DE69832875T2 - Isoliertes nukleinsäuremolekül, das die tumorabstossungs-antigenvorläufer mage- c1 und mage-c2 kodiert und seine verwendung - Google Patents

Isoliertes nukleinsäuremolekül, das die tumorabstossungs-antigenvorläufer mage- c1 und mage-c2 kodiert und seine verwendung Download PDF

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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die für Tumorabweisungsantigenvorläufer codieren. Insbesondere betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die Tumorabweisungsantigenvorläufer codieren, die, unter anderem, zu Peptiden prozessiert werden können, die durch viele MHC-Moleküle präsentiert werden, wie beispielsweise HLA-A1 und seine Allele, HLA-A2, HLA-Cw*1601, HLA-B44 usw. MAGE-C1, eine bevorzugte Ausführungsform, teilt eine teilweise Homologie mit anderen Mitgliedern der MAGE-Familie, die derzeit bekannt sind, ist jedoch etwa 2 kb größer. MAGE-C2 ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform. Diese Nukleinsäuremoleküle werden in einer Vielzahl von Tumoren und in normalen Hodenzellen exprimiert, werden aber nicht durch andere Zellen exprimiert.
  • HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK
  • Der Prozess, durch den das Säugetierimmunsystem fremde oder andersartige Materialien erkennt und darauf reagiert, ist komplex. Eine wichtige Facette des Systems ist der T-Lymphozyt oder die „T-Zell"-Antwort. Diese Antwort erfordert, dass T-Zellen Komplexe aus Peptiden und Zelloberflächenmolekülen erkennen und mit diesen wechselwirken, die als menschliche Leukozytenantigene („HLA"), oder Haupthistokompatibilitätskomplexe („MHCs") bezeichnet werden. Die Peptide werden aus längeren Molekülen gewonnen, die durch die Zellen prozessiert werden, die auch das HLA/MHC-Molekül präsentieren. Siehe diesbezüglich Male et al., Advanced Immunology (J. P. Lipincott Company, 1987), insbesondere die Kapitel 6–10. Die Wechselwirkung von T-Zellen und HLA/Peptide-Komplexen ist beschränkt, was eine T-Zelle erforderlich macht, die für eine spezielle Kombination aus einem HLA-Moleküle und einem Peptid spezifisch ist. Wenn keine spezifische T-Zelle vorliegt, gibt es keine T-Zellantwort, selbst wenn ihr Partnerkomplex vorhanden ist. In ähnlicher Weise tritt keine Antwort auf, wenn es an dem spezifischen Komplex fehlt, aber die T-Zelle vorhanden ist. Dieser Mechanismus ist bei der Antwort des Immunsystems auf Fremdmaterialien, bei Autoimmunpathologien und bei Antworten auf zelluläre Anomalien beteiligt. Es wurde sehr viel Arbeit auf die Mechanismen verwandt, durch die Proteine zu den HLA-bildenden Peptiden prozessiert werden. Siehe diesbezüglich Barinaga, Science 257: 880 (1992); Fremont et al., Science 257: 919 (1992); Matsumura et al., Science 257: 927 (1992); Latron et al., Science 257: 964 (1992).
  • Der Mechanismus, durch den T-Zellen zelluläre Anomalien erkennen, wurde auch mit Krebs in Zusammenhang gebracht. Beispielsweise wird in der PCT-Anmeldung PCT/LTS92/04354, eingereicht am 22. Mai 1992, veröffentlicht am 26. November 1992, eine Familie von Genen offenbart, die zu Peptiden prozessiert werden, die, wiederum, auf Zelloberflächen exprimiert werden, was zur Lyse der Tumorzellen durch spezifische zytolytische T-Lymphozyten („CTLs") führen kann. Die Gene sollen für „Tumorabweisungsantigenvorläufer" oder „TRAP"-Moleküle codieren und die davon abgeleiteten Peptide werden als „Tumorabweisungsantigene" oder „TRAs" bezeichnet. Siehe hierzu Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992); van der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991) für weitere Informationen betreffend diese Genfamilie. Siehe auch US-Patent 5,342,774 und Patent 5,462,871.
  • In dem US-Patent 5,405,940 wird erklärt, dass das MAGE-1-Gen für einen Tumorabweisungsantigenvorläufer codiert, der zu Nonapeptiden prozessiert wird, die durch das HLA-A1-Molekül präsentiert werden. Die Nonapeptide, die an HLA-A1 binden, folgen einer „Regel" zum Binden insoweit, als dass einem Motiv entsprochen wird. Siehe diesbezüglich, z. B., PCT/US93/07421; Falk et al., Nature 351: 290–296 (1991); Engelhard, Ann Rev. Immunol. 12: 181–207 (1994); Ruppert et al., Cell 74: 929–937 (1993); Rötzschke et al., Nature 348: 252–254 (1990); Bjorkman et al., Nature 329: 512–518 (1987); Traversari et al., J. Exp. Med. 176: 1453–1457 (1992). Die Literaturstelle lehrt, dass man bei der bekannten Spezifität spezieller Peptide für spezielle HLA-Moleküle erwarten sollte, dass ein spezielles Peptid an ein HLA-Molekül bindet, aber nicht an andere. Da unterschiedliche Individuen verschiedene HLA-Phänotypen besitzen, weist die Identifizierung eines speziellen Peptides als ein Partner für ein spezielles HLA-Molekül diagnostische und therapeutische Implikationen nur für Individuen mit dem speziellen HLA-Phänotyp auf. Es besteht ein Bedarf an weiteren Arbeiten auf diesem Gebiet, da zelluläre Anomalien nicht auf einen speziellen HLA-Phänotyp beschränkt sind und eine zielgerichtete Therapie ein gewisses Maß an Kenntnis des Phänotyps der infragestehenden anomalen Zellen erfordert. In den US-Patentanmeldungen 288,977, eingereicht am 11. August 1994, und nun US-Patent 5,629,166 wird die Tatsache offenbart, dass das MAGE-1-Expressionsprotein in ein zweites TRA prozessiert wird. Dieses zweite TRA wird durch die HLA-Cw*1601-Moleküle präsentiert. Die Offenbarung zeigt, dass ein TRAP eine Vielzahl von TRAs ergeben kann, von denen ein jedes einer Motivregel zum Binden an ein MHC-Molekül genügen wird.
  • In der US-Patentanmeldung 994,928, eingereicht am 22. Dezember 1992 wird gelehrt, dass eine Tyrosinase, ein Molekül, das durch einige normale Zellen (z. B. Melanozyten) produziert wird, in Tumorzellen prozessiert wird, um Peptide zu ergeben, die durch HLA-A2-Moleküle präsentiert werden.
  • In der US-Patentanmeldung 08/032,978, eingereicht am 18. März 1993 wird gelehrt, dass ein zweites TRA, das nicht von Tyrosinase abgeleitet ist, durch HLA-A2-Moleküle präsentiert wird. Das TRA wird von einem TRAP abgeleitet, ist aber durch ein Nicht-MAGE-Gen codiert. Diese Offenbarung zeigt, dass ein spezielles HLA-Moleküle TRAs präsentieren kann, die aus verschiedenen Quellen stammen.
  • In der US-Patentanmeldung 08/079,110, eingereicht am 17. Juni 1993, nun Patent 5,571,711, erteilt am 05. Januar 1996, ist ein nicht verwandter Tumorabweisungsantigenvorläufer, der sog. „BAGE"-Vorläufer beschrieben. Der BAGE-Vorläufer ist nicht mit der MAGE-Familie verwandt.
  • In den US-Patentanmeldungen 08/096,039 und 08/250,162, wird ebenfalls ein Nicht-MAGE-TRAP-Vorläufer, GAGE, offenbart.
  • Die US-Patentanmeldung 08/316,231, eingereicht am 30. September 1994, offenbart zusätzliche Tumorabweisungsantigenvorläufer. Diese Tumorabweisungsantigenvorläufer werden als „DAGE"-Tumorabweisungsantigenvorläufer bezeichnet. Sie zeigen keine Homologie mit den MAGE-, der BAGE- oder der GAGE-Genfamilien.
  • Die Arbeit, die durch die Veröffentlichungen, das Patent und die Patentanmeldungen, wie sie oben angegeben sind, betrifft im großen und ganzen die MAGE-, BAGE-, GAGE- und DAGE-Genfamilien. Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die für einen MAGE-verwandten Tumorabweisungsantigenvorläufer codieren, d. h. MAGE-C1 und MAGE-C2, und die Tumorabweisungsantigenvorläufer und Tumorabweisungsantigene selbst.
  • Die Erfindung betrifft auch Anwendungen von sowohl Nukleinsäure- als auch Proteinmolekülen.
  • Die Erfindung wird weiter in der folgenden Offenbarung dargelegt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Die 1(A)–1(F) ist die Nukleotidsequenz der MAGE-C1-cDNA. Die Position von verschiedenen Nukleotid-Sinn- und Antisinn-Primern ist angegeben.
  • Die 2(A)–2(F) stellt einen Vergleich der Nukleotidsequenzen von MAGE-C1- und MAGE-A1 dar.
  • 3 ist ein schematischer Vergleich des Gens MAGE-C1 mit dem isolierten cDNA-Klon MAGE-C1 und dem veröffentlichten Gen MAGE-A1. Exons sind als Kästchen dargestellt, die von I bis III (MAGE-A1) oder IV (MAGE-C1) durchnummeriert sind. Introns sind als Linien angezeigt. Die Deletion in dem cDNA-Klon verglichen mit dem Gen MAGE-C1 ist als Lücke dargestellt. Offene Kästchen zwischen den Genen MAGE-A1 und MAGE-C1 zeigen Regionen mit einer Ähnlichkeit an. Die offenen Leserahmen werden durch gepunktete Kästchen innerhalb der Exons angezeigt. Wiederholte Segmente im Gen MAGE-C1 werden als schraffiertes Kästchen gezeigt. Wichtige Restriktionsstellen sind angegeben (B: BamHI, D: Dpn11, E: EcoR1, P: Pst1, X: Xba1), ebenso wie Positionen von zwei Paaren von Oligonukleotiden (SL33/SL34 und SL38/SL43). Ein Sternchen oberhalb des MAGE-C1-Exons I zeigt die Stelle der Sp1- und der 2 Ets-Konsensuserkennungssequenzen an. Die Position der XbaI-EcoR1-cDNA-Sonde ist ebenfalls angegeben.
  • 4 ist eine schematische Darstellung der MAGE-C1-, MAGE-C2- und MAGE-A1-Gene. Die Exons erscheinen als offene Kästchen, Introns als Linien. Offene Leserahmen werden durch dunkle Kästchen dargestellt. Regionen mit Homologie zwischen MAGE-C2 und den beiden anderen Genen werden als schattierte Bereiche dargestellt. Wichtige PCR-Primer werden durch Pfeile angegeben. Das schraffierte Kästchen stellt die im Gen MAGE-C1 gefundene repetitive Region dar.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Viele menschliche Tumorantigene, die bisher identifiziert wurden, werden von Genen codiert, wie beispielsweise MAGE, BAGE und GAGE, die ein gemeinsames Expressionsmuster teilen: Sie werden im Hoden (und manchmal der Plazenta) exprimiert, aber nicht in anderem normalen Gewebe und sind bei verschiedenen Tumorarten reaktiviert. Diese Art von Antigen ist für die Tumorimmuntherapie von besonderem Interesse.
  • Als eine Alternative zur Identifizierung von Tumorantigenen durch Klonieren von Genen, die für Antigene codieren, von denen bekannt ist, dass sie durch zytolytische Antitumor-T-Lymphozyten (CTL) erkannt werden, suchten wir direkt nach neuen Genen, die spezifisch in Tumoren exprimiert werden, da derartige Gene eine Quelle für tumorspezifische Antigene darstellen könnten. Unter Verwendung einer PCR-basierten subtraktiven Hybridisierungstechnik, die als repräsentative Differenzialanalyse bezeichnet wird, die auf cDNA angewandt wird (Hubank und Shatz, „Identifying Differences in mRNA Expression By Representational Difference Analysis of cDNA", Nucleic Acids Res. 22: 5640–5648 (1994)), identifizierten wir eine Anzahl von Mitgliedern der MAGE-Genfamilie, die hierin beschrieben werden.
  • Die Beispiele dieser Erfindung zeigen die Isolierung von Nukleinsäuremolekülen, die für Tumorabweisungsantigenvorläufer („TRAP"), MAGE-C1 und MAGE-C2 codieren. Diese TRAP-codierenden Moleküle teilen eine teilweise Homologie mit der MAGE-Familie, die für Sequenzen codiert, die in den oben angegebenen Literaturstellen beschrieben sind. Somit ist ein Aspekt der Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein mit der Aminosequenz codiert, die durch die in SEQ ID NO: 9 angegebene Nukleotidsequenz codiert wird, und ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit der Aminosequenz codiert, die durch die in SEQ ID NO: 18 angegebene Nukleotidsequenz codiert ist. Bevorzugterweise ist das Nukleinsäuremolekül ein cDNA-Molekül. SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 18 sind zuvor unbekannte MAGE-, BAGE- oder GAGE-codierende Sequenzen, wie ersichtlich werden wird, indem sie mit der Sequenz von einem jeden dieser Gene, wie sie in den angegebenen Literaturstellen beschrieben sind, verglichen werden.
  • Ein Teil der Erfindung sind auch jene Nukleinsäuremoleküle, die die Nukleotidsequenz von Nukleotid 1–2815 und nt 2816–4225 von SEQ ID NO: 9 aufweisen. Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist auch ein Nukleinsäuremolekül, das für einen Tumorabweisungsantigenvorläufer codiert und mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das die Nukleotidsequenz 1–2815 von SEQ ID NO: 9 aufweist, aber nicht mit Nukleinsäuremolekülen hybridisiert, die die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 8 aufweisen, d. h. der MAGE-A1-Nukleotidsequenz, wie sie in 2 angegeben ist, unter stringenten Bedingungen. Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist ein Nukleinsäuremolekül, das für einen Tumorabweisungsantigenvorläufer codiert und mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das die Nukleotidsequenz 261–2856 von SEQ ID NO: 9 aufweist, aber nicht mit Nukleinsäuremolekülen mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 hybridisiert. Der Begriff „stringente Bedingungen", wie hierin verwendet, bezeichnet Hybridisierung in 5 × SSC, 0,1% SDS, 5 × Denhardt's-Reagens bei 65°C, über Nacht, gefolgt von zweimaligem Waschen bei Raumtemperatur für 20 Minuten in 2 × SSC und 0,1% SDS und einmaligem Waschen für 20 Minuten in 2 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C, und einmaligem Waschen in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Es gibt andere Bedingungen, Reagenzien usw., die verwendet werden können und zu dem gleichen oder einem höheren Maß an Stringenz führen. Der Fachmann wird mit derartigen Bedingungen vertraut sein und insoweit werden sie hierin nicht angegeben.
  • Die weite Verbreitung der Expression von MAGE-C1 und MAGE-C2 in Tumorzellen und nicht in normalen Zellen zeigt, dass die isolierten Nukleinsäuremoleküle als diagnostische Sonden verwendet werden können, um das Vorliegen von anomalen, z. B. Tumorzellen zu bestimmen, die MAGE-C1 oder MAGE-C2-verwandte Sequenzen exprimieren. Die Identifizierung von Seminom mit MAGE-C1 betrug 100% (Tabelle 2), so dass, auf einem sehr grundlegenden Niveau, die isolierten Nukleinsäuremoleküle verwendet werden können, um zu bestimmen, ob ein Seminom vorliegt oder nicht. Es ist beachtlich, dass es für den Fachmann vielfältige Wege gibt, um zu bestätigen, dass eine Tumorprobe ein Seminom ist und diese müssen hierin nicht wiederholt werden.
  • Es wird auch aus den Beispielen ersichtlich sein, dass die Erfindung die Verwendung der Sequenzen und Expressionsvektoren umfasst, die verwendet werden können, um Wirtszellen und Zelllinien zu transformieren oder zu transfizieren, seien es nun prokaryontische (z. B. E. coli) oder eukaryontische (z. B. CHO- oder COS-Zellen). Die Expressionsvektoren machen es erforderlich, dass die pertinente Sequenz, d. h. die oben beschriebenen, operativ mit einem Promotor verbunden sind. Der Expressionsvektor kann, z. B., eine Sequenz umfassen, die ein oder mehrere HLA-Moleküle codiert. In einer Situation, wo der Vektor beide codierenden Sequenzen enthält, kann er verwendet werden, um eine Zelle zu transformieren oder zu transfizieren, die normalerweise keine der beiden exprimiert. Die Tumorabweisungsantigenvorläufer-codierende Sequenz kann alleine verwendet werden wenn, z. B., die Wirtszelle bereits HLA-Moleküle exprimiert. Die spezielle Wirtszelle, die für die Expression der hierin beschriebenen Sequenzen geeignet ist, umfasst, z. B., prokaryontische oder eukaryontische Zellen, wie beispielsweise E. coli, CHO-, COS-Zellen oder Insektenzellen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Isolierung einer genomischen DNA (gDNA), die für ein Protein mit der Aminosäuresequenz codiert, die durch ein Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 18 codiert ist. Eine derartige gDNA kann unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Verfahren identifiziert und isoliert werden. Beispielsweise können MAGE-C1-spezifische Sonden, die von SEQ ID NO: 1 abgeleitet sind, oder MAGE-C2-spezifische Sonden die von SEQ ID NO: 18 abgeleitet sind, verwendet werden, um eine genomische DNA-Bibliothek zu screenen, die, beispielsweise, aus LB373-MEL-Zellen hergestellt ist. Die Fachleute auf dem Gebiet werden in der Lage sein, mittels Sequenzanalyse diejenigen Sequenzen zu bestimmen, die für MAGE-C1 und/oder MAGE-C2 spezifisch sind. Es ist auch unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren möglich, das Chromosom zu bestimmen, wo eine derartige gDNA angeordnet ist, siehe z. B. PCT/US95/02203.
  • Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist ein Expressionskit, der den Fachmann in die Lage versetzt, einen erwünschten Expressionsvektor oder -vektoren herzustellen. Derartige Expressionskits umfassen wenigstens verschiedene Teile von einer jeden der zuvor diskutierten codierenden Sequenz, z. B. einem Vektor wie beispielsweise ein bakterielles Plasmid, ein Cosmid oder einen viralen Vektor, der einen Promotor umfasst (DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2274–2278 (1988), Grosveld et al., Gene 10: 6715–6732 (1982), und Bates et al., Gene 26: 137–146 (1983)), eine jegliche der HLA-codierenden Sequenzen, wie die in Zemmour und Parham, Immunogenetics 37: 239–250 (1993) angegebenen, eine MAGE-C1- oder MAGE-C2-codierende Sequenz oder sowohl eine HLA- als auch eine MAGE-C1- oder MAGE-C2-codierende Sequenz. Andere Komponenten, wie beispielsweise Resistenzmarker, Enhancer oder induzierbare Promotoren, die in der Technik bekannt sind, können, wie erwünscht, hinzugefügt sein.
  • Um die Nukleinsäuremoleküle und die TRAPs und TRAs dieser Erfindung von zuvor beschriebenen MAGE-, BAGE- und GAGE-Materialien zu unterscheiden, soll die Erfindung auf das MAGE-C1-Gen, MAGE-C2-Gen, MAGE-C1-TRAP und -TRAs und MAGE-C2-TRAP und -TRAs bezogen sein. Entsprechend wird, wann immer MAGE-C1 oder MAGE-C2 hierin verwendet wird, auf Tumorabweisungsantigenvorläufer verwiesen und die von ihnen abgeleiteten TRAs, die durch die von den zuvor unbekannten Nukleinsäuresequenzen codiert werden. „MAGE-C1-codierende Sequenz", „MAGE-C2-codierende Sequenz" und ähnliche Begriffe werden verwendet, um die Nukleinsäuremoleküle selbst zu beschreiben.
  • Die Erfindung, wie sie hierin beschrieben ist, weist eine Anzahl von Anwendungen auf, von denen einige hierin beschrieben sind. Zuerst erlaubt die Erfindung dem Fachmann, eine Erkrankung zu diagnostizieren, die durch die Expression der MAGE-C1- oder MAGE-C2-Boten-RNAs und MAGE-C1- oder MAGE-C2-TRAPs und -TRAs gekennzeichnet ist. Die Verfahren umfassen das Bestimmen der Expression von mRNAs von den MAGE-C1- und MAGE-C2-Nukleinsäuremolekülen und verwandten Molekülen und/oder des Vorliegens von TRAs, die von dem TRAP abgeleitet sind, der durch MAGE-C1 oder MAGE-C2 und verwandte Nukleinsäuremoleküle codiert wird. In der ersten Situation können derartige Bestimmungen vermittels irgendwelcher Standardnukleinsäurebestimmungstests durchgeführt werden, einschließlich Polymerasekettenreaktion, oder Testen mit markierten Hybridisierungssonden. In der letzteren Situation können TRAP und TRA durch Testen auf TRAP oder TRA alleine oder Testen auf Komplexen aus TRA und HLA nachgewiesen werden unter Verwendung von Bindungspartnern wie beispielsweise Antikörpern. Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung besteht darin, das Vorliegen von zytolytischen T-Zellen in einer CTL-enthaltenden Probe nachzuweisen, die für Komplexe aus einem HLA-Molekül und einem Peptid spezifisch sind, das von dem durch das Nukleinsäuremolekül von Anspruch 1 codierte Protein abgeleitet sind, umfassend das Kontaktieren der Probe mit Zellen, die die Komplexe auf ihrer Oberfläche exprimieren, und Bestimmen (I) der Proliferation von zytolytischen T-Zellen oder (ii) Lyse von Zellen, die die Komplexe präsentieren, als eine Bestimmung der zytolytischen T-Zellen in der Probe. Die CTL-Proliferation kann nachgewiesen werden durch Testen auf TNF-Freisetzung oder der Freisetzung einer radiomarkierten Substanz wie beispielsweise 51Cr, wie beispielsweise in PCT/US95/02203 beschrieben, die in ihrer Gesamtheit hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Zusätzlich können CTL durch ELISPOT-Analyse wie beschrieben von Schmitt et al., J. Immunol. Meth., 210: 167–179 (1997) und Lalvani et al. J. Exp. Med., 186: 859 (1997), oder durch FACS-Analyse von fluorogenen Tetramerkomplexen aus MHC-Klasse I/Peptid (Dunbar et al. Current Biology, 8: 713–716 (1998)) nachgewiesen werden.
  • Die Isolierung dieser MAGE-C1- und MAGE-C2-Nukleinsäuremoleküle macht es auch möglich, TRAP-Moleküle selbst zu isolieren, insbesondere TRAP-Moleküle, die aus der Aminosäuresequenz bestehen, die durch SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 18 codiert ist. Die Isolierung der MAGE-C1- und MAGE-C2-Nukleinsäuremoleküle macht es auch möglich, TRAs zu identifizieren, die für MAGE-C1 oder MAGE-C2 einzigartig sind, wie hierin detaillierter unten diskutiert.
  • Weiterhin sind auch das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz 257–3682 von SEQ ID NO: 9 codiert ist, das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz 330–1449 von SEQ ID NO: 18 codiert ist, und die Polypeptide, die davon abgeleitet sind, Teil der Erfindung. Diese Polypeptide können, beispielsweise, alleine oder in Kombination mit anderen Polypeptiden aus anderen TRAP-Molekülen, mit Materialien kombiniert werden wie beispielsweise Adjuvanzien, die in der Technik gut bekannt sind, siehe z. B. US-Patent 5,057,540 von Kensil et al., oder PCT-Anmeldung PCT/CTS92/03579 von Scott et al., um Vakzine herzustellen, die bei der Behandlung von Erkrankungen nützlich sind, die durch die Expression der Moleküle gekennzeichnet sind.
  • Peptide, die von dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz abgeleitet sind, die durch die Nukleotidsequenz 257–3682 von SEQ ID NO: 9 codiert ist, und das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz 330–1449 von SEQ ID NO: 18 codiert ist, die durch MHC-Moleküle präsentiert und durch CTL erkannt werden, können mit Peptiden von anderen Tumorabweisungsantigenen kombiniert werden, um „Polytope" auszubilden. Beispielhafte Peptide umfassen jene, die in der US-Patentanmeldung 08/672,351; 08/718,964, nun US-Patent ..., 08/487,135, nun US-Patent ..., 08/530,569 und 08/889,963 angeführt sind.
  • Zusätzliche Peptide, die verwendet werden können, sind jene, die in den folgenden Literaturstellen beschrieben sind, nämlich den US-Patenten 5,405,940; 5,487,974; 5,519,117; 5,530,096; 5,554,506; 5,554,724; 5,558,995; 5,585,461; 5,589,334; 5,648,226; und 5,683,886; den internationalen Veröffentlichungen von PCT Nr. 92/20356; 94/20356; 96/10577; 96/21673; 97/10837; 97/26535; und 97/31017, ebenso wie der anhängigen US-Patentanmeldung 08/713,354.
  • Polytope sind Gruppen aus zwei oder mehr potentiell immunogenen oder immunstimulierenden Peptiden, die auf verschiedene Weise miteinander verbunden sein können, um zu bestimmen, ob dieser Typ von Molekül eine Immunantwort stimulieren und/oder provozieren wird.
  • Diese Peptide können direkt oder durch die Verwendung von flankierenden Sequenzen miteinander verbunden sein. Siehe hierzu Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 (13): 5845–5849 (1995), der die direkte Verbindung von relevanten Epitopsequenzen lehrt. Die Verwendung von Polytopen als Vakzine ist gut bekannt. Siehe z. B. Gilbert et al., Nat. Biotechnol., 15 (12): 1280–1284 (1997): Thomson et al., supra; Thomson et al., J. Immunol., 157 (2): 822–826 (1996); Tam et al., J. Exp. Med., 171 (1): 299–306 (1990). Tam et al. zeigen insbesondere, dass Polytope, wenn sie in einem Mausmodell verwendet werden, nützlich sind bei der Erzeugung von Antikörpern und schützender Immunität. Weiter zeigt die Literaturstelle, dass die Polytope, wenn sie verdaut werden, Peptide ergeben, die durch MHCs verwendet und präsentiert werden können. Tam et al. zeigen dies, indem sie die Erkennung von einzelnen Epitopen zeigen, die aus Polytop„-Fäden" durch CTLs prozessiert werden. Dieser Absatz kann, z. B., bei der Bestimmung verwendet werden, wie viele Epitope in einem Polytop verbunden sein können und noch eine Erkennung provozieren, und auch, um die Wirksamkeit verschiedener Kombinationen von Epitopen zu bestimmen. Verschiedene Kombinationen können „maßgeschneidert" werden für Patienten, die spezielle Untergruppen von Tumorabweisungsantigenen exprimieren. Diese Polyptope können als Polypeptidstrukturen eingeführt werden oder durch die Verwendung von Nukleinsäureabgabesystemen. Um dies auszuarbeiten, stellt die Technik viele verschiedene Wege zur Verfügung, um DNA, die ein einzelnes Epitop oder ein Polytop wie oben beschrieben codiert, einzuführen. Siehe hierzu, z. B. Allsopp et al., Eur. J. Immunol. 26 (8): 1951–1959 (1996). Adenoviren, Pockenviren, Ty-Viren-ähnliche Partikel, Plasmide, Bakterien etc. können verwendet werden. Man kann diese Systeme in Mausmodellen testen, um zu bestimmen, welches System für eine gegebene Parallelsituation beim Menschen am geeignetsten ist. Sie können auch in klinischen Versuchen am Menschen getestet werden.
  • Zusätzlich können Vakzine aus Zellen wie beispielsweise nicht-proliferativen Krebszellen, nicht-proliferativen Transfektanten etc. hergestellt werden, die die TRA/HLA-Komplexe auf ihrer Oberfläche präsentieren. In allen Fällen, wo Zellen als Vakzine verwendet werden, können die Zellen Transfektanten sein, die mit codierenden Sequenzen für eine oder beide der Komponenten transfiziert worden sind, die erforderlich sind, um eine CTL-Antwort zu ergeben, d. h. TRAP-, TRA- und HLA-Moleküle, unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind, siehe z. B. PCT/US95/02203 und Zemmour, oben, für die Sequenz verschiedener HLA-Moleküle. Alternativ können die Zellen sowohl HLA- als auch TRAP/TRA-Moleküle ohne Transfektion exprimieren. Weiterhin können die TRAP-Moleküle, ihre verbundenen TRAs, ebenso wie Komplexe aus TRA und HLA verwendet werden, um Antikörper unter Verwendung von in der Technik gut bekannten Standardverfahren zu erzeugen.
  • Wenn der Begriff „Erkrankung" hierin verwendet wird, bezieht er sich auf einen jeglichen pathologischen Zustand, wo der Tumorabweisungsantigenvorläufer exprimiert ist. Ein Beispiel für eine derartige Störung ist Krebs, insbesondere Seminom.
  • Therapeutische Ansätze, die auf der hierin gegebenen Offenbarung basieren, postulieren eine Antwort des Immunsystems eines Lebewesens, die zur Lyse von HLA/TRA präsentierenden Zellen führt. Ein derartiger Ansatz besteht in der Verabreichung von CTLs, die für einen HLA/TRA-Komplex spezifisch sind, an ein Lebewesen mit anomalen Zellen des infragestehenden Phänotyps. Es ist im Rahmen der Fähigkeiten der Fachleute, derartige CTLs in vitro herzustellen, siehe hierzu z. B. Herin et al., oben. Beispielsweise wird eine Probe mit Zellen, wie beispielsweise Blutzellen, mit einer Zielzelle in Kontakt gebracht, die einen HLA/TRA-Komplex exprimiert und in der Lage ist, einen spezifischen CTL zu proliferieren zu veranlassen. Die Zielzelle kann eine Transfektante wie beispielsweise eine COS-Zelle sein, die mit einem speziellen HLA und TRAP, wie oben beschrieben, transfiziert ist und diese exprimiert. Diese Transfektanten präsentieren den erwünschten Komplex auf ihrer Oberfläche und stimulieren, wenn mit einem interessierenden CTL kombiniert, seine Proliferation. COS-Zellen wie beispielsweise jene, die hierin verwendet werden, sind ebenso wie andere geeignete Wirtszellen umfänglich verfügbar, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, CHO-Zellen, Spodopitera furjiperda, E. Coli, Bacillus usw.
  • Ein therapeutisches Verfahren wird als adoptiver Transfer bezeichnet (Greenberg, J. Immunol. 136 (5): 1917 (1986); Riddel et al., Science 257: 238 (7-10-92); Lynch et al., Eur. J. Immunol. 21: 1403–1410 (1991); Kast et al., Cell 59: 603–614 (11-17-89)). Beim adoptiven Transfer werden Zellen, die den erwünschten HLA/TRA-Komplex präsentieren, mit CTLs kombiniert, was zur Proliferation der CTLs führt, die für diesen Komplex spezifisch sind. Die proliferierten CTLs werden dann einem Lebewesen mit einer zellulären Anomalie verabreicht, die dadurch gekennzeichnet ist, dass bestimmte der anomalen Zellen den besonderen Komplex präsentieren. Die CTLs lysieren dann die anomalen Zellen, wodurch das erwünschte therapeutische Ziel erreicht wird.
  • Die vorstehende Therapie nimmt an, dass wenigstens eine der anomalen Zellen des Lebewesens den HLA/TRA-Komplex präsentieren. Dies kann leicht bestimmt werden, da die Technik sehr vertraut mit Verfahren zum Identifizieren von Zellen ist, die ein besonderes HLA-Molekül exprimieren, ebenso wie damit, wie Zellen identifiziert werden, die DNA der pertinenten Sequenzen exprimieren, in diesem Fall ein MAGE-C1 oder ein MAGE-C2 und verwandte Sequenzen. Wenn die anomalen Zellen des Patienten den relevanten HLA/TRA-Komplex präsentieren, dann ist der Patient ein geeigneter Kandidat für die oben angegebenen therapeutischen Ansätze.
  • Adoptiver Transfer ist nicht die einzige Therapieform, die gemäß der Erfindung verfügbar ist. CTLs können auch in vivo produziert werden unter Verwendung einer Reihe von Ansätzen. Ein Ansatz, d. h. die Verwendung von nicht-proliferativen Zellen, die den Komplex exprimieren, als ein Vakzin, ist oben dargelegt worden. Die bei diesem Ansatz verwendeten Zellen können jene sein, die normalerweise den Komplex exprimieren, wie beispielsweise bestrahlte Seminomzellen oder bestrahlte Zellen, die mit einem oder beiden der für die Präsentation des Komplexes erforderlichen Genen transfiziert sind. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110–114 (Januar 1991) veranschaulichen diesen Ansatz und zeigen die Verwendung von transfizierten Zellen, die HPV E7-Peptide exprimieren, in einem therapeutischen Schema. Es könnten verschiedene Zelltypen verwendet werden.
  • In ähnlicher Weise können Vektoren wie beispielsweise virale oder bakterielle Vektoren, die ein Nukleinsäuremolekül tragen, das entweder ein HLA oder ein TRAP oder ein TRA oder eine Kombination davon codiert, verwendet werden. Bei diesen Systemen wird das Nukleinsäuremolekül durch, z. B., einen Vaccinia-Virus oder das Bakterium BCG getragen, die Wirtszellen „infizieren". Die infizierten Zellen präsentieren den HLA/TRA-Komplex und werden durch autologe CTLs erkannt, die anschließend proliferieren.
  • CTLs können auch in vivo produziert werden durch Kombinieren des TRA oder des TRAP selbst mit einem Adjuvans, um den Einbau in HLA-präsentierende Zellen zu erleichtern. Die Zellen präsentieren den interessierenden HLA/Peptidkomplex, indem der TRAP weiter prozessiert wird, um den Peptidpartner des HLA-Moleküls zu ergeben. Alternativ können die Zellen das TRA präsentieren, ohne dass das weitere Prozessieren erforderlich ist. Siehe z. B. Braciale, T. J. und Braciale, V. L., Immunology 12: 124–129 (1991); T. Elliot, Immunology 12: 386–388)1991) und: Madelboim et al., Nature 369: 67–71 (1994).
  • Weiter sind isolierte Peptide, die von dem MAGE-C1-TRAP oder MAGE-C2-TRAP abgeleitet sind, ein weiteres Merkmal der Erfindung, die den Regeln für eine Präsentation durch MHC-Molekülen genügen. Beispielsweise sind in der PCT-Anmeldung PCT/US93/07421 mehrere Motive als mit unterschiedlichen MHC-Molekül verbunden beschrieben. Diese Motive ebenso wie jene, die beispielsweise von Falk et al., Nature 351: 290–296 (1991); Engelhard, Ann. Rev. Immunol 12: 181–207 (1994); Ruppert et al., Cell 74: 929–937 (1993); Rötzschke et al., Nature 348: 252–254 (1990); Bjorkman et al., Nature 329: 512–518 (1987) und Traversari et al., J. Exp. Med. 176: 1453–1457 (1992) gelehrt werden, dienen als Grundlage zum Identifizieren geeigneter Peptide, die von der MAGE-C1-Aminosäuresequenz, und der Nukleotidsequenz, die das Protein codiert, erhalten oder abgeleitet werden können. In einem weiteren Aspekt der Erfindung können diese Peptide alleine oder in einer Mischung verwendet werden, um CTL-Proliferation zu stimulieren. Diese Peptide sind auch in Vakzinen nützlich.
  • Es ist gut etabliert, dass das Blut von an Tumoren leidenden Individuen häufig zytolytische T-Zellen („CTLs") enthält, die Komplexe aus MHC-Molekülen und präsentierten Peptiden erkennen. Siehe, z. B., Robbins et al., Canc. Res. 54: 3124–3126 (1994); Topolian et al., J. Immunol. 142: 3714–3725 (1989); Coulie et al., Int. J. Cancer 50: 289–297 (1992). Beachte auch Kawakami et al., J. Exp. Med. 180: 347–352 (1994); Horn et al., J. Immunother. 10: 153– 164 (1991), Darrow et al, J. Immunol. 142 (9): 3329–3335 (1989); Slovin et al., J. Immunol. 137 (9): 3042–3048 (1986). Diese Veröffentlichungen belegen alle die Nützlichkeit eines CTL-Proliferationsassays, um eine mögliche Krebserkrankung zu diagnostizieren.
  • Im Allgemeinen wird ein Patient nur CTLs aufweisen, die Zielzellen, die nur die speziellen Komplexe aus TRA und HLA exprimieren, erkennen und in Reaktion auf das Kontaktieren derselben proliferieren, wenn wengistens einige der eigenen Zellen des Patienten auch diesen besonderen Komplex exprimieren. Wenn man eine periphere Blutlymphozyten (PBL) enthaltende Probe von einem Patienten nimmt, von dem man vermutet, dass er anomale Zellen aufweist, z. B. Tumorzellen, und diese CTL-enthaltende Probe mit einer Zielzelle kontaktiert, die Komplexe aus einem relevanten MHC-Molekül und einem MAGE-C1- oder einem MAGE-C2-abgeleiteten Peptid präsentiert, wird man nur eine Proliferation von CTLs sehen, die für diesen Komplex spezifisch sind. Die Proliferation von CTLs in der PBL-Probe des Patienten wird somit anzeigen, dass der Patient möglicherweise Tumorzellen aufweist, die den speziellen HLA/TRA-Komplex exprimieren. Die Zielzellen können Zellen sein, die normalerweise das infragestehende MHC-Molekül präsentieren, oder können Zellen sein, die mit einer HLA-codierenden Sequenz transfiziert worden sind. Die Zielzellen können begreiflicherweise Tumorzellen oder normale Zellen sein.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung umfasst das Mischen einer Zielzellprobe mit (1) einem Peptid oder einer Mischung aus Peptiden, die von einem MAGE-C1-TRAP oder einem MAGE-C2-TRAP abgeleitet sind und durch die Zielzellen-MHC-Moleküle präsentiert werden, und (2) einer PBL-Probe des zu evaluierenden Lebewesens. Die Mischung wird dann auf CTL-Proliferation getestet. Verschiedene Verfahren zur Bestimmung von CTL-Proliferation sind in der Technik bekannt, z. B. TNF-Freisetzungstests und 51Cr-Freisetzungstests, siehe, z. B., PCT/US95/02203.
  • Das Peptid oder die Peptide der Erfindung können auch mit einem oder mehreren Adjuvanzien kombiniert werden, um eine ausgeprägtere CTL-Antwort zu stimulieren. Beispiele für derartige Adjuvanzien sind Saponine und ihre Derivate, wie jene, die in dem US-Patent 5,057,540 von Kensil et al. oder der PCT-Anmeldung PCT/US92/03579 von Scott et al. offenbart sind. Natürlich können auch Standardadjuvanzien wie beispielsweise Freund'sches vollständiges Adjuvans oder Freund'sches unvollständiges Adjuvans verwendet werden.
  • Andere Aspekte der Erfindung werden für die Fachleute klar sein und müssen hier nicht wiederholt werden.
  • Die Begriffe und Ausdrücke, die hierin verwendet worden sind, werden als Begriffe zur Beschreibung und nicht zur Beschränkung verwendet und es ist bei der Verwendung derartiger Begriffe und Ausdrücke nicht beabsichtigt, irgendwelche Äquivalente der Merkmale auszuschließen, die gezeigt oder beschrieben sind, oder Teile davon, wobei anerkannt wird, dass verschiedene Modifikationen im Umfang der Erfindung möglich sind.
  • Beispiel 1 Erzeugen von Differenzprodukten (DP) für den Tumor LB373-MEL und Hoden
  • Eine für Sequenzen angereicherte cDNA-Bibliothek, die nur in dem interessierenden Zelltyp, einer „Tester"-Zelle, und nicht in irgendeinem anderen Zelltyp, einer „Anreger"-Zelle, vorhanden sind, wurde wie im wesentlichen von Hubank und Schatz, Nucl. Acids, Res, 22: 5640–5645 (1994) beschrieben erzeugt. Kurz gesagt wurde Gesamt-RNA aus Testerzellen und Anregerzellen hergestellt. Die Testerzellen waren hierin Melanomzellen LB373-MEL und die Anregerzellen waren normale Hautzellen. Poly-A + RNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung von Oligo-dT-Säulen und von in der Technik gut bekannten Verfahren isoliert. Die Poly-A + RNA wurde dann revers transkribiert, um cDNA zu ergeben. Die cDNA wurde mit Restriktionsenzym Dpn11 verdaut, das DNA an GATC-Stellen schneidet, um kurze Fragmente aus doppelsträngiger DNA mit 5'-GATC-Überhängen zu erzeugen. Doppelsträngige DNA-Adaptoren mit einem 5'-GATC-Überhang (R-Bgl-Adaptor, der aus anneliertem R-Bgl-12- und R-Bgl 24-Oligonukleotid mit SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 11 hergestellt ist) wurden, mit der DpnII-verdauten cDNA ligiert, die aus den Tester- und Anregerzellen präpariert war. Die Adaptor-ligierte cDNA wurde nachfolgend durch die gut bekannte Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Das amplifizierte Produkt ist eine „Wiedergabe" des Testers bzw. des Anregers. Sowohl Tester- als auch Anreger-Wiedergaben wurden mit DpnII verdaut. Verdauter Tester wurde mit den neuen Adaptormolekülen ligiert (J-Bgl-Adaptor, der aus anneliertem J-Bgl-12- und J-Bgl-24-Olegonukleotid mit SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 12 zusammengesetzt ist). Eine erste Runde aus subtraktiver Hybridisierung wurde dann durchgeführt durch Mischen von 100/1-Teilen der verdauten Anreger-cDNA mit der verdauten Tester-cDNA, die an die J-Bgl-Adaptoren ligiert waren.
  • Die gemischte Anreger – und Tester-cDNA-Probe wurde bei 98°C für 5 Min. denaturiert und dann bei 67°C für 20 Stunden inkubiert, um die denaturierte Probe erneut zu hybridisieren. Dies führte zu einer Mischung aus hybriden doppelsträngigen cDNAs. Die Hybrid-cDNAs waren drei verschiedene Typen. Ein Hybridtyp bestand aus zwei Tester-cDNA-Molekülen, die Nukleotidsequenzen wiedergaben, die einzigartig für Tester-Zellen sind, ein zweiter Hybridtyp bestand aus zwei Anreger-cDNA-Molekülen und ein dritter Hybridtyp bestand aus einem Tester-cDNA-Molekül und einem Anreger-cDNA-Molekül. Nach Hybridisierung wurde die Probe PCR-amplifiziert unter Verwendung eines einzelsträngigen J-Bgl-Adaptors, J-Bgl-24 mit SEQ ID NO: 12. Hybrid-cDNAs, die aus zwei Anreger-cDNA-Molekülen bestanden, wurden nicht amplifiziert, da sie nicht den J-Bgl-Adaptor enthielten. Hybrid-cDNAs, die aus einem Tester-cDNA-Molekül und einem Anreger-cDNA-Molekül bestanden, wurden nur linear amplifiziert. Nur doppelsträngige cDNA, die aus zwei Tester-cDNA-Molekülen bestanden, wurden exponenziell amplifiziert.
  • Nach 10 PCR-Amplifikationszyklen, wie oben beschrieben, wurde die Probe mit Mung-Bean-Nuklease (die spezifisch die einzelsträngige DNA verdaut, die durch lineare Amplifikation erzeugt wurde) behandelt, und dann zusätzlichen 18 PCR-Zyklen unterworfen. Das sich ergebende angereicherte Produkt wurde als Differenzprodukt 1 (DP1) bezeichnet. Es wurden sowohl DP1-Hoden[-HLLK] als auch DP1-LB373[-Haut] erzeugt.
  • J-Bgl-Adaptoren an DP1 wurden ausgetauscht durch N-Bgl-12/24-Adaptor (N-Bgl-12: 5'GATCTTCCCTCG-3'; N-Bgl-24: 5'-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA-2'); d. h. annelierte N-Bgl-12 und N-Bgl-24-Oligonukleotide, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 13, und das Verfahren der subtraktiven Hybridisierung und ausgewählten Amplifikation wiederholt, um die zweiten Differenzprodukte zu erzeugen (mit der Ausnahme, dass das Annelieren und die Verlängerung in PCR-Reaktionen bei 72°C durchgeführt wurden). Das Verhältnis von Tester zu Anreger betrug 1/800, um DP2.Hoden(-HLLK) zu erzeugen, aber 1/100, um DP2.LB373(-Haut) zu erzeugen. Ein drittes Differenzprodukt DP3.Hoden(-HLLK) wurde erzeugt durch Wiederholen des Verfahrens mit J-Bgl, der mit DP2.Hoden(-HLLK) ligiert war, als Tester und HLLK-Darstellungen als Anreger, wobei die letztendliche Amplifikation über 22 Runden durchgeführt wurde.
  • Beispiel 2 Suche nach Sequenzen, die sowohl bei DP2.LB373[-Haut] als auch bei und DP3.Hoden[-HLLK] vorhanden sind.
  • Viele bekannte Tumorantigene werden durch Gene kodiert, die nur in Tumoren und in Hoden exprimiert werden. Indem wie oben beschrieben Sequenzen gesucht wurden, die sowohl bei DP3.Hoden[-HLLK] (wiedergebend Nukleinsäuresequnzen, die für Hodenzellen einzigartig sind) als auch bei DP2.LB373[-Haut] (wiedergebend Nukleinsäuresequenzen, die für Melanomzellen einzigartig sind) vorkommen, wurden Nukleinsäuresequenzen identifiziert, die nur in Hoden- und Tumorzellen exprimiert wurden, die zuvor nicht identifizierte Tumorantigene kodieren.
  • Um DP3.Hoden[-HLLK]-DNA zu klonieren, wurde DP3.Hoden[-HLLK] mit DpnII verdaut und die verdaute DNA mit BamHI-Verdauungen des kommerziell erhältlichen Plasmides pTZ18R ligiert. Die Bakterien, DH5αF'IQ (kommerziell erhältlich) wurden mit ligierter DNA elektroporiert. Die elektroporierten Bakterien wurden selektiert und durch Koloniehybridizierung mit einer Sonde gescreent, die durch Markieren von DP2.LB373[-Haut] mit Zufallsprimern, Klenow-DNA Polymerase und α-32P-dCTP erzeugt worden war.
  • Plasmide aus Transformanten, die mit der DP2.LB373[-Haut]-Probe hybridisierten, wurden isoliert und dann ihre Inserts analysiert. Ein Klon, der ein 283 bp-Insert enthielt, wurde gereinigt und unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren sequenziert. Die Sequenz des 283 bp-Inserts teilte eine teilweise Homologie mit der MAGE-Genfamilie. Die maximale Homologie (74%) wurde mit einer Nukleotidsequenz aus 147 Nukleotiden erhalten, die den Nukleotiden 9895 bis 10041 der MAGE-4a-cDNA entsprechen, wie aus der genomischen MAGE 4a-DNA (Genbank Zugangsnummer U 10687) vorhergesagt. Diese Daten schlagen vor, dass das 283 bp-Insert ein Teil eines zuvor nicht identifizierten Mitgliedes der MAGE-Familie ist. Dieses Familienmitglied wurde als MAGE-C1 bezeichnet.
  • Beispiel 3 Vollständige MAGE-C1-cDNA.
  • Um die vollständige MAGE-C1-cDNA zu erhalten, wurde eine aus LB373-MEL-RNA hergestellte und in pcDNAI/Amp subklonierte DNA-Bibliothek gescreent. Die cDNA-Bibliothek wurde wie folgt hergestellt.
  • Gesamt-RNA wurde aus LB373-MEL-Zellen extrahiert durch das Guanidin-Isothiocyanat-Verfahren (Davis L. G., M. D., Dibner und J. F. Battery, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, Seiten 130–135 (1986)). Poly-A + RNA wurde auf Oligo-dT-Säulen (Pharmacia) gereinigt und in cDNA umgewandelt unter Verwendung eines Oligo-dT (NotI, EcoRI)-Primers SEQ ID NO: 5. Die cDNA wurde an BstX1-Adaptoren (SEQ ID NO: 6) ligiert, mit Not1 verdaut und mit BstX1 und Not1 verdautem, kommerziell erhältlichem Expressionsvektor pcDNAI/Amp ligiert unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren. Top 10F'-Escherichia coli-Bakterien wurden elektroporiert mit den ligierten rekombinanten Plasmiden und die Transformanten mit Ampicillin (50 μg/ml) selektiert. Die Bibliothek wurde mit einer 32P-radiomarkierten Sonde gescreent, die aus dem oben isolierten 283 bp-Insert abgeleitet war.
  • Bakterielle Transformanten wurden auf MAGE-C1-Sequenzen gescreent unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind. Kurz gesagt wurden 140.000 Bakterien auf Nylonmembranfilter plattiert. Duplikatnylonmembranfilter wurden hergestellt und behandelt, um die bakterielle DNA zu denaturieren und zu fixieren. Eine 168 bp MAGE-C1-spezifische Sonde wurde durch RT-PCR (reverse Transkription-PCR) unter Verwendung von LB373-MEL-RNA als Matrize und MAGE-C1-spezifischen Primern erzeugt, d. h. Sinn-Primer SL26: 5'CCAGTAGATGAATATACAAGTT-3' der den Nukleotiden (nt) 2666 bis nt 2687 von SEQ ID NO: 1 entspricht, und der Antisinn-Primer SL27: 5'GATAGGCTGCTTCACTT-3', der komplementär zur Sequenz von nt 2817 bis nt 2833 von SEQ ID NO: 1 ist. Dieses 168 bp lange MAGE-C1-PCR-Produkt, das nt 2666 bis 2833 von SEQ ID NO: 1 entspricht, wurde auf einer Sepharose CL-6B-Säule gereinigt, dann unter Verwendung von Zufallsprimern, Klenow-DNA-Polymerase und α-32P-dCTP markiert, wie oben beschrieben (Beispiel 3). Die behandelten Duplikatmembranfilter wurden hybridisiert mit der MAGE-C1-spezifischen Sonde (500.000 cpm/ml; Übernachtinkubation bei 65°C in 5 × SSC, 0,1% SDS 5 × Denhardt's-Reagens), dann unter stringenten Bedingungen gewaschen und für 70 Stunden bei Raumtemperatur einer Autoradiographie unterzogen. Stringente Bedingungen wie hierin beschrieben, bezeichnen 0,1 × bis 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 20 Min. Zwei Kolonien wurden identifiziert, die mit der MAGE-C1-Sonde hybridisierten. Die Kolonien wurden gereinigt und erneut gescreent, um zu bestätigen, dass sie mit der Sonde hybridisierten. Die Plasmide wurden aus diesen Kolonien isoliert und ihre Inserts sequenziert und analysiert unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind. Ein Klon wurde ausgewählt und die eingeführte MAGE-C1-cDNA im Detail analysiert. Der analysierte Klon enthielt ein MAGE-C1-cDNA-Molekül mit einer Länge von 4031 bp (1) SEQ ID NO: 1. Ein offener Leserahmen (ORF) verläuft fast durch die gesamte cDNA mit einem ersten ATG, angeordnet an Position nt 257, gemäß der bekannten Regel nach Kozak, und einem Stop-Codon an nt 3473. Der ORF codiert ein mutmaßliches Protein aus 1072 Aminosäuren.
  • Das Alignment mit der MAGE-A1-cDNA erbrachte signifikante Homologien zwischen der MAGE-C1-cDNA (SEQ ID NO: 1) und den MAGE-A1-Exons 2 und 3. Der offene Leserahmen von MAGE-C1 ist jedoch etwa 2 kb länger als der von MAGE A1, wobei der Großteil des Unterschiedes durch eine große repetitive Sequenz bedingt wird.
  • Beispiel 4 MAGE-C1-Expression
  • Der Sinn-Primer SL33 (%'CGGAGGGAGGAGACTTA-3') nt 18–34 von SEQ ID NO: 1 und der Antisinn-Primer SL34 (5'-TTAAGGTGGTGCTCTAGG-3'), der zu nt 200–217 von SEQ ID NO: 1 komplementär ist, sind in 1 gezeigt. Diese Primer sind an unterschiedlichen Exons angeordnet, wie durch die unterschiedlichen Größen der PCR-Produkte von cDNAs (202 bp) oder genomische DNAs (etwa 1,1 kb) bestimmt, die aus normalem Gewebe und Tumorzellen hergestellt sind. Das Expressionmuster der MAGE-C1-Boten-RNA wurde durch Standard-RT-PCR-Analyse von Proben aus normalem Gewebe und Tumor bestimmt. Die Daten zeigen, dass mit Ausnahme von Hoden keine MAGE-C1-Expression in dem getesteten normalen Gewebe nachgewiesen wird (Tabelle 1). Unter den Tumorzellproben wird die MAGE-C1-Expression häufig bei Melanom (46%), Seminom (100%), Blasenübergangszellkarzinom (18%), Brustkarzinom (16%) und nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (16%) nachgewiesen. Sie wird auch in einem erheblichen Teil der Sarkome, Kopf- und Halskarzinome und Prostataadenokarzinome gefunden (Tabelle 2).
  • Beispiel 5 Northern Blot-Analyse
  • 10 μg Gesamt-RNA, die durch das Guanidin-Isothiocyanat-Verfahren isoliert wurde (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York, Seiten 130–135 (1986), wurden durch Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese getrennt, auf eine Nylonmembran durch Kapillartransfer überführt und durch UV-Bestrahlung fixiert. Die Hybridisierung an die MAGE-C1-1,31 kb-XbaI-EcoRI-Sonde entsprechend dem Nukleotid 589 bis 1904 von SEQ ID NO: 1 (radiomarkiert mit [α-32P]dCTP) wurde über Nacht bei 60°C in 10% Dextransulfat, 1 M NaCl, 1% SDS und 100 μg/ml denaturierter Lachsspermien-DNA durchgeführt. Die Membran wurde konsekutiv in 2 × SSC, 0,1% SDS für 20 Min. bei Raumtemperatur, in 2 × SSC, 0,1% SDS für 20 Min. bei 60°C und schließlich in 0,2 × SSC, 0,1% SDS für 5 Min. bei 60°C gewaschen. Die Autoradiographie wurde für 7 Tage unter Verwendung von BioMax MS-Film (Kodak) durchgeführt. Die gleiche Membran wurde mit β-Actin-spezifischer Sonde unter identischen Bedingungen hybridisiert mit der Ausnahme, dass das Waschen zweimal für 10 Min. in 2 × SSC bei Raumtemperatur und Autoradiographie über Nach durchgeführt wurde. Es wurde eine MAGE-C1-Boten-Art in der Gesamt-RNA aus normalen Hoden und einigen Tumorzelllinien beobachtet, die bei etwa 4 kb wanderte. Es wurde keine MAGE-C1-Boten-Art in der Gesamt-RNA aus normaler Lunge nachgewiesen.
  • Beispiel 6 Struktur der MAGE-C1-cDNA
  • Das Sequenzieren und das Alignment von SEQ ID NO: 1 (2 und 3) ergab, dass die MAGE-C1-cDNA zu MAGE-A1 (Van der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991)) nur in ihrem 3'-Drittel homolog ist. Mit Ausnahme eines weiteren kurzen homologen Abschnittes zu dem zweiten Exon von MAGE-A1, besteht MAGE-C1 aus Sequenzen, die mit der MAGE-Familie oder irgendeiner, in Datenbanken berichteten Sequenz nicht verwandt sind. Verglichen mit anderen MAGE-cDNAs enthält MAGE-C1 eine etwa 2,4 kb große Insertion, die in 3 durch ein großes schraffiertes Kästchen dargestellt ist, das 3 Arten von als Tandem wiederholte Sequenzen aufweist: 42 bp-Wiederholungen, 63 bp-Wiederholungen und 48 bp-Wiederholungen.
  • Beispiel 7: Southern Blot-Analyse
  • Southern Blots, die mit mehreren genomischen DNAs von Melanomzelllinien LB373-MEL, SK29-MEL und LB33.A-1 hergestellt waren (Coulie et al., J. Exp. Med. 180: 35–42 (1994); Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7976–7980 (1995); Lehmann et al. Eur. J. Immunol. 25: 340–347 (1995)), wurden mit einer 1,3 kb Xba1-EcoR1-cDNA-Sonde hybridisiert, die von SEQ ID NO: 1 abgeleitet war, die das meiste der Insertion enthielt, die den cDNA-Klon MAGE-C1 von anderen MAGE-cDNAs unterscheidet. Zehn μg genomischer DNA, die mit einem Restriktionsenzym verdaut war, wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt, auf Nylonmembranen durch Kapillartransferverfahren übertragen und durch UV-Bestrahlung fixiert, wie beschrieben (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, N. Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 9.31–9.58). Die Hybridisierung an die [α-32P]dCTP-radiomarkierte MAGE-C1-1,3 kb-XbaI-EcoRI-Sonde wurde in 5 × SSC, 5 × Denhardt's, 0,1% SDS und 100 μg/ml denaturierter Lachsspermien-DNA für 12 bis 24 Stunden bei 68°C durchgeführt. Die Membranen wurden konsekutiv in 2 × SSC, 0,1% SDS für 20 Minuten bei Raumtemperatur, in 2 × SSC, 0,1% SDS für 20 Minuten bei 68°C und in 0,2 × SSC, 0,1% SDS für 20 Minuten bei 68°C gewaschen. Die Autoradiographie wurde für drei Tage unter Verwendung von BioMax MS-Film (Kodak) durchgeführt.
  • Eine einzelne hybridisierende Bande war in DNA aus der SK29-Melanomlinie vorhanden, die mit fünf unterschiedlichen Restriktionsenzymen verdaut war, was nahe legt, dass MAGE-C1 das einzige Gen seiner Art in der MAGE-Familie ist. Pst1-verdaute DNAs, die aus Lymphozyten des peripheren Blutes von elf männlichen Patienten isoliert waren, enthielten jedoch jeweils eine einzige MAGE-C1-Bande, aber mit unterschiedlicher Größe, was die Existenz eines allelischen Polymorphismus im Gen MAGE-C1 nahe legt. EcoRI-verdaute DNAs aus LB373-MEL und LB33-MEL.A-1 enthielten eine einzige MAGE-C1-Bande mit identischer Größe (siehe 3 für die Positionen der Sonde und Restriktionsenzymen).
  • Beispiel 8 Isolierung von MAGE-C1-Gen
  • Um das MAGE-C1-Gen zu isolieren, wurde eine Cosmid-Bibliothek, die mit genomischer DNA von der Melanomzelllinie LB33-MEL.A-1 hergestellt war, gescreent. Genomische DNA aus der Melanomzelllinie LB33-MEL.A-1 wurde teilweise mit Mbol verdaut und mit Cosmidarmen des Vektors c2RB ligiert, wie beschrieben (Lurquin, C. et al., Cell 58: 293–303 (1989)). Die ligierte DNA wurde in λ-Phagenköpfer (GIGAPACK, Strategene) verpackt und auf Escherichia coli ED8767 titriert. Die Bibliothek wurde dargestellt durch 40 Gruppen aus 70.000 unabhängigen Cosmiden. Eine jede Gruppe wurde verwendet, um ED8767-Bakterien zu infizieren und in LB-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, amplifiziert. Aliquots von 16 Stunden alten Kulturen wurden eingefroren, anderen wurden titriert, um die Amplifikation der Bibliothek (105×) zu bewerten, und der Rest der Kulturen wurde weiter amplifiziert und verwendet, um Gesamt-Cosmid-DNA zu isolieren, wie beschrieben (De Plaen, Immunology Methods Manual Academic Press Ltd., 9.9: 691–718 (1997)).
  • DNA, die aus 16 Gruppen von insgesamt 70.000 unabhängigen Cosmiden isoliert war, wurde einer PCR-Amplifikation mit MAGE-C1-Primern unterzogen. Man hat festgestellt, dass zwölf Gruppen positiv waren und eine von diesen wurde durch Koloniehybridisierung mit der XbaI-EcoRI-Sonde gescreent. Ein positives Cosmid, C7.2, wurde identifiziert. Die Restriktionsanalyse und der Southern Blot ergaben, dass dieses Plasmid ein etwa 42 kb großes Insert enthielt, das vier EcoRI-Fragmente mit 1, 1,4, 1,6 bzw. 2 kb und ein BamHI-Fragment mit 2 kb trägt, das mit einer Sonde hybridisierte, die dem gesamten MAGE-C1-cDNA-Klon (SEQ ID NO: 1) entsprach. Diese fünf Fragmente wurden in Phagemid pTZ19R eincloniert und ihre Nukleotidsequenz bestimmt. Ein Vergleich dieser Sequenzen mit dem cDNA-Klon zeigte, dass MAGE-C1 aus vier Exons besteht (3). Ein Leserahmen mit 3.426 Basenpaaren beginnt mit einem ATG, das am Ende vom Exon III angeordnet ist, und läuft über den Großteil von Exon IV. Alle wiederholten Motive sind in dem letzteren enthalten, aber die Länge dieser repetitiven Region war länger in dem gDNA-Klon verglichen mit der in dem cDNA-Klon. Obwohl die cDNA- und genomischen Klone aus Bibliotheken mit unterschiedlichem Ursprung stammten (Unterzelllinien LB373-MEL bzw. LB33-MEL.A-1) könnte eine allelische Variation kaum diese Diskrepanz erklären, wie durch Southern Blot-Analyse mit der XbaI-EcoRI-Sonde gezeigt. Um die Ergebnisse der Southern Blot-Analyse zu bestätigen, wurde genomische DNA aus beiden Zelllinien durch PCR mittels der Primer SL38 (5'-GGCGACGACACCCAGT-3') entsprechend nt 521 bis 536 von SEQ ID NO: 1 und SL43 (5'-AGGAAAGTAGAGAGGAGACAT-3') entsprechend nt 1862 bis 1882 von SEQ ID NO: 1 amplifiziert und Produkte mit identischen Größen erhalten. Ein teilweises Sequenzieren dieser PCR-Produkte zeigte zwischen den zwei Zelllinien keinen Unterschied auf der Nukleotidebene, ausgenommen die Anwesenheit einer Splice-Stelle in LB373-MEL-Zellen, die in LB33-MEL-Zellen fehlt.
  • Um zu bestimmen, ob Artefakte der reversen Transkription für die unterschiedlichen Längen der repetitiven Regionen in den gDNA- und cDNA-Klonen verantwortlich waren, wurde cDNA, die aus reverser Transkription von Gesamt-RNA erhalten wurde, durch PCR unter Verwendung der Primer SL38 und SL43 amplifiziert.
  • Das Transcription in vitro Systems (Promega) wurde verwendet, um MAGE-C1-RNA für die PCR-Amplifikation und das Klonieren der MAGE-C1-repetitiven Region aus cDNA herzustellen. 1 μg HindIII verdaute pcDNAI/Amp, die den MAGE-C1-cDNA-Klon enthielt, wurde auf ein Endvolumen von 20 μl mit 4 μl 5 × SP6-Puffer, 1 μl von einem jeden NTP mit 10 mM, 2 μl Dithiotreitol mit 0,1 M, 0,5 μl (20 Einheiten) RNase-Inhibitor und 1 μl (15 Einheiten) SP6 RNA-Polymerase verdünnt. Eine Kontrollreaktion wurde durchgeführt, wo 5 μl [α32P]CTP (3000 Ci/mMol) einer Mischung hinzugesetzt wurden, die identisch zu der oben beschriebenen Transkriptionsmischung war, mit der Ausnahme, dass nur 2,4 μl 0,1 mM CTP verwendet wurden. Die Reaktion wurde bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Ein μl (1 U) RQ1 DNase wurde zu den Mischungen hinzugegeben, die wiederum für eine Stunde bei 37°C inkubiert wurden. Ein Zehntel der radiomarkierten RNA wurde durch Elektrophorese auf einem Formaldehyd-Agarosegel analysiert, das Gel getrocknet und einer Autoradiographie unterzogen, um zu bestätigen, dass nur Volllängenprodukte erhalten wurden. Nicht-radioaktive RNA wurde mittels Phenol extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in 10 μl Wasser erneut suspendiert. Ein μl RNA-Lösung wurde unter den gleichen Bedingungen wie Gesamt-RNA revers transkribiert (Weynants et al., Int. J. Cancer 56: 826–829 (1994)).
  • Um die Kontamination mit Plasmid-DNA auszuschließen, wurde eine Kontrollreaktion eingeschlossen, wo keine MoMLV reverse Transkriptase hinzugesetzt wurde. 1/40 der vollständigen Reaktion wurden 37 PCR-Zyklen mit SL38-Sinn-Primer und SL43-Antisinn-Primer unterzogen. Die PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Es wurde kein nachweisbares Produkt in Kontrollreaktionen nachgewiesen.
  • Der Sinn-Primer SL38 (5'-GGCGACGACACCCAGT-3') entsprechend nt 521 bis 536 von SEQ ID NO: 1 und der Antisinn-Primer SL43 (5'-AGGAAAGTAGAGAGGAGACAT-3') entsprechend nt 1862 bis 1882 von SEQ ID NO: 1 wurden verwendet, um cDNA (1/40 des reversen Transkriptionsproduktes aus 2 μg Gesamt-RNA) oder 500 ng genomische DNA aus den Melanomlinien LB373-MEL und LB33-MEL.A-1 zu amplifizieren. Die PCR wurde in 50 μl Gesamtvolumen durchgeführt mit 5 μl 10 × DynaZyme-Puffer, jeweils 1 μl 10 mM dNTP, jeweils 25 pMol Primer und 2 Einheiten DynaZyme (FynnZymes Oy) für 30 (genomische DNA) oder 37 (cDNA) Zyklen aus 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 65°C und 2 Minuten bei 72°C.
  • Die PCR-Produkte wurden an das Plasmid pCR3 ligiert unter Verwendung des Eukaryotic TA Cloning Kit (Invitrogen) und die Ligationsprodukte wurden in Top10F'-Bakterien elektroporiert. Mehrere Produkte wurden erhalten mit Größen von 1,6 bis 0,35 kb. Im Gegensatz dazu wurde ein einzelnes Produkt aus genomischer DNA erhalten, die durch PCR mit den Primer SL38 und SL43 amplifiziert war. Mehrere PCR-Produkte wurden auch mit Matrizen-cDNA erhalten, die aus der reversen Transkription einer Volllängen-RNA erhalten wurde, die in vitro aus dem cDNA-Klon MAGE-C1 (SEQ ID NO: 1) transkribiert wurde. Diese Ergebnisse schlagen vor, dass Artefakt der reversen Transkription für die Diskrepanz zwischen genomischen und cDNA-Klonen verantwortlich sind und dass die natürliche, von dem MAGE-C1-Gen in der Melanomlinie LB373-MEL transkribierte mRNA-Spezies die gesamte repetitive Region umfassen muss, wie sie in Cosmid C7.2 gefunden wird, wie oben beschrieben. Die Sequenz einer Volllängen-cDNA dieser natürlichen mRNA ist als SEQ ID NO: 9 angegeben.
  • Die repetitive Region entspricht insgesamt 18 direkten Wiederholungen von 14 Aminosäuren (aa), 17 Wiederholungen aus 21 aa und 16 Wiederholungen aus 16 aa. Das Gen MAGE-C1 teilt eine maximale Gesamthomologie mit dem Gen MAGE-A10. Es wurde jedoch ein Vergleich und ein Alignment in den 2 und 3 mit MAGE-A1 durchgeführt, den am besten charakterisierten Genen der MAGE-Familie. Das Exon 1 des Gens MAGE-C1 weist keine homologen Gegenstücke in anderen MAGEs auf, es ist aber beachtlich, dass eine SP1- und zwei Ets-Konsensus-Bindungsstellen unmittelbar dem ersten Exon vorangehen, wie bei MAGE-1 (De Smet et al., Immunogenetics 42: 282–290, (1995); De Smet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7149–7153, (1996)) und einigen MAGE-Promotoren (De Plaen, eingereicht) beschrieben.
  • Beispiel 9 Chromosomale Lokalisierung des MAGE-C1-Gens
  • Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) Experimente mit Cosmid C7.2 als Sonde zeigen, dass das Gen MAGE-C1 auf dem langen Arm des X-Chromosoms auf der Bande Xq27 angeordnet ist.
  • Eine menschliche genomische Cosmidsonde für MAGE-C1 wurde für in situ Fluoreszenzhybridisierung verwendet. Der gesamte MAGE-C1-Cosmidklon wurde unter Verwendung von Biotin-14 dATP und Biotin-14 dCTP (Gibco BRL) für in situ Fluoreszenzhybridisierung Nick-translatiert und mit normalen menschlichen Metaphasenspreitungen in zwei unabhängigen Experimenten hybridisiert.
  • Chromosompräparate wurden erhalten aus Phytohämagglutinin-stimulierten normalen Lymphozyten des peripheren Blutes, die für 72 Stunden kultiviert waren. Um R- Bandenausbildung zu induzieren, wurden einige der Kulturen mit Thymidin nach 48 Stunden synchronisiert, bei 37°C inkubiert und mit 5'Bromdesoxyuridin (BrdU) am nächsten Morgen während der finalen späten S-Phase behandelt und 6 Stunden später geerntet (Jacky, P. B., Raven Press, Seite 89, (1991)). Zytogenetische Ernten wurden vorgenommen und Objektträgerpräparate wurden hergestellt unter Verwendung von Standardverfahren. Die Objektträger wurden bei vor der Verwendung bei –80°C gelagert.
  • Die in-situ-Fluoreszenzhybridisierung an Metaphasenchromosomen wurde durchgeführt, wie von Pinkel et al. beschrieben (Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2934–2938, (1986)). Kurz gesagt wurde die Biotin-markierte Sonde (50–100 ng) in einer Hybridisierungsmischung (50% Formamid, 10% Dextransulfat, 2 × SSC, 0,1 μg COT-1 DNA (Gibco BRL), 10 μg gescherte Lachsspermien-DNA als Träger) gelöst und für 60 Min. bei 37°C inkubiert, um zu erlauben, dass COT-1-DNA an repetitive Sequenzen in der Sonde annelierte. Die Sondenmischung wurde dann auf den Objektträger aufgebracht und für 10 Min. bei 80°C auf einem Objektträgerwärmer co-denaturiert. Man erlaubte, dass die Hybridisierung über Nacht in einer feuchten Kammer bei 37°C erfolgte. Die Objektträger wurden unter Verwendung des Formamid-Waschverfahrens gemäß dem FITC-Biotin-Nachweiskit und, wenn angemessen, gemäß dem Amplifikationsprotokoll für zweifarbige FISH (Oncor) gewaschen. Der Nachweis der Biotin-markierten Sonde erfolgte durch Inkubieren mit dem FITC-Avidin-Konjugat und die Digoxigenin-markierten Chromosom X-spezifische α-Satellitenwiederholungssonde wurde nachgewiesen unter Verwendung eines anti-Digoxigenin-Rhodamin-Konjugates.
  • Die Chromosomenidentifizierung wurde durch gleichzeitige Hybridisierung mit einer für das Chromosom X spezifischen α-Satellitenwiederholungssonde (Oncor) oder durch R-Bandenausbildung unter Verwendung von 5-Bromdesoxyuridin und Einbetten der Objektträger in einer modifizierten Einbettungslösung gegen Verbleichen aus p-Phenylendiamin (pH 11) (Lemieux et al., Cytogenet. Cell Genet, 59: 311–312 (1992)), die 0,01 μg/ml Propidiumiodid als Gegenfärbung enthielt, um ein R-Bandenausbildungsmuster zu produzieren, vorgenommen. Die Objektträger wurden untersucht und unter Verwendung eines Zeiss Axiophot Mikroskops und geeigneten UV-Filterkombinationen photographiert. Die 35 mm Aufnahmen wurden gescannt unter Verwendung eines Nikon Coolscan, bearbeitet unter Verwendung von Adobe Photoshop 4.0 und ausgedruckt unter Verwendung eines Fujix Pictrography 3000.
  • Die chromosomale Lokalisierung des menschlichen MAGE-C1-Lokus wurde initial durch somatische Zellhybridkartierung in Experimenten erhalten, die hier nicht beschrieben sind, und wurde unabhängig bestätigt und durch in situ-Fluoreszenzhybridisierung wie oben beschrieben verfeinert. Bei diesen Experimenten wurden 47 R-gebänderte Metaphasenspreitungen von normalen Lymphozyten auf spezifische Hybridisierungssignale untersucht. Die Signale wurden nur dann als spezifisch erachtet, wenn sie auf einem jeden Chromatid von einem einzelnen Chromosom nachgewiesen wurden. Spezifische Signale wurden in 15 der 47 untersuchen Metaphasen gefunden (32%). In einem jeden Fall waren die Hybridisierungssignale im distalen Teil des X-Chromosoms angeordnet. Die Chromosomen mit einem R-Bandenmuster erlaubten eine genauere Lokalisierung des MAGE-C1-Lokus auf Xq26–q27.
  • Interessanterweise sind auch andere Mitglieder der MAGE-Familie auf sowohl dem langen als auch dem kurzen Arm des X-Chromosom lokalisiert worden. Es wurden zwölf Gene der MAGE-Familie in der distalen Region des langen Arms des X-Chromosoms kartiert (De Plaen, et al., Immunogenetics 40: 360–369, (1994); Oaks et al., Cancer Research 54: 1627–1629, (1994)) und MAGE-Xp befindet sich in der Xp21.3-Region des kurzen Armes in der Region (Muscatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4987–4991 (1995)).
  • Beispiel 10 Identifizierung von möglichen HLA Klasse I-bindenden MAGE-C1-Peptiden.
  • Das Durchsuchen der MAGE-C1-Proteinsequenz für HLA Klasse I-bindenden Peptide wurde auf der Website: http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio (Parker, K. C., M. A. Bednarek, und J. E. Coligan, „Scheme for Ranking Potential HLA-A2 Binding Peptides Based on Independent Binding of Individual Peptide Side-Chains," J. Immunol. 152: 163 (1994) durchgeführt. Tabelle 3 listet Peptide auf, von denen erwartet wird, dass sie an die angegebenen HLA Klasse I-Moleküle binden, und die mehr als einmal in dem MAGE-C1-Protein gefunden wurden.
  • Beispiel 11
  • A. Erzeugen von Differenzprodukten aus Melanomtumor LB373-MEL.
  • Eine für nur in Melanomzellen vorhandenen Sequenzen angereicherte cDNA-Bibliothek, die als Tester bezeichnet wurde, wurde erzeugt durch Entfernen von Sequenzen, die mit normalen Hautzellen geteilt werden, die als Anreger bezeichnet werden. Das Anreicherungsergebnis wird als Differenzprodukt (DP) bezeichnet.
  • Genauer wurde Gesamt-RNA aus Melanom LB373-MEL-Zellen (Tester-Zellen) und aus einer normalen Hautprobe (Anreger-Zellen) hergestellt, dann auf Oligo-dT-Säulen gereinigt, um Poly-A + RNA zu erhalten. Die Poly-A + RNA wurde revers transkribiert, um cDNA zu ergeben. Die sich ergebende cDNA wurde mit Restriktionsenzym Dpnll verdaut, das DNA an GATC-Stellen schneidet und kurze Fragmente aus doppelsträngiger DNA mit 5'-GATC-Überhängen erzeugt. Doppelsträngige Adaptoren mit einem 5'-GATC-Überhang (R-Bgl-Adaptor, der aus anneliertem R-Bgl 12 und R-Bgl 24, SEQ ID NOS: 2 bzw. 4 zusammengesetzt ist) wurden an die verdaute cDNA ligiert. Die Adaptor-ligierte cDNA wurde nachfolgend durch PCR amplifiziert unter Verwendung eines Stranges des R-Bgl-Adaptors, R-Bgl 24, als Primer. Das sich ergebende Produkt wird als eine Wiedergabe des Testers bzw. des Anregers bezeichnet. Beide Wiedergaben wurden mit Dpnll verdaut. Verdauter Tester wurde mit neuen Adaptormolekülen ligiert (J-Bgl-Adaptor, der aus anneliertem J-Bgl 12 und J-Bgl 24, SEQ ID NOs: 3 bzw. 12 zusammengesetzt ist). Eine erste Runde subtraktiver Hybridisierung wurde dann durchgeführt unter Mischen der verdauten Anreger-cDNA mit dieser J-Bgl-adaptierten und verdauten Tester-cDNA in Anteilen von 100/1, Denaturieren der Probe und Inkubieren bei 67°C für 20 Stunden, um die denaturierte Probe zu re-hybridisieren. Nach der Hybridisierung wurde die Probe PCR-amplifiziert unter Verwendung eines Stranges des J-Bgl-Adaptors, J-Bgl 24, als Primer. Hybride, die aus zwei DNA-Strängen bestanden, die aus der Anregerpopulation stammten, konnten nicht amplifiziert werden, da sie nicht mit dem J-Bgl-Adaptor ligiert sind, wohingegen Hybride, die aus einem Strang aus einer jeden Quelle (Tester und Anreger) bestanden, nur linear amplifiziert werden konnten. Nur Doppelstränge mit zwei Testersträngen (die Sequenzen wiedergaben, die für den Tester einzigartig waren) wurden exponentiell amplifiziert. Nach 10 Zyklen der PCR-Amplifikation wurde die Probe mit Mung-Bean-Nuclease behandelt (die spezifisch die einzelsträngige DNA verdaut, die durch lineare Amplifikation hergestellt ist), und dann 18 zusätzlichen PCR-Zyklen unterworfen.
  • Das sich ergebende Produkt wurde als Differenzprodukt 1 (DP1) bezeichnet. J-Bgl-Adaptoren auf DP1 wurden gegen N-Bgl-12/24-Adaptoren ausgetauscht (N-Bgl-12: 5'GATCTTCCCTCG-3'; N-Bgl-24: 5'-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA-3'), d. h. annelierte N-Bgl-12 und N-Bgl-24-Oligonukleotide, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 13 und das Verfahren der subtraktiven Hybridisierung und selektiven Amplifikation wiederholt, um die zweiten Differenzprodukte zu erzeugen (mit der Ausnahme, dass das Annelieren und die Verlängerung in den PCR-Reaktionen bei 72°C durchgeführt wurden). Das Verhältnis von Tester zu Anreger betrug 1:800, um die DP2.LB373(-Haut) zu erzeugen.
  • DP2.LB373[-Haut] wurde in den Phagemid-Vektor pTZ18R kloniert, um eine cDNA-Bibliothek zu erzeugen, die hinsichtlich Sequenzen angereichert war, die in Melanom exprimiert waren, aber in normaler Haut still waren.
  • B. Analyse der Melanom-angereicherten Bibliothek durch Sequenzieren von individuellen Klonen.
  • 49 individuelle Klone, die aus der angereicherten Melanombibliothek isoliert waren, wurden sequenziert. Sie entsprechen 27 unterschiedlichen Genen. Die Suche nach Homologien mit in Datenbanken enthaltenen Sequenzen zeigte, dass 16 von diesen 27 Genen zuvor identifizierten Genen entsprechen. Beachtlicherweise entsprechen zwei von ihnen dem Gen MAGE-A3 bzw. Gen MAGE-A10, von denen bekannt ist, dass sie ausschließlich in Tumoren und im Hoden exprimiert werden. Sieben Sequenzen waren unbekannt und RT-PCR wurde verwendet, um zu bestimmen, ob sie in einem Satz unterschiedlicher normaler Gewebe exprimiert wurden. Nur zwei von diesen elf neuen Genen wurden nicht in normalen Geweben mit Ausnahme von Hoden exprimiert. Das erste wurde als LAGE-1 bezeichnet und ist in der US-Patentanmeldung 08/791,495 beschrieben. Das zweite weist signifikante Homologien mit Mitgliedern der MAGE-Genfamilie und genauer mit dem MAGE-C1-Gen auf. Es wurde daher als MAGE-C2 bezeichnet.
  • C. Suche nach vollständiger MAGE-C2 cDNA.
  • Der MAGE-C2-Klon, der aus der angereicherten Melanombibliothek isoliert wurde, ist ein Dpnll-Restriktionsfragment des vollständigen MAGE-C2-Botens. Um eine vollständige MAGE-C2-cDNA zu isolieren, screenten wir eine cDNA-Bibliothek mit einer MAGE-C2 Sonde.
  • Die cDNA-Bibliothek wurde mit LB373-MEL-RNA in pcDNAI/Amp wie oben beschrieben konstruiert. Etwa 84.000 Bakterien wurden auf Nylonmembranen ausplattiert. Duplikate wurden hergestellt und behandelt, um die bakterielle DNA zu denaturieren und zu fixieren. Eine MAGE-C2-spezifische Sonde wurde erzeugt durch Durchführen von PCR auf dem teilweisen MAGE-C2-Klon mit den spezifischen Primern SL102 und SL103 (SL102: 5'AGGCGCGAATCAAGTTAG-3', SEQ ID NO: 15; SL103: 5'CTCCTCTGCTGTGCTGAC-3', SEQ ID NO: 16). Das 206 bp MAGE-C2-PCR-Produkt wurde auf einer Sepharose CL-6B-Säule gereinigt, dann markiert unter Verwendung von Zufallsprimern, Klenow-DNA-Polymerase und α-32P-dCTP. Behandelte Duplikate wurden mit der MAGE-C2-spezifischen Sonde hybridisiert (500.000 cpm/ml; Inkubation über Nacht bei 65°C), dann unter stringenten Bedingungen gewaschen (letztes Waschen durchgeführt bei 65°C in SSC 0,2×, SDS 0,1%) und für 70 Stunden autoradiographiert. Es ergaben sich acht positive Spots. Ein zweites Screening wurde durchgeführt und ein bakterieller Klon wurde erhalten, der einen großen offenen Leserahmen für MAGE-C2 enthielt.
  • Die MAGE-C2-cDNA ist 1983 bp-lang (SEQ ID NO: 18). Der offene Leserahmen beginnt mit einem ATG bei Position 330 und endet mit einem Stop-Codon an Position 1449, wobei er für ein mutmaßliches Protein mit 373 Aminosäuren (SEQ ID NO: 19) kodiert.
  • D. Struktur des MAGE-C2-Gens.
  • PCR-Primer, die zu mehreren Regionen der MAGE-C2-cDNA komplementär waren, wurden ausgewählt und die PCR-Produkte, die nach Amplifikation von cDNA und genomischer DNA erhalten wurden, durch Agarosegelelektrophorese analysiert. PCR-Amplifikation von genomischer DNA mit den Primerpaaren A und B (4) ergab Produkte, die größer waren als jene, die durch Amplifikation von cDNA erhalten wurden, was die Existenz von wenigstens zwei Introns in dem MAGE-C2-Gen enthüllte. Die Sequenzen dieser zwei Introns wurden durch Sequenzieren des PCR-Produktes bestimmt. PCR-Amplifikation mit den Primerpaaren C und D (4) ergab Produkte mit identischen Größen, wenn cDNA oder genomische DNA als Matrizen verwendet wurden, was nahelegt, dass kein zusätzliches Intron in dem MAGE-C2-Gen existiert. Die Sequenz des Gens MAGE-C2, wie aus der Sequenz des cDNA-Klons und aus den Sequenzen der Introns abgeleitet, ist in SEQ ID NO: 20 gezeigt.
  • Schematische Darstellungen der Gene MAGE-C2, MAGE-C1 und MAGE-A1 sind in 4 gezeigt. Das gesamte MAGE-C2-Gen ist homolog zu den MAGE-C1-Sequenzen. Nichtsdestotrotz enthält MAGE-C2 nicht die große repetitive Region, die in der kodierenden Region des Gens MAGE-C1 gefunden wird. Die Exon-Intron-Struktur des Gens MAGE-C2 liegt zwischen der des Gens MAGE-C1 und der der MAGE-A-Gene, wie in 4 durch das Gen MAGE-A1 dargestellt ist. Wie die MAGE-A-Gene umfasst das MAGE-C2 drei Exons, aber die MAGE-C2 Exons 1 und 2 sind homolog zu den MAGE-C1-Exons 1 und 2. Das dritte Exon von MAGE-C2 weist eine Struktur auf, die vergleichbar der des dritten Exons des MAGE-A-Gens ist: Es enthält den gesamten offenen Leserahmen und beginnt an einer ähnlichen Stelle. Die codierende Sequenz des Gens MAGE-C2 ist länger als die des Gens MAGE-A1 und dies wird bedingt durch die Einführung, kurz nach dem Startcodon, einer 108 bp-Sequenz, die in dem MAGE-A1-Gen nicht gefunden wird.
  • E. Expression des Gens MAGE-C2.
  • Das Expressionsmuster des MAGE-C2-Gens wurde bestimmt durch RT-PCR-Analyse von normalem Gewebe und Tumorproben. Der ausgebildete Sinn-Primer SL102 (SEQ ID NO: 15) und der Antisinn-Primer SL103 (SEQ ID NO: 16) sind in verschiedenen Exons angeordnet (4: Primerpaar A). MAGE-C2 wird nicht in einem Satz von normalen Geweben, die getestet wurden, mit der Ausnahme der Hoden exprimiert (Tabelle 4). Bei Tumorproben wird MAGE-C2 häufig in Melanom und Blasenübergangszellenkarzinom exprimiert. Es wird auch in einem erheblichen Teile der Kopf- und Halskarzinome, Brustkarzinome, nicht-kleinzelligen Lungenkarzinome und Sarkome exprimiert (Tabelle 5). Die MAGE-C2-Expression ist mit der von anderen MAGE-Genen korreliert. 326 Tumorproben wurden getestet. Unter den 63 Proben, die das MAGE-C2-Gen exprimieren, exprimieren 62 auch wenigstens ein MAGE-A-Gen. Die einzige Tumorprobe, die für MAGE-C2-Expression positiv ist, aber für alle anderen MAGE-Gene negativ ist, ist eine Brusttumorprobe. Für Krebspatienten, die Tumore wie den letzteren tragen, wird die spezifische Immuntherapie mit MAGE-Antigenen ausschließlich auf der Verwendung von MAGE-C2-abgeleiteten Antigenen beruhen.
  • F. Chromosomale Anordnung des MAGE-C2-Gens.
  • Die chromosomale Anordnung des MAGE-C2-Gens wurde durch PCR-Analyse des GeneBridge 4 Radiation Hybrid-Panel (Walter et al., Nature Genet, 7: 22–28 (1994)) bestimmt. Eine jede DNA aus dem Satz wurde einer PCR mit den Primern SL102 und SL103 SEQ ID NOs: 15 und 16 unterzogen. Die PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt, auf eine Nitrozellulosemembran geblottet und mit radiomarkiertem Primer SL118 (5'-AGCTGCCTCTGGTTGGCAGA-3' SEQ ID NO: 17) hybridisiert. Der Primer SL118 ist komplementär zu einer Sequenz des ersten Introns des Gens MAGE-C2. Die PCR-Ergebnisse wurden einer Analyse auf der Website http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/contig/rhmapper.pl unterzogen. Die Analyse ergab, dass MAGE-C2 auf X-Chromosom zwischen dem Markern DXS1227 und DSX7087 angeordnet ist. Das Gen MAGE-C1 ist zwischen diesen Markern angeordnet, was den zytogenetischen Banden Xq26–Xq27 entspricht.
  • G. MAGE-C2 und andere MAGE-Proteine.
  • Das MAGE-C2-Protein weist Ähnlichkeiten mit anderen MAGE-Proteinen auf. Mehrfache Alignments mit allen bekannten MAGE-Proteinen zeigen, dass eine maximale Homologie an ihrem COOH-Terminus beobachtet wird. Die Ergebnisse von paarweisen Vergleichen zwischen den C-terminalen zwei Dritteln des MAGE-C2-Gens und den entsprechenden Sequenzen von anderen MAGE-Proteinen sind in Tabelle 6 gezeigt. C-terminale Segmente von MAGE-A-Proteinen weisen eine Aminosäureidentität von 52 bis 94% auf und weisen untereinander eine größere Identität auf als mit den MAGE-B-Proteinen, mit denen sie eine Aminosäureidentität von 39 bis 55% teilen. In ähnlicher Weise weisen die MAGE-B-Proteine mit einer Aminosäureidentität von 52 bis 67% untereinander eine größere Identität auf als mit den MAGE-A-Proteinen. Auf der Grundlage eines Sequenzähnlichkeitskriteriums gehören MAGE-C1 und MAGE-C2 zu einer dritten Unterfamilie: Sie weisen eine Aminosäureidentität untereinander von 68% auf, während sie mit den MAGE-Proteinen nur eine Aminosäureidentität von 43 bis 55% und 39 bis 46% mit MAGE-B-Proteinen aufweisen.
  • H. Identifizierung von möglichen HLA Klasse I-bindenden MAGE-C2-Peptiden.
  • Das Durchsuchen der MAGE-C2-Proteinsequenz auf HLA Klasse I-bindende Peptide wurde auf der Website http://bimas.dcrt.nih.gov./molbio durchgeführt. Tabelle 7 listet MAGE-C2-Peptide auf, von denen erwartet wird, dass sie an die angegebenen HLA Klasse I-Moleküle binden. Man hat kürzlich gezeigt, dass diese HLA Klasse I-Moleküle auf einigen Tumoren bestimmte Peptide präsentieren, die durch ein Gen der MAGE-Familie kodiert werden.
  • I. Southern Blot-Analyse.
  • Ein Southern Blot, der mit genomischen DNAs von Melanomzelllinien LB373-MEL, SK29-MEL und LB33.A-1 gemacht wurde, wurde mit einer 1,9 kb PCR-amplifizierten Sonde hybridisiert, die von SEQ ID NO: 18 abgeleitet war. Die Herstellung des Blots wurde wie oben beschrieben durchgeführt (Beispiel 7). Die Hybridisierung an die [α-32P] dCTP-radiomarkierte MAGE-C2-Sonde wurde in 5 × SSC, 5 × Denhardt's, 0,1% SDS und 100 μg/ml denaturierter Lachsspermien-DNA für 18 Stunden bei 68°C durchgeführt. Die Membranen wurden konsekutiv in 2 × SSC, 0,1% SDS für 20 Min. bei Raumtemperatur und in 2 × SSC, 0,1% SDS für 20 Min. bei 68°C gewaschen. Eine Autoradiographie wurde für 10 Tage durchgeführt.
  • Mehrere Hybridisierungsbanden wurden in den genomischen DNAs gefunden, die von den drei Melanomlinien erhalten waren. Die genomische DNA wurde mit BamHI- oder EcoRI-Restriktionsenzymen verdaut. In genomischen DNAs, die mit EcoRI verdaut waren, können wenigstens 5 Banden unterschieden werden, die mit der MAGE-C2-Sonde hybridisieren. Man hat gefunden, dass zwei davon Fragmente der Gene MAGE-C1 bzw. MAGE-C2 darstellen. Diese Ergebnisse schlagen vor, dass MAGE-C1 und MAGE-C2, wie hierin beschrieben, Mitglieder einer großen MAGE-C-Familie sind. bestimmt. Tabelle 2. MAGE-C1-Expression, wie durch RT-PCR an normalen Gewebeproben
    Gewebeart Anzahl von Proben, die MAGE-C1 exprimieren/Anzahl von getesteten Proben
    Blase 0/2
    Gehirn 0/4
    Brust 0/3
    Dickdarm 0/2
    Nebenhoden 0/1
    Niere 0/1
    Leber 0/4
    Lunge 0/6
    Lymphozyten (PBL) 0/4
    Eierstock 0/1
    Plazenta 0/1
    Prostata 0/2
    Hoden 3/3
    Gebärmutter 0/4
    Tabelle 2. MAGE-C1-Expression, wie durch RT-PCR an Tumorproben bestimmt.
    Figure 00340001
    Tabelle 2. (Fortsetzung)
    Figure 00350001
    Tabelle 3. Wiederholte Peptide, die im Protein MAGE-C1 gefunden werden und von denen man erwartet, dass sie an HLA Klasse I-Moleküle binden, wie durch Analyse auf der Website http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio bestimmt
    Figure 00360001
    Tabelle 4. MAGE-C2-Expression in normalen Geweben, wie durch RT-PCR mit den Primern SL102 und SL103 analysiert.
    Gewebetyp MAGE-C2-Expression
    Blase –
    Gehirn –
    Brust –
    Dickdarm –
    Herz –
    Niere –
    Leber –
    Lunge –
    Lymphozyten –
    Eierstock –
    Plazenta –
    Haut –
    Nebenniere –
    Hoden +
    Gebärmutter –
    Tabelle 5 MAGE-C2-Expression in Tumorproben, wie durch RT-PCR mit den Primern SL102 und SL103 analysiert
    Tumorart Anzahl positiver Proben/getestete Anzahl
    Hautmelanom primär metastasenbildend 30/70 (43%) 10/30 (33%) 20/40 (50%)
    Uveamelanom 0/5
    Blasenübergangszellenkarzinom Invasiv Oberflächlich 9/30 6/15 3/15
    Kopf- und Hals-Adenoakanthom 4/20
    Brustkarzinom 3/20
    Lungenkarzinom (NSCLC) 4/35
    Sarkom 2/15
    Speiseröhrenkarzinom 2/15
    Prostataadenokarzinom 1/10
    Myelom 1/5
    Gehirntumoren 0/9
    kolorektales Karzinom 0/20
    Leukämie 0/25
    Neuroblastom 0/2
    Mesotheliom 0/4
    Nierentumoren 0/24
    Schilddrüsentumoren 0/5
    Gebärmuttertumor 0/5
  • Tabelle 6. Prozentsatz von Aminosäureidentität zwischen C-terminalen Fragmenten aller bekannter MAGE-Proteine
    Figure 00390001
  • Tabelle 7. Peptide, die im Protein MAGE-C2 gefunden werden und von denen man erwartet, dass sie an die angegebenen HLA Klasse I-Moleküle binden, wie durch Analyse auf der Website http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio bestimmt
    Figure 00400001
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
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  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
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  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001

Claims (23)

  1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das einen Tumorabweisungsantigenvorläufer kodiert, der eine Aminosäuresequenz eines Tumorabweisungsantigenvorläufers aufweist, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 18.
  2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die einen Tumorabweisungsantigenvorläufer kodiert, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 9 oder SWQ ID NO: 18 aufgeführt ist.
  3. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül ein cDNA- oder ein g-DNA-Molekül ist.
  4. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das einen Tumorabweisungsantigenvorläufer kodiert, dessen komplementäre Sequenz unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die aus den Nukleotiden 1–2815 von SEQ ID NO: 9 besteht.
  5. Isoliertes mRNA-Molekül, das dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 komplementär ist.
  6. Expressionsvektor umfassend ein isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, das operativ mit einem Promotor verbunden ist.
  7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei der Promotor ein induzierbarer Promotor ist.
  8. Zelllinie oder Zellstamm, der mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transfiziert oder transformiert ist.
  9. Zelllinie nach Anspruch 8, wobei die Zelllinie eine eukaryotische Zelllinie ist.
  10. Zelllinie nach Anspruch 9, wobei die Zelllinie eine Nagetier- oder Affenzelllinie, bevorzugt eine COS- oder eine CHO-Zelllinie ist.
  11. Methode zum Bestimmen des Vorliegens von zytolytischen T-Zellen, die für Komplexe eines HLA-Moleküls und eines Peptids spezifisch sind, das von dem Protein deriviert ist, das durch das isolierte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 kodiert wird, in einer CTL-haltigen Probe, umfassend das Kontaktieren der Probe mit Zellen, die die Komplexe an ihrer Oberfläche aufweisen, und das Bestimmen (i) der Proliferation zytolytischer T-Zellen oder (ii) der Lyse von Zellen, die die Komplexe aufweisen, als Bestimmung der zytolytischen T-Zellen in der Probe.
  12. Methode nach Anspruch 11, umfassend das Bestimmen der Proliferation zytolytischer T-Zellen durch Messen der Tumornekrosefaktorfreisetzung.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, umfassend das Bestimmen der Lyse der Zellen durch Bestimmen der Freisetzung einer radiogelabelten Substanz, bevorzugt 51Cr, aus den Zellen.
  14. Methode nach Anspruch 11, wobei die Zellen, die die Komplexe aufweisen, mit mindestens einem von (i) einem Nukleinsäuremolekül, das ein HLA-Molekül kodiert, und (ii) dem isolierten Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 transfiziert oder transformiert worden sind.
  15. Methode nach Anspruch 11, wobei die Zellen sowohl mit (i) einem Nukleinsäuremolekül, das ein HLA-Molekül kodiert, als auch (ii) der Nukleinsäure nach Anspruch 1 transfiziert oder transformiert worden sind.
  16. Isolierter Tumorabweisungsantigenvorläufer, der durch das isolierte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 3 kodiert wird.
  17. Kit, das bei einem auf einer Polymerasekettenreaktion basierenden Assay nützlich ist, umfassend ein Oligonukleotid mit einer Sequenz der Nukleotide 18–34 von SEQ IN NO: 1 und ein Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die den Nukleotiden 200–217 von SEQ IB No: 1 komplementär ist.
  18. Methode zum Bestimmen der Expression eines MAGE-C1-Gens in einer Probe umfassend das Kontaktieren der Probe mit einem Oligonukleotid mit einer Sequenz bestehend aus (i) den Nukleotiden 18–34 von SEQ ID NO: 1 und (ii) einem Oligonukleotid mit einer Sequenz, die den Nukleotiden 200–217 von SEQ ID NO: 1 komplementär ist, unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Sequenzen von (i) oder (ii) an eine MAGE-C1 kodierende Sequenz fördern, Durchführen einer Polymerasekettenreaktion und Bestimmen des Expressionsprodukts, um das Vorliegen einer MAGE-C1 kodierenden Sequenz in der Probe zu bestimmen.
  19. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das einen Tumorabweisungsantigenvorläufer kodiert, dessen komplementäre Sequenz unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül hybridisiert, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 18 dargestellt ist, unter der Voraussetzung, dass die komplementäre Sequenz unter stringenten Bedingungen nicht an SEQ ID NO: 8 hybridisiert.
  20. Methode zum Bestimmen der Expression eines MAGE-C2-Gens in einer Probe umfassend das Kontaktieren der Probe mit (i) einem Oligonukleotid mit einer Sequenz, die durch SEQ ID NO: 15 dargestellt ist und (ii) einem Oligonukleotid mit einer Sequenz, die durch SEQ ID NO: 16 dargestellt ist, unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Sequenzen von (i) oder (ii) an eine MAGE-C2-kodierende Sequenz fördern, Durchführen einer Polymerasekettenreaktion und Bestimmen des Expressionsprodukts, um das Vorliegen einer MAGE-C2 kodierenden Sequenz in der Probe zu bestimmen.
  21. Zelllinie oder Zellstamm, der mit dem isolierten Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 transfiziert oder transformiert ist.
  22. Polytop umfassend eine Mehrzahl von Tumorabweisungsantigenen, die von MAGE-C1- oder MAGE-C2-Tumorabweisungsantigenvorläufern nach Anspruch 16 deriviert sind.
  23. Polytop umfassend mindestens ein Tumorabweisungsantigen, das von dem MAGE-C1- oder MAGE-C2-Tumorabweisungsantigenvorläufer nach Anspruch 16 und mindestens einem anderen Tumorabweisungsantigen deriviert ist.
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