquid medium containing 800 ⁇ g of G418 per ml of culture. After 12 days of selection, the normal non-transfected cells as well as the cells transfected with the plasmids pXJ2 and pAG50 are all dead. In contrast, the clones pXJ1 and pXJ3 induce the development of resistant colonies. The efficiency of the polybrene-DMSO transfection method appears to be much higher than that of the calcium phosphate method.
  • example 2 which contains, in addition to the sequences already described, around forty nucleotides belonging to the erbB oncogene which are located 5 ′ from the env gene.
  • the fragments obtained are repaired by DNA polymerase I.
  • the insert is released at the BamHI site by enzymatic digestion and purified by electroelution after separation on agarose gel.
  • the purified fragments are then cloned into the replicative form of phage M13 previously prepared. After ligation and transformation of a bacterial culture
  • the recombinant single-stranded phages are analyzed by hybridization with a clone containing the JS21 fragment integrated in reverse. The presumptive clones are then verified by sequencing. The clone mJS21 erb- retained begins in the env gene
  • EXAMPLE 16 RECONSTRUCTION OF THE VECTOR WITHOUT ONCOGENIC SEQUENCES
  • the assembly of the different clones obtained in Example 15 is carried out in the bacterial plasmid pBR328 (BOLIVAR et al., 1977). The latter can, in fact, insert large fragments and be selected for its resistance to ampicillin.
  • the first fragment introduced into the plasmid is that which contains the gag gene present on the clone mpllgag.
  • the pBRgag clone thus obtained is analyzed by restriction endonuclease mapping.
  • This EcoRI site must, in fact, in the final construction serve as a unique cloning site for the genes to be inserted into the retroviral vector.
  • T4 DNA polymerase is used in order to obtain blunt ends after digestion with the endonuclease Sac1.
  • the activity of this T4 DNA polymerase is not strictly controllable and given the fact that the two enzymatic sites used for this subcloning (Sacl and EcoRI) belong to the polylinker of phage M13 and are very close to one of the other, we risk losing the EcoRI site.
  • the BamHI site must be deleted. This is carried out by digestion with the endonuclease BamHI, then filling with DNA polymerase I and ligation. After analysis by mapping of the replicative forms of phage M13, the presumptive clones are analyzed by sequencing. The mp10 clone thus prepared is then cloned into the pBRgag. After transformation of a competent C600 R / S bacterial culture, the pBRgag-J recombinant clones are analyzed by mapping.
  • Cloning of the J fragment in pBRgag creates the unique Xbal site located 5 ′ of J which will be used for cloning the genes to be inserted into the vector.
  • 3) Cloning of the JS21 erb- fragment 3 ′ of J into the vector pBRgag-J (FIG. 28)
  • the vector pBRgag-J and the JS21 erb- fragment are separated as indicated in the figure.
  • the cloning of the JS21 erb- fragment in 3 'of J brings to the vector the sequence of the env gene as well as the LTR 3'. It also creates the unique EcoRI site which will be used for the subcloning of genes to be inserted into the vector.
  • the pBRgag-J env LTR clones thus obtained are analyzed by mapping.
  • the fragment pBRgag-J env LTR and pJS21 are prepared as indicated in the figure. This subcloning provides the vector with the 5 ′ LTR, the leader sequence, and makes it possible to reconstitute the gag gene as it exists in wild AEV.
  • the clone pBRgag-J-env 2LTR thus obtained is analyzed by mapping.
  • this step leads to the appearance of an additional EcoRI site located at the junction of the AEV and pBR322 sequences. This will have to be eliminated later by partial digestion in order to have only one EcoRI site located 3 ′ of fragment J and which will be used for cloning the genes to be inserted.
  • This pBRgag-J-env 2LTR clone contains between the 2 LTRs the AEV genome without oncogenic sequence, it also has a unique Xbal cloning site located 5 ′ of fragment J.
  • An Xbal restriction fragment of the Tn5 transposon including the Neo r gene is introduced into the Xbal site of pBRgagJ-env 2LTR, the resulting plasmid is pAEV TSN which induces resistance to G418 for transformed avian cells.
  • the Neo r gene of the bacterial transposon Tn5 was inserted in place of the v-erbB gene (examples 12 and following). Viruses produced could induce cell resistance infected with the drug G418 thus demonstrating the correct transcription and translation of the inserted gene.
  • This construction left several potential initiation codons for translation, in various reading frames, upstream of the coding sequence of the Neo r gene.
  • the sequence of the vector has been modified so as to leave only the initiating codons normally used for the translation of viral genes.
  • this sequence After splicing of the genomic RNA into subgenomic RNA, this sequence is ordered following the leader sequence of the subgenomic RNA which carries the translation initiator codon. This arrangement provides the coding frame indicated above
  • NdeI site overlying the ATG codon was created by the site directed mutagenesis method, according to ZOLLER et al. (1983), using a synthetic oligonucleotide of sequence:
  • Neo r gene carrying an NdeI restriction site at the level of the initiating codon The nucleotide sequence at the level of the 5 ′ region of the Neo r gene is as follows:
  • the plasmid pXJ10 containing the modified Neo gene was thus constructed in which an NdeI site appears at the level of the initiator codon.
  • the coding part of the gene can be isolated from this plasmid after digestion with NdeI and BglII. c) Construction of a retroviral vector carrying the modified Neo r gene
  • the coding part of the modified Neo gene was inserted into the plasmid pXJ11 at the NdeI site so that the Neo r sequence is in the direction of normal transcription of the viral genome. Plasmid pXJ12 was thus obtained.
  • the final structure of the plasmid and the viral genome was verified by restriction mapping, in particular to confirm the presence of the NdeI site and therefore the validity of the sequence bordering on the gene initiating codon. The structure of; this plasmid is given in FIG. 31.
  • This plasmid when transferred to bacteria, induces their resistance to kanamycin at a concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • This plasmid thus constitutes a sort of shuttle vector which can be selected both on bacteria in the form of plasmid and on avian cells in the form of provirus.
  • AEV-XJ1 RAV-1 or RAV-2
  • the AEV-XJ12 virus therefore constitutes a selectable viral vector.
  • the genes to be transferred can be inserted into the region still occupied by the v-erbA sequences.
  • e) Expression of the viral genes in chicken fibroblasts infected with the vectors AEV-XJ1 and AEV-XJ12 In order to verify whether the insertion of the Neo r gene into the viral genome does not alter the transcription mechanisms, the RNA produced in chicken fibroblasts infected with the vectors AEV-XJ1 (vector containing several ATGs) and AEV-XJ12. We find in these cells two types of RNA corresponding to genomic and sub-genomic RNA, which demonstrates that the maturation of RNA is correct.
  • a critical point of this test is the time of addition of the drug compared to the time of infection.
  • the addition of the drug should not be too late to avoid secondary infections which would lead to overestimating the titer of the virus, or too early to allow the expression of the Neo protein in quantity sufficient in infected cells to make them resistant.
  • Spafas is 200 ⁇ g / ml.
  • EXAMPLE 18 DEVELOPMENT OF AVIAN HELPER CELLS This example concerns cultures of avian helper cells in which the 3 gag, pol and env genes are expressed but cannot be packaged in the produced virions.
  • the set of gag-pol-env genes was isolated in a single DNA fragment from a plasmid containing the genome of the RAV-1 helper virus provided by J.M. BISHOP (UCSF). This fragment is limited in 5 'by a SacI site located 146 nucleotides upstream of the initiator codon of the gag gene, and in 3' by an AccI site located in 120 nucleotides downstream of the termination codon of the env gene. The sequences responsible for the packaging of avian viral genomes are not present in the fragment considered. This fragment was inserted into plasmids allowing the expression of genes in eukaryotic cells.
  • the gag-pol-env set was cloned between the promoter of the TK gene of the HSV1 virus and the polyadenylation signal of the same virus, both isolated from the plasmid pAG60 from COLBERE-GARAPIN et al. (nineteen eighty one).
  • the gag-pol-env genes were inserted between the promoter-enhancer of the SV40 virus early gene and a sequence containing the t gene intron and the SV40 virus polyadenylation signal, all isolated from the plasmid pSV2gpt MULLIGAN and BERG (1981). These plasmids were transfected into quail cells, QT6 line, and chicken fibroblasts. In order to select the transfected cells, the DNAs of these plasmids were cotransfected with the DNA of plasmids carrying a selection marker, either the plasmid pAG60 or the plasmid pXJ12.
  • the foci of resistant cells after selection by G418 were removed and cultured in isolation. Others have been grouped and cultivated as a mixture. The production of viral particles by these cells was tested by looking for the presence of reverse transcriptase in particulate form in the culture supernatants. This activity was compared with that of the supernatants of the chicken erythroleukemic cells 6C2 which are highly productive of the AEV virus. Out of 9 cultures of QT6 cells transfected with HP1 and HP2, 7 have significant reverse transcriptase activity, 5 of which show activity greater than that of 6C2 cells.
  • gag, pol and env genes are possible from a promoter other than that contained in the viral LTRs,
  • extracellular virions can be produced from helper viral genomes lacking LTRs and encapsulation sequences.
  • the vectors according to the present invention make it possible to prepare cells resistant to G418 and have made it possible to clone and express human globin, in particular human delta globin, the experiments on the other globins having given equivalent results.
  • WIGLER M. SILVERSTEIN S., LEE L.S., PELLICER A., CHENG Y.C. & AXEL R. (1977). Transfer of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene to Cultures Cells. Cell 11: 223-232.
  • the erbB gene of Avian Erythroblastosis Virus is a Member of the src Gene Family. Cell 35: 71-78.
  • a new avian erythroblastosis virus AEV-H carries erb-B gene responsible for the induction of both erythroblastosis and sarcomas. Cell 34, 225-232.
  • BOLIVAR F. RODRIGUEZ R.L., GREEN P.J., BETLACH M.C., HEYNECKER H.L., BOYER H.W., CROSA J.H., FALKOW S. (1977). Construction and characterization of new cloning vehicles. A multiple purpose cloning System. Gene 2, 95-113.
  • pEMBL a new family of single stranded plasmids. Nucl. Acids Res. 11, 1645-1655.

Abstract

Virus for the cloning or expression of a foreign gene, characterized in that it is comprised by all or part of a genome of the fowl erythroblastosis virus and comprises at least one foreign gene situated between the two LTR sequences.

Description

VECTEURS DE CLONAGE OU D'EXPRESSION COMPORTANT LE GENOME DU VIRUS DE L'ERYTHROBLASTOSE AVIAIRE ET CELLULES TRANSFECTEES PAR CES VECTEURS. ------------------------------------------------------------------------------------------ CLONING OR EXPRESSION VECTORS COMPRISING THE GENOME OF AVIAN ERYTHROBLASTOSIS VIRUS AND CELLS TRANSFECTED BY THESE VECTORS. ---------------------------------------------------------- ----------------------------------------
L'introduction stable de matériel génétique dans des organismes implique, en général, que ce transfert soit effectué dans des cellules précurseurs dont les potentialités de multiplication et de différenciation sont élevées. Ces cellules précurseurs peuvent soit être représentatives d'une voie de différenciation bien particulière, comme par exemple les cellules souches hématopoiétiques, soit totipotentes comme les cellules germinales. Dans tous les cas, la population des cellules cibles du transfert est très minoritaire dans les tissus considérés.The stable introduction of genetic material into organisms generally implies that this transfer takes place in precursor cells whose potential for multiplication and differentiation is high. These precursor cells can either be representative of a very specific differentiation pathway, such as for example hematopoietic stem cells, or totipotent like germ cells. In all cases, the target cell population for transfer is very small in the tissues considered.
L'introduction stable de séquences génétiques dans ces cellules nécessite donc l'utilisation de techniques de transfert dont le rendement est élevé. Les méthodes classiques d'introduction de fragments d'ADN purifié dans des cellules en culture fournissent des taux d'incorporation faibles.The stable introduction of genetic sequences into these cells therefore requires the use of transfer techniques whose yield is high. Conventional methods of introducing purified DNA fragments into cultured cells provide low incorporation rates.
L'emploi de vecteurs composés comportant des génomes viraux a permis une nette amélioration de l'incorporation d'une séquence exogène dans une cellule en culture. La présente invention concerne de nouveaux vecteurs de ce type et en particulier des vecteurs de transfert de gènes dérivés de rétrovirus, notamment de rétrovirus de l'érythroblastose aviaire. Les rétrovirus doivent à leur structure particulière l'aptitude à s'intégrer facilement sous forme de provirus dans l'ADN génomique des cellules qu'ils infectent. Les éléments structuraux qui assurent cette intégration sont portés aux deux extrémités du provirus et sont appelés "Long Terminal Repeat" ou LTR.The use of compound vectors comprising viral genomes has enabled a marked improvement in the incorporation of an exogenous sequence into a cell in culture. The present invention relates to new vectors of this type and in particular to gene transfer vectors derived from retroviruses, in particular from avian erythroblastosis retroviruses. Retroviruses owe to their particular structure the ability to integrate easily in the form of proviruses into the genomic DNA of the cells they infect. The structural elements which ensure this integration are carried at the two ends of the provirus and are called "Long Terminal Repeat" or LTR.
Cette facilité d'insertion des rétrovirus au sein du génome des cellules qu'ils infectent a conduit à l'idée de leur utilisation comme vecteur potentiel pour le transfert de matériel génétique. Le génome du rétrovirus de l'érythroblastose aviaireThis ease of insertion of retroviruses into the genome of the cells they infect has led to the idea of using them as a potential vector for the transfer of genetic material. The genome of the avian erythroblastosis retrovirus
(AEV) renferme deux gènes onc appelés v-erbA et v-erbB et dont les expressions sont responsables du pouvoir oncogène de ce rétrovirus.(AEV) contains two onc genes called v-erbA and v-erbB and whose expressions are responsible for the oncogenic power of this retrovirus.
Dans un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, le pouvoir oncogène du virus de l'AEV a été utilisé comme marqueur de sélection et son aptitude d'insertion pour le transfert dans des cellules en culture d'un gène exogène inséré dans ce rétrovirus.In a first embodiment of the invention, the oncogenic power of the AEV virus was used as a selection marker and its ability to insert for the transfer into cultured cells of an exogenous gene inserted into this retrovirus.
Dans un second mode de mise en oeuvre de l'invention, le pouvoir oncogène du virus de l'AEV est supprimé et le gène marqueur est un gène étranger, par exemple de résistance à un antibiotique tel que le G418.In a second embodiment of the invention, the oncogenic power of the AEV virus is deleted and the marker gene is a foreign gene, for example of resistance to an antibiotic such as G418.
Une étude rapide des caractéristiques des rétrovirus permettra de mieux comprendre l'invention. Le génome d'un rétrovirus non défectif pour la réplication (figure 1) est formé d'une molécule d'ARN présentant dans le sens de la transcription (5'→3') une séquence courte identique à chacune des extrémités et appelée R (entre 21 et 80 bases). Elle est suivie, dans l'ordre, d'une séquence unique appelée U5 (de 70 à 80 bases), d'un site de fixation d'un ARNt (TBS, environ 20 bases), et d'une séquence non codante (séquence "leader"). La molécule d'ARN se poursuit par une région codant pour trois gènes dont les produits de traduction sont indispensables pour la réplication du virus et qui sont gag (protéines structurales des virions), pol (polymérase réverse), env (enveloppe). Le génome se termine, dans l'ordre, par une séquence non codante, une séquence riche en purines (PU), une séquence unique appelée U3 (de 200 à 450 bases), et enfin la séquence R. Les séquences extrêmes répétées (R) ou uniques (U5 et U3) particulières aux rétrovirus semblent assez bien conservées dans ce groupe de virus et renferment les signaux impliqués dans le contrôle de l'expression du génome viral.A rapid study of the characteristics of retroviruses will allow a better understanding of the invention. The genome of a non-replication-defective retrovirus (Figure 1) is made up of an RNA molecule with a short sequence in the direction of transcription (5 '→ 3') identical to each end and called R ( between 21 and 80 bases). It is followed, in order, by a unique sequence called U5 (from 70 to 80 bases), by a tRNA binding site (TBS, approximately 20 bases), and by a non-coding sequence ( "leader" sequence). The RNA molecule is continued by a region coding for three genes whose translation products are essential for the replication of the virus and which are gag (structural proteins of virions), pol (reverse polymerase), env (envelope). The genome ends, in order, with a non-coding sequence, a sequence rich in purines (PU), a unique sequence called U3 (from 200 to 450 bases), and finally the sequence R. The extreme repeated sequences (R ) or unique (U5 and U3) specific to retroviruses seem to be fairly well preserved in this group of viruses and contain the signals involved in controlling the expression of the viral genome.
Certains rétrovirus tels que l'AEV, responsables de transformations néoplasiques entraînant des leucémies ou des tumeurs, doivent leur pouvoir transformant à la présence de séquences particulières "onc" dans leur génome. Ces séquences onc ont une origine cellulaire et ont été intégrées dans le génome viral à la suite de recombinaisons avec le génome des cellules hôtes du virus. Dans la plupart de ces virus, cette intégration s'accompagne de la perte totale ou partielle des gènes gag, pol et env. Ces virus sont par conséquent défectifs pour la réplication. Pour se répliquer, ces virus nécessitent la présence dans la même cellule hôte d'un virus assistant fonctionnel. Les virus assistants (helper) sont capables de se répliquer. Leur génome ne renferme que les gènes fonctionnels gag, pol et env.Certain retroviruses such as AEV, responsible for neoplastic transformations resulting in leukemias or tumors, owe their transforming power to the presence of particular "onc" sequences in their genome. These onc sequences have a cellular origin and have been integrated into the viral genome following recombinations with the genome of the host cells of the virus. In most of these viruses, this integration is accompanied by the total or partial loss of the gag, pol and env genes. These viruses are therefore defective for replication. To replicate, these viruses require the presence in the same host cell of a functional helper virus. Helper viruses are able to replicate. Their genome contains only the functional genes gag, pol and env.
Le cycle d'infection par un rétrovirus débute par l'adsorption des virions à la surface des cellules, suivie de la pénétration dans le cytoplasme. Les étapes représentant la réplication et le cycle viral d'un rétrovirus sont résumées dans la figure 1. Dans le cytoplasme de la cellule, l'ARN viral simple brin (a) est transcrit par la polymérase réverse, présente dans le virion, en une copie linéaire d'ADN double brin (b). La copie d'ADN résultant de cette transcription réverse est légèrement plus longue que la molécule d'ARN viral qui lui a servi de matrice. Cette différence est le résultat de l'addition d'une séquence U3 à l'extrémité 5' et d'une séquence U5 à l'extrémité 3'.The retrovirus infection cycle begins with the adsorption of virions on the cell surface, followed by penetration into the cytoplasm. The steps representing the replication and the viral cycle of a retrovirus are summarized in FIG. 1. In the cytoplasm of the cell, the single-stranded viral RNA (a) is transcribed by the reverse polymerase, present in the virion, into a linear copy of double stranded DNA (b). The DNA copy resulting from this reverse transcription is slightly longer than the viral RNA molecule which served as its template. This difference is the result of the addition of a U3 sequence at the 5 'end and a U5 sequence at the 3' end.
La combinaison dans l'ordre des séquences U3-R-U5 constitue une séquence répétée aux deux extrémités de la molécule d'ADN appelée LTR (Long Terminal Repeat). Les copies d'ADN viral renfermant une ou deux séquences LTR sont acheminées jusqu'au noyau où elles sont converties en molécules de formes circulaires (c). Certaines molécules circulaires ne présentent plus qu'une seule LTR. Ces molécules sont ensuite intégrées dans l'ADN génomique cellulaire (d). L'ADN viral est intégré dans l'ADN cellulaire de telle sorte qu'il se trouve encadré par une LTR à chaque extrémité et porte alors le nom d'ADN proviral ou provirus. Par la suite, nous appellerons "LTR gauche"d'un provirus la LTR située en amont du gène gag et "LTR droite" la LTR située en aval du gène env.The combination in sequence of the U3-R-U5 sequences constitutes a sequence repeated at the two ends of the DNA molecule called LTR (Long Terminal Repeat). Copies of viral DNA containing one or two LTR sequences are sent to the nucleus where they are converted into molecules of circular shapes (c). Some circular molecules have only one LTR. These molecules are then integrated into cellular genomic DNA (d). The viral DNA is integrated into the cellular DNA so that it is surrounded by an LTR at each end and then bears the name of proviral DNA or provirus. Thereafter, we will call "left LTR" of a provirus the LTR located upstream of the gag gene and "right LTR" the LTR located downstream of the env gene.
C'est le provirus qui sert de matrice pour la transcription de molécules d'ARN virales. La transcription est initiée au niveau de la séquence R de la LTR de gauche et s'arrête au-delà du signal de polyadénylation porté par la séquence U3 ou R de la LTR de droite. Les ARN obtenus après transcription du provirus sont à l'image des ARNm des cellules eucaryotiques, "capes" par un résidu 7mG terminal à l'extrémité 5', et pourvus d'une séquence polyadénylée à leur extrémité 3' terminale.It is the provirus which serves as a template for the transcription of viral RNA molecules. Transcription is initiated at the R sequence of the left LTR and stops beyond the carried polyadenylation signal by the U3 or R sequence of the right LTR. The RNAs obtained after transcription of the provirus are like the mRNAs of eukaryotic cells, "wrapped" by a 7mG residue terminal at the 5 'end, and provided with a polyadenylated sequence at their 3' terminal end.
Les molécules d'ARN s'associent en dimères par des liaisons hydrogènes à leur extrémité 5' et sont encapsidées dans l'enveloppe protéique virale. Les particules virales forment un ensemble qui sédimente à 7OS. Elles sont rejetées à l'extérieur de la cellule productrice et vont infecter les cellules voisines. Cette libération de particules virales ne s'accompagne pas de la mort de la cellule.The RNA molecules associate in dimers via hydrogen bonds at their 5 ′ end and are encapsidated in the viral protein envelope. The viral particles form a whole which sediments at 7OS. They are rejected outside the producer cell and will infect neighboring cells. This release of viral particles is not accompanied by cell death.
L'utilisation du rétrovirus AEV comme vecteur de clonage ou d'expression d'un gène étranger (ci-après AEV vecteur) peut revêtir différentes formes compte tenu de son processus de développement.The use of the AEV retrovirus as a vector for cloning or for expression of a foreign gene (hereinafter AEV vector) can take various forms, taking into account its development process.
La description ci-après se réfère plus particulière ment au virus AEV, mais l'invention concerne de façon général les rétrovirus, et plus particulièrement les rétrovirus aviaires. Parmi les rétrovirus, l'invention est plus particulièrement intéressante pour les rétrovirus dans lesquels deux gènes peuvent être exprimés simultanément à partir du même promoteur, en particulier du promoteur contenu dans les LTR et qui dépendent de deux ARN génomique et sousgénomique.The description below refers more particularly to the AEV virus, but the invention relates generally to retroviruses, and more particularly to avian retroviruses. Among the retroviruses, the invention is more particularly advantageous for retroviruses in which two genes can be expressed simultaneously from the same promoter, in particular the promoter contained in the LTRs and which depend on two genomic and subgenomic RNAs.
Lorsque l'AEV vecteur est mis en oeuvre dans des conditions permettant sa réplication et la formation de virions, c'est-à-dire avec un virus assistant, l'infection de culture de cellules in vitro pourra être réalisée avec une efficacité considérable compte tenu de la multiplication des virions infectieux.When the vector AEV is used under conditions allowing its replication and the formation of virions, that is to say with an assistant virus, the infection of cell culture in vitro can be carried out with considerable efficiency. given the multiplication of infectious virions.
Mais, d'autre part, l'intégration sous forme de provirus permet d'envisager la modification permanente du génome d'un ensemble de cellules sans que le caractère infectieux persiste en l'absence de virus assistant.But, on the other hand, integration in the form of provirus makes it possible to envisage permanent modification of the genome of a set of cells without the infectious character persisting in the absence of assistant virus.
La présente invention concerne donc l'utilisation de rétrovirus aviaires, en particulier de l'AEV, à titre de vecteurs de clonage ou d'expression d'un gène étranger.The present invention therefore relates to the use of avian retroviruses, in particular AEV, as vectors for cloning or expression of a foreign gene.
Bien entendu, lorsque l'AEV est utilisé à titre de vecteur pour les besoins de la réalisation du vecteur ou pour des raisons pratiques d'utilisation, une partie du génome pourra avoir été délétée ou modifiée.Of course, when the AEV is used as a vector for the purposes of producing the vector or for practical reasons of use, part of the genome may have been deleted or modified.
Néanmoins, on continuera de parler d'AEV dans la mesure où le virus obtenu continuera de garder les caractéristiques essentielles du virus de l'AEV sauvage, c'est-à-dire l'existence de séquences LTR qui assurent son intégration.Nevertheless, we will continue to speak of AEV insofar as the virus obtained will continue to retain the essential characteristics of the wild AEV virus, that is to say the existence of LTR sequences which ensure its integration.
Les termes "vecteur de clonage ou d'expression" sont connus dans le domaine du génie génétique.The terms "cloning or expression vector" are known in the field of genetic engineering.
En outre, compte tenu du fait que l'AEV est un virus à ARN, la terminologie "virus" pourra parfois désigner le génome viral sous forme d'ADN, de même que dans certains cas le "gène" étranger pourra être sous forme d'ARN, en particulier lorsqu'il est inséré dans le génome d'un virion.In addition, given the fact that AEV is an RNA virus, the terminology "virus" may sometimes refer to the viral genome in the form of DNA, just as in certain cases the foreign "gene" may be in the form of 'RNA, especially when inserted into the genome of a virion.
Les techniques permettant de passer d'une forme ADN à la forme ARN et réciproquement sont connues et sont la transcription et la transcription réverse.The techniques for passing from a DNA form to the RNA form and vice versa are known and are transcription and reverse transcription.
Par "gène étranger" on entend désigner un gène qui ne se trouve pas dans le génome de l'AEV naturel et de préférence qui ne se trouve pas dans le génome d'un virus.The term “foreign gene” is intended to denote a gene which is not found in the genome of the natural AEV and preferably which is not found in the genome of a virus.
Le virus recombinant peut être utilisé tel quel sous forme de virion à ARN, mais le génome viral sous forme d'ADN comportant l'insertion d'un gène étranger. lui aussi sous forme d'ADN et correspondant à la transcription reverse de l'ARN du virus, peut être intégré dans un vecteur à ADN tel qu'un plasmide, un cosmide ou un phage par exemple. La caractéristique essentielle de ces vecteurs est que le gène étranger est inséré entre les deux séquences LTR du rétrovirus, en particulier de l'AEV.The recombinant virus can be used as such in the form of an RNA virion, but the viral genome in the form of DNA comprising the insertion of a foreign gene. also in the form of DNA and corresponding to the reverse transcription of the RNA of the virus, can be integrated into a DNA vector such as a plasmid, a cosmid or a phage for example. The essential characteristic of these vectors is that the foreign gene is inserted between the two LTR sequences of the retrovirus, in particular of the AEV.
Les rétrovirus en cause sont, le plus souvent, défectifs, c'est pourquoi lorsque le vecteur en cause doit être répliqué, il sera utilisé en présence d'un virus assistant fonctionnel qui renfermera au moins les gènes fonctionnels manquant pour la réplication de l'AEV, c'està-dire en général les gènes gag, pol et env.The retroviruses in question are, most often, defective, this is why when the vector in question must be replicated, it will be used in the presence of a functional assistant virus which will contain at least the functional genes missing for the replication of the AEV, that is to say in general the genes gag, pol and env.
De façon générale, le ou les gènes étrangers doivent donc être insérés de manière à préserver l'initiation et l'arrêt de la transcription, le site d'addition de polyA dans la LTR et les signaux d'épissage.In general, the foreign gene or genes must therefore be inserted so as to preserve the initiation and the stop of transcription, the site of polyA addition in the LTR and the splicing signals.
Comme cela a été dit précédemment, ce type de vecteur pourra être utilisé sous deux formes essentielles suivant la nature du gène marqueur utilisé. En effet, le gène marqueur peut mettre à profit les propriétés oncogènes de l'AEV, on aura alors des vecteurs oncogènes plus particulièrement utilisables pour les cultures cellulaires, ou bien l'activité oncogène aura été supprimée et remplacée par un gène marqueur de résistance à une drogue analogue à un. antibiotique tel que le G418, on aura alors un vecteur non oncogène utilisable par exemple pour certains transferts de gènes "in vivo". Les vecteurs oncogènesAs mentioned above, this type of vector can be used in two essential forms depending on the nature of the marker gene used. Indeed, the marker gene can take advantage of the oncogenic properties of AEV, there will then be oncogenic vectors more particularly usable for cell cultures, or else the oncogenic activity will have been deleted and replaced by a marker gene for resistance to a drug analogous to a. antibiotic such as G418, we will then have a non-oncogenic vector usable for example for certain gene transfers "in vivo". Oncogenic vectors
Le génome de l'AEV, schématisé à la figure 2, b, est constitué d'une séquence "leader" située immédiatement en aval de la région U5. Cette séquence est suivie d'un gène gag tronqué dans sa moitié 3'. Le gène pol est absent. Les gènes onc v-erbA et v-erbB couvrent environ 3 kb. Ces deux gènes sont séparés par une séquence de jonction renfermant un site accepteur d'épissage.The AEV genome, shown schematically in Figure 2, b, consists of a "leader" sequence located immediately downstream of the U5 region. This sequence is followed by a gag gene truncated in its 3 'half. The pol gene is absent. The onc v-erbA and v-erbB genes cover approximately 3 kb. These two genes are separated by a junction sequence containing a splice acceptor site.
Le génome de l'AEV est donc totalement dépourvu du gène pol et partiellement des gènes env et gag. La réplication du virus nécessite de ce fait l'infection simultanée par un virus assistant. Dans ce travail le virus assistant est RAV-2 dont le génome est représenté sur la figure 3. Par recombinaison génétique "in vitro" il a été possible de créer des délétions respectivement dans les gènes v-erbA et v-erbB. De l'analyse du pouvoir transformant des virus mutants ainsi créés il ressort que :The AEV genome is therefore completely devoid of the pol gene and partially of the env and gag genes. Replication of the virus therefore requires simultaneous infection with a helper virus. In this work, the assistant virus is RAV-2, the genome of which is represented in FIG. 3. By genetic recombination "in vitro" it was possible to create deletions in the genes v-erbA and v-erbB respectively. Analysis of the transforming power of mutant viruses thus created shows that:
. le gène v-erbB assure à lui seul la transformation des fibroblastes "in vitro" et l'induction de sarcomes "in vivo" ;. the v-erbB gene alone ensures the transformation of fibroblasts "in vitro" and the induction of sarcomas "in vivo";
. le gène v-erbA seul semble incapable d'induire aucune transformation "in vitro", les résultats des analyses "in vivo" concernant le gène v-erbA restent ambigus ;. the v-erbA gene alone seems incapable of inducing any transformation "in vitro", the results of the "in vivo" analyzes concerning the v-erbA gene remain ambiguous;
. la délétion du gène v-erbA seul entraîne une réduction du pouvoir transformant sur les précurseurs érythrocytiques "in vitro".. the deletion of the v-erbA gene alone results in a reduction of the transforming power on erythrocytic precursors "in vitro".
Ce pouvoir oncogène de l'AEV, localisé essentiellement sur erbB, peut être utilisé comme un moyen de contrôle de la transformation de cellules exposées à ce virus. De ce point de vue, le caractère transformant des rétrovirus en général et de l'AEV en particulier est à rapprocher de celui résultant des gènes codant pour l'expression de marqueurs dominants (gène xgprt ou gène Neor ) qui sont mis en oeuvre dans le second mode de réalisation de l'invention L'avantage de cette transformation oncogène induite par un rétrovirus est qu'elle entraîne des changements physiologiques qui confèrent aux cellules transformées un pouvoir multiplicatif accru. Notamment l'aptitude particulière des fibroblastes transformés à se développer dans l'agar mou offre une méthode de sélection des cellules ayant incorporé et exprimant le génome viral. Dans le but de préserver la fonction du gène v-erbB indispensable au développement du pouvoir oncogène, les gènes étrangers sont insérés soit dans le gène v-erbA soit en aval du gène v-erbB et avant la séquence LTR droite.This oncogenic power of AEV, located mainly on erbB, can be used as a means of controlling the transformation of cells exposed to this virus. From this point of view, the transforming character of retroviruses in general and of AEV in particular is to be compared to that resulting from genes coding for the expression of dominant markers (xgprt gene or Neo r gene) which are used in The second embodiment of the invention The advantage of this oncogenic transformation induced by a retrovirus is that it brings about physiological changes which give the transformed cells a increased multiplicative power. In particular, the particular ability of transformed fibroblasts to develop in soft agar offers a method of selecting cells that have incorporated and expressed the viral genome. In order to preserve the function of the v-erbB gene essential for the development of oncogenic power, foreign genes are inserted either in the v-erbA gene or downstream of the v-erbB gene and before the right LTR sequence.
Le choix de ces sites d'insertion doit tenir compte, en plus de la préservation du gène v-erbB, de celle d'autres zones "sensibles" du virus (initiation et arrêt de la transcription, site d'addition de polyA dans la LTR, signaux d'épissage).The choice of these insertion sites must take into account, in addition to the preservation of the v-erbB gene, that of other "sensitive" areas of the virus (initiation and stopping of transcription, site of polyA addition in the LTR, splicing signals).
Les expériences réalisées ont montré que le gène étranger pouvait être orienté dans l'un ou l'autre sens par rapport au sens de lecture du génome viral. L'insertion du gène étranger dans le site EcoRI(2) de l'AEV a conduit à deux vecteurs actifs, AEVdelta(28) et AEVdelta (17), incorporant le gène de la globine delta humaine,qui peuvent être utilisés en remplaçant le gène de la globine par un autre gène.The experiments carried out showed that the foreign gene could be oriented in one or the other direction relative to the direction of reading of the viral genome. The insertion of the foreign gene into the EcoRI site (2) of AEV has led to two active vectors, AEVdelta (28) and AEVdelta (17), incorporating the gene for human globin delta, which can be used by replacing the globin gene by another gene.
Dans les expériences réalisées, les éléments d'expression du gène étranger n'ont pas été étudiés systématiquement, mais il est clair que le gène étranger peut être précédé d'éléments d'expression qui lui seront propres, indépendamment des éléments d'expression existant déjà dans le virus.In the experiments carried out, the elements of expression of the foreign gene were not studied systematically, but it is clear that the foreign gene can be preceded by expression elements which will be specific to it, independently of the elements of expression existing. already in the virus.
Pour des raisons de commodité, les constructions ont été réalisées tout d'abord sur des plasmides qui comportent une séquence composite d'ADN correspondant au transcrit réverse d'un virus tel que décrit précédemment.For reasons of convenience, the constructions were firstly carried out on plasmids which comprise a composite DNA sequence corresponding to the reverse transcript of a virus as described above.
Bien entendu, ce plasmide peut comporter une partie de plasmide bactérien avec, par exemple, une origine de réplication dans les procaryotes et par exemple un caractère de résistance à un antibiotique, comme cela est connu, mais il peut s'agir également d'un phage ou d'un cosmide.Of course, this plasmid can comprise a part of bacterial plasmid with, for example, an origin of replication in prokaryotes and for example a resistance to an antibiotic, as is known, but it can also be a phage or a cosmid.
Des fibroblastes de poulet en culture transfectés par les virus recombinants sous forme de clones d'ADN ont donné lieu à une production de particules virales infectieuses avec des titres très élevés.Chicken fibroblasts in culture transfected with the recombinant viruses in the form of DNA clones gave rise to production of infectious viral particles with very high titers.
Les analyses des ADN des provirus et des ARN issus des particules virales ont montré que les virus recombinants conservent et transmettent le fragment d'ADN du gène humain de globine delta. Choix de gène humain de globine deltaAnalyzes of provirus DNA and RNA from viral particles have shown that recombinant viruses store and transmit the DNA fragment of the human globin delta gene. Choice of human globin delta gene
A titre d'exemple de gène étranger, on a utilisé les gènes de globine, en particulier de la globine delta humaine, car on peut imaginer qu'il pourra aisément être mis en évidence après son incorporation dans le génome de cellules de poulet. Le choix particulier du gène de globine delta repose sur divers critères :As an example of a foreign gene, the globin genes, in particular human delta globin, have been used, because it can be imagined that it can easily be detected after its incorporation into the genome of chicken cells. The particular choice of the globin delta gene is based on various criteria:
. la cartographie et la séquence ont été établies et un clone deltaPst (figure 7) existe ;. the mapping and the sequence have been established and a deltaPst clone (FIG. 7) exists;
. la taille du fragment deltaPst n'excède pas 2,3 kb, un fragment de taille beaucoup plus grande entraînerait une augmentation de la taille du génome viral qui pourrait inhiber son encapsidation dans les particules virales ;. the size of the deltaPst fragment does not exceed 2.3 kb, a fragment of much larger size would cause an increase in the size of the viral genome which could inhibit its encapsidation in the viral particles;
. cette séquence présente enfin une cartographie de restriction qui facilite son insertion dans le génome de l'AEV.. this sequence finally presents a restriction map which facilitates its insertion into the AEV genome.
Les vecteurs non oncogènes Dans ce second type de vecteur, le gène v-erbB ne s'exprime plus, de préférence parce qu'il a été au moins partiellement délété. Ainsi, dans les vecteurs qui seront étudiés en détail, les 1,6 kb de séquences nucléotides d'origine du gène erbB sont éliminés et remplacés par le gène structural Néor du transposon procaryotique Tn5. Il en résulte trois ADN recombinants pXJ1, pXJ2 et pXJ3.Non-oncogenic vectors In this second type of vector, the v-erbB gene is no longer expressed, preferably because it has been at least partially deleted. Thus, in the vectors which will be studied in detail, the 1.6 kb of nucleotide sequences of origin of the erbB gene are eliminated and replaced by the Neo r structural gene of the Tn5 prokaryotic transposon. The result is three recombinant DNAs pXJ1, pXJ2 and pXJ3.
Bien entendu, l'utilisation du gène structural Neor n'est décrite qu'à titre d'exemple, il est bien entendu possible d'utiliser d'autres gènes de résistance comme gène marqueur.Of course, the use of the Neo r structural gene is only described by way of example, it is of course possible to use other resistance genes as a marker gene.
Le clone pXJ1 comporte une seule copie du gène Neo s Orientant dans le même sens transcriptionnel que celui de l'AEV. Les séquences hétérologues introduites sont longues de 1,2 kb. Elles se composent d'une séquence issue de "polylinker" de clonage du phage mp11, des nucléotides dérivés d'un "linker" BglII, d'un fragment BglII-HincII du transposon bactérien Tn5 dans lequel se situe le gène Neor, et d'une courte séquence du gène tk de HSV portant notamment le site d'addition de séquences polyA.The pXJ1 clone contains a single copy of the Neo s Orienting gene in the same transcriptional direction as that of the AEV. The heterologous sequences introduced are 1.2 kb long. They consist of a sequence derived from a phage mp11 cloning "polylinker", nucleotides derived from a BglII "linker", from a BglII-HincII fragment from the bacterial transposon Tn5 in which the Neo r gene is located, and of a short sequence of the HSV tk gene carrying in particular the site of addition of polyA sequences.
Dans le clone pXJ3, deux copies du gène Neo sont introduites à l'emplacement du gène erbB délété. Ces deux gènes identiques se disposent en tandem dans la même orientation transcriptionnelle que celle du gène erbB délété. Dans ce recombinant, les séquences hétérologues introduites sont de 2,4 kb. Les jonctions entre les séquences hétérologues et le vecteur rétroviral sont les mêmes que dans le cas de pXJ1.In the clone pXJ3, two copies of the Neo gene are introduced at the location of the deleted erbB gene. These two identical genes are arranged in tandem in the same transcriptional orientation as that of the deleted erbB gene. In this recombinant, the heterologous sequences introduced are 2.4 kb. The junctions between the heterologous sequences and the retroviral vector are the same as in the case of pXJ1.
En somme, la seule différence entre l'AEV sauvage et les vecteurs rétroviraux construits est que l'oncogène viral v-erbB est remplacé par le gène procaryotique Neo .In short, the only difference between wild-type AEV and the constructed retroviral vectors is that the viral oncogene v-erbB is replaced by the prokaryotic gene Neo.
Lorsque les bactéries sont transformées par les vecteurs portant le gène Neo (pXJ1 , pXJ2 et pXJ3 ) , elles acquièrent une résistance à la kanamycine. Lorsque la concentration de kanamycine dépasseWhen bacteria are transformed by vectors carrying the Neo gene (pXJ1, pXJ2 and pXJ3), they acquire resistance to kanamycin. When the concentration of kanamycin exceeds
50 μg/ml de culture, les cellules bactériennes transformées par pXJ1 et pXJ3 montrent une croissance 10 fois plus élevée que celle des cellules transformées par pXJ2. Le clone pXJ5 dépourvu de gène Neor n'induit aucune résistance à la kanamycine des bactéries transformées.50 μg / ml of culture, the bacterial cells transformed by pXJ1 and pXJ3 show a growth 10 times higher than that of the cells transformed by pXJ2. The pXJ5 clone lacking the Neo r gene does not induce any resistance to kanamycin in the transformed bacteria.
Ainsi, il est possible que la LTR de l'AEV contienne des séquences jouant un rôle de promoteur procaryotique. Cependant, on ne peut exclure la possibilité que le gène Neor est activé par des promoteurs potentiels présents dans les séquences conservées de pBR322.Thus, it is possible that the LTR of the AEV contains sequences playing a role of prokaryotic promoter. However, the possibility cannot be excluded that the Neo r gene is activated by potential promoters present in the conserved sequences of pBR322.
Ces vecteurs ont été introduits dans les cellules L de souris et dans les cellules QT6 de caille par transfection. Seuls les vecteurs pXJ1 et pXJ3 induisent la résistance des cellules transfectées à des doses de G418 supérieures à 300 μg/ml. Ces résultats démontrent que la transcription du gène Neor est initiée au niveau du promoteur porté par la LTR gauche. Le vecteur portant deux gènes Neor en tandem induit la résistance des cellules transfectées avec une fréquence beaucoup plus faible que le vecteur pXJ1. Cette propriété pourrait provenir soit de la taille supérieure du vecteur pXJ3 qui réduirait sa capacité d'intégration dans le génome cellulaire, soit de l'existence de recombinaisons entre les deux séquences Neo répétées conduisant à des délétions plus ou moins étendues de ces séquences. L'interaction entre la terminaison de la traduction du premier gène et l'initiation de celle du deuxième pourrait également exercer un effet sur l'expression de ces deux gènes.These vectors were introduced into mouse L cells and into quail QT6 cells by transfection. Only the vectors pXJ1 and pXJ3 induce the resistance of the transfected cells to doses of G418 greater than 300 μg / ml. These results demonstrate that the transcription of the Neo r gene is initiated at the level of the promoter carried by the left LTR. The vector carrying two Neo r genes in tandem induces the resistance of the transfected cells with a much lower frequency than the vector pXJ1. This property could come either from the larger size of the vector pXJ3 which would reduce its capacity for integration into the cell genome, or from the existence of recombinations between the two repeated Neo sequences leading to more or less extensive deletions of these sequences. The interaction between the termination of the translation of the first gene and the initiation of that of the second could also have an effect on the expression of these two genes.
Il est évident que le gène Neor, outre son utilisation à titre de marqueur, doit être considéré comme un exemple de l'expression d'un gène étranger dans un vecteur selon l'invention. Toutefois, dans ce type de vecteur, le gène Neor sera utilisé comme marqueur et un autre gène étranger sera incorporé dans le vecteur. D'autres vecteurs non oncogènes proviennent de l'AEV dans lequel les deux oncogènes v-erbA et v-erbB sont inactivés par délétion partielle ou totale.It is obvious that the Neo r gene, in addition to its use as a marker, must be considered as an example of the expression of a foreign gene in a vector according to the invention. However, in this type of vector, the Neo r gene will be used as a marker and another foreign gene will be incorporated into the vector. Other non-oncogenic vectors originate from AEV in which the two oncogenes v-erbA and v-erbB are inactivated by partial or total deletion.
Dans ce cas, il est possible d'insérer deux gènes étrangers qui pourront être exprimés simultanément, en particulier si l'un de ces gènes est situé entre les séquences d'épissage et si l'autre gène est situé à l'extérieur des zones d'épissage en aval de celles-ci. Ces deux gènes seront alors traduits à partir de l'ARN génomique pour l'un et à partir de l'ARN sous-génomique pour l'autre.In this case, it is possible to insert two foreign genes which can be expressed simultaneously, in particular if one of these genes is located between the splicing sequences and if the other gene is located outside the zones splicing downstream of these. These two genes will then be translated from genomic RNA for one and from subgenomic RNA for the other.
Les expériences ont mis en évidence le fait qu'il était possible de faire varier la quantité d'ARN génomique par rapport à la quantité d'ARN sous-génomique. Ainsi, l'insertion du gène Neor a été effectuée d'abord dans une séquence laissant subsister plusieurs codons d'initiation dans des phases de lecture différentes, ensuite dans une construction ne comportant plus que des codons d'initiation dans une même phase de lecture. Il s'avère que cette dernière construction influence le rapport de production ARN génomique/ARN sous-génomique dans un sens favorable à la production d'ARN génomique, c'est-à-dire à l'expression du gène porté par le site placé en 5'. L'utilisation de ce vecteur a comporté la mise au point d'une méthode de titrage spécifique pour les virus aviaires portant le gène Neo.The experiments demonstrated that it was possible to vary the amount of genomic RNA relative to the amount of subgenomic RNA. Thus, the insertion of the Neo r gene was carried out first in a sequence leaving several initiation codons remaining in different reading phases, then in a construction comprising only initiation codons in the same phase of reading. It turns out that this latter construction influences the production ratio of genomic RNA / subgenomic RNA in a direction favorable to the production of genomic RNA, that is to say to the expression of the gene carried by the site placed in 5 '. The use of this vector has involved the development of a specific titration method for avian viruses carrying the Neo gene.
Les vecteurs particulièrement intéressants selon l'invention sont ceux dans lesquels on a inséré un site de restriction unique entre les deux sites accepteurs et donneurs d'épissage et un site de restriction unique en aval de ces sites d'épissage ; dans ces conditions, il est possible d'insérer dans ces sites des gènes étrangers qui correspondront à un ARN génomique et un ARN sousgénomique lors de la transcription. De préférence, ces sites seront placés pour que les gènes insérés puissent être en phase dans le cadre de lecture, on dit que les gènes sont synchronisés.The particularly advantageous vectors according to the invention are those in which a unique restriction site has been inserted between the two acceptor and splice donor sites and a unique restriction site downstream of these splice sites; under these conditions, it is possible to insert into these sites foreign genes which will correspond to a genomic RNA and a subgenomic RNA during transcription. Preferably, these sites will be placed so that the inserted genes can be in phase in the reading frame, it is said that the genes are synchronized.
Ces gènes seront de préférence placés pour être sous la dépendance du promoteur du LTR 5'.These genes will preferably be placed to be dependent on the promoter of the LTR 5 ′.
L'un des gènes en cause pourra, par exemple, être un gène de sélection tel que Neo ou autre.One of the genes in question could, for example, be a selection gene such as Neo or the like.
Comme cela ressort de la description précédente, les gènes étrangers insérés dans les vecteurs selon l'invention ont été exprimés souvent grâce à des éléments d'expression se trouvant dans le génome du virus, il est bien entendu possible d'insérer en amont du gène étranger des éléments d'expression spécifiques qui assurent une expression accrue de la protéine étrangère ; ces éléments d'expression pourront être, par exemple, des promoteurs de virus, en particulier de virus aviaires.As appears from the preceding description, the foreign genes inserted into the vectors according to the invention have often been expressed by means of expression elements found in the genome of the virus, it is of course possible to insert upstream of the gene foreign specific expression elements which provide increased expression of the foreign protein; these expression elements may be, for example, promoters of viruses, in particular of avian viruses.
Bien entendu, lorsque le vecteur est un plasmide, un cosmide ou un phage, il comportera également les éléments nécessaires à la réplication de ces derniers dans les cellules procaryotes, de même que les éléments caractéristiques de ce type de vecteur comme les extrémités cos dans le cosmide.Of course, when the vector is a plasmid, a cosmid or a phage, it will also contain the elements necessary for the replication of the latter in prokaryotic cells, as well as the elements characteristic of this type of vector such as the cos ends in the cosmid.
La présente invention concerne, en outre, des cellules transfectées par les vecteurs selon l'invention, qu'ils soient sous forme de virus ou de plasmides. Il est évident que la transfection primaire sera en général effectuée avec des vecteurs de type plasmidique, c'est-à-dire que l'AEV sera sous forme de l'ADN de son génome ; mais, en présence de l'ADN du virus assistant, des cellules aviaires transfectées vont dans ce cas se transformer et libérer des virus recombinants qui vont pouvoir transfecter d'autres cellules. Ce processus permet d'avoir un rendement de transformation de cellules très élevé qui sera particulièrement précieux dans les cultures cellulaires "in vitro". Ce type de processus permet également de constituer des stocks de virus vecteurs utilisables par la suite à la place des vecteurs plasmidiques.The present invention further relates to cells transfected with the vectors according to the invention, whether in the form of viruses or of plasmids. It is obvious that the primary transfection will generally be carried out with plasmid type vectors, that is to say that the AEV will be in the form of the DNA of its genome; but, in the presence of the DNA of the helper virus, transfected avian cells will in this case transform and release recombinant viruses which will be able to transfect other cells. This process makes it possible to have a very high cell transformation yield which will be particularly valuable in "in vitro" cell cultures. This type of process also makes it possible to build up stocks of vector viruses which can subsequently be used in place of the plasmid vectors.
Dans le cas où les cellules sont transfectées par des vecteurs oncogènes, leur sélection est naturelle sans qu'il soit nécessaire d'ajouter un agent de sélection, par contre dans le second type de vecteur non oncogène qui comporte un gène codant pour la résistance à un antibiotique, la culture devra être effectuée en présence dudit antibiotique.In the case where the cells are transfected with oncogenic vectors, their selection is natural without the need to add a selection agent, on the other hand in the second type of non-oncogenic vector which contains a gene coding for resistance to an antibiotic, the culture should be carried out in the presence of said antibiotic.
Les cellules en cause peuvent être diverses mais sont, de préférence, des cellules aviaires, en particulier des cellules hématopolétiques, germinales ou de type fibroblastique.The cells in question can be diverse but are preferably avian cells, in particular hematopoletic, germinal or fibroblastic type cells.
Les cellules préférées pour la mise en oeuvre des vecteurs de l'invention sont les fibroblastes d'embryon de poulet.The preferred cells for the implementation of the vectors of the invention are the chicken embryo fibroblasts.
Enfin, l'invention concerne le procédé de préparation d'une protéine déterminée, procédé dans lequel on cultive des cellules modifiées par un vecteur AEV selon l'invention dans lequel le gène étranger code pour ladite protéine et en ce que l'on récupère la protéine de la culture cellulaire.Finally, the invention relates to the process for the preparation of a specific protein, a process in which cells modified with an AEV vector according to the invention are cultivated in which the foreign gene codes for said protein and in that the cell culture protein.
I1 faut remarquer que les cellules dans lesquelles le virus s'est intégré sous forme de provirus peuvent constituer des lignées cellulaires, il peut s'agir d'ailleurs de cellules aviaires ou non-aviaires.It should be noted that the cells in which the virus has integrated in the form of proviruses can constitute cell lines, it can also be avian or non-avian cells.
Lorsque l'infection est effectuée au niveau des cellules germinales, notamment au niveau de l'oeuf, on peut obtenir des animaux transformés.When the infection is carried out at the level of the germ cells, in particular at the level of the egg, one can obtain transformed animals.
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.The examples below will illustrate evidence of other features and advantages of the present invention.
Ces exemples sont décrits en référence aux dessins sur lesquels : la figure 1 est un schéma des divers stades de développement d'un rétrovirus, la figure 2 représente la structure du génome d'AEVwt et d'AEVPst124, la figure 3 représente le génome du virus assistant RAV2 sous forme d'ADN double brin, la figure 4 représente la formation "in vitro" de génomes viraux à ADN portant une LTR à chaque extrémité; l'ADN du clone pRAV2 est ouvert par Sali puis soumis à l'action de la ligase, sous des conditions qui favorisent la formation de concatémères entre les molécules ; dans le mélange ains réalisé quelques molécules se trouvent entourées par une LTR à chaque extrémité ; elles pourront s'intégrer dans l'ADN du génome de la cellule hôte et donner naissance à des virions, on n'a représenté ici que les arrangements en dimères;
Figure imgf000018_0001
: séquence virale de RAV2These examples are described with reference to the drawings in which: FIG. 1 is a diagram of the various stages of development of a retrovirus, FIG. 2 represents the structure of the genome of AEVwt and of AEVPst124, FIG. 3 represents the genome of RAV2 helper virus in the form of double-stranded DNA, FIG. 4 represents the "in vitro" formation of viral DNA genomes carrying an LTR at each end; the DNA of the clone pRAV2 is opened by SalI and then subjected to the action of the ligase, under conditions which favor the formation of concatemers between the molecules; in the mixture thus produced some molecules are surrounded by an LTR at each end; they will be able to integrate into the DNA of the genome of the host cell and give rise to virions, only the arrangements in dimers have been shown here;
Figure imgf000018_0001
: viral sequence of RAV2
---- : séquence du plasmide pBR322 le sens des flèches indique le sens de transcription, la figure 5 représente la construction d'un génome d'ADN d'AEV comportant des séquences LTR à chaque extrémité (pAEV2LTR), la figure 6 représente la carte du plasmide recombinant pBRdeltaPst et des divers fragments du gène humain de globine delta utilisés dans les expériences de construction de vecteurs de transfert. la figure 7 représente la construction de vecteurs recombinants du type pAEV2LTRdelta, la figure 8 représente la structure de AEVdelta(28), la figure 9 représente des fragments d'ADN clones utilisés comme sondes, la figure 10 représente les cartes théoriques de restriction des génomes proviraux de type sauvage (a), mutant AEVdelta (28) (b), mutant AEVdelta (17) (c) , la figure 11 représente le clonage des fragments Bal31 dans mpll, la figure 12 représente la construction du mutant de l'AEV pAEVΔerbB(pXJ4), la figure 13 représente l'introduction du gène Neo du transposon Tn5 dans le vecteur rétroviral pXJ5, la figure 14 représente les structures des clones pAEVΔerbB----: sequence of the plasmid pBR322 the direction of the arrows indicates the direction of transcription, FIG. 5 represents the construction of an AEV DNA genome comprising LTR sequences at each end (pAEV2LTR), FIG. 6 represents the map of the recombinant plasmid pBRdeltaPst and of the various fragments of the human delta globin gene used in the experiments for the construction of transfer vectors. FIG. 7 represents the construction of recombinant vectors of the pAEV2LTRdelta type, FIG. 8 represents the structure of AEVdelta (28), FIG. 9 represents cloned DNA fragments used as probes, FIG. 10 represents the theoretical genome restriction maps wild type provirals (a), AEVdelta mutant (28) (b), AEVdelta mutant (17) (c), Figure 11 shows the cloning of Bal31 fragments in mpll, Figure 12 shows the construction of the AEV mutant pAEVΔerbB (pXJ4), FIG. 13 represents the introduction of the Neo gene of the transposon Tn5 into the retroviral vector pXJ5, FIG. 14 represents the structures of the clones pAEVΔerbB
(pXJ4,pXJ5) et la construction de pXJ5, la figure 15 représente la structure du génome de l'AEV clone dans pBR313, la figure 16 représente le clonage du fragment HincII-BamHI (1,2 kb) contenant la jonction entre v-erbA et v-erbB dans les bactériophages mp8 et mp11 sous forme d'ADN bicaténaire,(pXJ4, pXJ5) and the construction of pXJ5, FIG. 15 represents the genome structure of the AEV cloned in pBR313, FIG. 16 represents the cloning of the HincII-BamHI fragment (1.2 kb) containing the junction between v- erbA and v-erbB in bacteriophages mp8 and mp11 in the form of double-stranded DNA,
(1,2 kb) dans les bactériophages mp8 et mp11 sous forme d'ADN bicaténaire, la figure 17 est une comparaison des séquences nucléotidiques entre le gène v-erbB de l'AEV et celui de l'AEV-H (YAMAMOTO et al., 1983), —- : nucléotides identiques, les nucléotides différents sont indiqués dans la séquence de l'AEV le site BamHI dans la région 5' de v-erbB est souligné, la figure 18 représente la séquence nucléotidique des fragments Bal31 sélectionnés, la séquence non codante intercalée entre le gène erbA et le gène erbB est numérotée ; les limites des séquences des gènes v-erbA et v-erbB et celle du vecteur de clonage mp11 sont indiquées par des lignes verticales ; les lignes horizontales représentent les séquences du gène v-erbB conservées après la digestion par Bal31 ; les sites de restriction dans les séquences de mp11 sont soulignés ; p15-16, p15-21, p15-25, p15-28 : noms des clones CAG : site accepteur d'épissage présumé; la figure 19 représente la structure du clone pXJ1 et la carte des sites de restriction; la figure 20 représente la carte des sites de restriction et la structure de pXJ2; la figure 21 représente la carte des sites de restriction et la structure de pXJ3; la figure 22 représente les séquences de jonctions entre le gène Neo et les vecteurs rétroviraux dans les clones pXJ1 et pXJ3. la figure 23 représente la préparation du clone mJS21 erb-; la figure 24 représente la préparation du clone mp11 -gag ; la figure 25 représente la préparation du clone mp10-J; la figure 26 représente la préparation du clone pBRgag-2,7γ; la figure 27 représente la préparation du clone pBRgag-J; la figure 28 représente la préparation du clone pBRgag-J-env LTR; la figure 29 représente la préparation du clone pBRgag-J-env 2LTF la figure 30 représente la préparation du clone pXJ11; la figure 31 schématise la structure de pXJ12.(1.2 kb) in bacteriophages mp8 and mp11 in the form of double-stranded DNA, FIG. 17 is a comparison of the nucleotide sequences between the v-erbB gene of AEV and that of AEV-H (YAMAMOTO et al. ., 1983), —-: identical nucleotides, the different nucleotides are indicated in the sequence of the AEV, the BamHI site in the 5 ′ region of v-erbB is underlined, FIG. 18 represents the nucleotide sequence of the selected Bal31 fragments, the non-coding sequence inserted between the erbA gene and the erbB gene is numbered; the limits of the sequences of the v-erbA and v-erbB genes and that of the mp11 cloning vector are indicated by vertical lines; the horizontal lines represent the sequences of the v-erbB gene conserved after digestion with Bal31; restriction sites in mp11 sequences are underlined; p15-16, p15-21, p15-25, p15-28: names of the CAG clones: suspected splice acceptor site; Figure 19 shows the structure of the pXJ1 clone and the restriction site map; Figure 20 shows the restriction site map and structure of pXJ2; Figure 21 shows the restriction site map and structure of pXJ3; FIG. 22 represents the junction sequences between the Neo gene and the retroviral vectors in the clones pXJ1 and pXJ3. Figure 23 shows the preparation of the mJS21 erb- clone; FIG. 24 represents the preparation of the mp11 -gag clone; Figure 25 shows the preparation of the mp10-J clone; FIG. 26 represents the preparation of the pBRgag-2,7γ clone; Figure 27 shows the preparation of the pBRgag-J clone; Figure 28 shows the preparation of the pBRgag-J-env LTR clone; Figure 29 shows the preparation of the clone pBRgag-J-env 2LTF Figure 30 shows the preparation of the clone pXJ11; Figure 31 shows schematically the structure of pXJ12.
Ces figures et les séquences de nucléotides correspondantes font explicitement partie de la présente description mais n'ont pas été répétées pour éviter d'alourdir ladite description. Les sites de restriction sont abréviés de la façon suivante :These figures and the corresponding nucleotide sequences are explicitly part of the present description but have not been repeated to avoid adding to the said description. Restriction sites are abbreviated as follows:
B : BamHIB: BamHI
BII : BglIIBII: BglII
E : EcoRIE: EcoRI
F FkolF Fkol
P : PstIP: PstI
C : SealC: Seal
Sm : SmalSm: Smal
S : SaliS: dirty
X : Xho ) figures 1 à 22X: Xho) figures 1 to 22
H : HincII )H: HincII)
X : Xbal ) figures 23 à 31X: Xbal) figures 23 to 31
H : HindIII) H: HindIII)
I - TECHNIQUES GENERALESI - GENERAL TECHNIQUES
A) CULTURE DE CELLULES EUCARYOTIQUESA) CULTURE OF EUKARYOTIC CELLS
1) Les cellules L (souris) sont maintenues en culture à 37°C et à 5 % de CO2. Les cellules sont repiquées régulièrement tous les 3 ou 4 jours. Le milieu de culture est composé de DMEM (Gibco) complémenté de 10 % de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine, 2,2 mg/ml de bicarbonate de sodium, 100 ug/ml de streptomycine, 100 ui/ml de pénicilline. 2) Les fibroblastes de poulet sont obtenus après repiquage de cultures primaires préparées à partir d'embryons de 10 à 11 jours et maintenus en culture dans du milieu HAM F10 (Gibco) complémenté avec 10 % de tryptose phosphate broth (Gibco), 2 μg/ml de polybrène, 5 % de sérum de veau, 1 % de sérum de poule inactivé, 2 mg/ml de bicarbonate de sodium, 100 μg/ml de streptomycine, 100 ui/ml de pénicilline et 60 mg/ml de fungizone.1) L cells (mice) are maintained in culture at 37 ° C. and at 5% CO 2 . The cells are subcultured regularly every 3 or 4 days. The culture medium is composed of DMEM (Gibco) supplemented with 10% of fetal calf serum, 2 mM of glutamine, 2.2 mg / ml of sodium bicarbonate, 100 ug / ml of streptomycin, 100 ui / ml of penicillin . 2) Chicken fibroblasts are obtained after subculturing of primary cultures prepared from 10 to 11 day embryos and maintained in culture in HAM F10 medium (Gibco) supplemented with 10% tryptose phosphate broth (Gibco), 2 μg / ml polybrene, 5% calf serum, 1% inactivated chicken serum, 2 mg / ml sodium bicarbonate, 100 μg / ml streptomycin, 100 ui / ml penicillin and 60 mg / ml fungizone.
B) PREPARATION DES ACIDES NUCLEIQUESB) PREPARATION OF NUCLEIC ACIDS
1) Préparation des ADN a) Préparation des plasmides1) Preparation of DNA a) Preparation of plasmids
Les souches bactériennes d'E. coli HB101 ou C600RS hébergeant les plasmides utilisés sont cultivées sur milieu L. broth (bactotryptone 10 g/1, extraits de levure 5 g/1, NaCl 5 g/1) complémenté avec 5 ml/1 d'une solution de glucose à 20 % et par les antibiotiques appropriés.Bacterial strains of E. coli HB101 or C600RS harboring the plasmids used are cultured on L. broth medium (10 g / 1 bacterotryptone, 5 g / 1 yeast extracts, 5 g / 1 NaCl) supplemented with 5 ml / 1 of a glucose solution at 20 % and with appropriate antibiotics.
Les plasmides sont isolés par la technique du lysat clarifié selon EL-GEWELY et HELLING (1980), et purifiés sur gradient de chlorure de césium. Les ADN plasmidiens purifiés sont resuspendus dans de l'eau bidistillée et conservés à + 4°C. b) Preparation d'ADN de fibroblastes de poulet L'ADN des fibroblastes de poulet est obtenu après homogénéisation des cellules dans du Tris-HCl 100 mM pH 7,4, EdtaNa2 10 mM, NaCl 100 mM, SDS 0,5 %. De la pronase est rajoutée à 0,5 mg/ml et le mélange est incubé à 37ºC pendant 8 à 12 heures. L'ADN est extrait au phénol chloroforme et au chloroforme-alcool isoamylique. La solution est ajustée à 200 mM NaCl et précipitée une première fois à l'isopropanol puis 2 fois à l'éthanol. Le culot resuspendu dans du tampon T-E (Tris 10 mM pH 7,4, Edta 1 mM), est traité à la RNase (50 μg/ml)pendant 1 heure à 37°C, puis à la pronase (100 μg/ml) pendant 1 heure à 37°C. La solution d'ADN est extraite une fois au phénol, deux fois au chloroforme-alcool isoamylique et enfin l'ADN est précipité par deux volumes d'éthanol. Le culot d'ADN ainsi purifié est resuspendu dans du tampon T-E et gardé à + 4ºC. 2) Digestion par les enzymes de restrictionThe plasmids are isolated by the clarified lysate technique according to EL-GEWELY and HELLING (1980), and purified on a cesium chloride gradient. The purified plasmid DNAs are resuspended in double-distilled water and stored at + 4 ° C. b) Preparation of DNA from Chicken Fibroblasts The DNA from chicken fibroblasts is obtained after homogenization of the cells in 100 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM EdtaNa 2 , 100 mM NaCl, 0.5% SDS. Pronase is added to 0.5 mg / ml and the mixture is incubated at 37ºC for 8 to 12 hours. The DNA is extracted with phenol chloroform and chloroform-isoamyl alcohol. The solution is adjusted to 200 mM NaCl and precipitated a first time with isopropanol then 2 times with ethanol. The pellet resuspended in TE buffer (Tris 10 mM pH 7.4, Edta 1 mM), is treated with RNase (50 μg / ml) for 1 hour at 37 ° C., then with pronase (100 μg / ml) for 1 hour at 37 ° C. The DNA solution is extracted once with phenol, twice with chloroform-isoamyl alcohol and finally the DNA is precipitated with two volumes of ethanol. The DNA residue thus purified is resuspended in TE buffer and kept at + 4ºC. 2) Digestion by restriction enzymes
Les enzymes de restriction proviennent de Boehringer et sont utilisés sous les conditions d'incubation données par le fabricant. Généralement, 1 à 4 unités d'enzyme sont utilisées pour digérer 1 μg d'ADN pendant 2 heures à 37°C. La réaction enzymatique est arrêtée par incubation à 65°C pendant 5 à 10 minutes. 3) Préparation des ARNThe restriction enzymes come from Boehringer and are used under the incubation conditions given by the manufacturer. Generally, 1 to 4 units of enzyme are used to digest 1 μg of DNA for 2 hours at 37 ° C. The enzymatic reaction is stopped by incubation at 65 ° C for 5 to 10 minutes. 3) Preparation of RNAs
La verrerie utilisée pour l'extraction des ARN est préalablement stérilisée par chauffage au four pasteur pendant au moins 2 heures. Les tubes servant à l'extraction sont de plus traités au diéthylpyrocarbonate 1 % . (Sigma) . Les tampons sont stérilisés à 120°C pendant 30 à 40 minutes .The glassware used for the extraction of RNA is previously sterilized by heating in a pasteur oven for at least 2 hours. The tubes used for extraction are further treated with 1% diethylpyrocarbonate. (Sigma). The pads are sterilized at 120 ° C for 30 to 40 minutes.
L'ARN cellulaire total est extrait des cellules eucaryotiques selon la technique de AUFFRAY et ROUGEON (1980) à partir de 20.106 à 50.106 fibroblastes de poulet infectés par des rétrovirus.Total cellular RNA is extracted from eukaryotic cells according to the technique of AUFFRAY and ROUGEON (1980) from 20.10 6 to 50.10 6 chicken fibroblasts infected with retroviruses.
Après centrifugation des cellules à 800 rpm, les culots cellulaires sont congelés dans l'azote liquide 10 à 15 minutes et resuspendus dans un tampon dénaturant (LiCl 3 M, urée 6 M, acétate de sodium 0,01 M pH 5, complexe vanadyl ribonucléique (BRL) 0,01 M). La solution est ajustée à 0,01 % SDS et conservée une nuit à + 4°C. L'ARN est récupéré après centrifugation à 10000 rpm pendant 20 minutes à 4ºC. Le culot est lavé <par une solution urée 8 M, LiCl 4 M, puis resuspendu dans l'eau bidistillée. La solution d'ARN est extraite une fois au phénol, une fois au phénol-chloroforme, et enfin l'ARN est précipité avec 2 volumes d'éthanol en présence d'acétate de sodium 0,2 M pH 5. b) Préparation des ARN polya+ After centrifugation of the cells at 800 rpm, the cell pellets are frozen in liquid nitrogen 10 to 15 minutes and resuspended in a denaturing buffer (3M LiCl, 6 M urea, 0.01 M sodium acetate pH 5, 0.01 M vanadyl ribonucleic complex (BRL)). The solution is adjusted to 0.01% SDS and stored overnight at + 4 ° C. The RNA is recovered after centrifugation at 10,000 rpm for 20 minutes at 4ºC. The pellet is washed <with an 8 M urea solution, 4 M LiCl, then resuspended in double-distilled water. The RNA solution is extracted once with phenol, once with phenol-chloroform, and finally the RNA is precipitated with 2 volumes of ethanol in the presence of 0.2 M sodium acetate pH 5. b) Preparation of the Polya + RNA
Les ARN polyA sont préparés selon la technique décrite par LONCAGRE et RUTTER (1977), par filtration sur colonne.The polyA RNAs are prepared according to the technique described by LONCAGRE and RUTTER (1977), by column filtration.
200 à 500 μg d'ARN total sont déposés sur une colonne contenant 200 à 300 mg d'oligodT cellulose de type 3 (Collaborative Research). La filtration d'ARN est effectuée dans un tampon contenant Tris 10 mM pH 7,4 et KCl 500 mM. L'éluat est recyclé deux fois sur la colonne. L'ARN polyA est décroché par le tampon d'élution (Tris 10 mM pH 7,4). Les solutions d'ARN polyA sont ajustées à 200 mM acétate de sodium pH 5 et les ARN polyA sont précipités par deux volumes d'éthanol. Les culots sont resuspendus dans de l'eau bidistillée et conservés à - 20°C. c) Prégarâtign des ARN virions200 to 500 μg of total RNA are deposited on a column containing 200 to 300 mg of oligodT cellulose type 3 (Collaborative Research). The filtration of RNA is carried out in a buffer containing 10 mM Tris pH 7.4 and 500 mM KCl. The eluate is recycled twice on the column. The polyA RNA is released by the elution buffer (Tris 10 mM pH 7.4). The polyA RNA solutions are adjusted to 200 mM sodium acetate pH 5 and the polyA RNA are precipitated with two volumes of ethanol. The pellets are resuspended in double distilled water and stored at - 20 ° C. c) Prégarâtign of RNA virions
Les virions sont récupérés dans les surnageants de culture de fibroblastes de poulet infectés par le virus. En pratique, lorsque les cultures infectées par le virus contiennent une majorité de cellules transformées, le milieu de culture est changé par du milieu frais. Les virions sont ensuite collectés 24 heures plus tard. Les surnageants sont alors centrifugés une première fois à 2 000 rpm pendant 10 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Les virions sont ensuite sédimentés par ultracentrifugation dans un rotor 50.2 Ti à 16 000 - 18 000 rpm pendant 2 heures à 4ºC. Les culots contenant les virions sont resuspendus dans du Tris 10 mM pH 7,4 contenant Edta 10 mM, NaCl 100 mM et le complexe vanadyl-ribonucléique 10 mM. Du SDS 0,1 % et de la protéinase K (0,5 mg/ml) sont ajoutés et la suspension est incubée pendant 1 heure à 37°C puis extraite deux fois au phénol, deux fois au chloroforme, et l'ARN est précipité avec 2 volumes d'éthanol. C) ELECTROPHORESE ET TRANSFERT DES ACIDES NUCLEIQUES SUR FILTRE DE NITROCELLUL0SEThe virions are recovered in the culture supernatants of chicken fibroblasts infected with the virus. In practice, when the cultures infected with the virus contain a majority of transformed cells, the culture medium is changed by fresh medium. The virions are then collected 24 hours later. The supernatants are then centrifuged for the first time at 2000 rpm for 10 minutes to remove cellular debris. Virions are then sedimented by ultracentrifugation in a 50.2 Ti rotor at 16,000 - 18,000 rpm for 2 hours at 4ºC. The pellets containing the virions are resuspended in 10 mM Tris pH 7.4 containing 10 mM Edta, 100 mM NaCl and the 10 mM vanadyl-ribonucleic complex. 0.1% SDS and proteinase K (0.5 mg / ml) are added and the suspension is incubated for 1 hour at 37 ° C. then extracted twice with phenol, twice with chloroform, and the RNA is precipitated with 2 volumes of ethanol. C) ELECTROPHORESIS AND TRANSFER OF NUCLEIC ACIDS ON A NITROCELLULOSE FILTER
1 ) Electrophorèse et transfert d'ADN1) Electrophoresis and DNA transfer
15 à 20 μg d'ADN total préalablement digéré avec des enzymes de restriction sont déposés sur gel horizontal à 1 % d'agarose. L'electrophorèse est effectuée dans du tampon E-T (Tris 40 mM pH 7,5, acétate de sodium 20 mM, Edta 2 mM) contenant 0,5 μg de bromure d'éthydium, pendant 12 à 16 heures. Le gel est dénaturé par immersion dans une solution de NaOH 0,5 N et NaCl 1,5 M pendant 2 à 3 heures, puis neutralisé par du15 to 20 μg of total DNA previously digested with restriction enzymes are deposited on a horizontal gel containing 1% agarose. The electrophoresis is carried out in E-T buffer (40 mM Tris pH 7.5, 20 mM sodium acetate, 2 mM Edta) containing 0.5 μg of ethydium bromide, for 12 to 16 hours. The gel is denatured by immersion in a solution of 0.5 N NaOH and 1.5 M NaCl for 2 to 3 hours, then neutralized with
Tris-HCl 500 mM pH 5,6, NaCl 300 mM pendant 3 heures, à température ambiante. Le transfert de l'ADN est effectué en appliquant une membrane de nitrocellulose (Sartorius ou Schleicher et Schüll) sur le gel d'agarose pendant une nuit selon la technique de SOUTHERN (1975).500 mM Tris-HCl pH 5.6, 300 mM NaCl for 3 hours, at room temperature. The transfer of DNA is carried out by applying a nitrocellulose membrane (Sartorius or Schleicher and Schüll) to the agarose gel overnight according to the technique of SOUTHERN (1975).
2) Electrophorèse et transfert d'ARN2) RNA electrophoresis and transfer
15 à 20 μg d'ARN total ou d'ARN polyA+ ou 2 à 5 μg d'ARN polyA sont dénaturés à la formaldéhyde selon LEHRACH et al. (1977). Les ARN sont équilibrés par du tampon MOPS (acide morpholinopropane sulfonique 20 mM pH 7, acétate de sodium 5 mM, Edta 1 mM) et dénaturés en présence de 6 % de formaldéhyde et de 50 % de formamide à 65°C, pendant 5 à 10 minutes, puis refroidis rapidement dans la glace. Le fractionnement des ARN dénaturés est effectué sur gel horizontal de 1 % à 1,5 % d'agarose, contenant 6 % de formaldéhyde, dans du tampon MOPS. La migration s'effectue pendant 16 à 20 heures à 30-40 volts, à température ambiante avec recyclage du tampon. Le transfert des ARN du gel sur filtre de nitrocellulose est réalisé selon la technique de SOUTHERN (1975) modifiée par THOMAS (1980). Le filtre de nitrocellulose rincé avec l'eau bidistillée est équilibré pendant 5 à 10 minutes dans du SSC x 20 avant d'être appliqué sur le gel. Le transfert dure une nuit à + 4°C. Le filtre est ensuite récupéré, séché sous une lampe pendant 5-10 minutes.15 to 20 μg of total RNA or of polyA + RNA or 2 to 5 μg of polyA RNA are denatured with formaldehyde according to LEHRACH et al. (1977). The RNAs are balanced with MOPS buffer (20 mM morpholinopropane sulfonic acid pH 7, 5 mM sodium acetate, 1 mM Edta) and denatured in the presence of 6% formaldehyde and 50% formamide at 65 ° C, for 5 to 10 minutes, then quickly cooled in ice. The fractionation of the denatured RNA is carried out on a horizontal gel of 1% to 1.5% of agarose, containing 6% of formaldehyde, in MOPS buffer. Migration takes place for 16 to 20 hours at 30-40 volts, at room temperature with recycling of the buffer. The transfer of RNA from the gel to a nitrocellulose filter is carried out according to the technique of SOUTHERN (1975) modified by THOMAS (1980). The nitrocellulose filter rinsed with double distilled water is balanced for 5 to 10 minutes in SSC x 20 before being applied to the gel. The transfer lasts one night at + 4 ° C. The filter is then collected, dried under a lamp for 5-10 minutes.
D) PREPARATION DE SONDES RADIOACTIVES 0,4 μg à 0,5 μg de divers fragments d'ADN utilisés comme sondes sont marqués "in vitro" par translation de coupure (RIGBY et al. 1977). La réaction se déroule dans un volume de 100 μl final contenant du Tris-HCl 50 mM pH 7,8, MgCl2 5 mM, BSA 500 μg/ml, bétamercaptoéthanol 10 mM, dGTP 3,5 μM, dATP 3,5 μM, 40 μCi de dCTPalpha P32 et 40 μCi de TTPalpha P32 (activité spécifique 400 Ci/m mole - Amersham), 2 pg de DNasel (Wortington) et 4 à 5 unités d'ADN polymérase (Boehringer). Le mélange est incubé pendant 2 heures à 15ºC. La réaction est arrêtée par addition de 50 μl d'Edta 250 mM, et l'ADN marqué est séparé des nucléotides non incorporés sur colonne de Séphadex G.50 ou de biogel (Bio-Rad A. 1,5 m).D) PREPARATION OF RADIOACTIVE PROBES 0.4 μg to 0.5 μg of various DNA fragments used as probes are marked "in vitro" by cut translation (RIGBY et al. 1977). The reaction takes place in a volume of 100 μl final containing 50 mM Tris-HCl pH 7.8, MgCl 2 5 mM, BSA 500 μg / ml, betamercaptoethanol 10 mM, dGTP 3.5 μM, dATP 3.5 μM, 40 μCi of dCTPalpha P 32 and 40 μCi of TTPalpha P 32 (specific activity 400 Ci / mole - Amersham), 2 μg of DNasel (Wortington) and 4 to 5 units of DNA polymerase (Boehringer). The mixture is incubated for 2 hours at 15ºC. The reaction is stopped by adding 50 μl of 250 mM Edta, and the labeled DNA is separated from the nucleotides not incorporated on a column of Sephadex G.50 or biogel (Bio-Rad A. 1.5 m).
E) HYBRIDATION DES FILTRESE) HYBRIDIZATION OF THE FILTERS
Après transfert soit d'ADN soit d'ARN, les filtres sont séchés à 70-80°C pendant 2 heures, traités par un tampon de préhybridation (Tris-HCl 50 mM pH 7, SSC x 3, ARN 20 μg/ml, ADN de sperme de saumon 20 μg/ml, Denhardtslx, formamide 50 % pendant 8 à 20 heures à 42°C. L'hybridation est réalisée dans le même tampon contenant 5-10.106cpm de la sonde radioactive pendant 24 à 48 heures à 42ºC.After transfer of either DNA or RNA, the filters are dried at 70-80 ° C for 2 hours, treated with a prehybridization buffer (50 mM Tris-HCl pH 7, SSC x 3, RNA 20 μg / ml, salmon sperm DNA 20 μg / ml, Denhardtslx, 50% formamide for 8 to 20 hours at 42 ° C. L hybridization is carried out in the same buffer containing 5-10 × 10 6 cpm of the radioactive probe for 24 to 48 hours at 42 ° C.
En fin d'hybridation, les filtres sont lavés une fois dans du SSC 2x pendant une heure à 42°C puis deux fois dans du SSC0,1x, SDS 0,1 % pendant 45 minutes à 50°C, et enfin rincés 4 fois dans du SSC 0,1x pendant 5 minutes.At the end of hybridization, the filters are washed once in 2x SSC for one hour at 42 ° C then twice in 0.1x SSC, 0.1% SDS for 45 minutes at 50 ° C, and finally rinsed 4 times in 0.1x SSC for 5 minutes.
Après séchage, les filtres sont exposés pour autoradiographie sur film (Kodak royal X Omat AR) à - 80°C avec écrans renforçateurs . L ' exposition dure de 5 heures à plusieurs jours. F) DESHYBRIDATION DES FILTRESAfter drying, the filters are exposed for autoradiography on film (Kodak royal X Omat AR) at - 80 ° C with intensifying screens. The exhibition lasts from 5 hours to several days. F) DEHYBRIDATION OF FILTERS
Les filtres hybrides une première fois avec une sonde marquée au 32P sont déshybridés dans du SSCHybrid filters for the first time with a 32 P-labeled probe are dehybridized in SSC
70-75°C, pendant 10 à 15 minutes. Ils sont séchés et exposés pendant 48 heures en autoradiographie. Les filtres sont traités par le tampon de préhybridation et utilisés avec une nouvelle sonde.70-75 ° C, for 10 to 15 minutes. They are dried and exposed for 48 hours in autoradiography. The filters are treated with the prehybridization buffer and used with a new probe.
II - TECHNIQUES UTILISEES POUR LA RECOMBINAISON GENETIQUE "IN VITRO"II - TECHNIQUES USED FOR "IN VITRO" GENE RECOMBINATION
A) ISOLEMENT DE FRAGMENTS CLONES DANS DES PLASMIDES 1) Isolement après electrophorèse sur gel d'agaroseA) ISOLATION OF CLONED FRAGMENTS IN PLASMIDS 1) Isolation after electrophoresis on agarose gel
50 μg à 100 μg d'ADN de plasmide contenant le fragment à isoler sont digérés par les enzymes de restriction permettant de relâcher le fragment. Les fragments d'ADN sont ensuite séparés par electrophorèse sur gel horizontal d'agarose pendant une nuit à 30-40 volts. La région du gel contenant le fragment à isoler est ensuite découpée. L'ADN est extrait de l'agarose par l'une ou l'autre des deux techniques suivantes : a) Technigue d'électroélution50 μg to 100 μg of plasmid DNA containing the fragment to be isolated are digested with restriction enzymes making it possible to release the fragment. The DNA fragments are then separated by horizontal gel electrophoresis agarose overnight at 30-40 volts. The region of the gel containing the fragment to be isolated is then cut out. DNA is extracted from agarose by either of the following two techniques: a) Electroelution technique
La région découpée du gel, et contenant le fragment à isoler, est placée dans un sac à dialyse renfermant du tampon E-T (Tris 40 mM pH 7,5, acétate de sodium 20 mM, Edta 2 mM). Le sac est soumis à un champ électrique (30-40 volts) dans une cuve contenant du tampon E-T.The cut region of the gel, and containing the fragment to be isolated, is placed in a dialysis bag containing E-T buffer (Tris 40 mM pH 7.5, 20 mM sodium acetate, 2 mM Edta). The bag is subjected to an electric field (30-40 volts) in a tank containing E-T buffer.
L'élution de l'ADN est suivie par illumination brève à la lumière ultraviolette. En fin d'élution, l'ADN est extrait 3 à 4 fois à l'alcool isoamylique puis précipité par deux volumes d'éthanol. b) Technigue dite de "freeze sgueeze"The elution of the DNA is followed by brief illumination in ultraviolet light. At the end of elution, the DNA is extracted 3 to 4 times with isoamyl alcohol and then precipitated with two volumes of ethanol. b) Technigue known as "freeze sgueeze"
(TAUTZ et RENZ, 1983). Le morceau du gel contenant le fragment à isoler est équilibré dans 10 fois son volume d'une solution contenant de l'acétate de sodium 300 mM pH 7, et de l'EDTA 1 mM, avec agitation pendant 30 à 45 minutes à l'abri de la lumière. Le morceau de gel est placé dans un tube Eppendorf de 0,6 ml, percé à son fond et bouché avec de la laine de verre, et l'ensemble est congelé dans l'azote liquide. Le tube renfermant le morceau de gel est placé dans un tube Eppendorf de 1,5 ml puis centrifugé à 12 000 rpm pendant 10 minutes à température ambiante. La solution récupérée contenant le fragment à isoler est ajustée avec une solution contenant du MgCl2 1 mM et de l'acide acétique 10 %, puis précipitée avec 2,5 volumes d'éthanol. Le culot est rincé successivement avec un mélange contenant de l'éthanol 70 %. Le culot est séché brièvement, puis resuspendu dans du tampon T-E. 2) Gradient de sucrose(TAUTZ and RENZ, 1983). The piece of gel containing the fragment to be isolated is balanced in 10 times its volume of a solution containing 300 mM sodium acetate pH 7, and 1 mM EDTA, with stirring for 30 to 45 minutes at shelter from light. The gel piece is placed in a 0.6 ml Eppendorf tube, pierced at the bottom and capped with glass wool, and the whole is frozen in liquid nitrogen. The tube containing the gel piece is placed in a 1.5 ml Eppendorf tube and then centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at room temperature. The recovered solution containing the fragment to be isolated is adjusted with a solution containing 1 mM MgCl 2 and 10% acetic acid, then precipitated with 2.5 volumes of ethanol. The pellet is rinsed successively with a mixture containing 70% ethanol. The pellet is dried briefly, then resuspended in TE buffer. 2) Sucrose gradient
50 μg à 100 μg d'ADN de plasmide préalablement digéré par des enzymes de restriction sont déposés sur un gradient de sucrose 5-20 %. Le gradient est centrifugé pendant 14 à 16 heures, entre 30000 et 36 000 rpm, dans un rotor SW41 à 20°C. Les bandes repérées sous lumière ultra-violette sont récupérées à l'aide d'une pipette.50 μg to 100 μg of plasmid DNA previously digested with restriction enzymes are deposited on a 5-20% sucrose gradient. The gradient is centrifuged for 14 to 16 hours, between 30,000 and 36,000 rpm, in a rotor SW41 at 20 ° C. The bands identified under ultraviolet light are recovered using a pipette.
Les ADN sont dialyses dans du tampon T-E pendant une nuit puis purifiés au phénol et au chloroforme et enfin précipités à l'éthanol.The DNAs are dialyzed in T-E buffer overnight then purified with phenol and chloroform and finally precipitated with ethanol.
B) DEPHOSPHORYLATION DES EXTREMITES 3' DE L'ADNB) DEPHOSPHORYLATION OF THE 3 'END OF DNA
L'ADN est incubé en présence de phosphatase alcaline bactérienne ou BAP (BRL) pendant une heure à 65°C. Généralement, on utilise 10 unités de BAP par mole d'extrémité 3' d'ADN à déphosphoryler. L'enzyme est ensuite éliminé par deux extractions successives au phénolchloroforme et l'ADN est récupéré par précipitation à l'éthanol.The DNA is incubated in the presence of bacterial alkaline phosphatase or BAP (BRL) for one hour at 65 ° C. Generally, 10 units of BAP are used per mole of 3 'end of DNA to be dephosphorylated. The enzyme is then eliminated by two successive extractions with phenolchloroform and the DNA is recovered by precipitation with ethanol.
C) LIGATIONC) LIGATION
La ligation de fragments d'ADN est effectuée dans un tampon composé de Tris 600 mM pH 7,6, MgCl2 66 mM,The DNA fragments are ligated in a buffer composed of Tris 600 mM pH 7.6, MgCl 2 66 mM,
DTT 100 mM, ATP 4 mM, en présence de ligase du phage T4 (Boehringer) à la concentration de 2 u/μg d'ADN. Les ADN à liguer sont ajoutés en quantité équimolaire à la concentration finale de 5 à 10 μg/ml. Le mélange final qui n'excède pas 60 μl est incubé une nuit à 65°C.100 mM DTT, 4 mM ATP, in the presence of phage T4 ligase (Boehringer) at a concentration of 2 u / μg of DNA. The DNAs to be ligated are added in equimolar amount to the final concentration of 5 to 10 μg / ml. The final mixture which does not exceed 60 μl is incubated overnight at 65 ° C.
D) ADDITION DE "LINKERS"D) ADDITION OF "LINKERS"
Les "linkers" PstI ont été utilisés pour la construction des recombinants pAEVdeltaΔHpa. Dans ce cas particulier, les "linkers" sont ajoutés au site Hpal du gène humain de globine delta. 0,5 μg de "linkers" PstI (BRL) sont phosphorylés dans un mélange contenant du Tris HCl 60 mM pH 7,8, du MgCl2 10 mM, du béta-mercaptoéthanol 15 mM, 4 unités de polynucléotide kinase (Boehringer), de l'ATP 50 μM et 10 μCi d'ATP gamma 32P. La réaction est incubée à 37ºC pendant 30 minutes. Le mélange de "linkers" PstI phosphorylés est ajouté à 5 μg de plasmide pBRdeltaPst ouvert auparavant au site Hpal et déphosphorylé. Le mélange est soumis à l'action de la ligase T4 pendant une nuit à 15ºC.The PstI "linkers" were used for the construction of the pAEVdeltaΔHpa recombinants. In this particular case, the "linkers" are added to the Hpal site of the human globin delta gene. 0.5 μg of PstI linkers (BRL) are phosphorylated in a mixture containing 60 mM Tris HCl pH 7.8, 10 mM MgCl 2 , 15 mM beta-mercaptoethanol, 4 units of polynucleotide kinase (Boehringer), ATP 50 μM and 10 μCi ATP gamma 32 P. The reaction is incubated at 37ºC for 30 minutes. The mixture of phosphorylated PstI "linkers" is added to 5 μg of plasmid pBRdeltaPst previously opened at the Hpal site and dephosphorylated. The mixture is subjected to the action of T4 ligase overnight at 15ºC.
E) IDENTIFICATION DE BACTERIESE) IDENTIFICATION OF BACTERIA
Les ADN de plasmides recombinants sont introduits dans des bactéries C-600 RS rendues compétentes selon la technique de MANIATIS et al. (1982). Les bactéries transformées sont ensuite étalées sur boîte d'agar contenant les antibiotiques appropriés.The DNAs of recombinant plasmids are introduced into C-600 RS bacteria made competent according to the technique of MANIATIS et al. (1982). The transformed bacteria are then spread on an agar dish containing the appropriate antibiotics.
F) IDENTIFICATION DES PLASMIDES DANS LES CLONES BACTERIENSF) IDENTIFICATION OF PLASMIDS IN BACTERIAL CLONES
1) Transfert de colonies bactériennes sur filtre Cette technique est appliquée dans le cas où les plasmides recombinants recherchés représentent une faible proportion parmi les différents plasmides recombinants possibles. Elle permet un criblage rapide sur un grand nombre de colonies bactériennes. Un papier filtre (Whatman) stérilisé par chauffage à 150°C pendant 2 heures est appliqué 10 à 15 secondes sur la boîte d'agar contenant des colonies bactériennes bien individualisées. Après transfert, les filtres sont séchés à l'air pendant 5 à 10 minutes, puis traités dans NaOH 0,5 M pendant 5 minutes et placés dans une étuve à 37°C pendant 1 heure. Les filtres sont ensuite traités deux fois 5 minutes dans chacun des trois bains suivants, avec agitation : NaOH 0,5 M - Tris 0,5 M pH 8 - SSC2x, et enfin rincés dans l'éthanol et séchés à l'air.1) Transfer of bacterial colonies onto a filter This technique is applied in the case where the recombinant plasmids sought represent a small proportion among the various possible recombinant plasmids. It allows rapid screening on a large number of bacterial colonies. A filter paper (Whatman) sterilized by heating at 150 ° C for 2 hours is applied 10 to 15 seconds on the agar dish containing well individualized bacterial colonies. After transfer, the filters are air dried for 5 to 10 minutes, then treated in 0.5 M NaOH for 5 minutes and placed in an oven at 37 ° C for 1 hour. The filters are then treated twice 5 minutes in each of the following three baths, with agitation: 0.5 M NaOH - 0.5 M Tris pH 8 - SSC2x, and finally rinsed in ethanol and air dried.
Les colonies renfermant les recombinants recherchés sont identifiées par hybridation du filtre avec une sonde d'ADN marquée au dCTPalpha 32P par translation de coupure.The colonies containing the desired recombinants are identified by hybridization of the filter with a DNA probe labeled with dCTPalpha 32 P by cut translation.
Les filtres sont préhybridés dans un mélange de formamide 50 % et SSC5x pendant 2 heures à 37-42°C.The filters are prehybridized in a mixture of 50% formamide and SSC5x for 2 hours at 37-42 ° C.
L'hybridation s'effectue dans le même mélange en présence de sondes spécifiques appropriées pendant 24 à 48 heures à 42°C. Les filtres sont lavés respectivement 30 minutes dans du formamide 50 % et SSC5x à 37-42°C et 4 fois 30 minutes dans du SSC2x à température ambiante. Les filtres sont enfin rincés dans l'éthanol puis séchés à l'air et exposés pour autoradiographie pendant 2 à 4 heures, Les colonies contenant le fragment d'ADN recherché sont identifiées après révélation de l'autoradiographie, puis isolées et analysées par préparation rapide de plasmides. 2) Préparation rapide des ADN de plasmides Les plasmides sont préparés à partir de 1,5 ml de culture selon la méthode de lyse alcaline de BIRNBOIM et DOLY (1979) modifiée par MANIATIS et al. (1982).Hybridization is carried out in the same mixture in the presence of appropriate specific probes for 24 to 48 hours at 42 ° C. The filters are washed respectively 30 minutes in 50% formamide and SSC5x at 37-42 ° C and 4 times 30 minutes in SSC2x at room temperature. The filters are finally rinsed in ethanol then dried in air and exposed for autoradiography for 2 to 4 hours. The colonies containing the DNA fragment sought are identified after revelation of the autoradiography, then isolated and analyzed by rapid preparation. of plasmids. 2) Rapid preparation of the plasmid DNAs The plasmids are prepared from 1.5 ml of culture according to the alkaline lysis method of BIRNBOIM and DOLY (1979) modified by MANIATIS et al. (1982).
Les ADN plasmidiens sont analysés par digestion au moyen d'enzymes de restriction et fractionnement sur gels d'agarose.Plasmid DNAs are analyzed by digestion using restriction enzymes and fractionation on agarose gels.
III - PRODUCTION DE PARTICULES VIRALES PARIII - PRODUCTION OF VIRAL PARTICLES BY
TRANSFECTION DE FIBROBLASTES DE POULET La technique de transfection utilisée est la technique au phosphate de calcium décrite par GRAHAM et VAN DER EB (1973), modifiée par WIGLER et al. (1977). A) PREPARATION DE L'ADNTRANSFECTION OF CHICKEN FIBROBLASTS The transfection technique used is the calcium phosphate technique described by GRAHAM and VAN DER EB (1973), modified by WIGLER et al. (1977). A) PREPARATION OF DNA
La quantité d'ADN transfectée par boîte de culture de diamètre 60 mm est de 10 à 15 μg. Cet ADN se compose d'ADN de sperme de saumon (3 à 4 μg) et d'ADN viral. L'ADN viral est lui-même constitué du plasmide contenant le génome AZV modifié et du plasmide contenant I'ADN du virus assistant RAV-2 dans un rapport molaire de 5/1 à 10/1.The quantity of DNA transfected per culture dish with a diameter of 60 mm is 10 to 15 μg. This DNA is made up of salmon sperm DNA (3 to 4 μg) and viral DNA. The viral DNA itself consists of the plasmid containing the modified AZV genome and of the plasmid containing the DNA of the RAV-2 helper virus in a molar ratio of 5/1 to 10/1.
Le mélange d'ADN est suspendu dans un volume de tampon A (HEPES 25 mM, CaCl2 250 mM, pH 7,15). La précipitation phosphocalcique est réalisée par addition d'un volume de tampon B (HEPES 25 mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM, pH 7,15) avec agitation rapide (10 à 15 secondes). Un très fin précipité est observé dans le mélange au bout de 20 à 30 minutes à température ambiante.The DNA mixture is suspended in a volume of buffer A (25 mM HEPES, 250 mM CaCl 2 , pH 7.15). Phosphocalcic precipitation is carried out by adding a volume of buffer B (25 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.15) with rapid stirring (10 to 15 seconds). A very fine precipitate is observed in the mixture after 20 to 30 minutes at room temperature.
B) PREPARATION DES CELLULES ET TRANSFECTIONB) CELL PREPARATION AND TRANSFECTION
6.10 fibroblastes secondaires d'embryons de poulet sont ensemencés dans des boîtes de Pétri de 60 mm de diamètre, 16 heures avant la transfection.6.10 secondary fibroblasts from chicken embryos are seeded in 60 mm diameter petri dishes, 16 hours before transfection.
Pour la transfection, le mélange d'ADN précipité est déposé dans chaque boîte de culture et les cellules sont incubées pendant 5 à 6 heures à 37°C. Le milieu de transfection est remplacé ensuite par du milieu frais et les cellules sont repiquées dans une boîte de Pétri de 100 mm de diamètre. Tous les 3 à 4 jours, chaque boîte de culture est ensuite répartie dans trois boîtes de 100 mm de diamètre. EXEMPLE 1 CLONE DE L'ADN DU VIRUS ASSISTANTFor transfection, the precipitated DNA mixture is placed in each culture dish and the cells are incubated for 5 to 6 hours at 37 ° C. The transfection medium is then replaced with fresh medium and the cells are subcultured in a 100 mm diameter petri dish. Every 3 to 4 days, each culture dish is then distributed into three dishes 100 mm in diameter. EXAMPLE 1 CLONE OF THE DNA OF THE ASSISTING VIRUS
Le génome du virus assistant RAV-2 a été obtenu de BOONE et SKALKA (1981). Il est constitué d'une séquenèe de 8 kb insérée au site Sali de l'ADN du phage lambda.The RAV-2 helper virus genome was obtained from BOONE and SKALKA (1981). It consists of an 8 kb sequence inserted at the SalI site of the DNA of phage lambda.
Cette séquence a été sous-clonée dans le plasmide pBR322 pour fournir le clone pRAV2. Le génome RAV2 présente un seul site Sali situé dans le gène env. De ce fait, dans le plasmide, les séquences du génome sont en partie permutées (figure 3).This sequence was subcloned into the plasmid pBR322 to provide the clone pRAV2. The RAV2 genome has a single SalI site located in the env gene. As a result, in the plasmid, the genome sequences are partly permuted (Figure 3).
Afin de produire des virions RAV-2, l'ADN pRAV2 doit être transfecté sur fibroblastes de poulet. L'ADN viral doit être introduit dans les cellules réceptrices sous la forme d'un génome encadré de LTR et dans lequel l'arrangement des gènes correspond à celui existant dans l'ARN viral. Cet arrangement peut être réalisé "in vitro" après digestion du plasmide pRAV2 par Sali et religation entre eux des fragments obtenus afin de créer des concatémères (figure 4). La concatémérisation par ligation permet de générer un certain nombre de molécules qui pourront être intégrées dans le génome des cellules hôtes et transcrire des ARN génomiques pouvant générer des virions infectieux. On notera qu'une proportion seulement des concatémères est susceptible de donner naissance à des virions.In order to produce RAV-2 virions, pRAV2 DNA must be transfected into chicken fibroblasts. The viral DNA must be introduced into the receptor cells in the form of a genome framed by LTR and in which the arrangement of the genes corresponds to that existing in the viral RNA. This arrangement can be carried out "in vitro" after digestion of the plasmid pRAV2 with Sali and religation of the fragments obtained in order to create concatemers (FIG. 4). Concatemerization by ligation makes it possible to generate a certain number of molecules which can be integrated into the genome of the host cells and transcribe genomic RNA which can generate infectious virions. It will be noted that only a proportion of the concatemers is capable of giving birth to virions.
Ainsi, si l'on ne considère que l'arrangement en dimères, indispensable pour assurer le fonctionnement du système, on calcule que seulement 1/3 des molécules présenteront la structure d'un génome proviral reconstitué. EXEMPLE 2 CLONE DE L'ADN DE L'AEV SAUVAGE a) Clone PAEV11Thus, if we only consider the arrangement in dimers, essential to ensure the functioning of the system, we calculate that only 1/3 of the molecules will have the structure of a reconstituted proviral genome. EXAMPLE 2 WILD AEV DNA CLONE a) PAEV11 clone
Le clone de départ est constitué par le plasmide pAEV11 isolé par VENNSTROM et al. (1980) et qui est représenté sur la figure 2,a.The starting clone consists of the plasmid pAEV11 isolated by VENNSTROM et al. (1980) and which is shown in Figure 2, a.
Ce clone est constitué du plasmide pBR313 dans lequel le génome d'AEV d'environ 5,4 kb a été inséré au site unique EcoRI. Dans ce clone, le génome viral présente une permutation due à la présence du site EcoRI situé àThis clone consists of the plasmid pBR313 into which the AEV genome of about 5.4 kb has been inserted at the unique EcoRI site. In this clone, the viral genome presents a permutation due to the presence of the EcoRI site located at
37 pb en amont du codon de terminaison de v-erbB. Il faut souligner que ce clone renferme une structure LTR double.37 bp upstream from the v-erbB termination codon. It should be noted that this clone contains a double LTR structure.
Comme dans le cas de pRAV2, la production de virions à partir de pAEV11 implique la transfection, sur fibroblastes de poulet, de concatémères reconstituant un génome intégral. Dans ce cas aussi la proportion de concatémères présentant l'arrangement favorable est faible. Afin d'augmenter l'efficacité de production virale par transfection, on recrée par recombinaison génétique "in vitro" un clone dans lequel le génome viral est reconstitué sous une forme identique au provirus. b) Construction du clone pAEV2LTRAs in the case of pRAV2, the production of virions from pAEV11 involves the transfection, on chicken fibroblasts, of concaterers reconstituting an integral genome. In this case also the proportion of concaterers having the favorable arrangement is low. In order to increase the efficiency of viral production by transfection, a clone is recreated by genetic recombination "in vitro" in which the viral genome is reconstituted in a form identical to the provirus. b) Construction of the clone pAEV2LTR
Le réarrangement effectué consiste à isoler le fragment viral EcoRI-BamHI de 1,8 kb (figure 5) couvrant la fin du v-erbB, le résidu 3' terminal du gène env (Δenv), les séquences LTR et le début du gène gag. Ce fragment a été inséré et clone dans pBR322, délété de son fragment mineur EcoRI-BamHI. Le plasmide obtenu est appelé pJS21. Le génome entier de l'AEV est isolé de pBR313 après digestion du plasmide pAEV11 par EcoRI. Le fragment portant le génome AEV est ligué au plasmide pJS21 préala blement ouvert au site unique EcoRI. L'un des recombinants obtenus, appelé pAEV2LTR, présente la structure d'un provirus avec une copie LTR à chaque extrémité.The rearrangement carried out consists in isolating the 1.8 kb EcoRI-BamHI viral fragment (FIG. 5) covering the end of the v-erbB, the 3 ′ terminal residue of the env gene (Δenv), the LTR sequences and the start of the gag gene. . This fragment was inserted and cloned into pBR322, deleted from its minor EcoRI-BamHI fragment. The plasmid obtained is called pJS21. The entire AEV genome is isolated from pBR313 after digestion of the plasmid pAEV11 with EcoRI. The fragment carrying the AEV genome is ligated to the plasmid pJS21 priora openly open to the unique EcoRI site. One of the recombinants obtained, called pAEV2LTR, has the structure of a provirus with an LTR copy at each end.
L'ADN pAEV2LTR peut être transfecté sur fibroblastes de poulet sans digestion préalable. Après cotransfection avec l'ADN portant les séquences du virus assistant RAV2, les fibroblastes produisent des virions de type AEV et subissent une transformation oncogène décelable environ 15 jours après la transfection. On note que la transfection avec pAEV2LTR augmente très nettement l'efficacité de la production virale par rapport à la transfection avec pAEV11 concatémérisé.PAEV2LTR DNA can be transfected into chicken fibroblasts without prior digestion. After cotransfection with DNA carrying the sequences of the RAV2 helper virus, the fibroblasts produce virions of the AEV type and undergo a detectable oncogenic transformation approximately 15 days after the transfection. It is noted that transfection with pAEV2LTR very clearly increases the efficiency of viral production compared to transfection with concatimerized pAEV11.
Ainsi, pour induire la transformation oncogène d'une culture de fibroblaste, environ 25 μg de pAEV11 concatémérisé sont nécessaires, alors que l'on obtient le même résultat avec 10 μg de pAEV2LTR. De plus, la transformation oncogène des fibroblastes transfectés avec pAEV2LTR apparaît beaucoup plus vite qu'avec AEV11 concatémé Thus, to induce the oncogenic transformation of a fibroblast culture, approximately 25 μg of concatomerized pAEV11 are necessary, while the same result is obtained with 10 μg of pAEV2LTR. In addition, the oncogenic transformation of fibroblasts transfected with pAEV2LTR appears much faster than with concatenated AEV11
EXEMPLE 3 INSERTION DU GENE HUMAIN DE GLOBINE delta DANS LE GENOME DE L'AEVEXAMPLE 3 INSERTION OF THE HUMAN GENE OF GLOBIN delta into the AEV GENOME
a) Nature du fragment inséréa) Nature of the inserted fragment
Le fragment de globine delta est obtenu après digestion du plasmide pBRdeltaPst (figure 6 ) par EcoRI et isolement sur gradient de sucrose. Ce fragment d'ADN commence en amont par une séquence dérivée du plasmide pBR322 (EcoRI-PstI d'environ 0,750 kb). Le fragment pBR est maintenu essentiellement dans le but de conserver un site EcoRI à l'extrémité 5' du fragment delta.The globin delta fragment is obtained after digestion of the plasmid pBRdeltaPst (FIG. 6) with EcoRI and isolation on a sucrose gradient. This DNA fragment begins upstream with a sequence derived from the plasmid pBR322 (EcoRI-PstI of approximately 0.750 kb). The pBR fragment is maintained essentially for the purpose of retaining an EcoRI site at the 5 'end of the delta fragment.
La structure spécifique de la région delta s'étend du site PstI jusqu'au site EcoRI. Dans cette séquence, le gène delta proprement dit débute à 460 pb en aval du site PstI. Ce site appelé "cap" est le point d'initiation de la transcription des ARN messagers delta. 30 pb en amont du site "cap" se trouve la séquence CATAAAAG, qui est l'homologue de la séquence "TATA". Tandis que l'homologue de la deuxième séquence consensus "CAT" rencontrée dans la majorité des gènes d'eucaryotes entre 70 et 80 pb en amont du site cap semble modifiée dans le cas du gène delta (AACCAAC). Les deux séquences consensus TATA et CAT sont impliquées dans la régulation de la transcription des gènes eucaryotiques transcrits par l'ARN polymérase II. La région transcrite comprend respectivement en allant du site cap de 5' vers 3' : - une séquence "leader" couvrant 50 pb,The specific structure of the delta region extends from the PstI site to the EcoRI site. In this sequence, the delta gene proper begins at 460 bp downstream from the PstI site. This site called "cap" is the initiation point for the transcription of delta messenger RNAs. 30 bp upstream of the "cap" site is the CATAAAAG sequence, which is the counterpart of the "TATA" sequence. While the homolog of the second consensus sequence "CAT" encountered in the majority of eukaryotic genes between 70 and 80 bp upstream of the cap site seems modified in the case of the delta gene (AACCAAC). The two consensus sequences TATA and CAT are involved in the regulation of the transcription of eukaryotic genes transcribed by RNA polymerase II. The transcribed region includes respectively going from the cap site from 5 'to 3': - a "leader" sequence covering 50 bp,
- le premier exon (93 pb),- the first exon (93 bp),
- le premier intron (128 pb),- the first intron (128 bp),
- le deuxième exon (221 pb), - le deuxième intron (889 pb),- the second exon (221 bp), - the second intron (889 bp),
- les cinquante premières paires de bases du troisième exon.- the first fifty base pairs of the third exon.
De ce fait, l'extrémité 3' du gène est écourtée à partir du site EcoRI. La conséquence de cette délétion est l'élimination de 75 pb du 3ème exon et de toute la région 3' non codante portant entre autre le signal de polydénylation (AAUAAA) situé à 18 pb ayant le site de terminaison de la transcription. b) Clonage du fragment pBRdeltaEcoRI dans pAEV2LTR L'ensemble des séquences pBR et delta donne lieu à un fragment EcoRI-EcoRI de 2,6 kb qui est inséré dans l'un des sites EcoRI de pAEV2LTR. L'identification des clones pAEV2LTR qui ont subi cette insertion a été réalisée par la technique de transfert des colonies bactériennes sur filtre. Seules les colonies qui présentent une hybridation positive à la fois avec la sonde d'ADN de globine delta et la sonde d'ADN gag- erbA sont retenues. Sur 800 colonies analysées, 24 répondaient à ces critères. Le site d'insertion et l'orientation du fragment delta sont ensuite déterminés par cartographie de restriction des plasmides contenus dans ces bactéries positives.Therefore, the 3 'end of the gene is shortened from the EcoRI site. The consequence of this deletion is the elimination of 75 bp of the 3rd exon and of all the 3 'non-coding region carrying inter alia the polydenylation signal (AAUAAA) located at 18 bp having the transcription termination site. b) Cloning of the pBRdeltaEcoRI fragment into pAEV2LTR All of the pBR and delta sequences give rise to a 2.6 kb EcoRI-EcoRI fragment which is inserted into one of the EcoRI sites of pAEV2LTR. The identification of the pAEV2LTR clones which have undergone this insertion was carried out by the technique of transfer of the bacterial colonies on a filter. Only the colonies which exhibit positive hybridization with both the globin delta DNA probe and the gagerbA DNA probe are retained. Out of 800 colonies analyzed, 24 met these criteria. The insertion site and the orientation of the delta fragment are then determined by restriction mapping of the plasmids contained in these positive bacteria.
Parmi les nombreuses combinaisons possibles, seuls les plasmides recombinants ayant inséré le gène de globine au site EcoRI situé à l'extrémité du gène v-erbB, dans les deux orientations possibles, ont été retenus (figure 7). Ces recombinants sont appelés pAEV2LTRdelta(28) dans le cas où le sens de transcription du gène est orienté dans la même direction que celle du virus et pAEV2LTRdelta(17) dans le cas de l'orientation inverse.Among the many possible combinations, only the recombinant plasmids having inserted the globin gene at the EcoRI site located at the end of the v-erbB gene, in the two possible orientations, were retained (FIG. 7). These recombinants are called pAEV2LTRdelta (28) in the case where the direction of transcription of the gene is oriented in the same direction as that of the virus and pAEV2LTRdelta (17) in the case of the reverse orientation.
Sur les 24 clones ayant incorporé le fragment, deux étaient de type pAEV2LTRdelta(28) et 4 étaient de type pAEV2LTRdelta(17). Les clones pAEV2LTRdelta présentent donc 3 sites EcoRI que nous identifierons de gauche à droite respectivement sous les noms : EcoRI (1), EcoRI (2), EcoRI (3). c) Structure du plamide pAEV2LTRdelta(28) L'insertion du fragment portant le gène delta au site EcoRI unique de l'AEV interrompt la structure normale du gène v-erbB (figure 8,a). Le résultat de cette insertion se traduit par la création d'un nouveau codon de terminaison (UGA) pour la protéine ErbB, situé à 1 pb en aval du site EcoRI (2). En conséquence, la protéine erbB du mutant AEVdelta(28) doit présenter 12 acides aminés de moins dans la région C terminale.Of the 24 clones which incorporated the fragment, two were of the pAEV2LTRdelta type (28) and 4 were of the pAEV2LTRdelta type (17). The pAEV2LTRdelta clones therefore have 3 EcoRI sites which we will identify from left to right respectively under the names: EcoRI (1), EcoRI (2), EcoRI (3). c) Structure of the pAEV2LTRdelta plamide (28) The insertion of the fragment carrying the delta gene at the unique EcoRI site of the AEV interrupts the normal structure of the v-erbB gene (FIG. 8, a). The result of this insertion results in the creation of a new termination codon (UGA) for the ErbB protein, located 1 bp downstream of the EcoRI site (2). Consequently, the erbB protein of the AEVdelta mutant (28) must have 12 fewer amino acids in the C-terminal region.
Les signaux d'arrêt de transcription et de polyadénylation étant supprimés dans le fragment Pstl-EcoRI inséré, ce sont les structures virales localisées dans la séquence LTR de droite qui devront vraisemblablement remplir ces fonctions. d) Structure du plasmide pAEV2LTdelta(17) L'insertion du fragment delta en sens inverse de celui de la transcription du virus engendre, là encore, un décalage de la phase de lecture du gène v-erbB. Un nouveau codon de terminaison est créé à 75 pb en aval du site EcoRI (figure8,b). Il en résulte que la protéine erbB de ce mutant doit théoriquement renfermer dans la région C terminale 72 acides aminés de plus que la protéine erbB du virus sauvage. Dans ce génome viral recombinant, le brin viral qui transcrit l'ARN génomique (brin +) porte le brin anti-codant du gène delta. Dans cette disposition, le brin anti-codant du gène delta fait apparaître deux séquences qui rappellent des signaux de polyadénylation (AAUAAA) à 93 pb et 800 pb en aval du site EcoRI(2) (figure 9b). Dans cette construction, le promoteur propre du gène situé en amont du site cap n'est plus porté sur le brin viral transcrit.Since the transcription and polyadenylation stop signals are suppressed in the inserted Pstl-EcoRI fragment, it is the viral structures located in the right LTR sequence which will probably have to fulfill these functions. d) Structure of the plasmid pAEV2LTdelta (17) The insertion of the delta fragment in the opposite direction to that of the transcription of the virus again generates a shift in the reading phase of the v-erbB gene. A new termination codon is created at 75 bp downstream from the EcoRI site (FIG. 8, b). As a result, the erbB protein of this mutant should theoretically contain in the terminal C region 72 amino acids more than the erbB protein of the wild virus. In this recombinant viral genome, the viral strand which transcribes the genomic RNA (strand +) carries the anti-coding strand of the delta gene. In this arrangement, the anti-coding strand of the delta gene reveals two sequences which recall polyadenylation signals (AAUAAA) at 93 bp and 800 bp downstream of the EcoRI site (2) (FIG. 9b). In this construction, the promoter proper to the gene located upstream of the cap site is no longer carried on the viral strand transcribed.
EXEMPLE 4EXAMPLE 4
CARACTERISATION DES DIFFERENTS VECTEURS Tous les plasmides recombinants obtenus par recombinaison "in vitro" sont caractérisés par cartographie de restriction et hybridation avec une sonde spécifique du gène de globine delta. Les ADN plasmidiens des différents clones retenus, pAEV2LTR, pAEV2LTRdelta(28), pAEV2LTRdelta(17) , sont préparés par la technique de lyse alcaline (MANIATIS et al. 1982), digérés respectivement par les 4 enzymes de restriction suivants : EcoRI, BamHI, PstI et Sali. Les fragments de digestion sont séparés sur un gel d'agarose et visualisés en lumière U.V. L'ADN est ensuite dénaturé dans le gel puis transféré sur un filtre. Le filtre est hybride avec une sonde deltaPst marquée au 32P par translation de coupure. Les bandes correspondant aux fragments portant le gène sont révélées par exposition en autoradiographie. Pour chaque recombinant les tailles des fragments résultant des 4 digestion (EcoRI, BamHI,CHARACTERIZATION OF THE DIFFERENT VECTORS All the recombinant plasmids obtained by "in vitro" recombination are characterized by restriction mapping and hybridization with a probe specific for the globin delta gene. The plasmid DNAs of the different clones selected, pAEV2LTR, pAEV2LTRdelta (28), pAEV2LTRdelta (17), are prepared by the alkaline lysis technique (MANIATIS et al. 1982), digested respectively by the following 4 restriction enzymes: EcoRI, BamHI, PstI and Sali. The digestion fragments are separated on an agarose gel and visualized in UV light. The DNA is then denatured in the gel and then transferred to a filter. The filter is hybrid with a deltaPst probe labeled with 32 P by cut translation. The bands corresponding to the fragments carrying the gene are revealed by exposure in autoradiography. For each recombinant, the sizes of the fragments resulting from the 4 digestion (EcoRI, BamHI,
PstI et Sali) sont déduites des tailles des fragments du marqueur de poids moléculaire utilisé (ADN du phage lambda digéré par HindIII).PstI and Sali) are deduced from the sizes of the fragments of the molecular weight marker used (lambda phage DNA digested with HindIII).
A l'issue de ces analyses, on constate que : 1°) les tailles des fragments résultant des diverses digestions concordent pour chaque recombinant avec les tailles attendues ; 2°) l'hybridation par la sonde deltaPst ne révèle que les fragments porteurs de la séquence delta, présentant là aussi des tailles attendues.At the end of these analyzes, it can be seen that: 1) the sizes of the fragments resulting from the various digestions agree for each recombinant with the expected sizes; 2) hybridization with the deltaPst probe reveals only the fragments carrying the delta sequence, again showing expected sizes.
De ces deux constatations, on peut conclure que les clones recombinants retenus sont conformes aux constructions recherchées.From these two observations, it can be concluded that the recombinant clones selected conform to the constructions sought.
EXEMPLE 5 TRANSFERT DU GENE DE GLOBINE delta PAR LES PARTICULES VIRALES AEVdelta(28) et AEVdelta(17) A) PRODUCTION DE VIRUSEXAMPLE 5 TRANSFER OF THE DELTA GLOBIN GENE BY THE VIRAL PARTICLES AEVdelta (28) and AEVdelta (17) A) VIRUS PRODUCTION
1) Transfection des ADN proviraux dans les fibroblastes de poulet Pour déterminer si les vecteurs recombinants construit produisent des virus transmissibles, le plasmide recombinant pAEV2LTR et ses dérivés pAEV2LTRdelta(28) et pAEV2LTRdelta(17) ont été transfectés séparément en présence d'ADN du virus assistant (pRAV2) dans des cultures secondaires de fibroblastes embryonnaires de poulet.1) Transfection of Proviral DNAs into Chicken Fibroblasts To determine whether the recombinant vectors constructed produce transmissible viruses, the recombinant plasmid pAEV2LTR and its derivatives pAEV2LTRdelta (28) and pAEV2LTRdelta (17) were transfected separately in the presence of DNA from the virus. assistant (pRAV2) in secondary cultures of chicken embryonic fibroblasts.
Les cellules ont été maintenues en milieu liquide et repiquées régulièrement. Le changement morphologique caractéristique de la transformation des fibroblastes par l'AEV est apparu à partir du 4ème passage (2ème semaine) pour les trois virus. Après ensemencement dans de la gélose molle, ces cellules produisent des colonies de fibroblastes transformés. Les surnageants des cultures transformées ont été récupérés afin de constituer des stocks de virus et utilisés pour infecter des fibroblastes secondaires frais dont ils induisent la transformation oncogène visible au bout d'une semaine environ. Ceci démontre que des particules virales ont été produites par les cellules transfectées par les ADN de virus recombinants, ces particules sont infectieuses et ont conservé leur pouvoir oncogène. On appellera AEVdelta(17) et AEVdelta(28) les virus produits respectivement à partir des plasmides pAEV2LTRdelta(17) et pAEV2LTRdelta(28).The cells were maintained in a liquid medium and transplanted regularly. The morphological change characteristic of the transformation of fibroblasts by AEV appeared from the 4th passage (2nd week) for the three viruses. After seeding in soft agar, these cells produce colonies of transformed fibroblasts. The supernatants of the transformed cultures were collected in order to constitute stocks of virus and used to infect fresh secondary fibroblasts whose visible oncogenic transformation they induce after approximately one week. This demonstrates that viral particles have been produced by cells transfected with the DNA of recombinant viruses, these particles are infectious and have retained their power oncogene. The viruses produced from the plasmids pAEV2LTRdelta (17) and pAEV2LTRdelta (28) will be called AEVdelta (17) and AEVdelta (28).
2) Titrage des virus récupérés Les stocks de virus AEVdelta(17) et AEVdelta(28) ont été titrés pour leur pouvoir transformant selon la technique de dénombrement de foyers de transformation. Pour cela, 1 ml de suspension virale diluée a été inoculé sur des cultures de fibroblastes frais. Les cultures sont ensuite recouvertes d'agar afin de permettre le développement de foyers de transformation. Le titre, du virus est donné par le nombre de foyers de transformation par boîte multiplié par la dilution de la suspension de virus inoculé. Le titre est exprimé en F.F.U. (Focus Forming Unit) par ml. Le virus AEVdelta(28) récupéré à partir des cellules transfectées présentait un titre de 5.104 FFU/ml, supérieur à celui du virus AEVdelta(17) (2.104 FFU/ml).2) Titration of the recovered viruses The stocks of AEVdelta (17) and AEVdelta (28) viruses were titrated for their transforming power according to the technique of counting processing foci. For this, 1 ml of diluted viral suspension was inoculated on cultures of fresh fibroblasts. The cultures are then covered with agar in order to allow the development of processing centers. The titer of the virus is given by the number of foci of transformation per dish multiplied by the dilution of the suspension of inoculated virus. The titer is expressed in FFU (Focus Forming Unit) per ml. The AEVdelta virus (28) recovered from the transfected cells had a titer of 5.10 4 FFU / ml, higher than that of the AEVdelta virus (17) (2.10 4 FFU / ml).
Le virus sauvage AEVwt, produit dans des conditions similaires, présente généralement un titre voisin de 5.105 FFU/ml.The wild-type AEVwt virus, produced under similar conditions, generally has a titer close to 5.10 5 FFU / ml.
Afin de vérifier la stabilité des virus recombinants, les virus sont maintenus sur des cultures de fibroblastes de poulet pendant des durées variables. Pour cela, les stocks originaux, dérivés des cultures transfectées, ont été inoculés à des cultures de fibroblastes frais qui ont subi ensuite deux repiquages à l'issue desquels les surnageants de culture ont été collectés pour constituer les stocks viraux II. Les virus des stocks II ont ensuite été propagés à nouveau sur fibroblastes frais pendant deux repiquages, à l'issue desquels on a collecté le stock viral III.In order to verify the stability of the recombinant viruses, the viruses are maintained on cultures of chicken fibroblasts for variable durations. For this, the original stocks, derived from the transfected cultures, were inoculated into cultures of fresh fibroblasts which then underwent two subcultures at the end of which the culture supernatants were collected to constitute the viral stocks II. The viruses of stocks II were then propagated again on fresh fibroblasts during two subcultures, at the end of which the viral stock III was collected.
Les titres des virus dans les stocks II et III ont été déterminés et sont présentés dans le tableau I.
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The virus titers in stocks II and III have been determined and are presented in Table I.
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On constate d'une manière générale une réduction du titre du virus au cours des passages successifs. Bien que l'AEVwt n'ait pas été testé en parallèle l'expérience de l'utilisation de ce virus montre que son titre reste sensiblement stable après plusieurs passages sur culture cellulaire.There is generally a reduction in the titer of the virus during successive passages. Although AEVwt has not been tested in parallel, experience with the use of this virus shows that its titer remains substantially stable after several passages in cell culture.
B) ANALYSE DES ARN VIRAUX TRANSCRITS DANS LES CELLULES INFECTEES ET ENCAPSIDES DANS LES VIRIONSB) ANALYSIS OF VIRAL RNA TRANSCRIBED IN INFECTED CELLS AND ENCAPSIDES IN VIRIONS
Des fibroblastes embryonnaires de poulet ont été infectés par les virus AEVwt, AEVdelta(17) et AEVdelta(28). Lorsque les cultures présentaient une majorité de cellules transformées, les surnageants des cultures et les cellules ont été récupérés séparément.Chicken embryonic fibroblasts have been infected with the AEVwt, AEVdelta (17) and AEVdelta (28) viruses. When the cultures had a majority of transformed cells, the culture supernatants and the cells were recovered separately.
A partir des surnageants, on collecte des virions par centrifugation. Les ARN ont été extraits respectivement des virions et des cellules. Les ARN cellulaires ont été séparés sur oligodT cellulose en ARN polyA et polyA-. Les ARN polyA cellulaires et les ARN totaux des virions ont été fractionnés en electrophorèse sur agarose et transférés sur filtre de nitrocellulose. Les filtres ont été hybrides successivement avec différentes sondes représentées dans la figure 9. Après exposition en autoradiographie et révélation, les tailles des bandes observées ont été résumées dans le tableau II.From the supernatants, virions are collected by centrifugation. The RNAs were extracted from virions and cells respectively. The cellular RNAs were separated on oligodT cellulose into polyA and polyA- RNA. The cellular polyA RNAs and the total RNAs of the virions were fractionated by electrophoresis on agarose and transferred to a nitrocellulose filter. Filters have were successively hybridized with different probes shown in FIG. 9. After exposure to autoradiography and revelation, the sizes of the bands observed were summarized in Table II.
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Le tableau donne les tailles des bandes identifiées par les différentes sondes, dans les fibroblastes infectés par AEVwt, AEVdelta(17) et AEVdelta(28). Les valeurs signalées par un astérisque (*) correspondent à des transcrits présents à la fois dans les ARN polyA cellulaires et dans les ARN des virions.The table gives the sizes of the bands identified by the different probes, in the fibroblasts infected with AEVwt, AEVdelta (17) and AEVdelta (28). The values indicated by an asterisk (*) correspond to transcripts present both in cellular polyA RNA and in RNA of virions.
Ce tableau démontre l'obtention de virions porteurs de l'ARN du gène humain globine delta, de même que d'une partie de l'ARN correspondant au vecteur plasmidique pBR. C) ANALYSE DES PROVIRUS INTEGRES DANS LES FIBROBLASTES INFECTES PAR LES VIRUS RECOMBINANTSThis table demonstrates the obtaining of virions carrying the RNA of the human globin delta gene, as well as a part of the RNA corresponding to the plasmid vector pBR. C) ANALYSIS OF PROVIRUSES INTEGRATED IN FIBROBLASTS INFECTED WITH RECOMBINANT VIRUSES
1) But de la recherche de l'ADN proviral1) Purpose of proviral DNA research
L'ADN proviral représente, à l'exception des LTR, une copie parfaite de l'ARN génomique à partir duquel il est synthétisé. L'analyse du provirus doit donc fournir des informations sur la structure du génome viral transféré dans ces cellules. Cette analyse appliquée aux mutants AEVdelta(17) et AEVdelta(28) doit permettre de vérifier si ces virus sont capables de transférer, dans l'ADN des cellules infectées, les gènes qui ont été greffés dans leur génome. Elle permet aussi de savoir si ces gènes sont transmis intégralement ou si des modifications structurales sont survenues au cours des différents cycles de développement des virus.With the exception of LTRs, proviral DNA represents a perfect copy of the genomic RNA from which it is synthesized. The analysis of the provirus must therefore provide information on the structure of the viral genome transferred into these cells. This analysis applied to the AEVdelta (17) and AEVdelta (28) mutants should make it possible to verify whether these viruses are capable of transferring, into the DNA of the infected cells, the genes which have been grafted into their genome. It also makes it possible to know whether these genes are transmitted in full or whether structural changes have occurred during the different development cycles of viruses.
2) Identification des séquences d'ADN proviral L'existence dans l'ADN de fibroblastes de poulet de séquences c-erb apparentées aux séquences oncogènes virales est révélée après hybridation avec les sondes d'origine virale. Ces séquences c-erb se distinguent des séquences v-erb par leur cartographie de restriction.2) Identification of the proviral DNA sequences The existence in the DNA of chicken fibroblasts of c-erb sequences related to the viral oncogenic sequences is revealed after hybridization with the probes of viral origin. These c-erb sequences are distinguished from v-erb sequences by their restriction mapping.
3) Analyse des provirus3) Analysis of proviruses
Des cultures de fibroblastes embryonnaires de poulet ont été infectées séparément par AEVwt, AEVdelta(17) et AEVdelta(28). Après apparition du phénotype transformé, les cellules sont trypsinées et lysées pour en extraire l'ADN total. L'ADN est purifié et digéré par les enzymes de restriction EcoRI ou BamHI. Les produits de digestion ont été séparés sur gel d'agarose, dénaturés puis transférés sur filtres. Les filtres ont été hybridés successivement par les sondes erbB et deltaPst. Les bandes ont été révélées après exposition en autoradiographie de 5 à 10 jours. Les bandes relatives aux génomes proviraux AEVdelta(17) et AEVdelta(28) sont identifiées par comparaison avec les diagrammes d'ADN provenant de cellules infectées par l'AEVwt.Cultures of chicken embryonic fibroblasts were infected separately with AEVwt, AEVdelta (17) and AEVdelta (28). After the appearance of the transformed phenotype, the cells are trypsinized and lysed to extract the total DNA therefrom. The DNA is purified and digested with the restriction enzymes EcoRI or BamHI. The digestion products were separated on agarose gel, denatured and then transferred to filters. The filters were successively hybridized with the erbB and deltaPst probes. The tapes were revealed after exposure in autoradiography from 5 to 10 days. The bands relating to the proviral genomes AEVdelta (17) and AEVdelta (28) are identified by comparison with the DNA diagrams from cells infected with AEVwt.
D) INTERPRETATION DES RESULTATS ; STRUCTURE DES PROVIRUS ET TRANSCRIPTION DES ARN VIRAUXD) INTERPRETATION OF RESULTS; STRUCTURE OF PROVIRUSES AND TRANSCRIPTION OF VIRAL RNAs
Les tailles des bandes caractéristiques de chaque provirus ont été résumées dans le tableau IV. L'interprétation de ces bandes peut être réalisée en considérant la cartographie de restriction des provirus portée sur la figure 10. Sur le tableau III on a porté la taille théorique des bandes attendues à partir des génomes viraux qui ont été construits. Pour le virus AEVdelta(28), on a considéré que l'intron2 du gène delta a été éliminé.The sizes of the characteristic bands of each provirus have been summarized in Table IV. The interpretation of these bands can be carried out by considering the restriction mapping of the proviruses shown in FIG. 10. In Table III, the theoretical size of the bands expected from the viral genomes which have been constructed is plotted. For the AEVdelta virus (28), it is considered that the intron2 of the delta gene has been eliminated.
TABLEAU IIITABLE III
TAILLES (kb) THEORIQUES DES FRAGMENTS OBTENUS APRES DIGESTION DES PROVIRUS AEVdelta(17) ET AEVdelta(28) SOIT PAR BamHI, SOIT PAR EcoRI ET RECONNUS PAR LES SONDES VIRALES erbB OU DE GLOBINE deltaPstTHEORETICAL SIZES (kb) OF FRAGMENTS OBTAINED AFTER DIGESTION OF THE AEVdelta (17) AND AEVdelta (28) PROVIRUS EITHER BY BamHI, EITHER BY EcoRI AND RECOGNIZED BY THE erbB OR GLOBIN DELTAPst VIRAL PROBES
(Ces tailles ont été calculées à partir des plasmides pAEV2LTRdelta(28) et pAEV2LTRdelta (17). On a considéré que le provirus a perdu l'intron2 et éventuellement l'intron 1 du gène delta).(These sizes were calculated from the plasmids pAEV2LTRdelta (28) and pAEV2LTRdelta (17). The provirus was considered to have lost intron2 and possibly intron 1 of the delta gene).
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TABLEAU IV
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TABLE IV
TAILLES (kb) DES ADN DES PROVIRUS AEVdelta(17) ET AEVdelta (28) APRES CARTOGRAPHIE DE RESTRICTION (figure 10)SIZES (kb) OF THE DNAS OF THE AEVdelta (17) AND AEVdelta (28) PROVIRUSES AFTER RESTRICTION MAPPING (Figure 10)
(Les valeurs signalées par un astérisque (*) correspondent aux tailles des fragments attendus après digestion par EcoRI et par BamHI).(The values indicated by an asterisk (*) correspond to the sizes of the fragments expected after digestion with EcoRI and with BamHI).
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Les corrélations entre ces deux tableaux démontrent la présence des segments d'ADN des provirus renfermant des séquences de globine delta humaine.The correlations between these two tables demonstrate the presence of the DNA segments of the proviruses containing human delta globin sequences.
A partir du génome de l'AEV clone dans un plasmide, on a donc construit par recombinaison génétique "in vitro" un génome d'AEV renfermant des séquences du gène humain de globine delta. Après transfection de l'ADN viral recombinant dans des fibroblastes de poulet en culture, on obtient des virions infectieux qui renferment un génome viral portant les séquences humaines delta. Après infection de fibroblastes frais de poulet par ces virions, on observe que les cellules intègrent dans leur génome une information génétique nouvelle représentée par le gène humain de globine delta. EXEMPLE 6 STABILITE DES GENES TRANSFERESFrom the genome of the AEV cloned into a plasmid, an AEV genome was therefore constructed by genetic recombination "in vitro" containing sequences of the human gene for globin delta. After transfection of the recombinant viral DNA into cultured chicken fibroblasts, infectious virions are obtained which contain a viral genome carrying the human delta sequences. After infection of fresh chicken fibroblasts with these virions, it is observed that the cells integrate into their genome new genetic information represented by the human gene for globin delta. EXAMPLE 6 STABILITY OF THE TRANSFER GENES
1) Elimination des introns des gènes transférés Lorsque le gène delta est inséré dans l'ADN viral, dans une orientation telle que le brin codant du gène delta coïncide avec le brin codant viral, on observe une perte plus ou moins rapide des introns du gène delta qui conduit à la stabilisation de génomes viraux ne portant plus que les séquences codantes de delta.1) Elimination of the introns of the transferred genes When the delta gene is inserted into the viral DNA, in an orientation such that the strand coding for the delta gene coincides with the viral coding strand, a more or less rapid loss of the introns of the gene is observed delta which leads to the stabilization of viral genomes carrying only the delta coding sequences.
La perte des introns n'est pas observée lorsque le gène delta est inséré en orientation inverse dans le génome d'AEV. Il faut en conclure que les introns sont vraisemblablement éliminés par des phénomènes classiques d'épissage dans les ARN viraux qui sont transcrits au cours des cycles successifs d'infection virale. 2) Taille des génomes encapsldésThe loss of introns is not observed when the delta gene is inserted in reverse orientation into the AEV genome. It must be concluded from this that the introns are probably eliminated by conventional phenomena of splicing in the viral RNAs which are transcribed during the successive cycles of viral infection. 2) Size of the encapsulated genomes
Les virions AEVdelta(28) peuvent encapsider un génome de 7 kb alors que le génome d'AEVwt ne représente que 5,4 kb. Cette expérience démontre qu'il est possible de transférer au moyen de ce vecteur des séquences d'au moins 1,6 kb. On constate que dans les virions AEVdelta ( 17) l 'ARN génomique de 8 kb n 'est pas décelable . Ce défaut d'encapsidation peut résulter, soit d'une taille trop importante du génome viral, soit d'une modification de la structure secondaire du génome viral due à la présence du gène delta.The AEVdelta virions (28) can encapsulate a genome of 7 kb while the genome of AEVwt represents only 5.4 kb. This experiment demonstrates that it is possible to transfer using this vector sequences of at least 1.6 kb. It is noted that in the AEVdelta (17) virions the 8 kb genomic RNA is not detectable. This lack of packaging can result either from an excessively large size of the viral genome, or from a modification of the secondary structure of the viral genome due to the presence of the delta gene.
3) Stabilité des gènes transférés Lorsque le gène delta est inséré en sens direct, on ne discerne pas de remaniements majeurs au niveau des séquences codantes de ce gène dans les provirus intégrés dans les cellules infectées.3) Stability of the transferred genes When the delta gene is inserted in the forward direction, no major changes are seen in the coding sequences of this gene in the proviruses integrated into the infected cells.
Après infection par AEVdelta(17), on observe l'intégration de provirus présentant des remaniements plus ou moins importants dans la région 5' du gène delta et dans les séquences pBR flanquantes EXEMPLE 7 SELECTION DES VIRUS POUR LEUR POUVOIR TRANSFORMANT DOMAINE FONCTIONNEL DE LA PROTEINE CODEE PAR V-erbB Les virus générés à partir des plasmides pAEV2LTRdelta(17) et pAEV2LTRdelta(28) induisent la transformation oncogène des fibroblastes de poulet "in vitro". Dans le stock viral AEVdelta (17), les seuls génomes détectés renferment au moins une partie des séquences pBR et delta insérées. Ces virus donnent naissance à une protéine erbB renfermant en région C-terminale 24 acides aminés de plus que la protéine sauvage. Cette mutation n'affecte donc pas le pouvoir transformant du produit du gène erbB.After infection with AEVdelta (17), the integration of proviruses exhibiting more or less significant changes in the 5 ′ region of the delta gene and in the flanking pBR sequences is observed. EXAMPLE 7 SELECTION OF VIRUSES FOR THEIR TRANSFORMING POWER FUNCTIONAL AREA OF THE PROTEIN CODED BY V-erbB The viruses generated from the plasmids pAEV2LTRdelta (17) and pAEV2LTRdelta (28) induce the oncogenic transformation of chicken fibroblasts "in vitro". In the AEVdelta viral stock (17), the only genomes detected contain at least part of the inserted pBR and delta sequences. These viruses give rise to an erbB protein containing in the C-terminal region 24 amino acids more than the wild-type protein. This mutation therefore does not affect the transforming power of the erbB gene product.
Dans le stock viral AEVdelta(28), on trouve en abondance un génome viral recombinant ayant conservé les séquences pBR et les séquences codantes du gène delta. On ne peut exclure la présence de génomes ayant délété ces séquences et dont la structure se rapprocherait de celle du génome sauvage. La persistance du génome recombinant dans certains virions suggère que ces virions bénéficient d'un avantage sélectif de production qui pourrait être lié à leur pouvoir oncogène. Dans ces génomes recombinants, le gène v-erbB présente par rapport au gène sauvage, une modification structurale qui provoque un arrêt prématuré de la traduction de la protéine (fig.8). La protéine erbB produite par AEVdelta(28) ne renferme pas les 12 acides aminés C-terminaux normalement observés dans la protéine sauvage. Si AEVdelta(28) est capable de transformer les fibroblastes "in vitro", il faut en conclure que ces 12 acides aminés C-terminaux ne jouent pas un rôle essentiel dans le pouvoir transformant de la protéine erbB.In the viral stock AEVdelta (28), there is an abundance of a recombinant viral genome having conserved the pBR sequences and the coding sequences of the delta gene. We cannot exclude the presence of genomes which have deleted these sequences and whose structure is similar to that of the wild genome. The persistence of the recombinant genome in certain virions suggests that these virions benefit from a selective production advantage which could be linked to their oncogenic power. In these recombinant genomes, the v-erbB gene presents, compared to the wild-type gene, a structural modification which causes a premature stop of the translation of the protein (fig. 8). The erbB protein produced by AEVdelta (28) does not contain the 12 C-terminal amino acids normally observed in the wild-type protein. If AEVdelta (28) is capable of transforming fibroblasts "in vitro", it must be concluded that these 12 C-terminal amino acids do not play an essential role in the transforming power of the erbB protein.
Ces observations démontrent qu'il est possible d'insérer des séquences nucléotidiques étrangères au site EcoRI du gène v-erbB tout en conservant le pouvoir oncogène et sélectif du virus.These observations demonstrate that it is possible to insert nucleotide sequences foreign to the site. EcoRI of the v-erbB gene while retaining the oncogenic and selective power of the virus.
Dans les génomes d'AEVdelta(17) et d'AEVdelta(28), le gène delta est associé à ses propres séquences renfermant notamment les signaux de contrôle de transcription. Dans les deux types de provirus, on n'observe pas d'initiation de transcription au niveau du promoteur du gène. Tous les transcrits semblent initiés au niveau du promoteur viral situé dans la LTR de gauche.In the genomes of AEVdelta (17) and AEVdelta (28), the delta gene is associated with its own sequences, in particular containing the transcription control signals. In both types of proviruses, no transcription initiation is observed at the level of the gene promoter. All the transcripts seem to be initiated at the level of the viral promoter located in the LTR on the left.
Pour expliquer ces résultats, plusieurs hypothèses peuvent être proposées parmi lesquelles on retiendra essentiellement les trois suivantes :To explain these results, several hypotheses can be proposed, of which the following three are essentially retained:
1 ) Le gène de globine delta est peu exprimé dans les cellules érythrocytiques humaines et on peut imaginer que son promoteur est peu actif. 2) La transcription à partir des provirus a été analysée dans des fibroblastes dans lesquels les gènes endogènes de globine ne sont normalement pas transcrits.1) The globin delta gene is little expressed in human erythrocytic cells and one can imagine that its promoter is not very active. 2) Transcription from proviruses has been analyzed in fibroblasts in which the endogenous globin genes are not normally transcribed.
3) Des travaux récents de CULLEN et al. (1984) montrent que la LTR de gauche fonctionnelle d'un provirus exerce un effet inhibiteur sur l'initiation de transcription à partir d'un promoteur situé à proximité en aval. On peut penser que ce phénomène est identique à celui que nous observons dans le provirus AEVdelta(28).3) Recent work by CULLEN et al. (1984) show that the functional left LTR of a provirus exerts an inhibitory effect on the initiation of transcription from a promoter located nearby downstream. We may think that this phenomenon is identical to that which we observe in the AEVdelta provirus (28).
Les exemples suivants concernent des virus vecteurs non oncogènes, les matériels et les méthodes mis en oeuvre sont légèrement différents de ceux mis en oeuvre dans les exemples précédents. MATERIELS ET METHODESThe following examples relate to non-oncogenic vector viruses, the materials and methods used are slightly different from those used in the previous examples. MATERIALS AND METHODS
1) SOUSCLONES DES ADN DE L'AEV1) AEV DNA SUBCLONES
Un fragment SalI-BamHI (1,2 kb) qui couvre la région située entre les gènes v-erbA et v-erbB est inséré entre les sites Sali et BamHI du plasmide pBR322. La structure de ce clone (perb1) est présentée dans la figure 11.A SalI-BamHI fragment (1.2 kb) which covers the region between the v-erbA and v-erbB genes is inserted between the SalI and BamHI sites of the plasmid pBR322. The structure of this clone (perb1) is presented in Figure 11.
Le clone pJS21 résulte du clonage d'un fragment EcoRI-BamHI (1,8 kb) qui couvre la région 5' virale de pAEV11, entre les sites EcoRI et BamHI de pBR322 (figure 12)The clone pJS21 results from the cloning of an EcoRI-BamHI fragment (1.8 kb) which covers the 5 ′ viral region of pAEV11, between the EcoRI and BamHI sites of pBR322 (FIG. 12)
Le recombinant pAG50 a été construit par COLBERE-GARAPIN et al. (1981). Il contient un fragment BglII-HincII (1,1 kb) dérivé du transposon procaryotique Tn5 dans lequel se trouve le gène structural de résistance à la néomycine, Neor, dépourvu de son propre promoteur (figure 13) (BECK et al., 1982).The recombinant pAG50 was constructed by COLBERE-GARAPIN et al. (nineteen eighty one). It contains a BglII-HincII fragment (1.1 kb) derived from the prnaryotic transposon Tn5 in which is found the structural gene for resistance to neomycin, Neo r , devoid of its own promoter (FIG. 13) (BECK et al., 1982 ).
2) DIGESTION DES ADN PAR DES ENZYMES DE RESTRICTION2) DIGESTION OF DNA BY RESTRICTION ENZYMES
La digestion des ADN par les enzymes de restriction est réalisée comme décrit plus haut. Dans certains cas, les ADN digérés sont purifiés par extraction au phénol-chloroforme puis avec un mélange chloroformealcool isoamylique puis précipités à l'éthanol.Digestion of DNA by restriction enzymes is carried out as described above. In some cases, the digested DNAs are purified by extraction with phenol-chloroform and then with a chloroform / isoamyl alcohol mixture and then precipitated with ethanol.
3) TECHNIQUE DE LA DIGESTION DES ADN PAR LA NUCLEASE Bal313) TECHNIQUE OF DNA DIGESTION BY NUCLEASE Bal31
La nucléase Bal31 dégrade progressivement l'ADN bicaténaire linéaire à partir des extrémités 5' et 3' de chaque brin. Etant donnée une quantité définie d'ADN, la vitesse de digestion peut être contrôlée en fonction de la concentration de Bal31, de la température de réaction et du temps d'incubation. La spécificité de Bal31 nous permet d'éliminer, d'une façon successive, la séquence nucléotidique au sein de laquelle les sites de restriction utilisables sont absents. 12 μg de l'ADN de perbl linéarisé par BamHI sont incubés à 30°C en présence d'un tampon d'incubation contenant 12 mM CaCl2, 12 mM MgCl2, 600 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM Edta, et de 2,2 unités de Bal31. Les aliquotes (2 μg) sont prélevées au bout de 5, 10, 15, 20, 25 et 30 minutes respectivement. L'enzyme est inactivée par addition d'une solution contenant 0,5 % SDS et 25 mM Edta. Ensuite, les ADN digérés sont traités au phénol, précipités à l'alcool absolu froid puis soumis à une digestion par SalI, et, enfin, analysés par electrophorèse sur le gel de 1,6 % agarose. D'après la cinétique de cette réaction obtenue, la vitesse de dégradation d'une molécule est environ 30 nucléotides par minute.The Bal31 nuclease gradually degrades linear double-stranded DNA from the 5 'and 3' ends of each strand. Given a defined amount of DNA, the rate of digestion can be controlled as a function of the concentration of Bal31, the reaction temperature and the incubation time. The specificity of Bal31 allows us to successively eliminate the nucleotide sequence within which the usable restriction sites are absent. 12 μg of perbl DNA linearized with BamHI are incubated at 30 ° C. in the presence of an incubation buffer containing 12 mM CaCl 2 , 12 mM MgCl 2 , 600 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8) , 1 mM Edta, and 2.2 units of Bal31. The aliquots (2 μg) are taken after 5, 10, 15, 20, 25 and 30 minutes respectively. The enzyme is inactivated by the addition of a solution containing 0.5% SDS and 25 mM Edta. Then, the digested DNAs are treated with phenol, precipitated with cold absolute alcohol and then subjected to digestion with SalI, and, finally, analyzed by electrophoresis on the 1.6% agarose gel. According to the kinetics of this reaction obtained, the degradation rate of a molecule is around 30 nucleotides per minute.
En se basant sur le test préliminaire, 25 μg d'ADN perbl sont soumis à une digestion par Bal31 dans les conditions décrites ci-dessus pendant 15 minutes. Les ADN digérés sont ensuite purifiés et puis leurs extrémités sont réparées par le fragment de "Klenow" dérivé de la DNA polymérase I d'E. coli en présence des 4 nucléotides triphosphates (dATP, TTP, dCTP, dGTP).Based on the preliminary test, 25 μg of perbl DNA are subjected to digestion with Bal31 under the conditions described above for 15 minutes. The digested DNAs are then purified and then their ends are repaired by the "Klenow" fragment derived from DNA polymerase I of E. coli in the presence of the 4 nucleotide triphosphates (dATP, TTP, dCTP, dGTP).
4) ISOLEMENT DES FRAGMENTS D'ADN DE DIFFERENTES TAILLES4) ISOLATION OF DNA FRAGMENTS OF DIFFERENT SIZES
Le mélange des fragments d'ADN de tailles variables est d'abord redissous dans l'eau bidistillée de façon à obtenir une concentration de 100 μg d'ADN par ml. La séparation électrophorétique est réalisée ensuite à 30 volts pendant une nuit (16 heures) sur gel d'agarose préparatif horizontal dont la concentration varie de 0,8 à 1,6 % selon les tailles des fragments à séparer. Des marqueurs de poids moléculaires, en général soit de l'ADN du bactériophage lambda digéré par l'endonucléase de restriction HindIII soit de l'ADN du plasmide pBR322 digéré par l'endonucléase de restriction AluI, sont soumis à electrophorèse parallèlement aux échantillons. La coloration du gel par bromure d'éthidium permet de visualiser les bandes d'ADN sous illumination ultra-violette. La région du gel contenant la bande des fragments d'ADN de tailles déterminée est découpée. LesThe mixture of DNA fragments of variable sizes is first redissolved in double-distilled water so as to obtain a concentration of 100 μg of DNA per ml. The electrophoretic separation is then carried out at 30 volts overnight (16 hours) on a horizontal preparative agarose gel, the concentration of which varies from 0.8 to 1.6% depending on the sizes of the fragments to be separated. Molecular weight markers, in general either of the DNA of the bacteriophage lambda digested by the restriction endonuclease HindIII or of the DNA of the plasmid pBR322 digested by the restriction endonuclease AluI, are subjected to electrophoresis in parallel with the samples. Staining of the gel with ethidium bromide makes it possible to visualize the DNA bands under ultraviolet illumination. The region of the gel containing the band of DNA fragments of determined sizes is cut out. The
ADN sont ensuite élues par la méthode de "Freeze Squeeze". Cette opération conduit à l'obtention des ADN prêts à être soumis à la ligation ou la digestion par les enzymes de restriction. 5) LIGATION DES FRAGMENTS D'ADN ET DES VECTEURS DE CLONAGEDNAs are then elected by the "Freeze Squeeze" method. This operation leads to obtaining the DNAs ready to be subjected to ligation or digestion by restriction enzymes. 5) LIGATION OF DNA FRAGMENTS AND CLONING VECTORS
La ligation des fragments d'ADN isolés et des ADN de vecteurs est réalisée selon la technique décrite précédemment.The ligation of the isolated DNA fragments and of the vector DNA is carried out according to the technique described above.
6) CLONAGE ET SELECTION DES PLASMIDES RECOMBINANTS La transformation des bactéries, la sélection des bactéries et l'analyse rapide des plasmides sont réalisées selon les techniques décrites précédemment6) CLONING AND SELECTION OF RECOMBINANT PLASMIDS The transformation of bacteria, the selection of bacteria and the rapid analysis of plasmids are carried out according to the techniques described above.
7) PREPARATION DES ADN PLASMIDIENS7) PREPARATION OF PLASMIDIAN DNA
Les ADN de plasmides sont isolés sur gradient de chlorure de césium comme décrit précédemment.The plasmid DNAs are isolated on a cesium chloride gradient as described above.
Dans certains cas, ces ADN sont ultérieurement purifiés sur coussin de NaCl afin d'éliminer les oligoribonucléotides contaminants (MANIATIS, 1982).In certain cases, these DNAs are subsequently purified on an NaCl cushion in order to remove the contaminating oligoribonucleotides (MANIATIS, 1982).
8) SEQUENCAGE Les fragments à séquencer sont clones dans les variants mp8 et mp11 du phage M13. Le séquençage des fragments est réalisé selon la méthode de SANGER et al., 1977.8) SEQUENCING The fragments to be sequenced are cloned into the mp8 and mp11 variants of the phage M13. The sequencing of the fragments is carried out according to the method of SANGER et al., 1977.
9) ATTACHEMENT D'OLIGONUCLEOTIDES SYNTHETIQUES "LINKERS" En cas d'absence de site de restriction compatible avec les extrémités cohésives du fragment d'ADN à cloner, l'emploi des oligonucléotides synthétiques "linkers" contenant la séquence du site de restriction permet de créer de nouveaux sites de clonage dans les vecteurs. 9.1) Phosphorylatlon des "linkers"9) ATTACHMENT OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES "LINKERS" In the absence of a restriction site compatible with the cohesive ends of the DNA fragment to be cloned, the use of synthetic oligonucleotides "linkers" containing the sequence of the restriction site create new cloning sites in vectors. 9.1) Phosphorylatlon of "linkers"
Pour introduire un site de restriction BglII dans le vecteur pXJ4 (figure 14), les "linkers" BglIITo introduce a BglII restriction site into the vector pXJ4 (FIG. 14), the BglII "linkers"
5'-d(CAGATCTG)-3' (BRL) sont choisis. 3 μg de "linkers" BglII sont phosphorylés à5'-d (CAGATCTG) -3 '(BRL) are chosen. 3 μg of BglII "linkers" are phosphorylated at
37°C pendant 30 minutes en présence d'une solution de37 ° C for 30 minutes in the presence of a solution of
100 μl composée de 1 μM ATP froid, de 30 μCuriesγ- 32P-ATP100 μl composed of 1 μM cold ATP, 30 μCuriesγ- 32 P-ATP
(5 000 μCuries/mole), d'un tampon contenant 60 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl, et 15 mM 2-mercaptoéthanol et de 80 unités de polynucléotide kinase de phage T4 (BRL).(5,000 μCuries / mole), a buffer containing 60 mM Tris-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl, and 15 mM 2-mercaptoethanol and 80 units of phage T4 polynucleotide kinase (BRL).
Les "linkers" phosphorylés sont ensuite soumis à divers contrôles visant à vérifier leurs aptitudes à se lier en présence de ligase du phage T4 et à être digérés par l'enzyme de restriction BglII. 9.2) Modification des extrémités cohésivesThe phosphorylated "linkers" are then subjected to various controls aimed at verifying their ability to bind in the presence of phage T4 ligase and to be digested by the restriction enzyme BglII. 9.2) Modification of the cohesive ends
5' sortantes La digestion des ADN par certaines endonucléases de restriction conduit à l'obtention de molécules portant des extrémités cohésives 5' sortantes. Pour liguer les bras de vecteur portant les extrémités cohésives 5' sortantes avec les "linkers" dont les extrémités sont franches, il est donc indispensable de convertir les extrémités cohésives en extrémités franches.5 'outgoing The digestion of DNA with certain restriction endonucleases leads to the production of molecules carrying 5' outgoing cohesive ends. To bind the vector arms carrying the outgoing 5 'cohesive ends with the "linkers" whose ends are blunt, it is therefore essential to convert the cohesive ends into blunt ends.
17,5 μg de pXJ4 linéarisé par l'enzyme de restriction EcoRI sont incubés à 25°C pendant 10 minutes en présence de 39 unités du fragment de "Klenow" dérivé de la DNA polymérase I d'E. coli (BRL), d'un tampon d'incubation contenant 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgSO4,17.5 μg of pXJ4 linearized by the restriction enzyme EcoRI are incubated at 25 ° C for 10 minutes in the presence of 39 units of the fragment of "Klenow" derived from DNA polymerase I of E. coli (BRL), an incubation buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgSO 4 ,
0,1 mM DTT et 50 μg d'albumine de sérum de bovin par ml, de 3,9.10-2 mM de nucléotides triphosphates froids (dATP, dCTP, dGAP) et de 40 μCuries 32P-TTP. Au bout de 10 minutes. 10 μl de 2 mM TTP froids sont ajoutés dans 515 μl de milieu réactionnel et l'incubation continue à s'effectuer pendant 10 minutes. Les ADN modifiés sont par la suite purifiés par extraction au phénol et précipités à l'éthanol froid.0.1 mM DTT and 50 μg of bovine serum albumin per ml, 3.9.10 -2 mM of cold nucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGAP) and 40 μCuries 32 P-TTP. After 10 minutes. 10 μl of 2 mM cold TTP are added to 515 μl of reaction medium and the incubation continues for 10 minutes. The modified DNAs are subsequently purified by extraction with phenol and precipitated with cold ethanol.
9.3) Insertion de "linkers" dans les vecteurs La proportion moléculaire entre les "linkers" et les vecteurs à liguer est en général supérieure à 50/1. 750 μg d'ADN de pXJ4 et 570 ng de "linkers" BglII sont incubés à 15ºC pendant 20 heures en présence de 5 unités de ligase du phage T4 et d'un tampon de ligation identique à celui décrit dans le paragraphe 6), dans un volume final de 60 μl.9.3) Insertion of "linkers" into the vectors The molecular proportion between the "linkers" and the vectors to be ligated is generally greater than 50/1. 750 μg of pXJ4 DNA and 570 ng of BglII "linkers" are incubated at 15ºC for 20 hours in the presence of 5 units of phage T4 ligase and a ligation buffer identical to that described in paragraph 6), in a final volume of 60 μl.
Pour éliminer des "linkers" excessifs, le milieu réactionnel de ligation est ensuite incubé en présence de l'e de restriction BglII. Les ADN linéarisés sont ensuite soumis à deux précipitations à - 80°C pendant 30 minutes en présence d'un mélange d'éthanol et de 1,5 M d'acétate d'ammonium. Ces deux précipitations permettent de récupérer les ADN de hauts poids moléculaires (vecteurs) par centrifugation, tandis que les "linkers" libres et digérés restent dans le surnageant. Les vecteurs ainsi modifiés sont, ensuite, religués et clones dans les bactéries C600. L'introduction d'un site BglII est identifié par cartographie de restriction. 10) TRANSFECTION DES CELLULES EUCARYOTIQUES 10.1) Culture des cellulesTo remove excessive "linkers", the ligation reaction medium is then incubated in the presence of the restriction e BglII. The linearized DNAs are then subjected to two precipitations at -80 ° C. for 30 minutes in the presence of a mixture of ethanol and 1.5 M of ammonium acetate. These two precipitations allow DNA of high molecular weights (vectors) to be recovered by centrifugation, while the free and digested "linkers" remain in the supernatant. The vectors thus modified are then religated and cloned in the C600 bacteria. The introduction of a BglII site is identified by restriction mapping. 10) TRANSFECTION OF EUKARYOTIC CELLS 10.1) Culture of cells
Les cellules utilisées pour la transfection sont les suivantes : des cellules L de souris (lignée continue), des cellules de caille QT6 (lignée continue), et des fibroblastes d'embryons de poulet CEF. Les cultures des cellules L de souris et. des fibroblastes d'embryon de poulet sont réalisées selon les techniques décrites précédemment.The cells used for the transfection are the following: mouse L cells (continuous line), quail cells QT6 (continuous line), and fibroblasts from CEF chicken embryos. Mouse and L cell cultures. chicken embryo fibroblasts are produced according to the techniques described above.
Les cellules QT6 de caille sont cultivées à 37°C en milieu MEM (Gibco) contenant 2,5 mg/ml TPBThe quail QT6 cells are cultured at 37 ° C. in MEM medium (Gibco) containing 2.5 mg / ml TPB
(tryptose phosphate broth), 10 % de sérum de veau foetal, 1 % sérum de poulet, 0,19 % bicarbonate de sodium, 100 unités de pénicilline par ml, 100 μg de streptomycine par ml, des acides aminés non essentiels, des vitamines, 4 mM glutamine, et 1 % DMSO (diméthyl sulfoxide).(tryptose phosphate broth), 10% fetal calf serum, 1% chicken serum, 0.19% sodium bicarbonate, 100 units of penicillin per ml, 100 μg of streptomycin per ml, non-essential amino acids, vitamins , 4 mM glutamine, and 1% DMSO (dimethyl sulfoxide).
Ces cellules sont cultivées à 37°C en atmosphère humide contenant 5 % de CO2.These cells are cultured at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% CO 2 .
10.2) Transfection des cellules par la méthode de phosphate de calcium La technique est identique à celle décrite précédemment.10.2) Transfection of cells by the calcium phosphate method The technique is identical to that described above.
10.3) Transfection des cellules par la méthode de polybrène-DMSO10.3) Transfection of cells by the polybrene-DMSO method
Le principe de cette méthode est basé sur le fait que la présence des polycations (polybrène) conduit à l'attachement des ADN sur les membranes cellulaires. La pénétration des ADN dans les cellules est facilitée par traitement des cellules au DMSO (diméthyl sulfoxide) qui augmente la perméabilité des membranes cellulaires (KAWAI et al. 1984).The principle of this method is based on the fact that the presence of polycations (polybrene) leads to the attachment of DNA on cell membranes. The penetration of DNA into cells is facilitated by treatment of cells with DMSO (dimethyl sulfoxide) which increases the permeability of cell membranes (KAWAI et al. 1984).
5.105 cellules L de souris sont ensemencées dans une boîte de Pétri dont le diamètre est 60 mm. Après une incubation de 16 heures, les cellules sont mises en contact avec 4 μg d'ADN transformant et incubées à 37°C en présence d'un ml de milieu de culture frais contenant 25 μg de polybrène. Au bout de 6 heures, les cellules sont traitées avec 2 ml de milieu de culture frais contenant 25 % de DMSO à 37°C pendant 4 minutes. 10.4) Sélection des cellules transformées en présence de G418 2 à 4 jours après la transfection, les cellules sont soumises à la sélection en présence de l'antibiotique G418 dont la concentration est de 800 μg/ml de culture pour les cellules L de souris, de 400 μg/ml de culture pour les cellules QT6, et de 300 μg/ml pour les fibroblastes de de poulet.5.10 5 mouse L cells are seeded in a Petri dish whose diameter is 60 mm. After a 16 hour incubation, the cells are brought into contact with 4 μg of transforming DNA and incubated at 37 ° C. in the presence of a ml of fresh culture medium containing 25 μg of polybrene. After 6 hours, the cells are treated with 2 ml of fresh culture medium containing 25% DMSO at 37 ° C for 4 minutes. 10.4) Selection of cells transformed in the presence of G418 2 to 4 days after transfection, the cells are subjected to selection in the presence of the antibiotic G418, the concentration of which is 800 μg / ml of culture for mouse L cells, 400 μg / ml culture for QT6 cells, and 300 μg / ml for chicken fibroblasts.
EXEMPLE 8 LOCALISATION DE LA REGION 5' DU GENE erbB DE L'AEV-R Dans le génome de l'AEV du type sauvage, les deux oncogènes viraux v-erbA et v-erbB occupent la partie majeure des régions codantes (figure 15). Un fragment HincII-BamHI (1,2 kb) renferme la région 3' du gène erbA, une séquence non codante intercalée entre le gène v-erbA et le gène v-erbB, et la région 5' du gène v-erbB. Afin de déterminer la position exacte du codon initiateur du gène v-erbB et du site accepteur d'épissage situé entre v-erbA et v-erbB, on a déterminé la séquence nucléotidique de cette région. Le fragment HincII-BamHI est d'abord clone dans les vecteurs dérivés du bactériophage M13, mp8 et mp11 (figure 16). En état monocaténaire, le brin "plus" du fragment étudié est présent dans le clone p42 dérivé de mp8, tandis que le brin "moins" se trouve dans le clone p314 dérivé de mp11. Le séquençage effectué sur le clone p42 permet de déterminer une partie de séquence de la région 5' du gène v-erbB à partir du site BamHI (figure 17). La comparaison de la séquence du gène v-erbB de l'AEV et de celle du gène v-erbB du variant AEV-H fournie par YAMAMOTO et al., 1983 révèle une homologie de 276 nucléotides sur 279. Cette homologie importante permet de déduire que dans le génome d'AEV la distance entre le site BamHI et le codon initiateur "AUG" du gène v-erbB mesure 400 à 500 nucléotides, en supposant que les deux gènes v-erbB sont identiques dans leurs séquences 5'.EXAMPLE 8 LOCALIZATION OF THE 5 'REGION OF THE AEB-R erbB GENE In the wild type AEV genome, the two viral oncogenes v-erbA and v-erbB occupy most of the coding regions (FIG. 15). . A HincII-BamHI fragment (1.2 kb) contains the 3 'region of the erbA gene, a non-coding sequence inserted between the v-erbA gene and the v-erbB gene, and the 5' region of the v-erbB gene. In order to determine the exact position of the initiator codon of the v-erbB gene and of the splice acceptor site located between v-erbA and v-erbB, the nucleotide sequence of this region was determined. The HincII-BamHI fragment is first cloned into the vectors derived from the bacteriophage M13, mp8 and mp11 (FIG. 16). In single-stranded state, the "plus" strand of the studied fragment is present in the clone p42 derived from mp8, while the "minus" strand is found in the clone p314 derived from mp11. The sequencing carried out on the clone p42 makes it possible to determine a part of the sequence of the 5 ′ region of the v-erbB gene from the BamHI site (FIG. 17). The comparison of the sequence of the v-erbB gene of AEV and that of the v-erbB gene of the variant AEV-H provided by YAMAMOTO et al., 1983 reveals a homology of 276 nucleotides out of 279. This important homology makes it possible to deduce that in the AEV genome the distance between the BamHI site and the initiating codon "AUG" of the v-erbB gene measures 400 to 500 nucleotides, assuming that the two v-erbB genes are identical in their 5 ′ sequences.
EXEMPLE 9 ELIMINATION DE LA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DE LA REGION 5' DU GENE v-erbBEXAMPLE 9 ELIMINATION OF THE NUCLEOTIDE SEQUENCE OF THE 5 'REGION OF THE v-erbB GENE
En considérant l'absence de site de restriction utilisable en amont du site BamHI dans la région 5' du gène v-erbB, on a employé la nucléase Bal31 pour l'élimination de cette région à partir du site BamHI.Considering the absence of a restriction site which can be used upstream of the BamHI site in the 5 ′ region of the v-erbB gene, the Bal31 nuclease was used for the elimination of this region from the BamHI site.
Le clone perbl contenant les séquences de jonction entre v-erbA et v-erbB (figure 11) est digéré par l'enzyme de restriction BamHI puis par la nucléase Bal31 qui opère une dégradation progressive de la région 5' du gène v-erbB à partir du site BamHI. La digestion est contrôlée de telle façon qu'une séquence nucléotidique d'environ 0,45 kb soit éliminée en amont du site BamHI. La séparation des fragments viraux raccourcis du vecteur pBR322 est réalisée par digestion par l'enzyme de restriction SalI, suivie d'une electrophorèse sur gel d'agarose préparatif.The perbl clone containing the junction sequences between v-erbA and v-erbB (FIG. 11) is digested with the restriction enzyme BamHI then by the nuclease Bal31 which operates a progressive degradation of the 5 'region of the v-erbB gene to from the BamHI site. The digestion is controlled in such a way that a nucleotide sequence of approximately 0.45 kb is eliminated upstream from the BamHI site. The separation of the shortened viral fragments from the vector pBR322 is carried out by digestion with the restriction enzyme SalI, followed by electrophoresis on a preparative agarose gel.
Une famille de fragments viraux dont les tailles avoisinnent 0,8 kb est isolée du gel. Ces fragments présentent une délétion plus ou moins étendue dans la région 5' du gène v-erbB. EXEMPLE 10 ETUDE STRUCTURALE DE LA REGION NON CODANTE ENTRE LES GENES v-erbA et v-erbBA family of viral fragments whose sizes approach 0.8 kb is isolated from the gel. These fragments exhibit a more or less extensive deletion in the 5 ′ region of the v-erbB gene. EXAMPLE 10 STRUCTURAL STUDY OF THE NON-CODING REGION BETWEEN THE GENES v-erbA and v-erbB
Pour déterminer la délétion introduite dans la région 5' du gène v-erbB, les fragments raccourcisTo determine the deletion introduced into the 5 'region of the v-erbB gene, the shortened fragments
Bal31 sont d'abord clones entre les sites Sali et Smal de mp11 (figure 11).Bal31 are first cloned between the SalI and Smal sites of mp11 (Figure 11).
4 clones séquences montrent des résidus plus ou moins longs de séquence v-erbB (figure 18). Parmi tous ces clones, le clone p15-16 ne conserve que les 13 premiers nucléotides du gène v-erbB.4 sequence clones show more or less long residues of v-erbB sequence (FIG. 18). Among all these clones, the clone p15-16 retains only the first 13 nucleotides of the v-erbB gene.
L'analyse des séquences en amont du codon "ATG" du gène v-erbB indique qu'il existe un site consensus accepteur d'épissage "CAG" en position 171 précédé par une séquence de 15 nucléotides "TTTCTTTCCTTTTTG" (figure 18) (SHARP, 1981).Analysis of the sequences upstream of the "ATG" codon of the v-erbB gene indicates that there is a consensus acceptor splicing site "CAG" at position 171 preceded by a sequence of 15 nucleotides "TTTCTTTCCTTTTTG" (FIG. 18) ( SHARP, 1981).
Le codon de terminaison "TAG" du gène v-erbA se trouve à 188 nucléotides en amont du codon "ATG" du gène v-erbB. D'autre part, la séquence non codante est caractérisée par une fréquence élevée de doublets et de triplets des nucléotides A et des nucléotides T respectivement.The termination codon "TAG" of the v-erbA gene is located 188 nucleotides upstream of the codon "ATG" of the v-erbB gene. On the other hand, the non-coding sequence is characterized by a high frequency of doublets and triplets of nucleotides A and nucleotides T respectively.
L'étude comparative avec la séquence de l'AEV-H fournie par YAMAMOTO et al., 1983 montre que les séquences immédiatement en aval du codon "ATG" du gène v-erbB sont pratiquement identiques entre l'AEV et l'AEV-H.The comparative study with the sequence of AEV-H provided by YAMAMOTO et al., 1983 shows that the sequences immediately downstream of the codon "ATG" of the v-erbB gene are practically identical between AEV and AEV- H.
EXEMPLE 11EXAMPLE 11
CONSTRUCTION DU MUTANT pAEV-ΔerbBCONSTRUCTION OF THE MUTANT pAEV-ΔerbB
Dans le but de remplacer le gène v-erbB par un gène "marqueur", le gène Neor dérivé du transposon bactérien Tn5 a été inséré dans le génome modifié de l'AEV. La stratégie adaptée dans cette construction est schématisée dans la figure 12.In order to replace the v-erbB gene with a "marker" gene, the Neo r gene derived from the bacterial transposon Tn5 has been inserted into the modified genome of the AEV. The strategy adapted in this construction is shown diagrammatically in Figure 12.
Le clone p15-16 est tout d'abord digéré par les enzymes de restriction EcoRI et Sali. Un fragment SalI-EcoRI (0,75 kb), qui couvre la région 5' du gène v-erbA, la séquence non codante contenant le site accepteur d'épissage, les 13 premiers nucléotides du gène v-erbB et 11 nucléotides dérivés du polylinker de mp11, est isolé par electrophorèse sur gel d'agarose. La double digestion du clone pAEV124Ba par Sali et EcoRI permet d'isoler un fragment de 3,1 kb contenant entre autre les LTR, les séquences résiduelles gag et la moitié 5' du gène v-erbA de l'AEV.The clone p15-16 is firstly digested with the restriction enzymes EcoRI and Sali. A SalI-EcoRI fragment (0.75 kb), which covers the 5 ′ region of the v-erbA gene, the non-coding sequence containing the splice acceptor site, the first 13 nucleotides of the v-erbB gene and 11 nucleotides derived from the polylinker of mp11, is isolated by agarose gel electrophoresis. The double digestion of the clone pAEV124Ba by Sali and EcoRI makes it possible to isolate a 3.1 kb fragment containing inter alia the LTRs, the residual gag sequences and the 5 'half of the v-erbA gene of the AEV.
Ces deux fragments sont ligués en tandem et clones dans le site EcoRI du plasmide pJS21 qui fournit les séquences virales 3'. Le plasmide final contenant un génome viral reconstitué, dépourvu du gène v-erbB, est appelé pXJ4. La structure du plasmide pXJ4 est confirmée par les résultats de la digestion par SalI, Sacl, PstI, BamHI et SalI + EcoRI.These two fragments are ligated in tandem and cloned into the EcoRI site of the plasmid pJS21 which provides the 3 'viral sequences. The final plasmid containing a reconstituted viral genome lacking the v-erbB gene is called pXJ4. The structure of the plasmid pXJ4 is confirmed by the results of digestion with SalI, Sac1, PstI, BamHI and SalI + EcoRI.
EXEMPLE 12EXAMPLE 12
INTRODUCTION DU GENE STRUCTURAL Neor DE Tn5 DANS LE VECTEUR RETROVIRAL pXJ4INTRODUCTION OF THE Neo r STRUCTURAL GENE OF Tn5 INTO THE RETROVIRAL VECTOR pXJ4
L'obtention du vecteur rétroviral pXJ4 offre la possibilité d'insérer un gène de sélection à l'emplacement du gène v-erbB délété sans augmentation de la taille totale du vecteur par rapport à l'AEV du type sauvage.Obtaining the retroviral vector pXJ4 offers the possibility of inserting a selection gene at the location of the deleted v-erbB gene without increasing the total size of the vector relative to the wild type AEV.
Le plasmide pAG50, présenté sur la figure 13, comporte le gène structural de résistance à l'antibiotique néomycine (gène Neor) limité par des sites BglII (COLBERE-GARAPIN et al., 1981). La digestion de pAG50 par BglII permet d'isoler un fragment de 1,2 kb contenant le gène Neor. Pour introduire ce fragment dans le plasmide pXJ4 à l'emplacement du gène v-erbB délété, un site de restriction BglII a dû être créé dans le plasmide pXJ4 au niveau du site EcoRI situé en aval du site accepteur d'épissage. Le plasmide pXJ4 a été soumis à une digestion partielle par EcoRI, on a ensuite isolé, sur gel d'agarose préparatif, les molécules linéarisées de 9,7 kb résultant d'une seule coupure par EcoRI. Les extrémités des fragments isolés furent ensuite réparées en extrémités droites puis liées à des "linkers" BglII.The plasmid pAG50, presented in FIG. 13, contains the structural gene for resistance to the antibiotic neomycin (Neo r gene) limited by BglII sites (COLBERE-GARAPIN et al., 1981). Digestion of pAG50 with BglII makes it possible to isolate a 1.2 kb fragment containing the Neo r gene. To introduce this fragment into the plasmid pXJ4 at the location of the deleted v-erbB gene, a BglII restriction site had to be created in the plasmid pXJ4 at the EcoRI site located downstream of the splice acceptor site. The plasmid pXJ4 was subjected to a partial digestion with EcoRI, the linearized molecules of 9.7 kb were then isolated, on a preparative agarose gel, resulting from a single cut by EcoRI. The ends of the isolated fragments were then repaired into straight ends and then linked to BglII "linkers".
Cette procédure donne naissance à deux sites EcoRI encadrant le site BglII créé (figure 14). Le génome ainsi produit est représenté par le plasmide pXJ5 (figure 14) . La digestion de pXJ5 par BglII prouve l'insertion d'un site BglII. Les doubles digestions par BglII et Sacl, ou BglII et Sali, confirment la position de ce site en aval du codon initiateur "AUG" résiduel du gène v-erbB. La restitution du site EcoRI est confirmée par digestion par EcoRI. L'insertion du gène Neor dans le vecteur pXJ5 est réalisée par l'opération suivante : Le plasmide pXJ5 est d'abord linéarisé au site BglII puis lié avec le fragment BglII-BglII contenant le gène Neo isolé de pAG50. L'analyse des clones recombinants montre que le clone pXJ1 comporte une seule copie du gène Neor insérée dans la même orientation transcriptionnelle que celle du vecteur rétroviral (figure 19). Le clone pXJ2 (figure 20) porte une seule copie du gène Neor dont l'orientation est opposée à celle du vecteur. Le clone pXJ3 (figure 21) possède deux copies du gène Neor associées en tandem, toutes deux orientées dans le sens de transcription du génome viral. Les sites d'insertion, le nombre et l'orientation des gènes Neo dans les plasmides pXJ1, pXJ2 et pXJ3, ont été déterminés par digestion des plasmides avec chacune des enzymes BglII, EcoRI, HincII et PstI.This procedure gives rise to two EcoRI sites framing the BglII site created (Figure 14). The genome thus produced is represented by the plasmid pXJ5 (FIG. 14). Digestion of pXJ5 with BglII proves the insertion of a BglII site. The double digests with BglII and Sac1, or BglII and Sali, confirm the position of this site downstream of the residual initiator codon "AUG" of the v-erbB gene. The restitution of the EcoRI site is confirmed by digestion with EcoRI. The Neo r gene is inserted into the pXJ5 vector by the following operation: The plasmid pXJ5 is first linearized at the BglII site and then linked with the BglII-BglII fragment containing the Neo gene isolated from pAG50. Analysis of the recombinant clones shows that the pXJ1 clone has a single copy of the Neo r gene inserted in the same transcriptional orientation as that of the retroviral vector (FIG. 19). The clone pXJ2 (FIG. 20) carries a single copy of the Neo r gene whose orientation is opposite to that of the vector. The clone pXJ3 (FIG. 21) has two copies of the Neo r gene associated in tandem, both oriented in the direction transcription of the viral genome. The insertion sites, the number and the orientation of the Neo genes in the plasmids pXJ1, pXJ2 and pXJ3, were determined by digestion of the plasmids with each of the enzymes BglII, EcoRI, HincII and PstI.
Les séquences de jonction entre le gène Neor et les vecteurs rétroviraux dans les clones pXJ1 et pXJ3 sont présentées dans la figure 22.The junction sequences between the Neo r gene and the retroviral vectors in the clones pXJ1 and pXJ3 are presented in FIG. 22.
EXEMPLE 13EXAMPLE 13
EXPRESSION DU GENE Neor DANS LES CELLULES PROCARYOTIQUES Les bactéries du type Kans (sensible à la kanamycine) transformées par pXJ1, pXJ2 et pXJ3 sont cultivées à 37°C pendant 16 heures en présence d'un milieu liquide nutritif contenant de la kanamycine dont la concentration varie de 0 à 600 μg/ml de culture.EXPRESSION OF THE Neo r GENE IN PROKARYOTIC CELLS Kan s type bacteria (sensitive to kanamycin) transformed by pXJ1, pXJ2 and pXJ3 are cultured at 37 ° C. for 16 hours in the presence of a nutritive liquid medium containing kanamycin, the concentration varies from 0 to 600 μg / ml of culture.
Les bactéries transformées par le clone pXJ5 sans gène Neor sont aussi testées comme témoin.The bacteria transformed by the clone pXJ5 without the Neor gene are also tested as a control.
En présence de 50 μg de kanamycine par ml de culture, seules les bactéries transformées par les recombinants portant le gène Neo montrent une croissance normale. Néanmoins, lorsque la concentration de kanamycine est supérieure à 50 μg/ml de culture, les bactéries hébergeant les clones pXJ1 et pXJ3 présentent une croissance au moins 10 fois supérieure à celle des bactéries contenant le plasmide pXJ2. On n'observe aucune différence de sensibilité à la kanamycine entre les bactéries qui renferment pXJ1 et celles qui renferment pXJ3. EXEMPLE 14 EXPRESSION DU GENE Neor DANS LES CELLULES EUCARYOTIQUES 1 ) Transfection en présence de phosphate de calcium 1.1) Transfection des cellules L de sourisIn the presence of 50 μg of kanamycin per ml of culture, only the bacteria transformed by the recombinants carrying the Neo gene show normal growth. However, when the concentration of kanamycin is greater than 50 μg / ml of culture, the bacteria harboring the clones pXJ1 and pXJ3 exhibit growth at least 10 times that of the bacteria containing the plasmid pXJ2. No difference in sensitivity to kanamycin is observed between the bacteria which contain pXJ1 and those which contain pXJ3. EXAMPLE 14 EXPRESSION OF THE Neo r GENE IN EUKARYOTIC CELLS 1) Transfection in the presence of calcium phosphate 1.1) Transfection of mouse L cells
(tableau V) 5.105 cellules L de souris sont soumises à une transfection de 15 μg d'ADN de chacun des vecteurs pXJ1, pXJ2 ou pXJ3. Le plasmide pAG50 dans lequel le gène Neor est sous le commandement des éléments du contrôle de transcription du gène tk du virus Herpès simplex est choisi comme témoin (COLBERE-GARAPIN et al., 1981).(Table V) 5.10 5 mouse L cells are subjected to a transfection of 15 μg of DNA from each of the vectors pXJ1, pXJ2 or pXJ3. The plasmid pAG50 in which the Neo r gene is under the command of the elements of transcription control of the tk gene of the Herpes simplex virus is chosen as a control (COLBERE-GARAPIN et al., 1981).
24 heures après la transfection, les cellules sont sélectionnées en milieu liquide en présence de 800 μg de G418 par ml de culture. Au bout.de 14 de sélection, les cellules n'ayant pas subi de transfection ainsi que les cellules transfectées avec le plasmide pXJ2 sont toutes mortes. Par contre, les cellules transfectées avec pXJ1 et pXJ3 survivent et commencent à former les colonies. Les nombres de colonies résistantes sont comptés au bout de 19 jours de sélection. L'efficacité de transformation montrée par le clone pXJ3 portant deux copies de gène Neor est inférieure à celle du clone pXJ1 comportant une seule copie. 1.2) Transfection des cellules de caille QT624 hours after transfection, the cells are selected in a liquid medium in the presence of 800 μg of G418 per ml of culture. At the end of 14 of selection, the cells not having undergone transfection as well as the cells transfected with the plasmid pXJ2 all died. In contrast, cells transfected with pXJ1 and pXJ3 survive and begin to form colonies. The numbers of resistant colonies are counted after 19 days of selection. The transformation efficiency shown by the clone pXJ3 carrying two copies of the Neo r gene is lower than that of the clone pXJ1 comprising a single copy. 1.2) Transfection of QT6 quail cells
(tableau V) 5.105 cellules de caille QT6 sont transfectées avec 5 μg des vecteurs rétroviraux pXJ1, pXJ2 et pXJ3 respectivement. Parallèlement, 15 μg de pAG50 sont utilisés comme témoin. 25 heures après la transfection, les cellules sont soumises à la sélection en milieu liquide en présence de 400 μg de G418 par ml de culture. Au bout de 7 jours de sélection, les cellules normales non transfectées sont toutes mortes sous la pression d'une telle sélection. Pour faciliter le développement de colonies résistantes, la concentration de G418 est ramenée à 200 μg/ml. Après une sélection continue de 4 jours, 33 colonies résistantes sont formées dans le cas de pXJ1 tandis que les autres clones ne présentent aucune activité de transformation.(Table V) 5.10 5 quail cells QT6 are transfected with 5 μg of the retroviral vectors pXJ1, pXJ2 and pXJ3 respectively. In parallel, 15 μg of pAG50 are used as a control. 25 hours after transfection, the cells are subjected to selection in a liquid medium in the presence of 400 μg of G418 per ml of culture. After 7 days of selection, the normal non-transfected cells all died under the pressure of such selection. To facilitate the development of resistant colonies, the concentration of G418 is reduced to 200 μg / ml. After a continuous selection of 4 days, 33 resistant colonies are formed in the case of pXJ1 while the other clones show no transformation activity.
1.3) Transfeçtion des fibroblastes d'embrγon de poulet (tableau V)1.3) Transfer of chicken embryo fibroblasts (Table V)
5.105 fibroblastes d'embryon de poulet secondaires sont transfectés avec 5 μg des vecteurs pXJ1, pXJ2 et pXJ3 respectivement. En même temps, 15 μg de pAG50 sont employés comme témoin. 6 jours après la transfection, les cellules transfectées sont sélectionnées en milieu liquide contenant 300 μg de G418 par ml de culture. Au bout de deux semaines de sélection, les fibroblastes normaux non transfectés ainsi que les fibroblastes transfectés par pXJ2 et pAG50 sont tous morts. En revanche, les cellules transfectées avec pXJ1 et pXJ3 commencent à former des colonies. Les nombres de colonies résistantes sont comptés à la suite d'une sélection continue de 3 jours. Le clone pXJ1 contenant une copie du gène Neor fournit environ deux fois plus de colonies résistantes que le clone pXJ3. Les fibroblastes transformés par les vecteurs pXJ1 et pXJ3 présentent une morphologie identique à celle des cellules normales.5.10 5 secondary chicken embryo fibroblasts are transfected with 5 μg of the vectors pXJ1, pXJ2 and pXJ3 respectively. At the same time, 15 μg of pAG50 are used as a control. 6 days after transfection, the transfected cells are selected in a liquid medium containing 300 μg of G418 per ml of culture. After two weeks of selection, the normal non-transfected fibroblasts as well as the fibroblasts transfected with pXJ2 and pAG50 are all dead. In contrast, cells transfected with pXJ1 and pXJ3 begin to form colonies. The numbers of resistant colonies are counted following a continuous selection of 3 days. The pXJ1 clone containing a copy of the Neo r gene provides approximately twice as many resistant colonies as the pXJ3 clone. The fibroblasts transformed by the vectors pXJ1 and pXJ3 have a morphology identical to that of normal cells.
2) Transfection des cellules L de souris en présence de polybrène (tableau V) 5.105 cellules L de souris sont transfectées avec 4 μg de chacun des ADN transformants pXJ1, pXJ2, pXJ3 et pAG50. 48 heures après la transfection, les cellules sont cultivées en milieu liquide contenant 800 μg de G418 par ml de culture. Au bout de 12 jours de sélection, les cellules normales non transfectées ainsi que les cellules transfectées avec les plasmides pXJ2 et pAG50 sont toutes mortes. Par contre, les clones pXJ1 et pXJ3 induisent le développement de colonies résistantes. L'efficacité de la méthode de transfection au polybrène-DMSO apparaît beaucoup plus élevée que celle de la méthode au phosphate de calcium. 2) Transfection of mouse L cells in the presence of polybrene (Table V) 5.10 5 mouse L cells are transfected with 4 μg of each of the transforming DNAs pXJ1, pXJ2, pXJ3 and pAG50. 48 hours after transfection, the cells are cultured in a liquid medium containing 800 μg of G418 per ml of culture. After 12 days of selection, the normal non-transfected cells as well as the cells transfected with the plasmids pXJ2 and pAG50 are all dead. In contrast, the clones pXJ1 and pXJ3 induce the development of resistant colonies. The efficiency of the polybrene-DMSO transfection method appears to be much higher than that of the calcium phosphate method.
Figure imgf000065_0001
. L'organisation transcriptionnelle des ADN transformants est montrée dans ce tableau. L'orientation transcriptionnelle de chaque composant est indiquée par une flèche horizontale. . tkpr : promoteur du gène tk de HSV . tkpolyA: signal de polyadénylation du gène tk de HSV. EXEMPLE 15
Figure imgf000065_0001
. The transcriptional organization of transforming DNAs is shown in this table. The transcriptional orientation of each component is indicated by a horizontal arrow. . tkpr: promoter of the HSV tk gene. tkpolyA: polyadenylation signal of the HSV tk gene. EXAMPLE 15
1) Préparation du clone mJS21 erb- (figure 24) Ce clone a été préparé à partir du clone pJS211) Preparation of the clone mJS21 erb- (FIG. 24) This clone was prepared from the clone pJS21
(exemple 2, figure 23) qui contient, outre les séquences déjà décrites, une quarantaine de nucléotides appartenant à l'oncogène erbB qui sont situés en 5' du gène env.(example 2, FIG. 23) which contains, in addition to the sequences already described, around forty nucleotides belonging to the erbB oncogene which are located 5 ′ from the env gene.
Cette séquence résiduelle a été éliminée par linéarisationThis residual sequence has been eliminated by linearization
EcoRI et digestion avec Bal31.EcoRI and digestion with Bal31.
Les fragments obtenus sont réparés par la DNA polymérase I. L'insert est relâché au site BamHI par digestion enzymatique et purifié par électroélution après séparation sur gel d'agarose.The fragments obtained are repaired by DNA polymerase I. The insert is released at the BamHI site by enzymatic digestion and purified by electroelution after separation on agarose gel.
Les fragments purifiés sont ensuite clones dans la forme réplicative du phage M13 préalablement préparée. Après ligation et transformation d'une culture bactérienneThe purified fragments are then cloned into the replicative form of phage M13 previously prepared. After ligation and transformation of a bacterial culture
JM103 compétente, les phages monocaténaires recombinants sont analysés par hybridation avec un clone contenant le fragment JS21 intégré en sens inverse. Les clones présomptifs sont alors vérifiés par séquençage. Le clone mJS21 erb- retenu débute dans le gène envJM103 competent, the recombinant single-stranded phages are analyzed by hybridization with a clone containing the JS21 fragment integrated in reverse. The presumptive clones are then verified by sequencing. The clone mJS21 erb- retained begins in the env gene
9 nucléotides en 3' du codon terminateur du gène erbB.9 nucleotides 3 'to the terminator codon of the erbB gene.
2) Préparation du clone mp11gag mp10gag erbA contient les 400 derniers nucléotides du gène gag ainsi que les 400 premiers nucléotides du gène erbA. De la même manière que pour le clone mJS21 erb-, la séquence erbA du clone mp10gag erbA a été éliminée par digestion avec l'exonucléase Bal31 (figure 24).2) Preparation of the clone mp11gag mp10gag erbA contains the last 400 nucleotides of the gag gene as well as the first 400 nucleotides of the erbA gene. In the same way as for the mJS21 erb- clone, the erbA sequence of the mp10gag erbA clone was eliminated by digestion with the exonuclease Bal31 (FIG. 24).
Dans le clone mp11gag retenu, après analyse par séquençage des clones présomptifs, le gène erbA est totalement éliminé ainsi que 12 nucléotides 3' terminaux du gène gag. 3) Préparation du clone mp10-J (figure 25) Le fragment J a été préparé à partir du clone mp11 p15-16 (exemple 10) (appelé 15-16). Celui-ci contient, outre la séquence J, les 550 derniers nucléotides du gène erbA. Après analyse de la séquence publiée par DEBUIRE et coll. (1984) concernant cette région de l'AEV, on a identifié un site de restriction Fokl unique situé à proximité de la jonction des deux séquences erbA et J. Ainsi, la digestion de l'ADN du clone mpll p15-16 par cette endonucléase libère le fragment J. En 5' de J, il ne subsiste que 10 nucléotides de la séquence codante du gène erbA.In the clone mp11gag retained, after analysis by sequencing of the presumptive clones, the erbA gene is completely eliminated as well as 12 3 'terminal nucleotides of the gag gene. 3) Preparation of the clone mp10-J (FIG. 25) The fragment J was prepared from the clone mp11 p15-16 (example 10) (called 15-16). This contains, in addition to the sequence J, the last 550 nucleotides of the erbA gene. After analysis of the sequence published by DEBUIRE et al. (1984) concerning this region of AEV, a unique Fokl restriction site was identified located near the junction of the two sequences erbA and J. Thus, the digestion of the DNA of the clone mpll p15-16 by this endonuclease releases the J fragment. In 5 ′ of J, only 10 nucleotides of the coding sequence of the erbA gene remain.
EXEMPLE 16 RECONSTRUCTION DU VECTEUR DEPOURVU DE SEQUENCES ONCOGENES L'assemblage des différents clones obtenus à l'exemple 15 est réalisé dans le plasmide bactérien pBR328 (BOLIVAR et coll., 1977). Ce dernier peut, en effet, insérer des fragments de grande taille et être sélectionné pour sa résistance à l'ampicilline. 1) Clonage de la séquence gag du mp11gag dans le pBR328 (figure 26) Le premier fragment introduit dans le plasmide est celui qui contient le gène gag présent sur le clone mpllgag. Le clone pBRgag ainsi obtenu est analysé par cartographie aux endonucléases de restriction.EXAMPLE 16 RECONSTRUCTION OF THE VECTOR WITHOUT ONCOGENIC SEQUENCES The assembly of the different clones obtained in Example 15 is carried out in the bacterial plasmid pBR328 (BOLIVAR et al., 1977). The latter can, in fact, insert large fragments and be selected for its resistance to ampicillin. 1) Cloning of the gag sequence of mp11gag in pBR328 (FIG. 26) The first fragment introduced into the plasmid is that which contains the gag gene present on the clone mpllgag. The pBRgag clone thus obtained is analyzed by restriction endonuclease mapping.
2) Préparation du clone pBRgag-J (figure 27) a) Préparation du vecteur pBRgag La préparation du vecteur pBRgag pour l'insertion du fragment J a nécessité une série d'étapes destinées à conserver le site EcoRI situé en 3' de la séquence gag.2) Preparation of the clone pBRgag-J (FIG. 27) a ) Preparation of the vector pBRgag The preparation of the vector pBRgag for the insertion of fragment J required a series of steps intended to conserve the EcoRI site located 3 ′ of the sequence gag.
Ce site EcoRI doit, en effet, dans la construction finale servir de site unique de clonage pour les gènes à insérer dans le vecteur rétroviral. Pour préparer le vecteur pBRgag, on utilise la T4 DNA polymérase afin d'obtenir des extrémités franches après digestion par l'endonucléase Sacl. L'activité de cette T4 DNA polymérase n'est pas rigoureusement contrôlable et compte tenu du fait que les deux sites enzymatiques utilisés pour ce sous-clonage (Sacl et EcoRI) appartiennent au polylinker du phage M13 et sont très proches l'un de l'autre, on risque de perdre le site EcoRI. C'est la raison pour laquelle on introduit dans le vecteur pBRgag, afin d'éloigner le site EcoRI du site Sacl, un fragment d'ADN de 2,7 kb appartenant au gène de gamma globine humaine. Cette astuce technique permet, après différentes étapes, de conserver le site EcoRI. b) Préparation du clone mp10-J Le fragment J tel qu'il a été préparé est contenu dans le vecteur mp10 entre les sites Smal et EcoRI du polylinker. Ceci entraîne l'apparition, en 5' du fragment J, de 5 sites de restriction (BamHI, Xbal, Sali, PstI etThis EcoRI site must, in fact, in the final construction serve as a unique cloning site for the genes to be inserted into the retroviral vector. To prepare the vector pBRgag, T4 DNA polymerase is used in order to obtain blunt ends after digestion with the endonuclease Sac1. The activity of this T4 DNA polymerase is not strictly controllable and given the fact that the two enzymatic sites used for this subcloning (Sacl and EcoRI) belong to the polylinker of phage M13 and are very close to one of the other, we risk losing the EcoRI site. This is the reason why a 2.7 kb DNA fragment belonging to the human gamma globin gene is introduced into the pBRgag vector, in order to separate the EcoRI site from the SacI site. This technical trick allows, after different steps, to keep the EcoRI site. b) Preparation of the clone mp10-J The fragment J as it was prepared is contained in the vector mp10 between the SmaI and EcoRI sites of the polylinker. This results in the appearance, in 5 ′ of fragment J, of 5 restriction sites (BamHI, Xbal, Sali, PstI and
HindlII). Or, pour la suite de la construction, le site BamHI doit être supprimé. Ceci est réalisé par digestion avec l'endonucléase BamHI, puis remplissage par la DNA polymérase I et ligation. Après analyse par cartographie des formes réplicatives du phage M13, les clones présomptifs sont analysés par séquençage. Le clone mp10 ainsi préparé est alors clone dans le pBRgag. Après transformation d'une culture bactérienne C600 R/S compétente, les clones recombinants pBRgag-J sont analysés par cartographie. Le clonage du fragment J dans le pBRgag crée le site unique Xbal situé en 5' de J qui sera utilisé pour le clonage des gènes à insérer dans le vecteur. 3) Clonage du fragment JS21 erb- en 3' de J dans le vecteur pBRgag-J (figure 28) Le vecteur pBRgag-J et le fragment JS21 erb- sont séparés comme indiqué dans la figure. Le clonage du fragment JS21 erb- en 3' de J apporte au vecteur la séquence du gène env ainsi que la LTR 3'. Il crée également le site unique EcoRI qui sera utilisé pour le sous-clonage des gènes à insérer dans le vecteur. Les clones pBRgag-J env LTR ainsi obtenus sont analysés en cartographie. 4) Clonage du vecteur pBRgag-J env LTR dans le pJS21 (figure 29) Le fragment pBRgag-J env LTR et le pJS21 sont préparés comme indiqué dans la figure. Ce sous-clonage apporte au vecteur la LTR 5', la séquence leader, et permet de reconstituer le gène gag tel qu ' il existe dans l 'AEV sauvage. Le clone pBRgag-J-env 2LTR ainsi obtenu est analysé par cartographie.HindIII). However, for the rest of the construction, the BamHI site must be deleted. This is carried out by digestion with the endonuclease BamHI, then filling with DNA polymerase I and ligation. After analysis by mapping of the replicative forms of phage M13, the presumptive clones are analyzed by sequencing. The mp10 clone thus prepared is then cloned into the pBRgag. After transformation of a competent C600 R / S bacterial culture, the pBRgag-J recombinant clones are analyzed by mapping. Cloning of the J fragment in pBRgag creates the unique Xbal site located 5 ′ of J which will be used for cloning the genes to be inserted into the vector. 3) Cloning of the JS21 erb- fragment 3 ′ of J into the vector pBRgag-J (FIG. 28) The vector pBRgag-J and the JS21 erb- fragment are separated as indicated in the figure. The cloning of the JS21 erb- fragment in 3 'of J brings to the vector the sequence of the env gene as well as the LTR 3'. It also creates the unique EcoRI site which will be used for the subcloning of genes to be inserted into the vector. The pBRgag-J env LTR clones thus obtained are analyzed by mapping. 4) Cloning of the vector pBRgag-J env LTR into pJS21 (FIG. 29) The fragment pBRgag-J env LTR and pJS21 are prepared as indicated in the figure. This subcloning provides the vector with the 5 ′ LTR, the leader sequence, and makes it possible to reconstitute the gag gene as it exists in wild AEV. The clone pBRgag-J-env 2LTR thus obtained is analyzed by mapping.
Il est à noter que cette étape conduit à l'apparition d'un site EcoRI supplémentaire situé à la jonction des séquences AEV et pBR322. Celui-ci devra être éliminé ultérieurement par digestion partielle afin de n'avoir qu'un site EcoRI situé en 3' du fragment J et qui servira au clonage des gènes à insérer.It should be noted that this step leads to the appearance of an additional EcoRI site located at the junction of the AEV and pBR322 sequences. This will have to be eliminated later by partial digestion in order to have only one EcoRI site located 3 ′ of fragment J and which will be used for cloning the genes to be inserted.
Ce clone pBRgag-J-env 2LTR contient entre les 2 LTR le génome de l'AEV sans séquence oncogène, il possède également un site de clonage unique Xbal situé en 5' du fragment J.This pBRgag-J-env 2LTR clone contains between the 2 LTRs the AEV genome without oncogenic sequence, it also has a unique Xbal cloning site located 5 ′ of fragment J.
Un fragment de restriction Xbal du transposon Tn5 incluant le gène Neor est introduit dans le site Xbal de pBRgagJ-env 2LTR, le plasmide résultant est pAEV TSN qui induit la résistance au G418 pour les cellules aviaires transformées.An Xbal restriction fragment of the Tn5 transposon including the Neo r gene is introduced into the Xbal site of pBRgagJ-env 2LTR, the resulting plasmid is pAEV TSN which induces resistance to G418 for transformed avian cells.
EXEMPLE 17 TRANSFERT DE GENES SOUS LA DEPENDANCE DU PROMOTEUR VIRALEXAMPLE 17 GENE TRANSFER UNDER THE VIRAL PROMOTER DEPENDENCE
Dans une première série de constructions, le gène Neor du transposon bactérien Tn5 a été inséré à la place du gène v-erbB (exemples 12 et suivants). Les virus produits pouvaient induire la résistance des cellules infectées à la drogue G418 démontrant ainsi la transcription et la traduction correctes du gène inséré. Cette construction laissait cependant subsister plusieurs codons d'initiation potentiels de traduction, dans des cadres de lectures diverses, en amont de la séquence codante du gène Neor. Afin d'augmenter l'efficacité de traduction du gène et dans le but de produire un vecteur universel de transfert, la séquence du vecteur a été modifiée afin de ne laisser subsister que les codons initiateurs normalement utilisés pour la traduction des gènes viraux. a) Construction d'un vecteur universel portant un site de clonage Ndel au niveau d'un codon initiateur ATG (figure 30) La région codante du gène v-erbB présente en 5' la séquence suivante : - - - - 5 '
Figure imgf000070_0002
' - - - -In a first series of constructions, the Neo r gene of the bacterial transposon Tn5 was inserted in place of the v-erbB gene (examples 12 and following). Viruses produced could induce cell resistance infected with the drug G418 thus demonstrating the correct transcription and translation of the inserted gene. This construction, however, left several potential initiation codons for translation, in various reading frames, upstream of the coding sequence of the Neo r gene. In order to increase the translation efficiency of the gene and in order to produce a universal transfer vector, the sequence of the vector has been modified so as to leave only the initiating codons normally used for the translation of viral genes. a) Construction of a universal vector carrying an Ndel cloning site at the level of an ATG initiator codon (FIG. 30) The coding region of the v-erbB gene has the following sequence in 5 ': - - - - 5'
Figure imgf000070_0002
'- - - -
Après splicing de l'ARN génomique en ARN sousgénomique, cette séquence s'ordonne à la suite de la séquence leader de l'ARN sous-génomique qui porte le codon initiateur de traduction. Cet arrangement fournit la trame codante indiquée ci-dessus
Figure imgf000070_0001
After splicing of the genomic RNA into subgenomic RNA, this sequence is ordered following the leader sequence of the subgenomic RNA which carries the translation initiator codon. This arrangement provides the coding frame indicated above
Figure imgf000070_0001
On a créé un site Ndel recouvrant le codon ATG par la méthode de mutagénèse ponctuelle dirigée, selon ZOLLER et coll. (1983), en utilisant un oligonucléotide synthétique de séquence :An NdeI site overlying the ATG codon was created by the site directed mutagenesis method, according to ZOLLER et al. (1983), using a synthetic oligonucleotide of sequence:
5' CACTTCA TGGTGGTCTGG
Figure imgf000070_0003
Ndel
Figure imgf000070_0004
5 'CACTTCA TGGTGGTCTGG
Figure imgf000070_0003
Edel
Figure imgf000070_0004
La modification de séquence a été réalisée sur le clone p15-16 (figure 12) pour fournir le clone pXJ7 dans lequel la séquence en 5' du gène v-erbB est maintenant la suivante : 5 ' 5
Figure imgf000070_0005
The sequence modification was carried out on the clone p15-16 (FIG. 12) to provide the clone pXJ7 in which the 5 ′ sequence of the v-erbB gene is now as follows: 5 ′ 5
Figure imgf000070_0005
Ndel Cette séquence a été insérée dans le vecteur selon la construction présentée sur la figure 30 pour fournir finalement le génome viral vecteur porté par le plasmide pXJ11 à partir de pJS21 et pAEV124 obtenu par délétion Pstl-PstI dans le gène v-erbA de pAEV11.Edel This sequence was inserted into the vector according to the construction presented in FIG. 30 to finally supply the vector viral genome carried by the plasmid pXJ11 from pJS21 and pAEV124 obtained by deletion Pstl-PstI in the v-erbA gene of pAEV11.
Ce clone offre donc un système universel de construction de génomes vecteurs dans lesquels toute séquence insérée au site de clonage Ndel sera automatiquement en phase avec la trame de traduction protéique initiée dans la région leader des ARN viraux transcrits. Les gènes qui devront être intégrés dans ces vecteurs devront par conséquent comporter un site de restriction Ndel au niveau de leur codon ATG initiateur. b) Construction d'un gène Neor portant un site de restriction Ndel au niveau du codon initiateur La séquence nucléotidique au niveau de la région 5' du gène Neor est la suivante :This clone therefore offers a universal system for constructing vector genomes in which any sequence inserted at the Ndel cloning site will be automatically in phase with the protein translation frame initiated in the leader region of the transcribed viral RNAs. The genes which will have to be integrated into these vectors will therefore have to contain an NdeI restriction site at the level of their initiating ATG codon. b) Construction of a Neo r gene carrying an NdeI restriction site at the level of the initiating codon The nucleotide sequence at the level of the 5 ′ region of the Neo r gene is as follows:
5'GATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGC A
Figure imgf000071_0001
Cette séquence a été modifiée par mutagénèse ponctuelle dirigée au moyen d'un oligonucléotide de synthèse de séquence :5'GATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGC A
Figure imgf000071_0001
This sequence was modified by site-directed point mutagenesis using a sequence synthesis oligonucleotide:
5' GATCGTTTCA TGATTGAAC 3'
Figure imgf000071_0002
Figure imgf000071_0003
5 'GATCGTTTCA TGATTGAAC 3'
Figure imgf000071_0002
Figure imgf000071_0003
NdelEdel
On a ainsi construit le plasmide pXJ10 contenant le gène Neo modifié dans lequel un site Ndel apparaît au niveau du codon initiateur. La partie codante du gène peut être isolée de ce plasmide après digestion par Ndel et BglII. c) Construction d'un vecteur rétroviral portant le gène Neor modifiéThe plasmid pXJ10 containing the modified Neo gene was thus constructed in which an NdeI site appears at the level of the initiator codon. The coding part of the gene can be isolated from this plasmid after digestion with NdeI and BglII. c) Construction of a retroviral vector carrying the modified Neo r gene
La partie codante du gène Neo modifié a été insérée dans le plasmide pXJ11 au niveau du site Ndel de telle façon que la séquence Neor soit dans le sens de transcription normal du génome viral. On a obtenu ainsi le plasmide pXJ12. La structure finale du plasmide et du génome viral a été vérifiée par cartographie de restriction notamment pour confirmer la présence du site Ndel et par conséquent la validité de la séquence avoisinant le codon initiateur du gène. La structure de; ce plasmide est donnée sur la figure 31.The coding part of the modified Neo gene was inserted into the plasmid pXJ11 at the NdeI site so that the Neo r sequence is in the direction of normal transcription of the viral genome. Plasmid pXJ12 was thus obtained. The final structure of the plasmid and the viral genome was verified by restriction mapping, in particular to confirm the presence of the NdeI site and therefore the validity of the sequence bordering on the gene initiating codon. The structure of; this plasmid is given in FIG. 31.
Ce plasmide, lorsqu'il est transféré dans des bactéries, induit leur résistance à la kanamycine à la concentration de 50 μg/ml. Ce plasmide constitue ainsi une sorte de vecteur navette pouvant être sélectionné aussi bien sur bactéries sous la forme de plasmide que sur cellules aviaires sous forme de provirus. d) Production de virus dérivés du plasmide pXJ12 Par cotransformation de l'ADN du plasmide pXJ12 et de l'ADN contenant les génomes de virus helper RAV-1 ou RAV-2 sur fibroblastes de poulet, on a pu récupérer des virions AEV-XJ1 (RAV-1) et AEV-XJ12 (RAV-2). Ces virions peuvent infecter des fibroblastes de poulet in vitro et induire leur résistance à la drogue G418.This plasmid, when transferred to bacteria, induces their resistance to kanamycin at a concentration of 50 μg / ml. This plasmid thus constitutes a sort of shuttle vector which can be selected both on bacteria in the form of plasmid and on avian cells in the form of provirus. d) Production of viruses derived from the plasmid pXJ12 By cotransformation of the DNA of the plasmid pXJ12 and of the DNA containing the helper virus genomes RAV-1 or RAV-2 on chicken fibroblasts, it was possible to recover virions AEV-XJ1 (RAV-1) and AEV-XJ12 (RAV-2). These virions can infect chicken fibroblasts in vitro and induce their resistance to the drug G418.
Le virus AEV-XJ12 constitue donc un vecteur viral sélectionnable. Les gènes à transférer pourront être insérés dans la région encore occupée par les séquences v-erbA. e) Expression des gènes viraux dans les fibroblastes de poulet infectés par les vecteurs AEV-XJ1 et AEV-XJ12 Afin de vérifier si l'insertion du gène Neor dans le génome viral n'altère pas les mécanismes de transcription, on a analysé les ARN produits dans des fibroblastes de poulet infectés par les vecteurs AEV-XJ1 (vecteur contenant plusieurs ATG) et AEV-XJ12. On retrouve dans ces cellules deux types d'ARN correspondant aux ARN génomiques et sous-génomiques, ce qui démontre que la maturation des ARN est correcte. Cependant, dans les cellules infectées par AEV-XJ1, on observe une prédominance de l'ARN sous-génomique qui code pour la protéine Neor. Les expressions relatives des ARN génomiques et sous-génomiques ne sont pas sensiblement différentes dans les cellules cultivées en présence ou en l'absence de G418. Par contre, dans les fibroblastes infectés par AEV-XJ12, on observe sensiblement plus d'ARN génomique que d'ARN sous-génomique, dans un rapport qui est identique à celui observé pour l'AEV sauvage. f) Méthode de titrage de virus aviaires portant le gène Neor Le titrage biologique de virus portant un gène Neor repose sur l'induction de la résistance au G418 de cellules infectées. Aucune méthode standard n'a jusqu'à présent été proposée pour les virus aviaires. On a développé une méthode qui repose sur l'utilisation de fibroblastes d'embryon de poulet de souche Leghorn Spafas C/O. Ces cellules sont sensibles à tous les sous-groupes rétroviraux aviaires. En pratique, des fibroblastes secondaires en culture sont infectés avec des dilutions croissantes de suspension de virus, puis cultivés en présence de G418. Le titre du. virus en r-ffu/ml (résistant focus forming unit) représente le produit du nombre de foyers résistants par culture par la dilution de la suspension virale utilisée pour l'infection.The AEV-XJ12 virus therefore constitutes a selectable viral vector. The genes to be transferred can be inserted into the region still occupied by the v-erbA sequences. e) Expression of the viral genes in chicken fibroblasts infected with the vectors AEV-XJ1 and AEV-XJ12 In order to verify whether the insertion of the Neo r gene into the viral genome does not alter the transcription mechanisms, the RNA produced in chicken fibroblasts infected with the vectors AEV-XJ1 (vector containing several ATGs) and AEV-XJ12. We find in these cells two types of RNA corresponding to genomic and sub-genomic RNA, which demonstrates that the maturation of RNA is correct. However, in cells infected with AEV-XJ1, there is a predominance of the subgenomic RNA which codes for the protein Neo r . The relative expressions of the genomic and sub-genomic RNAs are not significantly different in the cells cultured in the presence or in the absence of G418. In contrast, in fibroblasts infected with AEV-XJ12, substantially more genomic RNA is observed than subgenomic RNA, in a ratio which is identical to that observed for wild-type AEV. f) Method for titrating avian viruses carrying the Neo r gene Biological titration of viruses carrying a Neo r gene is based on the induction of resistance to G418 in infected cells. No standard method has so far been proposed for avian viruses. We have developed a method based on the use of fibroblasts from Leghorn Spafas C / O chicken embryos. These cells are sensitive to all avian retroviral subgroups. In practice, secondary fibroblasts in culture are infected with increasing dilutions of virus suspension, then cultured in the presence of G418. The title of the. virus in r-ffu / ml (resistant focus forming unit) represents the product of the number of resistant outbreaks per culture by the dilution of the viral suspension used for infection.
Un point critique de ce test est le moment d'addition de la drogue par rapport au moment de l'infection. L'addition de la drogue ne doit pas être trop tardif pour éviter les infections secondaires ce qui conduirait à surestimer le titre du virus , ni trop précoce afin de permettre l'expression de la protéine Neo en quantité suffisante dans les cellules infectées afin de les rendre résistantes.A critical point of this test is the time of addition of the drug compared to the time of infection. The addition of the drug should not be too late to avoid secondary infections which would lead to overestimating the titer of the virus, or too early to allow the expression of the Neo protein in quantity sufficient in infected cells to make them resistant.
Une analyse cinétique montre que l'estimation du titre par ce test est identique lorsque la drogue est ajoutée dans les 24 heures qui suivent l'infection. La dose de G418 utilisée pour les fibroblastes de pouletKinetic analysis shows that the titer estimate by this test is identical when the drug is added within 24 hours of infection. The dose of G418 used for chicken fibroblasts
Spafas est de 200 μg/ml.Spafas is 200 μg / ml.
EXEMPLE 18 DEVELOPPEMENT DE CELLULES HELPER AVIAIRES Cet exemple concerne des cultures de cellules helper aviaires dans lesquelles les 3 gènes gag, pol et env s'expriment mais ne peuvent pas s'encapsider dans les virions produits.EXAMPLE 18 DEVELOPMENT OF AVIAN HELPER CELLS This example concerns cultures of avian helper cells in which the 3 gag, pol and env genes are expressed but cannot be packaged in the produced virions.
L'ensemble des gènes gag-pol-env a été isolé en un fragment unique d'ADN à partir d'un plasmide contenant le génome du virus helper RAV-1 fourni par J.M. BISHOP (UCSF). Ce fragment est limité en 5' par un site Sacl situé à 146 nucléotides en amont du codon initiateur du gène gag, et en 3' par un site AccI situé à 120 nucléotides en aval du codon de terminaison du gène env. Les séquences responsables de l'encapsidation des génomes viraux aviaires ne sont pas présentes dans le fragment considéré. Ce fragment a été inséré dans des plasmides permettant l'expression de gènes dans des cellules eucaryotiques.The set of gag-pol-env genes was isolated in a single DNA fragment from a plasmid containing the genome of the RAV-1 helper virus provided by J.M. BISHOP (UCSF). This fragment is limited in 5 'by a SacI site located 146 nucleotides upstream of the initiator codon of the gag gene, and in 3' by an AccI site located in 120 nucleotides downstream of the termination codon of the env gene. The sequences responsible for the packaging of avian viral genomes are not present in the fragment considered. This fragment was inserted into plasmids allowing the expression of genes in eukaryotic cells.
Dans le plasmide HP1, l'ensemble gag-pol-env a été clone entre le promoteur du gène TK du virus HSVl et le signal de polyadénylation du même virus tous deux isolés du plasmide pAG60 de COLBERE-GARAPIN et al. (1981).In the plasmid HP1, the gag-pol-env set was cloned between the promoter of the TK gene of the HSV1 virus and the polyadenylation signal of the same virus, both isolated from the plasmid pAG60 from COLBERE-GARAPIN et al. (nineteen eighty one).
Dans le plasmide HP2, les gènes gag-pol-env ont été insérés entre le promoteur-enhancer du gène précoce du virus SV40 et une séquence contenant l'intron du gène t et le signal de polyadénylation du virus SV40, tous isolés du plasmide pSV2gpt de MULLIGAN et BERG (1981). Ces plasmides ont été transfectés sur des cellules de caille, lignée QT6, et des fibroblastes de poulet. Afin de sélectionner les cellules transfectées, les ADN de ces plasmides ont été cotransfectées avec l'ADN de plasmides portant un marqueur de sélection, soit le plasmide pAG60, soit le plasmide pXJ12. Les foyers de cellules résistantes après sélection par G418 ont été prélevés et cultivés isolément. D'autres ont été regroupés et cultivés en mélange. La production de particules virales par ces cellules a été testée en cherchant la présence de réverse transcriptase sous forme particulaire dans les surnageants des cultures. Cette activité a été comparée à celle des surnageants des cellules érythroleucémiques 6C2 de poulet hautement productrices de virus AEV. Sur 9 cultures de cellules QT6 transfectées avec HP1 et HP2, 7 présentent une activité réverse transcriptase significative dont 5 montrent une activité supérieure à celle des cellules 6C2.In the plasmid HP2, the gag-pol-env genes were inserted between the promoter-enhancer of the SV40 virus early gene and a sequence containing the t gene intron and the SV40 virus polyadenylation signal, all isolated from the plasmid pSV2gpt MULLIGAN and BERG (1981). These plasmids were transfected into quail cells, QT6 line, and chicken fibroblasts. In order to select the transfected cells, the DNAs of these plasmids were cotransfected with the DNA of plasmids carrying a selection marker, either the plasmid pAG60 or the plasmid pXJ12. The foci of resistant cells after selection by G418 were removed and cultured in isolation. Others have been grouped and cultivated as a mixture. The production of viral particles by these cells was tested by looking for the presence of reverse transcriptase in particulate form in the culture supernatants. This activity was compared with that of the supernatants of the chicken erythroleukemic cells 6C2 which are highly productive of the AEV virus. Out of 9 cultures of QT6 cells transfected with HP1 and HP2, 7 have significant reverse transcriptase activity, 5 of which show activity greater than that of 6C2 cells.
Ces résultats démontrent :These results demonstrate:
- d'une part, que l'expression des gènes gag, pol et env est possible à partir d'un promoteur autre que celui contenu dans les LTR virales,on the one hand, that the expression of the gag, pol and env genes is possible from a promoter other than that contained in the viral LTRs,
- d'autre part, que l'on peut produire des virions extracellulaires à partir de génomes viraux helper dépourvus des LTR et des séquences d'encapsulation.- on the other hand, that extracellular virions can be produced from helper viral genomes lacking LTRs and encapsulation sequences.
Les vecteurs selon la présente invention permettent dé préparer des cellules résistantes au G418 et ont permis de cloner et d'exprimer la globine humaine, en particulier la delta globine humaine, les expériences sur les autres globines ayant donné des résultats équivalents. 3The vectors according to the present invention make it possible to prepare cells resistant to G418 and have made it possible to clone and express human globin, in particular human delta globin, the experiments on the other globins having given equivalent results. 3
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MICRO-ORGANISMESMICRO-ORGANISMS
Feuille facultative relative au micro-organisme mentionné an page 74 , ligne 6 à 9 d* la dtacrtption >Optional sheet relating to the microorganism mentioned in page 74, lines 6 to 9 of the description>
A. IDENTIFICATION OU OtPOT >A. IDENTIFICATION OR OtPOT>
O'autrea déoâts «ont identifiés »ur une feuille supplémentaire > QO'autrea deoat "identified" on an additional sheet> Q
Nom de l'Inatltutlon de dépit «Name of the Inatltutlon of spite "
INSTITUT PASTEURPASTOR INSTITUTE
Collection Nationale de Cultures de MicroorganismesNational Collection of Cultures of Microorganisms
Adrtiat de l'Inatltutlon de dépit (y eomprie le code poital et le paya) «Adatiat of the Inatltutlon of spite (it includes the poital code and the paya) "
28, rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX - FRANCE28, rue du Docteur Roux 75724 PARIS CEDEX - FRANCE
Date du dépdt * 9 OCTOBRE 1985 i N* d'ordre »Date of deposit * OCTOBER 9, 1985 i Order number "
Souche E. coli 600 PAEV TSN J nn . T-4 .2E. coli strain 600 PAEV TSN J nn. T-4 .2
INDICATIONS SUPPLÉMENTAIRES ' (à ne remplir que il néceaaaire). Une feuille séparée eat lointe pour la «uite de cea rentelgntmenta ] |ADDITIONAL INFORMATION '(to be completed only if necessary). A separate sheet is farte for the “uite de cea rentelgntmenta] |
suite dépôt 9 octobre 1985following filing October 9, 1985
Souche E. coli 600 RS pAEVA28 no 1-493E. coli 600 RS strain pAEVA28 no 1-493
Souche E. coli 600 RS pAEVXJ12 noI-494E. coli 600 RS strain pAEVXJ12 noI-494
ÉTATS DÉSIGNÉS POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT DONNEES > (ai lea indlcationa ne aont paa doππéea pour loua lee Etala déaignée)DESIGNATED STATES FOR WHICH THE INDICATIONS ARE GIVEN> (ai lea indlcationa ne aont paa doππéea pour loua lee Etala désaignée)
O. INDICATIONS FOURNIES SÉPARÉMENT • (a n* remplir que il nécessaire)O. INDICATIONS PROVIDED SEPARATELY • (fill in as necessary)
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Formulaire PCT. RO, 13-4 (Janvier 1 .1) REFERENCESPCT form. RO, 13-4 (January 1 .1) REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
I. Virus de clonage ou d'expression d'un gène étranger, caractérisé en ce qu'il est constitué par tout ou partie du génome d'un rétrovirus et comporte au moins un gène étranger situé entre les deux séquences LTR. I. Virus for cloning or expression of a foreign gene, characterized in that it is constituted by all or part of the genome of a retrovirus and comprises at least one foreign gene located between the two LTR sequences.
2. Virus de clonage ou d'expression d'un gène étranger, caractérisé en ce que le rétrovirus est un virus aviaire.2. Virus of cloning or expression of a foreign gene, characterized in that the retrovirus is an avian virus.
3. Virus selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le rétrovirus est le virus de l'érythroblastose aviaire.3. Virus according to claim 1 or 2, characterized in that the retrovirus is the avian erythroblastosis virus.
4. Virus selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il présente un caractère oncogène.4. Virus according to claims 1 to 3, characterized in that it has an oncogenic character.
5. Virus selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence v-erbB a été conservée. 5. Virus according to claim 4, characterized in that the v-erbB sequence has been conserved.
6. Virus selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le gène étranger a été inséré entre la fin du gène v-erbB et la séquence LTR en aval.6. Virus according to one of claims 1 to 5, characterized in that the foreign gene has been inserted between the end of the v-erbB gene and the downstream LTR sequence.
7. Virus selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le gène étranger est orienté dans le sens de lecture du génome viral.7. Virus according to one of claims 1 to 6, characterized in that the foreign gene is oriented in the reading direction of the viral genome.
8. Virus selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le gène étranger est orienté dans le sens opposé au sens de lecture du génome viral.8. Virus according to one of claims 1 to 7, characterized in that the foreign gene is oriented in the direction opposite to the direction of reading of the viral genome.
9. Virus selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le gène étranger est sous la dépendance d'un promoteur du rétrovirus.9. Virus according to one of claims 1 to 8, characterized in that the foreign gene is dependent on a promoter of the retrovirus.
10. Virus selon la revendication 9, caractérisé en ce que le virus vecteur est le virus AEV2LTR.10. Virus according to claim 9, characterized in that the vector virus is the AEV2LTR virus.
11. Virus selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de caractère oncogène. 11. Virus according to one of claims 1 to 3, characterized in that it is devoid of oncogenic character.
12. Virus selon la revendication 11, caractérisé en ce que le gène v-erbB a été au moins partiellement délété.12. Virus according to claim 11, characterized in that the v-erbB gene has been at least partially deleted.
13. Virus selon l'une des revendications 11 et 12, caractérisé en ce qu'au moins un gène étranger est inséré en aval du gène v-erbA.13. Virus according to one of claims 11 and 12, characterized in that at least one foreign gene is inserted downstream of the v-erbA gene.
14. Virus selon la revendication 11, caractérisé en ce que les gènes v-erbB et v-erbA ont été délétés.14. Virus according to claim 11, characterized in that the v-erbB and v-erbA genes have been deleted.
15. Virus selon la revendication 14, caractérisé en ce que deux gènes étrangers sont insérés entre les deux séquences LTR.15. Virus according to claim 14, characterized in that two foreign genes are inserted between the two LTR sequences.
16. Virus selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'un des gènes étrangers est inséré entre les deux sites d'épissage et l'autre gène étranger est inséré à l'extérieur des sites d'épissage et en aval de ceux-ci.16. Virus according to claim 14, characterized in that one of the foreign genes is inserted between the two splice sites and the other foreign gene is inserted outside the splice sites and downstream of them. this.
17. Virus selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisé en ce que les deux gènes étrangers insérés sont chacun,de façon indépendante et dans un rapport donné, sous le contrôle d'un même promoteur. 17. Virus according to one of claims 15 and 16, characterized in that the two foreign genes inserted are each, independently and in a given ratio, under the control of the same promoter.
18. Virus selon la revendication 17, caractérisé en ce que parmi les deux gènes étrangers insérés, l'un fournit un caractère sélectionnable.18. Virus according to claim 17, characterized in that among the two foreign genes inserted, one provides a selectable character.
19. Virus selon les revendications 11 à 18, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un gène marqueur, en particulier un gène de résistance à un antibiotique, qui s'exprime dans les cellules.19. Virus according to claims 11 to 18, characterized in that it comprises at least one marker gene, in particular an antibiotic resistance gene, which is expressed in cells.
20. Virus selon les revendications 11 à 19, caractérisé en ce que au moins un gène étranger inséré est choisi parmi les gènes humains de globine delta, de globine béta, de globine alpha et le gène d'origine bactérienne NeoR.20. Virus according to claims 11 to 19, characterized in that at least one inserted foreign gene is chosen from the human delta globin, beta globin, alpha globin genes and the gene of bacterial origin Neo R.
21. Virus selon les revendications 1 à 20, caractérisé en ce que le ou les gènes étrangers insérés comportent en amont leurs propres éléments d'expression dans les cellules eucaryotes. 21. Virus according to claims 1 to 20, characterized in that the inserted foreign gene(s) comprise upstream their own expression elements in eukaryotic cells.
22. Virus selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que les gènes étrangers insérés sont sous la dépendance d'un élément d'expression viral.22. Virus according to one of claims 1 to 20, characterized in that the inserted foreign genes are dependent on a viral expression element.
23. Virus selon l'une des revendications 14 à 22, caractérisé en ce que le virus de clonage et d'expression en lui-même comporte au moins un site de restriction unique entre les deux sites d'épissage et un site de restriction unique à l'extérieur et en aval des sites d'épissage.23. Virus according to one of claims 14 to 22, characterized in that the cloning and expression virus itself comprises at least one unique restriction site between the two splicing sites and a unique restriction site outside and downstream of splice sites.
24. Virus selon la revendication 23, caractérisé en ce que le site de restriction unique à l'extérieur des sites d'épissage est un site Ndel situé au niveau du codon d'initiation du gène v-erbB.24. Virus according to claim 23, characterized in that the unique restriction site outside the splicing sites is an Ndel site located at the initiation codon of the v-erbB gene.
25. Virus selon la revendication 23, caractérisé en ce que les gènes insérés sont sous la dépendance du promoteur de la séquence leader .25. Virus according to claim 23, characterized in that the inserted genes are dependent on the promoter of the leader sequence.
26. Plasmide vecteur de clonage ou d'expression d'un gène étranger, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence composite d'ADN transcrit réverse d'un virus selon l'une des revendications 1 à 25. 26. Plasmid vector for cloning or expression of a foreign gene, characterized in that it comprises a composite reverse transcribed DNA sequence of a virus according to one of claims 1 to 25.
27. Plasmide selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'ADN d'un plasmide bactérien, d'un phage ou d'un cosmide.27. Plasmid according to claim 26, characterized in that it comprises a DNA sequence of a bacterial plasmid, a phage or a cosmid.
28. Plasmide selon la revendication 27, caractérisé en ce que la séquence d'ADN de plasmide bactérien comporte au moins une origine de réplication dans les bactéries et un gène marqueur de sélection dans les bactéries.28. Plasmid according to claim 27, characterized in that the bacterial plasmid DNA sequence comprises at least one origin of replication in bacteria and a selection marker gene in bacteria.
29. Procédé de modification de cellules eucaryotes, caractérisé en ce qu'on effectue une infection des cellules avec des virus selon l'une des revendications 1 à 25.29. Method for modifying eukaryotic cells, characterized in that the cells are infected with viruses according to one of claims 1 to 25.
30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce qu'on effectue une coinfection avec un"virus assis tant" qui comporte les gènes assurant la réplication du virus de clonage ou d'expression. 30. Method according to claim 29, characterized in that a coinfection is carried out with a “sitting virus” which comprises the genes ensuring the replication of the cloning or expression virus.
31. Procédé de modification de cellules eucaryotes caractérisé en ce qu'on effectue une transfection des cellules avec des plasmides, selon l'une des revendications 26 à 28. 31. Process for modifying eukaryotic cells, characterized in that the cells are transfected with plasmids, according to one of claims 26 to 28.
32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce qu'on effectue une cotransfection des cellules avec un "plasmide assistant" dont les gènes assurent la réplication du vecteur de clonage ou d'expression.32. Method according to claim 31, characterized in that a cotransfection of the cells is carried out with a “helper plasmid” whose genes ensure the replication of the cloning or expression vector.
33. Cellule modifiée obtenue par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 29 à33. Modified cell obtained by implementing a method according to one of claims 29 to
32.32.
34. Cellule selon la revendication 33,caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules aviaires.34. Cell according to claim 33, characterized in that it is avian cells.
35. Cellule selon la revendication 34, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules hématopolétiques ou de cellules germinales.35. Cell according to claim 34, characterized in that they are hematopoietic cells or germinal cells.
36. Cellule selon la revendication 33, caractérisée en ce qu'il s'agit de fibroplastes embryonnaires de poulet. 36. Cell according to claim 33, characterized in that it is chicken embryonic fibroplasts.
37. Cellule selon l'une des revendications37. Cell according to one of the claims
33 à 36, caractérisée en ce que le gène étranger est intégré dans le génome de la cellule sous forme de provirus.33 to 36, characterized in that the foreign gene is integrated into the genome of the cell in the form of a provirus.
38. Cellule selon la revendication 37, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule non-aviaire.38. Cell according to claim 37, characterized in that it is a non-avian cell.
39. Procédé de préparation d'au moins une protéine déterminée par culture de cellules selon l'une des revendications 33 à 38, le gène étranger codant pour ladite protéine, la protéine étant récupérée après culture. 39. Process for preparing at least one protein determined by cell culture according to one of claims 33 to 38, the foreign gene coding for said protein, the protein being recovered after culture.
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