DE69929796T2

DE69929796T2 - Evolution ganzer zellen und organismen durch rekursive sequenz-rekombination

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Publication number: DE69929796T2
Application number: DE69929796T
Authority: DE
Inventors: Stephen Belmont DEL CARDAYRE; Matthew San Jose TOBIN; P. Willem Los Gatos STEMMER; E. Jon Sunnyvale NESS; Jeremy Menlo Park MINSHULL; A. Phillip Mountain View PATTEN; Venkiteswatan San Diego SUBRAMANIAN; A. Linda Mountain View CASTLE; M. Claus Mountain View KREBBER; Steve Hillsborough BASS; Ying-Xin Redwood City ZHANG; Tony Mountain View COX; Gjalt San Carlos HUISMAN; Ling El Marcero YUAN; A. Joseph Morgan Hill AFFHOLTER
Original assignee: Maxygen Inc
Current assignee: Maxygen Inc
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1999-07-15
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2019-07-16
Also published as: JP2002520071A; US6528311B1; US6335198B1; KR20010083053A; ATE317453T1; US8377681B2; JP4674329B2; US6716631B1; WO2000004190A1; CA2331263A1; CA2720311A1; AU5102699A; AU771511B2; US20120252681A1; US6326204B1; EP1108058A1; EP1707641A2; WO2000004190A9; EP1108058B1; US6287862B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Mit der Erfindung wird das technische Gebiet der Molekulargenetik angewandt, um die Entwicklung des Genoms von Zellen und Organismen dahin zu fördern, neue und verbesserte Eigenschaften anzunehmen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die WO 98/31837 (PCT/US98/00852) stellt bahnbrechende Technologien zur Entwicklungsförderung des Genoms von ganzen Zellen und Organismen bereit. Dem Fachmann wird klar sein, dass die in der WO 98/31837 bereitgestellte Technologie für den Fachmann wesentlich ist, Zellen und ganze Organismen in ihrer Entwicklung schnell fördern zu können. Das Dokument lehrt bspw. eine Vielzahl von rekursiven Verfahren zur künstlichen Rekombination von Nucleinsäuren in vivo, einschließlich ganzer Genome, und Wege zur Auswahl resultierender rekombinanter Organismen.
Diese Fähigkeit, Gene künstlich in ihrer Entwicklung fördern zu können, ist von grundsätzlicher Wichtigkeit. So werden Zellen in der Molekularbiologie, der Medizin und in industriellen Verfahren bspw. für eine Anzahl von etablierten Verwendungen eingesetzt. So werden bspw. Zellen gewöhnlicherweise als Wirte zur Manipulation von DNA in Verfahren, wie bspw. der Transformation und Rekombination eingesetzt. Zellen werden auch für die Expression von rekombinanten Proteinen eingesetzt, welche von transformierter/transfizierter DNA codiert sind, oder die anderweitig in die Zellen eingeführt wurden. Einige Zell-Arten werden als Vorläufer zur Generierung von transgenen Tieren und Pflanzen eingesetzt. Obwohl all diese Verfahren zwischenzeitlich Routineverfahren darstellen, so hatten sich – vor der in der WO 98/31837 offenbarten Technologie – die Genome der in diesen Verfahren verwendeten Zellen nur wenig von den Genomen natürlicher Zellen weiterentwickelt, und insbesondere nicht in Richtung Aneignung neuer oder verbesserter Eigenschaften zur Verwendung in den obigen Verfahren.
Zusätzliche Verfahren zur rekursiven Rekombination von Nucleinsäuren in vivo und zur Auswahl resultierender Rekombinanten wären daher nützlich. Die vorliegende Erfindung stellt eine Anzahl neuer und wertvoller Verfahren sowie Zusammensetzungen für die Entwicklungsförderung für das Gesamtgenom oder Teile des Genoms bereit.
EP-A-0262666 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Hybrid-Tomatenpflanze aus einer Tomatenpflanze mit Wildtypus sowie eine kultivierte Spezies einer Tomatenpflanze, bei welchem Verfahren Protoplasten fusioniert werden, die aus Zellen jeder Spezies gebildet werden, und bei dem anschließend eine Hybridpflanze aus den fusionierten Protoplasten unter selektiven Regenerationsbedingungen gewonnen wird.
US-A-4729951 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Streptomyces durch die Fusion von Protoplasten, die aus unterschiedlichen Stämmen von Streptomyces hergestellt wurden, gefolgt von einer Regeneration der Zellen und einem Screenen oder einer Auswahl der regenerierten Zellen mit einem verbesserten Phänotyp (verbesserte Antibiotika-Produktion).
Die US-A-5426040 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung verbesserter Stämme von Meeresalgen durch Protoplastenfusion, welches die Schritte des Herstellens von Protoplasten aus Elternsporen umfasst, und zwar unter Verwendung einer Enzymmischung, die die Zellwand verdaut. Die US-A-5426040 beschreibt auch ein Verfahren zur direkten Aufnahme von Fremd-DNA durch Elektroporation.
Die US-A-4677066 beschreibt ein Verfahren zur Förderung der Fusion von Pflanzenprotoplasten, bei welchem die Protoplasten unter spezifischen experimentellen Bedingungen fusioniert werden.
Die WO 92/17598 beschreibet ein Verfahren zur Herstellung transgener Sojabohnenpflanzen, bei welchem Fremd-DNA in Sojabohnenprotoplasten durch Elektroporation eingeführt wird.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Verfahren zur Förderung der Entwicklung einer Zelle dahingehend bereit, eine erwünschte Eigenschaft zu erlangen, wie in den Ansprüchen dargestellt.
Solche Verfahren können bspw. das Einführen einer Bibliothek von DNA-Fragmenten in eine Vielzahl von Zellen mit sich bringen, wobei zumindest eines der Fragmente mit einem Segment in dem Genom oder mit einem Episom der Zellen rekombiniert, wodurch modifizierte Zellen hergestellt werden. Wahlweise werden diese modifizierten Zellen gezüchtet, um die Diversität der resultierenden, rekombinierten, zellulären Population zu erhöhen. Die modifizierten Zellen oder die rekombinierte zelluläre Population werden anschließend hinsichtlich modifizierter oder rekombinierter Zellen gescreent, die sich in Richtung Aneignung der erwünschten Funktion entwickelt haben. Anschließend wird die DNA aus den modifizierten Zellen, die sich in Richtung der gewünschten Funktion entwickelt haben, wahlweise mit einer weiteren Bibliothek an DNA-Fragmenten rekombiniert, wobei zumindest eines davon mit einem Segment in dem Genom oder mit dem Episom der modifizierten Zellen rekombiniert, um weitere modifizierte Zellen zu produzieren. Die weiter modifizierten Zellen werden anschließend nach weiter modifizierten Zellen gescreent, die sich in Richtung Aneignung der erwünschten Funktion entwickelt haben. Die Schritte der Rekombination und des Screenens/der Selektion werden so lange wie benötigt wiederholt, bis die weiter modifizierten Zellen die erwünschte Funktion erlangt haben. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die modifizierten Zellen rekursiv rekombiniert, um die Diversität der Zellen zu erhöhen, und zwar bevor irgendwelche Selektions schritte bezüglich irgendwelchen resultierenden Zellen durchgeführt werden.
Bei einigen Verfahren wird die Bibliothek oder die weitere Bibliothek an DNA-Fragmenten mit recA-Protein beschichtet, um die Rekombination mit dem Segment des Genoms zu stimulieren. Die Fragmentbibliothek wird wahlweise denaturiert, um einzelsträngige DNA zu produzieren, die sich zur Bildung von Duplexen aneinander ausrichtet, und von denen einige Fehlanpassungen an Variationsstellen in den Fragmenten enthalten. Die Fehlanpassungen enthaltenden Duplexe werden wahlweise durch Affinitätschromatographie an immobilisiertem MutS selektiert.
Wahlweise ist die erwünschte Funktion die Sekretion eines Proteins, und die Vielzahl an Zellen weist ferner ein Konstrukt auf, welches für das Protein codiert. Das Protein ist – außer bei dessen Sekretion – wahlweise inaktiv, und weiter modifizierte Zellen werden wahlweise hinsichtlich der Proteinfunktion ausgewählt. Das Protein ist wahlweise für die Mehrzahl der Zellen toxisch, außer, wenn es sekretiert wird. In diesem Falle werden die modifizierten oder weiter modifizierten Zellen, die sich in Richtung der erwünschten Funktion entwickeln, durch eine Vermehrung der Zellen und durch Gewinnen der überlebenden Zellen gescreent.
Bei einigen Verfahren ist die erwünschte Funktion eine verstärkte Rekombination. Bei solchen Verfahren weist die Fragmentbibliothek ein Gencluster auf, das gemeinsam zur Rekombinationsfähigkeit beiträgt. Das Screenen kann dadurch erreicht werden, dass Zellen verwendet werden, die ein Gen tragen, welches für einen Marker codiert, dessen Expression durch eine Mutation verhindert wird, die durch Rekombination entfernt werden kann. Die Zellen werden durch ihre Expression des Markers gescreent, der aus der Entfernung der Mutation durch Rekombination resultiert.
Bei manchen Verfahren sind die Mehrzahl der Zellen Pflanzenzellen und die erwünschte Eigenschaft ist eine verbesserte Resistenz gegenüber einer Chemikalie oder Mikrobe. Die modifizierten oder weiter modifizierten Zellen (oder ganzen Pflanzen) werden der Chemikalie oder Mikrobe ausgesetzt und die modifizierten oder weiter modifizierten Zellen, die sich in Richtung Aneignung der erwünschten Funktion entwickelt haben, werden bezüglich ihrer Fähigkeit ausgewählt, die Aussetzung zu überleben.
Die Mehrzahl an Zellen kann eine Vielzahl an industriellen Mikroorganismen sein, die hinsichtlich Mikroorganismen angereichert ist, die gegenüber erwünschten Verfahrensbedingungen tolerant sind (Hitze, Licht, Strahlung, ausgewählter pH-Wert, Vorliegen von Detergenzien oder anderen denaturierenden Stoffen, Vorliegen von Alkohol oder anderen organischen Molekülen, etc.).
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Entwicklungsförderung einer Zelle bereit, eine gewünschte Eigenschaft zu erlangen. Diese Verfahren beinhalten das Bereitstellen einer Population unterschiedlicher Zellen. Die Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, bei denen DNA zwischen Zellen ausgetauscht wird, wodurch Zellen mit Hybrid-Genomen gebildet werden. Die Zellen werden anschließend gescreent oder hinsichtlich Zellen ausgewählt, die sich in Richtung Aneignung der erwünschten Eigenschaft entwickelt haben. Der DNA-Austausch und die Screening-/Selektionsschritte werden wie benötigt wiederholt, wobei die gescreenten/ausgewählten Zellen aus einem Zyklus die Population an unterschiedlichen Zellen für den nächsten Zyklus bilden, und zwar so lange, bis eine Zelle die erwünschte Eigenschaft erlangt hat.
Wahlweise kann eine Bibliothek an DNA-Fragmenten transformiert oder in die Zellen elektroporiert werden.
Die Verfahren zur Entwicklungsförderung einer Zelle, eine gewünschte Eigenschaft zu erlangen, werden durch einen Protoplasten-vermittelten Austausch von DNA zwischen den Zellen bewirkt. Solche Verfahren beinhalten das Bilden von Protoplasten einer Population unterschiedlicher Zellen. Die Protoplasten werden anschließend fusioniert, um Hybrid-Protoplasten zu bilden, in welchen die Genome aus den Protoplasten rekombinieren, um Hybrid-Genome zu bilden. Die Hybrid-Protoplasten werden unter Bedingungen inkubiert, die die Regeneration der Zellen fördern. Die regenerierten Zellen werden durch Protoplastenbindung rekombiniert, um die Diversität jeglicher resultierenden Zellen zu erhöhen. Die regenerierten Zellen werden mehrere Male rekombiniert, und zwar durch Protoplastenfusion, um eine unterschiedliche Population an Zellen zu bilden.
Der nächste Schritt ist die Selektion oder das Screenen, um regenerierte Zellen zu isolieren, die sich in Richtung Aneignung der gewünschten Eigenschaft entwickelt haben. Der DNA-Austausch und die Selektions-/Screening-Schritte werden wie benötigt wiederholt, wobei die regenerierten Zellen in einem Zyklus verwendet werden, um die Protoplasten für den nächsten Zyklus zu bilden, und zwar so lange, bis die regenerierten Zellen die erwünschte Eigenschaft erlangt haben. Industrielle Mikroorganismen sind eine bevorzugte Klasse an Organismen, um die oben beschriebenen Verfahren durchzuführen. Einige Verfahren weisen ferner einen Schritt der Selektion oder des Screenens nach fusionierten Protoplasten auf, die keine unfusionierten Protoplasten der Elternzellen aufweisen. Einige Verfahren weisen ferner einen Schritt der Selektion oder des Screenens nach fusionierten Protoplasten auf, welche Hybrid-Genome ohne Zellen mit Eltern-Genomen besitzen. In einigen Verfahren werden Protoplasten dadurch bereitgestellt, dass einzelne Zellen, Myzele oder Sporen mit einem Enzym behandelt werden, welches Zellwände abbaut. In einigen Verfahren ist der Stamm eine Mutante, der die Fähigkeit zur intakten Zellwandsynthese fehlt, und bei dem sich Protoplasten spontan bilden. In einigen Verfahren werden Protoplasten dadurch gebildet, dass wachsende Zellen mit einem Inhibitor der Zellwandbildung behandelt werden, um Protoplasten zu bilden.
Bei einigen Verfahren ist die erwünschte Eigenschaft die Expression und/oder Sektretion eines Proteins oder eines Sekundär-Metaboliten, wie bspw. ein industrielles Enzym, ein therapeutisches Protein, ein Primär-Metabolit, wie bspw. Milchsäure oder Ethanol, oder ein Sekundär-Metabolit, wie bspw. Erythromycin, Cyclosporin A, oder Taxol. Bei anderen Verfahren ist es die Fähigkeit der Zellen, Verbindungen umzuwandeln, die der Zelle für unterschiedliche Verbindungen verliehen wird. In noch anderen Verfahren ist die erwünschte Eigenschaft die Fähigkeit zur Meiose. In einigen Verfahren ist die erwünschte Eigenschaft die Kompatibilität, ein Heterokaryon mit einem anderen Stamm zu bilden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Figuren, die sich nicht auf die beanspruchte Erfindung beziehen, werden lediglich zu Illustrationszwecken bereitgestellt.
1, Felder A–D: Schema für das in vitro-Shuffling von Genen.
2: Schema zur Anreicherung von fehlangepassten Sequenzen unter Verwendung von MutS.
3: Alternatives Schema zur Anreicherung von fehlangepassten Sequenzen unter Verwendung von MutS.
4: Schema zur Entwicklungsförderung von Wachstumshormon-Genen, um größere Fische zu produzieren.
5: Schema für das Shuffling von Prokaryonten durch Protoplastenfusion.
6: Schema zur Einführung eines sexuellen Zyklus in Pilzen, die zuvor keine sexuelle Reproduktion durchführen konnten.
7: Allgemeines Schema für das Shuffling von Pilzen durch Protoplastenfusion.
8: Shuffling von Pilzen durch Protoplastenfusion, und zwar mit Protoplasten, die durch Verwendung von Inhibitoren von Enzymen generiert wurden, die für die Zellwandbildung verantwortlich sind.
9: Shuffling von Pilzen durch Protoplastenfusion, unter Verwendung von Pilzstämmen, die eine fehlerhafte Zellwandsynthese besitzen, und die spontan Protoplasten bilden.
10: YAC-vermitteltes Gesamtgenom-Shuffling von Saccharomyces cerevisiae und verwandten Organismen.
11: YAC-vermitteltes Shuffling von großen DNA-Fragmenten.
12: (A, B, C und D) DNA-Sequenzen eines Wildtyp-recA-Proteins und von fünf hyperrekombinogenen Varianten davon.
13: Aminosäuresequenzen eines Wildtyp-recA-Proteins und von fünf hyperrekombinogenen Varianten davon.
14: Darstellung der Kombinatorik.
15: Wiederholte paarweise Rekombination, zur Gewinnung vielfach mutierter Nachkommen.
16: Diagramm der Fitness gegenüber des Sequenzraumes bezüglich drei unterschiedlichen Mutationsstrategien.
17: Diagramm der asexuellen sequenziellen Mutagenese und der sexuellen rekursiven Rekombination.
18: Schema für die nicht-homologe Rekombination.
19: Schema für die Aufteilungs- und Poolstrategie.
20, Feld A: Schema für die Strategie des auswählbaren/gegen-auswählbaren Markers.
20, Feld B: Schema der Strategie für RecA bezüglich des auswählbaren/gegen-auswählbaren Markers.
21: Pflanzenregenerationsstrategie für die Regeneration Salz-toleranter Pflanzen.
22: Gesamt-Genom-Zusammenbau von analysierten (subklonierten) Genomen.
23: Schema zum Blindklonieren von Gen-Homologen.
24: Hochdurchsatz-Familien-Shuffling.
25: Schema und Diagramm der poolweisen Rekombination.
26: Schema der Protoplastenfusion.
27: Schematisches Assay für die poolweise Rekombination.
28: Schema des Hofs-Assays und des integrierten Systems.
29: Schematische Zeichnung, die das rekursive, gepoolte Züchten von Fischen darstellt.
30: Schematische Zeichnung, die das rekursive, gepoolte Züchten von Pflanzen darstellt.
31: Schema für das Shuffling von S. colicolor.
32: Schematische Zeichnung, die einen HTP-Actinorhodin-Assay darstellt.
33: Schematische Zeichnung und Tabelle, die das Gesamt-Genom-Shuffling von vier Elternstämmen zeigt.
34: Schematische Zeichnung von WGS durch ein organisiertes Heteroduplex-Shuffling.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
1. ALLGEMEIN
A. DER GRUNDLEGENDE ANSATZ
Die Erfindung stellt Verfahren zur künstlichen Entwicklungsförderung von Zellen bereit, eine neue oder verbesserte Eigenschaft durch rekursive Sequenzrekombination zu erlangen. Kurz gesagt beinhaltet die rekursive Sequenzrekombination aufeinander folgende Zyklen der Rekombination, um eine molekulare Diversität zu bilden, sowie ein Screenen/eine Selektion, mit welchem ein Vorteil aus der molekularen Diversität gezogen wird. Dies bedeutet, dass ein Familie von Nucleinsäuremolekülen gebildet wird, die eine wesentliche Sequenz- und/oder Strukturidentität aufweisen, die sich jedoch hinsichtlich des Vorliegens von Mutationen unterscheiden. Diese Sequenzen werden anschließend durch eine Protoplastenfusion rekombiniert, um die Diversität der Mutanten-Kombinationen zu optimieren, die in der entstehenden rekombinierten Bibliothek wiedergegeben werden. Jede resultierende rekombinante Nucleinsäure oder jedes Genom wird über einen oder mehrere Rekombinationszyklen rekursiv rekombiniert, um die Diversität der entstehenden Produkte zu erhöhen. Nach diesem rekursiven Rekombinationsverfahren werden die entstehenden Endprodukte gescreent und/oder bezüglich eines erwünschten Merkmals oder einer Eigenschaft ausgewählt.
Die Zellen, die in der Entwicklung gefördert werden sollen, können Bakterien, Archebakterien oder eukaryontische Zellen sein, und können eine homogene Zelllinie oder eine gemischte Kultur darstellen. Geeignete Zellen für die Entwicklungsförderung schließen die bakteriellen und eukaryontischen Zelllinien mit ein, die gegenwärtig allgemein in der Konstruktionsgenetik, der Proteinexpression oder der industriellen Produktion oder bei der Umwandlung von Proteinen, Enzymen, Primär-Metaboliten, Sekundär-Metaboliten, feinen, speziellen oder Fachchemikalien verwendet werden. Eukaryontische Zellen von Interesse schließen Pflanzenzellen, wie Mais, Reis, Weizen, Baumwolle, Sojabohne, Zuckerrohr, Tabak und Arabidopsis mit ein; Algen, Pilze (penicillium, aspergillus, podospora, neurospora, saccharomyces), Hefe (picchia und saccharomyces, Schizosaccharomyces pombe). Ferner sind viele bakteriellen Zelltypen von Interesse, sowohl gramnegative als auch grampositive, wie bspw. Bacillus subtilis, B. licehniformis, B. cereus, Escherichia coli, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Actinomycetes, Lactobacillius, Actinonitobacter, Deinococcus und Erwinia. Die vollständigen Genomsequenzen von E. coli und Bacillus subtilis sind von Blattner et al., Science 277, 1454–1462 (1997); Kunst et al., Nature 390, 249–256 (1997)) beschrieben.
Die Entwicklungsförderung beginnt durch die Generierung einer Population von verschiedenen Zellen. Typischerweise sind die Zellen in der Population vom gleichen Typus, stellen jedoch Varianten einer Vorläuferzelle dar. In manchen Fällen ist die Variation natürlich, wie wenn unterschiedliche Zellen von unterschiedlichen Individuen innerhalb einer Spezies gewonnen werden, von unterschiedlichen Spezies oder von unterschiedlichen Genera. In anderen Fällen wird die Variation durch Mutagenese einer Vorläuferzelle induziert. Die Mutagenese kann dadurch bewirkt werden, dass die Zelle mutagenen Wirkstoffen ausgesetzt wird, oder wenn die Zelle eine Mutatorzelle ist (bspw. wenn die Zelle Mutationen in Genen besitzt, die bei DNA-Replikation involviert sind, bei der Rekombination und/oder Reparatur, bei welchen das Einführen von Mutationen begünstigt ist), und einfach durch Vermehren der Mutatorzellen. Mutatorzellen können durch sukzessive Selektionen nach einfachen Phänotyp-Änderungen generiert werden (wie bspw. Aneignung einer Rifampicin-Resistenz, anschließend Nalidixinsäureresistenz und anschließend lac– zu lac+ (siehe Mao et al. J. Bacteriol. 179, 417–422 (1997)), oder Mutatorzellen können durch deren Aussetzen gegenüber spezifischen Inhibitoren zellulärer Faktoren generiert werden, was in den Mutator-Phänotyp resultiert. Diese können Inhibitoren von mutS, mutL, mutD, recD, mutY, mutM, dam, uvrD und Ähnlichen sein.
Allgemeiner gesagt, werden Mutationen in Zellpopulationen unter Verwendung irgendeiner möglichen Mutationstechnik induziert. Bekannte Mechanismen zur Induktion von Mutationen schließen – jedoch nicht ausschließlich – die Verwendung von Stämmen mit ein, welche Mutationen aufweisen, wie bspw. solche, die bei der Reparatur von Fehlanpassungen beteiligt sind, wie bspw. Mutationen in mutS, mutT, mutL und mutH; einem Aussetzen gegenüber UV-Licht; ferner eine chemische Mutagenese, d.h. die Verwendung von Inhibitoren von MMR, DNA-Schädigungs-induzierbare Gene, oder SOS-Auslöser; eine Überproduktion/Unterproduktion/Mutation irgendeiner Komponente des homologen Rekombinationskomplexes/Pfads, wie bspw. RecA, ssb, etc; Überproduktion/Unterproduktion/Mutation von Genen, die bei der DNA-Synthese/-Homeostase beteiligt sind; Überproduktion/Unterproduktion/Mutation von Rekombinations-stimulierenden Genen aus Bakterien, Phagen (bspw. Lambda Red-Funktion), oder anderen Organismen; Hinzufügen von Chi-Stellen in/oder flankierend zu den Donor-DNA-Fragmenten; Beschichten der DNA-Fragmente mit RecA/ssb und Ähnlichem.
In anderen Fällen ist die Variation das Ergebnis des Transfers einer Bibliothek aus DNA-Fragmenten in die Zellen (bspw. durch Konjugation, Protoplastenfusion, Liposomenfusion, Transformation, Transduktion oder natürliche Kompetenz). Zumindest eines der Fragmente, und gewöhnlich viele der Fragmente aus der Bibliothek, zeigt eine, nicht vollständige, Sequenz- oder Strukturidentität mit einem verwandten oder allelen Gen innerhalb der Zellen, die ausreichend ist, eine homologe Rekombination entstehen zu lassen. So führt bspw. bei einem Verfahren die homologe Integration eines Plasmids, welches ein zusammengesetztes Gen oder einen Stoffwechselweg trägt, zu dem Ein bau der Plasmidsequenzen in Angrenzung zu der genomischen Kopie. Wahlweise wird eine gegen-auswählbare Marker-Strategie eingesetzt, um Rekombinanten auszuwählen, bei denen eine Rekombination zwischen homologen Sequenzen vollzogen wurde, was zur Elimination des gegen-auswählbaren Markers geführt hat. Diese Strategie ist in 20A dargestellt. Eine Vielzahl von auswählbaren und gegen-auswählbaren Markern sind im Stand der Technik hinreichend beschrieben. Eine Liste nützlicher Marker findet sich bspw. in Berg und Berg (1996), Transposable element tools for microbial genetics; Escherichia coli and Salmonella Neidhardt, Washington, D. C., ASM Press 2: 2588–2612; LaRossa, ibid., 2527–2587. Diese Strategie kann rekursiv wiederholt werden, um die Sequenzdiversität der Zielgene vor dem Screenen/der Selektion bezüglich eines erwünschten Merkmals oder einer Eigenschaft zu maximieren.
Die Fragmentbibliothek kann aus einer oder mehreren Quellen stammen. Eine Quelle der Fragmente ist eine genomische Bibliothek von Fragmenten aus unterschiedlichen Spezies, Zelltypen, Organismen oder Individuen von den Zellen, die transfiziert werden. In diesem Fall besitzen viele der Fragmente in der Bibliothek ein verwandtes oder alleles Gen in den Zellen, die transformiert werden sollen, unterscheiden sich jedoch von dem Gen auf Grund des Vorliegens von natürlich vorkommendes Spezies-Variationen, Polymorphismen, Mutationen und im Vorliegen von verschiedenen Kopien einiger homologer Gene in dem Genom. Alternativ kann die Bibliothek von DNA aus dem gleichen Zelltypus abgeleitet sein, der transformiert wird, nachdem DNA einer induzierten Mutation unterzogen worden ist, und zwar durch herkömmliche Verfahren, wie bspw. Bestrahlung, fehleranfällige PCR, Wachstum in einem Mutatororganismus, Transposon- Mutagenese oder Kassetten-Mutagenese. Alternativ kann die Bibliothek aus einer Genom-Bibliothek von Fragmenten abgeleitet werden, die aus der gepoolten genomischen DNA einer Population an Zellen mit den gewünschten Merkmalen hergestellt wurde. Alternativ kann die Bibliothek aus einer Genom-Bibliothek von Fragmenten abgeleitet sein, die aus der gepoolten genomischen DNA einer Population von Zellen mit den erwünschten Charakteristika hergestellt wurde.
In allen diesen Fällen kann die genomische Bibliothek eine komplette genomische Bibliothek oder eine subgenomische Bibliothek sein, die bspw. von einem ausgewählten Chromosom abgeleitet ist, oder einem Teil eines Chromosoms oder einem episomalen Element innerhalb einer Zelle. Genau so gut oder anstelle dieser Quellen der DNA-Fragmente kann die Bibliothek Fragmente enthalten, die natürliche oder ausgewählte Varianten selektierter Gene mit bekannter Funktion darstellen (d.h. fokussierte Bibliotheken).
Die Anzahl der Fragmente in der Bibliothek kann von einem einzelnen Fragment bis zu über 10¹⁰ Fragmente variieren, wobei Bibliotheken mit 10³ bis 10⁸ Fragmenten üblich sind. Die Fragmente sollten hinreichend lang sein, so dass sie eine homologe Rekombination vollziehen können, und hinreichend kurz, so dass sie in eine Zelle eingeführt werden können, und, falls notwendig, vor dem Einführen manipuliert werden können. Die Fragmentgrößen können im Bereich von 10 b bis ungefähr 20 mb reichen. Die Fragmente können doppel- oder einzelsträngig sein.
Die Fragmente können in die Zellen als vollständige Genome oder als Komponenten von Viren, Plasmiden, YACs, HACs oder BACs eingeführt werden, oder können so wie sie sind eingeführt werden, in welchem Falle alle oder die meisten der Fragmente keinen Replikationsstartpunkt besitzen. Die Verwendung von viralen Fragmenten mit einzelsträngigen Genomen bietet den Vorteil, dass Fragmente in einzelsträngiger Form bereitgestellt werden können, was die Rekombination fördert. Die Fragmente können auch vor dem Einführen mit einem Selektionsmarker verbunden werden. Der Einschluss von Fragmenten in einen Vektor mit einem Replikationsstartpunkt benötigt einen längeren Zeitraum nach dem Einführen in die Zelle, in welcher die Fragmente eine Rekombination mit einem verwandten Gen eingehen können, bevor sie abgebaut oder herausselektiert werden, und aus der Zelle verloren gehen, wodurch der Anteil der Zellen mit rekombinanten Genomen erhöht wird. Wahlweise ist der Vektor ein Suizid-Vektor, der dazu in der Lage ist, länger als ein isoliertes DNA-Fragment zu existieren, der jedoch nicht in der Lage ist, in der Zelllinie permanent zu verbleiben. Ein solcher Vektor kann einen Marker transient exprimieren, und zwar für eine hinreichende Zeit, um eine Zelle, die den Vektor trägt, zu selektieren oder zu screenen (bspw., weil die Zellen, die durch den Vektor transduziert wurden, der Zielzelltyp sind, der in nachfolgenden Selektionsassays gescreent werden soll), der Vektor wird jedoch dann anschließend abgebaut oder auf andere Weise dazu unfähig gemacht, den Marker zu exprimieren. Die Verwendung solcher Vektoren kann bei der Durchführung von wahlweise aufeinander folgenden Rekombinationsrunden vorteilhaft sein, wie nachstehend diskutiert wird. So exprimieren bspw. einige Suizid-Vektoren ein langlebiges Toxin, welches durch ein kurzlebiges Molekül neutralisiert wird, das ausgehend vom gleichen Vektor exprimiert wird. Durch die Expression des Toxins alleine kann sich der Vektor nicht behaupten. Jense & Gerdes, Mol. Microbiol., 17, 205–210 (1995); Bernard et al., Gene 162, 159–160. Alternativ kann ein Vektor durch den Einbau eines defekten Replikationsstartpunkts (bspw. einem Temperatursensitiven Replikationsstartpunkts) oder durch Weglassen eines Replikationsursprungs suizidisch gemacht werden. Vektoren können auch durch den Einschluss von negativen Selektionsmarkern, wie bspw. ura3 in Hefe oder sacB in vielen Bakterien, suizidisch gemacht werden. Diese Gene werden nur in Gegenwart spezifischer Verbindungen toxisch. Solche Vektoren können derart ausgewählt werden, dass sie eine weite Bandbreite von Stabilitäten besitzen. Eine Liste von bedingten Replikationsdefekten für Vektoren, die eingesetzt werden können, um bspw. die Vektor-Replikation fehlerhaft zu machen, findet sich bspw. in Berg & Berg (1996, „Transposable element tools for microbial genetics" Escherichia coli and Salmonella Neidhardt, Washington, D. C., ASM Press, 2: 2588–2612. Eine ähnliche Liste für gegenauswählbare Marker, die allgemein für die Vektorauswahl anwendbar ist, wird auch in Berg & Berg, ebendort, gefunden. Siehe auch LaRossa (1996) „Mutant selections linking physiology, inhibitors, and genotypes" Escherichia coli and Salmonella F. C. Neidhardt, Washington, D. C., ASM Press, 2: 2527–2587.
Nach Einführen in die Zellen können die Fragmente mit der in dem Genom vorliegenden DNA oder mit Episomen der Zellen rekombinieren, und zwar durch homologe, nicht homologe oder Stellen-spezifische Rekombination. Für die vorliegenden Zwecke stellt die homologe Rekombination den bedeutendsten Beitrag für die Entwicklungsförderung der Zellen dar, da diese Form der Rekombination die existierende Diversität zwischen der DNA der Zellen, die transfiziert werden, und den DNA-Fragmenten amplifiziert. Wenn z.B. ein zu transfizierendes DNA-Fragment sich von einem verwandten oder allelen Gen an zwei Positionen unterscheidet, gibt es vier mögliche Rekombinationsprodukte, und jedes dieser Rekombinationsprodukte kann in unterschiedlichen Zellen in der transformierten Population gebildet werden. Daher verdoppelt die homologe Rekombination der Fragmente die anfängliche Diversität in diesem Gen. Wenn viele Fragmente mit korrespondierenden verwandten oder allelen Genen rekombinieren, erhöht sich die Diversität der Rekombinationsprodukte bezüglich der Ausgangsprodukte exponentiell mit der Anzahl der Mutationen. Die Rekombination resultiert in modifizierte Zellen mit modifizierten Genomen und/oder Episomen. Eine rekursive Rekombination vor der Selektion erhöht die Diversität der resultierenden modifizierten Zellen zusätzlich.
Die unterschiedlichen Zellen, egal, ob sie ein Ergebnis der natürlichen Variation, der Mutagenese oder einer Rekombination sind, werden gescreent oder ausgewählt, um eine Untereinheit von Zellen zu identifizieren, die sich in Richtung Aneignung einer neuen oder verbesserten Eigenschaft entwickelt haben. Die Art des Screenings hängt selbstverständlich von der Eigenschaft ab, und mehrere Beispiele werden nachstehend diskutiert. Vor dem anfänglichen Screenen wird die Rekombination wiederholt. In den sich wiederholenden Zyklen des Screenens kann die Stringenz erhöht werden.
Die Subpopulation an Zellen, die das Screenen überleben, wird wahlweise einer weiteren Rekombinationsrunde unterzogen. In manchen Fällen wird die weitere Rekombinationsrunde dadurch bewirkt, dass die Zellen unter Bedingungen vermehrt werden, unter welchen der Austausch von DNA zwischen den Zellen ermöglicht wird. So können bspw. Protoplasten aus den Zellen gebildet, fusioniert und regeneriert werden. Zellen mit rekombinanten Genomen werden aus den fusionierten Protoplasten vermehrt. Alternativ kann der Austausch von DNA durch das Vermehren von Zellen oder Protoplasten in einem elektrischen Feld gefördert werden. Bezüglich Zellen mit einem konjugativen Transferapparat kann der Austausch von DNA einfach durch Vermehrung der Zellen gefördert werden.
Bei anderen Verfahren wird die weitere Rekombinationsrunde durch einen Aufteilungs- und Pool-Ansatz durchgeführt. Dies bedeutet, dass die überlebenden Zellen in zwei Pools aufgetrennt werden. Aus einem Pool wird DNA isoliert und wenn nötig amplifiziert und dann anschließend in den anderen Pool transformiert. Entsprechend stellen die DNA-Fragmente aus dem ersten Pool eine weitere Bibliothek an Fragmenten dar und rekombinieren mit verwandten Fragmenten in dem zweiten Pool, was in eine weitere Diversität resultiert. Ein Beispiel dieser Strategie ist in 19 dargestellt. wie dort gezeigt ist, wird ein Pool an mutierten Bakterien mit Verbesserung in einem erwünschten Phänotyp erhalten und aufgeteilt. Aus der einen Hälfte werden Gene bspw. durch PCR, durch Klonierung zufälliger Genomfragmente, durch Infektion mit einem transduzierenden Phagen und durch Ernten der transduzierenden Partikel erhalten, oder durch zufälliges Einführen eines Transferstartpunkts (OriT) in das relevante Chromosom, um eine Donorpopulation an Zellen zu schaffen, die dazu in der Lage sind, zufällige Fragmente durch Konjugation in eine Akzeptorpopulation zu übertragen. Diese Gene werden dann neu zusammengebaut (in vitro durch bekannte Verfahren oder in vivo, wie hierin offenbart wird) oder einfach in einen allelen Ersatzvektor kloniert (wie bspw. einen, der auswählbare und gegen-auswählbare Marker trägt). Der Genpool wird anschließend in die andere Hälfte des ursprünglichen mutierten Pools transformiert, anschließend werden Rekombinanten selektiert und bezüglich weiteren Verbesserungen im Phänotyp gescreent. Diese besten Varianten werden als Ausgangspunkt für den nächsten Zyklus eingesetzt. Alternativ kann vor dem Screenen eine rekursive Rekombination durch eines der genannten Verfahren durchgeführt werden, wobei die Diversität der Population der Zellen, die gescreent werden sollen, dadurch erhöht wird.
In anderen Verfahren werden einige oder alle der Zellen, die das Screenen überleben, mit einer frischen Bibliothek an DNA-Fragmenten transfiziert, welche gleich oder unterschiedlich von der Bibliothek sein kann, die in der ersten Rekombinationsrunde verwendet wurde. In diesem Falle rekombinieren die Gene in der frischen Bibliothek mit verwandten Genen in den überlebenden Zellen. Wenn die Gene als Komponenten eines Vektors eingeführt werden, sollte die Kompatibilität dieses Vektors mit jedem anderen Vektor, der in einer vorherigen Transfektionsrunde verwendet wurde, bedacht werden. Wenn der Vektor in einer vorherigen Runde ein Suizidvektor war, gibt es kein Problem bezüglich Inkompatibilität. Wenn der Vektor, der in einer vorherigen Runde benutzt wurde, jedoch kein Suizidvektor war, sollte ein Vektor mit einem unterschiedlichen Inkompatibilitätsstartpunkt in der nachfolgenden Runde verwendet werden. Bei all diesen Formaten generiert die weitere Rekombination eine zusätzliche Diversität im DNA-Bestandteil der Zellen, was zu weiter modifizierten Zellen führt.
Die weiter modifizierten Zellen werden einer weiteren Screening-/Selektionsrunde gemäß den gleichen Prinzipien der ersten Runde unterzogen. Durch das Screenen/die Selektion wird eine Sub-Population weiterer modifizierter Zellen identifiziert, die sich weiter in Richtung Aneignung der Eigenschaft entwickelt haben. Diese Sub-Population an Zellen kann weiteren Rekombinations- und Screening-Runden gemäß den gleichen Prinzipien unterzogen werden, wahlweise wird die Stringenz des Screenens bei jeder Runde erhöht. Schließlich werden die Zellen identifiziert, die die erwünschte Eigenschaft erlangt haben.
II. DEFINITIONEN
Der Ausdruck „verwandt" bezieht sich auf eine Gensequenz, die hinsichtlich Evolution und Funktion zwischen Spezies verwandt ist. So ist beispielsweise im menschlichen Genom das menschliche CD4-Gen das verwandte Gen zum Maus-CD4-Gen, da die Sequenzen und Strukturen dieser zwei Gene darauf hindeuten, dass sie homolog sind und dass beide Gene für ein Protein kodieren, welches bei der Signalweiterleitung der T-Zellaktivierung durch MHC-Klasse-II-restringierte Antigenerkennung eine Rolle spielt.
Das Screenen/Screening ist im Allgemeinen ein Zweischrittverfahren, bei welchem zuerst bestimmt wird, welche Zellen einen Screening-Marker oder Phänotyp exprimieren oder auch nicht (oder einen ausgewählten Level an Marker oder Phänotyp), und bei welchem dann anschließend die Zellen mit der erwünschten Eigenschaft physikalisch getrennt werden. Die Selektion ist eine Form des Screenens, bei welcher eine Identifizierung und physikalische Trennung gleichzeitig mit der Expression eines Selektionsmarkers erreicht wird, welcher – unter manchen genetischen Umständen – es Zellen, die den Marker exprimieren, ermöglicht zu überleben, wohingegen andere Zellen sterben (oder umgekehrt). Screening-Marker schließen Luciferase, β-Galactosidase und das Green-Fluorescent-Protein mit ein. Selektionsmarker schließen Arzneimittel und Toxinresistenzgene mit ein.
Ein exogenes DNA-Segment ist ein für die Zelle fremdes (oder heterologes) Segment oder homolog zu der Zelle, jedoch in einer Position innerhalb der Wirtszellennucleinsäure, an welcher das Element normalerweise nicht gefunden wird. Exogene DNA-Segmente können exprimiert werden, um exogene Polypeptide zu erhalten.
Der Ausdruck „Gen" wird in einem breiten Sinne verwendet, um damit jedes DNA-Segment, das mit einer biologischen Funktion assoziiert ist, zu bezeichnen. Daher schließen Gene kodierende Sequenzen und/oder regulatorische Sequenzen mit ein, die für deren Expression benötigt werden. Gene schließen auch nicht-exprimierte DNA-Segmente ein, die bspw. Erkennungssequenzen für andere Proteine bilden.
Der Ausdruck „identisch" oder „Prozent-Identität" im Zusammenhang mit zwei oder mehreren Nucleinsäuren oder Polypeptidsequenzen bezieht sich auf zwei oder mehrere Sequenzen oder Sub-Sequenzen, die gleich sind oder einen bestimmten Prozentsatz an Aminosäureresten oder Nucleotiden besitzen, die gleich sind, wenn sie hinsichtlich der maximalen Übereinstimmung verglichen und ausgerichtet werden, wie durch Verwendung einer der folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch visuelle Inaugenscheinnahme bestimmt wird.
Der Ausdruck „im Wesentlichen identisch" im Zusammenhang von zwei Nucleinsäuren oder Polypeptiden bezieht sich auf zwei oder mehrere Sequenzen oder Sub-Sequenzen, welche mit zumindest 60%, vorzugsweise 80% und am bevorzugtesten mit 90 bis 95% in ihren Nucleotiden oder den Aminosäureresten übereinstimmen, wenn sie hinsichtlich ihrer maximalen Übereinstimmung verglichen und aneinander ausgerichtet werden, wie durch eine der folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch visuellen Vergleich gemessen werden kann. Eine vorwiegende Identität besteht vorzugsweise über eine Region der Sequenzen, die zumindest 50 Reste lang ist, vorzugsweise über eine Region von zumindest 100 Resten und am bevorzugtesten sind die Sequenzen im Wesentlichen identisch über zumindest 150 Reste. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die Sequenzen überwiegend identisch über die gesamte Länge der kodierenden Regionen.
Für einen Sequenzvergleich fungiert typischerweise eine Sequenz als Referenzsequenz, mit Bezug auf welche die Testsequenzen verglichen werden. Bei Verwendung eines Sequenzvergleichalgorithmus werden die Test- und die Referenzsequenz in einen Computer eingegeben, die Sub-Sequenzkoordinaten bestimmt, wenn notwendig, und die Sequenzalgorithmus-Programmparameter festgehalten. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann den Prozentsatz der Sequenzidentität bezüglich der Testsequenz(en) relativ zu der Referenzsequenz, basierend auf den festgesetzten Programmparametern.
Eine optimale Ausrichtung von Sequenzen für einen Vergleich kann bspw. durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), durchgeführt werden, ferner durch den Homologieausrichtungsalgorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch das Verfahren der „Suche nach Ähnlichkeit" von Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), und durch Computer-Implementierungen der Algorithmen GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI.
Ein anderes Beispiel für einen nützlichen Ausrichtungsalgorithmus ist PILEUP. PILEUP schafft eine Vielzahl von Sequenzausrichtungen aus einer Gruppe verwandter Sequenzen, und zwar unter Verwendung von progressiven, paarweisen Ausrichtungen, um die Verwandtschaft und den Prozentsatz an Sequenzidentität zu zeigen. Ferner zeichnet er einen Baum oder ein Dendogramm auf, in welchem die Verwandtschaft bezüglich der Clusterbildung gezeigt wird, die zur Bildung der Ausrichtung verwendet wurde. Bei PILEUP wird eine Vereinfachung des Verfahrens zur progressiven Ausrichtung von Feng & Doolittle eingesetzt, J. Mol. Evol. 35: 351–360 (1987). Das verwendete Verfahren ist ähnlich zu dem durch Higgins & Sharp beschriebenen Verfahren, CABIOS 5: 151–153 (1989). Das Programm kann bis zu 300 Sequenzen ausrichten, jede mit einer maximalen Länge von 5.000 Nucleotiden oder Aminosäuren. Das Verfahren zur vielfachen Ausrichtung startet mit der paarweisen Ausrichtung der zwei ähnlichsten Sequenzen, wodurch ein Cluster von zwei ausgerichteten Sequenzen entsteht. Dieses Cluster wird anschließend an der am engsten verwandten Sequenz oder Cluster der ausgerichteten Sequenzen ausgerichtet. Zwei Sequenzcluster werden durch eine einfache Verlängerung der paarweisen Ausrichtung zweier einzelner Sequenzen ausgerichtet. Die schließliche Ausrichtung wird durch eine Reihe an progressiven, paarweisen Ausrichtungen erreicht. Das Programm läuft durch die Bestimmung spezifischer Sequenzen und deren Aminosäuren oder Nucleotidkoordinaten bezüglich Regionen des Sequenzvergleichs und durch die Bestimmung der Programmparameter. So kann bspw. eine Referenzsequenz mit anderen Testsequenzen verglichen werden, um die Verwandtschaft der Prozentsequenzidentität zu bestimmen, unter Verwendung der folgenden Parameter: vorgegebenes Lückengewicht (3,00), vorgegebenes Lückenlängengewicht (0,10) und gewogene Endlücken.
Ein anderes Beispiel eines Algorithmus, der zur Bestimmung der Prozentsequenzidentität und Sequenzähnlichkeit geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990) beschrieben ist. Die Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist über das National Center for Biotechnology Information öffentlich verfügbar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Bei diesem Algorithmus werden zunächst Sequenzpaare mit hohen Treffern (HSPs) identifiziert, und zwar durch die Identifizierung kurzer Wörter der Länge W in der nachgefragten Sequenz, welche entweder passt oder einem positivwertigen Grenzwertbereich T genügt, wenn es mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz ausgerichtet wird. Auf T wird als Grenzwert für die Nachbarwortrate Bezug genommen (Altschul et al., siehe oben). Diese anfänglichen Nachbarworttreffer fungieren als Ausgangspunkte für die Einleitung von Recherchen zur Identifizierung längerer HSPs, die diese enthalten. Die Worttreffer werden dann in beide Richtungen verlängert, und zwar entlang jeder Sequenz so weit, wie der kumulative Ausrichtungstreffer gesteigert werden kann. Kumulative Treffer werden – bei Nucleotidsequenzen – unter Verwendung der Parameter M (Belohnungstreffer für ein Paar passender Res te; immer > 0) und N (Straftreffer für nicht-passende Reste; immer < 0) berechnet. Bei Aminosäuresequenzen wird eine Treffermatrix verwendet, um den kumulativen Treffersatz zu berechnen. Die Verlängerung der Worttreffer in jede Richtung wird dann gestoppt, wenn: der kumulative Ausrichtungstreffer um die Menge X von dessen maximal erreichtem Wert abweicht; der kumulative Treffersatz Richtung Null oder darunter tendiert, auf Grund der Akkumulation von einem oder mehrerer negativ-zählender Restausrichtungen; oder das Ende von einer der Sequenzen wird erreicht. Die BLAST-Algorithmusparameter W, T und X bestimmen die Sensitivität und die Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLASTN-Programm (für Nucleotidsequenzen) verwendet als Voreinstellungen eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4, und einen Vergleich beider Stränge. Bezüglich der Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP-Programm als Voreinstellungen eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Treffermatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).
Zusätzlich zu der Berechnung des Prozentsatzes der Sequenzidentität führt der BLAST-Algorithmus auch eine statistische Ähnlichkeits-Analyse zwischen zwei Sequenzen durch (siehe bspw. Karlin & Altschul. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787 (1993)). Eine Maßgabe bezüglich der Ähnlichkeit, die durch den BLAST-Algorithmus vorgesehen ist, ist die Wahrscheinlichkeit der kleinsten Summe (P(N)), welche ein Anzeichen für die Wahrscheinlichkeit darstellt, mit welcher eine Anpassung zwischen zwei Nucleotiden oder Aminosäurensequenzen zufällig auftreten würde. So wird bspw. eine Nucleinsäure als ähnlich mit einer Referenzsequenz betrachtet, wenn die Wahrscheinlichkeit der kleinsten Summe in einem Vergleich der Testnucleinsäure mit der Referenznucleinsäure weniger als ungefähr 0,1, bevorzugter weniger als ungefähr 0,01 und am bevorzugtesten weniger als ungefähr 0,001 ist.
Ein weiteres Anzeichen, dass zwei Nucleinsäuresequenzen oder Polypeptide im Wesentlichen identisch sind, ist, dass das Polypeptid, das durch die erste Nucleinsäure kodiert wird, immunologisch mit dem Polypeptid kreuzreagiert, welches durch die zweite Nucleinsäure kodiert wird, wie nachstehend beschrieben wird. Aus diesen Gründen ist ein Polypeptid typischerweise im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Polypeptid, wenn sich bspw. die zwei Peptide lediglich durch konservative Substitutionen unterscheiden. Ein anderes Anzeichen, dass zwei Nucleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, dass die zwei Moleküle unter stringenten Bedingungen miteinander hybridisieren.
Der Ausdruck „natürlich-vorkommend" wird verwendet, um ein Objekt zu beschreiben, das in der Natur aufgefunden wird. So ist bspw. eine Polypeptid- oder Polynucleotidsequenz natürlich vorkommend, die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorliegt, der aus einer Naturquelle isoliert werden kann, und der nicht absichtlich durch den Menschen im Labor modifiziert worden ist. Im Allgemeinen bezieht sich der Ausdruck „natürlich-vorkommend" auf ein Objekt, wie es in einem nicht-pathologischen (nicht-erkrankten) Individuum vorliegt, wie es typisch für die Spezies wäre.
Eine asexuelle Rekombination ist eine Rekombination ohne die Fusion von Gameten zur Bildung einer Zygote.
Ein „Stamm ohne Fehlanpassungs-Reparatur" kann jede Mutante in jedem Organismus mit einschließen, der in der Funktion der Fehlanpassungs-Reparatur beeinträchtigt ist. Diese schließen Mutanten-Genprodukte von mutS, mutT, mutH, mutL, ovrD, dcm, vsr, umuC, umuD, sbcB, recJ, etc. mit ein. Die Beeinträchtigung wird durch eine genetische Mutation, durch einen Allelen-Ersatz, eine selektive Inhibierung durch ein hinzugefügtes Reagens, wie bspw. eine kleine Verbindung oder eine exprimierte Antisens-RNA, oder durch andere Techniken erreicht werden. Die Beeinträchtigung kann in jedem Organismus bezüglich der aufgeführten Gene vorliegen oder bezüglich homologer Gene.
III. VARIATIONEN
A. BESCHICHTUNG VON FRAGMENTEN MIT RECA-PROTEIN
Die Frequenz der homologen Rekombination zwischen Bibliothekfragmenten und verwandten endogenen Genen kann vor der Einführung in die Zellen durch Beschichten der Fragmente mit einem rekombinogenen Protein erhöht werden. Siehe Pati et al., Molecular Biology of Cancer 1, 1 (1996); Sena & Zarling, Nature Genetics 3, 365 (1996); Revet et al., J. Mol. Biol. 232, 779–791 (1993); Kowalczkowski & Zarling in Gene Targeting (CRC 1995), Kapitel 7. Die rekombinogenen Proteine fördern das homologe Paaren und/oder den Strangaustausch. Das am besten charakterisierte recA-Protein stammt von E. coli und kann von Pharmacia (Piscataway, NJ) bezogen werden. Zusätzlich zu dem Wildtypprotein wurden einen Anzahl von recA-ähnlichen Proteinen von Mutanten identifiziert (bspw. recA803). Darüber hinaus haben viele Organismen recA-ähnliche Rekombinasen mit Strang-Transferaktivitäten (bspw. Ogawa et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 18, 567–576 (1993); Johnson & Symington, Mol Cell. Biol. 15, 4843–4850 (1995); Fugisawa et al., Nucl. Acids Res. 13, 7473 (1985); Hsieh et al., Cell 44, 885 (1986); Hsieh et al., J Biol. Chem. 264, 5089 (1989); Fishel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3683 (1988); Cassuto et al., Mol. Gen. Genet. 208, 10 (1987); Ganea. et al., Mol. Cell Biol. 7, 3124 (1987); Moore et al., J. Biol. Chem. 19, 11108 (1990); Keene et al., Nucl. Acids Res. 12, 3057 (1984); Kimiec, Cold Spring Harbor Symp. 48, 675 (1984); Kimeic, Cell 44, 545 (1986); Kolodner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5560 (1987); Sugino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3683 (1985); Halbrook et al., J. Biol. Chem. 264, 21403 (1989); Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7481 (1988); McCarthy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5854 (1988); Lowenhaupt et al., J. Biol. Chem. 264, 20568 (1989). Beispiele solcher Rekombinaseproteine schließen recA mit ein, außerdem recA803, uvsX (Kolodner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5560 (1987); Tishkoff et al., Molec. Cell. Biol. 11, 2593), RuvC (Dunderdale et al., Nature 354, 506 (1991)), DST2, KEM1, XRN1 (Dykstra et al., Molec. Cell. Biol. 11, 2583 (1991)), STP^α/DST1 (Clark et al., Molec. Cell. Biol. 11, 2576 (1991)), HPP-1 (Moore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88, 9067 (1991)), und außerdem andere eukaryontische Rekombinasen (Bishop et al., Cell 69, 439 (1992); Shinohara et al., Cell 69, 457).
Das recA-Protein bildet, wenn es einzelsträngige DNA umhüllt, ein Nucleoproteinfilament. In diesem Nucleoproteinfilament ist ein Monomer recA an ungefähr drei Nucleotide gebunden. Diese Eigenschaft von recA, einzelsträngige DNA zu umhüllen, ist im Wesentlichen sequenzunabhängig, obgleich besondere Sequenzen ein anfängliches Aufladen von recA auf ein Polynucleotid (bspw. Nucleation-Sequenzen) begünstigen. Die Nucleoproteinfilamente können im Wesentlichen auf jeder DNA gebildet werden, die zusammengesetzt werden soll, und können Komplexe sowohl mit einzelsträngiger als auch mit doppelsträngiger DNA bilden, sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Zellen.
Bevor die Fragmente mit recA oder anderen Rekombinasen in Kontakt gebracht werden, werden diese oftmals denaturiert, bspw. durch eine Hitzebehandlung. Anschließend wird recA-Protein mit einer Konzentration von ungefähr 1 bis 10 μM hinzugefügt. Nach der Inkubation wird die recA-beschichtete einzelsträngige DNA durch konventionelle Verfahren in Empfängerzellen eingeführt, wie bspw. durch eine chemische Transformation oder Elektroporation. Allgemein kann es wünschenswert sein, die DNA mit einem recA-Homolog zu beschichten, das aus dem Organismus isoliert wurde, in welchen die beschichtete DNA geliefert werden soll. Bei der Rekombination sind mehrere zelluläre Faktoren beteiligt und das Wirtsäquivalent zu recA tritt im Allgemeinen mit anderen Wirtsfaktoren besser in Wechselwirkung als weniger nah verwandte recA-Moleküle. Die Fragmente rekombinieren homolog mit verwandten endogenen Genen. Auf Grund der erhöhten Frequenz der Rekombination, die auf die Rekombinase-Beschichtung zurückzuführen ist, müssen die Fragmente nicht als Komponenten von Vektoren eingeführt werden.
Fragmente werden manchmal mit anderen Nucleinsäurebindenden Proteinen beschichtet, welche ihre Rekombination fördern, welche ferner Nucleinsäuren vor Abbau schützen, oder Nucleinsäuren zum Nucleus führen. Beispiele solcher Proteine schließen Agrobacterium virE2 mit ein (Durrenberger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9154–9158 (1989)). Alternativ sind die Empfängerstämme in der RecD-Aktivität fehlerhaft. Einzelsträngige Enden können auch durch eine 3'-5'-Exonucleaseaktivität generiert werden, oder durch Restriktionsenzyme, die 5'-Überhänge produzieren.
1. MutS-Selektion
Das Fehlanpassungs-Reparaturprotein aus E. coli MutS kann für eine Affinitäts-Chromatografie verwendet werden, um Fragmente doppelsträngiger DNA anzureichern, die zumindest eine Basenfehlanpassung enthalten. Das MutS-Protein erkennt die durch die einzelnen Stränge um die Stelle der Fehlanpassung gebildete Blase. Siehe bspw. Hsu & Chang, WO93/20233. Die Strategie der Affinitätsanreicherung partiell fehlangepasster Duplexe kann in die vorliegenden Verfahren eingebaut werden, um die Diversität zwischen einer einzuführenden Fragment-Bibliothek und korrespondierenden verwandten oder allelen Genen in Empfängerzellen zu erhöhen.
2 zeigt ein Schema, bei welchem MutS verwendet wird, um die Diversität zu erhöhen. Die DNA-Substrate zur Anreicherung sind im Wesentlichen miteinander ähnlich, unterscheiden sich jedoch an wenigen Stellen. So können bspw. die DNA-Substrate vollständige oder partielle Genome (bspw. eine Chromosomen-Bibliothek) aus unterschiedlichen Individuen darstellen, wobei die Unterschiede auf Polymorphismen zurückzuführen sind. Die Substrate können auch induzierte Mutanten einer Wildtypsequenz darstellen. Die DNA-Substrate werden gepoolt, einem Restriktionsverdau unterzogen und denaturiert, um Frag mente einzelsträngiger DNA zu bilden. Der einzelsträngigen DNA wird es anschließend ermöglicht, sich wieder zu verbinden. Einige einzelsträngige Fragmente verbinden sich wieder mit einem perfekt angepassten komplementären Strang, um perfekt angepasst Duplexe zu bilden. Andere einzelsträngige Fragmente verbinden sich und bilden nicht-angepasste Duplexe. Die fehlangepassten Duplexe werden aus perfekt angepassten Duplexen durch MutS-Chromatographie angereichert (bspw. mit an Beads immobilisiertem MutS). Die fehlangepassten Duplexe, die durch die Chromatographie gewonnen werden, werden in die Empfängerzellen eingeführt, wo sie mit verwandten endogenen Genen, wie oben beschrieben, rekombinieren. Die MutS-Affinitäts-Chromatographie erhöht den Anteil der Fragmente, die sich voneinander und dem verwandten endogenen Gen unterscheidet. Aus diesen Gründen resultiert die Rekombination zwischen den einzuführenden Fragmenten und den endogenen Genen in eine größere Diversität.
3 zeigt eine zweite Strategie zur MutS-Anreicherung. Bei dieser Strategie stellen die Substrate zur MutS-Anreicherung Varianten eines relativ kurzen Segments dar, wie bspw. einem Gen oder einem Cluster von Genen, bei welchem sich die meisten der unterschiedlichen Varianten nicht in mehr als in einem einzelnen Nucleotid unterscheiden. Das Ziel der MutS-Anreicherung ist es, Substrate für die Rekombination herzustellen, die mehr Variationen enthalten als Sequenzen, die in der Natur vorkommen. Dies wird durch eine Zufallsfragmentierung der Substrate erreicht, wodurch überlappende Fragmente geschaffen werden. Die Fragmente werden denaturiert und wieder verbunden, wie bei der ersten Strategie. Das Wiederverbinden generiert einige fehlangepasste Duplexe, die von den perfekt angepassten Duplexen durch MutS-Affinitäts-Chromatographie getrennt werden können. Wie zuvor beschrieben, werden mit der MutS-Chromatographie Duplexe angereichert, die zumindest eine einzelne Fehlanpassung aufweisen. Die fehlangepassten Duplexe werden anschließend in längere Fragmente zusammengebaut. Dies wird durch Zyklen mit Denaturierungen, Wiederverbinden und Kettenverlängerungen von partiell verbundenen Duplexen erreicht (siehe Sektion V). Nach mehreren solcher Zyklen werden Fragmente erreicht, die die gleiche Länge wie die Originalsubstrate besitzen, mit der Ausnahme, dass diese Fragmente sich voneinander an verschiedenen Stellen unterscheiden. Diese Fragmente werden dann in Zellen eingeführt, wo sie mit verwandten endogenen Genen rekombinieren.
2. Positive Auswahl hinsichtlich Allelenaustausch
Die Erfindung kann in Verbindung mit Verfahren zur Anreicherung von Zellen verwendet werden, welche – im Hinblick auf die Ausgangszellen – modifizierte Gene tragen. Dies kann durch die Einführung einer DNA-Fragmentbibliothek (bspw. ein einzelnes spezifisches Segment oder eine ganze oder partielle genomische Bibliothek) in einen Suizidvektor (d.h., ein Vektor, dem in der Empfängerzelle ein funktioneller Replikationsursprung fehlt) erreicht werden, der sowohl positive als auch negative Selektionsmarker enthält. Wahlweise können verschiedene Fragmentbibliotheken aus unterschiedlichen Quellen (wie bspw. B. subtilis, B. licheniformis und B. cereus) in unterschiedliche Vektoren kloniert werden, die unterschiedliche Selektionsmarker tragen. Geeignete positive Selektionsmarker schließen neo^R, Kanamycin^R, hyg, hisD, gpt, ble, tet^R mit ein. Geeignete negative Selektionsmarker schließen hsv-tk, hprt, gpt, SacB, ura3 und Cytosindeaminase mit ein. Eine Vielzahl von Beispielen von konditionellen Replikationsvektoren, Mutationen, die die Vektorreplikation beeinträchtigen, Vektoren mit einem begrenzten Wirtsspektrum und gegenauswählbaren Markern sind in Berg und Berg, supra, und LaRossa, ibid. sowie in den hierin zitierten Referenzen zu finden.
In einem Beispiel wurde ein Plasmid mit R6K- und f1-Replikationsursprüngen, einem positiv auswählbaren Marker (Beta-Lactamase) und einem gegenauswählbaren Marker (B. subtilis sacB) verwendet. Nach einer M13-Transduktion der Plasmide, die die klonierten Gene enthielten, wurden diese effizient in die chromosomale Kopie des jeweiligen Gens in eine rep-Mutante des E. coli-Stammes rekombiniert.
Eine andere Strategie, um eine negative Auswahl anzuwenden, ist es, ein Wildtyp-rpsL-Gen (welches für das ribosomale Protein S12 kodiert) in einem Vektor zur Verwendung in Zellen einzuschließen, die ein mutiertes rpsL-Gen besitzen, was eine Streptomycinresistenz verleiht. Die mutierte Form von rpsL ist in Zellen mit Wildtyp-rpsL rezessiv. Aus diesen Gründen werden durch die Auswahl hinsichtlich einer Sm-Resistenz Zellen selektiert, die eine Wildtyp-Kopie von rpsL besitzen. Siehe Skorupski & Taylor, Gene 169, 47–52 (1996). Alternativ können Vektoren verwendet werden, die lediglich einen positiven Selektionsmarker tragen, und zwar mit einer Selektionsrunde hinsichtlich Zellen, die den Marker exprimieren, und einer anschließenden Screening-Runde nach Zellen, die den Marker verloren haben (wie bspw. Screening nach Arzneimittel-Sensitivität). Das Screening nach Zellen, die den positiven Selektionsmarker verloren haben, ist mit einem Screening gegen die Expression eines negativen Selektionsmarkers äquivalent. So kann bspw. Bacillus mit einem Vektor transformiert werden, der ein CAT-Gen sowie eine zu integrierende Sequenz trägt. Siehe Harwood & Cutting, Molecular Biological methods for Bacillus, Seiten 31–33. Mit der Auswahl nach einer Chloramphenicol-Resistenz werden Zellen isoliert, die den Vektor aufgenommen haben. Nach einem geeigneten Zeitraum, der für die Rekombination gestattet wird, können mit der Auswahl für eine CAT-Sensitivität Zellen isoliert werden, die das CAT-Gen verloren haben. Ungefähr 50% solcher Zellen werden einer Rekombination mit der zu integrierenden Sequenz unterzogen worden sein.
Suizid-Vektoren, die einen positiven Selektionsmarker tragen, sowie wahlweise einen negativen Selektionsmarker und ein DNA-Fragment, können in chromosomale Wirts-DNA durch ein einziges Crossover an einer Stelle in der chromosomalen DNA integrieren, die zu dem Fragment homolog ist. Durch die Rekombination wird ein integrierter Vektor hergestellt, der von direkten Repeats der homologen Sequenz flankiert ist. In einigen Zellen resultiert die nachfolgende Rekombination zwischen den Repeats in einen Ausschluss des Vektors und entweder in die Aneignung der erwünschten Mutation von dem Vektor durch das Genom oder in die Herstellung des Genom-Wildtyps.
Bei solchen Verfahren wird nach dem Transfer der Gen-Bibliothek, die in einen geeigneten Vektor kloniert ist, eine positive Auswahl hinsichtlich der Expression des positiven Selektionsmarkers angewandt. Da nicht-integrierte Kopien des Suizidvektors schnell aus den Zellen beseitigt werden, werden mit dieser Selektion Zellen angereichert, die den Vektor in das Wirtschromosom integriert haben. Die Zellen, die die positive Selektion überleben, können anschließend vermehrt und einer negativen Selektion unterzogen werden, oder aber hinsichtlich des Verlustes des positiven Selektionsmarkers gescreent werden. Mit einer negativen Selektion können Zellen ausgewählt werden, die den negativen Selektionsmarker exprimieren. Daher exprimieren Zellen, die den integrierten Vektor beibehalten haben, den negativen Marker und werden selektiv eliminiert. Die Zellen, die beide Selektionsrunden überleben, sind diejenigen, die den Vektor anfänglich integriert und anschließend eliminiert haben. Diese Zellen werden hinsichtlich Zellen angereichert, die Gene besitzen, die durch homologe Rekombination mit dem Vektor modifiziert sind. Dieser Prozess diversifiziert durch einen einzelnen Austausch genetischer Information. Wenn der Prozess jedoch entweder mit den gleichen Vektoren oder mit einer Fragment-Bibliothek wiederholt wird, die durch eine PCR der gepoolten DNA aus der angereicherten rekombinanten Population erzeugt wurde, resultiert dies in eine Diversität der Zielgene, die bei jeder Rekombinationsrunde exponentiell verstärkt werden. Dieser Prozess kann rekursiv wiederholt werden, wobei jede Selektion wie erwünscht durchgeführt wird.
3. Individualisierte Optimierung der Gene
Im Allgemeinen ist es bei den oben beschriebenen Verfahren nicht notwendig, die Anzahl der zu optimierenden Gene, deren Lokation oder deren Funktion zu kennen. Dennoch kann dies, in manchen Fällen, wo diese Information für eines oder mehrere Gene verfügbar ist, genutzt werden. Ist z.B. die Eigenschaft, die durch Entwicklung erlangt werden soll, eine verstärkte Rekombination der Zellen, so ist das recA-Gen eines der Gene, das wahrscheinlich wichtig ist, obwohl auch viele andere Gene, bekannte und unbekannte, zusätzliche Beiträge leisten mögen. In diesem Fall kann das recA-Gen – zumindest teilweise – getrennt von anderen Kandidaten-Genen entwickelt werden. Das recA-Gen kann durch irgendein rekursives Rekombinationsverfahren, das im Abschnitt V beschrieben ist, entwickelt werden. Kurz gesagt beinhaltet dieser Ansatz, dass unterschiedliche Formen des recA-Gens gewonnen werden, dass ferner die Formen rekombiniert werden, Rekombinanten mit verbesserten Eigenschaften selektiert und die Rekombinanten weiteren Rekombinations- und Selektionszyklen unterzogen werden. An einer Stelle in der individualisierten Verbesserung des recA-Gens können die diversen Formen von recA mit Fragmenten vereinigt werden, die für andere Gene in einer Bibliothek kodieren, die in den hierin beschriebenen allgemeinen Verfahren verwendet werden sollen. Auf diese Weise wird die Bibliothek dahingehend „angeimpft", dass sie einen höheren Anteil an Varianten bezüglich eines Gens enthält, welches für die Eigenschaft bekanntermaßen wichtig ist, die erlangt werden soll, als anderweitig der Fall sein würde.
In einem Beispiel (dargestellt in 20B) wird ein Plasmid konstruiert, das eine nicht-funktionelle (mutierte) Version eines chromosomalen Gens, wie bspw. URA3, trägt, wobei das Wildtyp-Gen eine Sensitivität gegenüber einem Arzneimittel (in diesem Fall 5-Fluororotsäure) verursacht. Das Plasmid trägt auch einen auswählbaren Marker (Resistenz gegenüber einem anderen Arzneimittel, wie bspw. Kanamycin), sowie eine Bibliothek von recA-Varianten. Die Transformation des Plasmids in die Zelle resultiert in die Expression der recA-Varianten, von denen einige eine homologe Rekombination mit einer erhöhten Rate katalysieren werden. Diese Zellen, bei denen eine homologe Rekombination auftrat, sind gegenüber dem auswählbaren Arzneimittel auf dem Plasmid resistent, und auch gegenüber 5-Fluorotsäure, da die chromosomale Kopie dieses Gens unterbrochen ist. Die recA-Varianten, die die höchsten Raten an homologer Rekombination erzielen, sind in einem Pool von homologen Rekombinanten diejenigen, die am höchsten repräsentiert sind. Die mutierten recA-Gene können durch PCR aus diesem Pool isoliert werden, wieder neu zusammengesetzt sowie in das Plasmid zurückkloniert und der Prozess wiederholt werden. Andere Sequenzen können anstelle von recA eingefügt werden, um andere Komponenten des homologen Rekombinationssystems zu entwickeln.
4. Ernten der DNA-Substrate für das Shuffling
Bei einigen Shuffling-Verfahren werden DNA-Substrate aus natürlichen Quellen isoliert und können auf Grund von beständigen Unreinheiten, welche enzymatische Reaktionen vergiften können, nicht einfach durch eine DNA-Modifizierung oder durch polymerisierende Enzyme manipuliert werden. Solche Schwierigkeiten können dadurch vermieden werden, dass die DNA-Substrate über einen Erntestamm prozessiert werden. Der Erntestamm ist typischerweise eine Zellart, mit natürlicher Kompetenz und einer Fähigkeit zur homologen Rekombination zwischen Sequenzen mit wesentlicher Diversität (bspw. Sequenzen mit lediglich 75% Sequenzidentität). Der Erntestamm trägt einen Vektor, der für einen negativen Selektionsmarker kodiert, und der von zwei Segmenten flankiert ist, die jeweils zu zwei Segmenten komplementär sind, die ein Gen oder eine Region von Interesse in der DNA eines Zielorganismus flankieren. Der Erntestamm wird mit DNA-Fragmenten aus dem Ziel-Organismus in Verbindung gebracht. Die Fragmente werden durch die natürliche Kompetenz aufgenommen, oder aber durch andere hierin beschriebene Verfahren, und ein Fragment von Interesse aus dem Zielorganismus rekombiniert mit dem Vektor des Erntestammes, wodurch der negative Selektionsmarker verloren geht. Die Selektion hinsichtlich des negativen Markers ermöglicht die Isolation von Zellen, die das Fragment von Interesse aufgenommen haben. Das Shuffling kann entweder im Erntestamm (bspw. einem RecE/T-Stamm) durchgeführt werden, oder ein Vektor kann aus dem Erntestamm für ein in vitro-Shuffling oder einen Transfer in ein anderen Zelltypus für ein in vivo-Shuffling isoliert werden. Alternativ kann der Vektor über Konjugation, Protoplastenfusion oder Elektrofusion in einen anderen Zelltypus transferiert werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Erntestamm ist Acinetobacter calcoaceticus mutS. Melnikov und Youngman, (1999) Nucl Acid Res 27 (4): 1056–1062. Dieser Stamm ist natürlich kompetent und nimmt DNA in einer unspezifischen Weise auf. Auch auf Grund der mutS-Mutation ist der Stamm fähig zur homologen Rekombination von Sequenzen, die lediglich 75% Sequenzidentität zeigen.
IV. ANWENDUNGEN
A. REKOMBINOGENIZITÄT
Ein Ziel der Entwicklung ganzer Zellen ist es, Zellen zu generieren, die eine verbesserte Fähigkeit zur Rekombination besitzen. Solche Zellen sind für eine Vielzahl von Zwecken in der molekularen Genetik nützlich, einschließlich der in vivo-Formate der rekursiven Sequenzrekombination, die in Abschnitt V beschrieben ist. In E. coli wurden beinahe dreißig Gene (bspw. recA, recB, recC, recD, recE, recF, recO, recQ, recR, recT, ruvA, ruvB, ruvC, sbcB, ssb, topA, gyrA, und B, lig, polA, uvrD, E, recL, mutD, mutH, mutL, mutT, mutU, helD) und DNA-Stellen (bspw. chi, recC, sbcC) identifiziert, die bei der genetischen Rekombination beteiligt sind, und verwandte Formen mehrerer dieser Gene sind in anderen Organismen gefunden worden (bspw. rad51, rad55–rad57, Dmc1 in Hefe (siehe Kowalczykowski et al., Microbiol. Rev. 58, 401–465 (1994); Kowalczykowski & Zarling, supra), und menschliche Homologe von Rad51 und Dmc1 sind identifiziert worden (siehe Sandler et al., Nucl. Acids Res. 24, 2125–2132 (1996)). Zumindest einige der E. coli-Gene, einschließlich recA, sind in Säugetier-Zellen funktional und können auf den Nucleus abzielen, und zwar im Rahmen einer Fusion mit der nucleären Zielsequenz des SV40-großen-T-Antigens (Reiss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3094–3098 (1996)). Ferner entzerren Mutationen in fehlangepassten Reparatur-Genen, wie bspw. mutL, mutS, mutH, mutT die Homologie-Anforderungen, und gestatten eine Rekombination zwischen weiter voneinander abweichenden Sequenzen (Rayssiguier et al., Nature 342, 396–401 (1989)). Das Ausmaß der Rekombination zwischen divergierenden Stämmen kann dadurch verstärkt werden, dass fehlangepasste Reparatur-Gene und stimulierende SOS-Gene eingebaut werden. Dies kann durch die Verwendung von geeigneten Mutanten-Stämmen und/oder einem Wachstum unter Bedingungen eines Stoffwechselstresses erreicht werden, wodurch SOS-Gene stimuliert und fehlangepasste Reparatur-Gene inhibiert werden. Vulic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997). Darüber hinaus kann dies dadurch erreicht werden, dass die Produkte der fehlangepassten Reparatur-Gene durch ein Aussetzen gegenüber selektiven Inhibitoren beeinträchtigt werden.
Ausgangssubstrate für die Rekombination werden gemäß den allgemeinen Prinzipien, die weiter oben beschrieben sind, ausgewählt. Dies bedeutet, dass die Substrate Gesamtgenome oder Fraktionen davon sein können, die Rekombination-Gene oder -Stellen enthalten. Große Bibliotheken von im Wesentlichen Zufallsfragmenten können mit Fragmentsammlungen „angeimpft" werden, die aus Varianten von einem oder mehreren bekannten Rekombinations-Genen, wie bspw. recA, bestehen. Alternativ können Bibliotheken durch das Mischen verschiedener Formen der verschiedenen bekannten Rekombinations-Genen und -Stellen gebildet werden.
Die Fragment-Bibliothek wird in die Empfängerzellen, die verbessert werden sollen, eingeführt, und eine Rekombination findet statt, wodurch modifizierte Zellen gebildet werden. Die Empfängerzellen enthalten vorzugsweise ein Markergen, dessen Expression derart außer Kraft gesetzt wurde, dass es durch eine Rekombination korrigiert werden kann. So können die Zellen bspw. zwei Kopien eines Markergens enthalten, die Mutationen an unterschiedlichen Stellen aufweisen, deren Kopien rekombinieren können, wodurch das Wildtyp-Gen wieder hergestellt wird. Ein geeignetes Markergen ist das Green Fluorescent Protein (grün fluoreszierendes Protein). Ein Vektor kann konstruiert werden, der für eine Kopie des GFP mit Stopp-Codons nahe am N-Terminus kodiert, und eine andere Kopie des GFP mit Stopp-Codons nahe am C-Terminus des Proteins. Die Entfernung zwischen den Stopp-Codons an den jeweiligen Enden des Moleküls beträgt 500 bp und ungefähr 25% der Rekombinationsereignisse resultieren in aktives GFP. Die Expression von GFP in einer Zelle signalisiert, dass eine Zelle zur homologen Rekombination in der Lage ist, um zwischen den Stopp-Codons zu rekombinieren, wodurch eine fortlaufende kodierende Sequenz generiert wird. Durch das Screenen nach Zellen, die GFP exprimieren, werden Zellen angereichert, die die höchste Kapazität für eine Rekombination besitzen. Die gleiche Art eines Screens kann dazu eingesetzt werden, nachdem aufeinander folgende Runden einer Rekombination durchgeführt wurden. Dennoch sollten – außer wenn der in den vorherigen Runden verwendete Selektionsmarker ein Suizidvektor war – bei aufeinander folgenden Runden ein zweiter außer Kraft gesetzter Screeningmarker innerhalb eines zweiten Vektors eingesetzt werden, der einen Replikationsursprung oder einen positiven Selektionsmarker trägt, der unterschiedlich zu demjenigen der Vektoren ist, der in den vorherigen Runden eingesetzt wurde.
B. MULTIGENOMISCHE KOPIENANZAHL – GENREDUNDANZ
Der Großteil der bakteriellen Zellen in Kulturen, die sich in der stationären Phase befinden, und die in einem nährstoffreichen Medium gezüchtet wurden, enthalten zwei, vier oder acht Genome. In Minimalmedium enthalten die Zellen ein oder zwei Genome. Die Anzahl der Genome pro bakterieller Zelle hängt daher von der Wachstumsrate der Zelle mit Eintritt in die stationäre Phase ab. Dies liegt darin begründet, dass schnell wachsende Zellen vielfache Replikationsgabeln enthalten, welche in den Zellen in mehrere Genome nach der Termination resultieren. Die Anzahl der Genome ist abhängig vom Stamm, obwohl alle getesteten Stämme mehr als ein Chromosom in der stationären Phase besitzen. Die Anzahl der Genome in Zellen in der stationären Phase nimmt über die Zeit hin ab. Dies scheint auf eine Fragmentierung und einen Abbau der gesamten Chromosomen zurückzuführen zu sein, ähnlich der Apoptose in Säugetierzellen. Diese Fragmentierung von Genomen in Zellen mit vielfachen Genomkopien resultiert in eine massive Rekombination und Mutagenese. Geeignete Mutanten könnten Wege finden, Energiequellen zu nutzen, die es ihnen ermöglichen, weiter zu wachsen. Multigenom- oder Gen-redundante Zellen sind wesentlich resistenter gegenüber Mutagenese und können schneller hinsichtlich eines ausgewählten Merkmals verbessert werden.
Einige Zelltypen, wie bspw. Deinococcus radians (Daly und Minton, J. Bacteriol. 177, 5495–5505 (1995)), zeigen durch den gesamten Zellzyklus eine Polyploidie. Dieser Zelltypus ist auf Grund des Vorliegens vieler Kopien des Genoms resistent gegenüber hoher Strahlung. Eine Rekombination mit hoher Frequenz zwischen den Genomen ermöglicht das schnelle Entfernen von Mutationen, die durch eine Vielzahl von DNA-verletzenden Agenzien verursacht wurden.
Eine mögliche Verwendung der vorliegenden Verfahren ist es, andere Zelltypen dahingehend zu entwickeln, dass sie eine erhöhte Genom-Kopienanzahl besitzen, ähnlich zu derjenigen von Deinoccocus radians. Vorzugsweise wird die erhöhte Kopienanzahl über alle oder die meisten Zellzyklen hinweg, unter allen oder den meisten Wachstumsbedingungen hindurch aufrechterhalten. Das Vorliegen einer Vielzahl von Genomkopien in solchen Zellen resultiert in eine höhere Frequenz der homologen Rekombination in diesen Zellen, sowohl zwischen Kopien eines Gens in unterschiedlichen Genomen innerhalb der Zelle, als auch zwischen einem Genom innerhalb der Zelle und einem transfizierten Fragment. Die erhöhte Frequenz der Rekombination ermöglicht es den Zellen, schneller dahingehend entwickelt zu werden, andere nützliche Eigenschaften zu erlangen.
Ausgangssubstrate für die Rekombination können eine diverse Gen-Bibliothek sein, von welchen Genen nur wenige rele vant für die genomische Kopienanzahl sind, ferner eine fokussierte Bibliothek, die aus Varianten von Genen gebildet ist, die dafür bekannt sind oder von denen angenommen wird, eine Rolle bei der genomischen Kopienanzahl zu spielen, oder eine Kombination der beiden. Als eine allgemeine Regel würde man erwarten, dass eine erhöhte Kopienanzahl durch die Entwicklung von Genen erreicht werden würde, die bei der Replikation und Zelltrennung derart beteiligt sind, dass die Zelltrennung inhibiert wird, ohne die Replikation zu beeinflussen. Gene, die bei der Replikation beteiligt sind, schließen tus, xerC, xerD, dif, gyrA, gyrB, parE, parC, dif, TerA, TerB, TerC, TerD, TerE, TerF mit ein und Gene, die das Aufteilen der Chromosomen und die Genkopienanzahl beeinflussen, schließen minD, mukA (tolC), mukB, mukC, mukD, spoOJ, spoIIIE mit ein (Wake & Errington, Annu. Rev. Genet. 29, 41–67 (1995)). Eine geeignete Quelle für die Substrate ist das Genom eines Zelltypes, wie bspw. Deinoccocus radians, von dem bekannt ist, dass er der erwünschte Phänotyp einer multigenomischen Kopienanzahl besitzt. Genau so gut oder anstelle von den oben genannten Substraten können auch Fragmente verwendet werden, die für Protein- oder Antisens-RNA-Inhibitoren für Gene kodieren, von denen bekannt ist, dass sie bei der Zelltrennung beteiligt sind.
In der Natur würde die Existenz von vielen genomischen Kopien in einem Zelltypus normalerweise auf Grund der größeren Nahrungserfordernisse nicht vorteilhaft sein, die dazu notwendig wären, diese Kopienzahl aufrechtzuerhalten. Dennoch können künstliche Bedingungen aufgestellt werden, um hinsichtlich einer hohen Kopienanzahl zu selektieren. Modifizierte Zellen mit rekombinierten Genomen werden in nährstoffreichen Medien gezüchtet (unter diesen Bedingungen sollte die vielfache Kopienanzahl keinen Nachteil bedeuten) und einem Mutagen ausgesetzt, wie bspw. Ultraviolett- oder Gammastrahlung, oder einem chemischen Mutagen, bspw. Mitomycin, salpetrige Säure, photoaktiviertes Psoralene, alleine oder in Kombination, wodurch DNA-Brüche induziert werden, die durch eine Rekombination wieder repariert werden können. Mit diesen Bedingungen kann nach Zellen selektiert werden, die eine Multikopienanzahl besitzen, und zwar auf Grund der höheren Effizienz, mit welcher die Mutationen ausgeschnitten werden können. Die modifizierten Zellen, die das Aussetzen einem Mutagen gegenüber überleben, werden hinsichtlich Zellen angereichert, die eine mehrfache Genomkopienanzahl besitzen. Falls notwendig, können die ausgewählten Zellen individuell hinsichtlich der Genomkopienanzahl analysiert werden (bspw. durch quantitative Hybridisierung mit geeigneten Kontrollen). Einige oder alle der gesammelten Zellen, die die Selektion überleben, stellen die Substrate für die nächste Rekombinationsrunde dar. Darüber hinaus können individuelle Zellen aussortiert werden, und zwar unter Verwendung eines Zellsortierers hinsichtlich denjenigen Zellen, die mehr DNA enthalten, bspw. unter Verwendung von DNA-spezifischen, fluoreszierenden Verbindungen oder durch eine Auswahl hinsichtlich einer erhöhten Größe unter Einsatz der Licht-Dispersion. Schließlich werden Zellen entwickelt, die mindestens 2, 4, 6, 8 oder 10 Kopien des Genoms über den gesamten Zellzyklus hinweg besitzen. Auf eine ähnliche Weise können auch Protoplasten rekombiniert werden.
C. SEKRETION
Die Sekretionswege eines Proteins (oder eines Metaboliten) von bakteriellen oder eukaryontischen Zellen kann dahingehend entwickelt werden, erwünschte Moleküle effizienter zu exportieren, wie bspw. für die Herstellung von Protein-Pharmazeutika, Arzneimitteln, die aus kleinen Molekülen bestehen, oder speziellen Chemikalien. Verbesserungen in der Effizienz sind insbesondere hinsichtlich Proteinen wünschenswert, bei welchen ein Zusammenbau aus vielen Untereinheiten notwendig ist (wie bspw. bei Antikörpern) oder bei welchen vor der Sekretion eine aufwändige posttranslationale Modifikation notwendig ist.
Die Sekretionseffizienz kann von einer Anzahl genetischer Sequenzen abhängen, einschließlich einer kodierenden Sequenz für ein Signalpeptid, von Sequenzen, die für Proteine kodieren, die die kodierende Sequenz spalten oder anderweitig erkennen, und die kodierende Sequenz des Proteins, das sekretiert wird. Letzteres kann die Faltung des Proteins beeinflussen, sowie die Leichtigkeit, mit welcher es in Membranen integrieren und diese traversieren kann. Der bakterielle Sekretionsweg in E. coli schließt die SecA-, SecB-, SecE-, SecD- und SecF-Gene mit ein. In Bacillus subtilis sind die Hauptgene secA, secD, secE, secF, secY, ffh, ftsY, zusammen mit fünf Signalpeptidasegenen (sipS, sipT, sipU, sipV und sipW) (Kunst et al., supra). Bezüglich Proteinen, die eine posttranslationelle Modifikation benötigen, kann die Entwicklung von Genen, die eine solche Modifizierung bewirken, zu einer verbesserten Sekretion beitragen. Ähnlich können Gene mit Expressionsprodukten, die eine Rolle bei dem Zusammenbau von Proteinen aus vie len Untereinheiten spielen (bspw. Chaperonine), auch für eine verbesserte Sekretion sorgen.
Die Selektion von Substraten für die Rekombination folgt den allgemeinen, oben diskutierten Prinzipien. In diesem Fall umfassen die in Frage stehenden Bibliotheken, auf die oben Bezug genommen wird, Varianten der bekannten Sekretionsgene. Zur Entwicklung von prokaryontischen Zellen dahingehend, dass sie eukaryontische Proteine exprimieren, werden die Ausgangssubstrate für die Rekombination oftmals zumindest teilweise aus eukaryontischen Quellen gewonnen. Einzuschleusende Fragmente können eine Rekombination sowohl mit der chromosomalen DNA in den Empfängerzellen als auch mit dem Screening-Markerkonstrukt, das in solchen Zellen vorliegt (siehe unten), eingehen. Letztere Form der Rekombination ist für die Entwicklung der signalkodierenden Sequenz, die in dem Screening-Markerkonstrukt eingebaut ist, wichtig. Eine verbesserte Sekretion kann durch den Einschluss von einem Markerkonstrukt in die Zellen, die entwickelt werden sollen, gescreent werden. Das Markerkonstrukt kodiert für ein Markergen, welches operativ mit den Expressionssequenzen verbunden ist, und das gewöhnlich mit einer Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, operativ verbunden ist. Das Markergen wird manchmal als Fusionsprotein mit einem rekombinanten Protein von Interesse exprimiert. Dieser Ansatz ist dann nützlich, wenn die kodierende Sequenz für das rekombinante Protein zusammen mit Sekretionsgenen entwickelt werden soll.
In einer Variation kodiert das Markergen für ein Produkt, das für die Zelle toxisch ist, die das Konstrukt enthält, außer, wenn das Produkt sekretiert wird. Geeignete Toxin- Proteine schließen das Diphtherietoxin und das Ricintoxin mit ein. Mit der Vermehrung von modifizierten Zellen, die ein solches Konstrukt tragen, werden dann Zellen ausgewählt, die sich in Richtung einer verbesserten Sekretion des Toxins entwickelt haben. Alternativ kann das Markergen für einen Liganden für einen bekannten Rezeptor kodieren, und Zellen, die den Liganden tragen, können durch FACS unter Verwendung eines markierten Rezeptors detektiert werden. Wahlweise kann ein solcher Ligand mit einer Phospholipid-Verankerungssequenz operativ verbunden sein, welche den Liganden nach der Sekretion an die Zellmembranoberfläche bindet. (Siehe die gemeinsam angemeldete, ebenfalls anhängige 08/309,345.) In einer weiteren Variation kann das sekretierte Markerprotein in unmittelbarer Nachbarschaft zu der Zelle gehalten werden, welche es sekretiert, und zwar durch Aufteilen einzelner Zellen in Agartropfen. Dies wird bspw. dadurch erreicht, dass aus einer Zellsuspension Tröpfchen gebildet werden. Das sekretierte Protein wird innerhalb der Agarmatrix gehalten und kann bspw. durch FACS detektiert werden. In einer anderen Variation wird ein Protein von Interesse als Fusionsprotein zusammen mit Beta-Lactamase oder alkalischer Phosphatase exprimiert. Diese Enzyme verstoffwechseln kommerziell erhältliche, chromogene Substrate (bspw. X-gal), dies jedoch lediglich nach Sekretion in das Periplasma. Das Auftreten eines gefärbten Substrats in einer Kolonie von Zellen zeigt daher die Fähigkeit an, dass das Fusionsprotein sekretiert wird, und die Intensität der Farbe steht mit der Effizienz der Sekretion in Zusammenhang.
Die Zellen, die durch diese Screening- und Selektionsverfahren identifiziert werden, besitzen die Fähigkeit, erhöhte Mengen an Protein zu sekretieren. Diese Fähigkeit kann auf eine erhöhte Sekretion und eine erhöhte Expression oder lediglich auf eine erhöhte Sekretion zurückzuführen sein.
1. Expression
Zellen können auch dahingehend entwickelt werden, eine erhöhte Expression eines rekombinanten Proteins zu erlangen. Der Expressionsgrad ist selbstverständlich stark von dem Konstrukt abhängig, von welchem das rekombinante Protein exprimiert wird, sowie von den regulatorischen Sequenzen, wie bspw. dem Promoter, dem (den) Enhancer(n) und der hierin enthaltenen Transkriptionsterminationsstelle. Die Expression kann auch durch eine große Anzahl von Wirtsgenen beeinflusst werden, die bei der Transkription, posttranslationellen Modifizierung und Translation eine Rolle spielen. Darüber hinaus können Wirtsgene, die bei der Synthese von Ribonucleotiden und Aminosäurenmonomeren für die Transkription und Translation beteiligt sind, indirekte Effekte auf die Expressionseffizienz haben. Die Selektion der Substrate für die Rekombination folgt den allgemeinen Prinzipien, die zuvor diskutiert wurden. In diesem Falle weisen die in Frage kommenden Bibliotheken Varianten von Genen auf, von denen bekannt ist, dass sie bei der Expression eine Rolle spielen. Für die Entwicklung von prokaryontischen Zellen dahingehend, dass sie eukaryontische Proteine exprimieren, werden die Anfangssubstrate für die Rekombination oftmals – zumindest teilweise – von eukaryontischen Quellen gewonnen; dies sind bspw. eukaryontische Gene, die für Proteine kodieren, wie bspw. Chaperonine, die bei der Sekretion und bei dem Zusammenbau von Proteinen beteiligt sind. Eingeschleuste Fragmente können sowohl mit chromosomaler DNA in den Empfängerzellen als auch mit dem Screening-Markerkonstrukt, der in diesen Zellen vorliegt, eine Rekombination eingehen (siehe unten).
Das Screening für eine verbesserte Expression kann durch Einschluss eines Reportergenkonstrukts in die Zellen, die entwickelt werden sollen, bewirkt werden. Das Reportergenkonstrukt exprimiert (und sekretiert gewöhnlicherweise) ein Reporterprotein, wie bspw. GFP, das einfach detektiert werden kann und nicht toxisch ist. Das Reporterprotein kann alleine exprimiert werden, oder aber als Fusionsprotein zusammen mit einem Protein von Interesse. Wenn das Reportergen sekretiert wird, kann mit dem Screening effektiv nach Zellen selektiert werden, die entweder eine verbesserte Sekretion oder eine verbesserte Expression, oder aber beides aufweisen.
2. Pflanzenzellen
Eine weitere Anwendung der rekursiven Sequenz-Rekombination ist die Entwicklung von Pflanzenzellen und transgenen Pflanzen, die hieraus entwickelt wurden, um eine Resistenz gegenüber pathogenen Krankheiten (Pilze, Viren und Bakterien), Insekten, Chemikalien (wie bspw. Salz, Selen, Umweltgifte, Pestizide, Herbizide oder Ähnliches), einschließlich bspw. Atrazin oder Glyphosat zu erlangen, oder aber um die chemische Zusammensetzung, die Ausbeute oder Ähnliches zu modifizieren. Die Substrate für die Rekombination können wiederum Gesamtgenom-Bibliotheken sein, Fraktionen davon oder gezielte Bibliotheken, die Varianten von Genen enthalten, von denen bekannt ist oder von denen man annimmt, dass sie eine Resistenz gegenüber einem der oben genannten Agenzien vermitteln. Häufig wer den Bibliothekfragmente aus unterschiedlichen Spezies der Pflanze erhalten, die entwickelt werden soll.
Die DNA-Fragmente werden in die Pflanzengewebe, in kultivierte Pflanzenzellen, Pflanzenmikrosporen oder Pflanzenprotoplasten durch Standardverfahren, einschließlich der Elektroporation, eingeführt (From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), ferner durch Infektion mit viralen Vektoren, wie bspw. das Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) (Hohn et al., Molecular Biology of Plant Tumors, (Academic Press, New York, 1982) Seiten 549–560; Howell, US 4,407,956 ), durch eine ballistische Penetration mit hoher Geschwindigkeit durch kleine Partikel, bei welchen die Nucleinsäure entweder innerhalb der Matrix von kleinen Kügelchen oder Partikeln oder auf der Oberfläche vorliegt (Klein et al., Nature 327, 70–73 (1987)), mit der Verwendung von Pollen als Vektoren (WO 85/01856), durch die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder A. rhizogenes, die ein T-DNA-Plasmid tragen, in welches die DNA-Fragmente kloniert werden. Das T-DNA-Plasmid wird nach einer Infektion durch Agrobacterium tumefaciens in Pflanzenzellen überführt, und ein Anteil wird in das Pflanzengenom stabil integriert (Horsch et al., Science 233, 496–498 (1984); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4803 (1983)).
Eine Diversität kann auch durch den genetischen Austausch zwischen Pflanzenprotoplasten gemäß den gleichen Prinzipien, die nachstehend für Pilz-Protoplasten beschrieben sind, hergestellt werden. Verfahren zur Bildung und Fusion von Pflanzenprotoplasten sind von Takahashi et al., US 4,677,066 ; Akagi et al., US 5,360,725 ; Shimamotu et al., US 5,250,433 ; Cheney et al., US 5,426,040 , beschrieben.
Nach einem geeigneten Inkubationszeitraum, in welchem das Auftreten der Rekombination und die Expression von rekombinanten Genen ermöglicht wird, werden die Pflanzenzellen mit einem Agens in Verbindung gebracht, gegenüber welchem eine Resistenz erlangt werden soll, und die überlebenden Pflanzenzellen werden gesammelt. Einige oder alle dieser Pflanzenzellen können einer weiteren Rekombinations- und Screeningrunde unterzogen werden. Schließlich werden Pflanzenzellen erhalten, die den erwünschten Resistenzgrad erhalten haben.
Diese Zellen können anschließend in transgene Pflanzen kultiviert werden. Die Pflanzenregeneration aus kultivierten Protoplasten ist in Evans et al., „Protoplast Isolation and Culture", Handbook of Plant Cell Cultures 1, 124–176 (MacMillan Publishin Co., New York, 1983) beschrieben; ferner in Davey, „Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protplasts", Protoplasts, (1983), Seiten 12–29, (Birkhauser, Basel 1983); Dale, „Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops", Protoplasts (1983), Seiten 31–41, (Birkhauser, Basel 1983); Binding, "Regeneration of Plants", Plant Protoplasts, Seiten 21–73 (CRC Press, Boca Raton, 1985).
In einer Variation des oben genannten Verfahrens können eine oder mehrere vorläufige Rekombinations- und Screeningrunden in bakteriellen Zellen durchgeführt werden, und zwar gemäß der gleichen allgemeinen Strategie, die für Pflanzenzellen beschrieben ist. In bakteriellen Zellen kann auf Grund deren größerer Wachstumsrate und auf Grund der größeren Effizienz, mit welcher die DNA in solche Zellen eingeführt werden kann, eine schnellere Entwicklung erreicht werden. Nach einer oder mehreren Rekombinations-/Screeningrunden wird eine DNA-Fragmentbibliothek aus den Bakterien gewonnen und in die Pflanzenzellen transformiert. Die Bibliothek kann entweder eine vollständige Bibliothek oder eine ausgewählte Bibliothek sein. Eine ausgewählte Bibliothek kann durch Amplifizierung ausgehend von Primern hergestellt werden, die spezifisch für die Pflanzensequenzen sind, insbesondere für Pflanzensequenzen, von denen bekannt ist, oder von denen man annimmt, dass sie bei der Verleihung von Resistenz eine Rolle spielen.
3. Beispiel: Concatamerer Aufbau eines Atrazin-catabolisierenden Plasmids
Die Atrazin-catabolisierende Gene AtzA und AtzB von Pseudomonas wurden aus pMD1 (de Souza et al., Appl. Environ. Microbiol. 61, 3373–3378 (1995); de Souza et al., J. Bacteriol. 178, 4894–4900 (1996)) in pUC18 subkloniert. Ein 1,9 kb AvaI-Fragment, das AtzA enthielt, wurde an den Enden aufgefüllt und in eine AvaI-Stelle von pUC18 eingefügt. Ein 3,9 kb ClaI-Fragment, welches AtzB enthielt, wurde an den Enden aufgefüllt und in die HincII-Stelle von pUC18 kloniert. AtzA wurde dann aus pUC18 mit EcoRI und BamHI ausgeschnitten, AzB mit BamHI und HindIII, und die beiden Inserts wurden in pUC18, der mit EcoRI und HindIII verdaut wurde, coligiert. Als Ergebnis wurde ein 5,8 kb-Insert erhalten, welches AtzA und AtzB in pUC18 enthielt (Gesamtplasmidgröße 8,4 kb).
Die rekursive Sequenz-Rekombination wurde wie folgt durchgeführt. Das gesamte 8,4 kb-Plasmid wurde mit DNaseI in 50 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MnCl₂ behandelt und anschließend Fragmente mit einer Größe zwischen 500 und 2000 bp gel gereinigt. Die Fragmente wurden in einer PCR-Reaktion unter Verwendung des Tth-XL-Enzyms und Puffer von Perkin Elmer, 2,5 mM MgOAc, 400 μM dNTPs und Reihenverdünnungen von DNA-Fragmenten zusammengebaut. Die Aufbaureaktion wurde in einem MJ-Research „DNA-Engine" durchgeführt, der mit den folgenden Zyklen programmiert war: 1) 94°C, 20 Sekunden; 2) 94°C, 15 Sekunden; 3) 40°C, 30 Sekunden; 4) 72°C, 30 Sekunden + 2 Sekunden pro Zyklus; 5) gehe zu Schritt 2, 39 Mal; 6) 4°C.
Die AtzA- und AtzB-Gene wurden aus der Aufbaureaktion unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion nicht amplifiziert, vielmehr wurde die DNA mittels Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung aus der Reaktion gereinigt, und anschließend die aufgebaute DNA mit einem Restriktionsenzym verdaut, das das Plasmid linearisierte (KpnI: die KpnI-Stelle in pUC18 ging während der Subklonierung verloren, wodurch lediglich die KpnI-Stelle in AtzA übrig blieb). Das linearisierte Plasmid wurde Gel-gereinigt, über Nacht wieder ligiert, in den E. coli-Stamm NM522 transformiert. (Die Auswahl des Wirtsstammes war relevant: nur sehr wenig Plasmid mit geringer Qualität wurde aus einer Anzahl von anderen kommerziell verfügbaren Stämmen erhalten, einschließlich TG1, DH10B, DH12S.)
Reihenverdünnungen der Transformationsreaktion wurden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Ampicillin ausplattiert, und der Rest der Transformationsreaktion wurde auf 25% Glycerol gebracht und bei –80°C eingefroren. Sobald die transformierten Zellen getitert waren, wurden die eingefrorenen Zellen mit einer Dichte von zwischen 200 und 500 auf 150 mm-Durchmesser-Platten mit 500 μg/ml Atrazin ausplattiert und bei 37°C wachsen gelassen.
Atrazin mit einer Konzentration von 500 μg/ml bildet ein unlösliches Präzipitat. Die Produkte der AtzA- und AtzB-Gene transformieren Atrazin in ein lösliches Produkt. Zellen, die die Wildtyp-AtzA- und -AtzB-Gene in pUCl8 enthalten, sind daher von einem klaren Hof umgeben, innerhalb welchem das Atrazin abgebaut wurde. Je aktiver die AtzA- und AtzB-Enzyme sind, desto schneller wird sich ein klarer Hof bilden und auf den Atrazin-enthaltenden Platten wachsen. Als positive Kolonien wurden diejenigen gepickt, die am schnellsten die größten klaren Zonen bildeten. Die (annäherungsweise) 40 besten Kolonien wurden gepickt, vereinigt, und in Anwesenheit von 50 μg/ml Ampicillin wachsen gelassen; anschließend wurde aus diesen das Plasmid präpariert. Das gesamte Verfahren (von der DNase-Behandlung bis zur Ausplattierung auf Atrazin-Platten) wurde viermal mit 2000–4000 Kolonien/Zyklus wiederholt.
Eine Modifizierung wurde in der vierten Runde vorgenommen. Die Zellen wurden sowohl auf 500 μg/ml Atrazin als auch auf 500 μg/ml des Atrazin-Analogons Terbutylazin ausplattiert, welches durch die Wildtyp-AtzA- und -AtzB-Gene nicht abgebaut werden kann. Die positiven Kolonien, die beide Verbindungen abbauten, wurden gewonnen. Die Atrazin-Chlorhydrolase (Produkt des AtzA-Gens) war 10- bis 100-fach höher als diejenige, die vom Wildtyp-Gen produziert wird.
D. PFLANZENGENOM-SHUFFLING
Durch Pflanzengenom-Shuffling können rekursive Zyklen zur Einführung und Rekombination von Genen oder Wegen eingeführt werden, die der erwünschten Pflanzenspezies verbesserte Eigenschaften verleihen. Jede Pflanzenspezies, einschließlich Getreide und Wildpflanzen, die eine erwünschte Eigenschaft zeigen, wie bspw. eine Herbizid-Resistenz, Salztoleranz, Pestizidresistenz oder Temperaturtoleranz, kann als DNA-Quelle verwendet werden, welche in das Getreide oder in Kultur-Wirtspflanzenspezies eingeführt werden soll.
Die genomische DNA, gewonnen aus der Quellpflanze, wird fragmentiert (bspw. durch DNAaseI, Restriktionsenzyme oder mechanisch) und in einen Vektor kloniert, der zur Herstellung von Pflanzengenom-Bibliotheken geeignet ist, wie bspw. pGA482 (An. G., 1995, Methods Mol. Biol. 44: 47–58). Dieser Vektor enthält die linken und rechten Grenzbereiche von A. tumefaciens, die für den Gentransfer in Pflanzenzellen notwendig sind, sowie Antibiotika-Marker zur Selektion in E. coli, Agrobacterium und Pflanzenzellen. Eine Multiklonierungsstelle ist für die Insertion der genomischen Fragmente vorgesehen. Eine cos-Sequenz ist für eine effiziente Verpackung der DNA in Lambda-Bacteriophagenköpfen zur Transfektion der primären Bibliothek in E. coli vorgesehen. Der Vektor kann DNA-Fragmente von 25 bis 40 kb aufnehmen.
Die Primärbibliothek kann auch direkt in einen A. tumefaciens- oder A. rhizogenes-Stamm elektroporiert werden, der dazu verwendet wird, Wirtspflanzenzellen zu infizieren und transformieren (Main, GD et al., 1995 Methods Mol. Biol. 44; 405–412). Alternativ kann die DNA durch Elektroporation oder eine PEG-vermittelte Aufnahme in Protoplasten der Empfängerpflanzenspezies eingeführt werden (Bilang et al., (1994) Plant Mol. Biol Manual, Kluwer Academic Publishers, Al: 1–16) oder durch Partikelbeschuss der Zellen oder Gewebe (Christou, ibid. A2; 1–15). Falls notwendig können die Antibiotika-Marker in der T-DNA-Region eliminiert werden, solange die Selektion für das Merkmal möglich ist, so dass die Pflanzenendprodukte keine Antibiotika-Gene enthalten.
Stabil transformierte Gesamtzellen, die sich das Merkmal aneignen, werden auf festen oder flüssigen Medien, die das Agens enthalten, gegenüber welchem die eingeführte DNA eine Resistenz oder Toleranz verleiht, ausgewählt. Wenn das in Frage stehende Merkmal nicht direkt ausgewählt werden kann, können die transformierten Zellen mit Antibiotika selektiert werden, und es ihnen anschließend ermöglicht werden, einen Kallus zu bilden, oder aber sie werden zu ganzen Pflanzen regeneriert, und anschließend hinsichtlich der gewünschten Eigenschaft gescreent.
Der zweite und die weiteren Zyklen bestehen aus der Isolierung der genomischen DNA aus jeder transgenen Linie und der Einführung dieser in eine oder mehrere der anderen transgenen Linien. Bei jeder Runde werden die transformierten Zellen selektiert oder hinsichtlich einer schrittweisen Verbesserung gescreent. Um das Verfahren zur Verwendung vielfacher Transformationszyklen zu beschleunigen, kann von einer Pflanzenregeneration bis zur letzten Runde abgesehen werden. Das Kallus-Gewebe, das sich aus dem Protoplasten oder aus transformierten Geweben gebildet hat, kann als Quelle genomischer DNA und neuer Wirtszellen dienen. Nach der letzten Runde werden fruchtbare Pflanzen regeneriert und die Nachkommenschaft hinsichtlich Homozygosität der insertierten DNAs selektiert. Schlussendlich wird eine neue Pflanze generiert, die vielfache Inserts trägt, die sich additiv oder synergistisch dahingehend kombinieren, dass sie hohe Level der gewünschten Eigenschaft verleihen. Alternativ können Mikrosporen als Homozygote isoliert werden, die aus spontanen Diploiden generiert wurden.
Darüber hinaus kann die eingeführte DNA, die das gewünschte Merkmal verleiht, nachverfolgt werden, da es in dem Vektor von bekannten Sequenzen flankiert ist. Entweder PCR oder eine Plasmid-Isolierung wird dazu eingesetzt, die Sequenzen zu isolieren, und sie detaillierter zu charakterisieren. Eine lange PCR (Foord, OS und Rose, EA, 1995, PCR Primer: A Laboratory Manual, CSHL Press, Seiten 63–77) des gesamten 25 bis 40 kb-Inserts wird mit geeigneten Reagenzien und Techniken erreicht, unter Verwendung der T-DNA-Grenzsequenzen als Primer. Wenn der Vektor dahingehend modifiziert ist, dass er den Replikationsursprung von E. coli und einen antibiotischen Marker zwischen den T-DNA-Grenzen enthält, wird ein seltenes Restriktionsenzym, wie bspw. NotI oder SfiI, die lediglich an den Enden der insertierten DNA schneiden, verwendet, um Fragmente zu bilden, die die Quellpflanzen-DNA enthalten, welche anschließend ligiert und in E. coli transformiert wird, wo sie sich als Plasmide replizieren. Die Gesamt-DNA oder Subfragmente davon, die für das hinzugefügte Merkmal verantwortlich sind, kann einer in vitro-Entwicklung durch DNA-Shuffling unterzogen werden. Die geshuffelte Bibliothek kann reiterativ durch irgendein hierin beschriebenes Verfahren rekombiniert und anschließend in Wirtspflanzenzellen eingeführt werden, und anschließend hinsichtlich der Verbesserung des Merkmals gescreent werden. Auf diese Weise können einzelne und Multigen-Eigenschaften von einer Spezies auf die andere übertragen und hinsichtlich einer höheren Expression oder Aktivität optimiert werden, was zu einer Verbesserung des gesamten Organismus führt. Dieses ganze Verfahren kann auch reiterativ wiederholt werden.
Alternativ können die Zellen transformierte Mikrosporen sein, wobei die regenerierten haploiden Pflanzen direkt hinsichtlich der verbesserten Merkmale, wie nachstehend beschrieben, gescreent werden.
E. MIKROSPOREN-MANIPULIERUNG
Mikrosporen sind haploide (1n) männliche Sporen, die sich in Pollenkörnern entwickeln. Antheren enthalten eine große Anzahl von Mikrosporen in den früh-einkernigen bis zu den ersten-Mitose Stadien. Mikrosporen konnten erfolgreich zur Entwicklung in Pflanzen hinsichtlich der meisten Spezies eingeführt werden, wie bspw. Reis (Chen, CC, 1977, In Vitro, 13: 484–489), Tabak (Atanassov, I. et al., 1998, Plant Mol. Biol. 38: 1169–1178), Tradescantia (Savage JRK und Papworth DG, 1998, Mutat. Res. 422: 313–322), Arabidopsis (Park SK et al., 1998, Development 125: 3789–3799), Zuckerrübe (Majewska-Sawka A. und Rodrigues-Garcia MI, 1996, J. Cell. Sci. 109: 859–866), Gerste (Olsen FL, 1991, Hereditas 115: 255–266) und Ölsamenraps (Boutillier KA et al., 1994, Plant Mol. Biol. 26: 1711–1723).
Die Pflanzen, die von Mikrosporen abstammen, sind hauptsächlich haploid oder diploid (unregelmäßig polyploid und aneuploid). Die diploiden Pflanzen sind homozygot und fruchtbar und können in relativ kurzer Zeit hergestellt werden. Die Mikrosporen, die aus F1-Hybridpflanzen gewonnen wurden, repräsentieren eine große Diversität, weshalb sie ein ausgezeichnetes Modell zur Untersuchung der Rekombination darstellen. Darüber hinaus können Mikrosporen mit T-DNA transformiert werden, welche über Agrobacterium oder andere verfügbare Mittel eingeführt wird, und anschließend in individuelle Pflanzen regeneriert werden. Darüber hinaus können aus Mikrosporen Protoplasten gebildet werden, die auf ähnliche Weise fusioniert werden können, wie es bei Pflanzen und Bakterien vollzogen wird.
Auf Grund ihrer komplexen Ploidie und ihrer Fähigkeit zur Regeneration stellen Mikrosporen ein Werkzeug für das Pflanzen-Gesamtgenom-Shuffling dar. Wenn bspw. Pollen aus vier Elternteilen gesammelt und vereinigt werden, und anschließend dazu eingesetzt werden, die Elternteile zufällig zu bestäuben, sollten die Nachkommen 2⁴ = 16 mögliche Kombinationen aufweisen. Unter der Annahme, dass diese Pflanze 7 Chromosomen hat, werden Mikrosporen, die aus den 16 Nachkommenschaften gesammelt wurden, 2⁷ × 16 = 2048 mögliche chromosomale Kombinationen darstellen. Diese Anzahl ist sogar größer, wenn eine Meiose auftritt. Wenn die Mikrosporen diploid sind, werden homozygote Embryonen aus diesen Mikrosporen hergestellt, was in vielen Fällen der Fall ist, und sie werden anschließend hinsichtlich der gewünschten Phänotypen gescreent, bspw. hinsichtlich einer Herbizid- oder Krankheitsresistenz. Darüber hinaus können diese Embryos zu Pflanzenölzusammensetzungen in zwei Hälften aufgeteilt werden: eine für die Analyse und die andere für die Regeneration in eine lebensfähige Pflanze.
Protoplasten, die aus Mikrosporen (insbesondere die haploiden) hergestellt werden, werden vereinigt und fusioniert. Mikrosporen, die aus Pflanzen gewonnen werden, die durch Protoplastenfusion hergestellt wurden, werden vereinigt und wieder fusioniert, wodurch die genetische Diversität der resultierenden Mikrosporen erhöht wird.
Die Mikrosporen können auf verschiedenen Arten einer Mutagenese unterzogen werden, wie bspw. durch chemische Mutagenese, Strahlen-induzierte Mutagenese und bspw. tDNA-Transformation, und zwar vor der Fusion oder Regeneration. Neu hergestellte Mutationen können durch die rekursiven Verfahren, die zuvor beschrieben wurden und hierin beschrieben sind, rekombiniert werden.
F. BEISPIEL: ANEIGNUNG VON SALZTOLERANZ
Wie in 21 dargestellt, wird die DNA aus einer Salz-toleranten Pflanze isoliert und dazu eingesetzt, eine genomische Bibliothek herzustellen. Aus der Empfängerspezies werden Protoplasten hergestellt, die mit der genomischen Bibliothek transformiert/transfiziert werden (bspw. durch Elektroporation, Agrobacterium, etc.). Die Zellen werden auf Medien mit einem normalen inhibitorischen Grad an NaCl ausgewählt. Lediglich die Zellen mit einer neu erlangten Salztoleranz werden in Kallus-Gewebe wachsen. Die besten Linien werden ausgewählt und aus deren vereinigter DNA werden genomische Bibliotheken hergestellt. Diese Bibliotheken werden in Protoplasten transformiert, die aus den in der ersten Runde transformierten Kalli hergestellt wurden. Wiederum werden die Zellen auf erhöhte Salzkonzentrationen selektiert. Nachdem der erwünschte Grad an Salztoleranz erreicht ist, kann das Kallus-Gewebe dahingehend induziert werden, dass ganze Pflanzen regenerieren. Die Nachkommenschaft dieser Pflanzen wird typischerweise hinsichtlich Homozygosität der Inserts analysiert, um die Stabilität des erlangten Merkmals abzusichern. An den angezeigten Schritten kann die Pflanzenregeneration oder -isolation und das Shuffling der eingeführten Gene zu dem Gesamtprotokoll hinzugefügt werden.
J. DIE ENTWICKLUNGSTECHNISCHE WICHTIGKEIT DER REKOMBINATION
Eine Stammverbesserung ist die ausgerichtete Entwicklungsförderung eines Organismus, für eine gewünschte Aufgabe „fitter" zu sein. In der Natur wird die Adaption durch sexuelle Rekombination erleichtert. Sexuelle Rekombination ermöglicht es einer Population, die genetische Diversität innerhalb der Population zu verwerten, bspw. durch Verfestigen nützlicher Mutationen und Verwerfen von schädlichen. Auf diese Weise kann die Adaption und Evolution in Sprüngen voranschreiten. In Abwesenheit eines sexuellen Zyklus müssen sich die Mitglieder einer Population unabhängig voneinander durch die aufeinander folgende Akkumulierung von Zufallsmutationen entwickeln. Viele nützliche Mutationen gehen verloren, wohingegen schädigende Mutationen akkumulieren können. Auf diese Weise wird die Adaption und Evolution langsam vollzogen, verglichen zur sexuellen Evolution.
Wie in 17 gezeigt, ist diese asexuelle Evolution ein langsamer und ineffizienter Prozess. Populationen bewegen sich eher als Individuen als als Gruppen. Eine diverse Population wird durch die Mutagenese eines einzelnen Elternteils generiert, was in eine Verteilung von fitten und unfitten Individuen resultiert. In Abwesenheit eines sexuellen Zyklus bleibt jedes Stück genetischer Information der überlebenden Population in den einzelnen Mutanten. Die Selektion der „fittesten" resultiert in viele „fitte" Individuen, die zusammen mit der nützlichen genetischen Information, die sie tragen, verworfen werden. Die asexuelle Evolution vollzieht sich als ein genetisches Ereignis zu einem Zeitpunkt und ist daher durch den intrinsischen Wert eines einzigen genetischen Ereignisses limitiert. Die sexuelle Evolution bewegt sich schneller und effizienter. Das Paaren innerhalb einer Population verfestigt die genetische Information innerhalb der Population und resultiert in nützliche Mutationen, die zusammen kombiniert werden. Das Kombinieren nützlicher genetischer Information resultiert in eine Nachkommenschaft, die bedeutend fitter als ihre Elternteile ist. Die sexuelle Evolution schreitet daher durch vielfache genetische Ereignisse viel schneller fort.
In den vielen Jahren der Pflanzen- und Tierzüchtung konnte gezeigt werden, dass die Macht des Einsatzes der sexuellen Rekombination die schnelle Entwicklung von komplexen Genomen in Richtung einer bestimmten Aufgabe bewirkt. Dieses allgemeine Prinzip wird ferner durch die Verwendung von DNA-Shuffling gezeigt, wodurch DNA-Moleküle in vitro rekombiniert werden, um die Rate der gerichteten molekularen Evolution zu beschleunigen. Die Bemühungen der Fermentierungs-Industrie, Stämme zu verbessern, beruhen auf der gerichteten Evolution von Mikroorganismen durch eine sequenzielle Zufallsmutagenese. Der Einbau der Rekombination in diesen iterativen Prozess beschleunigt das Verfahren zur Stammverbesserung bedeutend, was wiederum die Profitabilität der laufenden Fermentations-Verfahren steigert und die Entwicklung neuer Produkte erleichtert.
K. DNA-SHUFFLING GEGENÜBER NATÜRLICHER REKOMBINATION – DIE NÜTZLICHKEIT EINER POOL-WEISEN REKOMBINATION
DNA-Shuffling schließt die rekursive Rekombination von DNA-Sequenzen mit ein. Ein bedeutender Unterschied zwischen dem DNA-Shuffling und der natürlichen sexuellen Rekombination liegt darin, dass durch das DNA-Shuffling DNA-Sequenzen produziert werden können, die von vielen verschiedenen Elternteil-Sequenzen herrühren, wohingegen bei der sexuellen Rekombination DNA-Sequenzen produziert werden, die lediglich von zwei Elternteil-Sequenzen herrühren (25).
Wie in 25 gezeigt, ist die Evolutionsrate teilweise durch die Anzahl der nützlichen Mutationen limitiert, die ein Mitglied einer Population zwischen den Selektionsereignissen akkumulieren kann. Bei der sequenziellen Zufallsmutagenese werden nützliche Mutationen jeweils einmal pro Selektionsereignis akkumuliert. Viele nützliche Mutationen werden pro Zyklus zugunsten des besten Produzenten verworfen und neutrale oder schädliche Mutationen, die überleben, sind genau so schwer loszuwerden, wie sie erlangt wurden, und akkumulieren daher. Bei der sexuellen Evolution ermöglicht es die paarweise Rekombination, dass sich Mutationen aus zwei unterschiedlichen Elternteilen aufspalten und in unterschiedliche Kombinationen rekombinieren. Nützliche Mutationen können akkumulieren und schädliche Mutationen können verloren gehen. Die pool-weise Rekombination, wie sie bspw. durch DNA-Shuffling bewirkt wird, hat die gleichen Vorteile wie paarweise Rekombination, jedoch ermöglicht es das DNA-Shuffling, Mutationen von vielen Elternteilen in eine einzige Nachkommenschaft zu verfestigen. Daher stellt die pool-weise Rekombination ein Mittel zur Steigerung der Anzahl von nützlichen Mutationen bereit, die bei jedem Selektionsereignis akkumulieren können. Das Diagramm in 25 zeigt eine Darstellung der möglichen Anzahl von Mutationen, die ein Individuum durch jedes dieser Verfahren akkumulieren kann. Die Rekombination ist exponentiell höher gegenüber der sequenziellen Zufallsmutagenese, und dieser Vorteil erhöht sich exponentiell mit der Anzahl der Elternteile, die rekombinieren können. Die sexuelle Rekombination ist daher konservativer. In der Natur kann die paarweise Eigenschaft der sexuellen Rekombination eine wichtige Stabilität innerhalb der Population beitragen, und zwar durch Verhindern großer Veränderungen in der DNA-Sequenz, die aus einer pool-weisen Rekombination herrühren können. Für die Zwecke der gerichteten Evolution ist jedoch die pool-weise Rekombination effizienter.
Die mögliche Diversität, die aus einer Population hergestellt werden kann, ist ausgehend von der pool-weisen Rekombination größer im Vergleich zu derjenigen, die von der paarweisen Rekombination ausgeht. Darüber hinaus ermöglicht es die pool-weise Rekombination, viele verschiedene vorteilhafte Mutationen zu kombinieren, die von vielen verschiedenen Elternteil-Sequenzen herrühren.
Um die Wichtigkeit der pool-weisen Rekombination gegenüber der paarweisen Rekombination bei der Herstellung einer molekularen Diversität zu zeigen, wird das Züchten von zehn unabhängigen DNA-Sequenzen in Betracht gezogen, von denen jede lediglich eine einzigartige Mutation aufweist. Es gibt 2¹⁰ = 1024 unterschiedliche Kombinationen dieser zehn Mutationen, die von einer einzelnen Sequenz mit keinen Mutationen (die Consen sussequenz) bis zu einer Sequenz reichen, die alle zehn Mutation trägt. Wenn dieser Pool durch paarweise Rekombination zusammen rekombiniert werden würde, würde eine Population, die die Consensussequenz enthält, die Elternteile und die 45 unterschiedlichen Kombinationen jeder zwei der Mutationen, in 56 oder ca. 5% der möglichen 1024 Mutanten-Kombinationen resultieren. Alternativ, wenn der Pool auf eine pool-weise Art und Weise miteinander rekombiniert wird, würden theoretisch alle 1024 generiert werden, was zu einem ungefähr 20-fachen Anstieg in der Bibliotheks-Diversität führt. Wenn man nach einer einzigartigen Lösung für ein Problem in der molekularen Evolution sucht, wird die Bibliothek um so komplexer, je komplexer die mögliche Lösung ist. Tatsächlich enthält das fitteste Mitglied oder eine geshuffelte Bibliothek oftmals mehrere Mutationen, die aus mehreren unabhängigen Startsequenzen herrühren.
1. DNA-Shuffling sorgt für eine rekursive paarweise Rekombination
Das in vitro-DNA-Shuffling resultiert in der effizienten Produktion von kombinatorischen genetischen Bibliotheken, und zwar durch das Katalysieren der Rekombination vieler verschiedener DNA-Sequenzen. Während das Ergebnis des DNA-Shufflings eine Population ist, die die pool-weise Rekombination vieler verschiedener Sequenzen darstellt, beruht das Verfahren nicht auf der Simultanrekombination vieler verschiedener DNA-Sequenzen, sondern vielmehr auf deren rekursiver paarweiser Rekombination. Der Aufbau kompletter Gene aus einem gemischten Pool kleiner Genfragmente macht vielfache neue Ausrichtungs- und Verlängerungszyklen notwendig, die thermalen Zyklen der primerlosen PCR-Reaktion. Während jedes thermalen Zyklus rich ten sich viele Fragmentpaare wieder aus und werden verlängert, um eine kombinatorische Population von größeren chimären DNA-Fragmenten zu bilden. Nach dem ersten Zyklus des Wiederaufbaus enthalten chimäre Fragmente Sequenzen, die aus hauptsächlich zwei unterschiedlichen Elternteile-Genen herrühren, mit allen möglichen Paaren der „Elternteile"-Sequenz, die theoretisch vorliegen. Dies ist zu dem Ergebnis eines einzelnen sexuellen Zyklus innerhalb einer Population ähnlich. Während des zweiten Zyklus richten sich diese chimären Fragmente wieder miteinander aus oder mit anderen kleinen Fragmenten, was in Chimären resultiert, die von bis zu vier der unterschiedlichen Ausgangssequenzen herrührt, wiederum mit allen möglichen Kombinationen der vier Elternteile-Sequenzen, die theoretisch vorliegen. Dieser zweite Zyklus ist zu der gesamten Population analog, die aus einer einzelnen sexuellen Kreuzung herrührt, also einer Inzucht.
Weitere Zyklen resultieren in Chimären, die aus 8, 16, 32 etc. Elternteile-Sequenzen herrühren, und die zu weiteren Inzuchten der vorhergehenden Population analog sind. Dies könnte als ähnlich zu der Diversität betrachtet werden, die aus einer kleinen Population von Vögeln entsteht, die isoliert auf einer Insel leben, und die miteinander über viele Generationen hinweg brüten. Das Ergebnis ahmt die Ausbeute der „pool-weisen" Rekombination nach, jedoch verläuft der Weg über die rekursive paarweise Rekombination. Aus diesem Grund sind die DNA-Moleküle, die aus einem in vitro-DNA-Shuffling hergestellt wurden, nicht die „Nachkommenschaft" der Ausgangs-„Elternteile"-Sequenzen, sondern vielmehr die Groß-, Groß-, Groß-, Groß_n-, ... (n = Anzahl der thermalen Zyklen) Groß-Nachkommenschaft der Ausgangs-„Vorläufer"-Moleküle.
L. FERMENTIERUNG
Die Fermentierung von Mikroorganismen zur Herstellung von Naturprodukten ist die älteste und ausgeklügeltste Anwendung der Biokatalyse. Industrielle Mikroorganismen bewirken die stufenweise Umwandlung erneuerbarer Rohstoffe zu hochwertigen chemischen Produkten in einem einzelnen Reaktor und katalysieren auf diese Weise eine Multi-Milliarden-Dollar-Industrie. Fermentationsprodukte liegen im Bereich von feinen und Handelschemikalien, wie bspw. Ethanol, Milchsäure, Aminosäuren und Vitamine, bis zu hochwertigen kleinen Molekül-Pharmazeutika, Protein-Pharmazeutika und industriellen Enzymen. (Siehe bspw. McCoy (1998) C & EN 13–19 hinsichtlich einer Einführung in die Biokatalyse).
Der Erfolg, diese Produkte auf den Markt zu bringen, und der Erfolg, im Markt konkurrenzfähig zu sein, hängt von der ständigen Verbesserung der Gesamtzell-Biokatalysatoren ab. Verbesserungen schließen eine erhöhte Ausbeute des erwünschten Produktes mit ein, ferner die Entfernung ungewollter Ko-Metaboliten, eine verbesserte Verwendung von günstigen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, sowie die Adaption an Fermenter-Bedingungen, eine erhöhte Produktion eines Primär-Metaboliten, eine erhöhte Produktion eines Sekundär-Metaboliten, eine erhöhte Toleranz gegenüber sauren Bedingungen, eine erhöhte Toleranz gegenüber basischen Bedingungen, eine erhöhte Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln, eine erhöhte Toleranz gegenüber hohen Salz-Bedingungen und eine erhöhte Toleranz gegenüber hohen oder niedrigen Temperaturen. Fehler in einem dieser Gebiete können in hohe Produktionskosten resultieren, in die Unmöglichkeit, den Marktanteil zu halten oder einzunehmen, und in das Versagen, versprechende Produkte auf den Markt zu bringen. Aus diesen Gründen investiert die Fermentierungs-Industrie bedeutende finanzielle und personelle Ressourcen in die Verbesserung der Produktionsstämme.
Gegenwärtige Strategien zur Stammverbesserung beruhen auf der empirischen und iterativen Modifizierung von Fermenter-Bedingungen und der genetischen Manipulation des produzierenden Organismus. Während Fortschritte in der Molekularbiologie etablierter industrieller Organismen gemacht wurden, ist eine vernünftige Stoffwechseltechnik informationsintensiv und nicht auf weniger charakterisierte industrielle Stämme anwendbar. Die am meisten verbreitete Strategie zur Stammverbesserung setzt eine Zufallsmutagenese des produzierenden Stammes ein und ein Screening nach Mutanten mit verbesserten Eigenschaften. Bei reifen Stämmen, zumindest bei denjenigen, die vielen Verbesserungsrunden unterzogen wurden, sorgen diese Bemühungen gewöhnlich für einen 10%igen Anstieg im Produkttiter pro Jahr. Auch wenn diese klassische Strategie effektiv ist, so ist sie dennoch langsam, aufwändig und teuer. Technologische Fortschritte in diesem Gebiet zielen auf eine Automatisierung ab und auf eine Erhöhung des Durchsatzes des Proben-Screenings, mit der Hoffnung, dass die Kosten der Stammverbesserung reduziert werden. Die wirklichen technischen Grenzen liegen jedoch in der intrinsischen Limitierung einzelner Mutationen, eine bedeutende Stammverbesserung zu bewirken. Die hierin beschriebenen Verfahren überwinden diese Limitierung und sorgen für einen Zugang zu vielen verschiedenen nützlichen Mutationen pro Zyklus, die dazu eingesetzt werden können, Automatisierungstechnologien zu ergänzen und Verfahren zur Stammverbesserung zu katalysieren.
Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen es, dass Biokatalysatoren schneller verbessert werden können als mit herkömmlichen Verfahren. Das Gesamtgenom-Shuffling kann die Rate der Stammverbesserung bei Mikroorganismen, die bei Fermentationen verwendet werden, im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren mindestens verdoppeln. Dadurch können die Kosten der Fermentationsverfahren relativ gesenkt werden. Neue Produkte können zügiger auf den Markt gebracht werden, Hersteller können ihre Gewinne ebenso wie die Marktanteile steigern, und den Verbrauchern werden mehr Produkte von höherer Qualität und zu niedrigeren Preisen bereitgestellt. Darüber hinaus führt eine erhöhte Effizienz der Produktionsverfahren zu einer geringeren Abfallproduktion und zur sparsameren Verwendung der Ressourcen. Das Gesamtgenom-Shuffling stellt Mittel bereit, viele verschiedene nützliche Mutationen pro Zyklus zu akkumulieren, und eliminiert daher die inhärente Limitierung der gegenwärtigen Stammverbesserungs-Programme (SIPs).
Das DNA-Shuffling stellt eine rekursive Mutagenese, Rekombination und Selektion von DNA-Sequenzen bereit. Ein wesentlicher Unterschied zwischen einer DNA-Shuffling-vermittelten Rekombination und einer natürlichen sexuellen Rekombination liegt darin, dass das DNA-Shuffling sowohl die paarweise (zwei Elternteile) und die pool-weise (viele verschiedene Elternteile) Rekombination von Elternteile-Molekülen bewirkt, wie weiter oben beschrieben wurde. Die natürliche Rekombination ist konservativer und auf die paarweise Rekombination beschränkt. In der Natur sorgt die paarweise Rekombination für eine Stabilität innerhalb einer Population, und zwar durch das Verhindern großer Sprünge in den Sequenzen oder in der Genomstruktur, die aus einer pool-weisen Rekombination herrühren können. Für die Zwecke der gerichteten Evolution bietet sich jedoch die pool-weise Rekombination an, da vorteilhafte Mutationen vieler verschiedener Elternteile während einer einzigen Kreuzung kombiniert werden können, um eine bessere Nachkommenschaft zu produzieren. Die pool-weise Rekombination ist analog zu der Kreuzzüchtung von Inzucht-Stämmen bei der klassischen Stammverbesserung, mit der Ausnahme, dass Kreuzungen zwischen vielen Stämmen auf einmal auftreten. Im Wesentlichen ist die pool-weise Rekombination eine Folge von Ereignissen, die die Rekombination einer Population von Nucleinsäuresequenzen bewirkt, was in der Generierung neuer Nucleinsäuren resultiert, die eine genetische Information von mehr als zwei der ursprünglichen Nucleinsäuren enthalten. Das Potenzial des in vitro-DNA-Shufflings liegt darin, dass große kombinatorische Bibliotheken aus einem kleinen Pool von DNA-Fragmenten hergestellt werden können, die durch rekursive paarweise Ausrichtungs- und Verlängerungsreaktionen, „Paarungen", wieder zusammengebaut werden. Viele der bekannten in vivo-Kombinationsformate (wie bspw. Plasmid-Plasmid, Plasmid-Chromosom, Phage-Phage, Phage-Chromosom, Phage-Plasmid, konjugale DNA-Chromosom, exogene DNA-Chromosom, Chromosom-Chromosom, wobei die DNA in die Zelle durch natürliche und nicht-natürliche Kompetenz eingeführt wird, Transduktion, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, etc.) resultieren hauptsächlich in der paarweisen Rekombination von zwei DNA-Molekülen. Wenn diese Formate daher für lediglich einen einzelnen Rekombinationszyklus ausgeführt werden, sind sie inhärent in ihrem Potenzial, eine molekulare Diversität zu generieren, beschränkt. Um den Grad der Diversität zu generieren, die durch in vitro-DNA-Shuffling-Verfahren erhalten werden kann, müssen Formate zur paarweisen Paarung rekursiv ausgeführt werden, d.h. über viele Generationen hinweg, und zwar bevor nach verbesserten Sequenzen gescreent wird. Daher muss ein Pool von DNA-Sequenzen, wie bspw. vier unabhängige Chromosomen, rekombiniert werden, bspw. durch Protoplastenfusion, und die Nachkommenschaft dieser Rekombination (von denen jede eine einzigartige Nachkommenschaft der paarweisen Paarung darstellt) muss anschließend vereint werden, und zwar ohne Selektion, und anschließend wieder und wieder und wieder rekombiniert werden. Dieses Verfahren sollte für eine hinreichende Anzahl von Zyklen wiederholt werden, um in eine Nachkommenschaft zu resultieren, die die erwünschte Komplexität aufweist. Nur wenn die hinreichende Diversität generiert worden ist, sollte die resultierende Population hinsichtlich neuer und verbesserter Sequenzen gescreent werden.
Es gibt einige wenige Verfahren zur Durchführung einer effizienten Rekombination in Prokaryonten. Bakterien besitzen einen bekannten sexuellen Zyklus per se, jedoch existieren natürliche Mechanismen, mit welchen die Genome dieser Organismen einer Kombination unterzogen werden. Diese Mechanismen schließen die natürliche Kompetenz, eine Phagen-vermittelte Transduktion und eine Zell-Zell-Konjugation mit ein. Bakterien, die natürlich kompetent sind, sind dazu in der Lage, effektiv nackte DNA aus der Umgebung aufzunehmen. Wenn diese DNA homolog ist, wird sie einer Rekombination mit dem Genom der Zelle unterzogen, was zu einem genetischen Austausch führt. Bacillus subtilis, der primäre Produktionsorganismus der Enzymindustrie, ist für seine Effizienz, mit welcher er diesen Prozess durchführt, bekannt.
Bei der verallgemeinerten Transduktion vermittelt ein Bacteriophage einen genetischen Austausch. Ein transduzierender Phage wird oftmals seinen Kopf mit dem Wirtsgenom auffüllen. Dieser Phage kann einen neuen Wirt infizieren und ein Fragment des vorherigen Wirtsgenoms liefern, das häufig über eine homologe Rekombination integriert wird. Durch Konjugation können Zellen die DNA auch selber zwischen sich austauschen. Zellen, die die geeigneten Paarungsfaktoren enthalten, übertragen Episome, genauso wie gesamte Chromosomen, an eine geeignete Empfängerzelle, wo es mit dem Empfängergenom rekombinieren kann. Die Konjugation erinnert an die sexuelle Rekombination bei Mikroben und kann intraspezifisch, interspezifisch und intergenetisch sein. So ist bspw. ein effizientes Mittel zur Transformierung von Streptomyces sp., der ein Genus darstellt, das für die Produktion vieler kommerzieller Antibiotika verantwortlich ist, der konjugale Transfer der Plasmide von Escherichia coli.
Hinsichtlich vieler industrieller Mikroorganismen fehlt das Wissen über die Kompetenz, über die Phagentransduktion oder über Fertilitätsfaktoren. Als Alternative zu diesen natürlichen Rekombinationsverfahren wurde die Protoplastenfusion als vielseitige und allgemeine Alternative entwickelt. Die Protoplasten werden durch Entfernen der Zellwand durch eine Behandlung der Zellen mit lytischen Enzymen in Gegenwart von osmotischen Stabilisatoren hergestellt. In Gegenwart eines fusogenen Agens, wie bspw. Polyethylenglykol (PEG) werden die Protoplasten dahingehend induziert, dass sie fusionieren und transiente Hybride oder „Fusionanten" bilden. Während dieses Hybrid-Stadiums tritt die genetische Rekombination mit höherer Frequenz auf, wodurch es den Genomen ermöglicht wird, sich neu zu sortieren. Der letzte wesentliche Schritt ist die erfolgreiche Auftrennung und Regenerierung von lebensfähigen Zellen aus den fusionierten Protoplasten. Die Protoplastenfusion kann intraspezifisch, interspezifisch und intergenetisch sein, und ist sowohl bei Prokaryonten als auch bei Eukaryonten angewandt worden. Darüber hinaus ist es möglich, mehr als zwei Zellen zu fusionieren, wodurch ein Mechanismus bereitgestellt wird, mit dem die pool-weise Rekombination bewirkt werden kann. Während für die Protoplastenfusion keine Fertilitätsfaktoren, transduzierende Phagen oder eine Kompetenzentwicklung notwendig sind, wird ein Verfahren für die Bildung, Fusionierung und Regenerierung der Protoplasten typischerweise für jeden Organismus optimiert. Die Protoplastenfusion, wie sie für die pool-weise Rekombination angewandt wird, ist weiter oben detaillierter beschrieben.
Ein Schlüssel für die SIP ist es, ein Assay zu besitzen, das jeweils in Abhängigkeit davon verwendet werden kann, dass wenige Mutanten aus tausenden identifiziert werden sollen, welche einen leichten Anstieg in der Produktionsausbeute besitzen. Der limitierende Faktor bei vielen Assayformaten ist die Einheitlichkeit des Zellwachstums. Diese Variation ist die Quelle der grundlegenden Variabilität in den nachfolgenden Assays. Die Größe der Beimpfung und die Kulturumgebung (Temperatur/Feuchtigkeit) sind Quellen einer Wachstumsvariation. Eine Automatisierung aller Aspekte der Etablierung der Anfangskulturen und Inkubatoren mit kontrollierter, bekannter Temperatur und Feuchtigkeit, sind für die Reduzierung der Variabilität nützlich.
Mutierte Zellen oder Sporen werden auf festem Medium getrennt, um einzelne sporulierende Kolonien zu bilden. Unter Verwendung eines automatisierten Kolonien-Pickers (Q-bot, Genetics, UK) werden die Kolonien identifiziert, gepickt und 96-Well-Microtiterplatten werden mit 10000 unterschiedlichen Mutanten in beimpft, welche zwei 3 mm-Glasbälle/Well enthalten. Der Q-bot pickt nicht die gesamte Kolonie, sondern führt vielmehr eine Nadel durch die Mitte der Kolonie ein und führt diese wieder mit einer kleinen Probe an Zellen (oder an Myzel) und Sporen heraus. Die Zeit, die die Nadel in der Kolonie eingeführt ist, die Anzahl der Dips für das Beimpfen des Kulturmediums und die Zeit, innerhalb derer die Nadel in diesem Medium ist, beeinflussen jeweils die Größe des Impfmaterials und können jeweils kontrolliert und optimiert werden. Der einheitliche Prozess des Q-bot senkt Fehler, die durch menschliches Handhaben auftreten können, und steigert die Rate, mit der Kulturen etabliert werden (ungefähr 10000/4 Stunden). Diese Kulturen werden anschließend in einem temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Inkubator geschüttelt. Die Glaskügelchen dienen dazu, für eine einheitliche Belüftung der Zellen zu sorgen, und für eine Verteilung der Myzel-Fragmente, ähnlich zu den Klingen eines Fermenters. Ein Beispiel dieses Verfahrens ist in 28 näher dargestellt, einschließlich einem integrierten System für das Assay.
1. Vorscreening
Die Fähigkeit, einen leichten Anstieg in dem Leistungsvermögen einer Mutante gegenüber demjenigen eines Elternstammes zu detektieren, beruht auf der Sensitivität des Assays. Die Chance, die Organismen zu finden, die eine Verbesserung besitzen, wird durch die Anzahl der individuellen Mutanten erhöht, die durch das Assay gescreent werden können. Um die Chancen, einen Pool mit hinreichender Größe zu identifizieren, zu erhöhen, kann ein Vorscreening eingesetzt werden, mit wel chem die Anzahl der prozessierten Mutanten um ein Zehnfaches erhöht wird. Das Ziel des primären Screenings wird es sein, schnell Mutanten mit gleichen oder besseren Produktionstitern als die Elternstämme zu identifizieren, und lediglich diese Mutanten in eine flüssige Zellkultur zu überführen.
Das primäre Screening, ein Agarplatten-Screening, wird durch den Q-bot-Kolonienpicker analysiert. Obwohl die Assays grundlegend unterschiedlich sein können, resultieren viele bspw. in der Produktion von Koloniehöfen. So wird bspw. die Antibiotikaproduktion auf Platten beurteilt, und zwar unter Verwendung einer Auflage eines empfindlichen Indikator-Stammes, wie bspw. B. subtilis. Die Antibiotikaproduktion wird typischerweise als eine geklärte Zone (inhibiertes Wachstum des Indikator-Organismus) um den produzierenden Organismus kontrolliert. Auf ähnliche Weise kann die Enzymproduktion auf Platten untersucht werden, die das Enzymsubstrat enthalten, wobei die Aktivität als eine Zone der Substratmodifizierung um die produzierende Kolonie herum detektiert wird. Der Produkttiter steht mit dem Verhältnis des Gebietes des Hofes zu dem Gebiet der Kolonie in Verbindung.
Der Q-bot oder ein anderes automatisiertes System wird derart programmiert, dass er lediglich Kolonien mit einem Hofverhältnis in den oberen 10% der Population pickt, d.h. 10.000 Mutanten aus den 100.000, die für das Platten-Vorscreening erfasst wurden. Dadurch kann die Anzahl an verbesserten Klonen in den sekundären Assays erhöht werden und der verschwendete Aufwand, Knock-out- und Niedrig-Produzenten zu screenen, beseitigt werden. Dies verbessert die „Trefferrate" des sekundären Assays.
M. UNTERSTÜTZUNG DES GENETISCHEN AUSTAUSCHS
1. Allgemein
Die Verfahren gemäß der Erfindung bewirken eine Rekombination zellulärer DNA durch das Vermehren von Zellen unter Bedingungen, unter denen der Austausch von DNA zwischen Zellen induziert wird. Der DNA-Austausch wird durch Protoplastenfusion gefördert.
Bei einigen Verfahren wird die anfängliche Diversität zwischen den Zellen (d.h. vor dem Genom-Austausch) durch eine chemische oder strahleninduzierte Mutagenese eines Vorläuferzelltyps induziert, wahlweise gefolgt von einem Screening nach einem gewünschten Phänotyp. Bei anderen Verfahren ist die Diversität natürlich, und zwar dort, wo die Zellen aus unterschiedlichen Individuen, Stämmen oder Spezies gewonnen wurden.
Bei einigen Shuffling-Verfahren wird der induzierte Austausch von DNA als einziges Mittel zur Bewirkung der Rekombination in jedem Rekombinationszyklus verwendet. Bei anderen Verfahren wird der induzierte Austausch in Kombination mit der natürlichen sexuellen Rekombination eines Organismus kombiniert. Bei anderen Verfahren werden der induzierte Austausch und/oder die natürliche sexuelle Rekombination in Kombination mit der Einführung einer Fragment-Bibliothek verwendet. Eine solche Fragment-Bibliothek kann ein Gesamtgenom, ein Gesamtchromosom, eine Gruppe funktionell oder genetisch verbundener Gene, ein Plasmid, ein Cosmid, ein mitochondriales Genom, ein virales Genom (replikativ oder nicht-replikativ) oder spezifische oder Zufallsfragmente von jedem dieser sein. Die DNA kann an einen Vektor verbunden sein, oder kann in freier Form vorliegen. Einige Vektoren enthalten Sequenzen, die die homologe oder nicht-homologe Rekombination mit dem Wirtsgenom fördern. Einige Fragmente enthalten doppelsträngige Brüche, wie bspw. solche, die durch Scheren mit Glaskügelchen, Ultraschallbehandlung oder chemische oder enzymatische Fragmentierung verursacht wurden, um die Rekombination zu stimulieren.
In jedem Fall die DNA zwischen den Zellen ausgetauscht werden, wonach sie zur Bildung von Hybrid-Genomen eine Rekombination eingehen kann. Im Allgemeinen werden die Zellen einer rekursiven Rekombination unterzogen, um die Diversität der Population vor dem Screenen zu steigern. Zellen, die Hybrid-Genome tragen und die nach mehreren Rekombinationszyklen generiert wurden, werden hinsichtlich des erwünschten Phänotyps gescreent, und Zellen, die diesen Phänotyp besitzen, werden isoliert. Diese Zellen können darüber hinaus das Ausgangsmaterial für weitere Rekombinationszyklen in einem rekursiven Rekombinations-/Selektionsschema bilden.
Ein Mittel zur Förderung des Austauschs von DNA zwischen Zellen ist die Fusion von Zellen, wie bspw. die Protoplastenfusion. Ein Protoplast resultiert aus der Entfernung von der Zellwand einer Zelle, wodurch eine Membran-gebundene Zelle zurückgelassen wird, die zur Aufrechterhaltung ihrer Integrität von einem isotonen oder hypertonen Medium abhängt. Wenn die Zellwand teilweise entfernt wird, wird die resultierende Zelle strikt als Sphaeroplast bezeichnet, und wenn sie vollständig entfernt wird, als Protoplast. Nichtsdestotrotz schließt vorliegend der Ausdruck Protoplast Sphaeroplasten mit ein, außer wenn anderweitig angezeigt.
Die Protoplastenfusion ist durch Shaffner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163 (1980) beschrieben, und andere beispielhafte Verfahren sind von Yoakum et al., US 4,608,339 , Takahashi et al., US 4,677,066 und Sambrooke et al., in Kapitel 16, beschrieben. Die Protoplastenfusion wurde auch zwischen Stämmen, Spezies und Genera (bspw. Hefe und Hühnererythrocyten) beschrieben.
Protoplasten können sowohl für bakterielle als auch für eukaryontische Zellen, einschließlich Pflanzenzellen, durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, einschließlich einer chemischen Behandlung, um die Zellwände abzustreifen. Zellwände können bspw. durch einen Verdau mit einem Zellwandabbauenden Enzym, wie bspw. Lysozym, in einem 10–20% Saccharose und 50 mM EDTA enthaltenden Puffer entfernt werden. Die Umwandlung von Zellen in sphaerische Protoplasten kann mittels einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet werden. Protoplasten können auch durch die Vermehrung von Zellen in Medien hergestellt werden, die mit einem Inhibitor der Zellwandsynthese ergänzt sind, oder aber durch Verwendung von mutierten Stämmen, denen die Fähigkeit zur Zellwandbildung fehlt. Eukaryontische Zellen werden vorzugsweise in der G1-Phase durch einen Arrest mit Inhibitoren, wie bspw. dem α-Faktor, dem K. lactis-Killertoxin, Leflonamid und Adenylatcyclase-Inhibitoren synchronisiert. Wahlweise können einige, jedoch nicht alle, zu fusionierenden Protoplasten getötet werden und/oder deren DNA kann durch eine Behandlung mit Ultraviolett-Strahlung, Hydroxylamin oder Cupferon behandelt werden (Reeves et al., FEMS Microbiol. Lett., 99, 193–198 (1992)). In diesem Fall werden die getöteten Protoplasten als Donoren bezeichnet und lebensfähige Protoplasten als Akzeptoren. Die Verwendung von toten Donor-Zellen kann bei der nachfolgenden Erkennung von fusionierten Zellen mit Hybrid-Genomen vorteilhaft sein, wie nachstehend beschrieben wird. Darüber hinaus ist das Aufbrechen der DNA in Donorzellen zur Stimulierung der Rekombination mit Akzeptor-DNA von Vorteil. Wahlweise können die Akzeptor- und/oder fusionierten Zellen auch kurz, jedoch nicht letal, einer UV-Strahlung ausgesetzt werden, um die Rekombination weiter zu stimulieren.
Sind die Protoplasten einmal gebildet, können sie in einer Vielzahl von Osmolyten und Verbindungen, wie bspw. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Sucrose, Sorbit in Gegenwart von DTT stabilisiert werden. Die Kombination aus Puffer, pH-Wert, reduzierendem Agens und osmotischem Stabilisator kann hinsichtlich unterschiedlichen Zelltypen optimiert werden. Protoplasten können durch die Behandlung mit einem chemischen Agens, wie bspw. PEG, Calciumchlorid oder Calciumpropionat oder Elektrofusion zur Fusion induziert werden (Tsoneva, Acta Microbiologica Bulgaria 24, 53–59 (1989)). Ein Verfahren der Zellfusion, bei welchem elektrische Felder eingesetzt werden, ist auch beschrieben worden. Siehe Chang, US 4,970,154 . Die Bedingungen können für unterschiedliche Stämme optimiert werden.
Die fusionierten Zellen sind Heterokaryen, die Genome aus zwei oder mehreren Protoplasten enthalten. Die fusionierten Zellen können aus unfusionierten parenteralen Zellen durch eine Sucrosegradientensedimentierung oder durch Zellsortieren angereichert werden. Die zwei Nuclei in den Heterokaryen können fusionieren (Karyogamie) und zwischen den Genomen kann eine homologe Rekombination auftreten. Die Chromosomen können sich auch asymmetrisch aufteilen, was zu regenerierten Protoplasten führt, die ganze Chromosomen verloren oder gewonnen haben. Die Rekombinationsfrequenz kann durch eine Behandlung mit Ultraviolettstrahlung oder durch Verwendung von Stämmen gesteigert werden, die recA oder andere Rekombinationsgene überexprimieren, oder durch die Hefe-rad-Gene und verwandte Varianten davon in anderen Spezies, oder durch die Inhibierung der Gen-Produkte von MutS, MutI oder MutD. Die Überexpression kann entweder das Ergebnis der Einführung exogener Rekombinationsgene oder das Ergebnis der Selektion von Stämmen sein, die, als ein Ergebnis einer natürlichen Variation oder induzierten Mutation, endogene Rekombinationsgene überexprimieren. Die fusionierten Protoplasten werden unter Bedingungen vermehrt, die die Regeneration der Zellwände, eine Rekombination und die Auftrennung rekombinanter Genome in Nachkommenschafts-Zellen aus dem Heterokaryon sowie die Expression rekombinanter Gene ermöglichen. Dieser Prozess wird reiterativ wiederholt, um die Diversität jedes Sets an Protoplasten oder Zellen zu steigern. Nach oder wahlweise vor oder während der Gewinnung der fusionierten Zellen werden die Zellen gescreent oder hinsichtlich ihrer Entwicklung in Richtung einer gewünschten Eigenschaft selektiert.
Anschließend kann eine nachfolgende Rekombinationsrunde durchgeführt werden, und zwar durch Herstellen von Protoplasten aus den Zellen, die die Selektion/das Screening in einer vorherigen Runde überleben. Die Protoplasten werden fusioniert, die Rekombination findet in fusionierten Protoplasten statt, und Zellen werden aus den fusionierten Protoplasten wieder gewonnen. Dieses Verfahren kann wiederum reiterativ wiederholt werden, um die Diversität der Ausgangspopulation zu steigern. Die Protoplasten, die regenerierten oder regenerie renden Zellen werden einer weiteren Selektion oder einem Screening unterzogen.
Nachfolgende Rekombinationsrunden können auf Basis eines aufgeteilten Pools, wie oben beschrieben, durchgeführt werden. Dies bedeutet, dass eine erste Subpopulation an Zellen, die das Screening/die Selektion aus einer vorherigen Runde überlebt haben, für die Protoplastenbildung verwendet wird. Eine zweite Subpopulation an Zellen, die die Selektion/das Screening aus einer vorherigen Runde überlebt hat, wird als Quelle für die DNA-Bibliothek-Herstellung verwendet. Die DNA-Bibliothek aus der zweiten Subpopulation von Zellen wird anschließend in die Protoplasten aus der ersten Subpopulation transformiert. Die Bibliothek rekombiniert mit den Genomen der Protoplasten, wodurch rekombinante Genome gebildet werden. Dieses Verfahren kann mehrere Male in Abwesenheit eines Selektions-Ereignisses wiederholt werden, um die Diversität der Zellpopulation zu steigern. Die Zellen werden aus Protoplasten regeneriert, und eine Selektion/ein Screening wird hinsichtlich regenerierender oder regenerierter Zellen angewandt. In einer weiteren Variation wird eine frische Bibliothek an Nucleinsäurefragmenten in Protoplasten eingeführt, welche die Selektion/das Screening aus einer vorherigen Runde überlebt haben.
Ein beispielhaftes Format für das Shuffling unter Verwendung einer Protoplastenfusion ist in 5 gezeigt. Die Figur zeigt die folgenden Schritte: Protoplastenbildung der Donor- und Empfängerstämme, Heterokaryonbildung, Karyogamie, Rekombination und Aufteilung der rekombinanten Genome in einzelne Zellen. Wahlweise können die rekombinanten Genome, wenn ein sexueller Zyklus vorliegt, einer weiteren Rekombination miteinander unterzogen werden, was ein Ergebnis der Meiose und der Paarung darstellt. Die rekursiven Zyklen der Protoplastenfusion oder das rekursive Paaren/die Meiose wird oftmals zur Steigerung der Diversität einer Zellpopulation eingesetzt. Nach Erreichen einer hinreichend diversen Population durch eine dieser Rekombinationsformen werden die Zellen gescreent oder hinsichtlich einer erwünschten Eigenschaft selektiert. Die Zellen, die die Selektion/das Screening überleben, können anschließend als Ausgangsmaterialien in einem weiteren Zyklus der Protoplastenbildung oder anderen Rekombinationsverfahren, wie hierin beschrieben, verwendet werden.
2. Auswahl hinsichtlich hybrider Stämme
Die Erfindung kann in Verbindung mit Selektionsstrategien verwendet werden, um Zellen zu identifizieren, die sich durch die Fusion von Komponenten aus parenteralen Zellen aus zwei oder mehreren bestimmten Subpopulationen gebildet haben. Die Selektion hinsichtlich hybriden Zellen wird gewöhnlicherweise vor der Selektion oder dem Screenen hinsichtlich Zellen durchgeführt, die sich dahingehend entwickelt haben (als ein Ergebnis des genetischen Austausches), dass sie eine gewünschte Eigenschaft erlangt haben. Eine grundlegende Voraussetzung der meisten solcher Selektions-Schemata ist es, dass zwei anfängliche Subpopulationen zwei bestimmte Marker aufweisen. Zellen mit Hybrid-Genomen können daher durch die Selektion hinsichtlich beider Marker identifiziert werden.
Bei einem solchen Schema trägt zumindest eine Subpopulation an Zellen einen selektiven Marker, der an seine Zellmembran angeheftet ist. Beispiele für geeignete Membranmarker schließen Biotin, Fluorescein und Rhodamin mit ein. Die Marker können an Amid- oder Thiol-Gruppen oder durch eine spezifischere Derivatisierungs-Chemie verbunden sein, wie bspw. Jod-Acetate, Jod-Acetamide, Maleimide. Ein Marker kann bspw. wie folgt beschrieben angeheftet werden. Zellen oder Protoplasten werden mit einem Puffer (bspw. PBS) gewaschen, der mit der chemischen Anheftung eines chemisch aktiven Liganden, der mit den Aminogruppen der Lysine oder den N-terminalen Aminogruppen der Membranproteine reagiert, nicht wechselwirkt. Der Ligand ist entweder selber ein Amin-Reaktiv (bspw. Isothiocyanate, Succinimidylester, Sulfonylchloride) oder wird durch einen heterobifunktionalen Linker (bspw. EMCS, SIAB, SPDP, SMB) aktiviert, um ein Amin-Reaktiv zu werden. Der Ligand ist ein Molekül, das von Protein-abgeleiteten magnetischen Kügelchen oder anderen festen Träger-Fängern einfach gebunden wird. Der Ligand kann bspw. Succinimidyl-aktiviertes Biotin sein (Molecular Probes Inc.: B-1606, B-2603, S-1515, S-1582). Der Linker wird mit Aminogruppen von Proteinen reagiert, die in und auf der Oberfläche einer Zellen liegen. Die Zellen werden anschließend gewaschen, um das überschüssige Markierungs-Agens zu entfernen, bevor sie mit Zellen aus der zweiten Subpopulation in Kontakt gebracht werden, welche einen zweiten Selektionsmarker tragen.
Die zweite Subpopulation an Zellen kann ebenfalls einen Membranmarker tragen, gleichwohl einen Marker, der sich von demjenigen der ersten Subpopulation unterscheidet. Alternativ kann die zweite Subpopulation einen genetischen Marker tragen. Der genetische Marker kann eine bestimmte Eigenschaft, wie bspw. eine Arzneimittelresistenz oder eine Eigenschaft, nach der gescreent werden kann, verleihen, wie bspw. die Expression des „green fluorescent protein".
Nach Fusion der ersten und zweiten Zell-Subpopulationen und der Wiedergewinnung werden die Zellen gescreent oder hinsichtlich des Vorliegens der Marker auf beiden parenteralen Subpopulationen selektiert. So werden bspw. fusionierte Zellen durch Adsorption an spezifische Kügelchen hinsichtlich einer Population angereichert und anschließend durch FACS hinsichtlich derjenigen sortiert, die einen Marker exprimieren. Zellen, die beide Screening Vorgänge für beide Marker überleben, sind diejenigen, die eine Protoplastenfusion durchlaufen haben, und besitzen deshalb eher rekombinierte Genome. Gewöhnlicherweise werden die Marker getrennt voneinander gescreent oder selektiert. Membrangebundene Marker, wie bspw. Biotin, können durch Affinitätsanreicherung hinsichtlich der Zellmembranmarker gescreent werden, bspw. durch Anbringen fusionierter Zellen an eine Affinitätsmatrix. So können bspw. hinsichtlich eines Biotin-Membranmarkers Zellen unter Verwendung der Streptavidinbeschichteten magnetischen Kügelchen (Dynal) Affinitäts-gereinigt werden. Diese Kügelchen werden mehrere Male gewaschen, um die nicht-fusionierten Wirtszellen zu entfernen. Alternativ können die Zellen gegen einen Antikörper gereinigt werden, der gegen den Membranmarker gerichtet ist. In einer weiteren Variation – wenn der Membranmarker fluoresziert – können die Zellen, die den Marker tragen, durch FRCS identifiziert werden. Screening-Verfahren hinsichtlich genetischer Marker hängen von der Natur der Marker ab, und schließen die Fähigkeit mit ein, auf mit Arzneimittel behandelten Medien zu wachsen, sowie das FACS-Auswahlverfahren hinsichtlich des grün fluoreszierenden Proteins. Wenn die ersten und die zweiten Zellpopulationen fluoreszierende Marker mit unterschiedlichen Wellenlängen besitzen, können beide Marker simultan durch FACS-Sortieren gescreent werden.
Bei einem weiteren Selektionsschema hinsichtlich Hybridzellen exprimieren erste und zweite Populationen an Zellen, die fusioniert werden sollen, unterschiedliche Einheiten eines heteromultimeren Enzyms. Gewöhnlicherweise besitzt das heteromultimere Enzym zwei unterschiedliche Untereinheiten, jedoch können auch heteromultimere Enzyme mit drei, vier oder mehreren unterschiedlichen Untereinheiten verwendet werden. Wenn ein Enzym mehr als zwei unterschiedliche Untereinheiten besitzt, kann jede Untereinheit in einer unterschiedlichen Zell-Subpopulation exprimiert werden (bspw. drei Untereinheiten in drei Subpopulationen), oder mehr als eine Untereinheit kann in der gleichen Subpopulation von Zellen exprimiert werden (bspw. eine Untereinheit in einer Subpopulation, zwei Untereinheiten in einer zweiten Subpopulation). In dem Fall, dass mehr als zwei Untereinheiten verwendet werden, kann eine Selektion hinsichtlich der pool-weisen Rekombination von mehr als zwei Protoplasten erreicht werden.
Hybridzellen, welche eine Kombination aus Genomen von ersten, zweiten oder mehreren Subpopulations-Zellen darstellen, können durch ein Assay für das intakte Enzym identifiziert werden. Solch ein Assay kann ein Bindungsassay sein, ist jedoch typischerweise eher ein funktionelles Assay (bspw. die Fähigkeit, ein Substrat des Enzyms zu verstoffwechseln). Die enzymatische Aktivität kann bspw. die Prozessierung eines Substrats in ein Produkt detektiert werden, und zwar mit einem fluoreszierenden oder anderweitig leicht detektierbaren Absorptions- oder Emissionsspektrum. Die einzelnen Untereinheiten eines heteromultimeren Enzyms, die in einem solchen Assay verwendet werden, besitzen vorzugsweise keine enzymatische Aktivität in dissoziierter Form, oder besitzen zumindest eine bedeutend niedrigere Aktivität in dissoziierter Form als in assoziierter Form. In Zellen, die für die Fusion verwendet wurden, fehlt vorzugsweise eine endogene Form des heteromultimeren Enzyms, oder aber dieses besitzt zumindest eine bedeutend niedrigere endogene Aktivität als diejenige, die von dem heteromultimeren Enzym herrührt, welches durch die Fusion der Zellen gebildet wurde.
Penicillinacylaseenzyme, die Cephalosporinacylase und Penicillinacyltransferase sind Beispiele geeigneter heteromultimerer Enzyme. Diese Enzyme werden von einem einzigen Gen kodiert, welches als Proenzym translatiert und durch posttranslationelle autokatalytische Proteolyse gespalten wird, wodurch ein Spacer-Endopeptid entfernt und zwei Untereinheiten gebildet werden, welche sich zur Bildung des aktiven heterodimeren Enzyms assoziieren. Keine der Untereinheiten ist in Abwesenheit der anderen Untereinheit aktiv. Jedoch kann die Aktivität wieder hergestellt werden, wenn die getrennten Gen-Abschnitte in der gleichen Zelle durch Ko-Transformation exprimiert werden. Andere Enzyme, die verwendet werden können, besitzen Untereinheiten, die durch bestimmte Gene kodiert werden (so kodieren bspw. die faoA- und faoB-Gene, die 3-Oxoacyl-CoA-thiolase von Pseudomonas fragi (Biochem. J. 328, 815–820 (1997)).
Ein beispielhaftes Enzym ist die Penicillin-G-Acylase von Escherichia coli, welche zwei Untereinheiten besitzt, die durch ein einzelnes Gen kodiert werden. Fragmente des Gens, welches für die zwei Untereinheiten kodiert, die operativ an geeignete Expressions-Regulationssequenzen gebunden sind, werden in erste und zweite Zell-Subpopulationen transfiziert, welchen die endogene Penicillin-Acylaseaktivität fehlt. Eine Zelle, die durch Fusion von Zellen aus der ersten und der zweiten Subpopulation gebildet wird, exprimiert die zwei Untereinheiten, die sich zur Bildung des funktionellen Enzyms, bspw. der Penicillinacylase, zusammensetzen. Die fusionierten Zellen können anschließend auf Agar-Platten selektioniert werden, die Penicillin-G enthalten, welches durch Penicillinacylase abgebaut wird.
Bei einer anderen Variation werden die fusionierten Zellen durch die Komplementierung auxotropher Mutanten identifiziert. Die Eltern-Subpopulationen der Zellen können hinsichtlich bekannter auxotropher Mutationen selektiert werden. Alternativ können auxotrophe Mutationen in einer Ausgangspopulation von Zellen spontan dadurch generiert werden, dass sie einem mutagenen Agens ausgesetzt werden. Zellen mit auxotrophen Mutationen werden durch Replika-Plating auf minimalem und vollständigem Medium selektiert. Läsionen, die zu einer Auxotrophie führen, werden erwartungsgemäß auf das Genom verteilt sein, insbesondere in Genen für Aminosäuren-, Nucleotid- und Vitamin-Biosynthesewege. Nach der Fusion der Elternzellen können die Zellen, die aus der Fusion resultieren, durch deren Fähigkeit, auf minimalem Medium zu wachsen, identifiziert werden. Diese Zellen können anschließend hinsichtlich der Entwicklung in Richtung einer gewünschten Eigenschaft gescreent oder selektiert werden. Weitere Schritte einer Mutagenese, durch welche neue auxotrophe Mutationen generiert werden, können in nachfolgende Rekombinations- und Screening/Selektionszyklen eingebaut werden.
Bei Variationen des oben beschriebenen Verfahrens kann die de novo-Bildung von auxotrophen Mutationen bei jeder Shuffling-Runde durch die Wiederverwendung der gleichen Auxotrophen vermieden werden. So können bspw. Auxotrophe durch eine Transposon-Mutagenese unter Verwendung eines Transposons generiert werden, welches einen Selektionsmarker trägt. Auxotrophe werden durch einen Screen, wie bspw. Replika-Plating, identifiziert. Die Auxotrophen werden gepoolt, und ein allgemeines transduzierendes Phagenlysat wird durch Wachstum eines Phagen auf einer Population von auxotrophen Zellen hergestellt. Eine getrennte Population von auxotrophen Zellen wird einem genetischen Austausch unterzogen, und die Komplementierung wird dazu eingesetzt, um Zellen zu selektieren, welche einen genetischen Austausch und eine Rekombination vollzogen haben. Diese Zellen werden anschließend hinsichtlich der Erlangung einer erwünschten Eigenschaft gescreent oder selektiert. Die Zellen, die das Screening oder die Selektion überleben, besitzen dann die auxotrophen Marker, welche durch Einführen der transduzierenden Transposon-Bibliothek regeneriert wurden. Die neu generierten auxotrophen Zellen können anschließend einem weiteren genetischen Austausch und einem weiteren Screening/Auswahl unterzogen werden.
Bei einer weiteren Variation werden auxotrophe Mutationen durch eine homologe Rekombination mit einem Ziel-Vektor hergestellt, welcher einen Selektionsmarker aufweist, der von Regionen flankiert ist, die mit einer Biosyntheseregion des Genoms der Zellen homolog ist, die entwickelt werden sollen. Die Rekombination zwischen dem Vektor und dem Genom schleust den positiven Selektionsmarker in das Genom ein, wodurch eine auxotrophe Mutation erzeugt wird. Der Vektor liegt vor der Einführung in die Zellen in linearer Form vor. Wahlweise kann die Einführungs-Sequenz des Vektors dadurch erhöht werden, dass dessen Enden mit Selbst-Komplementaritäts-Oligonucleotiden versehen werden, die in einer Haarnadelformation ausgerichtet sind. Der genetische Austausch und das Screening/die Selektion wird wie oben beschrieben weiter fortgeführt. Bei jeder Runde werden Ziel-Vektoren wieder eingeführt, wodurch die gleiche Population an auxotrophen Markern regeneriert wird.
Bei einer anderen Variation werden die fusionierten Zellen durch Screenen nach einem genomischen Marker identifiziert, der in einer Subpopulation der Elternzellen vorliegt, und nach einem episomalen Marker, der auf einer zweiten Subpopulation von Zellen vorliegt. So kann bspw. eine erste Hefe-Subpopulation, die Mitochondrien enthält, eingesetzt werden, um eine zweite Subpopulation von Hefe zu komplementieren, die einen kleinen Phänotyp aufweist (d.h., der Mitochondrien fehlen).
Bei einer weiteren Variation wird der genetische Austausch zwischen zwei Zell-Subpopulationen durchgeführt, von denen eine tot ist. Die Zellen werden vorzugsweise dadurch getötet, dass sie kurz DNA-fragmentierenden Reagenzien ausgesetzt werden, wie bspw. Hydroxylamin, Cupferon oder einer Bestrahlung. Lebensfähige Zellen werden anschließend hinsichtlich eines Markers gescreent, der auf der toten Eltern-Subpopulation vorliegt.
3. Liposomen-vermittelte Transfers
In den oben beschriebenen Verfahren, bei welchen Nucleinsäurefragment-Bibliotheken in Protoplasten eingeführt werden, sind die Nucleinsäuren manchmal in Liposomen eingekapselt, um die Aufnahme durch Protoplasten zu erleichtern. Die Liposomen-vermittelte Aufnahme von DNA durch Protoplasten ist in Redford et al., Mol. Gen. Genet. 184, 567–569 (1981) beschrieben. Die Liposomen können effizient große DNA-Volumen an Protoplasten liefern (siehe Deshayes et al., EMBO J. 4, 2731–2737 (1985)). Siehe auch Philippot und Schuber (Eds.) (1995) Liposomes as Tools in Basic Research and Industrv CRC press, Boca Raton, bspw. Kapitel 9, Remy et al., "Gene Transfer with Cationic Amphiphiles". Darüber hinaus kann die DNA als lineare Fragmente geliefert werden, die oftmals besser rekombinieren als Gesamtgenome. Bei einigen Verfahren werden die Fragmente vor der Einkapselung in Liposomen mutiert. Bei einigen Verfahren werden Fragmente mit RecA und dessen Homologen, oder Nucleasen (bspw. Restriktionsendonucleasen) vor der Einkapselung in Liposomen kombiniert, um die Rekombination zu fördern. Alternativ können Protoplasten mit letalen Dosen an aufbrechenden Reagenzien behandelt werden, und anschließend fusioniert werden. Die Zellen, die überleben, sind diejenigen, die durch Rekombination mit anderen genomischen Fragmenten repariert werden, wodurch ein Selektionsmechanismus bereitgestellt wird, mit welchem nach rekombinanten (und daher erwünscht diversen) Protoplasten selektiert werden kann.
4. Shuffling filamentöser Pilze
Filamentöse Pilze sind zur Durchführung der oben beschriebenen Shuffling-Verfahren besonders geeignet. Filamentöse Pilze werden in vier Hauptklassifizierungen eingeteilt, die auf deren Strukturen hinsichtlich der sexuellen Reproduktion basieren: Phycomyceten, Ascomyceten, Basidiomyceten und die Fungi imperfecti. Phycomyceten (bspw. Rhizopus, Mucor) bilden sexuel le Sporen im Sporangium. Die Sporen können einen oder viele Kerne aufweisen, und besitzen oftmals keine septierte Hyphen (coenocytisch). Ascomyceten (bspw. Aspergillus, Neurospora, Penicillium) produzieren sexuelle Sporen in einem Ascus als Ergebnis einer meiotischen Teilung. Die Asci enthalten typischerweise 4 Meioseprodukte, jedoch enthalten einige 8 als Ergebnis einer zusätzlichen mitotischen Teilung. Basidiomyceten schließen Ständerpilze und Brandpilze mit ein, und bilden sexuelle Sporen auf der Oberfläche eines Basidiums. Bei den Holobasidiomyceten, wie bspw. den Ständerpilzen, ist das Basidium ungeteilt. Bei den Hemibasidiomyceten, wie bspw. bei den Rostpilzen (Uredinales) und den Brandpilzen (Ustilaginales) ist das Basidium aufgeteilt. Die Fungi imperfecti, die die meisten menschlichen Pathogene mit einschließen, besitzen kein bekanntes sexuelles Stadium.
Pilze können sich asexuell, sexuell oder parasexuell reproduzieren. Die asexuelle Reproduktion schließt das vegetative Wachstum des Myzels, eine Kernteilung und die Zellteilung ohne Beteiligung der Gameten und ohne Kernfusion mit ein. Die Zellteilung kann durch Sporenbildung, Knospung oder durch Fragmentation der Hyphen geschehen.
Die sexuelle Reproduktion stellt einen Mechanismus dar, mit dem genetisches Material zwischen Zellen neu kombiniert werden kann. Ein sexueller Reproduktionszyklus ist durch das Abwechseln einer haploiden Phase mit einer diploiden Phase gekennzeichnet. Eine Diploidie tritt ein, wenn zwei haploide Gametenkerne fusionieren (Karyogamie). Die Gametenkerne können aus dem gleichen Elternstamm (selbstfertil) stammen, wie bspw. bei den homothallischen Pilzen. Bei den heterothallischen Pil zen stammen die Elternstämme aus Stämmen unterschiedlicher Paarungstypen.
Eine diploide Zelle wandelt sich durch Meiose in einen haploiden Typ um, welche im Wesentlichen aus zwei Kernteilungen besteht, was von einer Teilung der Chromosomen begleitet ist. Die Produkte der Meiose sind eine Tetrade (4 haploide Nuclei). Bei einigen Fällen tritt eine mitotische Teilung nach der Meiose auf, wodurch acht Produktzellen entstehen. Die Anordnung der resultierenden Zellen (gewöhnlich in Sporen eingeschlossen) erinnert an diejenige der Elternstämme. Die Länge der haploiden und diploiden Stadien unterscheidet sich bei den unterschiedlichen Pilzen: so besitzen die Basiliomyceten und viele der Ascomyceten einen überwiegend haploiden Lebenszyklus (dies bedeutet, dass die Meiose sofort nach der Karyogamie auftritt), wohingegen andere (bspw. Saccharomyces cerevisiae) weitgehend in ihrem Lebenszyklus diploid sind (die Karyogamie tritt bald nach der Meiose auf). Die sexuelle Reproduktion kann zwischen den Zellen im gleichem Stamm (selbst) oder zwischen Zellen aus unterschiedlichen Stämmen (auskreuzen) auftreten.
Ein sexueller Dimorphismus (Diözismus) ist die getrennte Produktion männlicher und weiblicher Organe auf unterschiedlichen Myzelien. Unter den Pilzen ist dies ein seltenes Phänomen, obwohl doch einige wenige Beispiele bekannt sind. Der Heterothallismus (ein Locus-zwei Allele) ermöglicht ein Auskreuzen zwischen Kreuzungs-kompatiblen Stämmen, die selbstinkompatibel sind. Die einfachste Form ist das zwei Allel-ein Locus-System der Paarungstypen/-faktoren, was durch die folgenden Organismen dargestellt wird:
A und a in Neurospora; a und α in Saccharomyces; plus und minus in Schizosaccharomyces und Zygomycetes; a₁ und a₂ in Ustilago.
Ein multipler-allelomorpher Heterothallismus zeigt sich bei einigen der höheren Basidiomyceten (bspw. bei Gasteromycetes und Hymenomycetes), die heterothallisch sind und mehrere Paarungstypen besitzen, was durch verschiedene Allele bestimmt wird. Der Heterothallismus in diesen Organismen ist entweder bipolar mit einem Paarungstypfaktor, oder aber tetrapolar mit zwei unverbundenen Faktoren, A und B. Eine stabile, fruchtbare Heterokaryon-Bildung hängt von der Gegenwart unterschiedlicher A-Faktoren ab, und, im Falle der tetrapolaren Organismen, auch von unterschiedlichen B-Faktoren. Dieses System ist bei der Förderung der Auszüchtung und dem Verhindern des Selbst-Züchtens effektiv. Die Anzahl unterschiedlicher Paarungsfaktoren kann sehr groß sein (bspw. Tausende) (Kothe, FEMS Microbiol. Rev. 18, 65–87 (1996)), und nicht-parenterale Paarungsfaktoren können durch Rekombination entstehen.
Die parasexuelle Reproduktion stellt ein weiteres Mittel bereit, mit welchem genetisches Material zwischen Zellen neu kombiniert werden kann. Dieses Verfahren ermöglicht die Rekombination parenteraler DNA, ohne die Beteiligung von Paarungstypen oder Gameten. Parasexuelle Fusion tritt durch Hyphen-Fusion auf, wodurch ein gemeinsames Cytoplasma mit unterschiedlichen Nuclei entsteht. Die beiden Nuclei können sich unabhängig voneinander im resultierenden Heterokaryon trennen, jedoch fusionieren sie gelegentlich. Auf die Fusion folgt eine Haploidisierung, bei welcher ein Verlust der Chromosomen auftreten kann, sowie ein mitotisches Crossing-over zwischen homo logen Chromosomen. Die Protoplastenfusion ist eine Form der parasexuellen Reproduktion.
Innerhalb der oben genannten vier Klassen werden die Pilze auch hinsichtlich vegetativer Kompatibilitätsgruppen klassifiziert. Pilze innerhalb einer vegetativen Kompatibilitätsgruppe können miteinander Heterokaryen bilden. Aus diesen Gründen werden für den Austausch von genetischem Material zwischen unterschiedlichen Pilzstämmen gewöhnlich Pilze aus der gleichen vegetativen Kompatibilitätsgruppe bereitgestellt. Jedoch kann ein genetischer Austausch auch zwischen Pilzen aus unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen auftreten, und zwar als Ergebnis einer parasexuellen Reproduktion (siehe Timberlake et al., US 5,605,820 ). Ferner, wie anderswo diskutiert, kann die natürliche vegetative Kompatibilitätsgruppe der Pilze als ein Ergebnis des Shufflings erweitert werden.
Mehrere Isolate von Aspergillus nidulans, A. flavus, A. fumigatus, Penicillium chrysogenum, P. notatum, Cephalosporium chrysogenum, Neurospora crassa, Aureobasidium pullulans wurden hinsichtlich ihres Karyotyps untersucht. Die Größe der Genome befindet sich bei den Aspergilli im Allgemeinen im Bereich zwischen 20 und 50 Mb. Zwischen ähnlichen Stämmen bestehen oftmals Unterschiede in den Chromosomensätzen und werden ebenso durch Transformation mit exogener DNA verursacht. Filamentöse Pilzgene enthalten Introns, gewöhnlich von ungefähr 50 bis 100 bp groß, mit ähnlichen 5'- und 3'-Consensus-Splice-Sequenzen. Promoter- und Terminationssignale sind oftmals Kreuz-erkennbar, wodurch die Expression eines Gens/eines Wegs aus einem der Pilze (bspw. A. nidulans) in einen anderen (bspw. P. chrysogenum) ermöglicht wird.
Die Hauptkomponenten der Pilzzellwände sind Chitin (oder Chitosan), β-Glucan und Mannoproteine. Chitin und β-Glucan bilden das Gerüst, wohingegen Mannoproteine interstitielle Komponenten sind, die die Porosität der Wände, die Antigenizität und die Adhäsion vorgeben. Die Chitinsynthetase katalysiert die Polymerisierung von β-(1,4)-verbundenem N-Acetylglucosamin(GIcNAc)-Resten, wodurch lineare Stränge gebildet werden, die antiparallel zueinander verlaufen; die β-(1,3)-Glucansynthetase katalysiert die Homopolymerisierung von Glucose.
Ein allgemeines Ziel des Shuffling ist es, Pilze dahingehend weiterzuentwickeln, dass sie zu brauchbaren Wirten für genetische Konstruktionen werden, insbesondere für das Shuffling unverwandter Gene. A. nidulans und neurospora sind im Allgemeinen die Pilzorganismen der Wahl, die als Wirte solcher Manipulationen dienen, gerade auf Grund ihrer sexuellen Zyklen und auf Grund ihrer gut erforschten Verwendung in der klassischen und der molekularen Genetik. Ein anderes Ziel ist es, die Fähigkeit der Pilze dahingehend zu verbessern, spezifische Verbindungen zu produzieren (wie bspw. antibakterielle Verbindungen (Penicilline, Cephalosporine), Anti-Pilzverbindungen (wie bspw. Echinocandine, Aureobasidine) und Holz-abbauende Enzyme). Unter diesen allgemeinen Zielen gibt es gewisse Überschneidungen, so dass einige der erwünschten Eigenschaften zur Erlangung beider Ziele nützlich sind.
Eine erwünschte Eigenschaft ist die Einführung eines Meiose-Apparats in Pilze, denen gegenwärtig ein sexueller Zyklus fehlt (siehe Sharon et al., Mol. Gen. Genet. 251, 60–68 (1996)). Ein Schema zur Einführung eines sexuellen Zyklus in den Pilz P. chrysogenum (ein Mitglied der Fungi imperfecti) ist in 6 gezeigt. Protoplasten-Subpopulationen werden aus A. nidulans (der einen sexuellen Zyklus besitzt) gebildet, sowie aus P. chrasogenum, welcher keinen sexuellen Zyklus aufweist. Die beiden Stämme tragen vorzugsweise unterschiedliche Marker. Die A. nidulans-Protoplasten werden durch Behandlung mit UV oder Hydroxylamin getötet. Die beiden Subpopulationen werden zur Bildung von Heterokaryen fusioniert. Bei einigen Heterokaryen fusionieren die Nuclei und eine gewisse Rekombination tritt auf. Die fusionierten Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, unter welchen neue Zellwände generiert werden, wonach anschließend eine sexuelle Rekombination zugelassen wird. Zellen mit rekombinanten Genomen werden anschließend selektiert (bspw. durch Auswahl hinsichtlich der Komplementierung auxotropher Marker, die auf den jeweiligen Elternstämmen vorliegen). Es ist wahrscheinlicher, dass Zellen mit Hybridgenomen die Gene erlangt haben, die für einen sexuellen Zyklus notwendig sind. Die Protoplasten der Zellen können anschließend mit getöteten Protoplasten einer weiteren Zellpopulation auf die gleiche Art und Weise gekreuzt werden, von denen bekannt ist, dass sie einen sexuellen Zyklus besitzen (den gleichen oder einen unterschiedlichen wie in der vorherigen Runde), gefolgt von einer Auswahl hinsichtlich Zellen, die Hybridgenome aufweisen.
Eine andere erwünschte Eigenschaft ist die Herstellung eines Pilz-Mutatorstammes. Ein solcher Pilz kann durch Shuffling eines Pilzstammes erzeugt werden, der ein Markergen mit einer oder mehreren Mutationen enthält, welche die Expression eines funktionellen Produktes beeinträchtigen oder verhindern. Die neu zusammengesetzten Pilze werden unter Bedingungen vermehrt, unter welchen hinsichtlich der Expression des positi ven Markers selektiert wird (wobei gleichzeitig eine kleine Menge an restlichem Wachstum ohne Expression zugelassen wird). Die neu zusammengesetzten Pilze, die am schnellsten wachsen, werden als Ausgangsmaterial für die nächste Runde des Shufflings ausgewählt.
Eine andere erwünschte Eigenschaft ist es, das Wirtsspektrum eines Pilzes derart zu erweitern, dass es mit Pilzen aus anderen vegetativen Kompatibilitätsgruppen Heterokaryen bilden kann. Eine Inkompatibilität zwischen Spezies resultiert aus den Wechselwirkungen spezifischer Allele an unterschiedlichen Inkompatibilitäts-Loci (wie bspw. die „het"-Loci). Wenn zwei Stämme einer hyphalen Anastomose unterzogen werden, kann eine letale zytoplasmatische Inkompatibilitätsreaktion auftreten, wenn sich die Stämme an diesen Loci unterscheiden. Die Stämme müssen, um vollständig kompatibel zu sein, identische Loci tragen. Mehrere dieser Loci wurden bei verschiedenen Spezies identifiziert, und der Inkompatibilitätseffekt ist in einem gewissen Maße additiv (daher kann eine „partielle Inkompatibilität" auftreten). Für diese Organismen sind einige tolerante und het-negative Mutanten beschrieben worden (bspw. Dales & Croft, J. Gen. Microbiol. 136, 1717–1724 (1990)). Darüber hinaus ist von einem Toleranzgen (tol) berichtet worden, welches die Paarungstyp-Heterokaryoninkompatibilität unterdrückt. Das Shuffling wird zwischen Protoplasten von Stämmen aus unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen durchgeführt. Bei einem bevorzugten Format wird ein lebender Empfängerstamm und ein UV-bestrahlter, toter Empfängerstamm verwendet. Die UV-Strahlung dient dazu, Mutationen in die DNA einzufügen, wodurch die het-Gene inaktiviert werden. Die zwei Stämme sollten unterschiedliche genetische Marker tragen. Die Protoplasten der Stämme wer den fusioniert, die Zellen werden regeneriert und hinsichtlich der Komplementierung der Marker gescreent. Aufeinander folgende Shuffling- und Selektionsrunden können auf die gleiche Art und Weise durchgeführt werden, indem die Zellen, die das Screening überleben, mit Protoplasten einer frischen Population an Donorzellen fusioniert werden. Ähnlich wie bei den hierin beschriebenen Verfahren werden die Zellen, die aus der Regenerierung der Protoplasten gewonnen werden, wahlweise durch erneute Protoplastenbildung refusioniert und in Zellen regeneriert, und zwar ein- oder mehrere Male vor jedem Selektionsschritt, um die Diversität der resultierenden Zellpopulation, die gescreent werden soll, zu erhöhen.
Eine andere erwünschte Eigenschaft ist die Einführung eines multiplen allelomorphen Heterothallismus in Ascomycetes und Fungi imperfectii, die diese Eigenschaft normalerweise nicht aufweisen. Dieses Paarungssystem gestattet ein Auskreuzen ohne Selbstzüchtung. Solch ein Paarungssystem kann durch Shuffling von Ascomycetes und Fungi imperfectii mit DNA aus Gasteromycetes oder Hymenomycetes eingeführt werden, welche ein solches System besitzen.
Eine andere erwünschte Eigenschaft ist die spontane Bildung von Protoplasten, um die Verwendung eines Pilzstammes als Shuffling-Wirt zu erleichtern. Daher wird der zu entwickelnde Pilz typischerweise mutagenisiert. Die Sporen des Pilzes, der entwickelt werden soll, werden kurz mit einem Zellwand-abbauenden Agens für einen Zeitraum behandelt, der für eine vollständige Protoplastenbildung nicht ausreicht, und werden mit Protoplasten von anderen Pilzstämmen gemischt. Protoplasten, die sich durch Fusion der zwei unterschiedlichen Subpopulationen bilden, werden durch genetisches oder anderes Screening/Auswählen wie oben beschrieben identifiziert. Diese Protoplasten werden zur Regenerierung des Myzels und anschließend der Sporen verwendet, welche das Ausgangsmaterial für die nächste Shuffling-Runde bilden. In der nächsten Runde werden zumindest einige der überlebenden Sporen mit einem Zellwandentfernenden Enzym behandelt, jedoch über einen kürzeren Zeitraum als in der vorherigen Runde. Nach der Behandlung werden die zum Teil von den Zellwänden befreiten Zellen mit einem ersten Marker markiert. Diese Zellen werden anschließend mit Protoplasten gemischt, die von anderen Zellen abstammen können, die die Selektion in einer vorherigen Runde überlebt haben, oder aus einem frischen Pilzstamm. Diese Protoplasten sind mit einem zweiten Marker physikalisch markiert. Nach Inkubation der Zellen unter Bedingungen für die Protoplastenfusion werden die fusionierten Zellen mit beiden Markern selektiert. Diese fusionierten Zellen werden zur Bildung von Myzel und Sporen für die nächste Shuffling-Runde eingesetzt, und so weiter. Schließlich wird die Nachkommenschaft, die spontan Protoplasten bildet (d.h. ohne Hinzufügung von Zellwand-abbauenden Agenzien), identifiziert. Wie bei den anderen hierin beschriebenen Verfahren können die Zellen oder Protoplasten reiterativ fusioniert und vor der Durchführung jedes Selektionsschritts regeneriert werden, um die Diversität der resultierenden Zellen oder Protoplasten, die gescreent werden sollen, zu erhöhen. Auf ähnliche Weise können ausgewählte Zellen oder Protoplasten reiterativ fusioniert und für einen oder mehrere Zyklen regeneriert werden, ohne eine Auswahl für die resultierenden zellulären oder Protoplasten-Populationen notwendig zu machen, wodurch die Diversität der Zellen oder Protoplasten, die schließlich gescreent werden sollen, erhöht wird. Dieses Verfahren der Durch führung verschiedener Rekombinationszyklen mit zerstreut angeordneten Selektionsschritten kann wie gewünscht reiterativ wiederholt werden.
Eine andere gewünschte Eigenschaft ist die Erlangung und/oder die Verbesserung von Genen, die für Enzyme in biosynthetischen Wegen kodieren, ferner für Gene, die Transporterproteine kodieren, und Gene, die für Proteine kodieren, die bei der Stoffwechselflusskontrolle beteiligt sind. In diesem Fall können die Gene des Weges in den zu entwickelnden Pilz entweder durch genetischen Austausch mit einem anderen Pilz eingeführt werden, welcher den Weg besitzt, oder durch Einführen einer Fragment-Bibliothek aus einem Organismus, der den Weg besitzt. Das genetische Material dieser Pilze kann anschließend einem weiteren Shuffling und Screening/einer Selektion durch die in dieser Anmeldung verschieden diskutierten Verfahren unterzogen werden. Die neu zusammengesetzten Pilzstämme werden ausgewählt (gescreent) hinsichtlich der Produktion der Verbindungen, die durch den Stoffwechselweg oder Vorläufer davon produziert werden.
Eine andere erwünsche Eigenschaft ist es, die Stabilität der Pilze unter extremen Bedingungen, wie Hitze, zu erhöhen. In diesem Fall können die Gene, die zur Stabilität beitragen, durch einen DNA-Austausch oder durch Transformation einer DNA aus einem Stamm, der diese Eigenschaften bereits besitzt, erlangt werden. Alternativ kann der zu entwickelnde Stamm einer Zufallsmutagenese unterzogen werden. Das genetische Material des Pilzes, der entwickelt werden soll, kann durch jede der in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren neu zusammengesetzt werden, wobei die neu zusammengesetzten Pilze dahingehend aus gewählt werden, dass sie ein Aussetzen gegenüber extremen Bedingungen überleben.
Eine andere erwünschte Eigenschaft ist die Fähigkeit eines Pilzes, unter veränderten ernährungstechnischen Bedingungen zu wachsen (bspw. Wachstum auf besonderen Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen. Die Änderung der ernährungstechnischen Bedingungen ist insbesondere für bspw. natürliche Pilzisolate wertvoll, die wertvolle kommerzielle Produkte produzieren, die jedoch einen komplizierten und daher teuren Nährstoff bedarf besitzen. Der zu entwickelnde Stamm wird einem genetischen Austausch und/oder einer genetischen Transformation mit DNA aus einem Stamm unterzogen, der den erwünschten Nährstoffbedarf besitzt. Der zu entwickelnde Pilz kann dann wahlweise einem weiteren Shuffling unterzogen werden, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, wobei die rekombinanten Stämme hinsichtlich ihrer Fähigkeit, unter den erwünschten Nährstoffbedingungen zu wachsen, ausgewählt werden. Wahlweise können die Nährstoffbedingungen in aufeinander folgenden Shuffling-Runden variiert werden, wobei nahe von den natürlichen Bedingungen des zu entwickelnde Pilzes ausgegangen wird, und in nachfolgenden Runden dem erwünschten Nährstoffbedarf angenähert wird.
Eine weitere erwünschte Eigenschaft ist die Aneignung natürlicher Kompetenz in einem Pilz. Das Verfahren zur Aneignung natürlicher Kompetenz durch Shuffling ist im Allgemeinen beschrieben in der PCT/US97/04494. Der zu entwickelnde Pilz wird typischerweise einem genetischen Austausch oder einer genetischen Transformation mit DNA aus einem bakteriellen Stamm oder Pilzstamm unterzogen, der bereits diese Eigenschaft besitzt. Zellen mit den rekombinanten Genomen werden anschließend hinsichtlich der Fähigkeit, ein Plasmid mit einem Selektionsmarker aufzunehmen, ausgewählt. Weitere Rekombinations- und Selektionsrunden können unter Verwendung jeder der oben beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Eine weitere erwünschte Eigenschaft ist die reduzierte oder erhöhte Sekretion von Proteasen und DNase. In diesem Fall kann der zu entwickelnde Pilz DNA durch einen Austausch oder durch eine Transformation von einem anderen Stamm erhalten, von dem bekannt ist, dass er die erwünschte Eigenschaft besitzt. Alternativ kann der zu entwickelnde Pilz einer Zufallsmutagenese unterzogen werden. Der zu entwickelnde Pilz wird dabei, wie oben beschrieben, neu zusammengesetzt. Die Gegenwart eines solchen Enzyms oder der Mangel daran kann dadurch bestimmt werden, dass das Kulturmedium von einzelnen Isolaten mit einem fluoreszierenden Molekül in Verbindung gebracht wird, welches über eine Peptid- oder DNA-Bindung an einen Träger gebunden ist. Die Spaltung der Verbindung setzt die detektierbare Fluoreszenz in das Medium frei.
Eine andere erwünschte Eigenschaft ist es, Pilze mit veränderten Transportern (wie bspw. MDR) herzustellen. Solche veränderten Transporter sind bspw. bei Pilzen nützlich, die dahingehend entwickelt wurden, dass sie neue Sekundärmetabolite entwickeln, um die Aufnahme von Vorläufern in eine Zelle zu ermöglichen, die für die Synthese des neuen Sekundärmetaboliten benötigt werden, oder dass sie das Ausschleusen des Sekundärmetaboliten aus der Zelle ermöglichen. Die Transporter können durch das Einführen einer Bibliothek von Transportervarianten in Pilzzellen entwickelt werden und dadurch, dass man Zellen sexuell oder parasexuell rekombinieren lässt. Um einen Trans porter mit der Fähigkeit zu entwickeln, einen Vorläufer in Zellen zu transportieren, werden die Zellen in Gegenwart des Vorläufers vermehrt und die Zellen anschließend hinsichtlich der Produktion des Metaboliten gescreent. Um einen Transporter mit der Fähigkeit zu entwickeln, einen Metaboliten auszuschleusen, werden die Zellen unter Bedingungen vermehrt, die die Produktion des Metaboliten unterstützen und anschließend hinsichtlich des Ausschleusens des Metaboliten in das Kulturmedium gescreent.
Ein allgemeines Verfahren des Pilz-Shufflings ist in 7 gezeigt. Sporen aus einem eingefrorenen Bestand, einem lyophilisierten Bestand oder frisch von einer Agar-Platte werden zur Beimpfung eines geeigneten flüssigen Mediums eingesetzt (1). Die Sporen werden zur Keimung gebracht, was in ein Hyphen-Wachstum resultiert (2). Das Myzel wird geerntet, und durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren gewaschen. Wahlweise kann die Probe mit DTT vorbehandelt werden, um die Protoplastenbildung zu verstärken (3). Die Protoplastenbildung wird in einem osmotisch stabilisierenden Medium (bspw. 1 m NaCl/20 mM MgSo₄ pH 5,8) unter Hinzufügung eines Zellwand-abbauenden Enzyms (bspw. Novozym 234) durchgeführt (4). Das Zellwand-abbauende Enzym wird durch wiederholtes Waschen mit einer osmotisch stabilisierenden Lösung entfernt (5). Die Protoplasten können vom Myzel, dem Abfall und den Sporen durch Filtrieren über ein Miracloth-Filterpapier und durch Dichten-Zentrifugation getrennt werden (6). Die Protoplasten werden durch Zentrifugieren geerntet und zu der geeigneten Konzentration resuspendiert. Dieser Schritt kann zu einer gewissen Protoplastenfusion führen (7). Die Fusion kann durch Hinzufügen von PEG (bspw. PEG 3350) stimuliert werden, und/oder durch wiederholte Zentrifugation und Resuspension mit oder ohne PEG. Ferner kann auch eine Elektrofusion durchgeführt werden (8). Die fusionierten Protoplasten können wahlweise aus den unfusionierten Protoplasten durch Sucrose-Gradienten-Sedimentierung (oder durch andere Screening-Verfahren, wie oben beschrieben) angereichert werden. Die fusionierten Protoplasten können wahlweise mit einer UV-Strahlung behandelt werden, um die Rekombination zu stimulieren (9). Anschließend werden die Protoplasten auf osmotisch stabilisierten Agar-Platten kultiviert, um die Zellwände zu regenerieren und um Myzel zu bilden (10). Das Myzel wird dazu verwendet, um Sporen zu bilden (11), die anschließend als Ausgangsmaterial für die nächste Shuffling-Runde eingesetzt werden (12).
Die Auswahl hinsichtlich einer erwünschten Eigenschaft kann entweder auf regeneriertem Myzel oder aus Sporen, die davon abgeleitet sind, durchgeführt werden.
Bei einem alternativen Verfahren werden die Protoplasten durch Inhibierung von einem oder mehreren Enzymen gebildet, die für die Zellwandsynthese benötigt werden (siehe 8). Der Inhibitor sollte bei den Einsatzbedingungen eher fungistatisch als fungizid sein. Beispiele für Inhibitoren schließen Antipilz-Verbindungen mit ein, die (von bspw. Georgopapadakou & Walsh, Antimicrob. Ag. Chemother. 40, 279–291 (1996) oder von Lyman & Walsh, Drugs 44, 9–35 (1992)) beschrieben sind. Andere Beispiele schließen Chitinsynthaseinhibitoren (Polyoxin- oder Nikkomycin-Verbindungen) und/oder Glucansyntheseinhibitoren (bspw. Echinocandine, Papulocandine, Pneumocandine) mit ein. Die Inhibitoren sollten in einem osmotisch stabilisierten Medium eingesetzt werden. Die Zellen, die von ihren Zellwänden befreit werden, können fusioniert werden, oder an derweitig als Spender oder Wirte in genetischen Transformations-Stammentwicklungs-Programmen eingesetzt werden. Ein mögliches Schema, bei welchem dieses Verfahren reiterativ eingesetzt wird, ist in 8 schematisch dargestellt.
Bei einer weiteren Variation werden die Protoplasten unter Verwendung von Pilzstämmen hergestellt, die dahingehend genetisch defizient oder in ihrer Fähigkeit eingeschränkt sind, intakte Zellwände zu synthetisieren (siehe 9). Solche Mutanten werden im Allgemeinen als fragil, osmotisch-rehabilitierend oder zellwandlos bezeichnet, und sind bei Stamm-Hinterlegungsstellen erhältlich. Beispiele solcher Stämme schließen Neurospora crassa os-Mutanten (Selitrennikoff, Antimicrob. Agents. Chemother. 23, 757–765 (1983)) mit ein. Einige solcher Mutationen sind temperaturempfindlich. Temperaturempfindliche Stämme können zu Zwecken der Selektion und Amplifizierung bei der toleranten Temperatur vermehrt werden, und zu Zwecken der Protoplastenbildung und -fusion bei der nicht-toleranten Temperatur. Ein temperaturempfindlicher Stamm von Neurospora crassa os ist beschrieben worden, der sich als Protoplasten vermehrt, wenn man ihn in einem osmotisch stabilisierenden Medium mit Sorbose und Polyoxiden bei nicht-toleranten Temperaturen wachsen lässt, der jedoch ganze Zellen produziert, nachdem er in ein Medium überführt wird, welches Sorbit bei einer toleranten Temperatur enthält. Siehe US 4,873,196 .
Andere geeignete Stämme können durch eine gezielte Mutagenese von Genen hergestellt werden, die bei der Chitinsynthese, der Glucansynthese oder anderen Zellwand-verwandten Verfahren beteiligt sind. Beispiele solcher Gene schließen CHT1, CHT2 und CALI (oder CSD2) von Saccharomyces cerevisiae und Candida spp. mit ein (Georgopapadakou & Walsh, (1996), ETGI/FKSI/CNDI/CWH53/PB RI und deren Homologe in S. cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, ChvAINdvA Agrobacterium und Rhizobium. Andere Beispiele sind MA oder IB oder IC, MD, tsE und bimG von Aspergillus nidulans (Borgia, J. Bacteriol. 174, 377–389 (1992)). Stämme von A. nidulans, die OrlAl oder tse l-Mutationen enthalten, lysieren bei restriktiven Temperaturen. Die Lysis dieser Stämme kann durch eine osmotische Stabilisierung verhindert werden, und die Mutationen können durch das Hinzufügen von N-Acetylglucosamin (GlcNac) komplementiert werden. BimGI l-Mutationen sind ts hinsichtlich einer Typ-1-Proteinphosphatase (den Keimlinien von Stämmen, die diese Mutation tragen, fehlen Chitin und Conidien, und schwellen daher an und lysieren). Andere geeignete Gene sind chsA, chsB, chsC, chsD und chsE von Aspergillus fumigatus; chs1 und chs2 von Neurospora crassa; Phycomyces Blakesleeanus MM und chs1, 2 und 3 von S. cerevisiae. Chs1 ist ein nicht-essentielles Reparaturenzym; chs2 ist bei der Septumbildung beteiligt und chs3 ist bei der Zellwandreifung und in der Knospen-Ringbildung beteiligt.
Andere geeignete Stämme schließen S. cerevisiae CLY (Zelllyse)-Mutanten mit ein, wie bspw. ts-Stämme (Paravicini et al., Mol. Cell Biol. 12, 4896–4905 (1992)), und den CLY 15-Stamm, der eine PKC 1-Gen-Deletion trägt. Andere geeignete Stämme schließen den Stamm VY 1160 mit ein, der in srb (kodiert für Actin) eine ts-Mutation enthält (Schade et al. Acta Histochem. Suppl. 41, 193–200 (1991)), und einen Stamm mit einer ses-Mutation, welche in eine erhöhte Sensitivität gegenüber Zellwand-abbauenden Enzymen resultiert, die aus dem Schneckendarm isoliert werden (Metha & Gregory, Appl. Environ. Microbi ol. 41, 992–999 (1981)). Geeignete Stämme von C. albicans schließen diejenigen mit Mutationen in chs1, chs2 oder chs3 mit ein (die für die Chitin-Synthetasen kodieren), wie bspw. osmotisch-rehabilitierende, bedingt letale Mutanten, die von Payton & de Tiani, Curr. Genet. 17, 293–296 (1990) beschrieben wurden, C. utilis-Mutanten mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber Zellwand-abbauenden Enzymen, isoliert aus Schneckendarm (Metha & Gregory, 1981, siehe oben); und N. crassa-Mutanten os-1, os-2, os-3, os-4, os-5 und os-6. Siehe Selitrennikoff, Antimicrob. Agents Chemother. 23, 757–765 (1983). Solche Mutanten wachsen und teilen sich ohne eine Zellwand bei 37°C, jedoch produzieren sie bei 22°C eine Zellwand.
Eine zielgerichtete Mutagenese kann durch die Transformation von Zellen mit einem positiv-negativ-Selektionsvektor erreicht werden, der homologe Regionen enthält, welche ein Zielsegment flankieren, einen positiven Selektionsmarker zwischen den homologen Regionen und einen negativen Selektionsmarker außerhalb der homologen Regionen (siehe Capecchi, US 5,627,059 ). Bei einer Variation kann der negative Selektionsmarker ein Antisens-Transkript des positiven Selektionsmarkers sein (siehe US 5,527,674 ).
Andere geeignete Zellen können anschließend durch Zufalls-Mutagenese oder durch Shuffling-Verfahren in Kombination mit Selektion ausgewählt werden. So kann man bspw. eine erste Subpopulation von Zellen mutagenisieren, sie anschließend von der Mutagenese erholen lassen, sie einem unvollständigen Abbau der Zellwände unterziehen und sie mit Protoplasten einer zweiten Zell-Subpopulation in Kontakt bringen. Hybridzellen, die Marker von beiden Subpopulationen tragen, werden (wie oben beschrieben) identifiziert und als Ausgangsmaterialien in nachfolgenden Shuffling-Runden verwendet. Mit diesem Selektionsschema können sowohl Zellen selektiert werden, die eine Fähigkeit zur spontanen Protoplastenbildung besitzen, als auch Zellen, die eine verstärkte Rekombinogenizität besitzen.
Bei einer weiteren Variation können Zellen mit der Fähigkeit zur spontanen Protoplastenbildung mit Zellen gekreuzt werden, die eine verstärkte Rekombinogenizität besitzen, welche sich unter Verwendung anderer Verfahren entwickelt haben. Die Hybridzellen sind besonders geeignete Wirte für das Gesamtgenom-Shuffling.
Zellen mit Mutationen in Enzymen, die bei der Zellwandsynthese oder bei deren Aufrechterhaltung beteiligt sind, können einer Fusion einfach dadurch unterzogen werden, dass die Zellen in einer osmotisch geschützten Kultur auf Grund der Spontanprotoplastenbildung vermehrt werden. Wenn die Mutation bedingt ist, werden die Zellen in nicht-permissive Bedingungen überführt. Die Protoplastenbildung und -fusion kann durch das Hinzufügen von unterstützenden Agenzien, wie bspw. PEG oder einem elektrischen Feld beschleunigt werden (siehe Philipova & Venkov, Yeast 6, 205–212 (1990); Tsoneva et al., FEMS Microbiol. Lett. 51, 61–65 (1989)).
5. Zielgerichtetes Shuffling – „Hot Spots"
Zielgerichtete homologe Gene können in spezifische Genomregionen (bspw. durch homologe Rekombination oder andere Zielverfahren) kloniert werden, die als Rekombinations-„Hot Spots" bekannt sind (d.h. Regionen, die erhöhte Rekombinations level im Vergleich zum Durchschnitts-Rekombinationslevel zeigen, der bei einem Gesamtgenom beobachtet wird), oder von denen bekannt ist, dass sie nahe bei solchen Hot Spots liegen. Die resultierenden rekombinanten Stämme werden rekursiv gepaart. Während der meiotischen Rekombination rekombinieren homologe rekombinante Gene, wodurch die Diversität der Gene erhöht wird. Nach mehreren Rekombinationszyklen durch rekursive Paarung werden die resultierenden Zellen gescreent.
6. Shuffling-Verfahren in Hefe
Hefestämme stellen Subspezies der Pilze dar, die als einzelne Zellen wachsen. Hefen werden zur Herstellung von fermentierten Getränken und Gärstoffen eingesetzt, ferner für die Produktion von Ethanol als Kraftstoff, Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht und für die heterologe Produktion von Proteinen und Enzymen (siehe beigefügte Liste der Hefestämme und deren Verwendungen). Gewöhnlich verwendete Hefestämme schließen Saccharomyces cerevisiae, Pichia sp., Candida sp. und Schizosaccharomyces pombe mit ein.
Mehrere Typen von Vektoren sind zur Klonierung in Hefe verfügbar, einschließlich eines integrativen Plasmids (YIp), einem Hefe-replizierenden Plasmid (YRp, wie bspw. die 2 μ-kreisbasierten Vektoren), das Hefe-episomale Plasmid (YEp), das Hefe-zentromere Plasmid (YCp) oder das Hefe-künstliche Chromosom (YAC). Jeder Vektor kann Marker tragen, die zur Selektion hinsichtlich des Vorliegens des Plasmids nützlich sind, wie bspw. LUE2, URA3 und HIS3, oder aber hinsichtlich Abwesenheit des Plasmids, wie bspw. URA3 (welches ein Gen darstellt, das für Zellen toxisch ist, die in Gegenwart von 5-Fluororotsäure wachsen).
Viele Hefen besitzen einen sexuellen und mehrere asexuelle (vegetative) Zyklen. Bei dem sexuellen Zyklus ist die Rekombination des Gesamtgenoms des Organismus beteiligt, und zwar jedes Mal, wenn die Zelle durch die Meiose geht. So werden bspw. diploide Zellen, wenn diploide Zellen von S. cerevisiae Stickstoff- und Kohlenstoff-begrenzenden Bedingungen ausgesetzt werden, einer Meiose unterzogen, wodurch Asci gebildet werden. Jeder Ascus beinhaltet vier haploide Sporen, zwei vom Paarungstyp „a" und zwei vom Paarungstyp „α". Nach Überführen in ein reiches Medium paaren die haploiden Sporen des jeweils entgegengesetzten Paarungstyps, wodurch wiederum diploide Zellen gebildet werden. Anisosporen der jeweils entgegengesetzten Paarungstypen können innerhalb des Ascus paaren, oder aber – wenn der Ascus bspw. mit Zymolase abgebaut ist – es werden die haploiden Zellen freigesetzt und können mit Sporen aus anderen Asci paaren. Dieser sexuelle Zyklus sorgt für ein Format, mit welchem endogene Hefegenome und/oder exogene Fragmentbibliotheken in Hefevektoren neu zusammengesetzt werden können. Dieses Verfahren resultiert in eine Verlagerung oder Akkumulation von Hybridgenen, und in das Shuffling von homologen Sequenzen, die von paarenden Zellen geteilt werden.
Hefestämme mit Mutationen in mehreren bekannten Genen besitzen Eigenschaften, die für das Shuffling nützlich sind. Diese Eigenschaften schließen das Erhöhen der Rekombinationsfrequenz und das Erhöhen der Frequenz spontaner Mutationen innerhalb einer Zelle mit ein. Diese Eigenschaften können das Ergebnis einer Mutation einer kodierenden Sequenz oder einer geänderten Expression (gewöhnlich Überexpression) einer Wildtyp-kodierenden Sequenz sein. Die HO-Nuclease bewirkt die Transposition von HMLa/α und HMRa/α in den MAT-Locus, wodurch der Paarungstyp geändert wird. Mutanten in dem Gen, das für dieses Enzym kodiert, ändern ihren Paarungstyp nicht und können dazu eingesetzt werden, eine Kreuzung zwischen Stämmen mit definiertem Genotyp zu erzwingen, wie bspw. diejenigen, die eine Bibliothek beinhalten, oder aber die einen erwünschten Phänotyp besitzen, und können ferner dazu eingesetzt werden, die Inzucht von Ausgangsstämmen zu verhindern. PMS1, MLH1, MSH2, MSH6 sind bei der Reparatur von Fehlanpassungen beteiligt. Mutationen in diesem Genen besitzen sämtlich einen Mutator-Phänotyp (Chambers et al., Mol. Cell. Biol. 16, 6110–6120 (1996)). Mutationen in der TOP3-DNA-Topoisomerase weisen eine sechsfache Verstärkung der interchromosomalen homologen Rekombination auf (Bailis et al., Molecular and Cellular Biology 12, 4988–4993 (1992)). Die RAD50-57-Gene verleihen eine Resistenz gegenüber einer Strahlung. Rad3 wirkt bei der Entfernung von Pyrimidin-Dimeren. RAD52 wirkt bei der Genkonversion. RAD50, MRE11, XRS2 wirken sowohl bei der homologen Rekombination als auch bei der illegitimen Rekombination. HOP1, RED1 wirken bei der frühen meiotischen Rekombination (Mao-Draayer, Genetics 144, 71–86). Mutationen in entweder HOP1 oder RED1 reduzieren doppelsträngige Brüche am HIS2-Rekombinations-Hotspot. Stämme, denen diese Gene fehlen, sind zur Aufrechterhaltung der Stabilität in hyper-rekombinogenen Konstrukten nützlich, wie bspw. in Tandem-Expressionsbibliotheken, welche auf YACs getragen werden. Mutationen in HPR1 sind hyper-rekombinogen. HDF1 besitzt eine DNA-Enden-bindende Aktivität und ist bei der Reparatur von doppelsträngigen Brüchen und der V(D)J-Rekombination beteiligt. Stämme, die diese Mutation tragen, sind für die Transformation mit Zufallsgenomfragmenten mit entweder einer Protoplastenfusion oder Elektroporation geeignet. Kar-1 ist eine dominante Mutation, die eine Karyogamie verhindert. Kar-1-Mutanten sind für den direkten Transfer einzelner Chromosomen von einem Geber- zu einem Empfängerstamm geeignet. Diese Technik ist beim Transfer von YACs zwischen Stämmen weit verbreitet und ist außerdem beim Transfer von entwickelten Genen/Chromosomen in andere Organismen geeignet (Markie, YAC Protocols, (Humana Press, Totowa, NJ, 1996)). HOT1 ist ein S. cerevisiae-Rekombinations-Hotspot innerhalb der Promoter- und Enhancer-Region der rDNA-Repeat-Sequenzen. Dieser Locus induziert die mitotische Rekombination an benachbarten Sequenzen – vermutlich auf Grund seines hohen Transkriptionslevels. Gene und/oder Wege, die unter der transkriptionellen Kontrolle dieser Region eingefügt werden, sind einer erhöhten mitotischen Rekombination ausgesetzt. Die Regionen, die die arg 4- und his 4-Gene umgeben, sind ebenfalls Rekombinations-Hotspots und Gene, die in diese Regionen kloniert werden, werden mit erhöhter Wahrscheinlichkeit einer Rekombination während der Meiose unterzogen. Homologe Gene können in diese Regionen kloniert und in vivo zusammengesetzt werden, und zwar durch rekursives Paaren der rekombinanten Stämme. CDC2 kodiert für die Polymerase δ und ist für die mitotische Genkonversion notwendig. Eine Überexpression dieses Gens kann in einem zusammengesetzten oder Mutatorstamm verwendet werden. Eine temperaturempfindliche Mutation in CDC4 stoppt den Zellzyklus in G1 bei restriktiver Temperatur und könnte dazu eingesetzt werden, Protoplasten für eine optimierte Fusion und nachfolgende Rekombination zu synchronisieren.
Wie bei filamentösen Pilzen schließen die allgemeinen Ziele des Shufflings in Hefe die Verbesserung der Hefe als Wirtsorganismus für eine genetische Manipulation und als Produktionsapparat für verschiedene Verbindungen mit ein. Eine erwünschte Eigenschaft in beiden Fällen ist es, die Fähigkeit der Hefe zu verbessern, ein heterologes Protein zu exprimieren und zu sekretieren. Das folgende Beispiel beschreibt die Verwendung des Shufflings, um Hefe dahingehend zu entwickeln, erhöhte Mengen an RNase A zu exprimieren und sekretieren.
RNase A katalysiert die Spaltung der P-O_5'-Bindung von RNA, und zwar spezifisch nach Pyrimidin-Nucleotiden. Das Enzym ist ein basisches, 124 Aminosäuren langes Polypeptid, das acht halbe Cysteinreste besitzt, von denen jedes für die Katalyse benötigt wird. YEpWL-RNase A ist ein Vektor, der die Expression und Sekretion von RNase A aus der Hefe S. cerevisiae bewirkt, und eine Hefe, die diesen Vektor trägt, sekretiert 1–2 mg rekombinanter RNase A pro Liter Kulturmedium (del Cardayre et al., Protein Engineering 8 (3): 26, 1–273 (1995)). Diese Gesamtausbeute ist jedoch für ein Protein, das in Hefe heterolog exprimiert wird, schlecht, und kann durch Shuffling mindestens um das Zehn- bis Hundertfache verbessert werden. Die Expression von RNase A kann durch mehrere Platten- und Mikrotiterplattenassays leicht detektiert werden (del Cardayre & Raines, Biochemistry 33, 6031–6037 (1994)). Jede der beschriebenen Formate für das Gesamtgenom-Shuffling kann dazu eingesetzt werden, einen Stamm von S. cerevisiae neu zusammenzusetzen, der YEPWL-RNase A trägt, und die resultierenden Zellen können hinsichtlich der erhöhten Sekretion von RNase A in das Medium gescreent werden. Die neuen Stämme werden einem rekursiven Shuffling-Format unterzogen, bis hinreichend hohe Level an RNase A-Sekretion beobachtet werden. Die Verwendung von RNase A ist besonders nützlich, da hierfür nicht nur ein richtiges Falten und eine Disulfidbrückenbildung notwendig ist, sondern auch eine richtige Glycosylierung. Auf diese Weise können zahlreiche Komponenten der Expression, des Faltens und der Sekretionssysteme optimiert werden. Der resultierende Stamm ist auch hinsichtlich einer verbesserten Sekretion anderer heterologer Proteine entwickelt.
Ein anderes Ziel des Shufflings von Hefe ist es, die Toleranz der Hefe gegenüber Ethanol zu erhöhen. Dies ist sowohl für die kommerzielle Produktion von Ethanol nützlich, als auch für die Produktion von mehreren alkoholhaltigen Bieren und Weinen. Der neu zusammenzusetzende Hefestamm erlangt das genetische Material durch Austausch oder Transformation mit anderen Hefestämmen, von welchen es bekannt sein mag, oder auch nicht, dass sie eine erhöhte Resistenz gegenüber Ethanol besitzen. Der zu entwickelnde Stamm wird neu zusammengesetzt und die neu zusammengesetzten Stämme werden hinsichtlich der Fähigkeit selektiert, den Aussatz gegenüber Ethanol zu überleben. In aufeinander folgenden Shuffling-Runden können erhöhte Ethanol-Konzentrationen eingesetzt werden. Die gleichen Prinzipien können dazu eingesetzt werden, Backhefe für eine erhöhte Osmotoleranz neu zusammenzusetzen.
Eine andere erwünschte Eigenschaft für das Shuffling von Hefe ist die Fähigkeit, unter bestimmten Nährstoffbedingungen zu wachsen. So ist es bspw. für die Hefe nützlich, auf billigen Kohlenstoffquellen, wie bspw. Methanol, Stärke, Melassen, Cellulose, Cellobiose oder Xylose zu wachsen, je nach Abhängigkeit von der Verfügbarkeit. Die Prinzipien des Shufflings und der Selektion sind ähnlich denjenigen, die bei den filamentösen Pilzen erläutert wurden.
Eine andere erwünschte Eigenschaft ist die Fähigkeit, Sekundärmetabolite zu produzieren, die natürlicherweise durch filamentöse Pilze oder Bakterien produziert werden. Beispiele solcher Sekundärmetabolite sind Cyclosporin A, Taxol und Cephalosporine. Die zu entwickelnde Hefe wird einem genetischen Austausch unterzogen oder wird mit DNA aus Organismen transformiert, die den Sekundärmetaboliten produzieren. So schließen bspw. Pilze, die Taxol produzieren, Taxomyces andreanae und Pestalotopis microspora mit ein (Stierle et al., Science 260, 214–216 (1993); Strobel et al., Microbiol. 142, 435–440 (1996)). Ferner kann DNA auch aus Bäumen gewonnen werden, die natürlicherweise Taxol produzieren, wie bspw. Taxus brevifolia. Die DNA, die für ein Enzym in dem Taxolstoffwechselweg kodiert, nämlich die Taxadien-Synthase, von der angenommen wird, dass sie den wesentlichen Schritt in der Taxolbiosynthese katalysiert und daher die Rate bei der Gesamttaxolproduktion limitiert, wurde kloniert (Wildung & Croteau, J. Biol. Chem. 271, 9201–4 (1996)). Die DNA wird anschließend neu zusammengesetzt und die neu zusammengesetzten Stämme werden hinsichtlich der Produktion des Sekundärmetaboliten gescreent/ausgewählt. So kann bspw. die Taxolproduktion unter Verwendung von Antikörpern gegen Taxol durch Massenspektroskopie oder durch UV-Spektrometrie beobachtet werden. Alternativ kann die Produktion von Zwischenprodukten bei der Taxolsynthese oder von Enzymen im Taxolsyntheseweg beobachtet werden. Concetti & Ripani, Biol. Chem. Hoppe Seyler 375, 419–23 (1994). Andere Beispiele für Sekundärmetabolite sind Polyole, Aminosäuren, Polyketide, nicht-ribosomale Polypeptide, Ergosterol, Carotenoide, Terpinoide, Sterole, Vitamin E und ähnliche.
Eine andere erwünschte Eigenschaft ist es, die Flockenbildung der Hefe zu erhöhen, um die Auftrennung in der Ethanolherstellung zu erleichtern. Die Hefe kann durch jede der oben beschriebenen Verfahren neu zusammengesetzt werden mit einer Selektion hinsichtlich einer zusammengesetzten Hefe, welche die größten Klumpen bildet.
7. Beispielhaftes Verfahren zur Hefe-Protoplastenbildung
Die Protoplastenherstellung in Hefe wird von Morgan ausführlich erläutert, und zwar in Protoplasts (Birkhauser Verlag, Basel, 1983). Frische Zellen (~10⁸) werden mit Puffer gewaschen, bspw. mit 0,1 M Kaliumphosphat, anschließend im gleichen Puffer mit einem reduzierenden Agens resuspendiert, wie bspw. 50 mM DTT, für 1 Stunde bei 30°C unter leichtem Schütteln inkubiert, und anschließend wieder mit dem Puffer gewaschen, um das reduzierende Agens zu entfernen. Diese Zellen werden anschließend in einem Puffer resuspendiert, der ein Zellwand-abbauendes Enzym enthält, wie bspw. Novozym 234 (1 mg/ml), und irgendeinem einer Vielzahl von osmotischen Stabilisatoren, wie bspw. Sucrose, Sorbit, NaCl, KCl, MgSO₄, MgCl₂ oder NH₄Cl, bei irgendeiner von einer Vielzahl von Konzentrationen. Diese Suspensionen werden anschließend bei 30°C unter leichtem Schütteln (~60 rpm) so lange inkubiert, bis die Protoplasten freigesetzt werden. Um Protoplasten herzustellen, die eher produktive fusionierte Zellen bilden, sind mehrere Strategien möglich.
Die Protoplastenbildung kann erhöht werden, wenn der Zellzyklus der Protoplasten dahingehend synchronisiert wurde, dass er in der G1-Phase angehalten wird. Im Falle von S. cerevisiae kann dies durch das Hinzufügen von Paarungsfaktoren, nämlich entweder a oder α erreicht werden (Curran & Carter, J. Gen. Microbiol. 129, 1589–1591 (1983)). Diese Peptide fungieren als Inhibitoren der Adenylatcyclase, welche durch Absenken des zellulären Levels an cAMP den Zellzyklus in der G1-Phase arretieren. Darüber hinaus konnte von Geschlechtsfaktoren gezeigt werden, dass diese für die Vorbereitung einer sexuellen Fusion von a- und α-Zellen ein Schwächen der Zellwand induzieren (Crandall & Brock, Bacteriol. Rev. 32, 139–163 (1968); Osumi et al., Arch. Microbiol. 97, 27–38 (1974)). Daher können, zur Vorbereitung von Protoplasten, die Zellen mit Paarungsfaktoren oder anderen bekannten Inhibitoren der Adenylatcyclase behandelt werden, wie bspw. Lefunomid oder dem Killertoxin aus K. lactis, um die Zellen in der G1-Phase zu arretieren (Sugisaki et al., Nature 304, 464–466 (1983)). Anschließend, nach der Fusion der Protoplasten (Schritt 2), kann cAMP zu dem Regenerationsmedium hinzugefügt werden, um die S-Phase und die DNA-Synthese zu induzieren. Alternativ können Hefestämme mit einer temperaturempfindlichen Mutation im CDC4-Gen eingesetzt werden, so dass die Zellen synchronisiert und in der G1-Phase arretiert werden können. Nach der Fusion werden die Zellen in die permissive Temperatur zurücküberführt, so dass die DNA-Synthese und das Wachstum fortschreiten können.
Sobald geeignete Protoplasten hergestellt worden sind, ist es notwendig, die Fusion durch physikalische oder chemische Mittel zu induzieren. Eine gleiche Anzahl an Protoplasten jedes Zelltypus wird in Phosphatpuffer (0,2 M, pH 5,8, 2 × 10⁸ Zellen/ml) mit einem osmotischen Stabilisator, wie bspw. 0,8 M NaCl und PEG 6000 (33% w/v) gemischt und anschließend 5 Minuten lang bei 30°C inkubiert, wobei die Fusion vollzogen wird. Ferner können Polyole oder andere Verbindungen, die Wasser binden, eingesetzt werden. Die fusionierten Zellen werden dann gewaschen und in dem osmotisch stabilisierten Puffer ohne PEG resuspendiert und anschließend in ein osmotisch stabilisiertes Regenerationsmedium überführt, auf/in welchem die Zellen hinsichtlich einer erwünschten Eigenschaft selektiert oder gescreent werden können.
8. Shuffling-Verfahren unter Verwendung künstlicher Chromosomen
Hefe-künstliche Chromosomen (Yacs) stellen Hefevektoren dar, in welche sehr große DNA-Fragmente (bspw. 50–2000 kb) kloniert werden können (siehe bspw. Monaco & Larin, Trends. Biotech. 12 (7), 280–286 (1994); Ramsey, Mol. Biotechnol. 1 (2), 181–201 (1994); Huxley Genet. Eng. 16, 65–91 (1994); Jakobovits, Curr. Biol. 4 (8), 761–3 (1994); Lamb & Gearhart, Curr. Opin. Genet. Dev. 5 (3), 342–8 (1995); Montoliu et al., Reprod. Fertil. Dev. 6, 577–84 (1994)). Diese Vektoren besitzen Telomere (Tel), ein Centromer (Cen), eine sich autonom replizierende Sequenz (ARS) und können Gene für eine positive (bspw. TRP1) und negative (bspw. URA3) Selektion aufweisen. YACs werden als andere Hefechromosomen aufrechterhalten, repliziert und abgetrennt, und zwar sowohl durch die Meiose und Mitosebindung, wodurch ein Mittel bereitgestellt wird, klonierte DNA einer echten meiotischen Rekombination zu unterziehen.
Mit YACs wird ein Träger für das Shuffling von Bibliotheken großer DNA-Fragmente in vivo bereitgestellt. Die Substrate für das Shuffling sind typischerweise große Fragmente von 20 kb bis 2 Mb. Die Fragmente können Zufallsfragmente sein, oder aber Fragmente, von denen bekannt ist, dass sie für eine erwünschte Eigenschaft kodieren. So kann bspw. ein Fragment ein Operon an Genen mit einschließen, welche bei der Produktion von Antibiotika beteiligt sind. Die Bibliotheken können ferner Gesamtgenome oder Chromosomen mit einschließen. Virale Genome und einige bakterielle Genome können intakt in ein einzelnes YAC kloniert werden. In einigen Bibliotheken werden die Fragmente von einem einzelnen Organismus erhalten. Andere Bibliotheken schließen Fragmentvarianten mit ein, und wiederum andere Bibliotheken werden von unterschiedlichen Individuen oder Spezies erhalten. Fragmentvarianten können auch durch eine induzierte Mutation hergestellt werden. Typischerweise werden die Gene innerhalb von Fragmenten ausgehend von natürlich assoziierten, regulatorischen Sequenzen innerhalb der Hefe exprimiert. Nichtsdestotrotz können alternativ einzelne Gene mit Hefe-regulatorischen Elementen verbunden werden, um eine Expressionskassette zu bilden, und ein Concatemer solcher Kassetten, von denen jede ein unterschiedliches Gen enthält, kann in ein YAC eingefügt werden.
In manchen Fällen werden die Fragmente in das Hefegenom eingebaut und dieses Shuffling wird dazu eingesetzt, verbesserte Hefestämme zu entwickeln. In anderen Fällen verbleiben die Fragmente als Komponenten der YACs über den gesamten Shuffling-Prozess hinweg, und nach Aneignung der erwünschten Eigenschaft werden die YACs in eine erwünschte Empfängerzelle überführt.
9. Verfahren zur Entwicklung von Hefestämmen
Fragmente werden in einen YAC-Vektor kloniert und die entstehende YAC-Bibliothek wird in kompetente Hefezellen transformiert. YAC-enthaltende Transformanten werden durch die Selektion für einen positiven Selektionsmarker identifiziert, der auf dem YAC vorliegt. Man lässt die Zellen regenerieren und poolt sie anschließend. Anschließend werden die Zellen zur Sporulation induziert, indem die Zellen aus einem reichen Medium in ein Medium mit begrenztem Stickstoff und Kohlenstoff überführt werden. Im Verlauf der Sporulation findet in den Stämmen eine Meiose statt. Anschließend werden die Sporen zur Paarung induziert, und zwar durch Rücküberführung in ein reiches Medium. Wahlweise werden die Asci lysiert, um die Sporen freizusetzen, so dass die Sporen mit anderen Sporen, die von anderen Asci herrühren, paaren können. Die Paarung resultiert in eine Rekombination zwischen den YACs, die unterschiedliche Inserts tragen, und zwischen YACs und natürlichen Hefechromosomen. Letzteres kann durch Bestrahlen der Sporen mit ultraviolettem Licht gefördert werden. Durch die Rekombination können neue Phänotypen entstehen, entweder als Ergebnis der Gen-Expression von Fragmenten auf den YACs oder als Ergebnis der Rekombination mit den Wirtsgenen, oder beidem.
Nach Induktion der Rekombination zwischen den YACs und den natürlichen Hefechromosomen werden die YACs oftmals durch eine Selektion gegen einen negativen Selektionsmarker auf den YACs eliminiert. So können bspw. YACs, die den Marker URA3 enthalten, durch eine Vermehrung 5-Fluororotsäure enthaltendes Medium herausselektiert werden. Jedes exogene oder geänderte genetische Material, das verbleibt, ist innerhalb der natürli chen Hefechromosomen enthalten. Wahlweise können weitere Rekombinationsrunden zwischen natürlichen Hefechromosomen nach der Eliminierung von YACs durchgeführt werden. Wahlweise kann die gleiche oder eine unterschiedliche Bibliothek von YACs in die Zellen transformiert werden, und die oben beschriebenen Schritte wiederholt werden. Durch das rekursive Wiederholen dieses Verfahrens wird die Diversität der Population vor dem Screening erhöht.
Nach der Eliminierung von YACs werden die Hefen hinsichtlich einer erwünschten Eigenschaft gescreent oder ausgewählt. Die Eigenschaft kann eine neue Eigenschaft sein, die durch die übertragenen Fragmente verliehen wird, wie bspw. die Produktion eines Antibiotikums. Die Eigenschaft kann auch eine verbesserte Eigenschaft der Hefe sein, wie bspw. die verbesserte Fähigkeit zur Expression oder Sekretion eines exogenen Proteins, eine verbesserte Rekombinogenizität, eine verbesserte Stabilität gegenüber Temperaturen oder Lösungsmitteln, oder eine andere Eigenschaft, die für kommerzielle oder Forschungsstämme der Hefe benötigt wird.
Die Hefestämme, die die Selektion/das Screening überleben, werden anschließend einer weiteren Rekombinationsrunde unterzogen. Die Rekombination kann ausschließlich zwischen den Chromosomen der Hefe stattfinden, welche die Selektion/das Screening überlebt haben. Alternativ kann eine Fragment-Bibliothek in die Hefezellen eingeführt werden und wie zuvor mit endogenen Hefechromosomen rekombiniert werden. Diese Fragment-Bibliothek kann gleich oder unterschiedlich zu der Bibliothek sein, die in den vorherigen Transformationsrunden verwendet wurde. So könnten bspw. die YACs eine Bibliothek genomi scher DNA enthalten, welche aus einem Pool der verbesserten Stämme isoliert wurde, die in den vorherigen Schritten gewonnen wurden. Die YACs werden wie zuvor eliminiert, gefolgt von zusätzlichen Rekombinations- und/oder Transformationsrunden mit weiteren YAC-Bibliotheken. Auf die Rekombination folgt eine weitere Selektions-/Screening-Runde, wie zuvor beschrieben. Weitere Rekombinations-/Screening-Runden können – je nach Notwendigkeit – durchgeführt werden, und zwar so lange, bis ein Hefestamm sich dahingehend entwickelt hat, die erwünschte Eigenschaft erlangt zu haben.
Ein beispielhaftes Schema zur Entwicklung von Hefe durch Einführen einer YAC-Bibliothek ist in 10 gezeigt. Der erste Teil der Figur zeigt eine Hefe mit einem endogenen diploiden Genom und eine YAC-Fragment-Bibliothek, welche Varianten einer Sequenz darstellt. Die Bibliothek wird in die Zellen transformiert, wodurch 100 bis 1000 Kolonien pro μg DNA erhalten werden. Die meisten transformierten Hefezellen enthalten nun ein einzelnes YAC neben den endogenen Chromosomen. Die Meiose wird durch Wachstum auf Medium, das hinsichtlich Stickstoff und Kohlenstoff begrenzt ist, induziert. Im Verlaufe der Meiose rekombinieren die YACs mit anderen Chromosomen in der gleichen Zelle. Die haploiden Sporen, die aus der Meiose gebildet werden, paaren und regenerieren diploide Formen. Die diploiden Formen enthalten nun rekombinante Chromosomen, von denen Teile aus endogenen Chromosomen stammen und andere Teile aus den YACs. Wahlweise können die YACs jetzt aus den Zellen durch Selektion gegenüber einem negativen Selektionsmarker, der auf den YACs vorliegt, herausselektiert werden. Unabhängig davon, ob die YACs herausselektiert werden, werden die Zellen anschließend gescreent oder hinsichtlich einer erwünschten Eigenschaft selektiert. Die Zellen, die die Selektion/das Screening überleben, werden mit einer anderen YAC-Bibliothek transformiert, um einen weiteren Shuffling-Zyklus zu beginnen.
10. Verfahren zur Entwicklung von YACs für den Transfer in einen Empfängerstamm
Diese Verfahren basieren teilweise auf der Tatsache, dass verschiedene YACs in der gleichen Hefezelle enthalten sein können, und dass bekannt ist, dass eine YAC-YAC-Rekombination auftreten kann (Green & Olson, Science 250, 94–98 (1990)). Die Rekombination zwischen den YACs sorgt für ein Format, mit welchem Familien homologer Gene, die auf Fragmenten mit einer Größe > 20 kb vorliegen, in vivo neu zusammengesetzt werden können. Die Ausgangspopulation der DNA-Fragmente besitzt eine Sequenzähnlichkeit untereinander, jedoch unterscheidet sie sich als Ergebnis, bspw. einer induzierten, allelischen oder Speziesdiversität. Oftmals kodieren DNA-Fragmente bekanntermaßen oder vermutetermaßen für verschiedene Gene, die in einem gemeinsamen Weg wirken.
Die Fragmente werden in ein YAC kloniert und in Hefe transformiert, typischerweise mit einer positiven Selektion für die Transformanten. Die Transformanten werden zur Sporulation induziert, wodurch die Chromosomen einer Meiose unterzogen werden. Anschließend werden die Zellen gepaart. Die meisten der resultierenden diploiden Zellen tragen jetzt zwei YACs, von denen jedes ein unterschiedliches Insert aufweist. Diese werden wiederum zur Sporulation induziert und gepaart. Die resultierenden Zellen enthalten YACs der rekombinierten Sequenz. Die Zellen können anschließend hinsichtlich der erwünschten Eigen schaft gescreent oder selektiert werden. Typischerweise tritt eine solche Selektion in dem Hefestamm auf, der für das Shuffling eingesetzt wird. Wenn die neu zusammengesetzten Fragmente jedoch nicht in der Hefe exprimiert werden, können die YACs isoliert und in einen geeigneten Zelltypus transferiert werden, in welchem sie für das Screening exprimiert werden. Beispiele solcher Eigenschaften schließen die Synthese oder den Abbau einer erwünschten Verbindung mit ein, die erhöhte Sekretion eines erwünschten Genprodukts oder einen anderen detektierbaren Phänotyp.
Vorzugsweise wird die YAC-Bibliothek in haploide a- und haploide α-Zellen transformiert. Diese Zellen werden anschließend zur Paarung miteinander induziert, d.h. sie werden gepoolt und durch Wachstum auf reichem Medium zur Paarung induziert. Die diploiden Zellen, von denen jede zwei YACs trägt, werden anschließend in ein Sporulationsmedium übertragen. Während der Sporulation tritt in den Zellen eine Meiose auf, und homologe Chromosomen rekombinieren. In diesem Fall werden die auf den YACs vorliegenden Gene rekombinieren, wodurch deren Sequenzen diversifizieren. Die resultierenden haploiden Acosporen werden anschließend durch einen enzymatischen Abbau der Asci-Wände oder durch andere geeignete Mittel von den Asci freigesetzt und die gepoolten, freigesetzten, haploiden Ascosporen werden durch ein Transfer in reiches Medium zur Paarung induziert. Dieses Verfahren wird mehrere Zyklen wiederholt, um die Diversität der DNA, die in die YACs kloniert wurde, zu erhöhen. Die resultierende Hefezellenpopulation, die vorzugsweise im haploiden Stadium ist, wird anschließend hinsichtlich der verbesserten Eigenschaften gescreent, oder aber die diversifizierte DNA wird in eine andere Wirtszelle oder in einen anderen Wirtsorganismus für das Screenen überführt.
Die Zellen, die die Selektion/das Screening überleben, werden weiteren, aufeinander folgenden Zyklen an Poolen, Sporulation, Paarung und Selektion/Screening unterzogen, bis der erwünschte Phänotyp beobachtet wird. Eine Rekombination kann durch Übertragen der Zellen aus reichem Medium in Medium leicht induziert werden, welches in Kohlenstoff und Stickstoff begrenzt ist, um die Sporulation zu induzieren, und anschließend durch Rücküberführen der Sporen in reiches Medium, um die Paarung zu induzieren. Die Asci können zur Stimulierung der Paarung der Sporen, die aus unterschiedlichen Asci herrühren, lysiert werden.
Nachdem die YACs dahingehend entwickelt wurden, eine erwünschte Eigenschaft zu kodieren, können sie in andere Zelltypen übertragen werden. Der Transfer kann durch Protoplastenfusion oder durch Retransformation mit isolierter DNA vollzogen werden. So wird bspw. der Transfer von YACs aus Hefezellen in Säugetierzellen diskutiert von Monaco & Larin, Trends in Biotechnology 12, 280–286 (1994); Montoliu et al., Reprod. Fertil. Dev. 6, 577–84 (1994); Lamb et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 342–8 (1995)).
Ein beispielhaftes Schema für das Shuffling einer YAC-Fragment-Bibliothek in Hefe ist in 11 gezeigt. Eine Bibliothek an YAC-Fragmenten, die genetische Varianten darstellt, wird in Hefe transformiert, welche diploide endogene Chromosomen aufweist. Die transformierte Hefe wird weiterhin diploide endogene Chromosomen besitzen, plus einem einzelnen YAC. Die Hefe wird zur Meiose und zur Sporulation induziert. Die Sporen enthalten haploide Genome und werden hinsichtlich denjenigen selektiert, die ein YAC enthalten, und zwar unter Verwendung des YAC-Selektionsmarkers. Die Sporen werden zur Paarung induziert wodurch diploide Zellen hergestellt werden. Die diploiden Zellen enthalten nun zwei YACs, welche unterschiedliche Inserts tragen, ebenso wie diploide endogene Chromosomen. Die Zellen werden wiederum zur Meiose induziert, und sporulieren. Während der Meiose tritt zwischen den YAC-Inserts eine Rekombination auf und die rekombinanten YACs werden in die Ascozyten abgetrennt. Einige Ascozyten enthalten daher haploide endogene Chromosomen plus einem YAC-Chromosom mit einem rekombinanten Insert. Die Ascozyten reifen zu Sporen, welche wiederum paaren können, wodurch diploide Zellen gebildet werden. Einige diploide Zellen besitzen nun ein diploides Komplement der endogenen Chromosomen plus zwei rekombinante YACs. Diese Zellen können anschließend weiteren Meiose-, Sporulations- und Paarungszyklen unterzogen werden. In jedem Zyklus tritt eine weitere Rekombination zwischen den YAC-Inserts auf, und weitere rekombinante Formen der Inserts werden hergestellt. Nach einem oder nach mehreren Rekombinationszyklen können die Zellen hinsichtlich der Aneignung der erwünschten Eigenschaft getestet werden. Weitere Rekombinationszyklen, gefolgt von einer Selektion, können anschließend auf ähnliche Weise durchgeführt werden.
11. In vivo-Shuffling von Genen durch die rekursive Paarung von Hefezellen, die homologe Gene in identischen Loci aufweisen
Ein Ziel des DNA-Shufflings ist es, die kombinatorischen Fähigkeiten der sexuellen Rekombination nachzuahmen und zu erweitern. Das in vitro-DNA-Shuffling führt hierin zu einem Erfolg. Nichtsdestotrotz können durch Abändern des Rekombinationsmechanismus und durch Abändern der Bedingungen, unter welchen die Rekombination auftritt, natürliche in vitro-Rekombinationsverfahren die intrinsische Information in einer DNA-Sequenz, welche es „entwickelbar" macht, gefährden.
Mit dem in vivo-Shuffling durch Anwenden der natürlichen Crossing-over-Mechanismen, die während der Meiose auftreten, kann eine inhärente natürliche Sequenzinformation erlangt werden, und es wird ein Mittel bereitgestellt, neu zusammengesetzte Bibliotheken mit höherer Qualität zu schaffen. Hierin ist ein Verfahren für das in vivo-Shuffling von DNA beschrieben, bei welchem die natürlichen Mechanismen der meiotischen Rekombination verwendet werden, und mit welchem ein alternatives Verfahren für das DNA-Shuffling bereitgestellt wird.
Die zugrunde liegende Strategie ist es, die neu zusammenzusetzenden Gene in identische Loci innerhalb des haploiden Hefegenoms zu klonieren. Die haploiden Zellen werden anschließend rekursiv zur Paarung und zur Sporulierung induziert. Durch diesen Prozess werden die klonierten Gene einer rekursiven Rekombination während den rekursiven Meiosezyklen unterzogen. Die entstehenden neu zusammengesetzten Gene werden an schließend in situ gescreent oder isoliert und unter unterschiedlichen Bedingungen gescreent.
Wenn bspw. eine Familie von fünf Lipase-Genen neu zusammengesetzt werden soll, wird mit dem nachfolgend Beschriebenen ein Mittel hierfür in vivo bereitgestellt.
Der offene Leserahmen jeder Lipase wird durch PCR derart amplifiziert, dass jeder ORF von identischen 3'- und 5'-Sequenzen flankiert ist. Die 5'-flankierende Sequenz ist mit einer Region innerhalb der 5'-kodierenden Sequenz des S. cerevisiae ura-3-Gens identisch, und die 3'-flankierende Sequenz ist mit einer Region innerhalb der 3'-kodierenden Sequenz des ura-3-Gens identisch. Die flankierenden Sequenzen werden derart ausgewählt, dass die homologe Rekombination des PCR-Produkts mit dem ura-3-Gen in den Einbau des Lipase-Gens und die Unterbrechung des ura-3-ORF resultiert. Sowohl S. cerevisiae a- und α-haploide Zellen werden anschließend mit jedem der durch die PCR-amplifizierten Lipase-ORFs transformiert, und Zellen, die das Lipase-Gen in den ura-3-Locus eingebaut haben, werden durch Wachstum auf 5-Fluorotsäure selektiert (5FOA ist für Zellen, die funktionelles URA3 exprimieren, tödlich). Das Ergebnis sind zehn Zelltypen, zwei unterschiedliche Paarungstypen, von denen jeder eines der fünf Lipase-Gene im unterbrochenen ura-3-Locus trägt. Diese Zellen werden anschließend vereinigt und unter Bedingungen wachsen gelassen, unter welchen zwischen den a- und α-Zellen eine Paarung gefördert wird, wie bspw. in einem reichen Medium.
Die Paarung resultiert in eine kombinatorische Mischung aus diploiden Zellen mit allen 32 möglichen Kombinatio nen der Lipase-Gene in den zwei ura-3-Loci. Die Zellen werden anschließend zur Sporulierung induziert, und zwar durch Wachstum unter Kohlenstoff- und Stickstoff-begrenzten Bedingungen. Während der Sporulation tritt in den diploiden Zellen eine Meiose auf, wodurch vier (zwei a und zwei α) haploide Ascosporen gebildet werden, die in einem Ascus enthalten sind. Während der Meiose II des Sporulationsprozesses richten sich Schwesterchromatide aneinander aus und überkreuzen sich. Die Lipase-Gene, die in die uar-3-Loci kloniert wurden, richten sich ebenfalls aus und rekombinieren. Daher werden die resultierenden haploiden Ascussporen eine Bibliothek an Zellen darstellen, von denen jede ein unterschiedliches, mögliches, chimäres Lipase-Gen trägt, von denen jedes ein einzigartiges Ergebnis der meiotischen Rekombination der zwei Lipase-Gene in der ursprünglichen diploiden Zelle darstellt. Die Wände der Asci werden durch Behandlung mit Zymolase behandelt, um die individuellen Ascussporen freizusetzen und eine Mischung dieser zu ermöglichen. Die Mischung wird anschließend unter Bedingungen wachsen gelassen, die die Paarung der a- und α-haploiden Zellen fördern. Es ist wichtig, die einzelnen Ascussporen freizusetzen, da ansonsten die Paarung zwischen den Ascussporen innerhalb eines Ascus auftritt. Das Mischen der haploiden Zellen ermöglicht die Rekombination zwischen mehr als zwei Lipase-Genen, wodurch eine „pool-weise" Rekombination ermöglicht wird. Durch die Paarung werden neue Kombinationen chimärer Gene ermöglicht, die anschließend nach der Sporulation einer Rekombination unterzogen werden können. Die Zellen werden rekursiven Zyklen einer Sporulation, Ascussporenmischung und Paarung unterzogen, bis durch die rekursive paarweise Rekombination der fünf Lipase-Gene eine hinreichende Diversität hergestellt wurde. Die einzelnen chimären Lipase-Gene können entweder in den haploiden Hefezellen direkt gescreent werden, oder aber in einen geeigneten Expressionswirt transferiert werden.
Das Verfahren ist oben für Lipasen und für Hefe beschrieben worden, jedoch kann jeder sexuelle Organismus, in welchen Gene eingeschleust werden können, eingesetzt werden, und selbstverständlich könnte irgendein anderes Gen anstelle der Lipasen eingesetzt werden. Dieses Verfahren ist mit dem Verfahren des Gesamtgenom-Shufflings durch rekursives paarweises Paaren analog. Jedoch ist die Diversität im Falle des Gesamtgenoms über das Wirtsgenom hinweg verteilt, und nicht auf spezifische Loci lokalisiert.
12. Verwendung von YACs zur Klonierung unverbundener Gene
Das Shuffling der YACs kann insbesondere dahingehend geändert werden, um unverbundene, jedoch funktionell verwandte Gene von einer Spezies auf die andere zu transferieren, insbesondere dort, wo solche Gene nicht identifiziert wurden. Dies ist der Fall für mehrere, kommerziell wichtige, Naturprodukte, wie bspw. Taxol. Der Transfer der Gene in den Stoffwechselweg eines unterschiedlichen Organismus ist oftmals erwünscht, da die Organismen, die solche Verbindungen natürlich produzieren, für eine Massenkultivierung nicht geeignet sind.
Cluster solcher Gene können dadurch isoliert werden, dass eine Gesamtgenom-DNA-Bibliothek aus einem Organismus, der eine nützliche Verbindung produziert, in eine YAC-Bibliothek kloniert wird. Die YAC-Bibliothek wird anschließend in Hefe transformiert. Die Hefe wird zur Sporulierung gebracht und derart gepaart, dass zwischen den YACs und/oder zwischen den YACs und dem natürlichen Hefechromosom eine Rekombination auftritt. Anschließend wird die Selektion/das Screening hinsichtlich der Expression der erwünschten Sammlung an Genen durchgeführt. Wenn die Gene für einen Biosyntheseweg kodieren, kann die Expression durch das Auftreten des Produktes des Weges detektiert werden. Die Produktion einzelner Enzyme in dem Weg, oder von Zwischenverbindungen des letztendlichen Expressionsproduktes oder die Fähigkeit der Zellen, solche Zwischenprodukte zu verstoffwechseln, deutet auf eine teilweise Erlangung des Syntheseweges hin. Die ursprüngliche Bibliothek oder eine unterschiedliche Bibliothek kann in Zellen eingeführt werden, die die Selektion/das Screening überleben und es können weitere Rekombinations- und Selektions-/Screening-Runden durchgeführt werden, bis das Endprodukt des erwünschten Stoffwechselwegs produziert wird.
13. YAC-YAC-Shuffling
Wenn ein Phänotyp von Interesse in einen einzigen Strang an genomischer DNA mit weniger als zwei Megabasen in Länge isoliert werden kann, kann er in ein YAC-kloniert und in S. cerevisiae repliziert werden. Die Klonierung ähnlicher DNA-Stränge aus verwandten Wirten in ein identisches YAC resultiert in einer Hefezellpopulation, von denen jede ein YAC mit einem homologen Insert trägt, was einen erwünschten Phänotyp bewirkt. Das rekursive Züchten dieser Hefezellen ermöglicht es, dass die homologen Regionen dieser YACs während der Meiose rekombinieren, wodurch Gene, Wege und Cluster während jedes Meiosezyklus rekombinieren können. Nach mehreren Paarungs- und Abtrennungszyklen sind die YAC-Inserts hinreichend gut neu zusammenge setzt. Diese neue, sehr diverse Hefebibliothek könnte dann hinsichtlich phänotypischen Verbesserungen gescreent werden, die von dem Shuffling der YAC-Inserts herrühren.
14. YAC-Chromosomen-Shuffling
Eine „mitotische" Rekombination tritt während der Zellteilung auf und ist ein Ergebnis der Rekombination von Genen während der Replikation. Diese Art an Rekombination ist nicht auf eine Rekombination zwischen Schwesterchromatiden beschränkt und kann durch Agenzien verstärkt werden, die die Rekombinationsmaschinerie induzieren, wie bspw. Strangbruch-Chemikalien und ultraviolette Strahlung. Da es oftmals schwierig ist, über eine Spezies-Barriere hinweg direkt zu paaren, ist es möglich, die Rekombination homologer Gene zu induzieren, die von unterschiedlichen Spezies herrühren, und zwar durch Bereitstellen der Ziel-Gene für einen erwünschten Wirtsorganismus in Form einer YAC-Bibliothek. Die Gene, die in dieser Bibliothek vorliegen, werden anschließend eingeführt, um mit homologen Genen auf dem Wirts-Chromosom durch verstärkte mitotische Rekombination zu rekombinieren. Dieser Prozess wird rekursiv durchgeführt, um eine Bibliothek diverser Organismen zu generieren, und anschließend hinsichtlich denjenigen Organismen gescreent, die die erwünschten phänotypischen Verbesserungen aufweisen. Die verbesserte Subpopulation wird anschließend rekursiv, wie oben beschrieben, gepaart, wodurch neue Stämme identifiziert werden, bei welchen sich verschiedene nützliche genetische Änderungen akkumuliert haben.
15. Akkumulation verschiedener, auf YACs vorliegenden, nützlicher Genen
Die Akkumulation verschiedener unverbundener Gene, die für die Erlangung oder die Verbesserung eines vorgegebenen Phänotyps benötigt werden, kann durch das Shuffling von YAC-Bibliotheken erreicht werden. Genomische DNA aus Organismen mit den erwünschten Phänotypen, wie bspw. eine Ethanoltoleranz, Wärmetoleranz und die Fähigkeit, Pentosezucker zu fermentieren, werden gepoolt, fragmentiert und in mehrere unterschiedliche YAC-Vektoren kloniert, von denen jeder einen unterschiedlichen Selektionsmarker trägt (his, ura, ade, etc.). S. cerevisiae werden mit diesen Bibliotheken transformiert und hinsichtlich deren Vorliegen selektiert (unter Verwendung selektiver Medien, d.h. Uracil-Dropout-Medien für die YAC, die den Ura3-Selektionsmarker enthalten) und anschließend danach gescreent, ob sie einen erwünschten Phänotyp erhalten oder diesen verbessert haben. Die überlebenden Zellen werden gepoolt, rekursiv gepaart und hinsichtlich der Akkumulation verschiedener YACs selektiert (durch eine Vermehrung in einem Medium mit verschiedenen Nährstoff-„Dropouts"). Zellen, die verschiedene YACs mit nützlichen genomischen Inserts erlangt haben, werden durch ein weiteres Screening identifiziert. Optimierte Stämme können direkt verwendet werden, jedoch kann – auf Grund der Last, die ein YAC für eine Zelle sein kann – das relevante YAC-Insert minimiert werden, subkloniert und in das Wirts-Chromosom rekombiniert werden, um einen stabileren Produktionsstamm zu bilden.
16. Auswahl des Wirts-SSF-Organismus
Eine beispielhafte Verwendung für die vorliegende Erfindung ist es, eine verbesserte Hefe für die Produktion von Ethanol aus Lignocellulosebiomasse zu bilden. Genauer gesagt ist ein Hefestamm mit verbesserter Ethanoltoleranz und Thermostabilität/Thermotoleranz erwünscht. Es werden zunächst Eltern-Hefestämme identifiziert, von denen bekannt ist, dass sie sich in einem „Simultaneous Saccharification and Fermentation" (SSF)-Verfahren gut verhalten. Diese Stämme werden mit anderen Stämmen kombiniert, von denen bekannt ist, dass sie eine Ethanoltoleranz und/oder Thermostabilität besitzen.
S. cerevisiae ist für die Entwicklung optimierter SSF-Verfahren äußerst zugänglich. Der Stamm besitzt inhärent mehrere Merkmale für diese Verwendung, einschließlich der Fähigkeit, eine Vielzahl von Zuckern, wie bspw. Sucrose, Glucose, Galactose, Maltose und Maltotriose zu importieren und zu fermentieren. Ferner hat die Hefe die Fähigkeit zur Flockenbildung, wodurch die Hefebiomasse am Ende eines Fermentierungszyklus wiedergewonnen werden kann, was deren Wiederverwendung in nachfolgenden Bioprozessen ermöglicht. Dies stellt eine wichtige Eigenschaft darin dar, dass es die Verwendung von Nährstoffen im Wachstumsmedium optimiert. Ferner ist S. cerevisiae auch für Labor-Manipulationen äußerst zugänglich, ist genetisch hinreichend charakterisiert worden und besitzt einen sexuellen Reproduktionszyklus. S. cerevisiae kann entweder unter aeroben oder anaeroben Bedingungen gezüchtet werden, im Gegensatz zu einigen anderen möglichen SSF-Organismen, die strikte Anaerobia darstellen (bspw. Clostridium spp.), wodurch diese sehr schwierig im Labor handzuhaben sind. S. cerevisiae wird ferner auch als „im Allgemeinen sicher" betrachtet („GRAS"), und ist auf Grund seiner weit verbreiteten Verwendung zur Herstellung wichtiger Nahrungsmittel für die allgemeine Öffentlichkeit (bspw. Bier, Wein, Brot, etc.) im Allgemeinen familiär und hinreichend bekannt. S. cerevisiae wird gewöhnlich in Fermentationsprozessen verwendet und die Bekanntheit seiner Handhabung durch Fermentationsexperten erleichtert die Einführung neuer verbesserter Hefestämme in die industrielle Umgebung.
S. cerevisiae-Stämme, die zuvor als besonders gute SSF-Organismen identifiziert wurden, wie bspw. S. cerevisiae D₅A (ATCC 200062) (South CR und Lynd LR (1994) Appl. Biochem. Biotechnol. 45/46: 467–481; Ranatunga TD et al. (1997), Biotechnol. Lett. 19: 1125–1127) können als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Darüber hinaus werden andere industriell verwendete S. cerevisiae-Stämme wahlweise als Wirtsstämme verwendet, insbesondere diejenigen, die wünschenswerte Fermentations-Merkmale zeigen, wie bspw. S. cerevisiae Y567 (ATCC 24858) (Sitton EC et al. (1979) Process Biochem. 14 (9): 7–10; Sitton OC et al. (1981) Adv. Biotechnol. 2: 231–237; McMurrough I et al. (1971) Folia Microbiol. 16: 346–349) und S. cerevisiae ACA174 (ATCC 60868) (Benitez T et al. (1983) Appl. Environ. Microbiol. 45: 1429–1436; Chem. Eng. J. 50: B17–B22, 1992), von denen gezeigt werden konnte, dass sie wünschenswerte Merkmale hinsichtlich einer Fermentierung im großen Maßstab besitzen.
17. Auswahl der Ethanol-toleranten Stämme
Viele Stämme von S. cerevisiae konnten aus Umgebungen mit hohem Ethanolgehalt isoliert werden, und haben in der Ethanol-reichen Umgebung durch adaptive Evolution überlebt. So haben bspw. Stämme aus der Alterung von Sherry-Wein („Flor"-Stämme) hochfunktionelle Mitochondrien entwickelt, um deren Überleben in einer Umgebung mit hohem Ethanolgehalt zu ermöglichen. Es konnte gezeigt werden, dass der Transfer dieser Wein-Hefe-Mitochondrien auf andere Stämme die Resistenz des Empfängers gegenüber hohen Ethanolkonzentrationen erhöht, ebenso wie die Thermotoleranz (Jimenez, J. und Benitez, T. (1988), Curr. Genet. 13: 461–469). In der ATCC gibt es einige hinterlegte Florstämme, bspw. S. cerevisiae MY91 (ATCC 201301), MY138 (ATCC 201302), C5 (ATCC 201298), ET7 (ATCC 201299), LA6 (ATCC 201300), OSB21 (ATCC 201303), F23 (S. globosus ATCC 90920). Ferner wurden auch mehrere Florstämme von S. uvarum und Torulaspora pretoriensis hinterlegt. Andere Ethanol-tolerante Weinstämme schließen S. cerevisiae ACA 174 (ATCC 60868), 15% Ethanol, und S. cerevisiae A54 (ATCC 90921) mit ein, isoliert aus Wein, der 18% (v/v) Ethanol enthält, und ferner NRCC 202036 (ATCC 46534), ebenfalls eine Weinhefe. Andere S. cerevisiae-Ethanologene, die darüber hinaus eine verstärkte Ethanoltoleranz zeigen, schließen ATCC 24858, ATCC 24858, G 3706 (ATCC 42594), NRRL Y-265 (ATCC 60593) und ATCC 24845-ATCC 24860 mit ein. Ein Stamm von S. pastorianus (S. carlsbergensis ATCC 2345) besitzt eine hohe Ethanoltoleranz (13% v/v). S. cerevisiae Sa28 (ATCC 26603), aus einer jamaikanischen Rohzuckersaftprobe produziert hohe Level an Alkohol aus Melassen, ist Zuckertolerant und produziert Alkohol aus Holzsäure-Hydrolyzat.
Mehrere der aufgeführten Stämme können – ebenso wie zusätzliche Stämme – als Ausgangsmaterial für die Züchtung der Ethanoltoleranz verwendet werden.
18. Auswahl von Temperatur-toleranten Stämmen
Ein paar wenige Temperatur-tolerante Stämme sind beschrieben worden, einschließlich des stark Flocken bildenden Stammes S. pastorianus SA23 (S. carlsbergensis ATCC 26602), der bei erhöhten Temperaturen Ethanol produziert, und S. cerevisiae Kyokai 7 (S. sake, ATCC 26422), eine Sake-Hefe, die gegenüber einem kurzen Erhitzen und oxidativem Stress tolerant ist. Ballesteros et al. ((1991) Appl. Biochem. Biotechnol. 28/28: 307–315) untersuchten 27 Hefestämme hinsichtlich deren Fähigkeit zu wachsen und Glukose in einem Temperaturbereich von 32 bis 45°C zu fermentieren, einschließlich Saccharomyces, Kluyveromyces und Candida spp. Von diesen erwies sich als der thermotoleranteste Klon Kluyveromyces marxianus LG und Kluyveromyces fragilis 2671 (Ballesteros et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 39/40: 201–211). S. cerevisiae-pretoriensis FDHI erwies sich als etwas thermotolerant, war jedoch nur wenig Ethanoltolerant. Die rekursive Rekombination dieses Stammes mit anderen, die eine Ethanoltoleranz aufweisen, kann dazu eingesetzt werden, dass die Nachkommenschaft die thermotoleranten Merkmale des Stammes erlangt, wobei die Nachkommenschaft auch eine Ethanoltoleranz zeigt.
Candida acidothermophilum (Issatchenkia orientalis, ATCC 20381) stellt einen guten SSF-Stamm dar, der ferner eine verbesserte Leistung in der Ethanolproduktion aus lignozellulosischer Biomasse bei höheren SSF-Temperaturen im Vergleich zu S. cerevisiae D₅A zeigt (Kadam, KL, Schmidt, SL (1997), Appl. Microbiol. Biotechnol. 48: 709–713). Dieser Stamm kann auch einen genetischen Beitrag für einen verbesserten SSF-Stamm leisten.
19. Shuffling der Stämme
In den Fällen, in denen die Stämme nahe verwandt miteinander sind, kann eine rekursive Paarungsstrategie verfolgt werden. So werden bspw. eine Population von haploiden S. cerevisiae (a und Alpha) mutagenisiert und hinsichtlich einer verbesserten Ethanol- oder Thermotoleranz gescreent. Die verbesserten haploiden Subpopulationen werden miteinander vermischt und als ein Pool gepaart, und ferner zur Sporulierung induziert. Die resultierenden haploiden Sporen werden durch Abbau der Asci-Wände freigesetzt und vermengt. Die freigesetzten Sporen werden anschließend zur Paarung und zur rekursiven Sporulation induziert. Dieser Prozess wird hinreichend oft wiederholt, um alle möglichen Mutantenkombinationen zu generieren. Die Population, die in ihrem Gesamtgenom neu zusammengesetzt ist (haploid), wird anschließend für eine weitere Ethanol- oder Hitzetoleranz gescreent.
Wenn die Stämme für eine rekursive Paarung nicht hinreichend genug verwandt sind, können Formate, basierend auf der Protoplastenfusion, eingesetzt werden. Eine rekursive und pool-weise Protoplastenfusion kann durchgeführt werden, um chimäre Populationen diverser Elternstämme zu generieren. Der resultierende Pool der Nachkommenschaft wird dahingehend selektiert und gescreent, um verbesserte Ethanol- und hitzeresistente Stämme zu identifizieren.
Alternativ kann ein Shuffling-Format, basierend auf einem YAC-Gesamtgenom-Shuffling, verwendet werden. Bei diesem Format werden YACs dazu eingesetzt, große chromosomale Fragmente zwischen Stämmen hin und her zu schleusen. Wie bereits wei ter oben beschrieben, tritt eine Rekombination zwischen YACs oder zwischen YACs und den Wirts-Chromosomen auf. Die genomische DNA aus den Organismen mit den erwünschten Phänotypen wird gepoolt, fragmentiert und in mehrere unterschiedliche YAC-Vektoren kloniert, von denen jeder einen unterschiedlichen Selektionsmarker trägt (his, ura, ade, etc.). S. cerevisiae wird mit diesen Bibliotheken transformiert und hinsichtlich deren Vorliegen selektiert (unter Verwendung selektiver Medien, d.h. Uracil-Dropout-Medien hinsichtlich der YAC, die den Ura3-Selektionsmarker enthalten) und anschließend dahingehend gescreent, ob sie einen erwünschten Phänotyp erlangt oder diesen verbessert haben. Die überlebenden Zellen werden gepoolt, rekursiv gepaart (siehe oben) und anschließend für die Ansammlung verschiedener YACs ausgewählt (durch Vermehrung in einem Medium mit verschiedenen Nährstoff-Dropouts). Zellen, die verschiedene YACs mit nützlichen genomischen Inserts erlangen, werden durch ein weiteres Screening identifiziert (siehe nachstehend).
20. Auswahl der verbesserten Stämme
Nach der Produktion großer Bibliotheken an neuen Stämmen durch Mutagenese und Rekombination ist eine erste Aufgabe nun, diese Stämme, die Verbesserungen in den erwünschten Phänotypen besitzen, zu isolieren. Die Identifizierung der Organismus-Bibliotheken wird dort erleichtert, wo die erwünschten Schlüsselmerkmale auswählbare Phänotypen sind. So hat bspw. Ethanol unterschiedliche Auswirkungen auf die Wachstumsrate einer Hefepopulation, auf die Lebensfähigkeit und auf die Fermentationsrate. Mit der Ethanolkonzentration steigt die Inhibierung des Zellwachstums und der Lebensfähigkeit an, jedoch wird die hohe Fermentationsfähigkeit nur bei höheren Ethanol konzentration inhibiert. Aus diesen Gründen ist die Auswahl von wachsenden Zellen in Ethanol ein durchführbarer Ansatz, um Ethanol-t,olerante Stämme zu isolieren. Anschließend können die ausgewählten Stämme hinsichtlich deren fermentativer Fähigkeit, Ethanol zu produzieren, analysiert werden. Vorausgesetzt, dass Wachstums- und Medium-Bedingungen für alle Stämme die gleichen sind (Elternstämme und Nachkommenschaft), muss eine Hierarchie der Ethanoltoleranz konstruiert werden.
Einfache Selektionsschemata für die Identifizierung von Hitze-toleranten und Ethanol-toleranten Stämmen sind verfügbar und basieren in diesen Fällen auf denjenigen, die zuvor entwickelt wurden, um möglicherweise nützliche SSF-Stämme zu identifizieren. Die Selektion der Ethanoltoleranz wird durch Aussetzen der Population gegenüber Ethanol durchgeführt, gefolgt von einem Ausplattieren der Population und einem Beobachten des Wachstums. Die Kolonien, die dazu in der Lage sind, nach dem Aussetzen gegenüber Ethanol zu wachsen, können einer höheren Ethanolkonzentration ausgesetzt werden und der Zyklus wiederholt werden, bis der toleranteste Stamm selektiert wird. Um zwischen Stämmen zu unterscheiden, die eine vererbbare Ethanoltoleranz besitzen, und Stämmen, die sich dies vorübergehend angeeignet haben, können diese Zyklen mit Wachstumszyklen ohne Selektion (d.h. ohne Ethanol) unterbrochen werden.
Alternativ kann die vermengte Population direkt mit ansteigenden Ethanolkonzentrationen gezüchtet werden und der toleranteste Stamm wird angereichert (Aguilera und Benitez, 1986, Arch Microbiol 4: 337–444). Diese Anreicherung könnte bspw. in einem Chemostaten oder in einem Turbidostaten durchgeführt werden. Ähnliche Auswahlverfahren können für eine Hitze toleranz entwickelt werden, bei welchem die Stämme durch deren Fähigkeit identifiziert werden, nach einer Hitzebehandlung zu wachsen, oder aber direkt für ein Wachstum bei erhöhten Temperaturen (Ballesteros et al., 1991, Applied Biochem and Biotech, 28: 307–315). Die durch diese Selektionen identifizierten besten Stämme werden in nachfolgenden Screens hinsichtlich Ethanol, Hitzetoleranz oder anderen Eigenschaften von Interesse gründlicher untersucht werden.
Organismen mit einer erhöhten Ethanoltoleranz können ausgewählt werden. Eine Population von natürlichen S. cerevisiae-Isolaten wird mutagenisiert. Diese Population wird anschließend unter Fermentationsbedingungen mit einer niedrigen Anfangsethanolkonzentration wachsen gelassen. Sobald die Kultur die Sättigung erreicht hat, wird die Kultur mit frischem Medium mit einem etwas höheren Ethanolgehalt verdünnt. Dieser Prozess der sukzessiven Verdünnung in einem Medium mit ansteigenden Ethanolkonzentrationen wird so lange fortgeführt, bis eine Schwelle der Ethanoltoleranz erreicht ist. Die überlebende mutierte Population mit der höchsten Ethanoltoleranz wird gepoolt und deren Genome durch irgendein hierin beschriebenes Verfahren rekombiniert. Die Anreicherung könnte auch durch eine kontinuierliche Kultur in einem Chemostaten oder Turbidostaten erreicht werden, in welchem die Temperatur oder die Ethanolkonzentrationen progressiv erhöht werden. Die resultierenden, neu zusammengesetzten Populationen werden anschließend wiederum der Anreicherungsstrategie unterzogen, jedoch bei einer höheren Ethanolkonzentration des Ausgangsmediums. Diese Strategie wird wahlweise für die Anreicherung von Hitze-toleranten Zellen und für die Anreicherung von Zellen angewandt, die eine kombinierte Hitze- und Ethanoltoleranz besitzen.
21. Screening nach verbesserten Stämmen
Stämme, die bei den anfänglichen Selektionen eine Lebensfähigkeit zeigen, werden hinsichtlich Verbesserungen in den erwünschten Eigenschaften quantitativer untersucht, bevor sie mit anderen Stämmen wieder neu zusammengesetzt werden.
Nachkommenschaften, die aus der Mutagenese eines Stammes herrühren, oder diejenigen, die hinsichtlich ihrer Ethanoltoleranz und/oder Hitzestabilität vorselektiert wurden, können auf nicht-selektivem Agar ausplattiert werden. Die Kolonien können mit Hilfe eines Roboters auf Mikrotiterplatten überführt und wachsen gelassen werden. Kulturen werden auf frische Mikrotiterplatten repliziert und die Replikate werden unter den (der) geeigneten Stressbedingung(en) inkubiert. Das Wachstum oder die Stoffwechselaktivität einzelner Klone kann beobachtet und eingestuft werden. Indikatoren für die Lebensfähigkeit können von der Größe der wachsenden Kolonien auf festem Medium, der Dichte der wachsenden Kulturen oder der Farbänderung eines Indikators für die Stoffwechselaktivität rangieren, welcher zu dem flüssigen Medium hinzugefügt wird. Stämme, die die höchste Lebensfähigkeit zeigen, werden anschließend vermischt und neu zusammengesetzt und die resultierende Nachkommenschaft wird unter stringenteren Bedingungen neu gescreent.
22. Entwicklung eines Ethanol-toleranten Stammes mit der Fähigkeit, Cellulose in Ethanol umzuwandeln
Sobald ein Hefestamm mit Hitzetoleranz und Ethanoltoleranz entwickelt worden ist, wird für den Abbau von Cellulose in monomere Zucker dadurch gesorgt, dass in den Wirtsstamm ein effizienter Cellulose-Abbauweg eingeschleust wird.
Zusätzliche wünschenswerte Charakteristika können nützlich sein, um die Produktion von Ethanol durch den Wirt zu verstärken. So kann bspw. der Einschluss von heterologen Enzymen und Wegen, die den Bereich des Substratzuckers vergrößern, durchgeführt werden. Ein „Tuning" des Stammes kann durch das Hinzufügen verschiedener anderer Merkmale erreicht werden, oder aber die Wiederherstellung bestimmter endogener Merkmale, die wünschenswert sind, die jedoch während der Rekombinationsschritte verloren gegangen sind.
23. Verleihen von Cellulase-Aktivität
Eine riesige Anzahl an Cellulasen und Cellulase-Abbausystemen sind für Pilze, Bakterien und Hefen beschrieben worden (siehe die Übersichtsartikel von Beguin, P. und Aubert, J-P (1994) FEMS Microbiol. Rev. 13: 25–58; Ohima, K et al. (1997) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 14: 365–414). Ein enzymatischer Weg, der für eine effiziente Zuckerumwandlung von Cellulose notwendig ist, benötigt die synergistische Wirkung von Endoglucanasen (Endo-1,4-β-D-glucanasen, EC 3.2.1.4), Exocellobiohydrolasen (Exo-1,4-β-D-glucanasen, EX 3.2.1.91) und β-Glucosidasen (Cellobiasen, 1,4-β-D-Glucanasen EC 3.2.1.21) (9). Die heterologe Produktion von Cellulaseenzymen in den Ethanol-toleranten Stämmen würde die Zuckerumwandlung von Cellulose ermöglichen, wodurch monomere Zucker entstehen, die durch den Organismus für die Ethanolproduktion verwendet werden können. Es gibt mehrere Vorteile für die heterologe Expression eines funktionellen Cellulasewegs in den Ethanol-toleranten Stämmen. So würde bspw. der SSF-Prozess die Notwendigkeit eines getrennten Bioprozessierungsschritts für die Zuckerumwandlung eliminieren und würde die Endprodukt-Inhibierung der Cellulaseenzyme durch akkumulierte Zwischenverbindungen und Produktzucker verbessern.
Natürlich vorkommende Cellulasewege werden in die Ethanol-toleranten Stämme eingefügt, oder es können herkömmlich verbesserte „Hybrid"-Cellulasewege ausgewählt werden, wobei die koordinierte Wirkung der Cellulasen eingesetzt wird, die aus unterschiedlichen natürlichen Quellen gewonnen wurden, einschließlich aus thermophilen Stämmen.
Bisher wurden mehrere Cellulasen aus Nicht-Saccharomyces hergestellt und erfolgreich aus diesem Organismus sekretiert, einschließlich bakterieller, Pilz- und Hefeenzyme, z.B. T. reesei CBH I ((Shoemaker (1994), in „The Cellulase System of Trichoderma reesei: Trichoderma strain improvement and Expression of Trichoderma cellulases in Yeast", Online, Pinner, UK, 593–600). Es ist möglich, direkte Stoffwechsel-Konstruktionstechniken einzusetzen, um in Saccharomyces eine Cellulaseaktivität zu erzeugen. Auch konnte die Hefe dazu gebracht werden, sich durch Protoplastenfusion Elemente von Cellulose-Abbauwegen anzueignen (bspw. sind intergenerische Hybride von Saccharomyces cerevisiae und Zygosaccharomyces fermentati, eine Cellobiase-produzierende Hefe, gebildet worden (Pina A. et al. (1986) Appl. Environ. Microbiol. 51: 995–1003). Im Allgemeinen könnte jedes Cellulase-Komponentenenzym, das von einem nahe verwandten Hefeorganismus abgeleitet ist, durch Protoplastenfusion übertragen werden. Cellobiasen, die von einem etwas breiteren Bereich an Hefen produziert werden, kön nen durch Gesamtgenom-Shuffling in einem seiner vielen Formate zugänglich gemacht werden (d.h. gesamt, fragmentiert, YAC-basierend).
Optimalerweise sollten die zu verwendenden Cellulaseenzyme eine gute Synergie aufweisen, ferner einen hinreichenden Expressions- und Sekretionslevel aus dem Wirt, eine gute Spezifitäts-Aktivität (d.h. die Resistenz gegenüber abbauenden Faktoren und Enzymmodifizierungen des Wirtes) und eine Stabilität in der erwünschten SSF-Umgebung. Ein Beispiel eines Hybrid-Celluloseabbauweges mit einer ausgezeichneten Synergie schließt die folgenden Enzyme mit ein: CBH I Exocellobiohydrolase aus Trichoderma reesei, die Endoglucanase aus Acidothermus cellulolyticus E1 und die Exocellulase aus Thermomonospera fusca E3 (Baker et al. (1998) Appl. Biochem. Biotechnol. 70–72: 395–403).
Vorliegend wird vorgeschlagen, dass diese Enzyme (oder deren verbesserte Mutanten) für einen Einsatz in dem SSF-Organismus geeignet sind, zusammen mit einer Cellobiase (β-Glucosidase), z.B. diejenige von Candida peltata. Andere mögliche Cellulasesysteme, die in Frage kommen, sollten eine besonders gute Aktivität gegenüber kristalliner Cellulose besitzen, wie bspw. das Cellulasesystem von T. reesei (Teeri, TT, et al. (1998) Biochem. Soc. Trans. 26: 173–178), oder sollte besonders gute Thermostabilitäts-Merkmale aufweisen (bspw. Cellulasesysteme aus thermophilen Organismen, wie bspw. Thermomonospora fusca (Zhang, S., et al. (1995) Biochem. 34: 3386–335).
Ein rationaler Ansatz für die Klonierung von Cellulasen in Ethanol-tolerante Hefewirtsstämme könnte eingesetzt werden. So werden bspw. bekannte Cellulase-Gene in Expressionskassetten kloniert, und zwar unter Verwendung von S. cerevisiae-Promotersequenzen, und die resultierenden linearen DNA-Fragmente können in den Empfängerwirt dadurch transformiert werden, dass kurze Hefesequenzen an den Termini platziert werden, um eine Stellen-spezifische Integration in das Genom zu fördern. Dies ist gegenüber einer Plasmid-Transformation bevorzugt, und zwar aus Gründen der genetischen Stabilität und Aufrechterhaltung der zu transformierenden DNA.
Wenn ein gesamter Cellulose-Abbauweg eingeführt würde, so könnte eine Selektion in einem Agar-Platten-basierenden Format angewandt werden, und eine große Anzahl an Klonen könnte innerhalb kurzer Zeit hinsichtlich Cellulase-Aktivität untersucht werden. So könnte bspw. die Selektion hinsichtlich einer Exocellulase dadurch ermöglicht werden, dass ein lösliches Oligocellulosesubstrat oder Carboxymethylcellulose (CMC) als einzige Kohlenstoffquelle dem Wirt zur Verfügung gestellt wird, der andererseits nicht dazu in der Lage wäre, auf Agar, der diese Substanzen als einzige Kohlenstoffquelle enthält, zu wachsen. Klone, die die aktiven Cellulasewege produzieren, würden auf Grund deren Fähigkeit, Glucose zu produzieren, wachsen.
Wenn die unterschiedlichen Cellulasen nacheinander eingeführt werden würden, wäre es auf der anderen Seite nützlich, zunächst eine Cellubiase einzuführen, wodurch eine Selektion unter Verwendung kommerziell erhältlicher Cellobiose als einzige Kohlenstoffquelle ermöglicht wäre. Gegenwärtig sind mehrere Stämme an S. cerevisiae, die dazu in der Lage sind, auf Cellubiose zu wachsen, durch die Einführung eines Cellubiase gens hergestellt worden (bspw. Rajoka MI, et al. (1998) Fioia Microbiol. (Praha) 43: 129–135; Skory, CD, et al. (1996) Curr. Genet. 30: 417–422; D'Auria, S. et al. (1996) Appl. Biochem. Biotechnol. 61: 157–166; Adam, AC, et al. (1995) Yeast 11: 395–406; Adam, AC, et al. (1991) Curr. Genet. 20: 5–8).
Eine darauf folgende Transformation dieses Organismus mit der CBHI-Exocellulase kann hinsichtlich Wachstum auf einem Cellulosesubstrat, wie bspw. Carboxymethylcellulose (CMC), selektiert werden. Schlussendlich wird durch das Hinzufügen einer Endoglucanase ein Hefestamm generiert, der eine verbesserte kristalline Abbaufähigkeit besitzt.
24. Übertragen der Pentosezuckerverwertung
Der Einschluss von Pentosezucker-Verwertungswegen stellt einen wichtigen Aspekt für einen möglicherweise nützlichen SSF-Organismus dar. Die erfolgreiche Expression von Xylosezucker-Verwertungswegen für die Ethanolproduktion konnte in Saccharomyces gezeigt werden (siehe bspw. Chen, ZD und Ho, NWY (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 39/40: 135–147).
Es wäre ferner nützlich, für die Ethanolproduktion im Saccharomyces-Wirt eine Verwertung von L-Arabinose-Substraten zu erreichen. Hefestämme, die L-Arabinose verwerten, schließen einige Candida und Pichia spp. mit ein (McMillan JD und Boynton BL (1994) Appl. Biochem. Biotechnol. 45–46: 569–584; Dien BS, et al. (1996) Appl. Biochem. Biotechnol. 57–58: 233–242). Die Gene, die für eine Arabinosefermentierung in E. coli notwendig sind, könnten ebenfalls durch sinnvolle Mittel eingeführt wer den (wie bspw. zuvor in Z. mobilis durchgeführt wurde (Deanda K, et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465–4470)).
25. Übertragen anderer nützlicher Aktivitäten
Mehrere andere Merkmale, die für die Optimierung eines SSF-Stammes wichtig sind, konnten nachgewiesenermaßen auf S. cerevisiae übertragen werden. Wie die Hitzetoleranz, die Cellulase-Aktivität und die Verwertung von Pentosezucker muss normalerweise Saccharomyces diese Merkmale nicht zeigen (oder der besondere Stamm von Saccharomyces, der als Wirt verwendet wird), und diese Merkmale können über genetische Verfahren hinzugefügt werden. So wurde bspw. die Expression der menschlichen Muskel-Acylphosphatase in S. cerevisiae vorgeschlagen, um die Ethanolproduktion zu steigern (Rougei, G., et al. (1996) Biotechnol. App. Biochem. 23: 273–278).
Es kann passieren, dass entwickelte, Stress-tolerante SSF-Stämme sich einige unerwünschte Mutationen im Verlauf der Evolutions-Strategie aneignen. Tatsächlich stellt dies bei Stammverbesserungs-Strategien, die lediglich auf Mutagenesetechniken basieren, ein erhebliches Problem dar, und kann zu äußerst instabilen oder fragilen Produktionsstämmen führen. Es ist möglich, einige dieser erwünschten Merkmale durch sinnvolle Verfahren, wie bspw. die Klonierung von spezifischen Genen, die ausgeschaltet wurden oder die in den vorherigen Runden der Stammverbesserung negativ beeinflusst wurden, wieder herzustellen. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Spezifität – das störende Gen kann direkt angepeilt werden. Der Nachteil ist es, dass es zeitaufwändig und wiederholungsintensiv ist, wenn mehrere Gene geschädigt wurden, und dadurch werden lediglich Probleme angesprochen, die charakterisiert wurden. Ein bevorzugter (und traditionellerer) Ansatz für die Entfernung von unerwünschten/schädlichen Mutationen ist es, den entwickelten Stamm zu einem erwünschten Elternstamm (bspw. der ursprüngliche „Wirts"-SSF-Stamm) zurückzukreuzen. Diese Strategie konnte im Verlaufe der Stammverbesserung erfolgreich eingesetzt werden, wo diese Möglichkeit gegeben war (d.h. für Organismen, die sexuelle Reproduktionszyklen besitzen). Fehlte der Vorteil eines sexuellen Prozesses, wurde dies durch andere Verfahren erreicht, wie bspw. durch parasexuelle Rekombination oder Protoplastenfusion. So wurde bspw. die Fähigkeit, Flocken zu bilden, auf einen nicht-Flocken-bildenden Stamm von S. cerevisiae übertragen, und zwar durch Protoplastenfusion mit einem Flocken-bildenden-kompetenten S. cerevisiae-Stamm (Watari, J., et al. (1990) Agric. Biol. Chem. 54: 1667–1681).
N. IN VITRO-GESAMTGENOM-SHUFFLING
Das Shuffling großer DNA-Sequenzen, wie bspw. von eukaryotischen Chromosomen, ist durch im Stand der Technik bekannte, in vitro-Shuffling-Verfahren schwierig. Ein Verfahren zur Überwindung dieser Einschränkungen ist hierin beschrieben.
Die Zellen verwandter eukaryotischer Spezies werden vorsichtig lysiert und die intakten Chromosomen freigesetzt. Die freigesetzten Chromosomen werden anschließend durch FACS oder ähnliche Verfahren (wie bspw. Pulsfeld-Elektrophorese) sortiert, wobei Chromosomen mit einer ähnlichen Größe zusammen abgeschieden werden. Jede Größenfraktion der sortierten Chromosomen stellt allgemein einen Pool analoger Chromosomen dar, wie bspw. das Y-Chromosom verwandter Säugetiere. Das erste Ziel ist es, intakte Chromosomen zu isolieren, die nicht irreversibel geschädigt wurden.
Die Fragmentierung und der Wiederzusammenbau solch großer komplexer DNA-Stücke, unter Einsatz von DNA-Polymerasen, ist schwierig und durch diese Verfahren würde sehr wahrscheinlich ein unakzeptabler hoher Level an Zufallsmutationen eingeführt. Ein alternativer Ansatz, bei welchem Restriktionsenzyme und DNA-Ligasen eingesetzt werden, stellt eine machbare und weniger destruktive Lösung dar. Eine chromosomale Fraktion wird mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen, die lange DNA-Sequenzen (~15–20 bp) erkennen, verdaut, wie bspw. die Intron- und Intein-kodierten Endonucleasen (I-PpoI, I-CeuI, PI-PspI, PI-TliI, PI-SceI (VDE). Diese Enzyme schneiden jeweils nur wenige Male innerhalb jedes Chromosoms, was zu einer kombinatorischen Mischung großer Fragmente führt, von denen jedes einzelsträngige, überhängende Termini aufweist, die zu anderen Stellen komplementär sind, die durch das gleiche Enzym geschnitten wurden.
Der Verdau wird ferner durch eine sehr kurze Inkubation mit einer einzelsträngigen Exonuclease modifiziert. Die Polarität der Nuclease wird unabhängig von dem einzelsträngigen Überhang ausgewählt, der von dem ausgewählten Restriktionsenzym abhängt. 5'-3'-Exonucleasen für 3'-Überhänge und 3'-5'-Exonucleasen für 5'-Überhänge. Dieser Verdau resultiert in sehr lange Regionen von ssDNA-Überhängen an jedem ds-DNA-Terminus. Das Ziel dieser Inkubation ist es, DNA-Regionen zu generieren, die spezifische DNA-Regionen definieren, in denen eine Rekombination stattfinden kann. Die Fragmente werden anschließend unter Bedingungen inkubiert, unter welchen die Enden der Frag mente mit anderen Fragmenten ausgerichtet werden, die homologe ssDNA-Termini besitzen. Oftmals werden die zwei miteinander auszurichtenden Fragmente von unterschiedlichen Chromosomen herrühren und werden in Gegenwart der DNA-Lipase kovalent verbunden, wodurch ein chimäres Chromosom gebildet wird. Dadurch entsteht eine genetische Diversität, mit welcher das Crossingover homologer Chromosomen nachgeahmt wird. Die vollständige Ligationsreaktion wird eine kombinatorische Mischung aller möglicher Ligationen von Fragmenten enthalten, die homologe Überhangtermini besitzen. Eine Untereinheit dieser Population wird vollständig chimäre Chromosomen aufweisen.
Um die neu zusammengesetzte Bibliothek zu screenen, werden die Chromosomen in einen geeigneten Wirt überführt, und zwar derart, dass die Chromosomen gesamt aufgenommen und exprimiert werden können. So können bspw. YACs (yeast artificial chromosomes, künstliche Hefechromosomen) durch Protoplastenfusion in eukaryotische Zellen eingeschleust werden. Auf diese Weise könnte die zusammengesetzte Bibliothek in Liposomen eingekapselt und mit Protoplasten der geeigneten Wirtszelle fusioniert werden. Die resultierenden Transformanten würden vermehrt und hinsichtlich der erwünschten zellulären Verbesserungen gescreent werden. Sobald die verbesserte Population identifiziert wäre, würden die Chromosomen isoliert, neu zusammengesetzt und rekursiv gescreent werden.
O. GESAMTGENOM-SHUFFLING NATÜRLICH KOMPETENTER MIKROORGANISMEN
Die natürliche Kompetenz ist ein Phänomen, das bei einigen mikrobiellen Spezies beobachtet wird, wobei einzelne Zellen DNA aus der Umgebung aufnehmen und sie durch homologe Rekombination in ihr Genom einbauen. Bacillus subtilis und Acetinetobacter spp. sind bekanntermaßen bei diesem Prozess besonders effizient. Ein Verfahren für das Gesamtgenom-Shuffling (WGS, whole genome shuffling) dieser und analoger Organismen ist hierin beschrieben, wobei dieser Prozess eingesetzt wird.
Ein Ziel des Gesamtgenom-Shufflings ist die schnelle Anhäufung nützlicher Mutationen aus einer Population von einzelnen Stämmen in einen überragenden Stamm. Wenn die zu entwickelnden Organismen natürlich kompetent sind, wird eine „split-pooled"-Strategie für die rekursive Transformation natürlich kompetenter Zellen mit DNA, die aus dem Pool herrührt, diesen Prozess bewirken. Ein beispielhaftes Verfahren lautet wie folgt.
Eine Population natürlich kompetenter Organismen, die eine Vielzahl von nützlichen Merkmalen aufweist (wie bspw. eine erhöhte Proteinsekretion), wird identifiziert. Die Stämme werden gepoolt, und der Pool wird anschließend aufgeteilt. eine Hälfte des Pools wird als gDNA-Quelle verwendet, wobei die andere Hälfte dazu verwendet wird, einen Pool natürlich kompetenter Zellen zu generieren.
Die kompetenten Zellen werden in Gegenwart der gepoolten gDNA wachsen gelassen, um eine DNA-Aufnahme und eine DNA-Rekombination zu ermöglichen. Die Zellen des einen Genotyps nehmen gDNA aus Zellen eines unterschiedlichen Typs auf und bauen diese ein, wodurch Zellen mit chimären Genomen gebildet werden. Das Ergebnis ist eine Zellpopulation, die eine kombina torische Mischung der genetischen Variationen darstellt, die aus dem ursprünglichen Pool herrühren. Diese Zellen werden wieder gepoolt und mit der gleichen DNA-Quelle wieder transformiert. Dieser Prozess wird wiederholt durchgeführt, um die Diversität der Genome der Zellen zu erhöhen, die aus der Transformation herrühren. Ist eine hinreichend große Diversität einmal generiert, so wird die Zellpopulation hinsichtlich neuer chimärer Organismen gescreent, welche die erwünschten Verbesserungen zeigen.
Dieses Verfahren wird durch ein Erhöhen der natürlichen Kompetenz des Wirtsorganismus verstärkt. COMS ist ein Protein, das, wenn es in B. subtilis exprimiert wird, die Effizienz der natürlichen Kompetenz, die durch eine Transformation vermittelt wird, um mehr als eine Größenordnung verstärkt.
Es konnte gezeigt werden, dass ca. 100% der Zellen, die das Plasmid pCOMS tragen, genomische DNA-Fragmente in ihre Genome aufnehmen und rekombinieren. Im Allgemeinen rekombinieren ungefähr 10% des Genoms in jeder vorgegebenen transformierten Zelle. Diese Beobachtung wurde wie folgt nachgewiesen.
Ein B. subtilis-Stamm mit pCOMS, der für zwei Nährstoffmarker auxotroph war, wurde mit genomischer DNA (gDNA) transformiert, die aus einem prototrophen Stamm des gleichen Organismus isoliert wurde. 10% der Zellen, die der DNA ausgesetzt wurden, waren hinsichtlich einem der zwei Nährstoffmarker prototroph. Die durchschnittliche Größe des DNA-Stranges, der durch B. subtilis aufgenommen wurde, betrug ungefähr 50 kb oder ~2% des Genoms. Damit hatte eine von zehn Zellen jeweils einen Marker rekombiniert, der in einem von 50 Molekülen der aufge nommenen gDNA jeweils vorlag. Aus diesen Gründen nehmen die meisten Zellen ungefähr fünf 50 kb-Moleküle oder 10% des Genoms auf und rekombinieren mit diesen. Dieses Verfahren stellt ein wirksames Werkzeug zur schnellen und effizienten Rekombination gesamter mikrobieller Genome dar.
In Abwesenheit von pCOMS nehmen lediglich 0,3% der Zellen, die für eine natürliche Kompetenz hergestellt wurden, einen spezifischen Marker auf und integrieren diesen. Dies legt nahe, dass ungefähr 15% der Zellen tatsächlich einer Rekombination mit einem einzelnen genomischen Fragment unterzogen wurden. Daher produziert eine rekursive Transformationsstrategie, wie oben beschrieben, eine neu zusammengesetzte Gesamtgenom-Bibliothek, sogar in Abwesenheit von pCOMS. Jedoch werden in Abwesenheit von pCOMS die komplexen Genome einen kleineren, aber immer noch Screening-fähigen Prozentsatz der transformierten oder neu zusammengesetzten Population darstellen.
P. KONGRESSION
Eine Kongression ist die Integration von zwei unabhängig verbundenen Markern in eine Zelle. 0,3% natürlich kompetenter B. subtilis-Zellen integrieren einen einzelnen Marker (wie oben beschrieben). Von diesen haben ungefähr 10% einen zusätzlichen Marker aufgenommen. Wenn daher hinsichtlich der Integration eines spezifischen Markers selektiert oder gescreent wird, werden somit 10% der resultierenden Population einen anderen spezifischen Marker integriert haben. Dies stellt einen Weg für die Anreicherung spezifischer Integrationsereignisse dar.
Wenn bspw. die Integration eines Gens kontrolliert wird, welches nicht einfach gescreent oder selektiert werden kann, wird es bei 0,3% der Zellpopulation existieren. Wenn die Population zunächst hinsichtlich eines spezifischen Integrationsereignisses selektiert wird, wird die erwünschte Integration in 10% der Population gefunden werden. Dies stellt eine signifikante (ungefähr 30fache) Anreicherung für das erwünschte Ereignis dar. Diese Anreicherung wird als „Kongressionseffekt" bezeichnet. Der Kongressionseffekt wird nicht durch das Vorliegen von pCOMS beeinflusst, weshalb der „pCOMS-Effekt" einfach ist, um den Prozentsatz natürlich kompetenter Zellen, die wahrhaftig natürlich kompetent sind, von ungefähr 15% in dessen Abwesenheit zu 100% in dessen Gegenwart zu steigern. Alle kompetenten Zellen nehmen ungefähr die gleiche DNA-Menge oder ~10% des Bacillusgenoms immer noch auf.
Der Kongressionseffekt kann in den folgenden Beispielen eingesetzt werden, um das Gesamtgenom-Shuffling zu verstärken, ebenso wie die gezielte Integration von zusammengesetzten Genen in das Chromosom.
Q. B. SUBTILIS-SHUFFLING
Eine Population an B. subtilis-Zellen mit erwünschten Eigenschaften wird identifiziert, gepoolt und wie oben beschrieben neu zusammengesetzt, mit einer Ausnahme: ist die gepoolte Population einmal aufgeteilt, so wird die eine Hälfte der Population mit einem Antibiotikum-Selektionsmarker transformiert, der von einer Sequenz flankiert ist, die dessen Integration und die Unterbrechung eines spezifischen Nährstoffgens erzielt, wie bspw. eines, das bei der Aminosäurebiosynthe se beteiligt ist. Die Transformanten, die gegenüber dem Arzneimittel resistent sind, sind hinsichtlich diesem Nährstoff auxotroph. Die resistente Population wird gepoolt und unter Bedingungen kultiviert, welche die Population natürlich kompetent machen (oder wahlweise zuerst mit pCOMS transformiert).
Die kompetenten Zellen werden anschließend mit gDNA transformiert, welche aus dem ursprünglichen Pool isoliert wurde, und die prototrophen Zellen werden selektiert. Die prototrophe Population wird einer Rekombination mit genomischen Fragmenten unterzogen worden sein, welche für eine funktionelle Kopie des Nährstoffmarkers kodieren, und werden daher hinsichtlich Zellen angereichert, welche einer Rekombination an anderen genetischen Loci durch den Kongressionseffekt unterzogen worden sind.
R. GEZIELTES EINBAUEN VON GENEN UND GEN-BIBLIOTHEKEN IN DAS CHROMOSOM
Es ist nützlich, Gene oder Gen-Bibliotheken direkt in eine spezifische Chromosomen-Location einer Zelle effizient übertragen zu können. Wie oben dargestellt, werden die Zielzellen mit einem positiven Selektionsmarker transformiert, der von Sequenzen flankiert ist, die dessen homologe Rekombination in das Chromosomen erzielen. Die selektierten Zellen, die den Marker tragen, werden natürlich kompetent gemacht (mit oder ohne pCOMS, jedoch vorzugsweise Ersteres) und werden mit einer Mischung von zwei Sets an DNA-Fragmenten transformiert. Das erste Set enthält ein Gen oder eine zusammengesetzte Gen-Bibliothek, von denen jedes mit einer Sequenz flankiert ist, um dessen Integration in einen spezifischen chromosomalen Locus zu bewirken. Das zweite Set enthält einen positiven Selektionsmarker (unterschiedlich von dem ersten, der in die Zellen integriert wurde), flankiert von Sequenzen, mit welchen dessen Integration und der Austausch des ersten positiven Selektionsmarkers erreicht werden kann. Unter optimalen Bedingungen ist die Mischung derart, dass das Gen oder die Gen-Bibliothek in molarem Überschuss im Vergleich zum positiven Selektionsmarker vorliegt. Anschließend werden die Transformanten hinsichtlich Zellen selektiert, die den neuen positiven Marker enthalten. Diese Zellen werden nach Zellen angereichert, die eine Kopie des erwünschten Gens oder Gen-Bibliothek durch den Kongressionseffekt eingebaut haben, und können direkt hinsichtlich Zellen gescreent werden, die das Gen oder Genvarianten von Interesse tragen. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung von PCR-Fragmenten < 10 kb durchgeführt, und es wurde herausgefunden, dass unter Einsatz des Kongressionseffektes eine Population angereichert werden kann, so dass 50% der Zellen Kongreganten sind. Auf diese Weise enthielt eine von zwei Zellen ein Gen oder eine Genvariante.
Alternativ kann dem Expressionswirt der erste positive Selektionsmarker fehlen und die kompetenten Zellen werden mit einer Mischung der Zielgene in einer begrenzten Menge des ersten positiven Selektionsmarkerfragments transformiert. Zellen, die hinsichtlich des positiven Markers selektiert wurden, werden hinsichtlich der erwünschten Eigenschaften in den Zielgenen gescreent. Die verbesserten Gene werden durch PCR amplifiziert, wiederum neu zusammengesetzt und anschließend in den ursprünglichen Wirt zurücküberführt, wiederum mit dem ersten positiven Selektionsmarker. Dieser Prozess wird rekursiv so lange durchgeführt, bis die erwünschte Funktion der Gene er reicht ist. Mit diesem Verfahren wird vermieden, dass ein primärer Wirtsstamm konstruiert werden muss und zwei positive Marker benötigt werden.
X. VERBESSERUNG ÜBEREXPRIMIERTER GENE HINSICHTLICH EINES ERWÜNSCHTEN PHÄNOTYPS
Die Verbesserung einer zellulären Eigenschaft oder eines Phänotyps wird oftmals durch die Erhöhung der Kopienanzahl oder durch die Erhöhung der Expression von Genen verstärkt, die bei der Expression dieser Eigenschaft beteiligt sind. Die Gene, die auf die erwünschte Eigenschaft einen solchen Effekt haben, können auch durch DNA-Shuffling verbessert werden, damit sie einen ähnlichen Effekt besitzen. Eine genomische DNA-Bibliothek wird hierzu in einen überexprimierenden Vektor kloniert und in eine Zielzellpopulation derart transformiert, dass die genomischen Fragmente in den Zellen, die hinsichtlich des Vorliegens des überexprimierenden Vektors selektiert wurden, stark exprimiert werden. Die selektierten Zellen werden anschließend hinsichtlich der Verbesserung einer gewünschten Eigenschaft gescreent. Der überexprimierende Vektor wird aus den verbesserten Zellen isoliert und die klonierten genomischen Fragmente neu zusammengesetzt. Das genomische Fragment, das auf dem Vektor jedes verbesserten Isolats getragen wird, wird unabhängig von oder mit identifizierten homologen Genen (Familien-Shuffling) neu zusammengesetzt. Die neu zusammengesetzten Bibliotheken werden anschließend in eine Zellpopulation zurücküberführt und die selektierten Transformanten hinsichtlich weiterer Verbesserung in der erwünschten Eigenschaft neu gescreent. Dieses Shuffling/Screening-Verfahren wird rekursiv durch Zyklen wiederholt, und zwar so lange, bis die erwünschte Eigenschaft auf das erwünschte Level optimiert worden ist.
Wie oben festgestellt, kann durch eine Gen-Dosierung eine erwünschte zelluläre Eigenschaft stark verstärkt werden. Ein Verfahren zur Erhöhung der Gen-Kopienanzahl von unbekannten Genen ist die Verwendung eines Verfahrens der Zufallsamplifizierung (siehe auch Mavingui et al. (1997) Nature Biotech, 15: 564). Bei diesem Verfahren wird eine genomische Bibliothek in einen Suizidvektor kloniert, der einen Selektionsmarker enthält, welcher auch bei einer höheren Dosierung für einen verstärkten Phänotyp sorgt. Ein Beispiel eines solchen Markers ist das Kanamycin-Resistenzgen. Mit einer schrittweise erhöhten Kopienanzahl wird die Resistenz zu schrittweise erhöhten Leveln an Kanamycin erreicht. Die genomische Bibliothek wird durch irgendeines von verschiedenen Verfahren in eine Zielzelle eingeschleust, einschließlich der Transformation, Transduktion, Konjugation, etc. Die Zellen, die den Vektor durch homologe Rekombination zwischen dem Vektor und chromosomalen Kopien der klonierten Gene in das Chromosomen eingebaut haben, können dadurch selektiert werden, dass sie die Expression des Selektionsmarkers unter Bedingungen benötigen, unter denen der Vektor nicht repliziert. Dieses Rekombinationsereignis resultiert in die Duplizierung des klonierten DNA-Fragments im Wirts-Chromosom, wobei eine Kopie des Vektors und des Selektionsmarkers die zwei Kopien trennt. Die Population der überlebenden Zellen wird hinsichtlich der Verbesserung einer erwünschten zellulären Eigenschaft gescreent, die aus dem Gen-Duplizierungsereignis herrührt. Weitere Gen-Duplizierungsereignisse, die in zusätzliche Kopien des ursprünglich klonierten DNA-Fragments resultieren, können durch eine weitere Vermehrung der Zellen unter schrittweise stringenteren Selektionsbedingungen erreicht werden, d.h. erhöhte Konzentrationen an Kanamycin. In diesem Fall wird für die Auswahl eine erhöhte Kopienanzahl des Selektionsmarkers benötigt, was jedoch auch mit einer erhöhten Kopienanzahl des erwünschten Genfragments einhergeht. Die überlebenden Zellen werden hinsichtlich einer Verbesserung in dem erwünschten Phänotyp gescreent. Die resultierende Zellpopulation resultiert wahrscheinlich in die Amplifizierung unterschiedlicher Gene, da oftmals viele Gene einen vorgegebenen Phänotyp bewirken. Um eine Bibliothek der möglichen Kombinationen dieser Gene herzustellen, wird die ursprünglich ausgewählte Bibliothek, die die phänotypischen Verbesserungen zeigt, rekombiniert, und zwar unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren, d.h. bspw. Protoplastenfusion, aufgeteilte „split pool"-Transduktion, Transformation, Konjugation, etc.
Die rekombinierten Zellen werden hinsichtlich der erhöhten Expression des Selektionsmarkers selektiert. Die überlebenden Zellen werden hinsichtlich Zellen angereichert, die zusätzliche Kopien der Vektorsequenz durch homologe Rekombination eingebaut haben, und diese Zellen werden hinsichtlich denjenigen angereichert, die kombinierte Duplikationen unterschiedlicher Gene festsetzen. In anderen Worten, die Duplizierung aus einer Zelle des verstärkten Phänotyps wird mit der Duplizierung einer anderen Zelle des verstärkten Phänotyps kombiniert. Diese überlebenden Zellen werden hinsichtlich weiterer Verbesserungen in dem erwünschten Phänotyp gescreent. Dieses Verfahren wird rekursiv so lange wiederholt, bis der erwünschte Level der Phänotyp-Expression erreicht ist.
Alternativ werden diejenigen Gene, die zuvor identifiziert wurden, oder von denen angenommen wird, dass sie gut für eine erhöhte Kopienanzahl sind, in Tandem-Form in geeignete Plasmidvektoren kloniert. Diese Vektoren werden anschließend transformiert und in einem geeigneten Wirtsorganismus vermehrt. Die Plasmid-Plasmid-Rekombination zwischen den klonierten Gen-fragmenten resultiert in eine weitere Duplizierung der Gene. Die Auflösung des Plasmid-Dupletts kann in einer ungleichen Verteilung der Gen-Kopienanzahl resultieren, wobei einige Plasmide zusätzliche Genkopien und andere Plasmide wenigere Genkopien aufweisen können. Die Zellen, die diese Plasmidverteilung tragen, werden anschließend hinsichtlich einer Verbesserung des Phänotyps gescreent, der durch die Gen-Duplizierungen bewirkt wird.
Zusammenfassend dargestellt, ist ein Verfahren zur Selektion einer erhöhten Kopienanzahl einer Nucleinsäuresequenz durch das oben beschriebene Verfahren möglich. In dem Verfahren wird eine genomische Bibliothek in einem Suizidvektor, wie oben beschrieben, verwendet, der einen Dosierungs-empfindlichen Selektionsmarker trägt. Die genomische Bibliothek wird in eine Population von Zielzellen transduziert. Die Zielzellen werden in eine Population von Zielzellen selektiert, und zwar mit ansteigenden Dosierungen des Selektionsmarkers unter Bedingungen, unter welchen der Suizidvektor sich nicht episomal repliziert. Eine Vielzahl von Zielzellen wird hinsichtlich des erwünschten Phänotyps selektiert, rekombiniert und wieder selektiert. Dieses Verfahren wird rekursiv – wenn erwünscht – so lange wiederholt, bis der erwünschte Phänotyp erhalten wird.
Y. STRATEGIEN ZUR VERBESSERUNG DES GENOM-SHUFFLINGS DURCH TRANSFORMATION LINEARER DNA-FRAGMENTE
Wildtyp-Mitglieder der Enterobacteriaceae (bspw. Escherichia coli) sind typischerweise gegenüber einem genetischen Austausch, der auf eine Transformation linearer DNA-Moleküle folgt, resistent. Dies ist zumindest teilweise auf die Exonuclease V (Exo V)-Aktivität des RecBCD-Holoenzyms zurückzuführen, welche lineare DNA-Moleküle nach einer Transformation schnell abbaut. Die Produktion von Exo V wurde auf das RecD-Gen zurückgeführt, welches für die D-Untereinheit des Holoenzyms kodiert. Wie durch Russel et al. (1989), Journal of Bacteriology 2609–2613 gezeigt wurde, kann die homologe Rekombination zwischen einem transformierten linearen Donor-DNA-Molekül und dem Chromosom des Empfängers einfach in Stämmen beobachtet werden, die eine Funktionsverlusts-Mutation in einer RecD-Mutante tragen. Die Verwendung von RecD-Stämmen stellt ein einfaches Mittel für das Genom-Shuffling der Enterobacteriaceae dar. So wird bspw. ein bakterieller Stamm oder ein Set von verwandten Stämmen, die eine RecD-Null-Mutation tragen (bspw. das E. coli recD1903::mini-Tet-Allel), mutagenisiert und hinsichtlich der erwünschten Eigenschaften gescreent. Nach Art des Split-Pool-Verfahrens könnte die präparierte chromosomale DNA aus einem Aliquot zur Transformation des zweiten Aliquots verwendet werden (bspw. durch Elektroporation oder chemisch induzierte Kompetenz). Die resultierenden Transformanten werden anschließend hinsichtlich der Verbesserung gescreent oder vor dem Screening rekursiv transformiert.
Die Verwendung von RecE/recT, wie oben beschrieben, kann die homologe Rekombination linearer DNA-Fragmente verbessern.
Das RecBCD-Holoenzym spielt bei der Initiierung der RecA-abhängigen homologen Rekombination eine wichtige Rolle. Sobald das RecBCD-Enzym ein dsDNA-Ende erkennt, wickelt es die DNA auf und baut diese asymmetrisch in 5'-3'-Richtung so lange ab, bis es auf eine Chi (oder „X")-Stelle (Consensus 5'-GCTGGTGG-3') trifft, die die Nucleaseaktivität bremst. Dies resultiert in die Herstellung einer ssDNA, die nahe der c-Stelle mit einem 3'-ssDNA-Schwanz endet, der für die Beladung mit RecA bevorzugt ist und für den nachfolgenden Einbau von dsDNA für die homologe Rekombination. Dementsprechend kann das Vorprozessieren von zu transformierenden Fragmenten mit einer 5'-3'-spezifischen ssDNA-Exonuclease, wie bspw. eine Lamda (λ)-Exonuclease (bspw. erhältlich von Boeringer Mannheim) vor der Transformation dazu dienen, die homologe Rekombination in einem recD^–-Stamm zu stimulieren, und zwar durch Bereitstellen eines ssDNA-invasiven Endes für die Beladung mit RecA und einem nachfolgenden Strangeinbau.
Das Hinzufügen von DNA-Sequenz-kodierenden Chi-Stellen (Consensus 5'-GCTGGTGG-3') an DNA-Fragmente kann sowohl der Verzögerung der Exonuclease V-Aktivität dienen als auch die homologe Rekombination stimulieren, wodurch die Notwendigkeit für eine recD-Mutation vermieden wird (siehe auch Kowalczykowski et al. (1994) „Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli", Microbiol. Rev. 58: 401–465, und Jessen et al. (1998) „Modification of bacterial artificial chromosomes through Chi-stimulated homologous recombination and its appli cation in zebrafish transgenesis." Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 5121–5126).
Die Chi-Stellen sind wahlweise in Linker eingeschlossen, die mit den Enden der transformierenden Fragmente ligiert sind, oder aber die in die externen Primer eingebaut sind, die zur Herstellung von zu transformierenden DNA-Fragmenten verwendet werden. Die Verwendung von Rekombinations-stimulatorischen Sequenzen, wie bspw. der Chi-Stelle, stellt einen allgemein nützlichen Ansatz für die Entwicklung eines breiten Bereiches von Zelltypen durch die Fragmenttransformation dar.
Verfahren zur Inhibierung oder zur Mutation von Analogen zu Exo V oder anderen Nucleasen (wie bspw. Exonuclease I (endA1), III (nth), IV (nfo), VII und VIII von E. coli) sind ebenfalls nützlich. Die Inhibierung oder die Eliminierung von Nucleasen oder die Modifizierung von Enden von zu transformierenden DNA-Fragmenten, um sie gegenüber der Exonucleaseaktivität resistent zu machen, findet in der Entwicklung eines breiten Bereiches von Zelltypen Anwendung.
Z. SHUFFLING FÜR DIE OPTIMIERUNG UNBEKANNTER WECHSELWIRKUNGEN
Viele beschriebene Merkmale sind das Ergebnis komplexer Wechselwirkungen verschiedener Gene oder Genprodukte. Die meisten solcher Wechselwirkungen sind immer noch uncharakterisiert. Dementsprechend ist es oftmals unklar, welche Gene optimiert werden müssen, um ein erwünschtes Merkmal zu erreichen, auch wenn manche der Gene, die zu dem Merkmal beitragen, bekannt sind.
Diese fehlende Charakterisierung ist während des DNA-Shufflings kein Thema, durch welches Lösungen produziert werden, mit denen das optimiert wird, wonach selektiert wird. Ein anderer Ansatz, durch welchen nicht nur dieses Problem gelöst werden könnte, sondern auch zukünftige Raten-limitierende Faktoren beseitigen könnte, ist die Komplementierung durch die Überexpression unbekannter Genomsequenzen.
Eine Bibliothek genomischer DNA wird zunächst, wie oben beschrieben, hergestellt. Diese wird in die zu optimierende Zelle transformiert und die Transformanten werden hinsichtlich Erhöhungen in einer erwünschten Eigenschaft gescreent. Die genomischen Fragmente, die zu einer verbesserten Eigenschaft führen, werden durch DNA-Shuffling entwickelt, um deren wirkungsvollen Effekt weiter zu erhöhen. Bei diesem Ansatz wird keine Sequenzinformation oder irgendein Wissen oder eine Annahme über die Natur des Proteins oder von Weg-Wechselwirkungen benötigt, oder sogar, welche Schritte Raten-begrenzend sind; dieses Verfahren beruht lediglich auf der Detektion des erwünschten Phänotyps. Diese Art der Zufallsklonierung und der nachfolgenden Entwicklung durch DNA-Shuffling von positiv wechselwirkenden Genomsequenzen ist ein äußerst wirkungsvolles und generisches Werkzeug. Eine Verschiedenheit von Quellen für die genomische DNA wird verwendet, ausgehend von isogenen Stämmen bis zu weiter entfernt verwandten Spezies mit möglicherweise erwünschten Eigenschaften. Darüber hinaus ist die Technik auch bei jeder Zelle anwendbar, für welche die molekularbiologischen Grundlagen der Transformation und Klonierungsvektoren verfügbar sind, und für jede Eigenschaft, die untersucht werden kann (vorzugsweise in einem Hochdurchsatzformat). Wenn die entwickelte DNA optimiert ist, kann diese alternativ durch homologe Rekombination oder zufallsbedingt durch Phagen-vermittelte, stellenspezifische Rekombination in das Chromosom zurücküberführt werden.
AA. HOMOLOGE REKOMBINATION INNERHALB DES CHROMOSOMS
Die homologe Rekombination innerhalb des Chromosoms wird verwendet, um die Einschränkungen einer Plasmid-basierten Entwicklung und die Größen-Beschränkungen zu umgehen. Die Strategie ist ähnlich zu derjenigen, die weiter oben für das Shuffling von Genen innerhalb deren chromosomalen Kontext beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass kein in vitro-Shuffling auftritt. Anstelle dessen wird der Elternstamm mit Mutagenen, wie bspw. ultraviolettem Licht oder Nitrosoguanidin, behandelt, und die verbesserten Mutanten werden selektiert. Die verbesserten Mutanten werden gepoolt und aufgeteilt. Die eine Hälfte des Pools wird verwendet, um genomische Zufallsfragmente für die Klonierung in einen homologen Rekombinationsvektor herzustellen. Zusätzliche genomische Fragmente werden wahlweise aus verwandten Spezies mit erwünschten Eigenschaften abgeleitet. Die klonierten genomischen Fragmente werden in die Genome der verbleibenden anderen Hälfte des mutierten Pools rekombiniert und Varianten mit verbesserten Eigenschaften werden selektiert. Diese werden einer weiteren Mutagenese-, Selektions- und Rekombinationsrunde unterzogen. Auch dieser Prozess ist wiederum hinsichtlich der Verbesserung jedes Gesamtzellbiokatalysatoren, für welches ein Rekombinationsvektor und ein Assay entwickelt werden kann, gänzlich generisch. Auch hier sollte wiederum bemerkt werden, dass vor dem Screening eine Rekombination rekursiv durchgeführt werden kann.
BB. VERFAHREN FÜR DIE REKURSIVE SEQUENZ-REKOMBINATION
Einige Formate und Beispiele für die rekursive Sequenz-Rekombination, die manchmal als DNA-Shuffling oder molekulare Züchtung bezeichnet wird, sind durch die vorliegenden Erfinder und Mitarbeiter in parallel anhängigen Anmeldungen beschrieben worden, Anwaltsaktenzeichen 16528A-014612, eingereicht am 25. März 1996, PCT/US95/02126, angemeldet am 17. Februar 1995 (veröffentlicht als WO 95/22625); Stemmer, Science 270, 1510 (1995); Stemmer et al., Gene, 164, 49–53 (1995); Stemmer, Bio/Technology, 13, 549–553 (1995); Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747–10751 (1994); Stemmer, Nature 370, 389–391 (1994); Crameri et al., Nature Medicine, 2 (1); 1-, (1996) und Crameri et al., Nature Biotechnology 14, 315–319 (1996).
Wie in den 16 und 17 gezeigt, stellt das DNA-Shuffling für die Entwicklung neuer komplexer Funktionen die schnellste Technologie dar. Wie in 16, Abschnitt (A) gezeigt, wird mit der Rekombination beim DNA-Shuffling die Anhäufung vieler verschiedener günstiger Mutationen in wenigen Zyklen erreicht. Im Gegensatz dazu – auf Grund der hohen Frequenz von schädigenden Mutationen relativ zu den günstigen Mutationen – müssen iterative Punktmutationen jeweils eine günstige Mutation aufbauen, was konsequenterweise viele Zyklen notwendig macht, um den gleichen Punkt zu erreichen. Wie in 16, Abschnitt B gezeigt, ist das DNA-Shuffling ein paralleler Prozess, bei welchem viele verschiedene Probleme unabhängig voneinander gelöst werden können und anschließend kombiniert werden, eher als eine einfache lineare Sequenz einer Mutationsanhäufung.
1. In vitro-Formate
Ein Format für das in vitro-Shuffling ist in 1 dargestellt. Die Anfangssubstrate für die Rekombination stellen einen Pool verwandter Sequenzen dar. Die X's in 1, Abschnitt A zeigen, wo sich die Sequenzen unterscheiden. Die Sequenzen können DNA oder RNA sein und können verschiedene Längen aufweisen, in Abhängigkeit von der Größe des Gens oder des Fragments, welches rekombiniert oder wieder zusammengebaut werden soll. Bevorzugte Sequenzen reichen von 50 bp bis 50 kb.
Der Pool verwandter Substrate wird in überlappende Fragmente umgewandelt, d.h. von ungefähr 5 bp bis 5 kb oder mehr, wie in 1, Abschnitt B gezeigt. Oftmals reicht die Größe der Fragmente von ungefähr 10 bp bis 1000 bp, und manchmal reicht die Größe der DNA-Fragmente von ungefähr 100 bp bis 500 bp. Die Konversion kann durch eine Vielzahl verschiedener Verfahren bewirkt werden, wie bspw. DNAaseI- oder RNAse-Verdau, Zufalls-Shearing oder partieller Restriktionsenzymverdau. Alternativ kann die Umwandlung der Substrate in Fragmente durch eine unvollständige PCR-Amplifizierung von Substraten oder durch eine PCR, ausgehend von einem einzelnen Primer, bewirkt werden. Alternativ können geeignete einzelsträngige Fragmente auf einem Nucleinsäuren-Synthetisierer hergestellt werden. Die Konzentration der Nucleinsäurefragmente einer bestimmten Länge und Sequenz ist oftmals weniger als 0,1% oder 1%/Gewicht der Gesamtnucleinsäure. Die Anzahl der unterschiedlichen spezifischen Nucleinsäurefragmente in der Mischung beträgt gewöhnlich mindestens ungefähr 100, 500 oder 1000.
Die gemischte Population der Nucleinsäurefragmente wird in eine zumindest teilweise einzelsträngige Form konvertiert. Die Konversion kann durch Erhitzen auf ungefähr 80°C bis 100°C, bevorzugter von 90°C auf 96°C bewirkt werden, um einzelsträngige Nucleinsäurefragmente zu bilden, mit anschließendem Wiederausrichten. Die Konversion kann auch durch eine Behandlung mit einem Einzelstrang-DNA-bindenden Protein oder dem recA-Protein erzielt werden. Einzelsträngige Nucleinsäurefragmente mit Regionen einer Sequenzidentität mit anderen einzelsträngigen Nucleinsäurefragmenten können anschließend durch Abkühlen auf 4°C bis 75°C, und vorzugsweise von 40°C auf 65°C wieder aneinander ausgerichtet werden. Die Renaturierung kann durch das Hinzufügen von Polyethylenglykol (PEG), anderen volumen-ausschließenden Reagenzien oder Salzen beschleunigt werden. Die Salzkonzentration beträgt vorzugsweise von 0 mM bis 200 mM, bevorzugter beträgt die Salzkonzentration von 10 mM bis 100 mM. Das Salz kann dabei KCl oder NaCl sein. Die Konzentration von PEG beträgt vorzugsweise von 0% bis 20%, bevorzugter von 5% bis 10%. Die sich ausrichtenden Fragmente können aus unterschiedlichen Substraten stammen, wie in 1, Abschnitt C gezeigt. Die ausgerichteten Nucleinsäurefragmente werden in Gegenwart einer Nucleinsäurepolymerase, wie bspw. Taq oder Klenow oder korrekturlesenden Polymerasen, wie bspw. pfu oder pwo, und dNTPs (d.h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP), inkubiert. Wenn die Regionen mit Sequenzidentität groß sind, kann die Taq-Polymerase mit einer Annealing-Temperatur von zwischen 45 bis 65°C verwendet werden. Wenn die Gebiete der Identität klein sind, kann die Klenow-Polymerase mit einer Annealing-Temperatur von zwischen 20 bis 30°C verwendet werden (Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), siehe oben). Die Polymerase kann vor dem Annealing zu den Zufallsnucleinsäurefragmenten hinzugefügt wer den, oder aber gleichzeitig mit dem Annealing oder nach dem Annealing.
Das Verfahren der Denaturierung, Renaturierung und Inkubation in Gegenwart der Polymerase von überlappenden Fragmenten, um eine Sammlung von Polynucleotiden herzustellen, die unterschiedliche Permutationen von Fragmenten tragen, wird manchmal als in vitro-Shuffling der Nucleinsäure bezeichnet. Dieser Zyklus wird für eine erwünschte Anzahl an Runden wiederholt. Bevorzugt ist es, wenn der Zyklus von 2 bis 100 Mal wiederholt wird, bevorzugter wird die Sequenz 10 bis 40 Mal wiederholt. Die resultierenden Nucleinsäuren sind eine Familie doppelsträngiger Polynucleotide von ungefähr 50 bp bis ungefähr 100 kb, vorzugsweise von 500 bp bis 50 kb, wie in 1, Abschnitt D gezeigt. Die Population stellt Varianten der Ausgangssubstrate dar, die eine wesentliche Sequenzidentität hierzu zeigen, die jedoch auch an mehreren Stellen unterschiedlich sind. Die Population hat mehr Mitglieder als die Ausgangssubstrate. Die Population der Fragmente, die von dem Shuffling herrühren, wird zur Transformation der Wirtszellen eingesetzt, wahlweise nach Klonierung in einen Vektor.
Bei einer Variation des in vitro-Shufflings können Untersequenzen der Rekombinations-Substrate durch Amplifizierung der vollständigen Sequenzen unter Bedingungen hergestellt werden, unter welchen eine wesentliche Fraktion, typischerweise mindestens 20% oder mehr, an unvollständig erweiterten Amplifizierungsprodukten produziert wird. Die Amplifizierungsprodukte, einschließlich der unvollständig erweiterten Amplifizierungsprodukte, werden denaturiert und mindestens einem zusätzlichen Re-Annealing- und Amplifikationszyklus unterzogen. Diese Variation, bei welcher durch zumindest einen Zyklus des Re-Annealings und der Amplifizierung eine wesentliche Fraktion unvollständig erweiterter Produkte bereitgestellt wird, wird als „Stuttering" bezeichnet. In der nachfolgenden Amplifizierungsrunde richten sich die unvollständig erweiterten Produkte wieder aneinander aus und starten die Erweiterung an unterschiedlichen Sequenz-bezogenen Template-Spezies.
Bei einer weiteren Variation wird eine Mischung aus Fragmenten mit einem oder mehreren Oligonucleotiden versehen. Die Oligonucleotide können derart ausgebildet sein, dass sie vorcharakterisierte Mutationen einer Wildtyp-Sequenz enthalten, oder stellen natürlich Variationen zwischen Individuen oder Spezies dar. Die Oligonucleotide schließen ferner eine hinreichende Sequenz- oder strukturelle Homologie mit ein, die solche Mutationen oder Variationen flankiert, durch welche ein Annealing mit den Wildtyp-Fragmenten ermöglicht wird. Einige Oligonucleotide können Zufallssequenzen sein. Die Annealing-Temperaturen können in Abhängigkeit der Homologielänge angepasst werden.
Bei einer weiteren Variation tritt die Rekombination in zumindest einem Zyklus durch ein „Template-Switching" (Wechsel des Templates) auf, so dass, wenn ein DNA-Fragment, das von einem Template abgeleitet ist, dieses an der homologen Position eines verwandten, jedoch unterschiedlichen Templates den Vorgang startet. Das Template-Switching kann durch die Hinzufügung von recA, rad51, rad55, rad57 oder anderen Polymerasen (bspw. viralen Polymerasen, reverse Transkriptase) zu der Amplifizierungs-Mischung induziert werden. Das Template-Switching kann ferner durch Erhöhen der DNA-Templatekonzentration erhöht werden.
Bei einer weiteren Variation kann zumindest ein Amplifizierungszyklus unter Verwendung einer Kollektion an überlappenden einzelsträngigen DNA-Fragmenten verwandter Sequenzen und unterschiedlicher Längen durchgeführt werden. Die Fragmente können unter Verwendung eines einzelsträngigen DNA-Phagen, wie bspw. M13, hergestellt werden. Jedes Fragment kann mit der Polynucleotid-Kettenverlängerung eines zweiten Fragments aus der Kollektion hybridisieren und den Vorgang starten, wodurch Sequenz-rekombinierte Polynucleotide gebildet werden. Bei einer weiteren Variation können ssDNA-Fragmente mit variabler Länge aus einem einzelnen Primer durch Vent- oder anderen DNA-Polymerasen auf einem ersten DNA-Template hergestellt werden. Die einzelsträngigen DNA-Fragmente werden als Primer für ein zweites, Kunkel-Typ-Template verwendet, welches aus Uracilenthaltender, zirkulärer ssDNA besteht. Dies resultiert in verschiedene Substitutionen des ersten Templates in das zweite. Siehe Levichkin et al., Mol. Biology 29, 572–577 (1995).
2. In vivo-Formate
(a). Plasmid-Plasmid-Rekombination
Die Ausgangssubstrate für die Rekombination sind eine Sammlung an Polynucleotiden, die variante Formen eines Gens umfassen. Die varianten Formen zeigen oftmals eine substantielle Sequenzidentität miteinander, die ausreichend ist, um zwischen den Substraten eine homologe Rekombination zuzulassen. Die Diversität zwischen den Polynucleotiden kann natürlich sein (bspw. allelische oder Spezies-Varianten), induziert (bspw. fehlerhafte PCR) oder das Ergebnis einer in vitro-Rekombination sein. Die Diversität kann auch von der Neusynthese von Genen herrühren, die für natürliche Proteine mit einer alternativen und/oder gemischten Codon-Verwendung kodieren. Es sollte eine zumindest hinreichende Diversität zwischen den Substraten bestehen, so dass die Rekombination unterschiedlichere Produkte als das Ausgangsmaterial produzieren kann. Es muss mindestens zwei Substrate geben, die sich in mindestens zwei Positionen unterscheiden. Jedoch wird üblicherweise eine Bibliothek von Substraten mit 10³ bis 10⁸ Mitgliedern eingesetzt. Der Grad der Diversität hängt von der Länge des zu rekombinierenden Substrats ab sowie von dem Ausmaß des zu entwickelnden funktionellen Austausches. Eine Diversität mit zwischen 0,1 bis 50% der Positionen ist typisch. Die unterschiedlichen Substrate werden in die Plasmide eingebaut. Die Plasmide sind oftmals Standardklonierungsvektoren, d.h. bakterielle Multikopien-Plasmide. Bei einigen nachstehend noch zu beschreibenden Verfahren schließen die Plasmide jedoch Mobilisierungsfunktionen mit ein. Die Substrate können in die gleichen oder unterschiedliche Plasmide eingebaut werden. Oftmals werden mindestens zwei unterschiedliche Typen von Plasmiden mit unterschiedlichen Typen von Selektionsmarkern verwendet, um eine Selektion hinsichtlich Zellen zu ermöglichen, die mindestens zwei Vektorentypen enthalten. Wenn unterschiedliche Plasmidtypen eingesetzt werden, können die unterschiedlichen Plasmide auch aus zwei unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen stammen, um eine stabile Koexistenz zweier unterschiedlicher Plasmide innerhalb der Zelle zu ermöglichen. Nichtsdestotrotz können Plasmide aus der gleichen Inkompatibilitätsgruppe innerhalb der gleichen Zelle hinreichend lange koexistieren, um eine homologe Rekombination zu ermöglichen.
Plasmide, die unterschiedliche Substrate enthalten, werden anfangs durch irgendein Transfektionsverfahren (bspw. chemische Transformation, natürliche Kompetenz, Elektroporation, virale Transduktion oder Biolistika) in prokaryotische oder eukaryotische Zellen eingeführt. Oftmals sind die Plasmide mit einer Konzentration nahe oder bei einem Sättigungsgrad vorhanden (mit Bezug auf eine maximale Transfektionskapazität), um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass mehr als ein Plasmid in die gleiche Zelle aufgenommen wird. Die Plasmide, die die verschiedenen Substrate enthalten, können gleichzeitig oder in verschiedenen Runden transfiziert werden. So können bspw. bei dem letzteren Ansatz Zellen mit einem ersten Aliquot eines Plasmids transfiziert werden, die Transfektanten anschließend selektiert und vermehrt werden und anschließend wiederum mit einem zweiten Aliquot des Plasmids transfiziert werden.
Nachdem die Plasmide in die Zellen eingeführt worden sind, tritt eine Rekombination zwischen den Substraten, die rekombinante Gene herstellen sollen, innerhalb der Zellen auf, die viele verschiedene Plasmide enthalten, und zwar durch bloße Vermehrung in den Zellen. Zellen, die jedoch lediglich ein Plasmid aufgenommen haben, sind zu einer Rekombination nicht in der Lage und der mögliche Beitrag der Substrate auf solchen Plasmiden für die Entwicklung wird nicht vollständig ausgenutzt (obwohl diese Plasmide zu einem gewissen Ausmaß beitragen können, wenn sie in Mutatorzellen vermehrt werden oder anderweitig Punktmutationen akkumulieren (bspw. durch eine Behandlung mit ultravioletter Strahlung)). Die Entwicklungsrate kann dadurch gesteigert werden, indem man alle Substrate bei der Rekombination teilnehmen lässt. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die transfizierten Zellen einer Elektroporation unterzogen werden. Die Bedingungen für eine Elektroporation sind die gleichen wie diejenigen, die gewöhnlicherweise für die Einführung exogener DNA in Zellen verwendet wird (bspw. 1000–2500 Volt, 400 μF und eine 1–2 mM Pause). Unter diesen Bedingungen werden die Plasmide zwischen den Zellen ausgetauscht, wodurch die Teilnahme aller Substrate an der Rekombination ermöglicht wird. Darüber hinaus können die Rekombinationsprodukte weiteren Rekombinationsrunden miteinander oder mit dem Originalsubstrat unterzogen werden. Die Entwicklungsrate kann ferner durch die Verwendung eines konjugativen Transfers erhöht werden. Systeme für den konjugativen Transfer sind bei vielen Bakterien bekannt (E. coli, P. aeruginosa, S. pneumoniae und H. influenzae), und können auch für den Transfer von DNA zwischen Bakterien und Hefen oder zwischen Bakterien und Säugetierzellen verwendet werden.
Um den konjugativen Transfer auszunutzen, werden die Substrate in Plasmide kloniert, die MOB-Gene tragen, und ferner werden tra-Gene in cis oder in trans für die MOB-Gene bereitgestellt. Der Effekt des konjugativen Transfers ist zu der Elektroporation darin sehr ähnlich, dass es Plasmiden ermöglicht wird, sich zwischen Zellen zu bewegen, und die Rekombination zwischen irgendeinem Substrat und den Produkten vorheriger Rekombinationen wird ermöglicht, und zwar lediglich durch Vermehrung der Kultur. Die Details davon, wie der konjugative Transfer in diesen Vektoren ausgenutzt wird, werden nachstehend detaillierter beschrieben. Die Entwicklungsrate kann auch durch Fusionieren von Protoplasten von Zellen gesteigert werden, um einen Austausch der Plasmide oder Chromosomen zu induzieren. Eine Fusion kann durch chemische Agenzien induziert werden, wie bspw. PEG oder Viren oder virale Proteine, wie bspw. dem Influenzavirus-Hämagglutinin, HSV-1 gB und gD. Die Entwicklungsrate kann ferner durch die Verwendung von Mutator-Wirtszellen gesteigert werden (bspw. MutL, S, D. T, H und Ataxia telangiectasia menschliche Zelllinien).
Alternativ können die Plasmide zusammen vermehrt werden, um eine Rekombination zu fördern, und anschließend isoliert, gepoolt und wieder in die Zellen eingeführt werden. Die Kombination der Plasmide ist in jeder Zelle unterschiedlich, und die Rekombination erhöht die Sequenzdiversität innerhalb der Population weiter. Dies wird wahlweise rekursiv so lange durchgeführt, bis der gewünschte Grad der Diversität erreicht ist. Anschließend wird die Population gescreent und selektiert, und dieser Prozess wird wahlweise mit irgendwelchen ausgewählten Zellen/Plasmiden wiederholt.
Die Zeitspanne, über die die Zellen vermehrt werden und eine Rekombination ermöglicht wird, variiert selbstverständlich mit dem Zelltyp, ist jedoch im Allgemeinen nicht kritisch, da sogar ein kleiner Grad an Rekombination die Diversität relativ zum Ausgangsmaterial wesentlich erhöhen kann. Die Zellen, die Plasmide tragen, welche rekombinierte Gene enthalten, werden einem Screening oder einer Selektion hinsichtlich einer erwünschten Funktion unterzogen. Wenn bspw. das zu entwickelnde Substrat ein Arzneimittelresistenz-Gen enthält, wird hinsichtlich der Arzneimittelresistenz selektiert. Zellen, die das Screening oder die Selektion überleben, werden einer oder weiteren Screening-/Selektionsrunden unterzogen, gefolgt von einer Rekombination, oder aber können direkt einer zusätzlichen Rekombinationsrunde unterzogen werden.
Die nächste Rekombinationsrunde kann durch mehrere unterschiedliche Formate, unabhängig von der vorherigen Runde, erreicht werden. So kann bspw. eine weitere Rekombinationsrunde einfach durch Wiederaufnahme der Elektroporation oder des Konjugations-vermittelten interzellulären Transfers der Plasmide, wie oben beschrieben, bewirkt werden. Alternativ kann ein frisches Substrat oder Substrate, das gleiche oder unterschiedliche zu den vorherigen Substraten, in die Zellen transfiziert werden, welche die Selektion/das Screening überlebt haben. Wahlweise werden die neuen Substrate in Plasmidvektoren eingeschlossen, die einen unterschiedlichen Selektionsmarker tragen und/oder die aus einer unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppe stammen, im Vergleich zu den ursprünglichen Plasmiden. Als eine weitere Alternative können die Zellen, die die Selektion/das Screening überleben, in zwei Subpopulationen aufgeteilt werden, und Plasmid-DNA aus einer Subpopulation kann in die andere transfiziert werden, wobei die Substrate von den Plasmiden aus den zwei Subpopulationen einer weiteren Rekombinationsrunde unterzogen werden. In einer der letzteren beiden Optionen kann die Entwicklungsrate durch Einsatz einer DNA-Extraktion, Elektroporation, Konjugation oder durch Einsatz von Mutatorzellen, wie oben beschrieben, erhöht werden. In noch einer weiteren Variation kann DNA aus Zellen, die das Screening/die Selektion überleben, extrahiert und einem in vitro-DNA-Shuffling unterzogen werden.
Nach der zweiten Rekombinationsrunde wird eine zweite Screening-/Selektionsrunde durchgeführt, vorzugsweise unter Bedingungen mit steigender Stringenz. Wenn gewünscht, können weitere Rekombinations- und Selektions-/Screening-Runden unter Verwendung der gleichen Strategie für die zweite Runde durchgeführt werden. Mit aufeinander folgenden Rekombinations- und Selektions-/Screening-Runden entwickeln sich die überlebenden rekombinierten Substrate in Richtung Aneignung eines erwünschten Phänotyps. Typischerweise unterscheidet sich bei diesen und anderen Verfahren der rekursiven Rekombination das Endprodukt der Rekombination, welches den erwünschten Phänotyp erlangt hat, von den Ausgangssubstraten bei 0,1% bis 25% der Positionen und hat sich mit einer Rate entwickelt, die um eine Größenordnung im Überschuss liegt (bspw. durch mindestens das Zehnfache, Hundertfache, Tausendfache oder Zehntausendfache) im Vergleich zu der Rate einer natürlich erlangten Mutation von ungefähr einer Mutation pro 10^–9 Positionen pro Generation (siehe Anderson & Hughes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 906–907 (1996)). Wie bei anderen hierin beschriebenen Techniken können die Rekombinationsschritte rekursiv durchgeführt werden, um vor dem Screening die Diversität zu verstärken. Darüber hinaus kann der gesamte Prozess auf eine rekursive Art und Weise durchgeführt werden, um erwünschte Organismen, Klone oder Nucleinsäuren herzustellen.
3. Virus-Plasmid-Rekombination
Die Strategie, die für eine Plasmid-Plasmid-Rekombination verwendet wurde, kann auch für eine Virus-Plasmid-Rekombination – gewöhnlicherweise eine Phagen-Plasmid-Rekombination – eingesetzt werden. Jedoch sind einige zusätzliche Anmerkungen, insbesondere für die Verwendung von Viren, angebracht. Die Ausgangssubstrate für die Rekombination werden sowohl in Plasmid- als auch in virale Vektoren kloniert. Gewöhnlicherweise ist es nicht kritisch, welche Substrate in den viralen Vektor und welche in das Plasmid eingefügt werden, obwohl gewöhnlicherweise der virale Vektor Substrate enthalten sollte, die sich von denen des Plasmids unterscheiden. Wie zuvor enthält das Plasmid (und das Virus) typischerweise einen Selektionsmarker. Das Plasmid und die viralen Vektoren können, wie oben beschrieben, durch Transfektion in die Zellen eingeführt werden. Das effizientere Verfahren ist es jedoch, die Zellen mit dem Plasmid zu transformieren, die Transformanten anschließend auszuwählen und im Anschluss daran die Transformanten mit einem Virus zu infizieren. Da die Effizienz der Infektion vieler Viren beinahe 100% der Zellen ausmacht, enthalten die meisten Zellen, die auf diese Weise transformiert und infiziert wurden, sowohl ein Plasmid als auch ein Virus, die unterschiedliche Substrate tragen.
Zwischen dem Plasmid und dem Virus findet eine homologe Rekombination statt, wodurch sowohl rekombinierte Plasmide als auch rekombinante Viren entstehen. Bei einigen Viren, wie bspw. ein filamentöser Phage, in welchen intrazelluläre DNA sowohl in doppelsträngigen als auch in einzelsträngigen Formen existiert, gilt, dass beide DNA-Arten bei der Rekombination teilnehmen können. Vorausgesetzt, dass das Virus nicht ein Virus ist, das die Zellen schnell tötet, kann die Rekombination durch Verwendung der Elektroporation oder Konjugation verstärkt werden, um Plasmide zwischen den Zellen zu übertragen. Die Rekombination kann bei einigen Virustypen auch dadurch verstärkt werden, dass die Nachkommenschaft des Virus aus einer Zelle andere Zellen reinfizieren kann. Bei anderen Virustypen zeigen Virus-infizierte Zellen eine Resistenz gegenüber einer Superinfektion. Jedoch kann eine solche Resistenz dadurch überwunden werden, dass mit einer hohen Vielzahl und/oder unter Verwendung von Mutantenstämmen des Virus infiziert wird, in welchem die Resistenz gegenüber einer Superinfektion reduziert ist. Eine rekursive Infektion und Transformation vor dem Screening kann zur Verstärkung der Diversität durchgeführt werden.
Das Ergebnis der Infektion Plasmid-enthaltender Zellen mit einem Virus hängt von der Natur des Virus ab. Einige Viren, wie bspw. filamentöse Phagen, existieren in der Zelle mit dem Plasmid stabil und schleusen ferner Nachkommen des Phagens aus der Zelle aus. Andere Viren, wie bspw. das Lambda-Virus, die ein Cosmid-Genom besitzt, existieren in einer Zelle wie Plasmide, ohne Virionen-Nachkommenschaften zu bilden. Andere Viren, wie bspw. der T-Phage und lytische Lambda-Phage, werden mit dem Plasmid einer Rekombination unterzogen, jedoch töten diese Viren letztendlich die Wirtszelle und zerstören die Plasmid-DNA. Bei Viren, die Zellen, ohne den Wirt zu töten, infizieren, können Zellen, die rekombinante Plasmide und Viren enthalten, unter Verwendung des gleichen Ansatzes wie für die Plasmid-Plasmid-Rekombination gescreent/selektiert werden. Viren-Nachkommenschaften, die durch Zellen ausgeschleust werden, die die Selektion/das Screening überleben, können auch gesammelt und als Substrate für nachfolgende Rekombinationsrunden verwendet werden. Bei Viren, die deren Wirtszellen töten, liegen die rekombinanten Gene, die aus der Rekombination herrühren, lediglich in der Viren-Nachkommenschaft vor. Wenn bei dem Screening oder dem Auswahlassay die Expression rekombinanter Gene in einer Zelle notwendig ist, sollten die rekombinanten Gene von der Virus-Nachkommenschaft auf einen anderen Vektor, bspw. einem Plasmidvektor, übertragen und anschließend in die Zellen retransfiziert werden, bevor die Selektion/das Screening durchgeführt wird.
Bei filamentösen Phagen liegen die Produkte der Rekombination sowohl in den Zellen vor, die die Rekombination überleben, als auch in den Phagen, die aus diesen Zellen ausgeschleust werden. Die zweifache Quelle der Rekombinationsprodukte sorgt für zusätzliche Optionen im Vergleich zu der Plasmid-Plasmid-Rekombination. So kann bspw. DNA aus Phagenpartikeln zur Verwendung in einer in vitro-Rekombinationsrunde isoliert werden. Alternativ kann die Phagen-Nachkommenschaft dazu verwendet werden, Zellen, die eine vorherige Screening-/Selektionsrunde überlebt haben, zu transfizieren oder zu infizieren, oder aber frische Zellen, die mit frischen Substraten für die Rekombination transfiziert worden sind.
4. Virus-Virus-Rekombination
Die Prinzipien, die für die Plasmid-Plasmid- und Plasmid-Virus-Rekombination beschrieben wurden, können mit wenigen Modifikationen auch für die Virus-Virus-Rekombination angewandt werden. Die Ausgangssubstrate für die Rekombination werden in einen viralen Vektor kloniert. Gewöhnlicherweise wird der gleiche Vektor für alle Substrate verwendet. Vorzugsweise ist das Virus ein Virus, das – entweder auf natürlichem Weg oder als Ergebnis einer Mutation – Zellen nicht tötet. Nach der Insertion können einige der viralen Genome in vitro verpackt werden. Die verpackten Viren werden dazu verwendet, Zellen mit einer hohen Vielzahl derart zu infizieren, dass die Wahrscheinlichkeit hoch ist, dass eine Zelle eine Vielzahl von Viren mit unterschiedlichen Substraten aufnimmt.
Nach der Anfangsinfektionsrunde hängen die nachfolgenden Schritte von der Natur der Infektion ab, wie zuvor in dem vorherigen Abschnitt diskutiert wurde. Wenn bspw. die Viren Phagemidgenome, wie bspw. Lambda-Cosmide oder M13-, F1- oder Fd-Phagemide besitzen, verhalten sich die Phagemide innerhalb der Zelle als Plasmide und werden einfach durch Vermehrung der Zellen einer Rekombination unterzogen. Die Rekombination und die Sequenzdiversität kann durch Elektroporation der Zellen verstärkt werden. Nach der Selektion/dem Screening können Cosmide, die die rekombinanten Gene enthalten, aus den überlebenden Zellen selektiert werden (bspw. durch Hitzeinduktion einer cos^–-lysogenen Wirtszelle), in vitro wiederverpackt werden und dazu eingesetzt werden, frische Zellen mit einer hohen Vielzahl für eine weitere Kombinationsrunde zu infizieren.
Wenn die Viren filamentöse Phagen sind, wird die Rekombination der replizierenden DNA-Form durch Vermehren der Kultur infizierter Zellen vollzogen. Durch eine Selektion/ein Screening können Kolonien von Zellen identifiziert werden, die virale Vektoren mit rekombinanten Genen mit verbesserten Eigenschaften besitzen, zusammen mit den Phagen, die aus solchen Zellen ausgeschleust werden. Die sich anschließenden Möglichkeiten sind im Wesentlichen die gleichen wie für die Plasmid-Virus-Rekombination.
5. Chromosomen-Plasmid-Rekombination
Dieses Format kann dazu eingesetzt werden, sowohl chromosomale als auch Plasmid-getragene Substrate zu entwickeln. Das Format ist insbesondere in Situationen nützlich, in denen viele chromosomale Gene zu einem Phänotyp beitragen, oder in denen die exakte Lokalisierung der zu entwickelnden chromosomalen Gene nicht bekannt ist. Die Ausgangssubstrate für die Rekombination werden in einen Plasmidvektor kloniert. Wenn die zu entwickelnden chromosomalen Gene bekannt sind, stellen die Substrate eine Familie an Sequenzen dar, die einen hohen Grad an Sequenzidentität aufweisen, die sich jedoch in gewisser Weise von den chromosomalen Genen unterscheiden. Wenn die zu entwickelnden chromosomalen Gene nicht lokalisiert wurden, stellen die Ausgangssubstrate gewöhnlicherweise eine Bibliothek an DNA-Segmenten dar, von denen lediglich eine kleine Anzahl eine Sequenzidentität gegenüber dem Gen oder den Genen zeigen, die entwickelt werden sollen. Eine Divergenz zwischen Plasmidgetragenem Substrat und dem chromosomalen Gen/Genen kann durch Mutagenese oder dadurch induziert werden, dass die Plasmidgetragenen Substrate aus einer Spezies gewonnen werden, die im Vergleich zu den Zellen, die das Chromosom tragen, unterschiedlich ist.
Die Plasmide, die die Substrate für die Rekombination tragen, werden in Zellen mit den zu entwickelnden chromosomalen Genen transfiziert. Die Entwicklung kann einfach durch Vermehren der Kultur vonstatten gehen und kann durch Transferieren der Plasmide zwischen den Zellen durch Konjugation, Elektroporation oder Protoplastenfusion beschleunigt werden. Die Entwicklung kann ferner durch die Verwendung von Mutator-Wirtszellen oder durch Ansäen einer Kultur von Nicht-Mutator-Wirtszellen beschleunigt werden, die mit den Mutator-Wirtszellen entwickelt werden, und durch die Induktion des interzellulären Transfers von Plasmiden durch Elektroporation, Konjugation oder Protoplastenfusion. Alternativ kann eine rekursive Isolation und Transformation eingesetzt werden. Die Mutator-Wirtszellen, die für das Ansäen eingesetzt werden, enthalten vorzugsweise einen negativen Selektionsmarker, um die Isolierung einer Reinkultur der Nicht-Mutatorzellen, die entwickelt werden sollen, zu erleichtern. Mit einer Selektion/einem Screening können die Zellen identifiziert werden, die die Chromosomen und/oder Plasmide tragen, die sich in Richtung Aneignung einer erwünschten Funktion entwickelt haben.
Daran schließen sich Rekombinations- und Selektions-/Screening-Runden an, und zwar auf ähnliche Weise wie diejenigen, die für die Plasmid-Plasmid-Rekombination beschrieben wurden. So kann bspw. eine weitere Rekombination dadurch bewirkt werden, dass die Zellen, die die Rekombination überlebt haben, in Kombination mit Elektroporation, konjugativem Transfer der Plasmide oder Protoplastenfusion vermehrt werden. Alternativ können die Plasmide, die die zusätzlichen Substrate für die Rekombination tragen, in die überlebenden Zellen eingeführt werden. Solche Plasmide sind vorzugsweise von einer unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppe und tragen einen Selektionsmarker, der zu den ursprünglichen Plasmiden unterschiedlich ist, um eine Selektion hinsichtlich Zellen zu ermöglichen, die mindestens zwei unterschiedliche Plasmide tragen. Als eine weitere Alternative kann Plasmid- und/oder chromosomale DNA aus einer Subpopulation überlebender Zellen isoliert und in eine zweite Subpopulation transfiziert werden. Chromosomale DNA kann vor der Transfektion in einen Plasmidvektor kloniert werden.
6. Virus-Chromosomen-Rekombination
Wie bei den weiter oben beschriebenen Verfahren ist der Virus normalerweise ein Virus, der die Zellen nicht tötet, und stellt oftmals ein Phage oder ein Phagemid dar. Das Verfahren ist im Wesentlichen das gleiche wie für die Plasmid-Chromosomen-Rekombination. Die Substrate für die Rekombination werden in den Vektor kloniert. Vektoren, die die Substrate mit einschließen, können anschließend in die Zellen transfeziert oder in vitro verpackt und anschließend durch eine Infektion in die Zellen eingeführt werden. Die viralen Genome rekombinieren durch bloßes Vermehren einer Kultur mit den Wirts-Chromosomen. Die Entwicklung kann dadurch beschleunigt werden, dass ein interzellulärer Transfer der viralen Genome durch Elektroporation oder durch Reinfektion der Zellen mit Nachkommenschaft-Virionen ermöglicht wird. Durch Screening/Selektieren können Zellen mit Chromosomen und/oder viralen Genomen identifiziert werden, die sich in Richtung Aneignung einer erwünschten Funktion entwickelt haben.
Es gibt mehrere Optionen für nachfolgende Rekombinationsrunden. So können bspw. virale Genome zwischen Zellen transferiert werden, die die Selektion/Rekombination überlebt haben, und zwar durch rekursive Isolation und Transfektion sowie Elektroporation. Alternativ können Viren, die aus den Zellen, die die Selektion/das Screening überlebt haben, gepoolt werden und zur Superinfektion der Zellen mit hoher Vielzahl eingesetzt werden. Alternativ können frische Substrate zur Rekombination in die Zellen eingeführt werden, entweder auf einem Plasmid oder auf viralen Vektoren.
CC. POOL-WEISE GESAMTGENOM-REKOMBINATION
Die asexuelle Evolution ist ein langsamer und ineffizienter Prozess. Die Populationen bewegen sich eher als Indivi duen als als eine Gruppe. Eine diverse Population wird durch Mutagenese eines einzelnen Elternteils hergestellt, was zu einer Verteilung von fitten und unfitten Individuen führt. In Abwesenheit eines sexuellen Zyklus bleibt jedes Stück genetischer Information für die überlebende Population in den einzelnen Mutanten. Die Auswahl der Fittesten resultiert in viele fitte Individuen, die verworfen werden, zusammen mit der genetisch nützlichen Information, die sie tragen. Die asexuelle Evolution macht einen genetischen Ereignisschritt pro Zeit und ist daher durch den intrinsischen Wert eines einzigen genetischen Ereignisses beschränkt. Die sexuelle Evolution entwickelt sich schneller und effizienter. Die Paarung innerhalb einer Population vereinigt die genetische Information innerhalb der Population und resultiert in der Kombination nützlicher Informationen. Die Kombination aus nützlichen genetischen Informationen resultiert in eine Nachkommenschaft, die bedeutend fitter als ihre Elternteile ist. Die sexuelle Entwicklung schreitet daher durch vielfache genetische Ereignisse viel schneller fort. Diese Unterschiede sind ferner in 17 dargestellt. Im Gegensatz zur sexuellen Entwicklung ist das DNA-Shuffling die rekursive Mutagenese, Rekombination und Selektion von DNA-Sequenzen (siehe auch 25).
Eine sexuelle Rekombination in der Natur bewirkt die paarweise Rekombination und resultiert in eine Nachkommenschaft, die genetische Hybride zweier Elternteile darstellt. Im Gegensatz dazu bewirkt das in vitro-DNA-Shuffling die pool-weise Rekombination, in welcher die Nachkommenschaft Hybride einer Vielzahl von Elternteilmolekülen sind. Dies liegt darin, dass das DNA-Shuffling viele einzelne paarweise Rekombinationsereignisse mit jedem thermalen Zyklus bewirkt. Nach vielen Zyklen ist das Ergebnis eine repetitiv gezüchtete Population, wobei die „Nachkommenschaft" das Fx (für X Zyklen an Wiederneuanordnung) der ursprünglichen Elternteilmoleküle ist. Diese Nachkommenschaft sind potentielle Nachfahren vieler oder aller der ursprünglichen Elternteile. Das in 25 gezeigte Diagramm zeigt eine Darstellung der möglichen Anzahl an Mutationen, die ein Individuum durch aufeinander folgende, paarweise und pool-weise Rekombination ansammeln kann.
Die pool-weise Rekombination ist ein wichtiges Merkmal des DNA-Shufflings, da es ein Mittel zur Herstellung eines größeren Anteils an möglichen Kombinationen der Mutationen aus einem einzelnen „Züchtungs"-Experiment bereitstellt. Auf diese Weise kann das „genetische Potential" einer Population einfach durch Screenen der Nachkommenschaft eines einzelnen DNA-Shuffling-Experiments beurteilt werden.
Wenn bspw. eine Population aus 10 einzelnen mutanten Elternteilen besteht, gibt es 2¹⁰ = 1024 mögliche Kombinationen dieser Mutationen, die sich auf eine Nachkommenschaft mit 0–10 Mutationen belaufen. Von diesen 1024 Kombinationen werden lediglich 56 aus einer einzelnen paarweisen Kreuzung resultieren (14) (d.h. diejenige, die 0, 1 und 2 Mutationen tragen). In der Natur werden die multiparenteralen Kombinationen schließlich nach einer Vielzahl von zufälligen sexuellen Paarungen entstehen, unter der Annahme, dass keine Selektion stattfindet, um einige Mutationen aus der Population zu entfernen. Auf diese Weise beeinflusst der sexuelle Zyklus den Zusammenbau und das Sammeln aller nützlicher Mutantenkombinationen, die innerhalb einer Population möglich sind. Zu dem Zwecke einer gerichteten Evolution ist es wünschenswert, dass die größte Anzahl an Mutantenkombinationen in einem Screen oder einer Selektion erfasst wird, so dass die beste Nachkommenschaft (d.h. gemäß den Auswahlkriterien, die in dem Auswahlscreen verwendet werden) innerhalb kürzester Zeit identifiziert werden kann.
Eine Herausforderung für das in vivo- und Gesamtgenom-Shuffling ist es, Verfahren zur Auslösung der pool-weisen Rekombination oder zu vielfachen repetitiven paarweisen Rekombinationsereignissen auszudenken. Bei Kreuzungen mit einer einzelnen paarweisen Kreuzung pro Zyklus vor dem Screening ist die Fähigkeit, das „genetische Potential" der Ausgangspopulation zu screenen, begrenzt. Aus diesen Gründen wäre die Rate der durch in vivo- und Gesamtgenom-Shufflings vermittelten zellulären Evolution durch das Bewirken einer pool-weisen Rekombination erleichtert. Nachstehend sind zwei Strategien für die pool-weise Rekombination beschrieben (Protoplastenfusion und Transduktion).
1. Protoplastenfusion:
Das durch die Protoplastenfusion (wie oben diskutiert) vermittelte Gesamtgenom-Shuffling (WGS) stellt ein Format dar, welches direkt eine pool-weise Rekombination bewirken kann. Das Shuffling ganzer Gene ist die rekursive Rekombination gesamter Genome, und zwar in Form einer oder mehrerer Nucleinsäuremoleküle (Fragmente, Chromosomen, Episome, etc.), aus einer Population eines Organismus, was zu der Produktion neuer Organismen führt, die eine verteilte genetische Information von mindestens zwei Ausgangspopulationen der Organismen besitzen. Das Verfahren der Protoplastenfusion ist ferner in 26 dargestellt.
Aus der Fusion vielfacher Elternprotoplasten sind Nachkommenschaften beobachtet worden (Hopwood & Wright, 1978), jedoch sind diese Nachkommenschaften selten (10^–4–10^–6). Die niedrige Frequenz ist auf die Verteilung der fusionierten Zellen zurückzuführen, die aus zwei, drei, vier, etc. Elternteilen herrühren und aus der Ähnlichkeit der vielfachen Rekombinationsereignisse (6 Crossovers bei vier Elternteilen-Kreuzungen), die bei einer Nachkommenschaft mit verschiedenen Elternteilen entstehen müsste. Aus diesen Gründen ist es nützlich, die Nachkommenschaft mit vielen verschiedenen Elternteilen anzureichern. Dies kann bspw. durch eine repetitive Fusion oder eine Anreicherung hinsichtlich vielfach fusionierter Protoplasten erreicht werden. Das Verfahren der pool-weisen Fusion und Rekombination ist ferner in 27 dargestellt.
2. Repetitive Fusion:
Aus identifizierten Elternzellen werden Protoplasten hergestellt, fusioniert und regeneriert. Die Protoplasten der regenerierten Nachkommenschaft werden anschließend – ohne ein Screening oder eine Anreicherung – gebildet, fusioniert und regeneriert. Dies kann vor dem Screening über zwei, drei oder mehrere Zyklen hinweg durchgeführt werden, um die Vertretung einer Nachkommenschaft mit vielen Elternteilen zu erhöhen. Die Anzahl der möglichen Mutationen/Nachkommenschaft verdoppelt sich in jedem Zyklus. Wenn bspw. eine Kreuzung hauptsächlich eine Nachkommenschaft mit 0, 1 und 2 Mutationen verursacht, so wird eine Züchtung dieser Population mit sich selber eine Nach kommenschaft mit 0, 1, 2, 3 und 4 Mutationen produzieren (15), die dritte Kreuzung auf acht, etc. Die Vertretung der Nachkommenschaft mit vielen verschiedenen Elternteilen aus diesen nachfolgenden Kreuzungen wird nicht so hoch wie die einzelne und doppelte Elternteil-Nachkommenschaft sein, wird jedoch detektierbar sein und bedeutend höher als von einer einzelnen Kreuzung. Die repetitive Fusion vor dem Screenen ist analog zu vielen sexuellen Kreuzungen innerhalb einer Population, und die einzelnen thermalen Zyklen des in vitro-DNA-Shufflings sind oben stehend beschrieben. Ein Faktor, der den Wert dieses Ansatzes beeinflusst, ist die Ausgangsgröße der parenteralen Population. Wenn die Population wächst, wird es wahrscheinlicher, dass eine Fusion mit vielen verschiedenen Elternteilen aus repetitiven Fusionen entstehen wird. Wenn bspw. 4 Elternteile zweimal fusioniert werden, werden die 4-Elternteil-Nachkommenschaften bis zu ungefähr 0,2% der Gesamtnachkommenschaft ausmachen. Dies reicht für das Auffrischen in einer Population von 3000 (95% Konfidenz) aus, jedoch ist eine bessere Vertretung bevorzugt. Wenn 10 Elternteile zweimal fusioniert werden, werden mehr als 20% der Nachkommenschaft die Nachkommen von vier Elternteilen sein.
3. Anreicherung hinsichtlich vielfach fusionierter Protoplasten:
Nach der Fusion einer Population von Protoplasten werden die fusionierten Zellen typischerweise in einem hypotonen Medium verdünnt, um das fusionierende Agens herauszuverdünnen (bspw. 50% PEG). Die fusionierten Zellen können über einen kurzen Zeitraum hinweg wachsen gelassen werden, um die Zellwände zu regenerieren, oder aber direkt getrennt und anschließend, basierend auf der Größe, getrennt werden. Dies wird bspw. durch eine Zellsortierung durchgeführt, unter Verwendung der Lichtdispersion als eine Größeneinschätzung, um die größten fusionierten Zellen zu isolieren. Alternativ können die fusionierten Zellen durch FACS auf Basis des DNA-Gehalts sortiert werden. Die großen fusionierten Zellen oder diejenigen, die mehr DNA enthalten, resultieren aus der Fusion vieler verschiedener Elternteile und teilen sich mit größerer Wahrscheinlichkeit in eine Nachkommenschaft mit vielen verschiedenen Elternteilen auf. Die angereicherten fusionierten Zellen werden regeneriert und direkt gescreent, oder aber die Nachkommenschaft wird rekursiv, wie weiter oben beschrieben, fusioniert, um die Population hinsichtlich diverser Mutantenkombinationen anzureichern.
4. Transduktion:
Die Transduktion kann die pool-weise Rekombination theoretisch beeinflussen, wenn die transduzierenden Phagenpartikel eher hauptsächlich wirtsgenomische DNA als Phagen-DNA enthalten. Wenn die Phagen-DNA überrepräsentiert ist, werden die meisten Zellen zumindest ein unerwünschtes Phagengenom empfangen. Die Phagenpartikel, die aus einem Locked-in-Prophagen (siehe oben) hergestellt wurden, sind für diesen Zweck geeignet. Eine Zellpopulation wird mit einem geeigneten transduzierenden Phagen infiziert, das Lysat gesammelt und dazu verwendet, die gleiche Ausgangspopulation zu infizieren. Eine hohe Vielzahl an Infektionen wird eingesetzt, um viele genomische Fragmente in jede infizierte Zelle einzuschleusen, wodurch die Chance erhöht wird, Rekombinanten zu produzieren, die Mutationen von mehr als zwei Elternteilgenomen enthalten. Die resultierenden Transduktanten werden unter Bedingungen gewonnen, unter welchen sich die Phagen nicht vermehren können, bspw. in Gegenwart von Citrat. Diese Population wird anschließend direkt gescreent oder wiederum mit Phagen infiziert, wobei die resultierenden transduzierenden Partikel dazu eingesetzt werden, die erste Nachkommenschaft zu transduzieren. Dies würde die rekursive Protoplastenfusion, die mehrfache sexuelle Rekombination sowie das in vitro-DNA-Shuffling nachahmen.
HH. MULTI-ZYKLEN-REKOMBINATION
Wie weiter oben bemerkt, stellt die Protoplastenfusion ein effizientes Mittel für die Rekombination zweier mikrobieller Genome dar. Das Verfahren resultiert reproduzierbar in ungefähr 10% einer nicht-selektierten Population, die rekombinante chimäre Organismen darstellt.
Protoplasten sind Zellen, bei welchen die Zellwände durch Behandlung in einem hypotonen Medium mit Zellwandverdauenden Enzymen entfernt wurde. Die Protoplastenfusion ist die induzierte Fusion der Membranen von zwei oder mehrerer dieser Protoplasten mittels fusogener Agenzien, wie bspw. Polyethylenglykol. Die Fusion resultiert in das Vermischen von Cytoplasma und versammelt die Genome der fusionierten Zellen innerhalb der gleichen Membran. Unter diesen Bedingungen ist die Rekombination zwischen den Genomen häufig.
Die fusionierten Protoplasten werden regeneriert, und während der Zellteilung teilen sich die einzelnen Genome in jeweils eine Tochterzelle auf. Typischerweise besitzen 10% dieser Tochterzellen Genome, die teilweise von mehr als einem der ursprünglichen parenteralen Protoplastengenome stammen.
Dieses Ergebnis ist ähnlich zu dem Crossing-over von Schwesterchromatiden in eukaryotischen Zellen während der Prophase der Meiose II. Der Prozentsatz an Tochterzellen, die rekombinant sind, ist nach der Protoplastenfusion etwas niedriger. Während die Protoplastenfusion in eine effiziente Rekombination resultiert, tritt die Rekombination hauptsächlich zwischen zwei Zellen wie bei der sexuellen Rekombination auf.
Um effizient Bibliotheken ganzer zusammengesetzter Genome zu generieren, werden Tochterzellen mit einer genetischen Information hergestellt, die aus verschiedenen Elternteilen herrührt.
Das in vitro-DNA-Shuffling resultiert in die effiziente pool-weise Rekombination verschiedener homologer DNA-Sequenzen. Die Wiederneuanordnung vollständiger Gene aus einem gemischten Pool kleiner Gen-Fragmente macht viele Annealing- und Verlängerungszyklen notwendig, nämlich die thermalen Zyklen der Primer-losen PCR-Reaktion. Während jedes thermalen Zyklus richten sich Fragmentpaare aneinander aus und werden verlängert, um eine kombinatorische Population größerer chimärer DNA-Fragmente zu bilden. Nach dem ersten Zyklus der Wiederanordnung enthalten die chimären Fragmente Sequenzen, die aus zwei unterschiedlichen parenteralen Genen herrühren. Dies ist ähnlich zu dem Ergebnis eines einzelnen sexuellen Zyklus innerhalb einer Population, einer paarweisen Kreuzung oder einer Protoplastenfusion. Während des zweiten Zyklus können diese chimären Fragmente aneinander ausgerichtet werden, oder mit anderen kleinen Fragmenten, was in Chimären resultiert, die von bis zu vier unterschiedlichen parenteralen Sequenzen herrühren.
Dieser zweite Zyklus ist analog zu der gesamten Nachkommenschaft aus einer einzigen sexuellen Kreuzungs-Inzucht. Weitere Zyklen werden in Chimären resultieren, die aus 8, 16, 32 etc. parenteralen Sequenzen herrühren und die zu weiteren Inzuchten der Nachkommenschaftpopulation analog sind. Die hohe Nützlichkeit des in vitro-DNA-Shufflings liegt darin, dass eine große kombinatorische Bibliothek aus einem einzelnen Pool von DNA-Fragmenten hergestellt werden kann, welche durch diese rekursiven paarweisen „Paarungen" wieder zusammengebaut sind. Wie oben beschrieben, resultieren in vivo-Shuffling-Strategien, wie bspw. die Protoplastenfusion, in einer einzigen paarweisen Paarungsreaktion. Daher werden, um den Grad der Diversität, der durch die in vitro-Verfahren erhalten wird, herzustellen, in vivo-Verfahren rekursiv durchgeführt. Dies bedeutet, dass ein Pool von Organismen rekombiniert und die Nachkommenschaft gepoolt wird, und zwar ohne Selektion, und anschließend wiederum rekombiniert wird. Dieses Verfahren wird über mehrere hinreichende Zyklen wiederholt, was in eine Nachkommenschaft resultiert, die viele parenterale Sequenzen besitzt.
Nachstehend beschrieben ist ein Verfahren, welches zur Neuzusammensetzung von vier Stämmen von Streptomyces coelicolor verwendet wird. Ausgehend von den ursprünglichen vier Stämmen, von denen jeder einen besonderen Nährstoffmarker enthält, waren drei bis vier Runden einer rekursiven gepoolten Protoplastenfusion hinreichend, um eine Population an neu zusammengesetzten Organismen zu schaffen, die alle 16 möglichen Kombinationen der vier Marker enthielten. Dies stellt eine 10⁶-fache Verbesserung bei der Herstellung der vier Elternnachkommenschaften dar, im Vergleich zu einer einzelnen gepoolten Fusion der vier Stämme.
Wie in 31 gezeigt, werden die Protoplasten aus mehreren Stämmen von S. coelicolor hergestellt, gepoolt und fusioniert. Das Myzel wird regeneriert und zur Sporulation gebracht. Die Sporen werden gesammelt, anschließend das Wachstum in Myzel zugelassen, Protoplasten geformt, gepoolt und fusioniert, und der Prozess anschließend für drei bis vier Runden wiederholt. Die resultierenden Sporen wurden dann einem Screening unterzogen.
Das zugrunde liegende Protokoll zur Herstellung einer neu zusammengesetzten Gesamtgenom-Bibliothek aus vier S. coelicolor-Stämmen, von denen jeder einen von vier unterschiedlichen Markern trägt, lautete wie folgt. Vier Myzelkulturen, von denen jede einen Stamm mit einem von vier unterschiedlichen Markern darstellte, wurden bis in die frühe stationäre Phase kultiviert. Das Myzel aus jeder der Kulturen wurde durch Zentrifugation geerntet und gewaschen. Die Protoplasten aus jeder Kultur wurden wie folgt hergestellt.
Ungefähr 10⁹ S. coelicolor-Sporen wurden in 50 ml YEME mit 0,5% Glycin in einem 250-ml-Kolben beimpft. Die Sporen wurden bei 30°C über 36 bis 40 Stunden in einem Rundschüttler inkubiert. Das Myzel wurde unter Verwendung eines Mikroskops verifiziert. Einige Stämme benötigten einen zusätzlichen Wachstumstag. Die Kultur wurde in ein 50-ml-Röhrchen überführt und 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert. Das Myzel wurde zweimal mit 10,3% Sucrose gewaschen und 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert (das Myzel kann nach dem Waschen bei –80°C aufbewahrt werden). Anschließend wurden 5 ml Lysozym zu dem ~0,5 g schweren Myzel-Pellet hinzugefügt. Das Pellet wurde suspendiert und 20 bis 60 Minuten bei 30°C unter vorsichtigem Rühren alle 10 Minuten inkubiert. Alle 20 Minuten wurde die Protoplastenbildung durch ein Mikroskop kontrolliert. Sobald der Großteil Protoplasten darstellte, wurde die Protoplastenbildung durch Hinzufügung von 10 ml P-Puffer gestoppt. Die Protoplasten wurden durch Baumwolle gefiltert und 7 Minuten bei Raumtemperatur bei 3000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Protoplasten vorsichtig resuspendiert, indem eine geeignete Menge an P-Puffer im Verhältnis zu der Pelletgröße (gewöhnlich etwa 500 μl) hinzugefügt wurde. In P-Puffer wurden Zehnfach-Reihenverdünnungen hergestellt, und die Protoplasten mit einer 10^–2-Verdünnung ausgezählt. Die Protoplasten wurden auf 10¹⁰ Protoplasten pro ml eingestellt.
Die Protoplasten aus jeder Kultur wurden mikroskopisch quantifiziert. 10⁸ Protoplasten aus jeder Kultur wurden im gleichen Röhrchen gemischt, gewaschen und anschließend durch das Hinzufügen von 50% PEG fusioniert. Die fusionierten Protoplasten wurden verdünnt und im Regenerationsmedium ausplattiert, sowie anschließend so lange inkubiert, bis die Kolonien sporulierten (vier Tage). Die Sporen wurden geerntet und gewaschen. Diese Sporen stellen einen Pool aller Rekombinanten und Elternteile aus der Fusion dar. Eine Probe der gepoolten Sporen wurde dazu verwendet, eine einzelne Flüssigkultur zu beimpfen. Die Kultur wurde bis zur frühen stationären Phase kultiviert, das Myzel geerntet und die Protoplasten hergestellt. 10⁸ Protoplasten aus dieser „Myzel-Bibliothek" wurden anschließend mit sich selber fusioniert, und zwar durch Hinzufügen von 50% PEG. Die Schritte zur Protoplastenfusion/Regeneration/Ernten/Protoplastenherstellung wurden zweimal wiederholt. Die Sporen, die aus der vierten Fusionsrunde herrührten, wurden als die „neu zusammengesetzte Gesamtgenom-Bibliothek" betrachtet und diese wurden hinsichtlich der Häufigkeit der 16 möglichen Kombinationen der vier Marker gescreent. Die Ergebnisse aus jeder Fusionsrunde sind in 33 und in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
Die Ergebnisse des Shuffling-Verfahrens sind in 33 wiedergegeben. Im Einzelnen wurde festgestellt, dass – wenn Rekombinationsrunden vor einer Selektion hinzugefügt werden – ein bedeutender Anstieg in der Anzahl der Klone erzielt wurde, die alle vier der relevanten Selektionsmarker eingebaut hatten, was darauf hindeutet, dass die Population ansteigend divers wurde, und zwar durch das rekursive Poolen und die Sporulation. Zusätzliche Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
Die vier Stämme der vier Elternteile-Shufflings waren jeweils auxotroph für drei und prototroph für eine von vier möglichen Nährstoffmarkern: Arginin (A), Cystein (C), Prolin (P) und/oder Uracil (U). Die Sporen aus jeder Fusion wurden in jeder der 16 möglichen Kombinationen dieser vier Nährstoffe ausplattiert und der Prozentsatz der Population, die auf einem besonderen Medium wuchs, wurde als das Verhältnis dieser Kolonien von einer selektiven Platte berechnet, im Verhältnis zu denjenigen, die auf einer Platte mit allen vier Nährstoffen wachsen (alle Varianten wachsen auf dem Medium mit allen vier Nährstoffen, so dass die Kolonien von dieser Platte die gesamte lebensfähige Population darstellen). Die korrigierten Prozentsätze für jedes der Phänotypen mit keinem, einem, zwei und drei Markern wurde durch Abziehen des Prozentsatzes an Zellen bestimmt, welche zusätzliche Marker besitzen, die auf dem Medium mit „unnötigen" Nährstoffen wachsen könnten. So wurde bspw. die Anzahl der Kolonien, die auf keinen zusätzlichen Nährstoffen (prototroph) wuchsen, von der Anzahl der Kolonien abgezogen, die auf jeder Platte wuchsen, die Nährstoffe benötigten.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sollen lediglich darstellenden Zwecken dienen, jedoch die vorliegende Erfindung nicht begrenzen. Im Wesentlichen äquivalente Variationen der genauen hierin dargestellten Verfahren werden den Fachleuten nach Durchsicht der vorliegenden Offenbarung klar sein. Beispiele, die sich nicht auf die beanspruchte Erfindung beziehen, sind lediglich zu Illustrationszwecken mit eingeschlossen.
B. BEISPIEL 2: GESAMTORGANISMUSENTWICKLUNG FÜR EINE HYPER-REKOMBINATION
Die Möglichkeit der Selektion eines E. coli-Stammes mit einem erhöhten Level an Rekombination wurde aus Phänotypen vom Wildtyp, ΔrecA-, mutS-, und ΔrecA mutS-Stämmen angezeigt, gefolgt von einem Aussetzen gegenüber Mitomycin C, einem Inter-Strang-kreuzverbindenden Agens der DNA.
Das Aussetzen von E. coli gegenüber Mitomycin C verursacht eine Inter-Strang-Kreuzverbindung der DNA, wodurch die DNA in der Replikation blockiert wird. Die Reparatur der Inter-Strang-DNA-Kreuzverbindung in E. coli wird durch einen RecA-abhängigen rekombinatorischen Reparaturweg vollzogen (Friedberg et al., in: DNA Repair and Mutagenesis (1995), Seiten 191–232). Die Weiterverarbeitung der Kreuz-Verbindungen während der Reparatur resultiert in gelegentliche Doppelstrang-DNA-Brüche, welche ebenfalls durch eine RecA-abhängige rekombinatorische Route repariert werden. Dementsprechend sind RecA^–-Stämme einer Mitomycin C-Aussetzung gegenüber bedeutend empfindlicher als Wildtyp-Stämme. Tatsächlich wird Mitomycin C bei einfachen Disk-Sensivitätsassays verwendet, um zwischen RecA⁺- und RecA^–-Stämmen zu unterscheiden.
Zusätzlich zu dessen rekombinogenen Eigenschaften ist Mitomycin C auch ein Mutagen. Das Aussetzen gegenüber DNA-schädigenden Substanzen, wie bspw. Mitomycin C, resultiert typischerweise in die Induktion des E. coli-SOS-Regulons, welches Produkte mit einschließt, die bei der Fehler-gebundenen Reparatur von DNA-Schädigungen beteiligt sind (Friedberg et al., 1995, siehe oben, Seiten 465–522).
Nach der Phagen-P1-vermittelten verallgemeinerten Transduktion des Δ(recA^–-srl)::Tn10-Allels (ein nicht-funktionelles Allel) in Wildtyp- und mutS-E. coli wurden Tetracyclinresistente Transduktanten hinsichtlich des recA^–-Phänotyps gescreent, und zwar unter Verwendung des Mitomycin C-Sensitivitätsassays. In LB-Überschichtungen mit einem 1/4-Inch-Filter-Plättchen, gesättigt mit 10 μg Mitomycin C wurde nach 48 Stunden bei 37°C beobachtet, dass das Wachstum des Wildtyps und der mutS-Stämme innerhalb einer Region mit einem Radius von ungefähr 10 mm vom Zentrum des Plättchens gehemmt war. Das DNA-Kreuzverbinden bei hohen Mitomycin C-Leveln sättigt deren rekombinatorische Reparatur, was zu einer tödlichen Blockierung der DNA-Replikation führt. Beide Stämme entwickelten innerhalb der Inhibierungszone gelegentlich Kolonie-bildende Einheiten, obwohl die Frequenz der Kolonien im mutS-Stamm zehn- bis zwanzigfach höher war. Dies ist vermutlich auf die erhöhte Rate der spontanen Mutation mit mutS-Hintergrund zurückzuführen. Ein direkter Vergleich zeigte, dass die ΔrecA- und ΔrecA mutS-Stämme bedeutend empfindlicher gegenüber Mitomycin C waren, wobei das Wachstum in einer Region inhibiert wurde, die sich über 15 mm vom Zentrum des Plättchens erstreckte. Jedoch wurden im Gegensatz zu den recA^–-Stämmen keine Mit^r-Individuen innerhalb der Region der Wachstumsinhibierung beobachtet, nicht einmal in dem mutS-Hintergrund. Das Auftreten von Mit^r-Individuen bei recA⁺-Hintergründen, jedoch nicht in ΔrecA-Hintergründen, deutete an, dass Mit^r von einem funktionellen recA-Protein abhängig ist, und legt nahe, dass Mit^r aus einer erhöhten Fähigkeit für eine rekombinatorische Reparatur einer Mitomycin C-induzierten Schädigung resultieren kann.
Mutationen, die zu einer erhöhten Fähigkeit für eine RecA-vermittelte rekombinatorische Reparatur führen, können unterschiedlich, unerwartet, unverbunden und potentiell synergistisch sein. Mit einem rekursiven Protokoll, bei welchem die Selektion hinsichtlich Mit^r und das chromosomale Shuffling abwechseln, werden individuelle Zellen mit einer bedeutend erhöhten Fähigkeit für die Rekombination entwickelt.
Das rekursive Protokoll lautet wie folgt. Nach dem Aussetzen eines mutS-Stammes gegenüber Mitomycin C werden Mit^r-Individuen gepoolt und kreuzgezüchtet (bspw. durch ein Hfrvermitteltes chromosomales Shuffling oder durch eine verallgemeinerte Split-Pool-Transduktion, oder durch Protoplastenfusion). Allele, die in Mit^r resultieren, und die vermutlich in einer erhöhten Fähigkeit für eine rekombinatorische Reparatur resultieren, werden in Abwesenheit einer Fehlanpassungs-Reparatur in der Population neu zusammengesetzt. Darüber hinaus kann die Fehler-basierte Reparatur nach einer Exposition gegenüber Mitomycin C neue Mutationen für die nächste Shuffling-Runde einführen. Das Verfahren wird unter Verwendung ansteigender, stringenter Aussetzungen gegenüber Mitomycin C wiederholt. Eine Anzahl paralleler Selektionen in der ersten Runde als Mittel zur Herstellung einer Verschiedenheit von Allelen. Wahlweise kann die Rekombinogenizität der Isolate hinsichtlich einer Hyper-Rekombination unter Verwendung eines Plasmid × Plasmid-Assays oder eines Chromosom × Chromosom-Assays beobachtet werden (bspw. dasjenige von Konrad, J. Bacteriol. 130, 167–172 (1977)).
C. BEISPIEL 3: GESAMTGENOM-SHUFFLING VON STREPTOMYCES COELICOLOR ZUR VERBESSERUNG DER PRODUKTION VON γ-ACTINORHODIN
Um die Produktion des Sekundär-Metaboliten γ-Actinorhodin von S. coelicolor zu verbessern, wird das Gesamtgenom dieses Organismus entweder alleine oder mit dessen nahen Verwandten S. lividans neu zusammengesetzt. Bei dem ersten nachstehend beschriebenen Verfahren entsteht die genetische Diversität aus Zufallsmutationen, die durch chemische oder physikalische Mittel hergestellt werden. In dem zweiten Verfahren entsteht die genetische Diversität aus der natürlichen Diversität, die zwischen den Genomen von S. coelicolor und S. lividans besteht.
Sporen-Suspensionen von S. coelicolor werden in sterilem Wasser resuspendiert und einer UV-Mutagenese derart unterzogen, dass 1% der Sporen überleben (~600 „Energie"-Einheiten unter Verwendung eines Stratalinkers, Stratagene), und die resultierenden Mutanten werden auf Sporulations-Agar „ausgewachsen". Einzelne Sporen repräsentieren einkernige Zellen, welche innerhalb ihres Genoms unterschiedliche Mutationen tragen. Die Sporen werden gesammelt, gewaschen und auf festem Medium ausplattiert, vorzugsweise auf Sojabohnen-Agar, R5, oder einem anderen reichen Medium, das in sporulierende Kolonien resultiert. Die Kolonien werden sichtbar gemacht und unter Verwendung eines automatisierten Kolonienpickers zufällig gepickt, bspw. durch den Q-bot (Genetix). Alternativ werden Kolonien, die größere oder dunklere Höfe aus blauem Pigment bilden, zusätzlich oder vorzugsweise gepickt.
Die Kolonien werden auf 96-Well-Mikrotiterplatten mit 1/3 × YEME-Medium (170 μl/Well) angeimpft. Zwei sterile 3-mm-Glaskügelchen werden in jedes Well hinzugefügt und die Platten bei 150 bis 250 rpm bei 30°C in einem befeuchteten Inkubator geschüttelt. Die Platten werden bis zu 7 Tage inkubiert und die Zellüberstände hinsichtlich der γ-Actinorhodin-Produktion untersucht.
Für die Untersuchung werden 50 μl des Überstands zu 100 μl an destilliertem Wasser in einer 96-Well-Polypropylen-Mikrotiterplatte hinzugefügt, und die Platte anschließend bei 4000 rpm zentrifugiert, um das Myzel zu pelletieren. 50 μl des klaren Überstandes wird entfernt und in eine Polystyren-96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden überführt, welche 150 μl 1 M KOH in jedem Well enthielt. Die resultierenden Platten werden anschließend in einem Mikrotiterplatten-Leser abgelesen, der die Absorption bei 654 nm der einzelnen Proben als Messung des Gehalts an γ-Actinorhodin misst.
Das Myzel aus Kulturen, die γ-Actinorhodin bei Leveln produzieren, die um einiges höher sind als diejenigen des Wildtyps S. coelicolor, werden anschließend isoliert. Diese werden auf festem Sporulationsmedium vermehrt und Sporenpräparate jeder verbesserten Mutante werden hergestellt. Aus diesen Präparaten werden Protoplasten jeder der verbesserten Mutanten hergestellt, gepoolt und fusioniert (wie in Genetic Manipulation of Streptomyces – A laboratory Manual, Hopwood, D. A., et al. beschrieben). Die fusionierten Protoplasten werden regeneriert und zur Sporulation gebracht. Die Sporen werden gesammelt und entweder auf festem Medium für ein weiteres Picken und Screening ausplattiert oder, um die Vertretung einer Nachkommen schaft mit verschiedenen Elternteilen zu erhöhen, werden zur Herstellung von Protoplasten verwendet und wieder fusioniert (oder mehrere Male, wie zuvor für andere Verfahren beschrieben, um eine pool-weise Rekombination zu bewirken), und zwar vor einem weiteren Picken und Screenen.
Weiter verbesserte Mutanten resultieren aus der Kombination von zwei oder mehreren Mutationen, die einen additiven oder synergistischen Effekt auf die γ-Actinorhodin-Produktion haben. Weiter verbesserte Mutanten können wiederum durch pool-weise Protoplastenfusion gepaart werden, oder sie können einer Zufalls-Mutagenese unterzogen werden, um eine neue Population an Zellen herzustellen, die gescreent und hinsichtlich weiterer Verbesserung gepaart werden sollen.
Als eine Alternative für die Zufalls-Mutagenese als Quelle der genetischen Diversität kann die natürliche Diversität eingesetzt werden. In diesem Fall werden Protoplasten, hergestellt aus dem Wildtyp S. coelicolor und S. lividans, fusioniert. Sporen aus der regenerierten Nachkommenschaft dieser Paarung werden anschließend repetitiv fusioniert und regeneriert, um eine zusätzliche Diversität zu bilden, oder aber sie werden auf festem Medium getrennt, gepickt und hinsichtlich der verstärkten Produktion von γ-Actinorhodin gescreent. Wie zuvor beschrieben, werden die verbesserten Subpopulationen gepaart, um weiter verbesserte Familien-neu-zusammengesetzte Organismen zu identifizieren.
D. BEISPIEL 4: EIN ACTINORHODIN-ASSAY MIT HOHEM DURCHSATZ
Zusätzliche Details über einen Actinorhodin-Assay mit hohem Durchsatz-Shuffling, das für die Selektion von Myzel eingesetzt wird, sind in 32 dargestellt. Kurz gesagt werden neu zusammengesetzte Zellen durch standardisierte und automatisierte Verfahren unter Verwendung eines Q-bot-Robotsystems gepickt und auf Standard-96-Well-Platten übertragen. Nach einer Inkubation bei 30°C über 7 Tage hinweg wird das resultierende Myzel zentrifugiert und eine Probe des Zellüberstandes entfernt und mit 0,1 M KOH in einer 96-Well-Platte vermengt und die Absorption bei 654 nm abgelesen. Die besten positiven Klone wurden ausgewählt und in Schüttelflaschen kultiviert.
Ungefähr 10⁹ Protoplasten wurden 7 Minuten lang bei 3000 rpm zentrifugiert. Wenn mehr als ein Stamm verwendet wurde, so wurde eine gleiche Anzahl an Protoplasten von jedem Stamm verwendet. Der Puffer wurde überwiegend entfernt und das Pellet im verbleibenden Puffer (~25 μl Gesamtvolumen) durch vorsichtiges Anschnipsen resuspendiert. 0,5 ml 50% PEG1000 wurde hinzugefügt und mit den Protoplasten durch vorsichtiges, zweimaliges Ein- und Auspipettieren gemischt. Anschließend wurde die Mischung 2 Minuten lang inkubiert. 0,5 μl P-Puffer wurde hinzugefügt und vorsichtig gemischt. (Dies stellt die Fusion mit einer Verdünnung von 10^–1 dar). Eine zehnfache Reihenverdünnung wurde in P-Puffer durchgeführt. Nach 2 Minuten wurden die Verdünnungen mit 10^–1, 10^–2 und 10^–3 auf R5-Platten mit jeweils 50 μl ausplattiert, 2^–3 Platten pro Verdünnung (pro Platte wurden –20 3-mm-Glaskügelchen eingesetzt, unter vorsichtigem Schütteln). Als eine erste Kontrolle für die Regeneration der Protoplasten wurde die gleiche Anzahl an Protoplasten wie oben stehend verwendet, wobei P-Puffer zu einem Gesamtvolumen von 1 ml hinzugefügt wurde (dies stellt die Regeneration mit einer Verdünnung von 10^–1 dar). Die Mischung wurde in P-Puffer weiter verdünnt (10×). Die Verdünnungen wurden mit 10^–3, 10^–4 und 10^–5 auf R5-Platten mit jeweils 50 μl ausplattiert. Als eine zweite Kontrolle (für die Überprüfung des Hintergrunds eines nicht-Protoplasten-bildenden Myzels) wurde die gleiche Anzahl an Protoplasten verwendet, und zwar unter Verwendung von 0,1% SDS in einem Gesamtvolumen von 1 ml (dies stellt den Hintergrund bei einer Verdünnung von 10^–1 dar). Nach einer weiteren zehnfachen Verdünnung in 0,1% SDS wurde die Verdünnung mit 10^–1, 10^–2 und 10^–3 mit jeweils 50 μl auf R5-Platten ausplattiert. Die Platten wurden luftgetrocknet und 3 Tage lang bei 30°C inkubiert.
Die Anzahl der Kolonien wurde auf jeder Platte ausgezählt (diejenigen, die auszählbar waren), unter Verwendung der Anzahl der regenerierten Protoplasten als ein Wert von 100%, und unter Berechnung des Prozentsatzes des Hintergrundes (gewöhnlicherweise kleiner als 1) und die Überlebensrate der Fusion (gewöhnlich größer als 10). Die Fusionsplatten wurden 2 weitere Tage bei 30°C inkubiert, bis alle Kolonien hinreichend sporulierten. Die Sporen wurden von denjenigen Platten geerntet, die weniger als 5000 Kolonien aufwiesen. Die Sporen wurden durch Baumwolle gefiltert und einmal mit Wasser gewaschen, anschließend in 20% Glycerol resuspendiert und ausgezählt. Diese Sporen wurden für weitere Untersuchungen eingesetzt, mit ihnen weitere Kulturen angeimpft oder einfach bei –20°C gelagert.
E. BEISPIEL 4: GESAMTGENOM-SHUFFLING VON RHODOCOCCUS HINSICHTLICH EINER ZWEIPHASEN-REAKTIONSKATALYSE
Dieses Beispiel stellt ein Beispiel dar, wie die hierin beschriebenen Techniken auf Technologien angewandt werden können, mit welchen die generische Verbesserung von Biotransformationen ermöglicht werden kann, die durch ganze Zellen katalysiert werden. Rhodococcus wurde als Ausgangsziel ausgewählt, da diese Spezies ein Vertreter eines Systems ist, welches in der Molekularbiologie elementar ist (da es für Ganzzell-Katalysatoren, die im Allgemeinen durch Screening von Umweltisolaten selektiert werden, gewöhnlich ist), und da Rhodococcus ein Organismus ist, der Zweiphasenreaktionen katalysieren kann.
Das Ziel des Gesamtgenom-Shufflings von Rhodococcus ist es, durch irgendeinen ausgewählten Weg einen Anstieg im Fluss zu erhalten. Die Substratspezifität des Weges kann dahingehend geändert werden, dass sie Moleküle akzeptiert, die nicht gegenwärtig verwendete Substrate sind. Jedes dieser Merkmale kann während des Gesamtgenom-Shufflings ausgewählt werden.
Während des Gesamtgenom-Shufflings werden Bibliotheken von neu zusammengesetzten Enzymen und Wege hergestellt und in Rhodococcus transformiert und anschließend gescreent, vorzugsweise durch Assays mit hohem Durchsatz, zur Verbesserung im Zielphänotyp, bspw. durch Massenspektroskopie zur Messung des Produktes.
Wie oben bemerkt, kann der chromosomale Kontext der Gene dramatische Effekte auf deren Aktivitäten haben. Die Klo nierung der Zielgene auf ein kleines Plasmid in Rhodococcus kann die Gesamtstoffwechselwegs-Aktivität dramatisch reduzieren (um einen fünf- bis zehnfachen Faktor, oder noch höher). Aus diesen Gründen kann der Ausgangspunkt für das DNA-Shuffling eines Weges (auf einem Plasmid) zehnfach niedriger sein als die Aktivität des Wildtyp-Stammes. Im Gegensatz hierzu kann die Integration der Gene in Zufallsstellen in das Rhodococcus-Chromosom zu einem signifikanten Anstieg in der Aktivität führen (5- bis 10-fach). Ein ähnliches Phänomen wurde bei der kürzlich vorgenommenen, gerichteten Evolution in E. coli beobachtet, und zwar für ein Arsen-Resistenzoperon (ursprünglich von Staphylococcus aureus) durch DNA-Shuffling. Das Shuffling dieses Plasmids produzierte Sequenzänderungen, die zu einer effizienten Integration des Operons in das E. coli-Chromosom führten. Von dem insgesamt 50-fachen Anstieg in der Arsen-Resistenz, die durch die gerichtete Evolution der drei Gen-Wege erreicht wurde, resultierte das etwa 10-fache aus dieser Integration in das Chromosom. Die Position innerhalb des Chromosoms ist wahrscheinlich auch wichtig: so haben bspw. Sequenzen nahe dem Replikationsursprung eine effektiv höhere Gen-Dosierung und besitzen daher einen höheren Expressionslevel.
Um unvorhersehbare chromosomale Positionseffekte vollständig zu erforschen, und um diese in einer gerichteten Evolutionsstrategie, bei welcher viele Mutationszyklen, Rekombinations- und Selektionszyklen eingesetzt werden, einzubauen, werden die Gene in vitro manipuliert und anschließend in eine optimale Chromosomenposition transferiert. Die Rekombination zwischen Plasmid und Chromosom vollzieht sich auf zwei unterschiedliche Wege. Die Integration findet an einer Position statt, wo es eine signifikante Sequenzhomologie zwischen Plas mid und Chromosom gibt, das heißt, durch homologe Rekombination. Die Integration findet auch dort statt, wo es keine offensichtliche Sequenzidentität gibt, das heißt, durch nicht-homologe Rekombination. Diese zwei Rekombinationsmechanismen werden durch unterschiedliche zelluläre Maschinerien beeinflusst und besitzen bei der gerichteten Evolution unterschiedliche potentielle Anwendungen.
Um den Anstieg in der Aktivität zu kombinieren, der aus der Gen-Duplikation und der chromosomalen Integration des Zielweges mit der wirkungsvollen Technik des DNA-Shufflings resultierte, werden in vitro Bibliotheken neu zusammengesetzter Gene hergestellt, und durch homologe Rekombination anstelle der Wildtyp-Gene in das Chromosom integriert. Anschließend werden die Rekombinanten hinsichtlich der erhöhten Aktivität gescreent. Der Prozess wird wahlweise rekursiv, wie hierin beschrieben, wiederholt. Die besten Rhodococcus-Varianten werden gepoolt und der Pool in zwei Teile aufgeteilt. Aus diesem Pool werden die Gene durch PCR herauskloniert, neu zusammengesetzt und durch homologe Rekombination wieder in die Chromosomen der anderen Hälfte des Pools integriert. Die Rekombinanten werden wiederum gescreent und die Besten herausgenommen und gepoolt, sowie der Prozess wahlweise wiederholt.
Manchmal gibt es komplexe Wechselwirkungen zwischen Enzymen, die die aufeinander folgende Reaktionen in einem Stoffwechselweg katalysieren. Manchmal kann das Vorliegen eines Enzyms die Aktivitäten anderer Enzyme in dem Weg nachteilig beeinflussen. Dies kann das Ergebnis von Protein-Protein-Wechselwirkungen sein, oder die Inhibierung eines Enzyms durch das Produkt eines anderen, oder aber ein Ungleichgewicht von Primär- und Sekundär-Metabolismus.
Dieses Problem wird durch das DNA-Shuffling überwunden, durch welches Lösungen im Zielgen-Cluster produziert werden, die zu Verbesserungen in dem Merkmal führen, das gescreent wird. Ein alternativer Ansatz, mit welchem nicht nur dieses Problem gelöst werden kann, sondern auch zukünftige Ratenlimitierende Schritte, wie bspw. abnehmende Fähigkeit und Substrattransporte, ist die Komplementierung durch die Überexpression von anderen, bisher unbekannten genomischen Sequenzen.
Zunächst wird eine Bibliothek der genomischen DNA von Rhodococcus in einem Multikopien-Rhodococcus-Vektor, wie bspw. pRC1 hergestellt. Dieser Vektor wird in Rhodococcus transformiert und die Transformanten werden hinsichtlich Anstiege in dem erwünschten Phänotyp gescreent. Genomische Fragmente, die zu einer erhöhten Wegs-Aktivität führen, werden durch DNA-Shuffling entwickelt, um deren vorteilhaften Effekt auf die ausgewählte Eigenschaft weiter zu erhöhen. Bei diesem Ansatz werden keine Sequenzinformationen benötigt, oder irgendein Wissen oder Annahmen über die Natur des Proteins oder der Stoffwechselwegs-Wechselwirkungen, oder sogar von irgendeinem Raten-limitierenden Schritt; der Ansatz beruht lediglich auf der Detektion des erwünschten Phänotyps. Diese Art des Zufallsklonierens und der nachfolgenden Entwicklung durch DNA-Shuffling positiv interagierender, genomischer Sequenzen stellt ein äußerst wirkungsvolles und generisches Werkzeug dar. Eine Vielzahl von Quellen genomischer DNA werden eingesetzt, von isogenen Stämmen bis zu entfernter verwandten Spezies mit möglicherweise erwünschten Eigenschaften. Darüber hinaus ist die Technik prinzipiell auf jeden Mikroorganismus anwendbar, für welchen die Grundlagen der Molekularbiologie, der Transformation und der Klonierungsvektor verfügbar sind, und für irgendeine Eigenschaft, die untersucht werden kann, vorzugsweise in einem Hochdurchsatz-Format.
Die homologe Rekombination innerhalb des Chromosoms wird verwendet, um die Beschränkungen der Plasmid-Evolution und der Größenbeschränkung zu umgehen, und wird wahlweise zur Änderung des zentralen Metabolismus eingesetzt. Die Strategie ist ähnlich zu derjenigen, die weiter oben für das Shuffling von Genen innerhalb deren chromosomalen Kontext beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass kein in vitro-Shuffling auftritt. Anstelle hiervon wird der Elternstamm mit Mutagenen behandelt, wie bspw. ultraviolettem Licht oder Nitrosoguanidin, und die verbesserten Mutanten werden ausgewählt. Die verbesserten Mutanten werden gepoolt und aufgeteilt. Die Hälfte des Pools wird verwendet, um Zufalls-genomische Fragmente für die Klonierung in einen homologen Rekombinationsvektor herzustellen. Zusätzliche genomische Fragmente werden von verwandten Spezies mit erwünschten Eigenschaften abgeleitet (in diesem Fall höhere Stoffwechselraten und die Fähigkeit, auf billigeren Kohlenstoffquellen zu wachsen). Die klonierten genomischen Fragmente werden einer homologen Rekombination in die Genome der verbleibenden Hälfte des mutierten Pools unterzogen, und Varianten mit verbesserten Phänotypen werden ausgewählt. Diese werden einer weiteren Mutagenese-, Selektions- und Rekombinationsrunde unterzogen. Dieser Prozess ist hinsichtlich der Verbesserung irgendeines Gesamtzell-Biokatalysators, für welchen ein Rekombinationsvektor und ein Assay entwickelt werden können, gänzlich generisch. Eine rekursive Rekombination kann durchgeführt werden, um die Diversität des Pools an jedem Schritt in dem Verfahren zu steigern.
Eine effiziente homologe Rekombination ist für die Rekursivität der chromosomalen Entwicklungsstrategien, die oben dargestellt wurden, wichtig. Eine nicht-homologe Rekombination resultiert in eine nutzlose Integration (nach der Selektion), gefolgt von einem Ausschluss (nach einer Gegenselektion) des gesamten Plasmids. Alternativ, wenn keine Gegenselektion eingesetzt wurde, integrieren immer mehr Kopien des Plasmids/der genomischen Sequenzen, die sowohl instabil sind als auch einen zusätzlichen Selektionsmarker für jeden Zyklus benötigen. Darüber hinaus wird eine zusätzliche nicht-homologe Rekombination an Zufallspositionen stattfinden und kann – oder auch nicht – zu einer vorteilhaften Expression der integrierten Sequenz führen.
F. BEISPIEL 5: ERHÖHEN DER RATE DER HOMOLOGEN REKOMBINATION IN RHODOCOCCUS
Ein genetischer Ansatz wird verwendet, um die Rate der homologen Rekombination in Rhodococcus zu steigern. Sowohl gezielte als auch nicht gezielte Strategien werden eingesetzt, um Anstiege in der homologen Rekombination zu entwickeln. Rhodococcus recA wird durch DNA-Shuffling entwickelt, um dessen Fähigkeit zu steigern, eine homologe Rekombination innerhalb des Chromosoms zu fördern. Das recA-Gen wurde ausgewählt, da es Varianten von recA gibt, die bekanntermaßen in erhöhte Raten einer homologen Rekombination in E. coli, wie weiter oben diskutiert, führen.
Das recA-Gen von Rhodococcus wird neu zusammengesetzt und in ein Plasmid kloniert, das einen Selektionsmarker trägt, sowie eine unterbrochene Kopie des Rhodococcus-Homologs des S. cerevisiae URA3-Gens (ein Gen, das auch Sensitivität gegenüber dem Uracil-Vorläuferanalog 5-Fluorotsäure verleiht). Die homologe Integration des Plasmids in das Chromosom unterbricht den Uracil-Syntheseweg des Wirtes, was zu einem Stamm führt, der den Selektionsmarker trägt, und der auch gegenüber 5-Fluorotsäure resistent ist. Das neu zusammengesetzte recA-Gen wird integriert und kann aus dem Chromosom amplifiziert, wiederum neu zusammengesetzt und anschließend in den Integrations-Selektionsvektor kloniert werden. In jedem Zyklus sind die recA-Gene, die den höchsten Grad an homologer Rekombination fördern, diejenigen Gene, die als Integranten in dem Genom am besten repräsentiert sind. Auf diese Weise wird ein Rhodococcus recA mit verstärkter Aktivität zur Förderung der homologen Rekombination entwickelt.
Viele andere Gene sind bei mehreren unterschiedlichen homologen Rekombinationswegen beteiligt, und Mutationen in einigen dieser Proteine können zu Zellen mit einem erhöhten Level an homologer Rekombination führen. So konnte bspw. für Mutationen in der E. coli-DNA-Polymerase III kürzlich gezeigt werden, dass die recA-unabhängige homologe Rekombination gesteigert wird. Die Resistenz gegenüber DNA-kreuzverbindenden Agenzien, wie bspw. Salpetersäure, Mitomycin und Ultraviolett hängen von der homologen Rekombination ab. Daher resultieren Anstiege in der Aktivität dieses Weges in einer erhöhten Resis tenz gegenüber diesen Agenzien. Rhodococcus-Zellen werden mutagenisiert und hinsichtlich einer erhöhten Toleranz gegenüber DNA-kreuzverbindenden Agenzien selektiert. Diese Mutanten werden hinsichtlich der Rate getestet, mit welcher ein Plasmid in das Chromosom homolog integrieren wird. Aus diesen Mutanten werden genomische Bibliotheken hergestellt, wie weiter oben beschrieben kombiniert und dazu eingesetzt, einen Stamm mit noch höheren Leveln an homologer Rekombination zu entwickeln.
Die oben stehende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurde lediglich zu Illustrations- und Beschreibungszwecken dargestellt. Sie sollen weder erschöpfend sein noch die Erfindung auf die Form begrenzen, die offenbart wurde, und viele Modifizierungen und Variationen sind im Lichte der oben beschriebenen Lehre möglich. Solche Modifizierungen und Variationen, die dem Fachmann offensichtlich sein werden, sollen innerhalb des Rahmens dieser Erfindung liegen.

Claims

Verfahren zur Entwicklungsförderung einer Zelle dahingehend, dass sie eine erwünschte Eigenschaft annimmt, welches die folgenden Schritte umfasst: (i.) Bilden von Protoplasten einer Population unterschiedlicher Zellen; (ii.) Fusionieren der Protoplasten zur Bildung von hybriden Protoplasten, in welchen die Genome der Protoplasten zur Bildung von Hybrid-Genomen rekombinieren; (iii.) Inkubieren der Hybrid-Protoplasten unter Bedingungen, welche die Regeneration der Zellen fördert, wodurch regenerierte Zellen generiert werden; (iv.) wiederholtes Bilden von Protoplasten aus den regenerierten Zellen, Fusionieren der Protoplasten zur Bildung von Hybrid-Protoplasten, in welchen die Genome der Protoplasten zur Bildung von weiteren Hybrid-Genomen rekombinieren; Inkubieren der weiteren Hybrid-Protoplasten unter Bedingungen, welche die Regeneration der Zellen fördern, wodurch zusätzliche regenerierte Zellen generiert werden; und, (v.) Auswählen oder Screenen zur Isolierung zusätzlich regenerierter Zellen, die sich in Richtung Aneignung der gewünschten Eigenschaft entwickelt haben.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erwünschte Eigenschaft ausgewählt ist aus: Hitzetoleranz, Ethanol-Produktion und Ethanol-Toleranz, Säure, verbesserte Herstellung und Aufrechterhaltung von Enzym-Cofaktoren, verbesserte Produktion und Aufrechterhaltung von NAD(P)H, und verbesserter Glukosetransport.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner ein Wiederholen der Schritte (i)–(v) umfasst, und zwar mit in Schritt (iii.) regenerierten Zellen oder mit in Schritt (iv.) zusätzlich regenerierten Zellen, die zur Bildung der Protoplasten in Schritt (i.) eingesetzt werden, bis die regenerierten Zellen die erwünschte Eigenschaft erlangt haben.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Hybrid-Protoplasten Zellen umfassen, welche mehr als zwei elterliche Genome aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die unterschiedlichen Zellen Pilz-Zellen sind, und die regenerierten Zellen Pilz-Myzelien sind.
Verfahren nach Anspruch 5, in welchem die Protoplasten dadurch bereit gestellt werden, dass die Myzelien oder die Sporen mit einem Enzym behandelt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, in welchem die Pilzzellen aus einem anfälligen Stamm stammen, welchem die Fähigkeit zur intakten Zellwandsynthese fehlt, wodurch sich spontan Protoplasten bilden.
Verfahren nach Anspruch 5, welches ferner die Behandlung der Myzelien mit einem Inhibitor der Zellwandbildung umfasst zur Bildung von Protoplasten.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner die Auswahl oder das Screenen zur Isolierung von regenerierten Zellen mit Hybrid-Genomen umfasst, welche frei von Zellen mit elterlichen Genomen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem eine erste Subpopulation von Zellen einen ersten Marker von Zellen und die zweite Subpopulation von Zellen einen zweiten Marker enthält, und wobei das Verfahren ferner die Auswahl oder das Screenen zur Identifizierung regenerierter Zellen umfasst, welche sowohl den ersten als auch den zweiten Marker exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 10, in welchem der erste Marker ein Membranmarker und der zweite Marker ein genetischer Marker ist.
Verfahren nach Anspruch 10, in welchem der erste Marker eine erste Untereinheit eines heteromeren Enzyms, und der zweite Marker eine zweite Untereinheit des heteromeren Enzyms ist.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner das Transformieren der Protoplasten mit einer Bibliothek von DNA-Fragmenten in zumindest einem Zyklus umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, in welchem die DNA-Fragmente von einem Restriktionsenzym begleitet sind.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner das Aussetzten der Protoplasten gegenüber einer ultravioletten Strahlung in zumindest einem Zyklus umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die gewünschte Eigenschaft die Expression eines Proteins, eines primären Metaboliten oder eines sekundären Metaboliten ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die gewünschte Eigenschaft die Sekretion eines Proteins oder eines Sekundär-Metaboliten ist.
Verfahren nach Anspruch 17, in welchem der Sekundär-Metabolit aus Taxol, Cyclosporin A und Erythromycin gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die erwünschte Eigenschaft die Fähigkeit zur Meiose ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die erwünschte Eigenschaft die Verträglichkeit ist, ein Heterokaryon mit einem anderen Stamm zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner das Aussetzten der Protoplasten oder der Myzelien gegenüber einem mutagenen Agens in zumindest einen Zyklus umfasst.