DE69932528T2

DE69932528T2 - Mit einer Fibrinschicht ausgestattetes Element, Herstellung und dessen Verwendung

Info

Publication number: DE69932528T2
Application number: DE69932528T
Authority: DE
Inventors: Yves Delmotte; Nathalie Belot; Pierre Vermeulen; Nicole Tasiaux
Original assignee: Baxter International Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1998-11-04
Filing date: 1999-11-04
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2019-11-05
Also published as: JP4713740B2; CA2348904C; EP1124591A1; ATE333904T1; DE1124591T1; WO2000025838A9; CA2348904A1; BE1012536A3; EP1124591B1; JP2002528233A; JP2010269154A; US7226657B1; AU1467100A; HK1035872A1; DE69932528D1; AU763443B2; WO2000025838A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Element mit einer auf Fibrin basierenden Schicht, wobei das Element (a) einen hydrophoben oder im wesentlichen hydrophoben Träger, der einen porösen Teil mit einer Dicke von 0,1 bis 5 mm aufweist und dessen Poren, welche sich über seine Dicke erstrecken, einen durchschnittlichen Durchmesser von 5 bis 40 μm aufweisen, wobei eine Fläche des porösen Teils mit einer auf Fibrin und/oder Fibrinogen basierenden Verbindung behandelt ist, und (b) eine auf Fibrin basierende Schicht, welche die behandelte Fläche des Trägers bedeckt, wobei die Fibrinschicht und mindestens die mit der Fibrinschicht in Kontakt stehende Fläche des Trägers weniger als 0,5 Gew.-% Fibrinogen enthalten, umfaßt.
Solche Elemente sind aus WO 96/07444 und aus US 5298255 bekannt. Diese bekannten Elemente werden durch einfaches Eintauchen eines Trägers in eine Lösung, enthaltend Fibrinogen und Thrombin, oder durch Drücken dieser Lösung durch einen porösen Träger hergestellt. Diese bekannten Elemente, wenn durch einfaches Eintauchen hergestellt, weisen im wesentlichen eine kompakte Fibrinschicht und wenig oder kein Fibrin in den Trägerporen auf, oder sie weisen aufgrund eines einfacheren Durchgangs von Fibrin durch die Poren mit größeren Durchmessern in den Poren mit größeren Durchmessern Fibrin und in den Poren mit kleineren Durchmessern im wesentlichen kein Fibrin auf. Dieser einfachere Durchgang von Fibrin durch die Poren mit größeren Durchmessern bewirkt ein Fehlen von Homogenität oder Gleichförmigkeit.
In manchen Fällen hat sich gezeigt, daß ein solches Fehlen von Homogenität oder Gleichförmigkeit in bezug auf die Gegenwart von Fibrin in den Trägerporen die Zellenanhaftung beeinträchtigt.
Diese Erfindung zielt auf eine Vorbeugung dieser Nachteile ab und bezieht sich im wesentlichen auf ein Element, wie im ersten Absatz dieser Beschreibung beschrieben, wobei das Element dadurch gekennzeichnet ist, daß die auf Fibrin basierende Schicht im wesentlichen gleichförmig und homogen auf der behandelten Oberfläche vorliegt. Die erfindungsgemäße Fibrinschicht ist dadurch gekennzeichnet, daß kein Fibrinogen in der Fibrinschicht gebunden vorliegt. Das Fehlen von Fibrinogen in der Fibrinschicht kann anhand der Abwesenheit der γ-Bande in dem Elektrophoresediagramm erkannt werden. Das Fehlen von Fibrinogen in der Fibrinschicht wird dadurch verursacht, daß irgendwelches Fibrinogen, welches nicht unter Bildung der Fibrinschicht reagiert hat, durch den porösen Träger gesaugt wurde. Das erfindungsgemäße Element ist somit dadurch gekennzeichnet, daß an der Kontaktoberfläche zwischen der Fibrinschicht und dem Träger vorzugsweise im wesentlichen kein Fibrinogen vorliegt, welches nicht reagiert hat. Die Fibrinschicht des erfindungsgemäßen Elements enthält beispielsweise weniger als 2 Gew.-% an Fibrinogen, welches nicht unter Bildung eines Fibrinnetzwerks reagiert hat, vorzugsweise weniger als 1%, insbesondere weniger als 0,5% und stärker bevorzugt weniger als 0,1%.
Vorteilhafterweise enthält die Fibrinschicht und mindestens eine Trägerschicht, die sich über eine Dicke von 10 μm erstreckt, weniger als 0,5 Gew.-%, bevorzugt weniger als 0,1 Gew.-%, Fibrinogen, welches nicht reagiert hat, bezogen auf das Gewicht der Fibrinschicht. Vorzugsweise erstreckt sich das Fibrin über die Dicke des behandelten porösen Teils des Trägers, von der behandelten Fläche bis zu einer Tiefe von mindestens 2 μm, sowohl durch die Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10 bis 20 μm als auch durch die Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mehr als 20 μm.
Gemäß einer bestimmten Ausführungsform, in welcher der poröse Teil des Trägers eine im wesentlichen homogene und gleichförmige Porosität über die behandelte Fläche aufweist, erstreckt sich etwas Fibrin homogen und gleichförmig über die Dicke des porösen Teils des Trägers bis zu einer Tiefe von mindestens 10 μm. Gemäß einer möglichen Ausführungsform enthält der poröse Träger Fibrinogen in einer Schicht, welche sich in einem Abstand von mehr als 10 μm von der mit der Fibrin schicht in Kontakt stehenden Fläche befindet, insbesondere bis zu einer Tiefe von 20 μm.
Die Gegenwart von freiem Fibrinogen (welches noch nicht reagiert hat) muß vorzugsweise verhindert werden, wenn das Fibrinnetzwerk bereits gebildet worden ist, um zu verhindern, daß sich beim erneuten Eintauchen der getrockneten Fibrinschicht neue Fibrin-Bindungen in dem Netzwerk bilden, denn solche Bindungen verringern die Größe der Alveolen oder einiger der Alveolen des Netzwerks.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung erstreckt sich etwas Fibrin, welches an dem Netzwerk angehaftet ist, über die Dicke des behandelten porösen Teils des Trägers, von der behandelten Oberfläche bis zu einer Tiefe von mindestens 2 μm, durch die Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10 bis 20 μm und durch die Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mehr als 20 μm. Obwohl der Träger aus irgendeinem hydrophoben oder im wesentlichen hydrophoben Material hergestellt werden kann, wird er insbesondere aus Polyethylen, Polyethylentherephthalat oder Polytetrafluorethylen hergestellt, wobei die Materialien vorteilhaft gestreckt werden, insbesondere in beide axiale Richtungen.
Die Bezeichnung hydrophobes oder im wesentlichen hydrophobes Material wird hierin verwendet, um Materialien mit einem Kontaktwinkel von 30 bis 50° zu erkennen, wobei der Kontaktwinkel mit dem Verfahren ASTM D 2578-84 gemessen wird.
Der poröse Teil des Trägers weist vorteilhaft eine im wesentlichen homogene und gleichförmige Porosität über die behandelte Oberfläche auf, d. h., die Porenverteilung oder Anzahl in Oberflächeneinheiten ist bezüglich des porösen Teils im wesentlichen gleichförmig. Wenn beispielsweise ein poröser Teil vorgegeben ist, schwankt das Volumen der Poren mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm in einem Bereich von 1 cm² des porösen Teils für jeden cm² des porösen Teils vom 0,8- bis 1,2fachen, vorzugsweise vom 0,9- bis 1,1fachen des durchschnittlichen Volumens von Poren mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm.
Gemäß einer Ausführungsform wird mindestens die der mit dem porösen Träger in Kontakt stehenden Fläche gegenüberliegende Fläche der Fibrinschicht stabilisiert. Insbesondere wird die auf Fibrin basierende Schicht mindestens teilweise vernetzt, um ein Netzwerk von benachbarten Alveolen mit Öffnungen dazwischen zu bilden. Die Schicht wird vorteilhaft genügend vernetzt, so daß sie nicht wasserlöslich ist. Gemäß einem Detail einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Schicht mit Zellen und/oder Proteinen, insbesondere mit Zell-Fibrin-Bindungen vermittelnden Proteinen, mit Fibronectin usw. ausgestattet
Obwohl die Dicke der Fibrinschicht, wenn sie hydratisiert und rehydratisiert wird, mehr als 100 μm, oder sogar mehr als 150 μm betragen kann, ist gemäß den Merkmalen einer bevorzugten Ausführungsform die vernetzte, auf Fibrin basierende Schicht (im hydratisierten oder posthydratisierten Zustand), die den porösen Teil des Trägers bedeckt, 0,5 bis 100 μm dick, vorteilhaft 2,5 bis 50 μm dick, vorzugsweise 5 bis 20 μm dick, mit zwischen den vernetzten, auf Fibrin basierenden Molekülen oder Bindungen gebildeten Alveolen, wobei die Alveolen ein Volumen von 5 bis 25 μm³ aufweisen, wobei die durchschnittliche Dicke oder Höhe der Kammer 1 bis 5 μm, insbesondere 1 bis 3 μm ist.
Gemäß einem Detail einer bestimmten Ausführungsform weisen die Poren des Trägerteils, welcher von der Fibrinschicht bedeckt ist, mindestens teilweise mit einem wasserlöslichen oder im wesentlichen wasserlöslichen Protein bedeckte innere Flächen auf. Beispielsweise sind die Poren des Trägerteils, welcher von der Fibrinschicht bedeckt ist, teilweise von Fibrinogen, Albumin, Fibronectin, Vibronectin oder einem Gemisch davon bedeckt. Insbesondere ist die der behandelten Fläche gegenüberliegende Trägerfläche mindestens teilweise mit einem wasserlöslichen oder im wesentlichen wasserlöslichen Protein bedeckt. Eine solche Bedeckung ist vorteilhaft, um die Haftung von Geweben, welche mit der Fläche, die der behandelten Fläche des Trägers gegenüberliegt, in Kontakt stehen, zu verbessern.
Einem vorteilhaften Merkmal entsprechend sind mindestens die Poren des porösen Teils des Trägers mindestens teilweise mit einem wasserlöslichen oder -mischbaren polaren Zusatzmittel bedeckt. Ein solches Zusatzmittel ist vorzugsweise für Protein und biokompatible Strukturen nicht-denaturierend. Solche Zusatzmittel können aus Glycerin, Zucker (Saccharose, Mannitol, Sorbit usw.) bestehen. Die Zusatzmittel sind insbesondere in Wasser löslich oder zumindest mischbar und werden insbesondere aus wasserlöslichen oder -mischbaren Zusatzmitteln ausgewählt, was eine Senkung der Gefriertemperatur im Vergleich zu der Gefriertemperatur von Wasser bei atmosphärischem Druck ermöglicht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Element trocken, wobei es beispielsweise einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 0,5 Gew.-%, oder sogar weniger als 0,1 Gew.-% aufweist.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Fibrinschicht in Gegenwart von Fibronectin vernetzt. Der vernetzte Fibronectingehalt in der Fibrinschicht beträgt vorteilhaft 0,5 bis 15%, vorzugsweise 1 bis 10% des Fibrin- und Fibronectingewichts in der vernetzten Schicht. Dieser Gehalt entspricht dem Gewicht von Fibronectin-Bindungen in der Schicht im Vergleich zu dem Gewicht von Fibrin- und Fibronectin-Bindungen der Schicht.
Gemäß einem Bestandteil einer vorteilhaften Ausführungsform enthält die Fibrinschicht Calcium, insbesondere Calcium und Chlor, genauer Calciumchlorid. Der Calciumgehalt der Fibrinschicht, ausgedrückt in μg an Calcium pro Volumeneinheit der Fibrinschicht (cm³), beträgt vorteilhaft 1 bis 100 μg/cm³, vorzugsweise 5 bis 90 μg/cm³, insbesondere 10 bis 50 μg/cm³. Der Chlorgehalt in der Fibrinschicht beträgt vorteilhaft 1,5 bis 200 μg/cm³, vorzugsweise 8 bis 170 μg/cm³, insbesondere 16 bis 100 μg/cm³. Wenn Calcium in der Form von Calciumchlorid vorliegt, beträgt der Calciumchloridgehalt in der Fibrinschicht (ausgedrückt in μg an Calciumchlorid pro Volumeneinheit (cm³) der Fibrinschicht) vorteilhaft 2,5 bis 300 μg/cm³, vorzugsweise 13 bis 260 μg/cm³, insbesondere 26 bis 150 μg/cm³.
Vorteilhaft enthält die Fibrinschicht neben Calciumchlorid im wesentlichen keine weiteren Salze von Alkali- oder Erdalkalimetallen.
Vorzugsweise ist der Gehalt an anderen Salzen von Alkali- oder Erdalkalimetallen als dem Calciumchlorid mindestens um das 10fache, vorzugsweise das 20fache, insbesondere das 50fache kleiner als der Gehalt an Calciumchlorid in der Fibrinschicht.
Obwohl der Träger ein beliebiger poröser Träger sein kann, ist der Element-Träger vorzugsweise ein biokompatibler und/oder biologisch abbaubarer Träger.
Gemäß einem bestimmten Detail einer Ausführungsform des Elements gemäß der Erfindung weist das Element zwei oder mehr übereinanderliegende Fibrinschichten auf. Vorteilhaft weisen die Schichten Alveolen mit unterschiedlichen durchschnittlichen Volumina auf. Insbesondere weist die Fibrinschicht, welche die Fibrinschicht in Kontakt mit dem porösen Träger bedeckt, Alveolen mit einem kleinern durchschnittlichen Volumen verglichen mit dem durchschnittlichen Volumen der Alveolen der Fibrinschicht, welche mit dem porösen Träger in Kontakt steht, auf. Beispielsweise beträgt das durchschnittliche Volumen von Alveolen in der Fibrinschicht, welche die Fibrinschicht in Kontakt mit dem Träger bedeckt, weniger als etwa das 0,5fache des durchschnittlichen Volumens von Alveolen in der Fibrinschicht, welche mit dem Träger in Kontakt stehen. Gemäß einer Ausführungsform tritt die Fibrinschicht, welche die Fibrinschicht in Kontakt mit dem Träger bedeckt, teilweise durch die Fibrinschicht in Kontakt mit dem Träger. Die Durchdringung der Fibrinschicht mit kleinen Alveolen in der Fibrinschicht mit großen Alveolen ist vorteilhaft so, daß die Fibrinschicht mit kleinen Alveolen mindestens durch 50% der Dicke der Fibrinschicht mit großen Alveolen, aber vorzugsweise weniger als durch die gesamte Dicke dringt.
Das Fibrin der Schicht des erfindungsgemäßen Elements sowie das in dem porösen Substrat vorliegende Fibrin ist im wesentlichen nicht-denaturiert, wobei es vorzugsweise nicht-denaturiert ist.
Die Erfindung bezieht sich ebenso auf ein Verfahren zur Herstellung eines Elements gemäß der Erfindung.
Dieses Verfahren stellt sicher, daß:

– mindestens ein poröser Teil einer ersten Fläche eines porösen Trägers mit einer wäßrigen Lösung, die Fibrin oder ein Fibrinogen enthält, oder mit einer oder mehreren auf Fibrin basierenden oder Fibrinogen-enthaltenden Verbindungen in Kontakt gebracht wird,
– die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Teils des Trägers homogen und gleichförmig einer Saugkraft unterworfen wird, um die Lösung mindestens teilweise durch den porösen Teil zu saugen, womit sowohl die bezüglich des porösen Teils homogene und gleichförmige Abscheidung einer Schicht, basierend auf Fibrin oder auf Fibrinogen-enthaltenden Materialien, und die Diffusion mindestens des Lösungswassers durch den porösen Teil des porösen Trägers als auch die Durchdringung von Fibrin oder Fibrinogen-enthaltenden Materialien durch den porösen Träger sichergestellt wird. Durch ein solches Saugen wird eine Fibrinschicht bereitgestellt, die im wesentlichen frei von Fibrinogen ist, besonders dann, wenn die Fibrinschicht mit Wasser oder mit einer wäßrigen Lösung gewaschen worden ist. Vorteilhaft wird das Saugen der Lösung durch das poröse Material mindestens während der Vernetzung von Fibrin, und vorzugsweise mindestens während der Reaktion des Fibrinogen-enthaltenden Materials und der Vernetzung des Fibrins durchgeführt. Das in dem porösen Material vorliegende Fibrin wird daher vorteilhaft mit der Fibrinschicht, welche die erste Fläche des porösen Materials bedeckt, vernetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein Element bereit, welches den vorhergehenden Erläuterungen nachkommt.
Dank des Saugens wird das Fibrin, das an dem Netzwerk angehaftet ist, so angeordnet, daß es durch den porösen Träger bis zu einer Tiefe von mindestens 2 μm, sowohl in den Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10 bis 20 μm als auch in den Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mehr als 20 μm, dringt.
Die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des Trägers wird vorteilhaft einem Druck von weniger als 0,8·10⁵ Pa unterworfen, wobei eine Druckdifferenz zwischen den beiden Flächen des porösen Teils von mindestens 0,3·10⁵ Pa erzeugt wird. Vorzugsweise wird die der ersten Fläche gegenüberliegende Trägerfläche einem Druck von weniger als 0,5·10⁵ PA, bevorzugt weniger als oder gleich 0,4·10⁵ Pa unterworfen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, wobei ein effizienter Durchgang von Fibrin oder Fibrinogen durch die Dicke des porösen Teils des Trägers gewährleistet wird, wird die der ersten Fläche gegenüberliegende Trägerfläche intermittierend einem ersten Druck von weniger als 0,8·10⁵ Pa, bevorzugt von weniger als 0,4·10⁵ Pa, unterworfen, wobei der erste Druck mindestens 5% höher als der zweite Druck ist. Anstelle den positiven oder negativen Druck auf der der ersten Fläche gegenüberliegenden Fläche zu verändern, wäre es möglich, den auf die erste Fläche ausgeübten Druck leicht zu verändern.
Die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers wird vorteilhaft einem Druck von weniger als 0,8·10⁵ Pa unterworfen und einer Temperatur von 0 bis 100 °C, bevorzugt einer Temperatur von 15 bis 60 °C, insbesondere einer Temperatur von 25 bis 40 °C unterworfen.
Gemäß einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers einer Lösung ausgesetzt, die derart ausgewählt ist, daß sie eine Umkehrosmose erzeugt, was die Diffusion von mindestens dem Lösungswasser in Kontakt mit der ersten Fläche durch den porösen Teil des Trägers verursacht. Durch eine solche Diffusion wird ein im wesentlichen gleichförmiger und regulärer Durchgang von Fibrin oder Fibrinogen mindestens teilweise durch die Dicke des porösen Trägers sichergestellt.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorteilhaft eine Lösung, die 5 bis 20 mg/ml Fibrinogen-enthaltende Materialien enthält, vorzugsweise eine Lösung, die 5 bis 20 mg/ml Fibrinogen-enthaltende Materialien und 0,01 bis 10 Einheiten Thrombin pro ml enthält, vorzugsweise eine Lösung, die 5 bis 20 mg/ml Fibrinogen-enthaltende Materialien Faktor XIII und 0,01 bis 2, bevorzugt 0,05 bis 1 Einheit Thrombin pro ml enthält, verwendet. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform enthält die Lösung weniger als 0,5 Einheiten Thrombin pro ml.
Vorteile sind ebenso bei einer Lösung bemerkt worden, die 0,1 bis 10 Einheiten Faktor XIII pro ml enthält. Vorteilhafte Ergebnisse sind ebenso mit einer Lösung erhalten worden, die 1 bis 40 Millimol CaCl₂/ml, insbesondere 1 bis 20 Millimol CaCl₂/ml enthält, um die Fibrinolyse zu verringern oder zu verlangsamen. So wurde beispielsweise bei einer Fibrinschicht, hergestellt aus 20 Millimol CaCl₂/ml eine Woche nach Herstellung der Fibrinschicht visuell keine Fibrinolyse bemerkt.
Man wird feststellen, daß kleinere Mengen an zur Bildung des Fibrinnetzwerks verwendetem Thrombin größeren Mengen an Fibrinogen, die durch den porösen Träger dringen können, entsprechen. Trotzdem stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine Fibrinschicht bereit, die, insbesondere an der Fläche des Trägers, die mit der Fibrinschicht in Kontakt steht, im wesentlichen frei von Fibrinogen ist.
Gemäß einem Merkmal eines erfindungsgemäßen Verfahrens wird während eines ersten Schritts mindestens ein Teil einer ersten Fläche eines porösen Trägers in Kontakt mit einer Lösung gebracht, die Fibrin und/oder Fibrinogen-enthaltende Materialien enthält, wobei die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers homogen und gleichförmig einer Saugkraft unterworfen wird, womit eine Diffusion mindestens des Lösungswassers durch die Dicke des porösen Trägers und eine Durchdringung von Fibrin oder Fibrinogen-enthaltenden Materialien durch den porösen Träger bis zu einer Tiefe von mindestens 2 μm homogen und gleichförmig bezüglich des porösen Teils der ersten Fläche sichergestellt wird, und wobei während eines zweiten Schritts die Fibrin- und/oder Fibrinogenschicht stabilisiert wird.
Gemäß einer möglichen Ausführungsform wird ein Kontakt zwischen dem Teil der ersten Fläche und einer sich bewegenden wäßrigen Lösung bereitgestellt.
Die Lösung, die Fibrin oder Fibrinogen-enthaltende Materialien enthält, enthält vorteilhaft ebenso ein polares organisches Zusatzmittel. Es hat sich erwiesen, daß die Verwendung eines solchen polaren organischen Zusatzmittels die Kontrolle der Faserdicke in dem Fibrinnetzwerk ermöglicht. Außerdem hat die Gegenwart eines solchen organischen Zusatzmittels ebenso Vorteile bezüglich des Schutzes der auf Fibrin basierenden Schicht während des Trocknungsschritts bereitgestellt, der mögli cherweise nach dem Waschschritt durchgeführt werden kann. Der Trocknungsprozeß wird vorteilhaft mindestens teilweise durch Gefriertrocknung, vorteilhaft bei einer Temperatur von -30 °C bis -100 °C, bevorzugt bei einer Temperatur von -40 °C bis -70 °C, bewirkt. Beispielsweise wird der Trocknungsprozeß in mehreren Schritten, d. h. einem ersten Trocknungsschritt zum Erhöhen der Temperatur (beispielsweise bei einer Temperatur von 30 bis 70 °C) oder zum Erzeugen eines Vakuums nach dem Entfernen des Fibrins oder der Fibrinogen-enthaltenden Materiallösung, die in Kontakt mit dem porösen Teil des Trägers steht, und einem zweiten Trocknungsschritt zur Gefriertrocknung, durchgeführt.
Trocknungsprozesse werden vorteilhaft nach einem oder mehreren Waschschritten mittels Wasser, einer wäßrigen Lösung, beispielsweise einer wäßrigen Lösung, die ein polares organisches Zusatzmittel (beispielsweise in der Größenordnung von 1 bis 20 Gew.-%, besonders in der Größenordnung von 5 bis 10 Gew.-%), wie Glycerin, enthält, durchgeführt. Ein bestimmter Waschvorgang beinhaltet das vollständige Inkontaktbringen der Fibrinschicht mit dem porösen Träger mit einer wäßrigen Lösung, insbesondere einer Lösung, die Glycerin (beispielsweise 1 bis 20 Gew.-%, insbesondere 5 bis 10 Gew.-%) enthält, und das anschließende Unterziehen der anderen Fläche des Trägers einer Saugkraft, um die Lösung durch den porösen Träger zu saugen. Ein solcher Waschvorgang stellt einen fibrinogenfreien porösen Träger bereit. Dieser Prozeß kann auf mit einer Fibrinschicht ausgestatteten Trägern, die nicht der Erfindung entsprechen, durchgeführt werden, wodurch ein Produkt, erhalten durch einfachen Kontakt des porösen Trägers mit der Fibrinogen-enthaltenden Lösung, zu einem Element gemäß der Erfindung umgewandelt werden kann.
Die Lösung aus Fibrin oder Fibrinogen-enthaltenden Materialien, die in dem Verfahren zum Bilden der erfindungsgemäßen Fibrinschicht verwendet wird, enthält vorzugsweise 0 bis 20%, besonders bevorzugt 3 bis 15% und stärker bevorzugt 5 bis 10% des polaren organischen Zusatzmittels.
Dieses Zusatzmittel kann vorteilhaft Glycerin, ein Zucker (Mannitol, Sorbit, Saccharose, Glucose usw.) sein. Bei Verwendung einer Lösung, enthaltend Fibrinogenenthaltende Materialien in der Größenordnung von 5 bis 20 mg/ml, Thrombin in der Größenordnung von 0,01 bis 10 Einheiten/ml und 5 bis 10% Glycerin in dem erfindungsgemäße Verfahren, wurde ein Netzwerk von Fibrinfasern erhalten, wobei die Größe der Alveolen derjenigen in dem Netzwerk ähnlich war, welches mit einer Lösung, enthaltend Fibrinogen-enthaltende Materialien in der Größenordnung von 5 bis 20 mg/ml, Thrombin in der Größenordnung von 0,01 bis 10 Einheiten/ml (ohne Glycerin) in dem erfindungsgemäßen Verfahren, erhalten wurde. Dennoch war die Fasergröße in dem Netzwerk, das unter Verwendung von Glycerin erhalten wurde, kleiner, wodurch eine bessere Verwendung von Fibrin oder Fibrinogen-enthaltenden Materialien in der Lösung erzielt wurde, wenn Glycerin verwendet wurde.
Der pH der Lösung aus Fibrin oder Fibrinogen-enthaltenden Materialien beträgt vorteilhaft 5 bis 8,5, vorzugsweise 5,5 bis 8, besonders bevorzugt 6 bis 7,5. Der pH der Lösung kann mittels einer Pufferlösung (beispielsweise einem Trispuffer), durch Zugabe einer starken (HCl) oder einer schwachen Säure mineralischen oder organischen Ursprungs (Zitronensäure usw.) kontrolliert werden.
Die Lösung enthält vorteilhaft ebenso mindestens ein wasserlösliches Protein, insbesondere Albumin.
Gemäß einer bestimmten Ausführungsform wird für mindestens einen Teil der Ablagerung der Schicht, die auf Fibrin- oder Fibrinogenverbindungen basiert, die Konzentration von Fibrin- oder Fibrinogenverbindungen in der Lösung in Kontakt mit der ersten Fläche kontrolliert, um eine im wesentlichen konstante Wasserdiffusion durch den Träger sicherzustellen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein biokompatibler oder biologisch abbaubarer poröser Träger verwendet.
Gemäß einer bestimmten Ausführungsform, mit der von Anfang an vorteilhaft eine im wesentlichen gleichförmige Wasserdiffusion durch die Dicke des porösen Trägers sichergestellt werden kann, wird der poröse Teil mit einer wäßrigen Lösung behandelt, die vorteilhaft ein Benetzungsmittel und/oder ein wasserlösliches Protein und/oder ein polares organisches Zusatzmittel enthält, bevor die Lösung, die Fibrin oder Fibrinogen enthält, in Kontakt mit dem porösen Teil gebracht wird.
Gemäß der Erfindung kann der poröse Träger ebenso nacheinander mit einer Lösung behandelt werden, die Fibrin oder Fibrinogen-enthaltende Materialien enthält, wodurch mehrere Fibrinschichten abgeschieden werden. Gemäß der Erfindung kann der poröse Träger mit einer Lösung behandelt werden, die Fibrin oder Fibrinogenenthaltende Materialien, aber kein Thrombin enthält, und dann kann der vorbehandelte Träger mit einer Lösung behandelt werden, die Thrombin enthält.
Die Erfindung bezieht sich ebenso auf einen Filter, welcher eine aus einem erfindungsgemäßen Element bestehende Filtermembran beinhaltet, auf einen Bioreaktor, welcher eine aus einem erfindungsgemäßen Element bestehende Membran beinhaltet, auf ein Implantat, welches aus einem erfindungsgemäßen Element besteht, und auf eine künstliche Haut, welche aus einem erfindungsgemäßen Element hergestellt ist.
Da sich Glycerin zum Kontrollieren der Größe von Alveolen als nützlich erwiesen hat, ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, zur besseren Verwendung von Fibrin (dünnere Fasern) und zum Sicherstellen einer besseren Lebensfähigkeit der Zellen, die an dem Fibrinnetzwerk angehaftet sind, eine Verbindung, die auf Fibrin oder Fibrinogen-enthaltenden Materialien basiert, wobei die Verbindung die Form eines trockenen Schaums oder von Teilchen eines trockenen Schaums aufweist und 0,05 bis 10 Gew.-% eines wasserlöslichen oder -mischbaren polaren organischen Zusatzmittels enthält, wobei der Schaum eine Porosität aufweist, die mindestens aus 50 Volumen-% Kammern oder Volumenhohlräumen von 5 bis 25 μm² besteht.
Vorteilhaft liegen mindestens 90 Gew.-% Fibrin in vernetzter Form vor. Die Verbindung enthält möglicherweise ebenso ein oder mehrere Proteine und/oder einen oder mehrere aktive Stoffe. Unter den polaren Zusatzmitteln ist Glycerin bevorzugt, aber andere Zusatzmittel, wie Zucker, Saccharose, Glucose, Mannitol usw., können ebenfalls verwendet werden. Der Wassergehalt beträgt vorteilhaft weniger als 0,5 Gew.-%. Der Schaum oder das vernetzte Fibrinnetzwerk ist tatsächlich minde stens teilweise mit dem wasserlöslichen oder -mischbaren polaren organischen Zusatzmittel bedeckt.
Die Herstellung dieser Verbindung kann in einem Verfahren bewirkt werden, wobei, möglicherweise nach einem Vortrocknungsschritt, eine wäßrige Lösung aus Fibrin und/oder Fibrinogen, die ebenso ein wasserlösliches oder -mischbares polares organisches Zusatzmittel enthält, durch Lyophilisation getrocknet wird, wobei der Gehalt an organischem Lösungsmittel in der Lösung 0,05 bis 10 Gew.-% beträgt, so daß eine Verbindung erhalten wird, die weniger als 0,5 Gew.-% davon enthält. Vorteilhaft wird der Trocknungsprozeß durch Lyophilisation bei einer Temperatur von -40 °C bis -100 °C, bevorzugt von -50 °C bis -75 °C bewirkt. Insbesondere wird die Lyophilisation in drei Schritten durchgeführt, wobei jeder Schritt eine Temperaturerhöhung der Verbindung oder Lösung auf eine Temperatur von -40 °C bis -100 °C beinhaltet, gefolgt von einer Druckminderung auf weniger als 0,4 bar (0,4·10⁵ Pa). Beispielsweise wird in einem ersten Schritt der Druck auf einen Druck von 0,2 bis 0,4·10⁵ Pa vermindert, und in dem letzten Schritt wird der Druck auf weniger als 0,2·10⁵ Pa vermindert.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren, welches das Extrahieren des ungebundenen Fibrinogens aus der Fibrinschicht und insbesondere des Fibrinogens, das in dem porösen Träger vorgefunden wird, in einer solchen Weise ermöglicht, daß eine fibrinogenfreie Fibrinschicht und insbesondere ein poröser Träger und eine Fibrinschicht, die beide frei von Fibrinogen sind, erhalten werden. Dieses Verfahren stellt sicher, daß:

– mindestens ein Teil der Fibrinschicht, welche an einer ersten Fläche des porösen Trägers angehaftet ist, in Kontakt mit einer wäßrigen Lösung gebracht wird, die vorteilhaft ein polares organisches Zusatzmittel enthält, und
– die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers homogen und gleichförmig einer Saugkraft unterworfen wird, um die Lösung mindestens teilweise durch den porösen Teil zu saugen, wodurch die bezüglich des porösen Teils homogene und gleichförmige Entfernung von Fibrinogen in der Nähe der ersten Flä che des Trägers sichergestellt wird. Dank dieses Saugens ist mindestens das Lösungswasser durch die Dicke des porösen Teils des porösen Trägers diffundiert. Wenn das Verfahren über einen ausreichenden Zeitraum angewendet wird, kann die Menge an Wasser, die durch die Dicke des porösen Teils diffundiert ist, ausreichend sein, um das Fibrinogen in den Poren des porösen Trägers zu entfernen oder zu extrahieren. Daher stellt dieses Saugen eine im wesentlichen fibrinogenfreie Fibrinschicht, oder sogar einen porösen Träger und eine Fibrinschicht bereit, die frei von Fibrinogen sind.

Dieser Waschvorgang ermöglicht bei Verwendung einer wäßrigen Lösung, die ein oder mehrere Zusatzmittel, beispielsweise ein oder mehrere lösliche Proteine, ein oder mehrere Arzneimittel usw., enthält, die Einführung einer bestimmten Menge des/der Zusatzmittel(s) in den porösen Träger oder das Bedecken der Fläche des Trägers, die nicht in Kontakt mit der Fibrinschicht steht, mit dem/n Zusatzmittel(n).
Dank des Lösungssaugens kann Wasser durch den porösen Träger dringen, so daß beispielsweise in einer Tiefe von mindestens 2 μm von der ersten Fläche (Fläche, die die Fibrinschicht trägt), vorteilhaft von mindestens 10 μm, bevorzugt von mindestens 20 μm, mindestens die Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10 bis 20 μm frei von Fibrinogen sind.
Vorteilhaft wird die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers einem Druck von weniger als 0,8·10⁵ Pa unterworfen, und eine Druckdifferenz von mindestens 0,3·10⁵ Pa wird zwischen den beiden Flächen des porösen Teils erzeugt. Vorzugsweise wird die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers einem Druck von weniger als 0,5·10⁵ Pa, stärker bevorzugt weniger als oder gleich 0,4·10⁵ Pa unterworfen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, wobei ein effizienter Durchgang von Wasser durch die Dicke des porösen Teils des Trägers gewährleistet wird, wird die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers intermittierend einem ersten Druck von weniger als 0,8·10⁵ Pa, bevorzugt weniger als etwa 0,4·10⁵ Pa, und einem zweiten Druck von weniger als 0,8·10⁵ Pa, bevorzugt weniger als 0,4·10⁵ Pa unterworfen, wobei der erste Druck mindestens 5% höher als der zweite Druck ist. Anstelle den positiven oder den negativen Druck auf der der ersten Fläche gegenüberliegenden Fläche zu verändern, wäre es möglich, den auf die erste Fläche ausgeübten Druck zu verändern.
Vorteilhaft wird die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers einem Druck von weniger als 0,8·10⁵ Pa unterworfen und wird einer Temperatur von 0 bis 100 °C, bevorzugt einer Temperatur von 15 bis 60 °C, besonders bevorzugt einer Temperatur von 25 bis 40 °C unterworfen.
Gemäß einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers einer Lösung ausgesetzt, die derart ausgewählt ist, daß sie eine Umkehrosmose erzeugt, was die Diffusion von mindestens dem Lösungswasser in Kontakt mit der ersten Fläche durch den porösen Teil des Trägers verursacht. Durch eine solche Diffusion wird ein im wesentlichen gleichförmiger und regulärer Durchgang von Wasser mindestens teilweise durch die Dicke des porösen Trägers sichergestellt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von porösen Trägern, die mit einer Schicht, welche aus einem bioabsorbierbaren Material oder einem absorbierbaren Polymer, insbesondere einem Polymilchsäurepolymer und/oder aus Polyglykolpolymeren und/oder Biopolymeren, sowie aus Strukturproteinen und Polysacchariden hergestellt ist, wobei die Strukturproteine aus der Gruppe ausgewählt werden, umfassend Collagen, Elastin, Fibronectin, Laminin und Fibrin und andere Proteine, die menschliche oder tierische Gewebe bilden, sowie rekombinante Proteine. Dieses Verfahren stellt sicher, daß eine wäßrige Lösung oder Suspension hergestellt wird, die ein oder mehrere Polymere und/oder Biopolymere und/oder Materialien zum Bilden der Polymere und/oder Biopolymere in-situ enthält. Diese Lösung oder Suspension wird in Kontakt mit einer ersten Fläche eines porösen Trägers gebracht, wobei mindestens ein Teil des Wassers der Lösung oder Suspension aus mindestens einer anderen Fläche des porösen Trägers (vorteilhaft der der ersten Fläche gegenüberliegenden Fläche) gesaugt wird.
Diese Saugkraft bewirkt, daß Wasser und vorteilhaft absorbierbare Biopolymere oder Polymere in dem porösen Träger diffundiert werden. Um eine solche Diffusion zu gewährleisten, wird die der ersten Fläche (der Fläche in Kontakt mit der Lösung oder Suspension) gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers einem Druck von weniger als 0,8·10⁵ Pa unterworfen wird, wobei eine Druckdifferenz zwischen den beiden Flächen des porösen Teils von mindestens 0,3·10⁵ Pa erzeugt wird. Vorzugsweise wird die der ersten Fläche gegenüberliegende Trägerfläche einem Druck von weniger als 0,5·10⁵ Pa, vorzugsweise weniger als oder gleich 0,4·10⁵ Pa unterworfen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, wobei ein effizienter Durchgang von Wasser durch die Dicke des porösen Teils des Trägers gewährleistet wird, wird die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des Trägers intermittierend einem ersten Druck von weniger als 0,8·10⁵ Pa, vorzugsweise weniger als 0,4·10⁵ Pa, und einem zweiten Druck von weniger als 0,8·10⁵ Pa, vorzugsweise weniger als 0,4·10⁵ Pa unterworfen, wobei der erste Druck mindestens 5% höher als der zweite Druck ist. Anstelle den positiven oder negativen Druck auf der der ersten Fläche gegenüberliegenden Fläche zu verändern, wäre es möglich, den auf die erste Fläche ausgeübten Druck leicht zu verändern. Die der Fläche in Kontakt mit der Polymerlösung oder Suspension gegenüberliegende Fläche könnte ebenfalls dem Einfluß einer Lösung ausgesetzt werden, die derart ausgewählt ist, daß sie eine Umkehrosmose erzeugt, was die Diffusion von mindestens dem Lösungswasser in Kontakt mit der ersten Fläche durch den porösen Teil des Trägers verursacht. Durch eine solche Diffusion wird ein im wesentlichen gleichförmiger und regulärer Durchgang von Wasser mindestens teilweise durch die Dicke des porösen Trägers sichergestellt. Die durch den porösen Träger diffundierende Lösung weist vorteilhaft eine Temperatur von 20 bis 70 °C, besonders bevorzugt von 30 bis 50 °C, auf. Sobald die Schicht aus absorbierbaren Polymeren oder Biopolymeren gebildet ist, wird diese Schicht vorteilhaft durch Lyophilisation getrocknet. Die Lyophilisation wird vorteilhaft wie bezüglich der Fibrinschicht beschrieben bewirkt. Wenn Trocknungsprozesse durch Lyophilisation durchgeführt werden, enthält die zum Bilden der Schicht verwendete Lösung vorteilhaft ein polares Zusatzmittel, insbesondere Glycerin, beispielsweise in der Größenordnung von 1 bis 15%, insbesondere 5 bis 10%.
Weitere Merkmale und Details gehen aus der folgenden ausführlichen Beschreibung einiger Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die anhängenden Zeichnungen hervor. In diesen Zeichnungen
ist 1 eine graphische Darstellung eines erfindungsgemäßen Elements;
ist 2 eine graphische Darstellung eines Aufbaus zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Elements;
sind die 3, 4 und 5 Querschnittsdarstellungen einer Scheibe von Fibrinnetzwerken, gemessen mit einem Elektronenmikroskop (Philips XL20 Rasterelektronenmikroskop) mit 5.000facher Vergrößerung, vor der Lyophilisation, wobei die 6, 7 und 8 Querschnittsdarstellungen einer Scheibe von Fibrinnetzwerken sind, gemessen mit einem Elektronenmikroskop mit 5.000facher Vergrößerung nach der Lyophilisation;
sind die 9, 10 und 11 Querschnittsdarstellungen der Netzwerke, die mittels einer Lösung erhalten wurden, die 1 IE/ml, 10 IE/ml bzw. 20 IE/ml Thrombin enthält, wie aus dem Querschnitt ersichtlich;
sind die 12 bis 14 Querschnittsdarstellungen von Netzwerken, die mittels einer Lösung erhalten wurden, die kein CaCl₂ (12), 2,7 mM CaCl₂/ml (13) und 27 mM CaCl₂/ml (14) enthält, gemessen mit einem Elektronenmikroskop (Philips XL20) mit 5.000facher Vergrößerung;
sind die 15, 16, 17 und 18 Draufsichten der Fibrinnetzwerke mit Zellen nach zweistündiger Kultur, gemessen mit einem Elektronenmikroskop (Philips XL20 Rasterelektronenmikroskop) mit 5.000facher Vergrößerung;
sind die 19 bis 21 Querschnittsdarstellungen eines porösen Trägers 2, der eine Fibrinschicht 4 trägt, mit Zellen „C", gemessen mit einem Elektronenmikroskop mit 100facher, 100facher bzw. 1000facher Vergrößerung;
ist 22 ein Elektrophoresediagramm von Markern mit geringem Molekulargewicht (1, 6), von Kontrollfibrinogen (5), von Kontrollfibrin (4), von der Polymerschicht aus dem Exsudat (dem Teil, der durch die poröse Membran dringt) nach der Inkubation und von dem beweglichen Teil des Exsudats nach der Inkubation.
1 stellt graphisch ein vergrößertes Schnittbild eines Teils eines erfindungsgemäßen Elements dar.
Das Element 1 umfaßt (a) einen hydrophoben oder im wesentlichen hydrophoben Träger 2, beispielsweise PTFE (in beide axiale Richtungen ausgedehnt und gestreckt), der einen porösen Teil mit einer Dicke E von 0,1 bis 5 mm, beispielsweise von 300 bis 500 μm, aufweist, und dessen Poren P sich über seine Dicke mit einem durchschnittlichen Durchmesser „d" (poröses Volumen/Oberfläche von Poren) von 5 bis 100 μm, beispielsweise von etwa 30 bis 40 μm, erstrecken, wobei eine Fläche 3 des porösen Teils des Trägers 2 mit einer Verbindung behandelt wird, die auf Fibrin und/oder Fibrinogen basiert, und (b) eine auf Fibrin basierende Schicht 4, die die behandelte Oberfläche 3 des Trägers 2 bedeckt.
Die auf Fibrin basierende Schicht 4 liegt im wesentlichen gleichförmig und homogen auf der behandelten Fläche 3 vor. Nachdem die Fibrinschicht 4 gewaschen wurde, enthält sie kein Fibrinogen mehr. Der Fibrinogengehalt in der Schicht 4 (in der Fibrinschicht ungebundenes Fibrinogen) beträgt weniger als 0,5 Gew.-%; vorzugsweise weniger als 0,1 Gew.-% der Fibrinschicht.
Etwas Fibrinogen F kann sich über die Dicke E des behandelten porösen Teils des Trägers von der behandelten Fläche bis zu einer Tiefe „e" von mindestens 10 μm sowohl in den Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10 bis 20 μm (Poren, deren Volumen, ausgedrückt in μm³, geteilt durch die Oberfläche der Porenwände, ausgedrückt in μm², 10 bis 20 μm ergibt) als auch in den Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mehr als 20 μm erstreckt. Insbesondere erstreckt sich in allen Poren der behandelten Fläche des porösen Teils, die eine Größe von mehr als 25 μm aufweisen, etwas Fibrinogen über die Dicke E des Trägers bis zu einer Tiefe „e" von mindestens 30 μm. Dennoch ist der Träger an der Fläche 3 im wesentlichen frei von im Netzwerk ungebundenen Fibrinogen. Das Fehlen von im Fibrinnetzwerk ungebundenem Fibrinogen liegt an dem Durchgang von Wasser durch den porösen Träger. In einer bestimmten Ausführungsform ist der poröse Träger frei von Fibrinogen bis zu einer Tiefe von mindestens 10 μm von der Fläche, die die Fibrinschicht trägt. Gemäß einer bestimmten, vorteilhaften Ausführungsform ist der Träger über seine gesamte Dicke frei von Fibrinogen.
Die Fibrinschicht 4, wie in 1 gezeigt, wird durch Quervernetzung aufgrund der Gegenwart von Faktor XIII stabilisiert. Somit bildet die Schicht 4 ein Netzwerk von benachbarten Alveolen 40.
Die Dicke „h" der Fibrinschicht, wie durch die Fläche 3 (in ihrer dehydratisierten Form) bestimmt, beträgt beispielsweise etwa 10 μm, wobei das durchschnittliche Volumen einer Kammer oder Zelle in der Größenordnung von 10 μm³ liegt. Die Alveolen sind offen und weisen Öffnungen dazwischen auf. Die Bezeichnung Alveolen definiert fibrinfreie Bereiche mit einem Volumen von mehr als 5 μm³, umgeben von Fibrin-Bindungen. Die Verteilung von Alveolen über die Schicht 4 ist im wesentlichen regulär, d. h. das Volumen der Alveolen über einen Bereich von 1 cm² der Fläche 3, der mit der Schicht 4 bedeckt ist, beträgt das 0,8- bis 1,2fache (vorzugsweise das 0,9- bis 1,1fache) des durchschnittlichen Volumens von Kammern pro Oberflächeneinheit (cm²) des Bereichs. Die durchschnittliche Höhe der Kammern, gemessen im rechten Winkel zu Fläche 3, beträgt beispielsweise 2 bis 3 μm.
Das in 1 gezeigte Element liegt vorteilhaft in trockenem Zustand vor. Der Feuchtigkeitsgehalt beträgt beispielsweise weniger als 0,01 Gew.-%, was eine ausgezeichnete Konservierung und Stabilität des Elements sicherstellt. Bei Rehydratisierung des Elements bläht sich die Fibrinschicht beispielsweise um einen Faktor von mehr als 1,5, insbesondere um einen Faktor von 1,6 bis 2,5 auf (die Dicke der Fibrinschicht nach der Rehydratisierung entspricht dem 1,6- bis 2,5fachen der Dicke der trockenen Fibrinschicht).
Gemäß einer besonderen Ausführungsform weisen die Poren P innere Flächen auf, die mindestens teilweise mit einem wasserlöslichen oder im wesentlichen wasserlöslich Protein bedeckt sind, und/oder die der behandelten Fläche gegenüberliegende Fläche 6 des Trägers ist mindestens teilweise mit wasserlöslichem oder im wesentlichen wasserlöslichem Protein bedeckt. Ein solches Bedecken ist vorteilhaft, um beispielsweise die Zellfixierung, die Haftung der Gewebe, welche die Fläche umgeben, die der mit Fibrin oder Fibrinogen-enthaltendem Materialien behandelten Fläche gegenüberliegt, zu unterstützen.
Gemäß eines vorteilhaften Merkmals einer Ausführungsform sind die Poren P (Innenwände) des porösen Teils des Trägers mindestens teilweise mit einem wasserlöslichen oder -mischbaren polaren organischen Zusatzmittel oder mit Spuren eines solchen Zusatzmittels bedeckt. Dieses polare organische Zusatzmittel liegt vorteilhaft ebenso mindestens teilweise auf den Fibrinschichten der Schicht 4 und auf den Flächen 3 und 6 des Trägers vor. Dieses Zusatzmittel kann beispielsweise Glycerin, ein Zucker usw. oder ein Gemisch aus diesen Zusatzmitteln sein. Die Zusatzmittel sind insbesondere in Wasser löslich oder zumindest mischbar und werden insbesondere aus wasserlöslichen Zusatzmitteln ausgewählt, was eine Verminderung der Gefriertemperatur bezüglich der Wassergefriertemperatur bei atmosphärischem Druck ermöglicht. Die Menge an löslichem oder mischbarem Zusatzmittel in der Fibrin-, Fibrinogen- und/oder Thrombinlösung oder in der naßvernetzten Fibrinschicht (nicht getrocknet, der Wassergehalt in den Poren liegt in der Größenordnung von 50%) ist vorzugsweise ausreichend, um die Gefriertemperatur bei atmosphärischem Druck von weniger als -5 °C, bevorzugt von weniger als -10 °C zu vermindern.
Obwohl der Träger der erläuterten Ausführungsform ein biokompatibler poröser Träger aus PTFE ist, kann ein anderer biokompatibler Träger, insbesondere ein biologisch abbaubarer Träger, oder ein biokompatibler und biologisch abbaubarer Träger verwendet werden.
Einige Beispiele für Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Elements werden hierin nachstehend beschrieben.
Zur Herstellung eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Elemente ist eine Vakuumkammer 10, verbunden mit einer Vakuumpumpe 11, verwendet worden, um in Bezug auf atmosphärischen Druck ein Vakuum oder einen negativen Druck in der Kammer zu erzeugen. Diese Kammer ist graphisch in 2 gezeigt.
Die Kammer verfügt über einen Einlaß, um die Lösungen in den Innenraum oder Hohlraum eines Rohrs mit einem Innendurchmesser von 1 bis 100 mm, stärker bevorzugt von 2 bis 10 mm einzulassen. Das Rohr 13 verfügt über poröse zylindrische Teile 13A (wobei der durchschnittliche Durchmesser der Poren 20 bis 30 μm beträgt), die durch einen nicht-porösen Ring 13B getrennt werden. Die Rohrdicke beträgt für die porösen Teile etwa 200 bis 300 μm. Der Einlaß 12 umfaßt das Mittel zum Befestigen eines Endes 13C des Rohrs daran in flüssigkeitsdichter Weise. Der Einlaß 12 ist mittels einer Leitung 15 mit einem Behälter 14, der eine wäßrige Lösung aus einem Fibrinogen-enthaltenden Material (in einer Konzentration von 10 bis 40 mg/ml) enthält, umfassend 0,2 bis 20 Einheiten Faktor XIII pro ml (IE/ml) und 100 bis 1.000 μg/ml Fibronectin, mittels einer Leitung 16 mit einem Behälter 17, der eine wäßrige Lösung aus Thrombin (in einer Konzentration von 0,05 bis 2 IE/ml) enthält, und mittels einer Leitung 18 mit einem Behälter 19, der Wasser und möglicherweise ein oder mehrere Zusatzmittel enthält, verbunden. Die Leitungen 15, 16 und 18 sind mit Ventilen V ausgerüstet, um den Durchgang eines Fluids zuzulassen oder zu verhindern. Die Leitungen leiten je nach atmosphärischem Druck ein oder mehrere Fluide zu dem Einlaß. Ein Kontrollsystem 20 kontrolliert den Vakuumpumpenprozeß in Abhängigkeit von dem erwünschten Vakuum und dem Vakuum, gemessen in der Kammer.
Das Rohrende, das dem gegenüberliegt, welches an dem Einlaß befestigt ist, wird durch einen Stopfen 21 verschlossen, der sich vorteilhaft durch eine Leitung 22 mit einem Ventil 23 erstreckt, um die Evakuierung von Fluiden oder Lösungen zu ermöglichen, die in dem Rohr enthalten sind.
Die Kammer ist ebenfalls mit einem Mittel 24 ausgestattet, um die Kammertemperatur im Bereich von +60 °C bis -100 °C einzustellen.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wurden eine Lösung A, enthaltend 20 mg/ml eines Fibrinogenenthaltenden Materials, 1000 μg Fibronectin pro ml und 2 IE/ml Faktor XIII, und eine Lösung B, enthaltend 0,2 IE Thrombin pro ml und 40 mM (Millimol) Calciumchlorid pro ml, verwendet.
Die Lösung A und die Lösung B wurden bei gleicher Fließgeschwindigkeit in den Einlaß gefüllt, um ein 1 : 1-Gemisch aus beiden Lösungen A und B zu erhalten. Das dadurch erhaltene Gemisch enthielt 10 mg/ml Fibrinogen, 500 μg/ml Fibronectin, 1 IE/ml Faktor XIII, 0,1 IE/ml Thrombin und 20 mM/ml CaCl₂.
Der Hohlraum oder Innenraum des Rohrs wurde mit dem Gemisch aus den Lösungen A und B befüllt, und der Kammerdruck wurde auf 0,4·10⁵ Pa (d. h. einen negativen Druck bezüglich des atmosphärischen Drucks von etwa 600 Millibar) vermindert. Diese Vakuumerzeugung verursachte, daß Wasser durch die Dicke der porösen Teile des Rohrs eingesaugt wurde. Da das Vakuum auf der äußeren Oberfläche des Rohrs erzeugt wurde, wurde letzteres leicht gestreckt oder gespannt, was die Diffusion von Flüssigkeit durch die Poren des Rohrs unterstützte.
Während der Erzeugung und Aufrechterhaltung des Vakuums wurde festgestellt, daß die Außenwand des Rohrs naß war.
Nach Aufrechterhaltung des Vakuums für etwa 1 bis 30 Minuten wurde der Kammerdruck schrittweise wieder auf atmosphärischen Druck eingestellt. Sobald das Rohr geleert und mit Wasser gewaschen war, wurde festgestellt, daß die Innenfläche des Rohrs mit einer etwa 5 μm dicken vernetzten Fibrinschicht mit Kammern oder offenen Zellen mit einer Größe von 15 bis 20 μm³ auf den porösen Teilen des Rohrs (Zellhöhe von 2 bis 3 μm, Bereich von 5 bis 7 μm², gemessen parallel zur Fläche des Trägers, der die Schicht trägt) bedeckt war. Es wurde weder in der Fibrinschicht noch an der Trägergrenzfläche mit der Fibrinschicht in der Fibrinschicht ungebundenes Fibrinogen vorgefunden.
Fibrinogen wurde in den Poren des Trägers bis zu einer Tiefe (von der inneren Oberfläche des Rohrs) von mindestens etwa 20 μm für alle Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mehr als 10 μm vorgefunden.
Der Durchgang von Fibrinogen durch den porösen Träger wurde mittels des Elektrophoresediagramms von 22 nachgewiesen. Tatsächlich wurde etwas Flüssigkeit von der Fläche gesammelt, die derjenigen in Kontakt mit der Fibrinogenlösung gegenüberliegt. Nach der Inkubation dieser Flüssigkeit wurden Elektrophoresepeaks sowohl für die gebildete Polymerschicht (2) als auch für den Überstand (3) bestimmt.
Als Ergebnis zeigte die Elektrophorese (2) nach der Inkubation für Fibrin typische Peaks, was belegt, daß Fibrinogen durch den porösen Träger durchgegangen war.
Dieses Rohr wurde anschließend durch ein auf 50 °C erwärmtes Gas getrocknet.
Beispiel 2
Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß der Waschschritt dadurch bewirkt wurde, daß demineralisiertes Wasser in das Rohr fließen konnte, um die Fibrinogenlösung zu evakuieren, während ein Druck von etwa 0,4·10⁵ Pa in der Kammer gehalten wurde, um eine Diffusion von Waschwasser durch den porösen Träger sicherzustellen. Diese Diffusion ermöglichte die Entfernung von Fibrinogen von dem porösen Träger.
Beispiel 3
Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß das Rohr durch Senken der Rohrtemperatur auf -60 °C zum Umwandeln von Wasser in Eis und durch Lyophilisieren dessen bei dieser Temperatur getrocknet wurde.
Beispiel 4
Beispiel 3 wurde wiederholt, außer daß Glycerin in der Größenordnung von 5 Gew.-% des Gemischs, bestehend zu 50% aus Lösung A und 50% aus Lösung B, zugegeben wurde. Es wurde bemerkt, daß die Gegenwart von Glycerin so wohl in dem porösen Träger als auch in der Fibrinschicht dem Element eine gewisse Flexibilität verlieh. Außerdem ließ sich der Lyophilisationsschritt leichter durchführen.
Die Gegenwart von Glycerin bei der Bildung des vernetzten Fibrins erwies sich zum Bereitstellen einer regulären und homogenen Struktur der Fibrinschicht als vorteilhaft. Überdies unterstützte die Gegenwart von Glycerin den Durchgang von Fibrin und Fibrinogen in den Poren des porösen Teils des Rohrs.
Beispiel 5
Beispiel 4 wurde wiederholt, außer daß Glycerin in der Größenordnung von 10 Gew.-% des Gemischs, bestehend zu 50% aus Lösung A und 50% aus Lösung B, zugegeben wurde.
Es wurde bemerkt, daß die Gegenwart von Glycerin sowohl in dem porösen Träger als auch in der Fibrinschicht dem Element eine gewisse Flexibilität verlieh. Außerdem ließ sich der Lyophilisationsschritt leichter durchführen.
Einige Teile des Fibrinnetzwerks aus den Beispielen 2 und 4 wurden vor und nach der Lyophilisation eine Nacht in Schalen, enthaltend eine Lösung aus 2 bis 2,5 Glutaraldehyd, stehen gelassen. Danach wurde eine Scheibe aus dem Netzwerk, das durch Glutaraldehyd fixiert war, mittels eines erwärmten Skalpells geschnitten, wobei die Scheibe durch 40%ige, 50%ige, 70%ige, 80%ige, 90%ige und 100%ige Ethanollösungen dehydratisiert wurde.
Die 3, 4 und 5 sind Querschnittsdarstellungen von Scheiben von Fibrinnetzwerken aus den Beispielen 2, 3 bzw. 4, gemessen mit einem Elektronenmikroskop (Philips XL20 Rasterelektronenmikroskop) mit 5.000facher Vergrößerung vor der Lyophilisation, wohingegen die 6, 7 und 8 Querschnittsdarstellungen von Scheiben von Fibrinnetzwerken aus den Beispielen 2, 3 bzw. 4 sind, gemessen mit einem Elektronenmikroskop mit 5.000facher Vergrößerung nach der Lyophilisation. Ein Vergleich dieser Figuren ergibt, daß die Alveolen des Fibrinnetzwerks aus den Beispielen 2, 3 und 4 vor der Lyophilisation ähnlich sind, daß die Alveolen des Fibrinnetzwerks aus den Beispielen 2, 3 und 4 nach der Lyophilisation ähnlich sind und daß die Verwendung von Glycerin eine Verringerung der Größe der Netzwerkfasern ermöglicht.
Somit ist Glycerin zusätzlich dazu, daß es zum Schutz von Fasern während des Lyophilisationsschritts nützlich ist, ein Mittel, das eine Kontrolle der Größe oder des Durchmessers der Fasern des Fibrinnetzwerks ermöglicht.
Beispiel 6
Beispiel 4 wurde wiederholt, außer daß Glycerin zuerst durch Glucose und dann durch Mannitol ersetzt wurde.
Beispiel 7
Beispiel 1 wurde wiederholt, außer das eine Lösung, enthaltend Fibrinogen in der Größenordnung von 10 mg/ml und Thrombin in der Größenordnung von 1 IE/ml, 10 IE/ml bzw. 20 IE/ml, verwendet wurde.
Die dadurch erhaltenen Netzwerke wurden mit einer Lösung, enthaltend 2 bis 2,5 Glutaraldehyd, und mit Ethanol-enthaltenden Lösungen, wie in Beispiel 4 beschrieben, behandelt. Einige Scheiben der so erhaltenen Netzwerke wurden mit einem Elektronenmikroskop (Rasterelektronenmikroskop, Philips XL20) untersucht. Die 9, 10 und 11 sind Querschnittsdarstellungen der Netzwerke, die mit einer Lösung, enthaltend 1 IE/ml, 10 IE/ml bzw. 20 IE/ml Thrombin, mit 3.500facher Vergrößerung erhalten wurden.
Diese 9 bis 11 zeigen, daß eine höhere Konzentration an Thrombin in der Lösung zwar eine größere Anzahl an Fasern erzeugt, diese aber eine kleinere Größe aufweisen.
Beispiel 8
Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß Thrombin- und Fibrinogenlösungen hergestellt wurden, die eine CaCl₂-Konzentration von 0 mM/ml, 2,7 mM/ml und 27 mM/ml aufwiesen. Nach der Behandlung und dem Waschen der Netzwerke, wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde der Querschnitt der Netzwerke, die mit einer Lösung, enthaltend 0 mM/ml (12), 2,7 mM/ml (13) und 27 mM/ml (14) erhal ten wurden, mit einem Elektronenmikroskop (Philips XL20) mit 5.000facher Vergrößerung untersucht. Diese Figuren zeigen, daß ein höherer Calciumgehalt einer größeren Anzahl an Fasern, einer größeren Größe dieser und einem kleineren Volumen der Alveolen entspricht.
Beispiel 9
Beispiel 4 wurde wiederholt, außer daß eine Lösung, enthaltend 5% Glycerin, 20 mg/ml Fibrinogen, 500 μg Fibronectin pro ml, 10 IE/ml Faktor XIII, 1 IE Thrombin pro ml und 40 mM (Millimol) Calcium pro ml, verwendet wurde.
Beispiel 10
Beispiel 4 wurde wiederholt, außer daß das Kammervakuum kontrolliert wurde, wodurch dessen intermittierende Variation von 600 mbar in bezug auf atmosphärischen Druck (ein Druck von etwa 0,4·10⁵ Pa) bis 630 mbar in bezug auf atmosphärischen Druck (ein Druck von etwa 0,38·10⁵ Pa) verursacht wurde. Diese Variation des Vakuums wurde für die Fibrin- und Fibrinogendiffusion in den Poren des Trägers als vorteilhaft angesehen. Nach dem Waschen mit Wasser, dem Inkontaktbringen der Fibrinschicht mit einem Wasserstrom und Erzeugen eines Vakuums in der Kammer mit einer Variation von 600 mbar in bezug auf atmosphärischen Druck (ein Druck von etwa 0,4·10⁵ Pa) bis 630 mbar in bezug auf atmosphärischen Druck (ein Druck von etwa 0,38·10⁵ Pa) enthielten der Träger und die Fibrinschicht kein freies Fibrinogen mehr.
Das Rohr kann gegebenenfalls vor oder nach der Lyophilisation bei einer Temperatur von 121 °C für 60 Minuten, beispielsweise in einem Autoklaven, leicht sterilisiert werden. Es kann irgendein Sterilisationsverfahren verwendet werden, sofern es weder die Alveolenstruktur der vernetzten Fibrinschicht noch die Trägerstruktur zerstört.
Beispiel 11
Beispiel 3 wurde wiederholt, außer daß die Fibrinogenkonzentration während des Diffusionsschritts in dem Rohr kontrolliert wurde, um eine im wesentlichen konstante Fibrinogenkonzentration in dem Rohr sicherzustellen. Dafür wurde das Ventil 23 intermittierend geöffnet, um eine bestimmte Menge an Lösung aus dem Rohr zu evakuieren, und eine Lösung, enthaltend wenig oder kein Fibrinogen wurde in das Rohr gefüllt. Dadurch wurde sichergestellt, daß die Fibrinschicht eine im wesentlichen reguläre und homogene Dicke aufwies.
Beispiel 12
Beispiel 11 wurde wiederholt, außer daß die Fibrinogenkonzentration im wesentlichen kontinuierlich kontrolliert wurde, um diese Konzentration bei der Ablagerung von Fibrin auf der Innenwand des Rohrs zu vermindern.
Beispiel 13
Beispiel 3 wurde wiederholt, außer daß vor der Behandlung der Rohre mit der Fibrinogenlösung demineralisiertes Wasser, eine wäßrige Lösung, enthaltend 1 mg/ml Albumin, eine wäßrige Lösung, enthaltend 10 mg/ml Albumin, eine wäßrige Lösung, enthaltend 30 mg/ml Albumin, jeweils in die Rohre gefüllt wurden, so daß die Poren mit der Lösung gefüllt oder gesättigt wurden, bevor die Rohre mit der Fibrinogenlösung behandelt wurden.
Beispiel 14
Beispiel 3 wurde wiederholt, außer daß die in der Lösung enthaltenen Proteine 30 mg/ml Albumin und 10 mg/ml Fibronectin waren. Anstelle von Albumin und/oder Fibronectin konnten andere Proteine, wie Vibronectin usw., einzeln oder in einem Gemisch verwendet werden.
Wie in WO 96/07444 ausführlich beschrieben, kann die Fibrinschicht behandelt werden, um sie entweder zu denaturieren oder mit bestimmten Eigenschaften auszustatten.
Die Fibrinschicht kann mit Wasser, mit einem oder mehreren Salzen (möglicherweise in Lösung), mit Zusatzmitteln, die zur Verbesserung der Biokompatibilität des Trägers, der mit der Fibrinschicht ausgestattet ist, verwendet werden. Die Zusatzmittel können beispielsweise aus Proteinen, gerinnungshemmenden Mitteln, entzündungshemmenden Verbindungen, Verbindungen, die die Transplantatabstoßung verringern, lebenden Zellen, Zellwachstumsinhibitoren, Mitteln, die Endothelzellen anregen, Antibiotika, Antineoplastika, genetischen Materialien, Proteinen, die das Wachstum und/oder Anhaften von Endothelzellen an die vernetzte Fibrinschicht fördern oder anregen, Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktoren zur Heparinbindung, Stoffe gegen Cholesterin (ZOCOR^®) usw. ausgewählt werden. Einige bestimmte Beispiele für Zusatzmittel sind in US 5,660,873 angegeben, wobei deren Gehalt in der Anmeldung durch Referenz eingeschlossen ist.
Die Fibrinschicht kann gegebenenfalls beispielsweise mittels eines Plasmins teilweise hydrolysiert werden.
Beispiel 15
Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß während eines ersten Schritts Lösung A in das Rohr gefüllt wurde, um durch Erzeugen eines Vakuums in der Kammer eine nicht-vernetzte Fibrin- oder Fibrinogenschicht zu erhalten, und daß während eines zweiten Schritts Lösung B (Thrombin) in das Rohr gefüllt wurde, um Fibrinmonomere zu bilden und eine vernetzte Struktur zu erhalten.
Beispiel 16
Beispie 4 wurde wiederholt, außer daß die Lyophilisation in mehreren Schritten bewirkt, d. h. durch Senken der Temperatur auf -58 °C, durch Halten dieser Temperatur bei -58 °C, durch Erzeugen eines Vakuums (die Lyophilisationsvorrichtung mußte auf einen Drucksollwert von 7 Pa eingestellt werden, so daß die Vakuumpumpe kontinuierlich arbeiten konnte) für 1 bis 5 Stunden, durch Erhöhen der Temperatur von -58 °C auf -20 °C bis -30 °C unter Aufrechterhaltung des Vakuums, durch Halten der Temperatur bei -20 °C bis -30 °C unter Aufrechterhaltung des Vakuums für mindestens 10 Stunden (10 bis 100 Stunden), durch Erhöhen der Temperatur auf mehr als 20 °C unter Aufrechterhaltung des Vakuums.
Beispiel 17
Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß das poröse Rohr nacheinander mit Lösung A und mit Lösung B behandelt wurde.
Die Behandlungsschritte von diesem Beispiel waren:

a) Einfüllen von Lösung A (Fibrinogen) in das Rohr;
b) Erzeugen eines Vakuums in dem Raum außerhalb des Rohrs, um Lösung A durch die Wände des Rohrs zu saugen;
c) Entfernen von noch in dem Rohr vorhandener Lösung A;
d) Inkubieren der abgelagerten Fibrinogenschicht für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur (die Schritte a), b), c) und d) können vor Schritt e) einmal oder mehrmals, beispielsweise zweimal oder dreimal, wiederholt werden);
e) Einfüllen von Lösung B (Thrombin) in das Rohr;
f) Erzeugen eines Vakuums in dem Raum außerhalb des Rohrs, um Lösung B durch die Wände des Rohrs zu saugen;
g) Entfernen von noch in dem Rohr vorhandener Lösung B; h) Inkubieren der Schicht bei 37 °C für 30 Minuten;
i) Einfüllen von Lösung A (Fibrinogen) in das Rohr;
j) Erzeugen eines Vakuums in dem Raum außerhalb des Rohrs, um Lösung A durch die Wände des Rohrs zu saugen;
k) Entfernen von noch in dem Rohr vorhandener Lösung A;
l) Inkubieren der Schicht für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur (die Schritte i, j, k und l können einmal oder mehrmals wiederholt werden);
m) Inkubieren der Schicht für 90 Minuten bei 37 °C.

Beispiel 18
Beispiel 16 wurde wiederholt, außer daß die Zwischeninkubationsschritte d, h und l ausgelassen wurden.
Beispiel 19
Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß das poröse Rohr nacheinander mit Lösung A und mit Lösung B behandelt wurde.
Die Behandlungsschritte von diesem Beispiel waren:

a) Einfüllen von Lösung A (Fibrinogen) in das Rohr;
b) Erzeugen eines Vakuums in dem Raum außerhalb des Rohrs, um Lösung A durch die Wände des Rohrs zu saugen;
c) Entfernen von noch in dem Rohr vorhandener Lösung A;
d) Inkubieren der abgelagerten Fibrinogenschicht für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur;
e) Einfüllen von Lösung B (Thrombin) in das Rohr;
f) Erzeugen eines Vakuums in dem Raum außerhalb des Rohrs, um Lösung B durch die Wände des Rohrs zu saugen;
g) Entfernen von noch in dem Rohr vorhandener Lösung B; h) Inkubieren der Schicht bei 37 °C für 30 Minuten;
i) Waschen des Rohrs mit Wasser (vorzugsweise in aufeinanderfolgenden Waschvorgängen);
j) Wiederholen der Schritte a bis i einmal oder mehrmals;
k) Inkubieren der Schicht für 90 Minuten bei 37 °C.

Beispiel 20
Beispiel 4 wurde wiederholt, außer daß der pH des Lösungsgemischs bei dessen Einführen in 6, 6,5, 7 bzw. 7,5 geändert wurde, oder außer daß der pH der Lösung in dem Rohr während des Verfahrens kontrolliert wurde, um ihn beispielsweise bei 6,5 oder 7 oder 7,5 zu halten.
Beispiel 21
Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß, anstatt das poröse Rohr in einer Vakuumkammer zu plazieren, das Rohr in einem Behälter mit einer konzentrierten wäßrigen Salzlösung (NaCl) plaziert wurde, um durch Umkehrosmose eine Wasser- und Fibrin-Fibrinogen-Diffusion durch die Wand des Rohrs hin zu der konzentrierten Lösung zu erzeugen.
Beispiel 22
Die Fibrinogen- und Thrombinverbindung aus Beispiel 1 wurde mittels einer Spritze in ein Rohr injiziert, um auf der Innenwand des Rohrs eine Fibrinschicht zu erzeugen. Durch dieses Verfahren wurde verursacht, daß Fibrinogen auf der Innenwand des Rohrs und in der Fibrinschicht in der Nähe der Innenwand vorlag.
Nach Entfernen der Fibrinogenlösung und Eintauchen des Rohrs in Wasser (Vorwäsche) wurde das Rohr in der in Beispiel 1 verwendeten Vakuumkammer plaziert. Dann wurde demineralisiertes Wasser in das Rohr eingefüllt, woraufhin ein Vakuum in der Kammer erzeugt wurde (Druck von 0,3·10⁵ Pa), so daß Wasser durch die Wand des Rohrs aus der Innenwand in die Außenwand gesaugt wurde. Diese Diffusion von Wasser durch die Rohrwand ermöglicht, daß das ungebundene Fibrinogen von der Fibrinschicht und der Außenseite des Träger entfernt wird, so daß mindestens der Teil des Rohr, der sich in der Nähe der Innenwand des Rohrs befindet, frei von Fibrinogen ist.
Beispiel 23
Beispiel 22 wurde wiederholt, außer daß eine wäßrige Lösung, enthaltend 5% Glycerin, für den Waschvorgang durch Diffusion von Wasser durch die Rohrwand verwendet wurde.
Beispiel 24
Beispiel 22 wurde wiederholt, außer daß eine wäßrige Lösung, enthaltend 5% Glycerin und 1% Albumin, für den Waschvorgang durch Diffusion von Wasser durch die Rohrwand verwendet wurde.
In den obigen Beispielen wurden Fibrinschichten unter Verwendung von Fibrinogen und Thrombin aus menschlichem Blut hergestellt. Diese können durch im Handel erhältliche Produkte, wie biologische Leime von CRYOLIFE, z. B. das Produkt FibRx, oder von VITEX (das Produkt VIGuard), oder sogar rekombinantes Fibrinogen, ersetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Elemente oder Membranen, beispielsweise die Membranen aus Beispiel 1 bis 13, können in verschiedenen Anwendungen, als Membranen für Bioreaktoren, wie beispielsweise in der Anmeldung EP 96910867 (veröffentlicht als EP 822976 ) beschrieben, als Membranen für Filter, als Implantate wie künstliche innere Organe, als künstliche Venen, als künstliche Arterien, als antithrombotische Materialien, als Herzklappen, als künstliche Haut verwendet werden; die Membran kann ebenso zur Herstellung von Testkits oder -geräten usw. verwendet werden.
Eine Anzahl an Tests wurde durchgeführt, um die Morphologie der Zellen zu bestimmen, die an ein lyophilisiertes Fibrinnetzwerk, das ohne Zugabe von Glycerin (Beispiel 3) hergestellt wurde, an ein Fibrinnetzwerk, das vor und nach der Lyophilisation mit einer Lösung, enthaltend etwa 5% Glycerin (Beispiel 4), hergestellt wurde, und an ein Fibrinnetzwerk, das mit einer Lösung, enthaltend etwa 10% Glycerin (Beispiel 6) mit Lyophilisation, hergestellt wurde, angehaftet waren.
In diesen Tests wurde ein Kulturmedium aus Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) hergestellt.
Die folgenden Komponenten, in Gew.-%, wie hierin nachstehend angegeben, wurden zu diesem DMEM-Medium zugegeben:

– 20% HAM'S F 12 (Kulturmedium)
– 10% FKS (Fetalkalbsserum)
– 1% nicht-essentielle Aminosäuren (d. h. L-Alanin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Prolin, L-Serin)
– 1% Nariumpyruvat
– 1% Penicilliumstreptomycin und
– 1% L-Glutamin.

Dieses Medium wird hierin nachstehend als „hergestelltes DMEM-Medium" bezeichnet.
Die in diesen Tests verwendeten Zellen wurden wie folgt isoliert:
Gleich nach dem Schlachten der Kühe wurde die Rinderaorta gewonnen. Nach Trennung der Fettgewebe der Aorten wurden die Kollateralarterien abgebunden. Die innere Oberfläche der Aorten wurde für 15 Minuten bei 37 °C mit einer Lösung, enthaltend 250 IE/ml Kollagenase, behandelt. Die bei dieser Behandlung freigesetzten Zellen wurden gewonnen und in ein DMEM-Kulturmedium, enthaltend Valin D, 10% FKS, 100 IE/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B, gegeben. Das Kulturmedium wurde nach 24 stunden erneuert.
Nach zwei Tagen wurde das Kulturmedium in ein 70%iges DMEM-Kulturmedium, enthaltend 20% Ham's F 12, 10% FKS, 100 IE/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B, gegeben.
Sobald die Zellen einen Zusammenfluß erreicht hatten, wurden sie mit Hilfe von Trypsin (1 mg/ml) in Gegenwart von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) gewonnen.
Dann wurden sie in dem „hergestellten DMEM-Medium" gezüchtet.
Vor Zugabe der Zellen in Petri-Schalen, enthaltend einen Träger mit einem Fibrinnetzwerk, wurden die Zellen aus dem DMEM-Medium, das durch Inkubation in ei nem Trypsin-EDTA-Medium (mit 5facher Konzentration) für 5 Minuten bei 37 °C hergestellt wurde, gewonnen, dann wurden 10 ml eines Kulturmediums, enthaltend 10% FKS, zugegeben, um die Wirkung der Enzyme zu unterbrechen. Die Anzahl an Zellen in dem Medium wurde mit Hilfe eines Mikroskops durch Zählen der Zellen in einer Bürker-Kammer nach Trypanblaumarkierung bestimmt. Dieses Verfahren wird hierin nachstehend Mikroskopzählverfahren genant. Die resultierende Anzahl an Zellen betrug 25.000 Zellen/ml für eine erste Lösung und 125.000 Zellen/ml für eine zweite Lösung.
Es wurden 2 ml des Kulturmediums, enthaltend 50.000 Zellen bzw. 250.000 Zellen, getrennt in die verschiedenen Petri-Schalen gegeben, die jeweils ein lyophilisiertes Fibrinnetzwerk, hergestellt ohne Zugabe von Glycerin (Schale 1), ein Fibrinnetzwerk, hergestellt mit einer Lösung, enthaltend etwa 5% Glycerin (Beispiel 4) vor der Lyophilisation (Schale 2) und nach der Lyophilisation (Schale 3), und ein Fibrinnetzwerk, hergestellt mit einer Lösung, enthaltend etwa 10% Glycerin (Beispiel 5) mit Lyophilisation (Schale 4), enthielten.
Die Kultur von Zellen in Petri-Schalen fand bei 37 °C für 2 Stunden für eine erste Charge von Schalen (Schalen, enthaltend 50.000 Zellen) und für 11 Tage für eine zweite Charge von Schalen (Schalen, enthaltend 250.000 Zelle) statt. Nach Verstreichen der Kulturzeit, entweder 2 Stunden oder 11 Tage, wurden die Fibrinnetzwerke in Petri-Schalen mittels einer 2,5%igen Glutaraldehydlösung fixiert. Die 15, 16, 17 und 18 sind Draufsichten der Fibrinschicht der Schalen 1, 2, 3 und 4 nach 2 Stunden Kultur, gemessen mit einem Elektronenmikroskop (Philips XL20 Rasterelektronenmikroskop). Diese Figuren zeigen eine gute Zellenanhaftung auf Fibrinnetzwerken in den unterschiedlichen Schalen nach zwei Stunden Kultur. Die Zellen sind auf der oberen Oberfläche mit einer regulären und flachen Anordnung verteilt.
Bezüglich der Schalen, die für 11 Tage bei 37 °C in Kultur waren, wurde eine visuelle Untersuchung der Schalen während der Kulturzeit durchgeführt. Diese Untersuchung zeigte, daß nach 8 Tagen Kultur die Fibrinolyse des Netzwerks von Schale 1 (Fibrinnetzwerk ohne Glycerin) sichtbar war, wohingegen bezüglich der Netzwerke der Schalen 2, 3 und 4 keine Fibrinolyse nach 8 Tagen Kultur erkennbar war.
Nach 11 Tagen Kultur wurde die Anzahl an lebensfähigen Zellen für Schale 1 und für die Schalen 2 und 3 gezählt. Die Anzahl an lebensfähigen Zellen wurde mittels eines enzymatischen Kits, Boehringer Mannheim WST-1 (Katalog-Nr. 1644807; Chargen-Nr. 14890800) bestimmt. Das Prinzip dieses Verfahrens basiert auf der Spaltung eines zu dem Medium zugegebenen Tetrazoliumsalzes in Formazan durch ein Mitochondrienenzym (Succinat-Tetrazolium-Reduktase). Diese Reduktion fand nur in lebensfähigen Zellen statt. Die durch stoffwechselaktive Zellen erzeugte Formazanfarbe wurde durch ein Rasterelektronenmikroskop (ELISA-Reader) quantitativ bestimmt. Diese Bestimmung wurde durch Ersetzen des Kulturmediums der Petri-Schalen 1, 2 und 3 durch 1 ml eines frischen Mediums, enthaltend 100 μl der Lösung des enzymatischen WST-1-Kits, erzielt. Nach vier Stunden Inkubation bei 37 °C unter einer Atmosphäre, enthaltend 7% CO₂, wurden 100 μl der gefärbten Lösung von jeder Schale für eine Spektrometeranalyse gesammelt. Die Differenz zwischen dem Absorptionspeak bei 450 nm und der Absorption bei 655 nm wurde für jede Lösung bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die Absorptionsdifferenz für die Schalen 2 und 3 viel bedeutender (40 bis 50% höher) als die für Schale 1 war. Die Absorptionsdifferenz für die Schalen 1, 2 und 3 war mindestens viermal höher als die einer Probe ohne darin enthaltener Zellen. Diese Analyse belegt, daß die Zellen in den Schalen 1, 2 und 3 lebensfähig sind und ferner, daß die Gegenwart von Glycerin eine bessere Zellebensfähigkeit sicherstellt.

Claims

Element, ausgestattet mit einer auf Fibrin- oder Fibrinogen-enthaltendem Material basierenden Schicht, wobei das Element (a) einen hydrophoben oder im Wesentlichen hydrophoben Träger, der einen porösen Teil mit einer Dicke von 0,1 bis 5 mm aufweist und dessen Poren, welche sich über seine Dicke erstrecken, einen durchschnittlichen Durchmesser von 5 bis 40 μm aufweisen, wobei eine Fläche des porösen Teils mit einer auf Fibrin und/oder einem Fibrinogen-enthaltendem Material basierenden Verbindung behandelt ist, und (b) eine auf Fibrin basierende Schicht, welche die behandelte Oberfläche des Trägers bedeckt, wobei die Fibrinschicht und mindestens die mit der Fibrinschicht in Kontakt stehende Fläche des Trägers weniger als 0,5 Gewichtsprozent Fibrinogen enthalten, umfasst.
Element nach Anspruch 1, wobei die Fibrinschicht und mindestens eine Trägerschicht, sich über eine Dicke von 10 μm erstreckend, bevorzugt weniger als 0,1 Gewichtsprozent bezüglich des Gewichts der Fibrinschicht an Fibrinogen enthalten, welches nicht reagiert hat.
Element nach Anspruch 1 oder 2, wobei sich das Fibrin über die Dicke des behandelten porösen Teils des Trägers, von der behandelten Fläche bis zu einer Tiefe von mindestens 2 μm, sowohl durch Poren mit einem durchschnittlicher Durchmesser von 10 bis 20 μm als auch durch Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von mehr als 20 μm erstreckt.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der poröse Teil des Trägers eine im Wesentlichen homogene und gleichförmige Porosität über die behandelte Fläche aufweist, wobei sich etwas Fibrin homogen und gleichförmig über die Dicke des porösen Teils des Trägers zu einer Tiefe von mindestens 10 μm erstreckt.
Element nach Anspruch 2, wobei der poröse Träger Fibrinogen in einer Schicht enthält, welche sich in einem Abstand von mehr als 10 μm von der mit der Fibrinschicht in Kontakt stehenden Fläche befindet.
Element nach Anspruch 5, wobei sich Fibrinogen über die Dicke des Trägers zu einer Tiefe von mindestens 20 μm erstreckt.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei mindestens die Fläche der Fibrinschicht, welche derjenigen gegenüberliegt, die mit dem porösen Träger in Kontakt steht, stabilisiert ist.
Element nach Anspruch 7, wobei die auf Fibrin basierende Schicht mindestens teilweise vernetzt ist, um ein Netzwerk von benachbarten Alveolen zu bilden.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Schicht mit Zellen und/oder Proteinen, insbesondere mit Zell-Fibrin-Bindungen vermittelnden Proteinen, ausgestattet ist.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die vernetzte, auf Fibrin basierende Schicht, die den porösen Teil des Trägers bedeckt, wenn in trockenem Zustand gemessen, 0,5 bis 100 μm dick, bevorzugt 2,5 bis 50 μm dick ist, mit zwischen den vernetzten, auf Fibrin basierenden Molekülen oder Bindungen oder Fasern gebildeten Alveolen, wobei die Alveolen ein Volumen von 5 bis 25 μm³ aufweisen, wobei die durchschnittliche Dicke oder Höhe der Alveolen von 1 bis 5 μm, insbesondere von 1 bis 3 μm ist.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Poren des Trägerteils, welcher von der Fibrinschicht bedeckt ist, mindestens teilweise mit einem wasserlöslichen oder im Wesentlichen wasserlöslichen Protein bedeckte innere Flächen aufweisen.
Element nach Anspruch 11, wobei die Trägerfläche, welche der behandelten Fläche gegenüberliegt, mindestens teilweise mit einem wasserlöslichen oder im Wesentlichen wasserlöslichen Protein bedeckt ist.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei mindestens die Poren des porösen Teils des Trägers mit einem wasserlöslichen oder einem mischbaren polaren organischen Zusatzmittel bedeckt sind.
Element nach Anspruch 13, wobei das Netzwerk von vernetzten Fibrinfasern mindestens teilweise mit einem wasserlöslichen oder mischbaren polaren Zusatzmittel, bevorzugt mit einem Zusatzmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glycerin, Zuckern und Gemischen davon, bedeckt ist und/oder ein wasserlösliches oder mischbares polares Zusatzmittel, bevorzugt ein Zusatzmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glycerin, Zuckern und Gemischen davon, enthält.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei es einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 0,5 Gewichtsprozent, bevorzugt von weniger als 0,1 Gewichtsprozent aufweist.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei Fibronectin an der Fibrinschicht angehaftet ist, wobei der Fibronectingehalt im Vergleich mit dem Fibrin- und Fibronectingewicht in der Schicht von 0,5 bis 15% beträgt.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Fibrinschicht Calcium in der Größenordnung von 1 bis 100 μg, bevorzugt von 1 bis 50 μg Cacium pro cm³ des Fibrinschichtvolumens enthält.
Element nach Anspruch 14, wobei Calcium in der Form von Calciumchlorid vor liegt.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Träger zwei übereinander liegende Fibrinschichten aufweist, wobei die Schicht in Kontakt mit dem Träger Alveolen mit größeren Volumina verglichen mit den Alveolen der Schicht, welche die Fibrinschicht in Kontakt mit dem Träger bedeckt, aufweist.
Element nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Träger biokompatibel und/oder biologisch abbaubar ist.
Verfahren zur Herstellung eines Elements nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei mindestens ein poröser Teil einer ersten Fläche eines porösen Trägers mit einer wäßrigen Lösung, die Fibrin oder ein Fibrinogen-enthaltendes Material enthält, in Kontakt gebracht wird, wobei die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Teils des Trägers homogen und gleichförmig einer Saugkraft unterworfen wird, um die Lösung mindestens teilweise durch den porösen Teil zu saugen, womit sowohl die bezüglich des porösen Teils homogene und gleichförmige Abscheidung einer Schicht basierend auf Fibrin oder auf Fibrinogen-enthaltenden Materialien und die Diffusion mindestens des Lösungswassers durch den porösen Teil des porösen Trägers als auch die Durchdringung von Fibrin oder Fibrinogen durch den porösen Träger sichergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des Trägers einem Druck von weniger als 0,8 10⁵ Pa unterworfen wird, und wobei eine Druckdifferenz zwischen den beiden Flächen des porösen Teils von mindestens 0,3 10⁵ Pa erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die der ersten Fläche gegenüberliegende Trägerfläche einem Druck von weniger als 0,5 10⁵ Pa, bevorzugt weniger als oder gleich 0,4 10⁵ Pa unterworfen wird.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei die der ersten Fläche gegenüber liegende Trägerfläche intermittierend einem ersten Druck von weniger als 0,8 10⁵ Pa, bevorzugt von weniger als 0,4 10⁵ Pa, und einem zweiten Druck von weniger als 0,8 10⁵ Pa, bevorzugt von weniger als 0,4 10⁵ Pa, unterworfen wird, wobei der erste Druck mindestens 5% höher als der zweite Druck ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers einem Druck von weniger als 0,8 10⁵ Pa unterworfen wird, und einer Temperatur von 0 bis 100°C, bevorzugt einer Temperatur von 15 bis 60°C unterworfen wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers einer Lösung ausgesetzt wird, die derart ausgewählt ist, um eine reverse Osmose zu erzeugen, was die Diffusion von mindestens dem Lösungswasser in Kontakt mit der ersten Fläche durch den porösen Teil des Trägers verursacht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei eine Lösung verwendet wird, die 5 bis 20 mg/ml Fibrinogen-enthaltende Materialien enthält.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei eine Lösung verwendet wird, die 5 bis 20 mg/ml Fibrinogen-enthaltende Materialien und 0,01 bis 10 Einheiten Thrombin pro ml enthält.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei eine Lösung verwendet wird, die 5 bis 20 mg/ml Fibrinogen-enthaltende Materialien, Faktor XIII und 0,01 bis 2 Einheiten Thrombin pro ml enthält.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei eine Lösung verwendet wird, die 0,1 bis 10 Einheiten Faktor XIII pro ml enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei die Lösung 1 bis 40 Millimol Calciumchlorid pro ml enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 31, wobei die Lösung 0 bis 20 Gewichtsprozent, vorteilhaft 3 bis 15 Gewichtsprozent, bevorzugt 5 bis 10 Gewichtsprozent eines wasserlöslichen oder mischbaren polaren organischen Zusatzmittels enthält.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Zusatzmittel Glycerin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 33, wobei während eines ersten Schritts mindestens ein Teil einer ersten Fläche eines porösen Trägers in Kontakt mit einer Lösung gebracht wird, die Fibrin und/oder Fibrinogen-enthaltende Materialien enthält, wobei die der ersten Fläche gegenüberliegende Fläche des porösen Trägers einer Saugkraft unterworfen wird, womit eine Diffusion mindestens des Lösungswassers durch die Dicke des porösen Trägers und eine Durchdringung von Fibrin oder Fibrinogen durch die Dicke des porösen Trägers homogen und gleichförmig bezüglich des porösen Teils der ersten Fläche sichergestellt wird, und wobei während eines zweiten Schritts die Fibrin- und/oder Fibrinogenschicht stabilisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 34, wobei ein Kontakt zwischen dem Teil der ersten Fläche und einer sich bewegenden Lösung bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 35, wobei eine wäßrige Lösung verwendet wird, die ein Benetzungsmittel enthält, um die Poren des porösen Trägers vor dem Inkontaktbringen des Trägers mit der Lösung, die Fibrin oder Fibrinogen-enthaltende Materialien enthält, zu füllen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 36, wobei die Fibrinschicht einem Trocknungsschritt unterworfen wird, dem möglicherweise ein Waschschritt vorausgeht.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei dieser Trocknungsvorgang mindestens teilweise durch Gefriertrocknung, vorteilhaft bei einer Temperatur von -30°C bis -100°C, bevorzugt bei einer Temperatur von -40°C bis -70°C, bewirkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 38, wobei für mindestens einen Teil der Ablagerung der Schicht, die auf Fibrin oder auf Fibrinogenenthaltenden Materialien basiert, die Konzentration von Fibrin oder Fibrinogenenthaltenden Materialien in der Lösung in Kontakt mit der ersten Fläche kontrolliert wird, um eine im Wesentlichen konstante Wasserdiffusion durch den Träger sicherzustellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 39, wobei ein biokompatibler und/oder biologisch abbaubarer poröser Träger verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 40, wobei der poröse Teil mit einer wäßrigen Lösung behandelt wird, die vorteilhaft ein Benetzungsmittel, ein Protein oder ein polares organisches Zusatzmittel oder ein Gemisch davon enthält, bevor die Lösung, die Fibrin und/oder Fibrinogen-enthaltende Materialien enthält, in Kontakt mit dem porösen Teil gebracht wird.
Filter, welcher eine aus einem Element nach einem der Ansprüche 1 bis 20 bestehende Membran beinhaltet.
Bioreaktor, welcher eine aus einem Element nach einem der Ansprüche 1 bis 20 bestehende Membran beinhaltet.
Implantat, welches aus einem Element nach einem der Ansprüche 1 bis 20 besteht.