DE69929573T2

DE69929573T2 - Biosensor, enthaltend ein Enzym und einen Zucker

Info

Publication number: DE69929573T2
Application number: DE69929573T
Authority: DE
Inventors: Keiko Nara-shi Yugawa; Toshihiko Hirakata-shi Yoshioka; Shiro Hirakata-shi Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1999-07-05
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2019-07-06
Also published as: EP0969097A3; EP0969097B1; DE69929573D1; US6656702B1; EP0969097A2; CN1243952A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor, welcher die einfache und schnelle Quantifizierung eines spezifischen Bestandteils in einer Probe mit hoher Genauigkeit erleichtert.
Herkömmlich wurden verschiedene Biosensoren als ein System vorgeschlagen, um eine einfache Quantifizierung eines spezifischen Bestandteils in einer Probe ohne die Notwendigkeit des Verdünnens oder des Rührens einer Probenlösung. Das folgende ist ein bekanntes Beispiel eines derartigen Biosensors (japanische offengelegte Patentveröffentlichung Hei 2-062952).
Der in diesem Stand der Technik offenbarte Biosensor wird durch die Schritte der Bildung eines Elektrodensystems einschließlich einer Arbeitselektrode, einer Gegenelektrode und einer Referenzelektrode auf einer elektrisch isolierenden Grundplatte unter Verwendung eines Siebdruckverfahrens, oder ähnlichem, und Ausbildung einer Enzymreaktionsschicht einschließlich eines hydrophilen Polymers, einer Oxidoreduktase und eines Elektronenakzeptors unmittelbar oberhalb dieses Elektrodensystems hergestellt.
Wenn der derartig hergestellte Biosensor mit einem Tropfen einer Probenlösung, die ein Substrat enthält, auf die Enzymreaktionsschicht versehen wurde, tritt ein Auflösen der Enzymreaktionsschicht in die Probenlösung auf, was eine Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat auslöst (Enzymreaktion). Als ein Ergebnis wird sich eine Reduktion des Elektronenakzeptors entwickeln. Nach Abschluss dieser Enzymreaktion wird der reduzierte Elektronenakzeptor elektrochemisch reoxidiert. Auf der Grundlage des Oxidationsstromwertes, gemessen während dieses Reoxidationsschritts, kann die Konzentration des Substrats in der Probenlösung quantifiziert werden.
Der vorher beschriebene Biosensor ermöglicht prinzipiell Messungen verschiedener Materialien, wenn ein geeignetes Enzym entsprechend dem Substrat eines Zielmaterials ausgewählt wird.
EP 0 560 336 A1 offenbart einen Biosensor, in welchem die Reaktionsschicht wenigstens ein Enzym, einen Elektronenakzeptor und einen Katalysator, hergestellt aus Phosphat, umfasst, zur Beschleunigung einer Gleichgewichtsreaktion zwischen α-Glukose und β-Glukose hergestellt wird.
Enzyme, welche Protein als ihren Hauptbestandteil enthalten, sind innerhalb eines Biosensors normalerweise in einem trockenen Zustand vorhanden. Jedoch kann in der Luft enthaltenes Wasser in das Enzym oder aus dem Enzym durch seine Oberfläche in Abhängigkeit von den Bedingungen der Temperatur und der Luftfeuchtigkeit gelangen. Daher wird ein langer Kontakt des Enzyms mit der Luft in einer Änderung des Wassergehalts des Enzyms resultieren, welches in dem Enzym in einer geringen Menge vorhanden ist. Als ein Ergebnis wird das Enzym abgebaut und verliert seine enzymatische Aktivität.
Während der Konservierung eines Sensors nach seiner Herstellung, wenn die Aktivität eines Enzyms in dem Sensor über die Zeit beeinträchtig wird, wird das Enzym, welches in der Enzymreaktion mit einem Substrat teilnehmen soll, abgereichert. Dies erzeugt ein Problem der Unvereinbarkeit des gemessenen Antwortstromwertes mit der Substratkonzentration.
Um das vorher erwähnte Problem zu lösen, ist es wichtig, in der Nähe des Enzyms eine Umgebung sicherzustellen, welche die Enzymaktivität für eine lange Zeit aufrechterhalten kann.
Es ist ebenfalls notwendig, einen problemlosen Transfer des Substrats und der Elektronen während der Enzymreaktion herzustellen, um die Sensorantwort zu erhöhen.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Mit Blick auf das vorher erwähnte Problem ist es eine Absicht der vorliegenden Erfindung einen Biosensor mit hoher Stabilität gegen die Abnahme der Aktivität des in dem Biosensor enthaltenen Enzyms während seiner Konservierung nach seiner Herstellung zur Verfügung zu stellen.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen kompakten, wegwerfbaren Biosensor mit geringen Kosten zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt einem Biosensor mit einer elektrisch isolierenden Grundplatte, einem Elektrodensystem einschließlich wenigstens einer Arbeitselektrode und einer auf der Grundplatte gebildeten Gegenelektrode und einer Reaktionsschicht zur Verfügung, wobei die Reaktionsschicht Trehalose und Glukosedehydrogenase, deren Coenzym Pyrrolo-Chinolin-Chinon ist, in einem Verhältnis von 40 bis 200 Nanomol Trehalose zu 5 bis 20 Einheiten Glukosedehydrogenase, deren Coenzym Pyrrolo-Chinolin-Chinon ist, und einen Elektronenakzeptor umfasst, zur Verfügung.
Wenn das Enzym die Anwesenheit eines Co-Faktors oder eines Coenzyms erfordert, können diese Bestandteile ebenfalls in der Reaktionsschicht enthalten sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Enzym Glukosedehydrogenase, deren Coenzym Pyrrolo-Chinolin-Chinon ist, und der Zucker ist Trehalose.
Während die neuartigen Merkmale der Erfindung insbesondere in den angehängten Ansprüchen festgelegt werden, wird die Erfindung, sowohl hinsichtlich ihrer Organisation und des Inhalts, besser verstanden und geschätzt werden, zusammen mit anderen Aufgaben und Merkmalen davon, aus der folgenden ausführlichen Beschreibung zusammen mit den Zeichnungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER VERSCHIEDENEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist eine schematische Draufsicht auf einen Biosensor gemäß eines Beispiels der vorliegenden Erfindung, unter Weglassung der Reaktionsschicht.
Die 2 ist eine Längsquerschnittsansicht der wesentlichen Teile des Biosensors der 1.
Die 3 ist eine grafische Darstellung, die die Antworteigenschaften des Biosensors gemäß eines Beispiels der vorliegenden Erfindung und diejenigen des Biosensors eines Vergleichsbeispiels zeigt.
Die 4 ist eine grafische Darstellung, die die Antworteigenschaften des Sensors mit verschiedenen Mengen an Enzym in der Reaktionsschicht zeigt.
Die 5 ist eine grafische Darstellung, die einen Vergleich des Verhältnisses des Antwortstromwertes nach Konservierung zu dem anfänglichen Antwortstromwert zwischen verschiedenen Sensoren mit verschiedenen Mengen an Trehalose in der Reaktionsschicht zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie vorher angegeben enthält der erfindungsgemäße Biosensor einen Zucker in der Reaktionsschicht. Wenn die Reaktionsschicht durch Auftropfen einer Enzymlösung mit einem Zucker und Trocknen der Lösung gebildet wird, wird die Oberfläche des Enzyms mit dem Zucker beschichtet. Diese Zuckerbeschichtung schützt das Enzym vor jeder Umweltänderung, wie etwa der Temperatur, der Feuchtigkeit usw., und stellt die Stabilität der Enzymaktivität für eine lange Zeit sicher.
Ferner wird der Zucker leicht in Wasser gelöst. Daher unterstützt er die schnelle Lösung der Reaktionsschicht in einer Probenlösung, wenn die Probenlösung zu der Reaktionsschicht gegeben wird. Dies ist sehr bequem, um die Enzymreaktion und die Elektrodenreaktion problemlos ablaufen zu lassen.
Insbesondere wenn das Enzym Glukosedehydrogenase ist, deren Coenzym Pyrrolo-Chinolin-Chinon ist, erzeugt die Auswahl von Trehalose als der Zucker eine bessere Sensorantwort, selbst nachdem der Sensor eine lange Zeit konserviert wurde, da Trehalose eine überraschende bewahrende Wirkung auf die Aktivität von Glukosedehydrogenase hat.
Wenn das Enzym Glukosedehyrogenase ist, deren Coenzym Pyrrolo-Chinolin-Chinon ist, und der Zucker ist Trehalose, dann ist es angemessen das Enzym Glukosedehydrogenase von 1 bis 40 Einheiten und Trehalose von 4 bis 400 nM (Nanomol) zu enthalten, bevorzugter 5 bis 20 Einheiten bzw. 40 bis 200 nM pro Sensorchip, wenn der Sensor ein Wegwerfsensor ist, welcher 3 bis 5 μl Blut als Probenlösung erfordert.
Einsetzbare Elektronenakzeptoren sind beispielsweise Ferricyanidionen, p-Benzochinon und seine Derivate, Phenazinmethosulfat, Methylenblau, Ferrocen und seine Derivate. Die Verwendung von in der Probenlösung vorhandenem Sauerstoff als der Elektronenakzeptor kann in gleicher Weise eine Sensorantwort erzeugen.
Der erfindungsgemäße Biosensor erlaubt ebenfalls eine weitere Einfügung eines hydrophilen Polymers in die Reaktionsschicht, zusätzlich zu dem Enzym, dem Zucker und dem Elektronenakzeptor.
Die Anwesenheit eines derartigen hydrophilen Polymers in der Reaktionsschicht vermeidet effektiv die Ablösung oder Abtrennung der Reaktionsschicht von der Oberfläche des Elektrodensystems. Das hydrophile Polymer hat eine weitere Wirkung der Vermeidung der Rissentwicklung in der Oberfläche der Reaktionsschicht, welche wirkungsvoll ist, um die Verlässlichkeit des resultierenden Biosensors zu erhöhen.
Bevorzugte Beispiele des hydrophilen Polymers für den vorher erwähnten Zweck sind Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose, Carboxymethylethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyaminosäuren, wie etwa Polylysin, Polystyrolsulfonat, Gelatine und ihre Derivate, ein Polymer von Acrylsäure oder einem Acrylat, ein Polymer von Methacrylsäure oder einem Methacrylat, Stärke und ihre Derivate, ein Polymer von Maleinsäureanhydrid oder einem Maleat, Agarosegel und seine Derivate.
Die Reaktionsschicht kann in dem Biosensor auf verschiedene Arten und Weisen zusätzlich zu seiner Lokalisierung auf dem Elektrodensystem angeordnet sein, welches auf der elektrisch isolierenden Grundplatte ausgebildet wird. Zum Beispiel kann es an einer anderen Stelle als dem Elektrodensystem auf der Grundplatte innerhalb des Biosensors angeordnet sein. Andererseits, wenn ein Deckelelement verwendet wird, welches mit der Grundplatte zu kombinieren ist, um einen Probenlösungszufuhrweg für die Zufuhr einer Probenlösung zu dem Elektrodensystem zwischen dem Deckelelement und der Grundplatte zu bilden, kann die Reaktionsschicht auf einer Seite des Deckelelements angeordnet sein, welche zu dem zwischen dem Deckelelement und der Grundplatte gebildeten Probenlösungszufuhrweg exponiert ist.
Um den Oxidationsstrom zu messen. kann ein Zwei-Elektrodensystem einschließlich nur einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode, und ein Drei-Elektrodensystem, das ferner eine Referenzelektrode zusätzlich zu den zwei Elektroden enthält, verwendet werden. Das letztere erleichtert präzisere Messungen.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung spezifischer mit Bezugnahme auf konkrete Beispiele beschreiben.
1 zeigt eine schematische Draufsicht auf einen Biosensor gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung, von welchem die Reaktionsschicht entfernt wurde. Eine Silberpaste wird auf eine elektrisch isolierende Grundplatte 1 aus Polyethylenterephthalat durch ein herkömmliches Siebdruckverfahren gedruckt, um die Leitungen 2 und 3 auf der Grundplatte 1 zu bilden. Nachfolgend wird eine leitfähige Kohlenstoffpaste mit einem Harzbindemittel auf die Grundplatte 1 gedruckt, um eine Arbeitselektrode 4 darauf zu bilden. Die Arbeitselektrode 4 ist in Kontakt mit der Leitung 2. Dann wird ferner eine elektrisch isolierende Schicht 6 auf der Grundplatte 1 durch Drucken einer isolierenden Paste darauf gebildet. Die elektrisch isolierende Schicht 6 bedeckt die Peripherie der Arbeitselektrode 4, um die exponierte Fläche der Arbeitselektrode 4 konstant zu halten. Schließlich wird die gleiche Kohlenstoffpaste mit einem Harzbindemittel wie vorher auf die Grundplatte 1 gedruckt, um die Kohlenstoffpaste in Kontakt mit der vorher gebildeten Leitung 3 zu bringen und eine ringförmige Gegenelektrode 5 wird daraus resultieren. Auf diese Art und Weise wird ein Elektrodensystem auf der Grundplatte 1 gebildet.
Die 2 ist eine Längsquerschnittsansicht des Biosensors der 1. Auf dem Elektrodensystem, gebildet auf die in der 1 gezeigten Art und Weise, wird weiterhin eine Reaktionsschicht 8 mit wenigstens einem Enzym und einem Zucker zusätzlich zu einem hydrophilen Polymer 7 ausgebildet.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wurde, nachdem das Elektrodensystem auf der Grundplatte 1 wie in der 1 gebildet war, eine wässrige Lösung mit 0,5 Gewichtsprozent des Natriumsalzes des hydrophilen Polymers Carboxymethylcellulose (hiernach als „CMC" bezeichnet) auf das Elektrodensystem getropft und in einem Trockner bei 50°C für 10 Minuten getrocknet, um eine CMC-Schicht 7 auf dem Elektrodensystem zu bilden. Nachfolgend wurde auf der derartig gebildeten CMC-Schicht 7 eine gemischte Lösung (4 μl) von 5000 Einheiten Glukosedehyrogenase (hiernach als „GDH" bezeichnet), deren Coenzym Pyrrolo-Chinolin-Chinon ist (hiernach als „PQQ" bezeichnet) als das Enzym, 20 μM Trehalose als der Zucker und 50 μM Kaliumferricyanid als der Elektronenakzeptor, gelöst in 1 ml Wasser aufgetropft und getrocknet, um eine Reaktionsschicht 8 auf der CMC-Schicht zu bilden. Auf diese Art und Weise wurde der Biosensor des Beispiels 1 fertiggestellt.
Es wurden separat voneinander verschiedene wässrige Glukoselösungen als Probenlösungen durch Variation der Glukosekonzentration hergestellt. Ein Aliquot von jeder der derartig hergestellten Probenlösungen wurde auf die Reaktionsschicht getropft.
Wie vorher angegeben, wurde nach Zufuhr einer Probenlösung mit Glukose zu der Reaktionsschicht die Glukose in der Probenlösung durch die in der Reaktionsschicht enthaltene GDH oxidiert. Entsprechend dieser Oxidationsreaktion wird Kaliumferricyanid in der Reaktionsschicht zu Kaliumferrocyanid reduziert.
Eine Minute nach Zufuhr der Probenlösung wurde eine Spannung von +0,5 V an die Arbeitselektrode 4 unter Verwendung der Gegenelektrode 5 als Referenz angelegt, um das Kaliumferrocyanid zu reoxidieren. Nach 5 Sekunden wurde der Stromfluss über die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode gemessen. Auf diese Art und Weise wurde ein Stromwert von allen wässrigen Glukoselösungen mit verschiedenen Glukosekonzentrationen erhalten, und ein Antworteigenschaftsdiagramm des Biosensors wurde durch Auftragen der Glukosekonzentration auf die horizontale Achse und des Stromwertes auf die vertikale Achse hergestellt. Die Ergebnisse werden in der 3 gezeigt.
Andere Biosensoren wurden in der gleichen Art und Weise wie vorher hergestellt und für 6 Monate konserviert. Eine Aufstellung der Antworteigenschaften wurde für jeden Biosensor in der vorher erwähnten Art und Weise angefertigt. Die Ergebnisse werden ebenfalls in der 3 angegeben.
Wie aus der 3 ersichtlich, besteht eine bestimmte Korrelation zwischen der Glukosekonzentration und dem Stromwert; die Korrelation hat eine scharfe Linearität. Es gab nahezu keine Änderung in der Antwort des Biosensors unmittelbar nach Herstellung und nach 6 Monaten Konservierung, was eine hervorragende Konservierungseigenschaft des Biosensors beweist.
Vergleichsbeispiel 1
Ein weiterer Glukosebiosensor wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, außer der Abwesenheit des Zuckers Trehalose in der Reaktionsschicht 8. Zum Vergleich wurde eine Antworteigenschaftsdiagramm des Biosensors in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 unmittelbar nach Herstellung und nach 6 Monaten Konservierung angefertigt. Die Ergebnisse werden ebenfalls in der 3 gezeigt.
Wie aus der 3 ersichtlich, erzeugte der Biosensor des Vergleichsbeispiels einen niedrigeren Antwortstromwert als der des Beispiels 1. Nach 6 Monaten Konservierung nimmt bei dem Biosensor des Vergleichsbeispiels die Korrelation zwischen der Glukosekonzentration und dem Stromwert ab, und wird der Antwortstromwert, verglichen zu dem unmittelbar nach Herstellung, reduziert.
Als nächstes wurden andere Biosensoren durch Einstellen des Trehalosegehalts in der Reaktionsschicht auf einen konstanten Wert (80 nM) und Variation des Gehalts an GDH, deren Coenzym PQQ ist, hergestellt und für 6 Monate konserviert. Dann wurden die Biosensoren auf ihre Antwort auf die Glukosekonzentration durch Zufuhr von Probenlösungen mit verschiedenen Glukosekonzentrationen zu der Reaktionsschicht untersucht. Die Ergebnisse werden in der 4 gezeigt.
Andere Biosensoren wurden ebenfalls durch Einstellen des Gehalts an GDH, deren Coenzym PQQ ist, auf einen konstanten Wert (20 Einheiten) und Variation des Gehalts an Trehalose von 4, 40, 200 bis 400 nM hergestellt. Dann wurden die Biosensoren auf ihre Antwort gegenüber der Glukosekonzentration unmittelbar nach Herstellung und nach 6 Monaten Lagerung durch Zufuhr einer Probenlösung mit 10 mM (Millimol) Glukose untersucht. Die 5 zeigt das Verhältnis des Antwortstromwertes nach 5 Monaten Konservierung zu dem unmittelbar nach Herstellung.
Die in den Figuren angegebenen Ergebnisse zeigen eine lineare Korrelation zwischen der Glukosekonzentration und der Sensorantwort an, wenn der Enzymgehalt 1 Einheit ist, und die Glukosekonzentration 600 mg/dl oder weniger ist.
Wenn der Biosensor extrem hohe Enzymanteile von mehr als 40 Einheiten erfordert, ist ein derartiger Biosensor nachteilig unter dem Gesichtspunkt der Herstellungskosten. Daher ist ein geeigneter Enzymgehalt pro Sensorchip 1 bis 40 Einheiten und bevorzugter 5 bis 20 Einheiten.
Andererseitssind bevorzugte Bereiche des Trehalosegehalts pro Sensorchip 4 nM bis 400 nM, und bevorzugtere Bereiche sind 40 nM bis 200 nM, da die Figur anzeigt, dass Trehalosegehalte von 4 nM und 400 nM nur eine leichte Beeinträchtigung der Konservierungseigenschaft des resultierenden Biosensors erzeugen.
Obwohl die vorliegende Erfindung im Bezug auf die bisher bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurden, ist zu verstehen, dass eine derartige Offenbarung nicht als beschränkend zu interpretieren ist. Verschiedene Veränderungen und Modifikationen werden zweifelsohne den Fachleuten, an die sich die vorliegende Erfindung wendet, deutlich sein, nachdem sie die vorhergehende Offenbarung gelesen haben.

Claims

Biosensor mit: einer elektrisch isolierenden Grundplatte, einem Elektrodensystem, einschließlich wenigstens einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode gebildet auf der Grundplatte, und einer Reaktionsschicht, wobei die Reaktionsschicht Trehalose und Glukosedehydrogenase, deren Coenzym Pyrrolo-Chinolin-Chinon ist, in einem Verhältnis von 40 bis 200 Nanomol Trehalose zu 5 bis 20 Einheiten Glukosedehydrogenase, deren Coenzym Pyrrolo-Chinolin-Chinon ist, und einen Elektronenakzeptor umfasst.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Reaktionsschicht ferner ein hydrophiles Polymer umfasst.
Biosensor nach Anspruch 2, wobei das hydrophile Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose, Carboxymethylethylcellulose, Polyvinylpryrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyaminosäuren, Polystyrolsulfonat, Gelatine und ihre Derivate, Polymere von Acrylsäure, Polymere von Acrylat, Polymere von Methacrylatsäure, Polymere von Methacrylat, Stärke und ihre Derivate, Polymere von Maleinsäureanyhdrid, Polymere von Maleat und Agarosegel und seine Derivate.