DE69828432T2

DE69828432T2 - Verfahren, kits und zusammenfassungen mit beziehung zu linearen baken

Info

Publication number: DE69828432T2
Application number: DE69828432T
Authority: DE
Inventors: D. Brian GILDEA; M. James COULL; J. Jens HYLDIG-NIELSEN; J. Mark FIANDACA
Original assignee: Boston Probes Inc
Current assignee: Boston Probes Inc
Priority date: 1997-10-27
Filing date: 1998-10-27
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2018-10-28
Also published as: EP1027372B1; DE69842040D1; EP1484337A2; US20090136941A1; EP1027372A1; ES2235375T3; EP1484337A3; JP4372341B2; DK1027372T3; JP2003526597A; EP1484337B1; WO1999021881A1; ATE490978T1; AU1121499A; JP2009082137A; US7422852B2; US6649349B2; US20070178471A1; ATE286066T1; US6485901B1

Description

Hintergrund:
1. Technisches Gebiet
Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet des auf Sonden basierenden Nucleinsäuresequenz-Nachweises, der -Analyse und der -Quantifizierung. Genauer bezieht sich diese Erfindung auf neue Verfahren, Kits und Zusammensetzungen, die zu Linear Beacons gehören.
2. Hintergrund-Stand der Technik
Das Löschen eines Fluoreszenzsignals kann entweder durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer "FRET" (auch bekannt als Nichtstrahlungsenergietransfer: siehe Yaron et al., Analytical Biochemistry, 95: 228-235 (1979), auf S. 232, Sp. 1, Z. 32-39) oder durch Nicht-FRET-Wechselwirkungen (auch bekannt als strahlungsloser Energieübergang: siehe Yaron et al., Analytical Biochemistry, 95, auf S. 229, Sp. 2, Z. 7-13) geschehen. Der kritische unterscheidende Faktor zwischen FRET- und Nicht-FRET-Löschung ist, dass das Nicht-FRET-Löschen einen kurzen Bereich der Wechselwirkung durch "Kollision" oder "Kontakt" benötigt und deswegen keine spektrale Überlappung zwischen den Einheiten des Donor- und Akzeptorpaares benötigt (siehe Yaron et al., Analytical Biochemistry, 95, auf S. 229, Sp. 1, Z. 22-42). Im Gegensatz dazu benötigt das FRET-Löschen eine spektrale Überlappung zwischen den Donor- und Akzeptoreinheiten und die Effizienz des Löschens ist direkt proportional zu dem Abstand zwischen den Donor- und Akzeptoreinheiten des FRET-Paares (siehe Yaron et al., Analytical Biochemistry 95, auf S. 232, Sp. 1, Z. 46, bis Sp. 2, Z. 29). Ausgedehnte Überblicke über das FRET-Phänomen sind beschrieben in R. M. Clegg, Methods Enzymol., 221: 353-388 (1992), und P. R. Selvin, Methods Enzymol., 246: 300-334 (1995). Yaron et al. schlugen auch vor, dass die darin beschriebenen Prinzipien auf die Hydrolyse von Oligonucleotiden angewandt werden könnten (siehe Yaron et al., Analytical Biochemistry, 95, auf S. 234, Sp. 2, Z. 14-18).
Das FRET-Phänomen wurde für den direkten Nachweis von Nucleinsäurezielsequenzen genutzt, ohne das Erfordernis, dass markierte Nucleinsäurehybridisierungssonden oder -primer von dem Hybridisierungskomplex vor dem Nachweis getrennt werden müssen (siehe Livak et al. US 5,538,848 ). Ein Verfahren der Nutzung von FRET, um mit Hilfe von Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifizierte Nucleinsäure in einem Closed-Tube-Format zu analysieren, ist im Handel erhältlich von Perkin Elmer. Der TaqMan^TM-Test verwendet eine Nucleinsäurehybridisierungssonde, die mit einem Fluoreszenzreporter und einer Löschereinheit in einer Anordnung markiert ist, die in der Löschung der Fluoreszenz in der intakten Sonde resultiert. Während der PCR-Amplifikation hybridisiert die Sondensequenz spezifisch mit der amplifizierten Nucleinsäure. Wenn sie hybridisiert ist, baut die Exonucleaseaktivität der Taq-Polymerase die Sonde ab, wobei die durch die intakte Sonde aufrecht erhaltene intramolekulare Löschung eliminiert wird. Da die Sonde gestaltet ist, um spezifisch mit der amplifizierten Nucleinsäure zu hybridisieren, kann der Anstieg in der Fluoreszenzintensität der Probe, verursacht durch den enzymatischen Abbau der Sonde, in Beziehung gesetzt werden mit der Aktivität des Amplifizierungsvorgangs.
Nichtsdestotrotz benötigt dieses Verfahren vorzugsweise, dass jede der Fluorophor- und Löschereinheiten an den 3'- und 5'-Enden der Sonde angeordnet sind, so dass das optimale Signal-Rausch-Verhältnis erreicht wird (siehe: Nazarenko et al., Nucl. Acids Res., 25: 2516-2521 (1997), auf S. 2516, Sp. 2, Z. 27-35). Diese Orientierung resultiert jedoch notwendigerweise in weniger als der optimalen Fluoreszenzauslöschung, da das Fluorophor und die Löschereinheiten im Raum voneinander getrennt sind und der Transfer von Energie am effizientesten ist, wenn sie eng benachbart sind. Folglich kann die Hintergrundemission der unhybridisierten Sonde in dem TagMan^TM-Test relativ hoch sein (siehe Nazarenko et al., Nucl. Acids Res., 25, auf S. 2516, Sp. 2, Z. 36-40).
Das Nucleinsäure-Molecular-Beacon ist ein weiteres Konstrukt, welches das FRET-Phänomen nutzt, um Nucleinsäurezielsequenzen nachzuweisen (siehe Tyagi et al. Nature Biotechnology, 14:303-308 (1996). Ein Nucleinsäure Molecular Beacon umfasst eine Sondierungssequenz, die in zwei komplementären Armsequenzen eingebettet ist (siehe Tyagi et al, Nature Biotechnology, 14, auf S. 303, Sp. 1, Z. 22-30). An jedes Ende der Sondierungssequenz wird eines von entweder einem Fluorophor oder einer Löschereinheit angeheftet. In der Abwesenheit des Nucleinsäureziels lagern sich die Armsequenzen aneinander an, um dadurch eine Schleifen- und Haarnadelstammstruktur zu bilden, welche das Fluorophor und den Löscher zueinander bringt (siehe Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, auf S. 304, Sp. 2, Z. 14-25). Wenn sie mit der Zielnucleinsäure in Kontakt gebracht werden, werden die komplementäre Sondensequenz und Zielsequenz miteinander hybridisieren. Da der Haarnadelstamm mit der festen Doppelhelix, die nach der Hybridisierung gebildet wird, nicht koexistieren kann, zwingen die resultierenden, konformatorischen Änderungen der Armsequenzen auseinander und bringen das Fluorophor und den Löscher dazu, voneinander getrennt zu werden (siehe Tyagi et al. Nature Biotechnology, 14, auf S. 303, Sp. 2, Z. 1-17). Wenn das Fluorophor und der Löscher getrennt werden, geht die Energie des Donorfluorophors nicht auf die Akzeptoreinheit über und das fluoreszierende Signal wird dann nachweisbar. Da unhybridisierte Molecular Beacons nicht fluoreszierend sind, ist es nicht notwendig, dass jede überschüssige Sonde aus einem Test entfernt wird. Folglich stellen Tyagi et al. fest, dass Molecular Beacons für den Nachweis von Zielnucleinsäuren in einem homogenen Test und in lebenden Zellen verwendet werden können (siehe Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, auf S. 303, Sp. 2, Z. 15-77).
Die Armsequenzen der offenbarten Nucleinsäure-Molecular-Beacon-Konstrukte stehen mit der Sondiersequenz nicht in Beziehung (siehe Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, auf S. 303, Sp. 1, Z. 30). Da die Molecular Beacons von Tyagi et al. Nucleinsäuremoleküle umfassen, hängt die saubere Stammbildung und Stabilität von der Länge des Stamms, dem G:C-Gehalt der Armsequenzen, der Salzkonzentration, in der sie gelöst sind, und der Anwesenheit oder dem Fehlen von Magnesium, in welchem die Sonde gelöst ist, ab (siehe Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, auf S. 305, Sp. 1, Z. 1-16). Weiterhin sind die Nucleinsäure-Molecular-Beacons von Tyagi et al. für den Abbau durch Endonucleasen und Exonucleasen empfänglich.
Nach dem Sondenabbau wird das Fluoreszenz-Signal des Hintergrundes zunehmen, da Donor- und Akzeptoreinheiten nicht länger in enger Nähe zueinander gehalten werden. Folglich werden Tests, die Enzyme nutzen, von denen bekannt ist, dass sie Nucleaseaktivität haben, einen kontinuierlichen Anstieg in der Hintergrund-Fluoreszenz, indem das Nucleinsäure-Molecular-Beacon abgebaut wird, zeigen (siehe 7 in Tyagi et al.: Die mit (O) und (⎕) verknüpften Daten zeigen, dass der fluoreszierende Hintergrund, vermutlich durch den Sondenabbau verursacht, mit jedem Amplifikationszyklus steigt). Zusätzlich werden Molecular Beacons auch, zumindest teilweise, in lebenden Zellen abgebaut, da Zellen aktive Nucleaseaktivität enthalten.
Die von Tyagi et al. beschriebenen Konstrukte sind weiter beschrieben in WO95/13399 (auf die hierin anschließend Bezug genommen wird als "Tyagi2 et al."), mit der Ausnahme, dass Tyagi2 et al. auch offenbaren, dass das Nucleinsäure-Molecular-Beacon auch bimolekular sein kann, worin sie bimolekular dahingehend definieren, als einheitliche Sonden der Erfindung, umfassend zwei Moleküle (z. B. Oligonucleotide), worin die Hälfte oder grob die Hälfte der Zielkomplementsequenz, ein Glied des Affinitätspaares und ein Glied des Markierungspaares in jedem Molekül anwesend sind (siehe Tyagi2 et al., S. 8, Z. 25, bis S. 9, Z. 3). Tyagi2 et al. stellen jedoch besonders fest, dass man bei der Gestaltung einer einheitlichen Sonde für die Verwendung in einer PCR-Reaktion natürlich eine Zielkomplementsequenz wählen würde, die nicht zu einem der PCR-Primer komplementär ist (siehe Tyagi2 et al., S. 41, Z. 27). Tests der Erfindung schließen Echtzeit- und Endpunktbestimmung spezifischer einzelsträngiger oder doppelsträngiger Produkte der Nucleinsäuresynthesereaktionen ein, vorausgesetzt jedoch, dass, falls einheitliche Sonden dem Schmelzen oder anderer Denaturierung ausgesetzt werden, die Sonden unimolekular sein müssen (siehe Tyagi2 et al., S. 37, Z. 1-9). Weiterhin setzen Tyagi2 et al. fest, dass, obwohl die einheitlichen Sonden der Erfindung bei Amplifikations- oder anderen Nucleinsäuresynthesereaktionen verwendet werden können, bimolekulare Sonden (wie in Tyagi2 et al. definiert) nicht für die Verwendung in irgendeiner Reaktion (z. B. PCR) geeignet sind, worin das Affinitätspaar in einer zielunabhängigen Weise getrennt würde (siehe Tyagi2 et al., S. 13, Z. 9-12). Weder Tyagi et al. noch Tyagi2 et al. offenbaren, legen nahe oder lehren irgendetwas über PNA.
In einer jüngeren Offenbarung wurden modifizierte Haarnadelkonstrukte, die ähnlich sind mit den Nucleinsäure-Molecular-Beacons von Tyagi et al., die jedoch geeignet sind, als Primer für die Polymeraseverlängerung, offenbart (siehe Nazarenko et al., Nucleic Acids Res., 25: 2516-2521(1997)). Ein Verfahren, das geeignet ist für den direkten Nachweis von mit PCR amplifizierter DNA in einem geschlossenen System, ist auch offenbart. Gemäß dem Verfahren werden die Primerkonstrukte von Nazarenko et al. durch die Tätigkeit des PCR-Vorgangs in das Amplifikationsprodukt eingebaut. Der Einbau in ein durch PCR amplifiziertes Produkt resultiert in einer Änderung der Konfiguration, die die Donor- und Akzeptoreinheiten trennt. Folglich können Anstiege in der Intensität des fluoreszierenden Signals direkt mit der Menge des Primers, der in das durch PCR amplifizierte Produkt eingebaut wurde, in Beziehung gesetzt werden. Die Autoren schließen daraus, dass dieses Verfahren besonders gut für die Analyse von durch PCR amplifizierte Nucleinsäure in einem Closed-Tube-Format geeignet ist.
Da sie Nucleinsäuren sind, sind die Primerkonstrukte von Nazarenko et al. anerkanntermaßen Gegenstand der Nucleaseverdauung, wobei eine Zunahme im Hintergrundsignal während des PCR-Vorgangs verursacht wird (siehe Nazarenko et al., Nucleic Acids Res., 25, auf S. 2519, Sp. 1; Z. 28-39). Ein zusätzlicher Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die einem Molecular Beacon ähnlichen Primerkonstrukte während der Amplifikation linearisiert werden müssen (siehe Nazarenko et al., Nucleic Acids Res., 25, auf S. 2519, Sp. 1, Z. 7-8). Folglich muss die Polymerase durch den Stamm des haarnadel-modifizierten, einem Molecular Beacon ähnlichen Primerkonstruktes hindurchlesen und ihn dissoziieren, falls ein Fluoreszenzsignal erzeugt werden soll. Nazarenko et al. legen nicht nahe, lehren oder offenbaren irgendetwas über PNA.
In noch einer anderen Anwendung von FRET, um den Nucleinsäuresequenznachweis zum Ziel zu nehmen, wurden ebenfalls doppelt markierte fluoreszierende Oligonucleotidsonden, die für die Exonucleaseverdauung unempfindlich gemacht worden waren, verwendet, um Zielnucleinsäuresequenzen in PCR-Reaktionen und in in situ-PCR nachzuweisen (Mayrand, US 5,691,146 ). Die Oligonucleotidsonden von Mayrand umfassen ein Fluorescer-(Reporter-)Molekül, das an ein erstes Ende des Oligonucleotids angeheftet ist, und ein Löschermolekül, das an das gegenüber liegende Ende des Oligonucleotids angeheftet ist (siehe Mayrand, Zusammenfassung). Mayrand schlägt vor, dass der Stand der Technik lehrt, dass der Abstand zwischen dem Fluorophor und dem Löscher ein wichtiges Merkmal ist, das minimiert werden muss, und folglich sollte der bevorzugte Abstand zwischen den Reporter- und den Löschereinheiten einer DNA-Sonde 6 bis 16 Nucleotide sein (siehe Sp. 7, Z. 8-24). Mayrand lehrt jedoch, dass das Reportermolekül und die Löschereinheiten vorzugsweise in einem Abstand von 18 Nucleotiden (siehe Sp. 3, Z. 35-36) oder von 20 Basen (siehe Sp. 7, Z. 25-46) lokalisiert sein sollen, um das optimale Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen. Folglich lehren sowohl Mayrand als auch der darin zitierte Stand der Technik, dass die nachweisbaren Eigenschaften von Nucleinsäuresonden (DNA oder RNA), umfassend ein Fluorophor und einen Löscher, eine starke Abhängigkeit von der Sondenlänge zeigen.
Beständigkeit gegen Nucleinsäureverdauung ist ebenfalls ein wichtiger Aspekt der Erfindung (siehe US 5,691,146 in Sp. 6, Z. 42-64) und folglich schlägt Mayrand vor, dass das 5'-Ende des Oligonucleotids beständig gegen Nucleaseverdauung gemacht werden kann, indem eine oder mehrere modifizierte Internucleotidkopplungen an dem 5'-Ende der Oligonucleotidsonde eingeschlossen werden (siehe US 5,691,146 in Sp. 6, Z. 45-50). Weiterhin schlägt Mayrand vor, dass eine Polyamid-Nucleinsäure (PNA) oder Peptid als eine nuclease-beständige Kopplung verwendet werden kann, um dadurch das 5'-Ende der Oligonucleotidsonde der Erfindung zu modifizieren und es für Nucleaseverdauung unempfindlich zu machen (siehe US 5,691,146 in Sp. 6, Z. 53-64). Mayrand offenbart jedoch nicht, legt nicht nahe oder lehrt nicht, dass ein PNA-Sonden-Konstrukt ein geeigneter Ersatz für die Praxis der Erfindung sein könnte, trotzdem, dass er offensichtlich Wissen über seine Existenz hatte. Weiterhin lehrt Mayrand einem Fachmann nicht, wie eine PNA mit den Fluorescer- oder Löschereinheiten zuzubereiten und/oder zu markieren ist.
Die Effizienz des Energietransfers zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten, wie er durch die Oligonucleotidlänge (den -abstand) beeinflusst werden kann, wurde weiter untersucht und insbesondere angewandt auf fluoreszierende Nucleinsäuresequenzieranwendungen (siehe Mathies et al., US 5,707,804 ). Mathies et al. stellen fest, dass zwei Fluorophore durch ein Rückgrat oder eine Kette verknüpft werden, wo die Distanz zwischen den beiden Fluorophoren variiert werden kann (siehe US 5,707,804 in Sp. 4, Z. 1-3). Folglich muss der Abstand gewählt werden, um einen Energietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor durch den wohl bekannten Foerster-Mechanismus bereitzustellen (siehe US 5,707,804 in Sp. 4, Z. 7-9). Vorzugsweise trennen ungefähr 3 bis 10 Nucleoside die Fluorophore einer einzelsträngigen Nucleinsäure (siehe US 5,707,804 in Sp. 7, Z. 21-25). Mathies et al. legen nicht nahe, lehren oder offenbaren irgendetwas über PNA.
Aus der Analyse der DNA-Duplexe wurde beobachtet, dass: 1. die Effizienz von FET (oder FRET, wie hierin definiert) irgendwie von der Nucleobasensequenz des Oligonucleotids abzuhängen scheint; 2. die Donorfluoreszenz sich auf eine Weise ändert, welche nahe legt, dass Farbstoff-DNA-Wechselwirkungen die Effizienz von FET beeinflussen; und 3. die Forster-Gleichung nicht quantitativ zu dem beobachteten Energietransfer beiträgt und folglich kann die Länge zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten, die an die Oligonucleotide angeheftet sind, nicht quantifiziert werden, obwohl sie qualtitativ verwendet werden kann (siehe Promisel et al., Biochemistry, 29: 9261-9268 (1990)). Promisel et al. schlagen vor, dass Nicht-Forster-Effekte zu einigen ihrer beobachteten, jedoch anderweitig nicht erklärbaren Ergebnisse beitragen könnten (siehe Promisel et al., Biochemistry, 29, auf S. 9267, Sp. 1, Z. 43, bis S. 9268, Sp. 1, Z. 13). Die Ergebnisse von Promisel et al. legen nahe, dass die FRET-Phänomene, wenn sie in Nucleinsäuren genutzt werden, nicht vollständig vorhersehbar oder gut verstanden sind. Promisel et al. legen nicht nahe, lehren oder offenbaren irgendetwas über PNA und in der Tat hat das Manuskript ein früheres Datum als die Erfindung der PNA.
Der so weit diskutierte Hintergrund-Stand der Technik offenbart nicht, legt nicht nahe oder lehrt nicht irgendetwas über PNA-Oligomere, an die direkt ein Paar aus Donor- und Akzeptoreinheiten angeheftet ist. In der Tat scheint das FRET-Phänomen, wie es auf den Nachweis von Nucleinsäuren angewendet wird, auf die Zubereitung von Konstrukten, in denen der Teil der Sonde, welcher komplementär ist zu der Zielnucleinsäuresequenz selbst, ausschließlich aus Nucleinsäure zusammengesetzt ist, beschränkt zu sein.
FRET wurde auch auf dem Gebiet der Peptide genutzt. (Siehe Yaron et al., Analytical Biochemistry, 95, auf S. 232, Sp. 2, Z. 30, bis S. 234, Sp. 1, Z. 30). In der Tat scheint die Verwendung passend markierter Peptide als Enzymsubstrate die primäre Anwendbarkeit für Peptide zu sein, die mit Donor- und Akzeptorpaaren markiert sind (siehe Zimmerman et al., Analytical Biochemistry, 70: 258-262 (1976), Carmel et al., Eur. J. Biochem., 73: 617-625 (1977), Ng et al., Analytical Biochemistry, 183: 50-56 (1989), Wang et al., Tett. Lett., 31: 6493-6496 (1990), und Meldal et al., Analytical Biochemistry, 195: 141-147 (1991)). Frühe Arbeiten schlugen vor, dass die Löscheffizienz des Donor- und Akzeptorpaares von der Peptidlänge abhängig war (siehe Yaron et al., Analytical Biochemistry, 95, auf S. 233, Sp. 2, Z. 36-40). Die spätere Arbeit schlug jedoch vor, dass ein effizientes Löschen nicht so abhängig war von der Peptidlänge (siehe Ng et al., Analytical Biochemistry, 183, auf S. 54, Sp. 2, Z. 23, bis S. 55, Sp. 1, Z. 12; Wang et al., Tett. Lett., 31, worin das Peptid acht Aminosäuren lang ist; und Meldal et al., Analytical Biochemistry, 195, auf S. 144, Sp. 1, Z. 33-37). Es wurde von Ng et al. vorgeschlagen, dass das beobachtete Löschen in langen Peptiden als ein noch unbestimmter Mechanismus geschehen könnte (siehe Ng et al., Analytical Biochemistry 183, auf S. 55, Sp. 1, Z. 13, bis Sp. 2, Z. 7).
Trotz seines Namens ist Peptid-Nucleinsäure (PNA) weder ein Peptid noch eine Nucleinsäure noch ist es sogar eine Säure. Peptid-Nucleinsäure (PNA) ist ein nicht natürlich vorkommendes Polyamid (Pseudo-Peptid), das mit Nucleinsäure (DNA und RNA) mit Sequenzspezifität hybridisieren kann (siehe US-Patent Nr. 5,539,082 und Egholm et al., Nature, 365: 566-568 (1993)). PNA werden durch Anpassung von Standardpeptidsynthesevorgängen in einem Format, das nun im Handel erhältlich ist, synthetisiert. (Für einen allgemeinen Überblick über die Zubereitung von PNA-Monomeren und -Oligomeren siehe bitte: Dueholm et al., New J. Chem., 21: 19-31 (1997), oder Hyrup et. al., Bioorganic & Med. Chem., 4: 5-23 (1996)). Alternativ können markierte und nicht markierte PNA-Oligomere erworben werden (siehe PerSeptive Biosystems Promotional Literature: Bio-Concepts, Veröffentlichung Nr. NL612, Practical PNA, Review and Practical PNA, Band 1, Ausgabe 2.)
Als nicht natürlich vorkommende Moleküle sind PNAs nicht bekannt dafür, dass sie Substrate für die Enzyme sind, von denen bekannt ist, dass sie Peptide oder Nucleinsäuren abbauen. Folglich sollten PNAs in biologischen Proben stabil sein, ebenso wie sie auch eine lange Lagerzeit haben sollten. Anders als die Nucleinsäurehybridisierung, die sehr von der Ionenstärke abhängig ist, ist die Hybridisierung einer PNA mit einer Nucleinsäure ziemlich unabhängig von der Ionenstärke und wird begünstigt bei einer niedrigen Ionenstärke und damit bei Bedingungen, die stark die Hybridisierung von Nucleinsäure mit Nucleinsäure benachteiligen (Egholm et al., Nature, auf S. 567). Die Wirkung der Ionen stärke auf die Stabilität und Konformation von PNA-Komplexen wurde ausgedehnt untersucht (Tomac et al., J. Am. Chem. Soc., 118: 5544-5552 (1996)). Die Sequenzunterscheidung ist wirksamer für PNA, die DNA erkennt, als für DNA, die DNA erkennt (Egholm et al., Nature, auf S. 566). Es scheinen jedoch die Vorteile in der Unterscheidung von Punktmutationen mit PNA-Sonden im Vergleich zu DNA-Sonden in einem Hybridisierungstest etwas sequenzabhängig zu sein (Nielsen et al., Anti-Cancer Drug Design, 8: 53-65, (1993)). Als ein zusätzlicher Vorteil hybridisieren PNAs an Nucleinsäure sowohl in paralleler als auch in antiparalleler Orientierung, obwohl die antiparallele Orientierung bevorzugt wird (siehe Egholm et al., Nature, auf S. 566).
Trotz der Fähigkeit, mit Nucleinsäure auf eine sequenzspezifische Art und Weise zu hybridisieren, gibt es viele Unterschiede zwischen PNA-Sonden und Standard-Nucleinsäuresonden. Diese Unterschiede können gewöhnlich in biologische, strukturelle und physikalisch-chemische Unterschiede aufgegliedert werden. Wie unten detaillierter diskutiert werden wird, können diese biologischen, strukturellen und physikalischchemischen Unterschiede zu unvorhersagbaren Ergebnissen führen, wenn versucht wird, PNA-Sonden in Anwendungen zu verwenden, wo Nucleinsäuren typischerweise verwendet worden sind. In der Chemie wird diese Nicht-Äquivalenz abweichender Zusammensetzungen oftmals beobachtet.
Hinsichtlich biologischer Unterschiede sind Nucleinsäuren biologische Materialien, die eine zentrale Rolle in dem Leben lebender Organismen als Mittel genetischer Übertragung und Expression spielen. Ihre in vivo-Eigenschaften sind ziemlich gut verstanden. PNA auf der anderen Seite ist ein erst kürzlich entwickeltes, vollständig künstliches Molekül, empfangen in den Gehirnen von Chemikern und hergestellt unter Verwendung synthetischer organischer Chemie. Sie hat keine bekannte biologische Funktion (das heißt, von nativer (nicht modifizierter) PNA ist nicht bekannt, dass es ein Substrat für irgendeine Polymerase, Ligase, Nuclease oder Protease ist).
Strukturell unterscheidet sich PNA auch dramatisch von Nucleinsäure. Obwohl beide gewöhnliche Nucleobasen (A, C, G, T und U) verwenden können, sind die Rückgrate dieser Moleküle strukturell unterschiedlich. Die Rückgrate von RNA und DNA sind zu sammengesetzt aus sich wiederholenden Phosphodiesterribose- und 2-Desoxyriboseeinheiten. Im Gegensatz dazu sind die Rückgrate der meisten gewöhnlichen PNAs aus N-[2-(Aminoethyl)]glycin-Untereinheiten zusammengesetzt. Zusätzlich sind in der PNA die Nucleobasen durch eine zusätzliche Methylencarbonyleinheit mit dem Rückgrat verbunden.
PNA ist keine Säure und enthält folglich keine geladenen sauren Gruppen, wie jene, die in DNA und RNA anwesend sind. Da ihnen die formale Ladung fehlt, sind PNAs im Allgemeinen hydrophober als ihre äquivalenten Nucleinsäuremoleküle. Der hydrophobe Charakter der PNA erlaubt die Möglichkeit, nicht spezifischer (hydrophobe/hydrophobe Wechselwirkungen) Wechselwirkungen, die mit Nucleinsäure nicht beobachtet werden. Weiterhin ist PNA achiral, wodurch es mit der Fähigkeit versehen ist, strukturelle Konformationen anzunehmen, deren Äquivalent im RNA/DNA-Reich nicht existiert.
Die einzigartigen strukturellen Eigenschaften von PNA resultieren in einem Polymer, das in Lösung hochorganisiert ist, insbesondere bei purinreichen Polymeren (siehe Dueholm et al., New J. Chem., 21: 19-31 (1997), auf S. 27, Sp. 2, Z. 6-30). Umgekehrt ist eine einzelsträngige Nucleinsäure eine zufällige Spule, die eine sehr geringe Sekundärstruktur zeigt. Da PNA hochorganisiert ist, sollte PNA widerstandsfähiger dagegen sein, alternative Sekundärstrukturen (z. B. einen Haarnadelstamm und/oder -schleife) anzunehmen.
Die physikalisch-chemischen Unterschiede zwischen PNA und DNA oder RNA sind auch wesentlich. PNA bindet an ihre komplementäre Nucleinsäure schneller als Nucleinsäuresonden an dieselbe Zielsequenz binden. Von diesem Verhalten wird angenommen, dass es zumindest teilweise auf der Tatsache beruht, dass PNA auf ihrem Rückgrat Ladung fehlt. Zusätzlich zeigen jüngere Publikationen, dass der Einbau von positiv geladenen Gruppen in PNAs die Kinetiken der Hybridisierung verbessern wird (siehe Iyer et al., J. Biol. Chem., 270: 14712-14717 (1995)). Da ihm die Ladung auf dem Rückgrat fehlt, ist die Stabilität des PNA/Nucleinsäurekomplexes höher als jene eines analogen DNA/DNA- oder RNA/DNA-Komplexes. In gewissen Situationen wird DNA hochstabile tripelhelikale Komplexe durch einen Vorgang, der bezeichnet wird als "Strangverdrängung", bilden. In der DNA/RNA-Welt sind keine äquivalenten Strangverdrängungsvorgänge oder -strukturen bekannt.
Kürzlich wurde das "auf Hybridisierung basierende Screening auf Peptid-Nucleinsäure-(PNA)-Oligomeranordnungen" beschrieben, worin Arrays von etlichen tausend PNA-Oligomeren mit individueller Sequenz auf Polymermembranen synthetisiert wurden (siehe Weiler et al., Nucl. Acids Res., 25: 2792-2799(1997)). Arrays werden allgemein in einem einzigen Test verwendet, um eine Information über die Affinitätsbindung (Hybridisierung) über eine spezifische Sequenz oder Probe mit zahlreichen Sonden definierter Zusammensetzung zu erzeugen. Folglich können PNA-Arrays in diagnostischen Anwendungen oder für das Screening von Bibliotheken von Verbindungen auf Leitverbindungen, die eine therapeutische Nützlichkeit ausüben könnten, nützlich sein. Weiler et al. bemerken jedoch, dass die Affinität und Spezifität einer DNA-Hybridisierung an immobilisierte PNA-Oligomere von den Hybridisierungsbedingungen mehr abhing als erwartet. Ferner gab es eine Tendenz zu unspezifischer Bindung bei einer niedrigeren Ionenstärke. Weiterhin wurden gewisse sehr starke Bindungsfehlpaarungen identifiziert, die nicht durch stringentere Waschbedingungen eliminiert werden konnten. Diese unerwarteten Ergebnisse sind bezeichnend für das Fehlen des vollständigen Verständnisses dieser neu entdeckten Moleküle (das heißt PNA).
Zusammenfassend sind PNAs nützliche Kandidaten für die Untersuchung als Ersatzsonden, wenn sondenbasierte Hybridisierungstests entwickelt werden, da PNAs an Nucleinsäuren mit Sequenzspezifität hybridisieren. PNA-Sonden sind jedoch nicht äquivalent zu Nucleinsäuresonden, sowohl hinsichtlich der Struktur als auch der Funktion. Folglich erfordern die einzigartigen biologischen, strukturellen und physikalisch-chemischen Eigenschaften von PNA, dass Experimente durchgeführt werden, um dabei zu untersuchen, ob PNAs für Anwendungen geeignet sind, wo Nucleinsäuresonden gewöhnliche verwendet werden.
Offenbarung der Erfindung
1. Zusammenfassung
Es wurden zahlreiche PNA-Polymere in einem Versuch untersucht, ein PNA-Molecular-Beacon zuzubereiten. Die Anmelder haben festgelegt, dass alle PNA-Oligomere, die sie untersuchten, welche Donor- und Akzeptoreinheiten enthielten, die an entgegengesetzten Enden des Polymers lokalisiert sind, einen niedrigen inhärenten Hintergrund einer nachweisbaren Signalzunahme nach der Bindung der Sonde an eine Zielsequenz zeigten. Sehr überraschend wurden diese charakteristischen Eigenschaften eines Nucleinsäure-Molecular-Beacon beobachtet, ob das PNA-Oligomer geeignet war oder nicht für das Annehmen einer Haarnadelstamm- und -schleifenstruktur auf eine Weise im Einklang stehend mit dem Design der Nucleobasensequenz. Zum Beispiel übten in Hybridisierungstestanalysen die PNA-Oligomere (ursprünglich gestaltet als Kontroll-Oligomere), die nicht irgendwelche Armsequenzen, die geeignet wären für die Schaffung einer Haarnadel, aufwiesen, ein Signal-(PNA-Oligomer, gebunden an Zielsequenz)-Rausch-(keine Zielsequenz anwesend)-Verhältnis aus, das annähernd die Hälfte dessen ist, das für PNAs beobachtet wird, die selbstkomplementäre Nucleobasensequenzen umfassen.
Diese Erfindung ist auf Linear Beacons gerichtet. Ein Linear Beacon überträgt effizient Energie zwischen den Donor- und Akzeptoreinheiten, die an die Sonde gekoppelt sind, in der Abwesenheit einer Zielsequenz, ob es oder ob es nicht durch sein Design eine selbstkomplementäre Nucleobasensequenz umfasst. Nach der Hybridisierung an eine Zielsequenz wird die Effizienz des Energietransfers zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten des Linear Beacons geändert, so dass ein nachweisbares Signal von wenigstens einer Einheit verwendet werden kann, um das Auftreten des Hybridisierungsereignisses zu überwachen oder zu quantifizieren. Wir nehmen auf diese Sonden Bezug als Linear Beacons, um sie von den Haarnadelstrukturen zu unterscheiden, die typischerweise mit Nucleinsäure-Molecular-Beacons verbunden sind. Nichtsdestotrotz beabsichtigen die Anmelder nicht, damit anzudeuten, dass diesen Sonden eine Sekundärstruktur fehlt, da die Literatur lehrt, dass PNAs in Lösung hochorganisiert sein können (siehe Dueholm et al., New J. Chem., 21: 19-31 (1997), auf S. 27, Sp. 2, Z.6-30).
Die Linear Beacons dieser Erfindung besitzen etliche Eigenschaften, die einzigartig und nicht vorhersagbar sind. Zum Beispiel zeigen die Anmelder, dass die Effizienz des Energietransfers zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten eines Linear Beacons im Wesentlichen unabhängig ist von der Länge, da im Wesentlichen dasselbe Rauschen (siehe Beispiel 17 dieser Spezifikation) und Signal-Rausch-Verhältnis (siehe Beispiel 18 dieser Spezifikation) für Oligomere mit einer Länge von 11 bis 17 Untereinheiten beobachtet wurde. Dies war ein sehr überraschendes Ergebnis, da das intramolekulare Löschen geeignet markierter Nucleinsäureoligomere stark abhängig von der Länge der Sonde ist (siehe Hintergrund und Daten, die in Beispiel 17 dieser Spezifikation vorgestellt werden).
Zusätzlich zeigten die Anmelder, dass die Effizienz des Löschens eines Linear Beacons weder sequenzabhängig noch im Wesentlichen abhängig von der spektralen Überlappung der Donor- und Akzeptoreinheiten ist (siehe Beispiele 17, 18 und 21 dieser Spezifikation). Genauer umfasst die Mehrheit der PNA-Sonden, die zubereitet wurden, eine Fluorescein-Donoreinheit und eine Dabcyl-Löscher-(Akzeptor-)Einheit. Obwohl diese Donorakzeptorkombination kein ideales FRET-Paar ist, da die Emission der Donor-Fluoresceineinheit keinen hohen Grad spektraler Überlappung mit der Absorption der Akzeptor-Dabcyl-Einheit hat, ist das von den Anmeldern beobachtete Löschen nichtsdestotrotz wesentlich bei sämtlichen Konstrukten. Weiterhin wurde von den Linear Beacons, die das Cy3/Dabcyl- bzw. Donor/Akzeptor-Paar umfassen, beobachtet, dass sie sowohl ein Rauschen als auch ein Signal-Rausch-Verhältnis zeigen, die ähnlich waren mit jenen, die für das Fluorescein/Dabcyl-System beobachtet wurden, trotzdem, dass es eine wesentlich geringere spektrale Überlappung zwischen Cy3 und Dabcyl gab (siehe Beispiele 17, 18 und 21 dieser Spezifikation). Folglich zeigen die von den Anmeldern zusammengestellten Daten überraschend, dass Linear Beacons keine optimalen FRET-Paare zu umfassen brauchen, um arbeitsfähig zu sein. Folglich legen die Daten nahe, dass der direkte Kontakt der primäre, jedoch möglicherweise nicht der einzige, Modus des Energietransfers ist, da die spektrale Überlappung ein Erfordernis für FRET ist, jedoch nicht für den Nicht-FRET-Energietransfer benötigt wird. Weiterhin legen die Daten nahe, dass unabhängig von den Sondenlänge die Fluorophor- und Löschereinheiten eines Linear Beacon ähnlich liegen, um dabei einen Grad des Löschens zu erreichen, der ziemlich unabhängig ist von der Sondenlänge oder der Nucleobasensequenz.
Anmelder haben desgleichen untersucht, welche Wirkung variierende Ionenstärke und besonders die Anwesenheit oder Abwesenheit, die Magnesium auf das Sondenrauschen und die Sonden-Signal-Rausch-Verhältnisse hat. Wiederum wurde von PNAs befunden, dass sie Rauschen und Signal-Rausch-Verhältnisse zeigen, die im Wesentlichen unabhängig von Unterschieden in der Ionenstärke oder der Anwesenheit oder dem Fehlen von Magnesium sind, wohingegen die Eigenschaften von DNA-Sonden ähnlicher Länge und Markierungskonfiguration abhängig waren von Variationen der Ionenstärke und/oder hochabhängig waren von der Anwesenheit oder dem Fehlen von Magnesium.
Zusammenfassend wurde auch von den Anmeldern beobachtet, dass das Rauschen und das Signal-Rausch-Verhältnis von Linear Beacons im Wesentlichen unabhängig ist von der Länge oder von Untereinheiten, die Donor- und Akzeptoreinheiten trennen, von der Ionenstärke der Umgebung oder der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium. Wenn sie als Ganzes betrachtet werden, sind diese Ergebnisse sehr unerwartet im Lichte der Lehren des Standes der Technik. Folglich zeigen die Daten der Anmelder eine deutliche Nichtäquivalenz von Struktur und Funktion zwischen Nucleinsäure- und DNA-Sonden ähnlicher Länge und mit ähnlichen Markierungskonfigurationen. Es folgt daraus, dass die neuen Verfahren, Kits und Zubereitungen dieser Erfindung Linear Beacons umfassen, die einzigartige und überraschende Eigenschaften besitzen.
In einem Ausführungsbeispiel ist diese Erfindung auf ein Linear Beacon gerichtet. Im Allgemeinen ist ein Linear Beacon ein Polymer, das im Minimum wenigstens eine ge koppelte Energiedonoreinheit und wenigstens eine gekoppelte Energieakzeptoreinheit umfasst, worin diese Donor- und Akzeptoreinheiten durch wenigstens einen Teil einer Nucleobasensondiersequenz getrennt werden. Durch ihr Design bildet ein Linear Beacon nicht eine Stamm- und Schleifenhaarnadel. Das Linear Beacon ist weiter dadurch gekennzeichnet, dass die Effizienz des Energietransfers zwischen diesen Donor- und Akzeptoreinheiten, wenn das Polymer in wässriger Lösung solvatisiert wird, im Wesentlichen unabhängig von wenigstens zwei variablen Faktoren ist, ausgewählt aus der Grup pe, bestehend aus der Länge der Untereinheiten, die die Donor- und Akzeptoreinheiten trennen, wenn das Polymer in wässriger Lösung solvatisiert wird, im Wesentlichen unabhängig von wenigstens zwei variablen Faktoren ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Länge der Untereinheiten, die die Donor- und Akzeptoreinheiten trennen, der spektralen Überlappung der Donoreinheit und der Akzeptoreinheit, der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium in der wässrigen Lösung und der Ionenstärke der wässrigen Lösung. Vorzugsweise ist das Linear Beacon weiter dadurch gekennzeichnet, dass die Effizienz der Energietransfers zwischen diesen Donor- und Akzeptoreinheiten im Wesentlichen von wenigstens drei variablen Faktoren unabhängig ist, und am bevorzugtesten im Wesentlichen von allen vier variablen Faktoren unabhängig ist.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist ein Linear Beacon ein Polymer, welches zu einem Minimum aus einer Nucleobasensondiersequenz mit einem ersten und einem zweiten Ende besteht. Wenigstens eine Donoreinheit ist an eines der ersten oder zweiten Enden der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt; und wenigstens eine Akzeptoreinheit ist an das andere des ersten oder zweiten Endes der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt.
Vorzugsweise ist das Polymer eine PNA.
In einem zweiten Ausführungsbeispiel bezieht sich die Erfindung auf ein Polymer, umfassend:

a) eine Nucleobasensondiersequenz zum Sondieren einer Zielsequenz, zu welcher die Nucleobasensequenz komplementär ist;
b) wenigstens eine Energiedonoreinheit, die mit der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt ist; und
c) wenigstens eine Energieakzeptoreinheit, die mit der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt ist, worin die wenigstens eine Energiedonoreinheit von der wenigstens einen Energieakzeptoreinheit durch wenigstens einen Teil der Nucleobasensondiersequenz abgetrennt ist.

Vorzugsweise ist die Nucleobasensondiersequenz 5 bis 30 Untereinheiten lang.
In den ersten und zweiten Ausführungsbeispielen hat jede der Untereinheiten der Nucleobasensondiersequenz vorzugsweise die Formel:
worin
jedes J dasselbe oder unterschiedlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: H, R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, NR¹ ₂, F, Cl, Br und I;
jedes K dasselbe oder unterschiedlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: O, S, NH, und NR¹;
jedes R¹ dasselbe oder unterschiedlich ist und eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen ist, die optional ein Heteroatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe enthalten können;
jedes A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Einzelbindung, einer Gruppe der Formel – (CJ₂)_s – und einer Gruppe der Formel – (CJ₂)_sC(O) -, worin J wie oben definiert ist und jedes s eine ganze Zahl von eins bis fünf ist:
jedes t 1 oder 2 ist;
jedes u 1 oder 2 ist; und
jedes L dasselbe oder unterschiedlich ist und unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus J, Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uridin, 5-Methylcytosin, 2-Aminopurin, 2-Amino-6-chlorpurin, 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin, Pseudoisocytosin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymidin, andere natürlich vorkommenden Nucleobasenanaloga, andere nicht natürlich vorkommenden Nucleobasen, substituierte und unsubstituierte aromatische Einheiten, Biotin und Fluorescein.
Vorzugsweise besteht jede PNA-Untereinheit aus einer natürlich oder einer nicht natürlich vorkommenden Nucleobase, die an den Aza-Stickstoff eines N-[2-(Aminoethyl)]-glycin-Gerüstes durch eine Methylen-Carbonyl-Bindung angeheftet ist.
Vorzugsweise ist die Donoreinheit ein Fluorophor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 5(6)-Carboxyfluorescein und seinen Derivaten, 5-(2'-Aminoethyl)-aminonaphtalen-1-sulfonsäure (EDANS), Bodipy und seinen Derivaten, Rhodamin und seinen Derivaten, Cy2, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, Texasrot und seinen Derivaten.
Vorzugsweise ist die Akzeptoreinheit 4-((4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure (Dabcyl).
Vorzugsweise trennt wenigstens ein Spacermolekül eines oder beide der Donor- und Akzeptormoleküle von der Nucleobasensequenz, an welche es gekoppelt ist.
Vorzugsweise ist die Nucleobasensondiersequenz perfekt komplementär zu der Zielsequenz.
Vorzugsweise ist das Polymer auf einem Träger immobilisiert.
Vorzugsweise ist das Polymer ein Bestandteilspolymer einer Anordnung.
In einem anderen Ausführungsbeispiel bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweisen, Identifizieren oder Quantifizieren einer Zielsequenz in einer Probe. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Linear Beacon und dann das Nachweisen, Identifizieren oder Quantifizieren der Hybridisierung des Polymers mit der Zielsequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen, worin die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der Zielsequenz, die in der Probe von Interesse anwesend ist, in Beziehung gesetzt werden kann mit einer Änderung in dem nachweisbaren Signal im Zusammenhang mit wenigstens einer Donor- oder Akzeptoreinheit des Polymers. Die messbare Änderung in dem detektierbaren Signal von wenigstens einer Donor- oder Akzeptoreinheit der Sonde kann verwendet werden, um die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der Zielsequenz, die in der Probe von Interesse vorhanden ist, zu bestimmen, da die Anmelder gezeigt haben, dass die Effizienz des Energietransfers zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten durch Hybridisierung des Linear Beacons an ihre beabsichtigten Zielsequenzen unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen geändert wird. Eine genaue Quantifizierung kann durch Korrigieren mit dem Signal, das durch ein unhybridisiertes Linear Beacon erzeugt wird, erreicht werden. Folglich sind die Linear Beacons dieser Erfindung besonders gut geeignet für den Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung von Zielsequenzen in Closed-Tube-Ansätzen und besonders in asymmetrischen PCR-Ansätzen (siehe Beispiel 19 dieser Spezifizierung). Da von Linear Beacon nicht bekannt ist, dass sie von Enzymen abgebaut werden, sind die Linear Beacons auch besonders gut geeignet für den Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung von Zielsequenzen in Zellen, Geweben oder Organismen, ob lebend oder nicht (siehe Beispiel 20 dieser Spezifikation).
In einem weiteren Ausführungsbeispiel bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren für den Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz und einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:

a) in Kontakt bringen der Probe mit einem Polymer, umfassend: (i) eine Nucleobasensondiersequenz, die komplementär zu der Zielsequenz ist; (ii) wenigstens eine Energiedonoreinheit, die mit der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt ist, und (iii) wenigstens eine Energieakzeptoreinheit, die mit der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt ist und die von der wenigstens einen Energieakzeptoreinheit durch wenigstens einen Teil der Nucleobasensondiersequenz abgetrennt ist; und
b) Detektieren, Identifizieren oder Quantifizieren der Hybridisierung des Polymers mit der Zielsequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen, worin die Anwesenheit, Abwesenheit oder die Menge der Zielsequenz, die in der Probe vorhanden ist, in Beziehung gesetzt werden kann mit einer Änderung im detektierbaren Signal im Zusammenhang mit wenigstens einer Donor- oder Akzeptoreinheit des Polymers.

In jedem dieser beiden Ausführungsbeispiele kann das Verfahren verwendet werden, um eine Zielsequenz in einem Closed-Tube-(homogenen)-Test nachzuweisen. Das Verfahren kann verwendet werden, um eine Nucleinsäure, umfassend eine Zielsequenz, nachzuweisen, worin diese Nucleinsäure in einer Reaktion synthetisiert oder amplifiziert worden ist, die in dem Closed-Tube-(homogenen)-Test geschieht.
Vorzugsweise wird die Nucleinsäuresynthese- oder Nucleinsäureamplifikationsreaktion ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), Ligase-Ketten-Reaktion (LCR), Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA), Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) und Q-beta-Replikase. Wo die Nucleinsäureamplifikationsreaktion eine asymmetrische PCR-Reaktion ist.
Vorzugsweise wird die synthetisierte oder amplifizierte Zielsequenz in Echtzeit gemessen. Die Verfahren können verwendet werden, um eine Lining- oder Nicht-Lining-Zielsequenz in einer Zelle oder Gewebe nachzuweisen.
Vorzugsweise wird die Zielsequenz in der Zelle oder in dem Gewebe unter Verwendung von in situ-Hybridisierung nachgewiesen, identifiziert oder quantifiziert.
Vorzugsweise wird die Probe mit diesem Polymer und einer oder mehreren Sperrsonden in Kontakt gebracht.
Wahlweise bestimmt der Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz die Anwesenheit oder Menge eines Organismus oder Virus in der Probe.
Alternativ bestimmt der Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz die Anwesenheit oder Menge von einer oder mehreren Arten eines Organismus in der Probe.
Alternativ bestimmt der Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz die Wirkung antimikrobieller Mittel auf das Wachstum eines oder mehrerer Mikroorganismen in der Probe.
Alternativ bestimmt der Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz die Anwesenheit oder Menge einer taxonomischen Gruppe von Organismen in der Probe.
Der Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz erleichtert eine Diagnose eines Zustandes von medizinischem Interesse.
Die Zielsequenz kann auf einer Oberfläche immobilisiert sein. Alternativ kann das Polymer auf einer Oberfläche immobilisiert sein.
Das Polymer kann ein Bestandteilspolymer einer Anordnung sein.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel steht diese Erfindung in Beziehung mit Kits, die geeignet sind für das Durchführen eines Tests, welcher die Anwesenheit, Abwesenheit oder Anzahl von Zielsequenzen in einer Probe nachweist. Die Kits dieser Erfindung umfassen eines oder mehrere Linear Beacons und andere Reaktionsmittel oder Zusammensetzungen, die ausgewählt sind, um einen Test durchzuführen oder anderweitig die Erscheinung eines Tests zu simplifizieren.
Vorzugsweise haben eines oder mehrere der Polymere des Kits eine Nucleobasensondiersequenz mit einer Länge von 11 bis 17 Untereinheiten.
Vorzugsweise werden zwei oder mehr Polymere mit unabhängig voneinander nachweisbaren Einheiten markiert.
Vorzugsweise werden die unabhängig voneinander nachweisbaren Einheiten verwendet, um unabhängig wenigstens zwei unterschiedliche Zielsequenzen nachzuweisen, zu identifizieren oder zu quantifizieren, die in derselben Probe vorhanden sein könnten.
Vorzugsweise wird der Kit in einem in situ-Hybridisierungstest verwendet.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel ist diese Erfindung auch auf eine Anordnung gerichtet, die zwei oder mehrere trägergebundene Linear Beacons umfasst, die geeignet sind für den Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz von Interesse. Anordnungen von Linear Beacons sind bequem, da sie ein Mittel bereitstellen, um schnell zahlreiche Proben unter Verwendung eines sekundären Nachweissystems auf die Anwesenheit einer oder mehrerer Zielsequenzen von Interesse in Echtzeit abzufragen.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel bezieht sich die Erfindung auf eine Anordnung, umfassend zwei oder mehrere trägergebundene Polymere, worin wenigstens ein Polymer der Anordnung Folgendes umfasst:

a) eine Nucleobasensondiersequenz, um eine Zielsequenz zu sondieren, zu welcher die Nucleobasensondiersequenz komplementär ist;
b) wenigstens eine Energiedonoreinheit, die an die Nucleobasensondiersequenz gekoppelt ist; und
c) wenigstens eine Energieakzeptoreinheit, die an die Nucleobasensondiersequenz gekoppelt ist, worin die wenigstens eine Donoreinheit von der wenigstens einen Akzeptoreinheit und wenigstens einem Teil der Nucleobasensondiersequenz abgetrennt ist; und

In jedem der beiden vorangegangenen Ausführungsbeispiele ist die wenigstens eine Energiedonoreinheit des wenigstens einen Polymers vorzugsweise mit einem ersten oder einem zweiten Ende der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt und die wenigstens eine Energieakzeptoreinheit des wenigstens einen Polymers ist vorzugsweise mit dem anderen des ersten oder zweiten Endes der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt.
Vorzugsweise ist die Anordnung für die Regenerierung durch die Behandlung mit einem oder mehreren Regenerationskatalysatoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hitze, Nucleaseenzym und chemischen Denaturierungsmitteln, geeignet.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung eines wie oben beschriebenen Kits, um Organismen in Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Toilettenartikeln, Molkereiprodukten oder Umweltproben nachzuweisen, sie bezieht sich auch auf die Verwendung eines Kits, um Rohrmaterialien, Produkte oder Prozesse zu testen, sie bezieht sich auch auf die Verwendung eines Kits, um klinische Proben wie klinische Muster oder Ausrüstung, Fixierungen und Produkte, um Menschen oder Tiere zu behandeln, zu untersuchen, sie bezieht sich auch auf die Verwendung eines Kits, um eine Zielsequenz nachzuweisen, die für eine genetisch begründete Krankheit spezifisch ist oder die spezifisch ist für eine Veranlagung für eine Erkrankung mit genetischer Grundlage, und sie bezieht sich auch auf die Verwendung eines Kits, um eine Zielsequenz in einer forensischen Technik wie Pränataluntersuchung, Vaterschaftsuntersuchung, Identitätsbestätigung oder kriminalistische Untersuchung nachzuweisen.
Der Kit kann verwendet werden, um eine Zielsequenz im Zusammenhang mit einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus β-Thalassämie, Sichelzellenanämie, Faktor-V-Leiden, zystische Fibrose, und um mit Krebs im Zusammenhang stehende Ziele wie p53, p10, BRC-1 und BRC-2 nachzuweisen.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung eines wie oben beschriebenen Kits. Die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung sind besonders nützlich für den Nachweis von Zielsequenzen von Organismen, die in Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Toilettenartikeln, Molkereiprodukten oder Umweltproben gefunden werden können. Die Analyse bevorzugter Getränke schließt Soda, Wasser in Flaschen, Fruchtsaft, Bier, Wein oder Likörprodukte ein. Zusätzlich werden die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen besonders für die Analyse von Rohmaterialien, Ausrüstung, Produkten oder Vorgängen nützlich sein, die verwendet werden, um Nahrungsmittel, Getränke, Wasser, pharmazeu tische Produkte, Toilettenartikel, Molkereiprodukte oder Umweltproben herzustellen oder zu lagern.
Ob trägergebunden oder in Lösung, die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung werden besonders nützlich sein für die schnelle, empfindliche, zuverlässige und vielseitige Detektion von Zielsequenzen, die eigentümlich sind für Organismen, die in klinischen Umgebungen gefunden werden können. Folglich werden die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung besonders nützlich für die Analyse klinischer Muster oder von Ausrüstung, Einrichtungsgegenständen oder Produkten sein, die verwendet werden, um Menschen oder Tiere zu behandeln. Zum Beispiel kann dieser Test verwendet werden, um eine Zielsequenz nachzuweisen, die spezifisch für eine genetisch begründete Erkrankung ist oder die spezifisch für eine Veranlagung für eine genetisch begründete Erkrankung ist. Nicht begrenzende Beispiele von Erkrankungen schließen β-Thalassämie, Sichelzellenanämie, Faktor-V-Leiden, zystische Fibrose und mit Krebs in Beziehung stehende Ziele wie p53, p10, BRC-1 und BRC-2 ein.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel kann die Zielsequenz mit chromosomaler DNA in Beziehung stehen, worin der Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz in Bezug auf forensische Techniken, wie Pränatalscreening, Vaterschaftsuntersuchung, Identitätsbestätigung oder kriminalistische Untersuchung, verwendet werden kann.
2. Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele:
1. Definitionen:

a. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Nucleobase" jene natürlich vorkommenden und jene nicht natürlich vorkommenden heterocyclischen Einheiten einschließen, die gewöhnlich jenen bekannt sind, die Nucleinsäuretechnologie nutzen oder die die Peptid-Nucleinsäuretechnologie nutzen, um dabei Polymere zu erzeugen, die sequenzspezifisch an Nucleinsäuren binden.
b. Wie hierin verwendet, ist der Begriff "Nucleobasensequenz" irgendein Segment eines Polymers, das Nucleobasen enthaltende Untereinheiten umfasst. Nicht begrenzende Beispiele geeigneter Polymere oder Polymersegmente schließen Oligonucleotide, Oligoribonucleotide, Peptid-Nucleinsäuren und Analoga oder Chimären davon ein.
c. Wie hierin verwendet, ist der Begriff "Zielsequenz" irgendeine Sequenz von Nucleobasen in einem Polymer, welches nachgewiesen werden soll. Die "Zielsequenz" kann das gesamte Polymer umfassen oder kann eine Untersequenz der Nucleobasensequenz sein, die für das Polymer von Interesse einzigartig ist. Ohne Begrenzung kann das Polymer, das die "Zielsequenz" umfasst, eine Nucleinsäure, eine Peptid-Nucleinsäure, eine Chimäre, ein gekoppeltes Polymer, ein Konjugat oder irgendein anderes Polymer, umfassend Substituenten (z. B. Nucleobasen), an welche die Linear Beacons dieser Erfindung in einer sequenzspezifischen Weise binden können, sein.
d. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Peptid-Nucleinsäure" oder "PNA" als ein Oligomer, gekoppeltes Polymer oder chimäres Oligomer definiert sein, umfassend zwei oder mehrere PNA-Untereinheiten (-Reste), einschließlich irgendeiner der Verbindungen, auf die Bezug genommen wird als oder die beansprucht werden als Peptid-Nucleinsäuren in den US-Patenten Nrn. 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,736,336, 5,773,571 oder 5,786,571. Der Begriff "Peptid-Nucleinsäure" oder "PNA" soll auch auf jene Nucleinsäuremimetika angewandt werden, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben werden: Diderichsen et al., Tett. Lett., 37: 475-478 (1996); Fujii et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 7: 637-627 (1997); Jordan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 7: 687-690 (1997); Krotz et al., Tett. Lett., 36: 6941-6944 (1995); Lagriffoul et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 4: 1081-1082 (1994); Lowe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, (1997) 1: 539-546; Lowe et al., J. Chem. Soc: Perkin Trans., 1, 1: 547-554 (1997); Lowe, et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1: 555-560 (1997); und Petersen et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 6: 793-796 (1996).

In bevorzugten Ausführungsbeispielen ist eine PNA ein Polymer, umfassend zwei oder mehr PNA-Untereinheiten der Formel:
worin jedes J dasselbe oder unterschiedlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, NR¹ ₂, F, Cl, Br und I. Jedes K ist dasselbe oder unterschiedlich und ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus O, S, NH and NR¹. Jedes R¹ ist dasselbe oder unterschiedlich und ist eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, die wahlweise ein Heteroatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe enthalten kann. Jedes A ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Einzelbindung, einer Gruppe der Formel -(CJ₂)_s und einer Gruppe der Formel -(CJ₂)_sC(O)-, worin J wie oben definiert ist und jedes s eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist. Die ganze Zahl t ist 1 oder 2 und die ganze Zahl u ist 1 oder 2. Jedes L ist dasselbe oder unterschiedlich und ist unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus J, Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uridin, 5-Methylcytosin, 2-Aminopurin, 2-Amino-6-chlorpurin, 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin, Pseudoisocytosin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymidin, andere natürlich vorkommende Nucleobasenanaloga, andere nicht natürlich vorkommende Nucleobasen, substituierte und unsubstituierte aromatische Einheiten, Biotin und Fluorescein. In dem bevorzugtesten Ausführungsbeispiel besteht eine PNA-Untereinheit aus einer natürlich vorkommenden oder nicht natürlich vorkommenden Nucleobase, die an den Aza-Stickstoff des N-[2-(Aminoethyl)]glycin-Gerüstes durch eine Methylen-Carbonyl-Verknüpfung angehängt ist.
II. Detaillierte Beschreibung
A. Allgemeines:
PNA-Synthese:
Verfahren für den chemischen Zusammenbau von PNAs sind wohl bekannt (siehe US-Patente Nrn. 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,736,336, 5,773,571 oder 5,786,571). Chemikalien und Ausrüstung für den trägergebundenen automatischen chemischen Zusammenbau von Peptid-Nucleinsäuren sind nun im Handel erhältlich. Der chemische Zusammenbau einer PNA ist analog zu der Festphasenpeptidsynthese, worin bei jedem Zyklus des Zusammenbaus das Oligomer einen reaktionsfähigen Alkylaminoterminus besitzt, der mit dem nächsten an das wachsende Polymer anzuhängenden Synthon kondensiert wird. Da Standardpeptidchemie verwendet wird, werden natürliche und nicht natürliche Aminosäuren routinemäßig in ein PNA-Oligomer eingebaut. Da ein PNA ein Polyamid ist, hat es einen C-Terminus (Carboxylende) und einen N-Termins (Aminoende). Für die Zwecke des Designs einer Hybridisierungssonde, die geeignet ist für das antiparallele Binden an die Zielsequenz (die bevorzugte Orientierung), ist der N-Terminus der Nucleobasensondiersequenz der PNA-Sonde das Äquivalent des 5'-Hydroxylendes eines äquivalenten DNA- oder RNA-Oligonucleotids.
Markierungen:
Die an die Linear Beacons dieser Erfindung angehängten Markierungen umfassen einen Satz (nachfolgend "Beacon-Satz(Sätze)") aus Energietransfereinheiten, umfassend wenigstens eine Energiedonor- und wenigstens eine Energieakzeptoreinheit. Typischerweise wird der Beacon-Satz eine einzelne Donoreinheit und eine einzelne Akzeptoreinheit umfassen. Nichtsdestotrotz kann ein Beacon-Satz mehr als eine Donoreinheit und/oder mehr als eine Akzeptoreinheit enthalten. Die Donor- und Akzeptoreinheiten sind in der Art tätig, dass eine oder mehrere Akzeptoreinheiten Energie aufnehmen, die von einer oder mehreren Donoreinheiten übergegangen sind, oder sie löschen anderweitig Signal von der Donoreinheit oder den -einheiten.
Vorzugsweise ist die Donoreinheit ein Fluorophor. Bevorzugte Fluorophore sind Derivate von Fluorescein, Derivate von Bodipy, 5-(2'-Aminoethyl)-aminonaphthalen-1-sulfonsäure (EDANS), Derivate von Rhodamin, Cy2, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, Texasrot und deren Derivate. Obwohl die kürzlich aufgelisteten Fluorophore auch als Akzeptoren tätig sein können, ist die Akzeptoreinheit vorzugsweise eine Löschereinheit. Vorzugsweise ist die Löschereinheit eine nicht-fluoreszierende aromatische oder heteroaromatische Einheit. Die bevorzugte Löschereinheit ist 4-((4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure (Dabcyl).
Der Energietransfer kann durch Kollision der eng benachbarten Einheiten eines Beacon-Satzes oder durch einen nicht strahlenden Vorgang wie Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) geschehen. Damit FRET geschehen kann, erfordert der Übergang von Energie zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten eines Beacon-Satzes, dass die Einheiten eng benachbart im Raum sind und dass das Emissionsspektrum von einem Donor(en) eine wesentliche Überlappung mit dem Absorptionsspektrum von dem (den) Akzeptor(en) hat (siehe Yaron et al. Analytical Biochemistry, 95: 228-235 (1979), und besonders S. 232, Sp. 1, bis S. 234, Sp. 1). Alternativ kann ein kollisionsvermittelter (strahlungsloser) Energietransfer zwischen eng miteinander im Zusammenhang stehenden Donor- und Akzeptoreinheiten geschehen, ob oder ob das Emissionsspektrum von einer Donoreinheit(en) eine wesentliche Überlappung mit dem Absorptionsspektrum von der (den) Akzeptoreinheit(en) hat oder nicht (siehe Yaron et al., Analytical Biochemistry, 95: 228-235 (1979), und besonders S. 229, Sp. 1, bis S. 232, Sp. 1). Auf diesen Vorgang wird Bezug genommen als intermolekulare Kollision, da angenommen wird, dass Löschen durch den direkten Kontakt der Donor- und Akzeptoreinheiten verursacht wird. (siehe Yaron et al.). Wie die Anmelder gezeigt haben, brauchen die Donor- und Akzeptoreinheiten, die an die Linear Beacons dieser Erfindung angeheftet werden, keine spektrale Überlappung zwischen der Emission der Donoreinheiten und der Extinktion der Akzeptoreinheiten. Ohne zu beabsichtigen, an diese Hypothese gebunden zu sein, legen diese Daten nahe, dass die Kollision oder der Kontakt als der primäre Modus des Löschens in Linear Beacons wirkt.
Detektion des Energietransfers:
Da die Effizienz von sowohl kollisionsvermitteltem als auch nicht strahlendem Transfer von Energie zwischen den Donor- und Akzeptoreinheiten eines Beacon-Satzes direkt abhängig ist von der Nähe der Donor- und Akzeptoreinheiten, kann der Nachweis der Hybridbildung eines Linear Beacon mit einer Zielsequenz durch Messen von wenigstens einer physikalischen Eigenschaft von wenigstens einem Glied des Beacon-Satzes überprüft werden, die nachweislich unterschiedlich ist, wenn der Hybridisierungskomplex gebildet wird im Vergleich zu dem Zustand, wenn das Linear Beacon in der Abwesenheit von Zielsequenz existiert. Wir nehmen auf dieses Phänomen Bezug als die selbstanzeigende Eigenschaft der Linear Beacons. Diese Änderung im detektierbaren Signal sollte aus der Änderung in der Effizienz des Energietransfers zwischen dem Donor und dem Akzeptor resultieren, der aus der Hybridisierung des Linear Beacon resultiert. Vorzugsweise werden die Nachweismittel das Messen der Fluoreszenz eines Donor- oder Akzeptorfluorophors eines Beacon-Satzes einschließen. Am bevorzugtesten wird der Beacon-Satz wenigstens ein Donorfluorophor und wenigstens einen Akzeptorlöscher umfassen, so dass die Fluoreszenz des Donorfluorophors verwendet werden wird, um die Hybridisierung zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
PNA-Markierung:
Das chemische Markieren einer PNA ist analog zur Peptidmarkierung. Da die Synthesechemie des Zusammenbaus im Wesentlichen dieselbe ist, kann irgendein Verfahren, das gewöhnlich verwendet wird, um ein Peptid zu markieren, verwendet werden, um eine PNA zu markieren. Typischerweise wird der N-Terminus des Polymers durch eine Reaktion mit einer Einheit markiert, die eine Carboxylsäuregruppe oder aktivierte Carboxylsäuregruppe hat. Eine oder mehrere Spacereinheiten können wahlweise zwischen die Markierungseinheit und die Nucleobasensondiersequenz des Oligomers eingefüllt werden. Im Allgemeinen wird die Spacereinheit eingebaut, bevor die Markierungsreaktion durchgeführt wird. Der Spacer kann jedoch in die Markierung eingebettet werden und dabei während der Markierungsreaktion eingebaut werden.
Typischerweise wird das C-terminale Ende der Nucleobasensondiersequenz markiert, indem zuerst eine markierte Einheit mit dem Träger, auf dem die PNA zusammengebaut werden soll, kondensiert wird. Als Nächstes kann das erste Synthon der Nucleobasensondiersequenz mit der markierten Einheit kondensiert werden. Alternativ können eine oder mehrere Spacereinheiten zwischen der markierten Einheit und dem Oligomer eingeführt werden (z. B. 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure). Wenn einmal das Linear Beacon vollständig zusammengebaut und markiert ist, wird es von dem Untergrund abgespalten, deprotektioniert und unter Verwendung von Standardverfahren aufgereinigt.
Die markierte Einheit könnte ein Lysinderivat sein, worin die ε-Aminogruppe mit einer Donor- oder Akzeptoreinheit modifiziert ist. Zum Beispiel könnte die Markierung ein Fluorophor wie 5(6)-Carboxyfluorescein oder eine Löschereinheit wie 4-((4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure (Dabcyl) sein. Die Kondensation des Lysinderivates mit dem Syntheseuntergrund würde unter Verwendung von Standardkondensations- (Peptid-)Chemie vollbracht werden. Die α-Aminogruppe des Lysinderivates würde dann deprotektioniert werden und der Zusammenbau der Nucleobasensondiersequenz würde durch Kondensation des ersten PNA-Synthons mit der α-Aminogruppe der Aminosäure Lysin gestartet werden. Wie oben diskutiert, könnte eine Spacereinheit wahlweise zwischen der Aminosäure Lysin und dem ersten PNA-Synthon durch Kondensieren eines geeigneten Spacers (z. B. Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctansäure) mit der Aminosäure Lysin vor der Kondensation des ersten PNA-Synthons der Nucleobasensondiersequenz eingefügt werden.
Alternativ wird eine funktionelle Gruppe des zusammengebauten oder teilweise zusammengebauten Polymers mit einer Donor- oder Akzeptoreinheit markiert, während es noch trägergebunden ist. Dieses Verfahren macht es notwendig, dass eine geeignete Schutzgruppe in das Oligomer eingebaut werden kann, um dabei eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe zu ergeben, an welche die Donor- oder Akzeptoreinheit gekoppelt ist, es hat jedoch den Vorteil, dass die Markierung (z. B. Dabcyl oder ein Fluorophor) an irgendeine Position in dem Polymer, einschließlich in der Nucleobasensondiersequenz angehängt werden kann. Zum Beispiel könnte die ε-Aminogruppe eines Lysins mit einer 4-Methyltriphenylmethyl-(Mtt-), einer 4-Methoxytriphenylmethyl-(MMT-) oder einer 4,4'- Dimethoxytriphenyhnethyl-(DMT-)Schutzgruppe geschützt werden. Die Mtt-, MMT- oder DMT-Gruppen können aus PNA (zusammengebaut unter Verwendung von im Handel erhältlichen Fmoc-PNA-Monomeren und einem Polystyrolträger mit einem PAL-Linker; PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA) durch Behandlung des Harzes unter schwach sauren Bedingungen entfernt werden. Folglich kann dann die Donor- oder Akzeptoreinheit mit der ε-Aminogruppe der Aminosäure Lysin kondensiert werden. Nach vollständigem Zusammenbau und Markierung wird das Polymer dann von dem Träger abgespalten, deprotektioniert und gereinigt unter Verwendung von wohlbekannten Verfahren.
Durch noch ein anderes Verfahren wird die Donor- oder Akzeptoreinheit an das Polymer, nachdem es vollständig zusammengebaut ist, angehängt und von dem Träger abgespalten. Dieses Verfahren wird bevorzugt, wo die Markierung mit den Spaltungs-, Deprotektionierungs- oder Aufreinigungsregimes, die gewöhnlich verwendet werden, um das Oligomer herzustellen, inkompatibel ist. Durch dieses Verfahren wird die PNA allgemein in Lösung durch die Reaktion einer funktionellen Gruppe auf dem Polymer mit einer funktionellen Gruppe auf der Markierung markiert werden. Durchschnittsfachleute werden erkennen, dass die Zusammensetzung der Kopplungslösung von der Art des Oligomers und der Donor- oder Akzeptoreinheit abhängen wird. Die Lösung kann organisches Lösungsmittel, Wasser oder irgendeine Kombination davon umfassen. Allgemein wird das organische Lösungsmittel ein polares, nicht nucleophiles Lösungsmittel sein. Nicht begrenzende Beispiele geeigneter organischer Lösungsmittel schließen Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylsulfoxid und N,N'-Dimethylformamid ein.
Allgemein wird die funktionelle Gruppe auf dem zu markierenden Polymer ein Amin sein und die funktionelle Gruppe auf der Markierung wird eine Carboxylsäure oder eine aktivierte Carboxylsäure sein. Nicht begrenzende Beispiele an funktionellen Gruppen in der Form von aktivierten Carboxylsäuren schließen N-Hydroxysuccinimidylester ein. In wässriger Lösung kann die Carboxylsäuregruppe von entweder der PNA oder der Markierung (in Abhängigkeit von der Art der gewählten Bestandteile) mit einem wasserlöslichen Carbodiimid aktiviert werden. Das Reaktionsmittel 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) ist ein im Handel erhältliches Reaktionsmittel, das spezifisch für wässrige, amidbildende Kondensationsreaktionen verkauft wird.
Allgemein wird der pH-Wert der wässrigen Lösungen mit einem Puffer während der Kondensationsreaktion moduliert werden. Vorzugsweise liegt der pH-Wert während der Kondensation im Bereich von 4-10. Wenn ein Arylamin mit der Carboxylsäure kondensiert wird, liegt der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 4-7. Wenn ein Alkylamin mit einer Carboxylsäure kondensiert wird, liegt der pH-Wert vorzugsweise in dem Bereich von 7-10. Allgemein wird die Basizität nichtwässriger Reaktionen durch die Zugabe nicht nucleophiler organischer Basen moduliert werden. Nicht begrenzende Beispiele geeigneter Basen schließen N-Methylmorpholin, Triethylamin und N,N-Diisopropylethylamin ein. Alternativ wird der pH-Wert unter Verwendung von biologischen Puffern wie (N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure) (HEPES) oder 4-Morpholineethansulfonsäure (MES) oder anorganischen Puffern wie Natriumbicarbonat moduliert.
Spacer-/Linkereinheiten:
Allgemein werden Spacer verwendet, um die nachteiligen Wirkungen, die sperrige Markierungsreaktionsmittel auf Hybridisierungseigenschaften von Linear Beacons haben könnten, zu minimieren. Linker induzieren typischerweise Flexibilität und Zufälligkeit in das Linear Beacon oder verknüpfen anderweitig zwei oder mehrere Nucleobasensondiersequenzen einer Sonde. Bevorzugte Spacer-/Linkereinheiten für Sonden dieser Erfindung bestehen aus einer oder mehreren Aminoalkylcarboxylsäuren (z. B. Aminocapronsäure), der Seitenkette einer Aminosäure (z. B. der Seitenkette von Lysin oder Ornithin), natürlichen Aminosäuren (z. B. Glycin), Aminooxyalkylsäuren (z. B. 8-Amino-3,6-Dioxaoctansäure), zweibasigen Alkylsäuren (z. B. BeRNAteinsäure) oder zweibasigen Alkyloxysäuren (z. B. Diglycolsäure). Die Spacer-/Linkereinheiten können auch gestaltet werden, um die Löslichkeit des Linear Beacons zu erhöhen.
Vorzugsweise umfasst eine Spacer-/Linkereinheit eine oder mehrere gekoppelte Verbindungen mit der Formel: -Y-(O_m-(CW₂)_n)_p-Z-. Die Gruppe Y hat die Formel: eine Einzel bindung, -(CW₂)_p-, -C(O)(CW₂)p-, -C(S)(CW₂)_p- und -S(O₂)(CW₂)_p-. Die Gruppe Z hat die Formel NH, NR², S oder O. Jedes W ist unabhängig voneinander H, R², -OR², F, Cl, Br oder I, worin jedes R² unabhängig ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: -CX₃, -CX₂CX₃, -CX₂CX₂CX₃, -CX₂CX(CX₃)₂ und -C(CX₃)₃. Jedes X ist unabhängig voneinander H, F, Cl, Br oder I. Jedes m ist unabhängig 0 oder 1. Jedes n, o und p sind unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 10.
Chimäres Oliogmer:
Ein chimäres Oligomer umfasst zwei oder mehr gekoppelte Untereinheiten, die ausgewählt sind aus unterschiedlichen Klassen an Untereinheiten. Zum Beispiel würde eine PNA/DNA-Chimäre wenigstens zwei PNA Untereinheiten, die an wenigstens eine 2'-Desoxyribonucleinsäure-Untereinheit gekoppelt sind, umfassen (für Verfahren und Zusammensetzungen, bezogen auf die PNA/DNA-Chimärenzubereitung, siehe WO96/40709). Die Bestandteilsuntereinheiten der chimären Oligomere sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus PNA-Untereinheiten, DNA-Untereinheiten, RNA-Untereinheiten und Analoga davon.
Gekoppeltes Polymer:
Ein gekoppeltes Polymer umfasst zwei oder mehr Nucleobasensequenzen, die durch einen Linker gekoppelt sind. Die Nucleobasensequenzen, die gekoppelt sind, um das gekoppelte Polymer zu bilden, werden ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Oligodesoxynucleotid, einem Oligoribonucleotid, einer Peptid-Nucleinsäure und einem chimären Oligomer. Die PNA-Sonden dieser Erfindung schließen gekoppelte Polymere ein, worin die Nucleobasensondiersequenz an eines oder mehrere zusätzliche Oligodesoxynucleotide, Oligoribonucleotide, Peptid-Nucleinsäuren oder chimäre Oligomere gekoppelt sind.
Hybridisierungsbedingungen/Stringenz:
Die Durchschnittsfachleute der Nucleinsäurehybridisierung werden erkennen, dass Faktoren, die gewöhnlich verwendet werden, um die Stringenz der Hybridisierung zu schaffen oder zu kontrollieren, die Formamidkonzentration (oder die eines anderen chemischen Denaturierungsreaktionsmittels), Salzkonzentration (das heißt Ionenstärke), Hybridisierungstemperatur, die Konzentration des Detergens, pH-Wert und die Anwesenheit oder Abwesenheit chaotroper Ionen einschließen. Eine optimale Stringenz für eine Nucleobasensondiersequenz/Zielsequenz-Kombination wird oftmals gefunden durch die wohl bekannte Technik der Festlegung etlicher der zuvor genannten Stringenzfaktoren und des anschließenden Bestimmens der Wirkung des Variierens eines einzelnen Stringenzfaktors. Dieselben Stringenzfaktoren können moduliert werden, um dabei die Stringenz der Hybridisierung von Linear Beacons mit Zielsequenzen zu kontrollieren, mit der Ausnahme, dass die Hybridisierung einer PNA ziemlich unabhängig von der Ionenstärke ist. Die optimale Stringenz für einen Test kann experimentell bestimmt werden durch Untersuchung jedes Stringenzfaktors bis der gewünschte Grad der Diskriminierung erreicht wird.
Nucleobasensondiersequenz:
Die Nucleobasensondiersequenz eines Linear Beacons ist der Sequenzerkennungsteil des Konstruktes. Folglich wird die Nucleobasensondiersequenz gestaltet, um mit wenigstens einem Teil der Zielsequenz zu hybridisieren. Vorzugsweise hybridisiert die Nucleobasensondiersequenz mit der gesamten Zielsequenz. Die Nucleobasensondiersequenz ist ein Nicht-Polynucleotid und vorzugsweise ist die Nucleobasensondiersequenz ausschließlich aus PNA-Untereinheiten zusammengesetzt. Die Untereinheitenlänge der Nucleobasensondiersequenz wird folglich im Allgemeinen so gewählt werden, dass ein stabiler Komplex zwischen dem Linear Beacon und der Zielsequenz, die detektiert werden soll, unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen gebildet wird. Die Nucleobasensondiersequenz eines PNA-Oligomers, geeignet für die Praxis dieser Erfindung, wird im Allgemeinen eine Länge von zwischen 5 und 30 PNA-Untereinheiten haben. Vorzugsweise wird die Nucleobasensondiersequenz 8 bis 18 Untereinheiten lang sein. Am bevorzugtesten wird die Nucleobasensondiersequenz 11-17 Untereinheiten lang sein.
Die Nucleobasensondiersequenz von Linear Beacons wird allgemein eine Nucleobasensondiersequenz haben, die komplementär zu der Zielsequenz ist. Alternativ könnte eine im Wesentlichen komplementäre Sondensequenz verwendet werden, da gezeigt worden war, dass eine größere Sequenzunterscheidung erhalten werden kann, wenn Sonden verwendet werden, worin eine einzelne Punktmutation (Basenfehlpaarung) zwischen der Nucleobasensondiersequenz und der Zielsequenz existiert (siehe Guo et al., Nature Biotechnology, 15: 331-335 (1997), Guo et al., WO97/46711, und Guo et al., US 5,780,233 ).
Sperrsonden:
Sperrsonden sind PNA- oder Nucleinsäuresonden, die verwendet werden können, um die Bindung der Nucleobasensondiersequenz einer Sonde an eine Hybridisierungsstelle, die nicht in Beziehung steht mit oder die in enger Beziehung steht mit der Zielsequenz, zu unterdrücken (siehe Coull et al., PCT/US97/21845, auch bekannt als WO98/24933). Allgemein unterdrücken die Sperrsonden das Binden der Nucleobasensondiersequenz an eng benachbarte Nicht-Zielsequenzen, da die Sperrsonde mit der Nicht-Zielsequenz hybridisiert, um einen thermodynamisch stabileren Komplex zu bilden, als er durch die Hybridisierung zwischen der Nucleobasensondiersequenz und der Nicht-Zielsequenz gebildet wird. Folglich sind Sperrsonden typischerweise unmarkierte Sonden, die in einem Test verwendet werden, um dadurch ein unspezifisches Signal zu unterdrücken. Da sie gewöhnlich gestaltet werden, um mit eng benachbarten Nicht-Zielsequenzen zu hybridisieren, wird typischerweise ein Satz aus zwei oder mehr Sperrsonden in einem Test verwendet werden, um dadurch ein unspezifisches Signals aus Nicht-Zielsequenzen zu unterdrücken, welche anwesend sein könnten und mit dem Erscheinungsteil des Tests in Wechselwirkung treten könnten.
B. Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung:
Linear-Beacon-Sonden:
Es werden Linear Beacons offenbart, die geeignet sind, um den Energietransfer zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten zu erleichtern, wenn die Sonde mit seiner Zielsequenz nicht hybridisiert hat. Die Hybridisierung der Sonde an seine Zielsequenz wird jedoch die Effizienz des Energietransfers zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten ändern und dabei in einer messbaren Änderung im Signal in Verbindung mit wenigstens einem Glied des Beacon-Satzes resultieren.
Allgemein ist ein Linear Beacon ein Polymer, das zu einem Minimum wenigstens eine gekoppelte Donoreinheit und wenigstens eine gekoppelte Akzeptoreinheit umfasst, worin diese Donor- und Akzeptoreinheiten durch wenigstens einen Teil einer Nucleobasensondiersequenz getrennt werden, worin die Nucleobasensondiersequenz geeignet ist für die Hybridisierung an eine komplementäre oder im Wesentlichen komplementäre Zielsequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen. Durch ihre Gestaltung bildet ein Linear Beacon nicht einen Haarnadelstamm. Vorzugsweise werden die Donor- und Akzeptoreinheiten an gegenüber liegenden Enden der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt. Das Linear Beacon ist weiter dadurch gekennzeichnet, dass die Effizienz des Transfers der Energie zwischen diesen Donor- und Akzeptoreinheiten, wenn das Polymer in wässriger Lösung solvatisiert wird, im Wesentlichen unabhängig von wenigstens zwei variablen Faktoren ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus der Länge der Untereinheiten, die die Donor- und Akzeptoreinheiten voneinander trennen, der spektralen Überlappung der Donoreinheit und der Akzeptoreinheit, der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium in der wässrigen Lösung und der Ionenstärke der wässrigen Lösung. Vorzugsweise ist das Linear Beacon weiter dadurch gekennzeichnet, dass die Effizienz des Energietransfers zwischen diesen Donor- und Akzeptoreinheiten im Wesentlichen unabhängig ist von wenigstens drei variablen Faktoren und am bevorzugtesten im Wesentlichen unabhängig ist von allen vier variablen Faktoren.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Linear Beacon ein Polymer, das zu einem Minimum aus einer Nucleobasensondiersequenz mit einem ersten und zweiten Ende besteht. Die Nucleobasensondiersequenz ist komplementär oder im Wesentlichen komplementär mit einer Zielsequenz von Interesse. Wenigstens eine Donoreinheit ist an das erste oder zweite Ende der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt; und wenigstens eine Akzeptoreinheit ist an das andere Ende des ersten oder zweiten Endes der Nucleobasensondiersequenz gekoppelt. Eine oder mehrere Spacer- oder Linkereinheiten können verwendet werden, um die Donor- und Akzeptoreinheiten mit den jeweiligen Enden der Nucleobasensondiersequenz zu verknüpfen. In einem bevorzugtesten Ausführungsbeispiel ist das Linear Beacon ein PNA-Oligomer.
Linear Beacons können nur eine Nucleobasensondiersequenz umfassen (wie kürzlich hierin beschrieben) und verknüpfte Donor- und Akzeptoreinheiten eines Beacon-Satzes oder können wahlweise zusätzliche verknüpfte Einheiten umfassen. Nicht begrenzende Beispiele zusätzlicher verknüpfter Einheiten schließen andere Markierungen, Linker, Spacer, natürliche und nicht natürliche Aminosäuren, Peptide, Proteine, Nucleinsäuren, Enzyme und/oder eine oder mehrere andere Untereinheiten von PNA, DNA oder RNA ein. Zusätzliche Einheiten können funktionell oder nicht funktionell in einem Test sein. Allgemein werden zusätzliche Einheiten jedoch ausgewählt, um in dem Design des Testes, in welchem die Linear Beacons verwendet werden sollen, funktionell zu sein. Die Linear Beacons dieser Erfindung können wahlweise auf einer Oberfläche immobilisiert werden.
Als ein nicht begrenzendes Beispiel kann ein Linear Beacon dieser Erfindung eine Nucleinsäure umfassen, die mit einer Nucleobasensondiersequenz verknüpft ist, worin die Nucleinsäure mit einer zweiten Zielsequenz hybridisieren könnte. Als ein zweites nicht begrenzendes Beispiel kann ein Linear Beacon ein Enzym umfassen, das mit einer Nucleobasensondiersequenz verknüpft ist, worin das Enzym in einem sekundären Detektionsschema verwendet werden könnte. Ein drittes nicht begrenzendes Beispiel eines Linear Beacons könnte einen Antikörper umfassen, der mit der Nucleobasensondiersequenz verknüpft ist, worin der Antikörper in einem sekundären Detektionsnachweis verwendet werden könnte. Als noch ein viertes nicht begrenzendes Beispiel könnte ein Linear Beacon ein oder mehrere Spacereinheiten umfassen, die mit einer Nucleobasensondiersequenz verknüpft sind, worin die eine oder mehrere Spacereinheiten verwendet werden, um die Linear Beacons an einem Untergrund festzumachen.
Einzigartige Eigenschaften von Linear Beacons:
Es gibt viele Unterschiede zwischen Nucleinsäurekonstrukten des Standes der Technik und den Linear Beacons dieser Erfindung. Zum Beispiel umfassen Nucleinsäurekonstrukte ein Polynucleotidgerüst, wohingegen die Linear Beacons dieser Erfindung Nucleobasenson diersequenzen umfassen, welche anders sind als Polynucleotid. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel üben Linear Beacons, zusammengesetzt aus PNA, alle günstigen Eigenschaften von PNA aus, wie Resistenz gegen Nucleaseabbau, die salzunabhängige Sequenzhybridisierung an komplementäre Nucleinsäuren und extrem schnelle Hybridisierungskinetiken.
Zusätzlich ist der Energietransfer zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten in einem Linear Beacon im Wesentlichen unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium, der Ionenstärke der Sondenumgebung und der Nucleobasensondiersequenz der Sonde (siehe Beispiele 17, 18 und 21 dieser Spezifikation). Noch überraschender ist, dass die Effizienz des Energietransfers zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten eines Beacon-Satzes im Wesentlichen unabhängig von der Länge von Untereinheiten, die Donor- und Akzeptoreinheiten voneinander trennen, ist, wohingegen der Energietransfer zwischen Einheiten in Nucleinsäuren, die dieselbe Nucleobasensondiersequenz und Markierungskonfiguration haben, eine wesentliche Abhängigkeit von der Sondenlänge ausübt (siehe Beispiele 17 und 18 dieser Spezifikation).
Am überraschendsten ist jedoch, dass Linear Beacons arbeiten, ob oder ob die Donor- und Akzeptoreinheiten nicht eine wesentliche Überlappung des Emissionsspektrums der Donoreinheit und des Extinktionsspektrums der Akzeptoreinheit ausüben (siehe Beispiele 17, 18 und 21 dieser Spezifikation). Ohne an diese Hypothese gebunden sein zu wollen, legen diese Daten nahe, dass Kollision oder Kontakt als der primäre Modus des Energietransfers in Linear Beacons wirkt im Vergleich zu Nucleinsäuren, worin FRET als die primäre Quelle für den Energietransfer zwischen Donor- und Akzeptoreinheiten beschrieben wurde.
Zusätzliche Vorteile von Linear Beacons schließen die Leichtigkeit der Synthese im Vergleich mit Konstrukten, die zusätzliche Untereinheiten umfassen, um Armsegmente zu bilden, ein. Zusätzlich zeigen die von den Anmeldern zusammengetragenen Daten, dass Linear Beacons schneller als Konstrukte hybridisieren, welche zusätzliche Untereinheiten umfassen, um Armsegmente zu bilden (siehe Beispiele 15 und 16 dieser Spezifikation).
Sondensätze:
In einem anderen Ausführungsbeispiel ist diese Erfindung auf Sätze von Linear Beacons gerichtet, die geeignet sind zum Nachweisen oder Identifizieren der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge von zwei oder mehr unterschiedlichen Zielsequenzen, die in einer Probe anwesend sein könnten. Die Eigenschaften von Linear Beacons, die geeignet sind für den Nachweis, die Identifikation oder Quantifizierung von Zielsequenzen wurden kürzlich hierin beschrieben. Das Gruppieren von Linear Beacons in Sätzen, die gekennzeichnet sind für den spezifischen Nachweis von zwei oder mehr Zielsequenzen, ist ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel dieser Erfindung.
Sondensätze dieser Erfindung sollen wenigstens ein Linear Beacon umfassen, brauchen jedoch nicht nur Linear Beacons zu umfassen. Zum Beispiel können Sondensätze dieser Erfindung Mischungen von Linear Beacons, anderen PNA-Sonden und/oder Nucleinsäuresonden umfassen, vorausgesetzt jedoch, dass ein Satz wenigstens ein Linear Beacon, wie es hierin beschrieben ist, umfasst. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel ist wenigstens eine Sonde des Satzes eine Sperrsonde, wie sie hierin definiert ist.
Immobilisierung eines Linear Beacons an einer Oberfläche:
Eines oder mehrere Linear Beacons können wahlweise auf einer Oberfläche immobilisiert werden. In einem Ausführungsbeispiel kann die Sonde auf eine Oberfläche immobilisiert werden unter Verwendung des wohl bekannten Vorgangs des UV-Quervernetzens. Alternativ wird das PNA-Oligomer auf der Oberfläche in einer Weise synthetisiert, die geeignet ist für die Deprotektionierung, jedoch nicht die Spaltung von dem Syntheseträger.
Vorzugsweise ist die Sonde kovalent an eine Oberfläche durch eine Reaktion geeigneter funktioneller Gruppen auf der Sonde und dem Träger gekoppelt. Funktionelle Gruppen wie Aminogruppen, Carboxylsäuren und Diole können in ein Linear Beacon eingebaut werden durch Verlängerung eines der Enden mit geeigneten geschützten Einheiten (z. B. Lysin, Glutaminsäure und Cystein). Wenn das Ende verlängert wird, kann eine funktionelle Gruppe einer verzweigten Aminosäure wie Lysin verwendet werden, um die Donor- oder Akzeptormarkierung an der geeigneten Position in dem Polymer einzubauen (siehe Abschnitt überschrieben mit "PNA-Markierung"), während die andere funktionelle Gruppe des Zweigs verwendet wird, um wahlweise das Polymer weiter zu verlängern und es auf einer Oberfläche zu immobilisieren.
Verfahren für das Anhängen von Sonden an Oberflächen schließen allgemein die Reaktion einer nucleophilen Gruppe (z. B. ein Amin oder Thiol) der zu immobilisierenden Sonde mit einer elektrophilen Gruppe auf dem zu modifizierenden Träger ein. Alternativ kann das Nucleophil auf dem Träger anwesend sein und das Elektrophil (z. B. aktivierte Carboxylsäure) auf dem Linear Beacon anwesend sein. Da native PNA ein Aminoende besitzt, wird eine PNA nicht notwendigerweise der Modifikation bedürfen, um sie dadurch auf einer Oberfläche zu immobilisieren (siehe Lester et al., Poster betitelt "PNA Array Technology").
Bedingungen, die für die Immobilisierung einer PNA auf einer Oberfläche geeignet sind, werden allgemein ähnlich sein mit jenen Bedingungen, die für das Markieren einer PNA geeignet sind (siehe Unterüberschrift "PNA-Markierung"). Die Immobilisierungsreaktion ist im Wesentlichen das Äquivalent der Markierung der PNA, wobei die Markierung durch die Oberfläche ersetzt wird, auf welcher die PNA-Sonde kovalent immobilisiert werden soll.
Zahlreiche Oberflächentypen, die mit Aminogruppen, Carboxylsäuregruppen, Isocyanaten, Isothiocyanaten und Malimidgruppen derivatisiert sind, sind im Handel erhältlich. Nicht begrenzende Beispiele geeigneter Oberflächen schließen Membranen, Glas, Glas mit kontrollierten Poren, Polystyrolpartikel (Perlen), Kieselsäure und Goldnanopartikel ein.
Wenn sie auf einer Oberfläche immobilisiert sind, wird der Energietransfer zwischen Einheiten eines Beacon-Satzes in dem Linear Beacon geschehen. Nach der Hybridisierung mit einer Zielsequenz und geeigneten Hybridisierungsbedingungen wird der Ort auf der Oberfläche, wo das Linear Beacon (mit bekannter Sequenz) angeheftet ist, ein detektierbares Signal erzeugen, basierend auf der messbaren Änderung im Signal von wenigstens einem Glied des Beacon-Satzes des immobilisierten Linear Beacons. Folglich kann die Intensität des Signals auf der Oberfläche verwendet werden, um die Anwesenheit oder Menge einer Zielsequenz in einer Probe, die mit der Oberfläche, auf welcher das Linear Beacon immobilisiert ist, in Kontakt tritt, nachzuweisen, zu identifizieren oder zu quantifizieren. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Detektion der Oberflächenfluoreszenz verwendet werden, um die Hybridisierung mit einer Zielsequenz nachzuweisen.
Detektierbare und unabhängig detektierbare Einheiten/Multiplexanalyse
In bevorzugten Ausführungsbeispielen dieser Erfindung wird ein Multiplex-Hybridisierungstest durchgeführt. In einem Multiplextest werden zahlreiche Bedingungen von Interesse gleichzeitig untersucht. Die Multiplexanalyse beruht auf der Fähigkeit, Probenbestandteile oder die damit verbundenen Daten während oder nachdem der Test abgeschlossen ist, zu sortieren. In bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung werden gesondert unabhängig detektierbare Einheiten verwendet, um die unterschiedlichen Linear Beacons eines Satzes zu markieren. Die Fähigkeit, zwischen jeder der unabhängig detektierbaren Einheiten zu differenzieren und/oder diese zu quantifizieren, stellt die Mittel bereit, einen Hybridisierungstest als Multiplexverfahren auszulegen, da die Daten, die mit der Hybridisierung jedes der gesondert (unabhängig voneinander) markierten Linear Beacons mit einer Zielsequenz korrelieren, mit der Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge der Zielsequenz, die in einer Probe detektiert werden soll, korreliert werden können. Folglich können die Multiplextests dieser Erfindung verwendet werden, um simultan die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge einer oder mehrerer Zielsequenzen, die in derselben Probe in demselben Test vorhanden sein können, nachzuweisen. Vorzugsweise werden unabhängig voneinander detektierbare Fluorophore als die unabhängig detektierbaren Einheiten eines Multiplextestes unter Verwendung von Linear Beacons verwendet werden. Zum Beispiel könnten zwei Linear Beacons verwendet werden, um jede von zwei unterschiedlichen Zielsequenzen nachzuweisen, worin eine mit Fluorescein (grün) markierte Sonde verwendet werden würde, um die erste der beiden Zielsequenzen nachzuweisen, und worin eine mit Rhodamin oder Cy3 (rot) markierte Sonde verwendet werden würde, um die zweite der beiden Zielsequenzen nachzuweisen. Folglich würden ein grünes, ein rotes oder ein grünes und rotes Signal in dem Test die Anwesenheit der ersten, zweiten bzw. der ersten und zweiten Zielsequenzen bedeuten.
Arrays von Linear Beacons:
Arrays sind Oberflächen, auf welchen zwei oder mehr Sonden von Interesse an vorbestimmten Örtlichkeiten immobilisiert worden sind. Es wurden in der Literatur Arrays beschrieben, die sowohl Nucleinsäure- als auch PNA-Sonden umfassen. Die auf dem Array immobilisierten Sondensequenzen werden vernünftigerweise so gewählt, um eine Probe abzufragen, die eine oder mehrere Zielsequenzen von Interesse enthalten könnte. Da die Örtlichkeit und Sequenz jeder Sonde bekannt ist, werden Arrays im Allgemeinen verwendet, um simultan die Anwesenheit oder Menge einer oder mehrerer Zielsequenz in der Probe nachzuweisen, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Folglich können PNA-Arrays in diagnostischen Anwendungen oder beim Screening von Verbindungen nach Leitsubstanzen nützlich sein, die einen therapeutischen Nutzen ausüben könnten.
Zum Beispiel wird in einem diagnostischen Test eine Zielsequenz durch die komplementäre Sonde auf der Array-Oberfläche eingefangen und dann wird der Sonden/Zielsequenz-Komplex unter Verwendung eines sekundären Detektionssystems detektiert: In einem Ausführungsbeispiel wird der Sonden/Zielsequenz-Komplex unter Verwendung einer zweiten Sonde detektiert, die mit einer anderen Sequenz des Zielmoleküls von Interesse hybridisiert. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird der markierte Antikörper verwendet, um die Anwesenheit des Sonden/Zielsequenz-Komplexes zu detektieren, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
Da die Zusammensetzung des Linear Beacons an der Örtlichkeit auf der Oberfläche des Arrays bekannt ist (da die PNA auf dieser Position in dem Array synthetisiert wurde oder an diese angeheftet wurde), kann die Zusammensetzung von Zielsequenz(en) direkt detektiert, identifiziert oder quantifiziert werden durch Bestimmung der Örtlichkeit des in dem Array erzeugten detektierbaren Signals. Da die Hybridisierung des Linear Beacons mit einer Zielsequenz selbstanzeigend ist, wird kein sekundäres Detektionssystem benötigt, um den Array auf die Hybridisierung zwischen dem Linear Beacon und der Zielsequenz zu analysieren.
Arrays, die aus PNAs zusammengesetzt sind, haben den zusätzlichen Vorteil, dass PNAs hochstabil sind und nicht durch Enzyme abgebaut werden sollten, welche Nucleinsäuren abbauen. Folglich sollten PNA-Arrays wiederverwendbar sein, vorausgesetzt, dass die Nucleinsäure von einer Probe von dem Array vor der Einführung der zweiten Probe abgezogen werden kann. Nach dem Abziehen der hybridisierten Zielsequenzen sollte das Signal auf dem Array von Linear Beacons wiederum bis zum Hintergrund reduziert werden. Da PNAs nicht durch Hitze oder Endonuclease- und Exonucleaseaktivität abgebaut werden, sollten Arrays von Linear Beacon geeignet sein für die einfache und schnelle Regenerierung durch die Behandlung mit Hitze, Nucleasen oder chemischen Denaturierungsmitteln wie wässrigen Lösungen, die Formamid, Harnstoff und/oder Natriumhydroxid enthalten.
Verfahren:
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel ist diese Erfindung auf ein Verfahren für den Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz und einer Probe gerichtet. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Linear Beacon und dann das Nachweisen, Identifizieren oder Quantifizieren der Änderung im detektierbaren Signal in Verbindung mit wenigstens einer Einheit eines Beacon-Satzes, wobei eine Korrelation zwischen dem nachweisbaren Signal und der Hybridisierung möglich ist, da Linear Beacons selbstanzeigend sind. Da Linear Beacons selbstanzeigend sind, ist dieses Verfahren besonders geeignet für die Analyse, die in einem Closed-Tube-Test (auch bekannt als "homogene Tests") durchgeführt wird. Mit Closed-Tube-Test meinen wir, dass, wenn einmal die Bestandteile des Tests kombiniert worden sind, es keinen Bedarf gibt, das Röhrchen zu öffnen und Bestandteile des Tests zu entnehmen, um das Ergebnis zu bestimmen. Da das Reagenzglas nicht geöffnet zu werden braucht und vorzugsweise auch nicht geöffnet wird, um das Ergebnis zu bestimmen, muss es eine gewisse detektierbare oder messbare Änderung geben, die geschieht und die beobachtet oder quantifiziert werden kann, ohne das Reagenzglas zu öffnen oder die Inhalte des Tests zu entfernen. Folglich beruhen die meisten Closed-Tube-Tests auf einer Änderung in der Fluoreszenz, die mit dem Auge beobachtet werden kann oder die anderweitig mit einem Fluoreszenzgerät, das das Reagenzglas als den Probenhalter nutzt, detektiert und/oder quantifiziert werden kann. Beispiele solcher Geräte schließen den Light Cycler von Idaho Technologies und das Prism 7700 von Perkin Elmer ein.
Bevorzugte Closed-Tube-Tests dieser Erfindung umfassen den Nachweis von Nucleinsäurezielsequenzen, die durch Betätigung des Tests synthetisiert oder amplifiziert worden sind. Nicht begrenzende Beispiele bevorzugter Nucleinsäuresynthese- oder Nucleinsäureamplifikationsreaktionen sind die Polymerasekettenreaktion (PCR), Ligase-Ketten-Reaktion (LCR), Strangverdrängungsamplifikation (SDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA), Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) und die Q-beta-Replikase. Die in dem Closed-Tube-Test vorhandenen Linear Beacons werden ein nachweisbares Signal in Antwort auf die Zielsequenzproduktion aus der Nucleinsäuresynthese- oder Nucleinsäureamplifikationsreaktion, die in dem Closed-Tube-Test geschieht, erzeugen. In einem am meisten bevorzugten Ausführungsbeispiel ist der Test eine asymmetrische PCR-Reaktion (siehe Beispiel 19 dieser Spezifikation).
Da Linear Beacons dieser Erfindung gestaltet werden können, um stabil gegen die in der Zelle gefundenen Enzyme zu sein, ist dieses Verfahren besonders gut geeignet, um eine Zielsequenz in einer Zelle, in einem Gewebe oder Organismus, ob lebend oder nicht, nachzuweisen. Folglich wird in bevorzugten Ausführungsbeispielen in-situ-Hybridisierung als das Testformat verwendet, um Zielorganismen nachzuweisen, zu identifiezieren oder zu quantifizieren (siehe Beispiel 20 dieser Spezifikation). Am bevorzugtesten ist Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH oder PNA-FISH) das Testformat. Beispielhafte Verfahren für die Durchführung von PNA-FISH können gefunden werden in: Thisted et al., Cell Vision, 3: 358-363 (1996) oder in der WIPO-Patentanmeldung WO97/18325).
Organismen, die mit Linear Beacons dieser Erfindung behandelt worden sind, können durch zahlreiche beispielhafte Verfahren detektiert werden. Die Zellen können auf Objektträgern fixiert werden und dann mit einer Mikroskop- oder Laser-Scan-Vorrichtung sichtbar gemacht werden. Alternativ dazu können die Zellen fixiert und dann in einem Durchflusszytometer analysiert werden (siehe zum Beispiel: Lansdorp et al.; WIPO-Patentanmeldung WO97/14026). Objektträgerscanner und Durchflusszytometer sind be sonders nützlich, um schnell die in der Probe von Interesse anwesenden Zielorganismen zu quantifizieren.
Da das Verfahren dieser Erfindung in einem auf Sonden basierenden Hybridisierungstest verwendet werden kann, wird diese Erfindung Nutzen finden bei der Verbesserung von Tests, die verwendet werden, um die Anwesenheit oder Menge eines Organismus oder Virus in einer Probe durch die Detektion von Zielsequenzen, die mit dem Organismus oder Virus in Verbindung stehen, nachzuweisen, zu identifizieren oder zu quantifizieren. (Siehe US-Patent Nr. 5,641,631, betitelt „Method for detecting, identifying and quantitiating organisms and viruses"). Ähnlich wird diese Erfindung Nutzen finden in einem Test, der bei der Detektion, Identifizierung und Quantifizierung von einer oder mehreren Arten in einer Probe verwendet wird (siehe US-Patent-Nr. 5,288,611, betitelt „Method for detecting, identifying and quantitiating organisms and viruses"). Diese Erfindung wird auch Nutzen in einem Test finden, der verwendet wird, um die Wirkung antimikrobieller Mittel auf das Wachstum eines oder mehrerer Mikroorganismus(en) in einer Probe zu bestimmen (siehe US-Patent-Nr. 5,612,183, betitelt „Method for determining the effect of antimicrobial agents on growth using ribosomal nucleic acid subunit subsequence specific probes"). Diese Erfindung wird auch Nutzen finden in einem Test, der verwendet wird, um die Anwesenheit oder Menge einer taxonomischen Gruppe von Organismen in einer Probe zu bestimmen (siehe US-Patent Nr. 5,601,984, betitelt "Method for detecting the presence of amount of a taxonomic group of organisms using specific r-RNA subsequences as probes").
Wenn das Verfahren dieser Erfindung durchgeführt wird, kann es bevorzugt sein, eine oder mehrere nicht markierte oder unabhängig nachweisbare Sonden in dem Test zu verwenden, um dabei das Binden des Linear Beacons an eine Nicht-Zielsequenz zu unterdrücken. Die Anwesenheit von der (den) "Sperrsonde(n)" hilft, die Unterscheidung des Tests zu erhöhen und dabei Zuverlässigkeit und Sensitivität (Signal-Rausch-Verhältnis) zu verbessern.
In gewissen Ausführungsbeispielen dieser Erfindung wird eine Zielsequenz auf einer Oberfläche durch die geeignete Behandlung der Probe immobilisiert. Immobilisierung der Nucleinsäure kann leicht verwirklicht werden durch Auftragen der Probe auf eine Mem brane und dann UV-Quervernetzen. Zum Beispiel können die Proben in einem Array angeordnet werden, so dass der Array mit einem oder mehreren Linear Beacons nacheinander abgefragt werden kann, um dabei zu bestimmen, ob jede Probe eine oder mehrere Zielsequenzen von Interesse enthält.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel wird das Linear Beacon auf einem Träger immobilisiert und die Proben werden nacheinander abgefragt, um dadurch zu bestimmen, ob jede Probe eine Zielsequenz von Interesse enthält. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Linear Beacons auf einem Array immobilisiert, welcher mit der Probe von Interesse in Kontakt gebracht wird. Folglich kann die Probe simultan auf die Anwesenheit oder Menge von zahlreichen Zielsequenzen von Interesse analysiert werden, worin die Zusammensetzung der Linear Beacons vernünftigerweise so gewählt und sie an vorbestimmten Örtlichkeiten auf der Oberfläche angeordnet werden, so dass die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge von bestimmten Zielsequenzen unzweideutig bestimmt werden können. Arrays von Linear Beacons sind besonders nützlich, da kein zweites Detektionssystem benötigt wird. Folglich ist diese Erfindung auch auf einen Array gerichtet, der zwei oder mehr trägergebundene Linear Beacons umfasst, die geeignet sind für den Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz von Interesse.
Kits:
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel ist diese Erfindung auf Kits gerichtet, die geeignet sind für das Durchführen eines Tests, welcher die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge einer oder mehrere Zielsequenzen detektiert, die in einer Probe vorhanden sein könnten. Die Eigenschaften von Linear Beacons, die für den Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung der Menge einer oder mehrerer Zielsequenzen geeignet sind, wurden kürzlich hierin beschrieben. Weiterhin wurden kürzlich hierin auch Verfahren beschrieben, die geeignet sind, um die Linear-Beacon-Bestandteile eines Kits zu verwenden, eine oder mehrere Zielsequenzen, die in einer Probe vorhanden sein könnten, nachzuweisen, zu identifizieren oder zu quantifizieren.
Die Kits dieser Erfindung umfassen eines oder mehrere Linear Beacons und andere Reagenzien oder Zusammensetzungen, die ausgewählt werden, um einen Test durchzuführen oder anderweitig die Erscheinung eines Tests zu vereinfachen. Bevorzugte Kits enthalten Sätze von Linear Beacons, worin jedes von wenigstens zwei Linear Beacons des Satzes verwendet werden, um gesondert die zwei oder mehr unterschiedlichen Zielsequenzen nachzuweisen oder zwischen diesen zu unterscheiden, die in der Probe anwesend sein könnten. Folglich werden die Linear Beacons des Satzes vorzugsweise mit unabhängig nachweisbaren Einheiten markiert, so dass jede der zwei oder mehr unterschiedlichen Zielsequenzen individuell detektiert, identifiziert oder quantifiziert werden können (ein Multiplextest).
Beispielhafte Anwendungen für die Verwendung der Erfindung
Ob trägergebunden oder in Lösung, die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung sind besonders nützlich für die schnelle, empfindliche, zuverlässige und vielseitige Detektion von Zielsequenzen, die besonders sind für Organismen, welche in Nahrungsmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Toilettenartikeln, Molkereiprodukten oder Umweltproben gefunden werden könnten. Die Analyse bevorzugter Getränke schließen Soda, Wasser in Flaschen, Fruchtsaft, Bier, Wein oder Likörprodukte ein. Folglich werden die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung besonders nützlich sein für die Analyse von Rohmaterialien, Ausrüstung, Produkten oder Vorgängen, die verwendet werden, um Nahrungsmittel, Getränke, Wasser, pharmazeutische Produkte, Toilettenartikel, Molkereiprodukte oder Umweltproben herzustellen oder zu lagern.
Ob trägergebunden oder in Lösung, die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung sind besonders nützlich für die schnelle, empfindliche, zuverlässige und vielseitige Detektion von Zielsequenzen, die besonders sind für Organismen, welche in klinischen Umgebungen gefunden werden könnten. Folglich werden die Verfahren, Kits und Zusammensetzungen dieser Erfindung besonders nützlich sein für die Analyse von klinischen Mustern oder Ausrüstung, festem Inventar oder Produkten, die verwendet werden, um Menschen oder Tiere zu behandeln. Zum Beispiel kann der Test verwendet werden, um eine Zielsequenz nachzuweisen, die spezifisch ist für eine genetisch begründete Erkrankung oder die spezifisch ist für eine Veranlagung für eine genetisch begründete Erkrankung. Nicht begrenzende Beispiele von Erkrankungen schließen β-Thalassämie, Sichelzellenanämie, Faktor-V-Leiden, zystische Fibrose und krebsverwandte Ziele wie p53, p10, BRC-1 und BRC-2 ein.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel kann die Zielsequenz in Beziehung stehen mit chromosomaler DNA, worin der Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz verwendet werden kann in Bezug auf forensische Techniken wie Pränataluntersuchung, Vaterschaftsuntersuchung, Identitätsbestätigung oder kriminalistischer Untersuchung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist eine grafische Veranschaulichung von Fluoreszenz-gegen-Temperatur-Daten für PNA-Sonden, die ein thermisches Fluoreszenzprofil vom Typ A zeigen.
1B1, 1B2 und 1B3 sind grafische Veranschaulichungen von Fluoreszenz-gegen-Temperatur-Daten für PNA-Sonden, die ein thermisches Fluoreszenzprofil vom Typ B zeigen.
1C ist eine grafische Veranschaulichung von Fluoreszenz-gegen-Temperatur-Daten für PNA-Sonden die ein thermisches Fluoreszenzprofil vom Typ C zeigen.
2A1 und 2A2 sind grafische Veranschaulichungen von Fluoreszenz-gegen-Zeit-Daten für PNA-Sonden, welche ein Hybridisierungsprofil vom Typ A zeigen.
2B ist eine grafische Veranschaulichung von Fluoreszenz-gegen-Zeit-Daten für PNA-Sonden, welche ein Hybridisierungsprofil vom Typ B zeigen.
2C ist eine grafische Veranschaulichung von Fluoreszenz-gegen-Zeit-Daten für PNA-Sonden, welche ein Hybridisierungsprofil vom Typ C zeigen.
3 ist eine grafische Veranschaulichung von Rausch- (Hintergrundfluoreszenz)Daten für DNA- und PNA-Sonden unterschiedlicher Längen- und Markierungskonfigurationen.
4A, 4B, 4C, 4D und FE sind grafische Veranschaulichungen von Signal-Rausch-Daten für PNA- und DNA-Sonden mit einer Länge von 11 und 15 Untereinheiten.
5 ist eine Digitalaufnahme von zwei Eppendorfröhrchen, wobei jedes die Inhalte einer Reaktion enthält, welche 45 PCR-Zyklen durchlief und ein Linear Beacon enthält.
6A und 6B sind Digitalaufnahmen von Probenschnitten, die E. coli-, P. aeruginosa- oder B. subtilis-Bakterien enthalten, welche mit Linear Beacon und Propidiumjodid behandelt worden sind, worin die Linear Beacons Nucleobasensondiersequenz umfassen, die spezifisch ist für entweder P. aeruginosa (6A) oder B. subtilis (6B). Die Aufnahmen wurden gewonnen unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskopes und von im Handel erhältlichen Lichtfiltern, angepasst an das Mikroskop bzw. die Kamera. In beiden Figuren sind die Bilder I, III und IV die roten Aufnahmen, gewonnen unter Verwendung eines roten Mikroskop- und Kamerafilters, worin die mit Propidiumjodid gefärbten Zellen sichtbar sind. In beiden Figuren sind die Bilder II, IV und VI die grünen Aufnahmen, gewonnen unter Verwendung eines grünen Mikroskop- und Kamerafilters.
7A und 7B sind grafische Darstellungen von Daten, die für Rausch- und Signal-Rausch-Verhältnisse für eine mit Cy3 markierte 15-mer PNA-Sonde mit einer durcheinander gebrachten (engl.: scrambled) Nucleobasensequenz angehäuft worden sind.
8 ist eine grafische Veranschaulichung von Signal-Rausch-Verhältnissen in Hybridisierungstests für Sonden, die in Tabelle 1A aufgelistet sind.
Arten für die Durchführung der Erfindung
Diese Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert, von denen nicht beabsichtigt wird, dass sie in irgendeiner Weise begrenzend sind.
Beispiel 1: Synthese von N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-Lysin-OH
Zu 20 mmol N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-Lysin-OH wurden 60 ml 2/1 Dichlormethan (DCM)/Trifluoressigsäure (TFA) hinzugefügt. Der Lösung wurde ermöglicht, zu rühren, bis die tert.-Butyloxycarbonyl-(t-boc)-Gruppe vollständig von dem N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-Lysin-OH entfernt wurde. Die Lösung wurde dann bis zur Trockene verdampft und der Rückstand wurde in 15 ml DCM erneut gelöst. Es wurde dann ein Versuch unternommen, um das Produkt durch die tropfenweise Zugabe der Lösung zu 350 ml Ethylether zu fällen. Da das Produkt ausölte, wurde der Ethylether dekantiert und das Öl wurde hohem Vakuum ausgesetzt, um einen weißen Schaum zu ergeben. Der weiße Schaum wurde in 250 ml Wasser gelöst und die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 4 durch die Zugabe von gesättigtem Natriumphosphat (zweibasig) neutralisiert. Es bildete sich ein weißer Feststoff und wurde durch Vakuumfiltration gesammelt. Das Produkt wurde in einem Vakuumofen bei 35-40 °C über Nacht getrocknet. Ausbeute: 17,6 mmol, 88 %.
Beispiel 2: Synthese von N-α-(Fmoc)-N-ε-(Dabcyl)-L-Lysin-OH
Zu 1 mmol N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-Lysin-OH wurden 5 ml N,N'-Dimethylformamid (DMF) und 1,1 mmol TFA hinzugefügt. Dieser Lösung wurde ermöglicht, zu rühren, bis die Aminosäure vollständig gelöst war.
Zu 1,1 mmol 4-((4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure, Succinimidylester (Dabcyl-NHS; Molecular Probes, P/N D-2245) wurden 4 ml DMF und 5 mmol Diisopropylethylamin (DIEA) hinzugefügt. Zu dieser Rührlösung wurde tropfenweise die, wie oben beschrieben, zubereitete N-α-(Fmoc)-N-ε-(NH₂)-L-Lysin-OH-Lösung hinzugefügt. Der Reaktion wurde ermöglicht, über Nacht zu rühren, und wurde dann aufgearbeitet.
Das Lösungsmittel wurde vakuumverdampft und der Rückstand wurde in 50 ml DCM und 50 ml 10%iger wässriger Zitronensäure verteilt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit wässrigem Natriumbicarbonat gewaschen und wiederum mit 10%iger wässriger Zitronensäure. Die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem orangefarbigen Schaum verdampft. Der Schaum wurde aus Acetonitril (ACN) kristallisiert und die Kristalle wurden durch Vakuumfiltration gesammelt. Ausbeute: 0,52 mmol, 52 %.
Beispiel 3: Synthese von N-α-(Fmoc)-N-ε-(Dabcyl)-L-Lysin-PAL-PEG/PS-Syntheseträger
N-α-(Fmoc)-N-ε-(Dabcyl)-L-Lysin-OH (Beispiel 2) wurde verwendet, um einen Syntheseträger zuzubereiten, der für die Zubereitung von C-terminal dabcyliertem PNA nützlich ist. Die Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc)-Gruppe von 0,824 g im Handel erhältlichem Fmoc-PAL-PEG-PS-Syntheseträger (PerSeptive Biosystems, Inc.; P/N GEN913384) wurde durch die in einem Durchflussgefäß erfolgende Behandlung mit 20 % Piperidin in DCM für 30 Minuten entfernt. Der Träger wurde dann mit DCM gewaschen. Schließlich wurde der Träger mit DMF gewaschen und mit einem Spülstrom von Argon getrocknet.
Es wurde eine Lösung, die 0,302 g N-α-(Fmoc)-N-ε-(Dabcyl)-L-Lysin-OH, 3,25 ml DMF, 0,173 g [O-(7-Azabenzotriaol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HA-TU), 0,101 ml DIEA und 0,068 ml 2,6-Lutidin enthielt, durch die aufeinanderfolgende Kombination der Reaktionsmittel zubereitet. Diese Lösung wurde dann zu dem gewaschenen Syntheseträger hinzugefügt und es wurde ihr ermöglicht, für zwei Stunden zu reagieren. Die Lösung wurde dann durch das Gefäß mit einem Argonstrom gespült und der Untergrund wurde nacheinander mit DMF, DCM und DMF gewaschen. Das Harz wurde dann mit einem Argonstrom getrocknet.
Der Träger wurde mit 5 ml im Handel erhältlichem Standard-PNA-Capping-Reaktionsmittel (PerSeptive Biosystems, Inc., P/N GEN063102) behandelt. Das Capping-Reaktionsmittel wurde dann aus dem Gefäß gespült und der Träger wurde mit DMF und DCM gewaschen. Der Träger wurde dann mit einem Argonstrom getrocknet. Schließlich wurde der Syntheseträger unter Hochvakuum getrocknet.
Die Endbeladung des Trägers wurde durch die Analyse von Fmoc bestimmt, indem er mit drei Proben von annähernd 6 bis 8 mg beladen wurde. Die Analyse bestimmte die Beladung als annähernd 0,145 mmol/g seiend.
Dieser Syntheseträger wurde in eine leere PNA-Synthesesäule gepackt, wie benötigt, und wurde verwendet, um PNA-Oligomere mit einer C-terminalen Dabcyl-Löscheinheit zuzu bereiten, die an das PNA-Oligomer durch die ε-Aminogruppe der C-terminalen L-Lysin-Aminosäure angeheftet ist.
Beispiel 4: Synthese von PNA
PNAs wurden synthetisiert unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reaktionsmitteln und Instrumenten, erhalten von PerSeptive Biosystems, Inc. Es wurden oftmals Doppelkupplungen durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Rohprodukt von annehmbarer Reinheit war. Es wurden PNAs, die eine C-terminale Dabcyl-Einheit besaßen, zubereitet, indem die Synthese unter Verwendung des wie in Beispiel 3 beschrieben zubereiteten, mit Dabcyl-Lysin modifizierten Syntheseträgers durchgeführt wurde, oder indem die N-ε-Aminogruppe des C-terminalen Lysinrestes markiert wurde, während die PNA noch trägergebunden war, wie in Beispiel 10 beschrieben. Alle PNAs, die sowohl eine N-terminale Fluoresceineinheit als auch eine C-terminale Dabcyl-Einheit besaßen, wurden mit den geeigneten Markierungsreaktionsmitteln und Linkern (soweit benötigt) vor der Abspaltung von dem Syntheseträger behandelt. PNAs, die eine N-terminale Cy3-Markierung (Amersham) umfassten, wurden von dem Syntheseträger abgespalten und mit HPLC vor der Cy3-Markierung gereinigt (siehe Beispiel 12).
Beispiel 5: Bevorzugtes Verfahren für die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe
Der Syntheseträger wurde mit einer Lösung aus 25 % Piperidin in DMF für 5 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Nach der Behandlung wurde der Syntheseträger gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet. Der Träger wurde dann mit dem geeigneten Markierungsreagens behandelt und/oder von dem Syntheseträger abgespalten.
Beispiel 6: Synthese des Fluorescein-O-Linkers
Zu 7,5 mmol of N-(tert-Butyloxycarbonyl)-8-amino-3,6-dioxaoctansäure, rührend in 10 ml DCM, wurden 50 mmol TFA hinzugefügt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis die t-boc-Gruppe vollständig entfernt worden war. Das Lösungsmittel wurde dann durch Vakuumverdampfen entfernt und das Produkt wurde dann in 10 ml DCM resuspendiert.
Zu dieser Rührlösung wurde tropfenweise ein Lösung, enthaltend 7,5 mmol Di-O-pivaloyl-5(6)-carboxyfluorescein-NHS-Ester, 30 mmol N-Methylmorpholin (NMM) und 20 ml DCM hinzugefügt. Der Reaktion wurde ermöglicht, über Nacht zu laufen, und wurde dann in einen Abscheidetrichter am Morgen übertragen.
Diese organische Lösung wurde mit wässriger 10%iger Zitronensäure zweimal gewaschen und dann mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem braunen Schaum verdampft. Das Produkt wurde unter Verwendung von Kieselsäuregel auf einer Säule gereinigt. Eine mobile Phase aus DCM und ein schrittweiser Methanolgradient wurden verwendet, um das Produkt aus der stationären Phase zu eluieren. Eine Ausbeute von 2,8 g Schaum wurde durch Auflösen in einer minimalen Menge DCM und der tropfenweisen Zugabe von jener Lösung zu Hexan gefällt. Ausbeute: 2,32 g weißes Pulver. Die Reinheit des Produktes war nicht zum Markieren geeignet, so wurde eine zusätzliche Umkehrphasenchromatographieauftrennung auf einer Probe dieses Materials durchgeführt.
Ein Gramm des gefällten Produktes wurde in 30 ml 50 mM wässriges Triethylammoniumacetat (pH 7), enthaltend 40 % Acetonitril, gelöst. Diese Lösung wurde dann zu einer voräquilibrierten 2 g Waters Sep-Pack Vac 12 cc tC18-Kartusche (P/N WAT043380) in Aliquoten von 10,3 ml hinzugefügt. Nach der Zugabe von sämtlichem Beladungslösungmittel wurden zwei Aliquoten mit 3 ml 50 mM wässriges Triethylammoniumacetat (pH 7), enthaltend 40 % Acetonitril, als eine erste Waschung geladen. Zwei Aliquoten mit 3 ml 50 mM wässriges Triethylammoniumacetat (pH 7), enthaltend 60 % Acetonitril, wurden dann als zweite Waschung geladen. Schließlich wurde eine einzelne Aliquote mit 3 ml Acetonitril verwendet, um auf der Säule verbleibendes Material zu eluieren. Das Eluat jeder Aliquote wurde individuell gesammelt und durch HPLC auf Reinheit analysiert. Die Aliquoten wurden vakuumverdampft und die Masse jeder bestimmt. Fraktionen geeigneter Reinheit wurden in DCM erneut gelöst, die Fraktionen wurden kombiniert und in Hexan gefällt. Ausbeute: 0,232 g.
Beispiel 7: Allgemeines Verfahren für die N-terminale Markierung von trägergebundener PNA mit Fluorescein-O-Linker
Für die N-terminale Fluorescein-Markierung wurde die aminoterminale Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc-)Gruppe von etlichen der vollständig zusammengebauten PNA-Oligomere durch Piperidinbehandlung entfernt und das Harz wurde gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Harz wurde dann für 20 bis 30 Minuten mit annähernd 3 μl einer Lösung, enthaltend 0,07 M Fluorescein-O-Linker, 0,06 M (HATU), 0,067 M DIEA und 0,1 M 2,6-Lutidin, behandelt. Nach der Behandlung wurde das Harz gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet. Das PNA-Oligomer wurde dann abgespalten, deprotektioniert und, wie unten beschrieben, gereinigt.
Beispiel 8: Allgemeines Verfahren für die Markierung trägergebundener PNA mit 5(6)-Carboxyflurescein-NHS
Dieses Verfahren wurde als eine Alternative zu dem im Beispiel 7 beschriebenen Vorgehen für die Markierung von PNA mit 5(6)-Carboxyfluorescein verwendet. Dieses Vorgehen erfordert, dass der N-Terminus des PNA-Oligomers mit Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctansäure zur Reaktion gebracht wird, bevor die Markierungsreaktion durchgeführt wird, so dass äquivalente PNA-Konstrukte zubereitet werden. Die aminoterminale Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc-)Gruppe des vollständig zusammengebauten PNA-Oligomers wurde durch Piperidinbehandlung entfernt und der Syntheseträger wurde gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Der Syntheseträger wurde dann für 4 bis 5 Stunden bei 37 °C mit annähernd 300 μl einer Lösung behandelt, die 0,1 M 5(6)-Carboxyfluorescein-NHS (Molecular Probes, P/N C-1311), 0,3 M DIEA und 0,3 M 2,6-Lutidin enthielt. Nach der Behandlung wurde der Syntheseträger gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet. Das PNA-Oligomer wurde dann abgespalten, deprotektioniert und, wie unten beschrieben, gereinigt.
Bevorzugter wurde der Syntheseträger dann für 2 bis 5 Stunden bei 30 bis 37 °C mit annähernd 250 μl einer Lösung behandelt, die 0,08 M 5(6)-Carboxyfluorescein-NHS, 0,24 M DIEA und 0,24 M 2,6-Lutidin enthielt.
Beispiel 9: Allgemeines Vorgehen für die Markierung trägergebundener PNA mit 5(6)-Carboxyfluorescein
Nach der sauberen Reaktion mit Linkern und dem Entfernen terminaler Aminschutzgruppen wurde das Harz mit 250 μl einer Lösung, enthaltend 0,5 M 5(6)-Carboxyfluorescein, 0,5 M N,N'-Diisopropylcarbodiimid, 0,5 M 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) in DMF behandelt (siehe Weber et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 8: 597-600 (1998)). Nach der Behandlung wurde der Syntheseträger gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet. Das PNA-Oligomer wurde dann abgespalten, deprotektioniert und, wie unten beschrieben, gereinigt.
Bemerkung zum Fluoreszenz-Markieren: Die hierin beschriebenen, mit Fluorescein markierten PNAs wurden unter Verwendung etlicher unterschiedlicher Vorgehensweisen zubereitet. Die unterschiedlichen Vorgehensweisen wurden entwickelt, um die Fluorescein-Markierungsbedingungen zu optimieren. Zu diesem Zeitpunkt bevorzugen wir die Verwendung des Vorgehens von Weber et al. für die meisten Fluorescein-Markierungsvorgänge.
Beispiel 10: Allgemeines Vorgehen für die Dabcyl-Markierung der N-ε-Aminogruppe von trägergebundenem L-Lysin
Dieses Vorgehen wurde als eine Alternative verwendet, um den vorderivatisierten Träger zu verwenden, wenn dabcylierte PNA zubereitet wird. Dieses Vorgehen hat den Vorteil, dass die Lysineinheit (und deswegen die angehängte Dabcyl-Einheit) in dem Polymer an Ort und Stelle platziert werden kann, einschließlich in der Nucleobasensondiersequenz.
Das Harz (immer noch in der Synthesesäule) wurde mit 10 ml einer Lösung, enthaltend 1 % Trifluoressigsäure, 5 % Triisopropylsilan (TIS) in Dichlormethan, behandelt, indem die Lösung durch die Säule über einen Zeitraum von annähernd 15 Minuten hindurchgeführt wurde. Nach der Behandlung wurde der Syntheseträger mit DMF gewaschen. Vor der Behandlung mit Markierungsreagens wurde der Träger durch die Behandlung mit annä hernd 10 ml einer Lösung, enthaltend 5 % Diisopropylethylamin in DMF, neutralisiert. Nach der Behandlung wurde der Träger mit Dabcyl-NHS (als ein Ersatz für 5(6)-Carboxyfluorescein-NHS in dem Vorgehen) behandelt, im Wesentlichen wie beschrieben in Beispiel 8.
Bemerkung: Dieses Vorgehen wurde nur an PNA durchgeführt, das unter Verwendung von Fmoc-PAL-PEG/PS (PerSeptive P/N GEN913384) zubereitet worden war. Es wurde nicht durchgeführt mit dem säurelabileren Fmoc-XAL-PEG/PS (PerSeptive P/N GEN913394).
Beispiel 11: Allgemeines Vorgehen für die Abspaltung, Deprotektionierung und Reinigung
Der Syntheseträger (Fmoc-PAL-PEG/PS; P/N GEN913384) wurde aus der Synthesekartusche entfernt, in eine Ultrafree-Spin-Kartusche (Millipore Corp., P/N SE3P230J3) übertragen und mit einer Lösung aus TFA/m-Kresol (entweder 7/3 oder 8/2 (bevorzugt)) für 1 bis 3 Stunden behandelt. Die Lösung wurde durch das Trägerbett gewirbelt und wiederum wurde der Träger mit einer Lösung aus TFA/m-Kresol für 1 bis 3 Stunden behandelt. Die Lösung wurde wiederum durch das Trägerbett gewirbelt. Die kombinierten Eluate (TFA/m-Kresol) wurden dann durch die Zugabe von annähernd 1 ml Diethylether gefällt.
Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation pelletiert. Das Pellet wurde dann in Ethylether resuspendiert und zwei weitere Male pelletiert. Das getrocknete Pellet wurde dann in 20 wässrigem Acetonitril (ACN), enthaltend 0,1 % TFA, resuspendiert (zusätzliches ACN wurde, wie notwendig, hinzugefügt, um das Pellet zu lösen). Das Produkt wurde analysiert und gereinigt unter Verwendung von Umkehrphasenchromatographieverfahren.
Bemerkung: Etliche PNAs wurden zubereitet unter Verwendung des von PerSeptive Biosystems, Inc. erhältlichen neuen Produktes Fmoc-XAL-PEG/PS-Syntheseträger (P/N GEN 913394). Dieser Träger hat den Vorteil, dass die PNA schneller und unter milder-sauren Bedingungen entfernt werden kann. Für PNAs, die mit Fmoc-XAL-PEG/PS zubereitet worden waren, wurde der Träger, wie oben beschrieben, behandelt, mit der Ausnahme, dass eine Lösung aus DFA/m-Kresol 9/1 allgemein für einen Zeitraum von 10 bis 15 Minuten (zweimal) verwendet worden war.
Beispiel 12: Cy3-Markierung von PNAs
Das gereinigte, PNA enthaltende Amin wurde in 1/1 DMF/Wasser in einer Konzentration von 0,05 OD/μl gelöst, um eine PNA-Stammlösung zuzubereiten. Aus der Stammlösung wurden annähernd 30 nmol PNA zu einem Röhrchen hinzugefügt. Zu diesem Röhrchen wurden dann 125 μl 0,1 M HEPES (pH 8,5) und ausreichend 1/1 DMF/Wasser hinzugefügt, um das Gesamtvolumen auf 250 μl zu bringen. Diese Lösung wurde dann gründlich vermischt. Zu einem vorgepackten Röhrchen aus Cy3-Farbstoff (Amersham) wurde die gesamte 250 μl-Lösung, zubereitet wie oben beschrieben, hinzugefügt. Das Röhrchen wurde gut vermischt und es wurde ihm dann ermöglicht, für eine Stunde bei Umgebungstemperatur zu reagieren.
Nach der Reaktion wurde das Lösungsmittel durch Verdampfen in einem Speed-Vac-Gerät entfernt. Das Pellet wurde dann in 400 μl einer Lösung, enthaltend 3:1 1 % wässrige TFA/ACN, gelöst. Wahlweise wurde die Lösung dann auf ein 5000-MW-Ultrafree-(Millipore, P/N UFC3LCC25) oder ein 3000-MW-(Amicon, P/N 42404) Filter übertragen, um im Überschuss vorhandenen Farbstoff zu entfernen. Das wiedergewonnene Produkt wurde dann erneut unter Verwendung von Umkehrphasenchromatographieverfahren gereinigt.
Beispiel 13: Analyse und Reinigung von PNA-Oligomeren
Alle PNA-Sonden wurden mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert und gereinigt. Die Sondenzusammensetzung wurde durch Vergleich mit theoretisch berechneten Massen bestätigt.
HPLC-Vorgehen:
Allgemein wurden zwei unterschiedliche Hochleistungsflüssigchromatographie-(HPLC-) Gradienten verwendet, um die PNA-Oligomere zu analysieren und zu reinigen (Gradienten A & B). Präparative Reinigungen wurden skaliert, basierend auf den in den Gradienten A & B beschriebenen Analysebedingungen. Gradient B wurde entwickelt, da die anfängliche Reinigung unter Verwendung von Standardgradienten (Gradient A) sich als weniger als zufrieden stellend herausstellte. Die experimentellen Bedingungen sind, wie unten beschrieben, mit der Ausnahme, dass etliche Versuche gemacht wurden, um die Reinigungen durch die Zugabe von 20 % Formamid zu den Laufpuffern während etlicher der Reinigungen zu verbessern. Dieses Vorgehen wurde aufgegeben, da es nicht irgendwelche günstigen Ergebnisse zu produzieren scheint. Kurioserweise legte jedoch die sorgfältige Durchsicht der Daten nahe, dass von den HPLC-Artefakten, von denen kürzlich gedacht wurde, dass sie mit der Struktur gewisser Sonden korrelieren (siehe provisorische Patentanmeldung Nr. 60/063,283, angemeldet am 27. Oktober 1997), auch gefunden wurde, dass sie mit der Anwesenheit von Formamid während der Aufreinigung korrelieren. Deswegen wird angenommen, dass keine Korrelation zwischen der Struktur der PNA-Sonde und den HPLC-Profilen, die für die gereinigten Oligomere beobachtet wurden, existiert.
Gradienten A & B

Puffer A = 0,1 % TFA in Wasser.
Puffer B = 0,1 % TFA in Acetonitril.
Durchflussgeschwindigkeit: 0,2 ml/Min.
Säulentemperatur: 60 °C
Gerät: Waters 2690 Alliance: Kontrolle durch Waters Millennium Software Stationäre Phase: Waters Delta Pak C18, 300 Å, 5 μm, 2 × 150 mm (P/N WAT023650) Detektion bei 260 nm

Gradientenprofil A
Gradientenprofil B
Massenanalyse:
Die Proben wurden unter Verwendung eines linearen Voyager-Delayed-Extraction-Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionization-Time-Of-Flight-(DE-MALDI-TOF-) Massenspektrometers (PerSeptive Biosystems, Inc.) analysiert. Sinipininsäure wurde als die Probenmatrix verwendet und wurde auch verwendet als ein Punkt für die Kalibrierung auf der Massenachse. Rinderinsulin wurde als ein interner Kalibrierungsstandard für den zweiten Kalibrierungspunkt der Massenachse verwendet.
Die Proben wurden allgemein für die Analyse zubereitet, indem zuerst eine Lösung aus Sinipininsäure mit einer Konzentration von 10 mg/ml in einer 1:2-Mischung aus Acetonitril und 0,1 % wässriger Trifluoressigsäure zubereitet wurde. Als Nächstes wurde eine Insulinlösung zubereitet, indem 1 mg Rinderinsulin (Sigma) in 0,1 % wässriger Trifluoressigsäure gelöst wurde. Schließlich wurde eine Insulin/Matrix-Lösung dann durch Mischen von 9 Teilen der Sinipininlösung mit einem Teil der Rinderinsulinlösung zubereitet. Proben wurden für die Analyse zubereitet, indem 1 μl der Insulinmatrixlösung auf das Massenspektrometerziel getupft wurde, gefolgt von dem Tupfen von 1 μl der verdünnten Probe (annähernd 0,1 bis 1 OD pro ml). Dem Instrumentenziel wurde ermöglicht, zu trocknen, bevor es in das Massenspektrometer eingeführt wurde.
TABELLE 1A: Sonden, zubereitet, um PNA-Haarnadeln zu beurteilen

1. CODE ist ein einfaches Mittel, um die Länge komplementärer Nucleobasen an den Amino- und Carboxylenden des PNA-Polymers und die Zahl und Örtlichkeit irgendwelcher flexiblen 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure-Linkereinheiten zu bestimmen. Die Nucleobasen-Sondiersequenz ist dieselbe für alle in der Tabelle aufgelisteten Sonden. Die erste Stelle in dem CODE repräsentiert die Länge des N-terminalen Armsegmentes, welches komplementär ist zu dem C-terminalen Armsegment. Die zweite Stelle in dem CODE repräsentiert die Zahl flexibler Linkereinheiten, welche den N-terminalen Arm an die Nucleobasen-Sondiersequenz koppelt. Die dritte Stelle in dem CODE repräsentiert die Zahl flexibler Linkereinheiten, welche den C-terminalen Arm mit der Nucleobasen-Sondiersequenz koppelt. Die vierte Stelle in dem CODE repräsentiert die Länge des C-terminalen Armsegmentes, welches komplementär ist zu dem N-terminalen Armsegment. Folglich kann der CODE verwendet werden, um per Sicht die allgemeine Struktur der unterschiedlichen, in Tabelle 1 aufgelisteten PNA-Oligomere zu vergleichen.
2. Eine sich entsprechende 4 bp lange Überlappung zwischen den Nucleobasen an den Amin- und Carboxylenden sind in diesem Konstrukt vorhanden, anstelle einer direkt vergleichbaren 3 bp langen Überlappung.

TABELLE 1B: Linear Beacons, zubereitet, um Eigenschaften zu untersuchen
TABELLE 1C: Linear Beacons. zubereitet, um PNA-FISH-Tests zu beurteilen
Für die Tabellen 1A, 1B und 1C sind sämtliche PNA-Sequenzen von dem Amin- zu dem Carboxylende geschrieben. Die Abkürzungen sind: Flu = 5-(6)-Carboxyfluorescein, dabcyl = 4-((4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure, 0 = 8-Amino-3,6-Dioxaoctansäure, K = die Aminosäure L-Lysin und Cy3 ist der von Amersham erhältliche Cyanin-3-Farbstoff.
Beispiel 14: Synthese von DNA-Oligonucleotiden zum Studium
Für diese Studie wurden mit Biotin markierte DNA-Oligonucleotide, die als Nucleinsäuren geeignet sind, umfassend eine Zielsequenz, die komplementär ist zu der PNA-Sondiersequenz der k-ras-PNA-Sonden, entweder unter Verwendung von gewerblich erhältlichen Reagenzien und Instrumenten synthetisiert oder wurden von gewerblichen Verkäufern bezogen. Zusätzlich wurden DNA-Oligomere mit äquivalenter Nucleobasenlänge und Markierungskonfigurationen im Vergleich mit etlichen Linear Beacons unter Verwendung des Dabcyl-Syntheseträgers, erhältlich von Glen Research (P/N 20-5911), und anderen im Handel erhältlichen DNA-Reagenzien und Geräten zubereitet. Die 5(6)-Carboxyfluorescein-Markierung sämtlicher DNAs wurde erhalten unter Verwendung von Fluoredite-Phosphoramidit (PerSeptive Biosystems, Inc., P/N GEN080110). Sämtliche DNAs wurden mittels gewöhnlichen Verfahren gereinigt. Die Sequenzen der zubereiteten DNA-Oligonucleotide sind in den Tabellen 2A und 2B dargestellt. Verfahren und Zubereitungen für die Synthese und die Reinigung von synthetischen DNAs sind Fachleuten wohl bekannt.
TABELLE 2A: DNA-Ziele
Das Nucleinsäureziel ist vom 5'- bis zum 3'-Ende dargestellt.
TABELLE 2B: DNsA mit einer Untereinheitenlänge, die äquivalent ist mit Linear Beacons
Detaillierte strukturelle Analyse von PNA-Oligomeren, die für eine PNA-Molecular-Beacon-Studie zubereitet worden sind
Beispiel 15: Analyse von thermischen Fluoreszenzprofilen
Allgemeines experimentelles Vorgehen:
Es wurden Fluoreszenzmessungen unter Verwendung eines RF-5000-Spektrofluorometers (Shimadzu), das mit einem wasserummantelten Zellhalter (P/N 206-15439, Shimadzu) ausgerüstet war, unter Verwendung einer 1,6ml-Küvette mit 10 mm Weglänge (Starna Cells, Inc.) gemacht. Die Küvettentemperatur wurde unter Verwendung eines zirkulierenden Wasserbades (Neslab) moduliert. Die Temperatur der Küvetteninhalte wurde direkt überwacht unter Verwendung einer Thermoelementsonde (Barnant; Modell Nr. 600-0000), welche unter das Flüssigkeitsniveau eingeführt wurde, indem die Sondenspitze durch die Kappe auf der Küvette (einzeln nach Maß angefertigt) geführt wurde.
Es wurde eine Stammlösung aus HPLC-gereinigtem PNA-Oligomer zubereitet, indem die PNA in 50 % wässrigem N,N'-Dimethylformamid (DMF) gelöst wurde. Aus jeder PNA-Stammlösung wurde eine Lösung aus PNA-Oligomer zubereitet, jede in einer Konzentration von 10 pmol in 1,6 ml Hyb.-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,3 und 100 mM NaCl) durch serielle Verdünnung gereinigter PNA-Stammlösung mit Hyb.-Puffer.
Die Proben wurden bei 493 nm angeregt und die Fluoreszenz bei 521 nm gemessen. Datenpunkte wurden bei zahlreichen Temperaturen gesammelt, während die Küvette erhitzt wurde, und dann wiederum gemessen, während der Küvette ermöglicht wurde, abzukühlen. Allgemein wurde die Badtemperatur nacheinander um 5 °C erhöht und es wurde ihr dann ermöglicht zu äquilibrieren, bevor jeder Datenpunkt aufgenommen wurde. Ähnlich wurde die Badtemperatur nacheinander um 5 °C reduziert und ihr dann erlaubt, zu äquilibrieren, bevor jeder Datenpunkt aufgenommen wurde, um das Kühlprofil zu erzeugen.
Diskussion der Daten:
Von Nucleinsäure-Molecular-Beacons, die eine Haarnadelstruktur bilden, wird erwartet, dass sie eine Zunahme in der Fluoreszenzintensität zeigen, wenn sie erhitzt werden, was in Übereinstimmung steht mit dem Schmelzen des Haarnadelstammes und dem physikalischen Übergang des Sondenstamms von einer Helix zu einer zufälligen Verknäuelung. In Übereinstimmung mit jedem Nucleinsäureschmelzereignis wird von dem Vorgang erwartet werden, dass er reversibel ist und dabei in einer Abnahme der Fluoreszenz nach dem Kühlen der Probe resultiert, verursacht durch die resultierende erneute Ausbildung der helikalen Struktur. Das erwartete Schmelzphänomen ist für Nucleinsäure-Molecular-Beacons dokumentiert, beschrieben von Tyagi et al. (siehe Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14: 303-308 (1996) in 3).
TABELLE 3: Zusammenfassung der in den Experimenten 15-16 zusammengetragenen Daten
Die Ergebnisse der thermischen Fluoreszenzschmelzanalyse der PNA-Oligomere sind in den in Tabelle 3 vorgestellten Daten zusammengefasst und sind grafisch dargestellt in den 1A, 1B1, 1B2, 1B3 und 1C. Mit Bezugnahme auf Tabelle 3 gibt es drei unterschiedliche allgemeine thermische Profile, die für die verschiedenen Konstrukte und unter den untersuchten Bedingungen beobachtet wurden. Diese sind in der Tabelle 3 als Typen A, B und C repräsentiert.
Der thermische Fluoreszenzprofiltyp A wird durch eine Zunahme in der Fluoreszenzintensität nach dem Erhitzen (Schmelzen) und einer korrelierenden Abnahme in der Fluoreszenzintensität nach dem Kühlen (Re-Annealing) charakterisiert. Diese Ergebnisse sind ähnlich zu jenen, die für Nucleinsäure-Molecular-Beacons, welche eine Schleifen- und Haarnadelstammstruktur ausbilden, veröffentlicht worden sind. Folglich steht ein thermisches Fluoreszenzprofil vom Typ A in Übereinstimmung mit der Bildung einer stabilen Haarnadelstamm- und Schleifenstruktur. Von diesem Phänomen wird deswegen angenommen, dass es verursacht wird durch das Schmelzen und Re-Annealing einer Stamm- und Schleifenstruktur in dem PNA-Molecular-Beacon. Die Anmelder behaupten jedoch nur, dass ein thermisches Fluoreszenzprofil vom Typ A kennzeichnend ist für ziemlich reversibles Fluoreszenzlöschen, da andere Strukturen für das beobachtete Phänomen verantwortlich sein könnten.
Vertreter von thermischen Fluoreszenzprofilen des Typs A sind in 1A dargestellt. Die in der Figur präsentierten Daten sind die der PNA-Oligomere .001,.007 und .002. Es werden sowohl Daten für das Schmelzen (offenes Symbol) als auch für das Re-Annealing (gefülltes Symbol) präsentiert. Die sigmoidalen Übergänge stehen in Übereinstimmung mit einem Schmelzen und Re-Annealing einer Duplex.
Das thermische Fluoreszenzprofil vom Typ B ist gekennzeichnet durch eine Zunahme in der Fluoreszenzintensität nach dem Erhitzen (Schmelzen), jedoch keiner wesentlich korrelierenden Abnahme in der Fluoreszenzintensität nach dem Kühlen der Probe. Folglich scheinen unter den untersuchten Bedingungen die Wechselwirkungen, welche anfänglich das Löschen der Fluoreszenz bewirken, nicht leicht reversibel zu sein. Demzufolge legen die Daten nahe, dass ein PNA-Oligomer, das ein thermisches Fluoreszenzprofil vom Typ B zeigt, nicht alle die Eigenschaften eines echten Molecular Beacons zeigt. Nichtsdestotrotz hält ein thermisches Fluoreszenzprofil vom Typ B das PNA-Oligomer nicht davon ab, als ein PNA-Beacon zu funktionieren, wie gesehen durch die Hybridisierungstestdaten.
Vertreter von thermischen Fluoreszenzprofilen vom Typ B sind in den 1B1, 1B2 und 1B3 dargestellt. Die Daten sind in drei Sätzen präsentiert, so dass jede Spur deutlicher gesehen werden kann. Die in den Figuren präsentierten Daten sind die der PNA-Oligomere .010,.008,.009 (1B1),.018,.011A,.017 (1B2) und .003 und .004 (1B3). Es sind sowohl Daten für das Schmelzen (offenes Symbol) als auch das Re-Annealing (gefülltes Symbol) vorgestellt.
Das thermische Fluoreszenzprofil vom Typ C ist durch eine hohe anfängliche Fluoreszenzintensität gekennzeichnet, welche anfänglich abnimmt mit dem Erhitzen und sogar noch weiter abnimmt nach dem Kühlen der Probe. Die hohe anfängliche Fluoreszenzintensität legt nahe, dass dieses Konstrukt das anfängliche Fluoreszenzlöschen nicht ausübt, das mit den meisten der anderen untersuchten PNA-Konstrukte beobachtet wurde. Die konstante Abnahme in der Fluoreszenzintensität nach dem Kühlen ist nicht richtig verstanden.
Nichtsdestotrotz, wie zu sehen ist durch die Daten des Hybridisierungstests, hindert ein thermisches Fluoreszenzprofil vom Typ C das PNA-Oligomer nicht daran, als ein PNA-Beacon zu funktionieren.
Vertreter von thermischen Profilen vom Typ C sind in 1C dargestellt. Die in der 1C vorgestellten Daten sind die der PNA-Oligomere .005 und .006. Es sind sowohl Daten für das Schmelzen (offenes Symbol) als auch das Re-Annealing (gefülltes Symbol) vorgestellt.
Beispiel 16: Analyse der Daten des Hybridisierunsgstests
Allgemeines experimentelles Vorgehen
Sämtliche Hybridisierungstestdaten wurden gesammelt unter Verwendung eines Wallac 1420 VICTOR-Gerätes, ausgerüstet mit einem F485-CW-Lampenfilter und einem F535- Emissionsfilter. Als das Reaktionsgefäß wurde die auseinanderbrechbare NUNC Maxi-Sorp-Mikrotiterplatte verwendet. Jede Mikrotiterplatte wurde mit Hyb.-Puffer bei Raumtemperatur für 15 Minuten vorgewaschen, bevor die Reaktionsbestandteile hinzugefügt wurden. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 100 μl in Hyb.-Puffer.
Es wurde eine Stammlösung aus gereinigter PNA-Sonde zubereitet, indem die PNA in 50 % wässrigem N,N'-Dimethylformamid (DMF) gelöst wurde. Aus dieser PNA-Stammlösung wurde eine Lösung von jeder PNA in einer Konzentration von 25 pmol/l μl durch serielle Verdünnung der PNA-Stammlösung mit 50 % wässrigem DMF zubereitet.
Es wurde eine Stammlösung aus gereinigter wt-k-ras2-DNA zubereitet, indem die gereinigte DNA in TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1,0 mM EDTA, Sigma Chemical) gelöst wurde. Aus dieser DNA-Stammlösung wurde eine Lösung der wt-k-ras2-DNA in einer Konzentration von 100 pmol/99 μl durch serielle Verdünnung der DNA-Stammlösung mit Hyb.-Puffer zubereitet.
Jede für die Analyse verwendete Reaktionsprobe wurde zubereitet, indem 1 μl des geeigneten PNA-Oligomers (25 pmol/μl) mit entweder 99 μl wt-k-ras2-DNA-Stammlösung oder 99 μl Hyb.-Puffer (Kontrolle) kombiniert wurde, wie es notwendig ist, um 100 μl Probe zuzubereiten.
Die Proben wurden vermischt und dann wurde die Fluoreszenzintensität über die Zeit überwacht unter Verwendung des Wallac-VICTOR-Gerätes. Proben wurden dreifach laufen gelassen, um reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen. Daten wurden für 20 bis 25 Minuten gesammelt, nachdem die Reagenzien vermischt worden waren, und dann wurden die Vertiefungen versiegelt und die Platte wurde auf 42 bis 50 °C in einem Inkubationsgerät für 30 bis 40 Minuten erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wurden die Vertiefungen entsiegelt und dann wurden weitere 10 Datenpunkte gesammelt über ungefähr 5 Minuten.
Diskussion der Daten:
Von Nucleinsäure-Molecular-Beacons, die eine Haarnadelstamm- und Schleifenstruktur bilden, wird erwartet, dass sie eine Zunahme in der Fluoreszenzintensität nach der Hybridisierung der Sondiersequenz mit der komplementären Nucleinsäure zeigen. Die erwartete Zunahme in der Fluoreszenzintensität ist für DNA-Molecular-Beacons dokumentiert, beschrieben von Tyagi et al. (siehe Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14: 303-308 (1996)).
Die Ergebnisse der Hybridisierungsanalyse der PNA-Oligomere sind in Tabelle 3 zusammengefasst und sind grafisch in den 2A1, 2A2, 2A3, 2B und 2C präsentiert. Mit Bezugnahme auf Tabelle 3, gibt es drei unterschiedliche allgemeine Hybridisierungsprofile, die für die unterschiedlichen untersuchten Konstrukte beobachtet werden. Diese sind in Tabelle 3 als Typen A, B und C repräsentiert. In 8 ist das Signal-Rausch-Verhältnis (vor und nach dem Erhitzen) für alle untersuchten Sonden grafisch dargestellt, wobei die Absolutwerte auch unterhalb der Figur gezeigt werden.
Das Hybridisierungsprofil vom Typ A ist durch die Zunahme der Fluoreszenzintensität in Proben, die komplementäre Ziel-DNA enthalten, im Vergleich mit Proben, die nur das PNA-Oligomer enthalten, gekennzeichnet. Nach dem Erhitzen steigt die Fluoreszenzintensität von Proben, die Zielsequenz enthalten; die Hintergrund-Fluoreszenz der Kontrollprobe(n) ändert sich jedoch nicht signifikant. Da die PNAs eine sehr niedrigen Eigenfluoreszenz besitzen, haben die Sonden, die ein Hybridisierungsprofil vom Typ A zeigen, allgemein die höchsten Signal-Rausch-Verhältnisse. Vertreter von Typ-A-Hybridisierungsprofilen sind in den 2A1, 2A2 and 2A3 dargestellt. Die Daten sind in zwei unterschiedlichen grafischen Darstellungen vorgestellt, um die Präsentation klarzustellen. Die in den Figuren präsentierten Daten sind die der PNA-Oligomere .001,.007, .010 (2A1),.002,.008,.009 (2A2) und .011A,.017 und .018 (2A3).
Das Hybridisierungsprofil vom Typ B ist durch die sehr schnelle Zunahme in der Fluoreszenzintensität in Proben charakterisiert, die komplementäre Ziel-DNA enthalten, im Vergleich mit Proben, die nur das PNA-Oligomer enthalten. Die Fluoreszenzintensität erreicht schnell ein Plateau, welches sich nach dem Erhitzen nicht signifikant ändert (falls über haupt). Die Hintergrund-Fluoreszenz der Kontrollprobe(n) ändert sich nicht signifikant, sogar nach dem Erhitzen. Dies legt nahe, dass das Hybridisierungsereignis schnell und mit wenig Widerstand ein Bindungsäquilibrium erreicht, ohne irgendein Erfordernis für das Erhitzen. Vertreter von Hybridisierungsprofilen vom Typ B sind in 2B dargestellt. Die in 2B vorgestellten Daten sind die der PNA-Oligomere .018,.003 und .004, obwohl das PNA-Oligomer .018 nicht alle der Eigenschaften eines Typ-B-Hybridisierungsprofils zeigt. Besonders das Signal für die Sonde .018 scheint nach dem Erhitzen (Typ B) nicht zu steigen, sondern die Hybridisierungskinetiken scheinen mehr wie ein Typ-A-Hybridisierungsprofil zu sein.
Die Kontrollsonden .003 und .004 (auf die hierin Bezug genommen wird als "Linear Beacons") üben ein Hybridisierungsprofil vom Typ B aus. Folglich sind die schnellen Hybridisierungskinetiken des Typ-B-Hybridisierungsprofils möglicherweise das Ergebnis dessen, dass sie keinen Haarnadelstamm haben oder irgendeine andere starke Kraft, welche die nicht fluoreszierende Polymerform stabilisieren kann. Nichtsdestotrotz ist der dynamische Bereich (Signal-Rausch-Verhältnis), der in dem Hybridisierungstest dieser Sonden beobachtet wird, typischerweise ziemlich hoch und legt nahe, dass andere Kräfte als die Wasserstoffindung komplementärer Nucleobasen von Armsequenzen die Wechselwirkungen zwischen den Donor- und Akzeptoreinheiten stabilisieren könnten. Die Anmelder beobachteten, dass die Markierung/Markierung-Wechselwirkungen ziemlich stark sein können und ein wichtiger Faktor in diesem überraschenden Ergebnis sein könnten.
Obwohl der Hintergrund (Rauschen) für die .003- und .004-Sonden höher ist im Vergleich mit den .001-,.002-,.007-,.009- und .010-Sonden, ist die Fluoreszenzintensität nach der Hybridisierung höher als jene, die in irgendwelchen bis jetzt untersuchten Sonden beobachtet wurde. Als ein Ergebnis des höheren Hintergrundes haben die PNA-Oligomere .003 und .004 ein sehr günstiges Signal-Rausch-Verhältnis. Dieses S/N-Verhältnis ist nahezu so günstig wie irgendeines (und besser als etliche) der anderen untersuchten PNA-Oligomere, ob sie Armsegmente enthalten oder nicht. Die Daten zeigen, dass es nicht notwendig ist, armbildende Segmente zu haben, um eine Sonde zu schaffen, welche eine anfänglich niedrige Fluoreszenzintensität und eine entsprechende Zunahme im Fluoreszenzsignal nach dem Binden der Sonde an eine Zielsequenz zeigt.
Das Hybridisierungsprofil C ist durch eine mäßige Zunahme in der Fluoreszenzintensität in Proben, die Ziel-DNA enthalten, gekennzeichnet, im Vergleich mit Proben, die nur das PNA-Oligomer enthalten. Die Fluoreszenzintensität erreicht schnell ein Plateau, welches sich nicht signifikant nach dem Erhitzen ändert (falls überhaupt). Die Hintergrund-Fluoreszenz der Kontrollprobe(n) ist vergleichsweise hoch, ändert sich jedoch nicht signifikant sogar nach dem Erhitzen. Die Hybridisierungsprofile B und C unterscheiden sich primär deswegen, da die Hintergrund-Fluoreszenz in den Kontrollproben, die keine Zielnucleinsäure enthalten, im Hybridisierungsprofil vom Typ C dramatisch höher ist. Die für Proben, welche komplementäre Nucleinsäure enthalten, erhaltenen Hybridisierungsdaten legen nahe, dass das Hybridisierungsereignis schnell und mit nur geringem Widerstand ein Äquilibrium erreicht. Das sehr hohe Hintergrundsignal legt jedoch nahe, dass Kräfte, welche die Donor- und Akzeptoreinheiten in enger Nachbarschaft halten sollten, in diesen Konstrukten nicht stark genug sind, um wirksam das Fluoreszenzsignal zu löschen. Als eine Folge der moderaten Zunahme in der Fluoreszenz nach dem Binden an die Zielsequenz und die höhere als übliche Eigenfluoreszenz, hat ein PNA-Molecular-Beacon, welches ein Hybridisierungsprofil vom Typ C zeigt, ein sehr niedriges Signal-Rausch-Verhältnis. Vertreter von Typ-C-Hybridisierungsprofilen sind in 2C dargestellt. Die in 2C vorgestellten Daten sind die der PNA-Oligomere .006 bzw. 005.
Zusammenfassung der in den Beispielen 15-16 vorgestellten Daten
Das überraschendste Ergebnis aller von den Anmeldern durchgeführten Experimente ist, dass sämtliche der untersuchten PNA-Oligomere, einschließlich der Kontrollsonden .003 und .004, welche keine armbildenden Segmente haben, eine Korrelation zwischen einer erhöhten Fluoreszenzintensität und der Bindung der Sonde an die Zielsequenz zeigen. Folglich ist es nicht entscheidend, PNAs so zu gestalten, dass sie armbildende Segmente zu besitzen, um dadurch Konstrukte zu erzielen, die eine sehr niedrige Eigenfluoreszenz besitzen, die jedoch hochfluoreszierend nach der Hybridisierung mit einer Zielsequenz werden. Dies ist ein sehr überraschendes Ergebnis im Lichte der Lehren mit Bezug auf Nucleinsäure-Molecular-Beacons. Folglich können die Linear Beacons dieser Erfindung verwendet werden, um Zielsequenzen zu detektierten, zu identifizieren oder zu quantifizie ren, ohne irgendein Erfordernis, dass Überschusssonden vor der Detektion von dem Sonden/Zielsequenz-Komplex abgetrennt werden.
Beispiel 17: Korrelation der Linear-Beacon-Länge mit dem Rauschen (Hintergrund-Fluoreszenz)
Für dieses Beispiel wurden sowohl DNA- als auch PNA-Sonden verglichen, um zu bestimmen, welche Wirkung Längenvariationen auf das Rauschen (Grund- oder Hintergrund-Fluoreszenz) natürlicher Sonden haben würde. Vergleiche wurden gemacht bezüglich Änderungen in der Ionenstärke (und einer geringen Änderung im pH-Wert), Änderungen in der Art des Donor/Akzeptor-Paares und der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium.
Materialien und Methoden:
Die PNA-Sonden PNA003-11, PNA003-13, PNA003-15, PNA003-17 und Cy3PNA003-.15 (siehe Tabelle 1B) und die DNA-Sonden DNA003-11, DNA003-13, DNA003-15 und DNA003-17 (siehe Tabelle 2B) wurden zubereitet, wie beschrieben. Die gereinigten Sonden wurden in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1 mM EDTA) auf eine Konzentration von 25 pmol/μl verdünnt und dann auf 25 pmol/1,6 ml mit entweder Puffer A, B oder C verdünnt. Proben dieser Sonden wurden dreifach zubereitet und jede 1,6ml-Probe wurde unter Verwendung eines Spektrofluorometers Shimadzu RF 5000 und einer Zelle mit einer Weglänge von 10 mm analysiert. Für mit Fluorescein markierte Oligomere wurde die Exzitationswellenlänge auf 493 nm gesetzt und die Daten wurden für eine Emission bei 520 nm aufgenommen. Für mit Cy3 markierte Oligomere wurde die Exzitationswellenlänge auf 545 nm gesetzt und die Daten wurden für die Emission bei 560 nm aufgenommen. Sämtliche gesammelten Daten wurden in relativen Lichteinheiten (RLU) aufgenommen.
Der Hintergrund jeder Sonde wurde in jedem der Puffer A, B und C untersucht. Die Ergebnisse der dreifachen Analysen wurden gemittelt und die erhaltenen Daten sind in 3 grafisch dargestellt, wobei der Absolutwert für die durchschnittlichen RLU an der Spitze jeder Säule vorgestellt sind. Mit Bezugnahme auf 3 sind die Daten in Puffer A, B und C für jede untersuchte Sonde gruppiert. Mit der Ausnahme der Cy3PNA003-15-Sonde wurden alle PNAs am N-Terminus mit 5(6)-Carboxyfluorescein und am C-Terminus mit Dabcyl markiert. Die Cy3PNA003-15-Sonde unterschied sich von PNA003-15 dahingehend, dass Cy3 5(6)-Carboxyfluorescein ersetzte. Sämtliche DNAs wurden am 5'-Ende mit 5(6)-Carboxyfluorescein und am 3'-Ende mit Dabcyl markiert. Mit den gegebenen, im Handel erhältlichen Chemikalien wurde der Versuch unternommen, sicherzustellen, dass Markierungstypen und Markierungsabstände der DNA- und PNA-Sonden so vergleichbar als vernünftigerweise möglich waren.
Pufferzusammensetzungen:

Puffer A: 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 5 mM MgCl₂.
Puffer B: 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0.
Puffer C: 15 mM Tris-Cl, pH 8,3, 100 mM NaCl.

Ergebnisse und Diskussion:
Mit Bezugnahme auf 3, werden die Daten für die mit Fluorescein/Dabcyl markierten DNA-Sonden mit einer Länge von 11, 13, 15 und 17 Untereinheiten auf der linken Seite vorgestellt. Bei einem kursorischen Überblick über die Daten gibt es eine deutliche Korrelation zwischen der Länge der DNA-Oligonucleotide und der Menge des Rauschens (Hintergrund). Spezifisch und ohne Rücksicht auf die Pufferart stieg das Rauschen wesentlich mit jeder Zunahme von zwei Untereinheiten des DNA-Oligomers an. Diese Beobachtung passt gut zu den Berichten von Mayrand et al. (siehe US 5,691,146 , Sp. 7, Z. 8-24), Mathies et al. (siehe US 5,707,804 in Sp. 7, Z. 21-25) und Nazarenko et al. (siehe Nucl. Acids Res., 25, auf S. 2516, Sp. 2, Z. 36-40).
Hinsichtlich spezifischer Pufferwirkungen war für sämtliche DNA-Oligomere das in Puffer A beobachtete Rauschen wesentlich niedriger als jenes, das beobachtet wurde, wenn sich die Sonde in den Puffern B oder C befand. Da die Puffer A und B von einer vergleichbaren Ionenstärke sind, reduzierte klar die Anwesenheit von Magnesium in Puffer A wesentlich das Rauschen sämtlicher Sonden. Obwohl die Puffer B und C sich wesentlich in der Ionen stärke unterschieden und kaum unterschiedlich waren im pH-Wert, wurde nur eine geringe Zunahme im Rauschen mit der Änderung von Puffer B zu Puffer C beobachtet. Diese Änderung ist wahrscheinlicher das Ergebnis des pH-Anstieges, da Fluorescein eine höhere Quantensausbeute bei höherem pH-Wert haben wird. Folglich liegt wahrscheinlich nur wenig der Zunahme im Rauschen, das zwischen den Puffern B und C beobachtet worden war, an der Zunahme in der Ionenstärke.
Zusammenfassend scheinen Magnesiumgehalt und Oligomerlänge eine wesentliche Wirkung auf das Rauschen (Hintergrund-Fluoreszenz) von DNA-Sonden zu haben, wohingegen Variationen in der Ionenstärke der Sondenumgebung einen geringeren Einfluss auf das Rauschen auszuüben scheinen.
Mit Bezugnahme auf 3 sind die Daten für die markierten PNA-Sonden mit einer Länge von 11, 13, 15 und 17 Untereinheiten auf der rechten Seite vorgestellt. Bei einem kursorischen Überblick über die Daten gibt es einen viel geringeren Unterschied zwischen dem für die Sonden mit unterschiedlicher Länge beobachteten Rauschen (Hintergrund). Weiterhin gibt es keine deutliche Beziehung zwischen der Sondenlänge und der Rauschintensität, anders als bei DNA.
Hinsichtlich spezifischer Puffereffekte war am dramatischsten die Beständigkeit des Hintergrunds, ungeachtet der Art des Puffers. Obwohl es geringere Unterschiede gab, war der absolute Unterschied im Rauschen (Hintergrund-Fluoreszenz), das in jedem der drei Puffer gemessen worden war, bemerkenswert gering im Vergleich mit den DNA-Sonden. Folglich wurde gefunden, dass das Rauschen von PNA-Sonden ziemlich unabhängig von der Länge der Sonde, der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium und der Ionenstärke des Puffers war. Wiederum ist der geringe Anstieg im Rauschen zwischen den Puffern B und C wahrscheinlich eine pH-Wirkung.
Die Daten für die PNA-Sonde Cy3PNA003-15 können am wirksamsten mit den Daten für die PNA-Sonde PNA003-15 verglichen werden, da sich nur die Donor-Fluorophore (Fluorescein zu Cy3) unterscheiden. Obwohl die Intensität des Rauschens (Hintergrund) nicht direkt korreliert werden kann, da sich die Emissions- und Exzitationswellenlängen, die verwendet werden, um die Fluorescein- und Cy3-Farbstoffe zu untersuchen, wesentlich unterscheiden, gibt es für dieses Linear Beacon annähernd keinen relativen Unterschied im Rauschen in jedem der drei untersuchten Puffer. Am bemerkenswertesten ist, dass es keinen wesentlichen Unterschied zwischen den Daten für die Puffer B und C gibt. Dies unterstützt das Argument, dass die Zunahmen im Rauschen, das für die Fluoresceinsonden beobachtet wurde, am wahrscheinlichsten ein pH-Effekt ist, da die Quantenausbeute von Cy3 von den geringen Unterschieden im pH-Wert weniger angegriffen werden sollte. Weiterhin zeigen die vergleichsweise geringen Hintergründe für die Linear Beacons unter fluorophor-optimierten Bedingungen, da optimale Exzitations- und Emissionswellenlängen sowohl für die Fluorescein- als auch für die Cy3-Fluorophore für die Untersuchung verwendet worden sind, dass das substanzielle Löschen der Fluoreszenz für beide Sonden geschieht, ungeachtet der Art der spektralen Eigenschaften des Donor-Fluorophors und Akzeptorlöschers. Als Ganzes genommen zeigen die Daten, dass das Rauschen der PNA-Sonden im Wesentlichen unabhängig ist von der Sondenlänge, der Ionenstärke, der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium und der spektralen Eigenschaften des Beacon-Satzes.
Zusammengefasst, ist für PNA-Sonden das Rauschen im Wesentlichen unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium, der Oligomerlänge und der Ionenstärke im Vergleich mit DNA-Sonden mit der ähnlichsten Längen- und Markierungskonfiguration. Linear Beacons besitzen auch die ungewöhnliche Eigenschaft, dass Energietransfer geschehen kann, ungeachtet der Art der spektralen Eigenschaften des Beacon-Satzes, wodurch gezeigt wird, dass der Energietransfer wahrscheinlich primär durch Kontakt und nicht durch FRET geschieht. Nichtsdestotrotz belegen diese Daten eine deutliche Unterscheidung in der Struktur und Funktion zwischen den untersuchten PNA-Sonden und den DNA-Sonden.
Beispiel 18: Korrelation der Linear-Beacon-Länge mit dem Signal-Rausch-Verhältnis in einem Hybridisierungstest
Für dieses Beispiel wurden sowohl DNA- als auch PNA-Sonden verglichen, um zu bestimmen, welche Wirkungen Längenvariationen auf das Signal-Rausch-Verhältnis der nativen Sonde haben würde, worin das Signal-Rausch-Verhältnis von dem in der Anwesenheit von Zielsequenzen erzeugten Signal abgeleitet wird im Vergleich mit dem Rauschen oder der Hintergrund-Fluoreszenz der Sonde in der Abwesenheit von Zielsequenz. Es wurden Vergleiche gemacht hinsichtlich Änderungen in der Sondenlänge, Ionenstärke, Änderungen in der Art des Donor/Akzeptor-Paares und in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium. Auf einem praktischen Niveau unterschieden sich diese Daten von jenen in Beispiel 17 vorgestellten, da sie die relative Erscheinung der Sonden in einem Hybridisierungstest vergleichen. Zu Gunsten der Kürze sind nur die Daten für die 11-mer und 15-mer DNAs und PNAs vorgestellt.
Materialien und Methoden:
Es wurden die PNA-Sonden PNA003-11, PNA003-15, Cy3PNA003-15 (siehe Tabelle 1B) und die DNA-Sonden DNA003-11 und DNA003-15 (siehe Tabelle 2B) zubereitet, wie beschrieben. Die gereinigten Sonden wurden in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1 mM EDTA) auf eine Konzentration von 25 pmol/μl verdünnt und dann wurde diese Stammlösung weiter verdünnt auf 25 pmol/50 μl mit einem der Puffer A, B oder C. Die Zusammensetzungen der Puffer A, B und C sind in Beispiel 17 beschrieben. Proben von 50 μl jeder Sonde in dem geeigneten Puffer wurden in jede von sechs Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte gegeben, so dass für jede Sonde drei Hybridisierungsreaktionen und drei negative Kontrollreaktionen (verwendet, um das Rauschen oder die Hintergrund-Fluoreszenz zu messen) durchgeführt wurden. Für jede der Hybridisierungsreaktionen wurden 50 μl Ziel-DNA (wt k-ras, Tabelle 2A), die durch Verdünnung der Ziel-DNA in TE-Puffer auf 100 pmol/μl und anschließende Verdünnung dieser Stammlösung auf 25 pmo/μl mit jedem der Puffer A, B oder C zubereitet worden war, zu jeder Reaktion hinzugefügt. Für jede Kontrolle wurden 50 μl von einem der Puffer A, B oder C hinzugefügt. Als eine Folge der Zeit, die notwendig war, um die Inhalte der Vertiefungen zu pipettieren und zu vermischen, wurden sämtliche Reaktionen für annähernd eine Minute vor dem ersten Fluoreszenzlesen vermischt. Sämtliche Hybridisierungsreaktionen wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt.
Hybridisierungsdaten wurden unter Verwendung eines Wallac 1420 Victor Multilabel-Zählgerätes gesammelt. Es wurde die Fluoreszenzintensität jeder Vertiefung für 0,1 Sekunden gemessen. Für sämtliche Proben wurden 40 Messungen über einen Zeitraum von annähernd 30 Minuten getätigt. Folglich wurde die Zeitabhängigkeit der Signal-Rausch-Verhältnisse aus den über den 30-Minuten-Zeitraum gesammelten Daten abgeleitet. Die Signal-Rausch-Verhältnisse, abgeleitet von dem Durchschnitt der drei Hybridisierungsreaktionen im Vergleich mit den Kontrollreaktionen, wird vorgestellt für:
1) die DNA- und PNA-11-mere in den 4A und 4B, 2) die DNA- und PNA-15-mere in den 4C und 4D und 3) die 15-mer-PNA-Sonde Cy3PNA003-15 in 4E.
Ergebnisse und Diskussion:
Mit Bezugnahme auf 4A, werden Signal-Rausch-Verhältnisse für die 30 Minuten der Daten, die für das DNA-11-mer in jedem der Puffer A, B und C gesammelt wurden, vorgestellt. Da ein Signal-Rausch-Verhältnis von 1 kein Signal anzeigt, ist das bemerkenswerteste Ergebnis das Fehlen jegliches Signals, wenn Puffer B verwendet wird. Im Vergleich dazu, resultieren die Zugabe von Magnesium (Puffer A) oder die Zunahme der Ionenstärke und des pH-Wertes (Puffer C) in einer wesentlichen Verbesserung im Signal-Rausch-Verhältnis. Weiterhin ist die Zunahmerate im Signal-Rausch-Verhältnis über die Zeit ziemlich verschieden und kann verwendet werden, um Kinetiken der Hybridisierungsraten zu überwachen.
Das für das PNA-11-mer in sämtlichen Puffern erhaltene Signal-Rausch-Verhältnis ist grafisch in 4B vorgestellt. Im Vergleich zu dem DNA-11-mer wurde ein Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als 1 unter sämtlichen untersuchten Bedingungen erhalten. Ferner gab es einen weniger dynamischen Bereich in dem Signal-Rausch-Verhältnis für jeden der drei untersuchten Puffer (der Bereich des S/N für das DNA-11-mer bei 30 Minuten war ungefähr 1 bis 14, wohingegen der Bereich von S/N für das PNA-11-mer bei 30 Minuten ungefähr 3 bis 6 war). Folglich scheint das Signal-Rausch-Verhältnis für das PNA-11-mer im Vergleich zu dem DNA-11-mer ziemlich unabhängig von der Ionenstärke seiner Umgebung zu sein, obwohl es wenigstens einen gewissen Anstieg gibt, der dem Wechsel zwischen den Puffern B und C zugeschrieben werden kann. Ferner scheint das Signal-Rausch- Verhältnis des PNA-11-mers vollständig unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium zu sein, da die Daten für die Puffer A und B im Wesentlichen dieselben sind.
Zusätzlich gibt es einen sehr geringen Anstieg im Signal-Rausch-Verhältnis für das PNA-11-mer gegenüber der Zeit. Folglich legen die Daten nahe, dass die Hybridisierungskinetiken des Linear Beacons PNA003.11 äußerst schnell in sämtlichen untersuchten Puffern sind und dass die Hybridisierung innerhalb der ersten wenigen Minuten der Reaktion fast ein Äquilibrium erreicht hat.
Mit Bezugnahme auf die 4C und 4D sind die Daten für die DNA- bzw. PNA-15-mere grafisch dargestellt. Allgemein sind alle die für die 15-mere gewonnenen Daten parallel mit jenen für die 11-mere. Genauer ist das Signal-Rausch-Verhältnis für das DNA-15-mer in Puffer B1, wodurch angezeigt wird, dass keine Hybridisierung innerhalb der Grenzen des Experimentes nachgewiesen wird. In den Puffern A und C ergibt das DNA-15-mer ein Signal-Rausch-Verhältnis, das mit der Zeit ansteigt, so dass die Hybridisierungskinetiken durch Datenanalyse bestimmt werden können. Zusätzlich liegt der dynamische Bereich des Signal-Rausch-Verhältnisses für das DNA-15-mer in den Puffern A und C zwischen 6 und 11 im Vergleich zu dem PNA-15-mer, bei dem das Signal-Rausch-Verhältnis ungefähr 7 bis 13 ist.
Insgesamt genommen, belegen die Daten, dass das Signal-Rausch-Verhältnis des PNA-15-mers ziemlich unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium ist, da die Daten im Wesentlichen dieselben für die Puffer A und B sind. Weiterhin scheint das Signal-Rausch-Verhältnis für das PNA-15-mer im Vergleich zu dem DNA-15-mer ziemlich unabhängig von der Ionenstärke seiner Umgebung zu sein, obwohl es wenigstens einen gewissen Anstieg gibt, der dem Wechsel zwischen den Puffern B und C zugeschrieben werden kann. Schließlich legen die Daten nahe, dass die Hybridisierungskinetiken des Linear Beacons PNA003-15 extrem schnell in sämtlichen untersuchten Puffern sind, da die Hybridisierung innerhalb der ersten wenigen Minuten der Reaktion nahezu ein Äquilibrium erreicht hat, im Vergleich zu den Hybridisierungskinetiken des DNA-15-mers, die wesentlich langsamer sind.
Mit Bezugnahme auf 4E werden die Signal-Rausch-Daten für das mit Cy3 markierte PNA-15-mer Cy3PNA003-15 vorgestellt. Die Daten für diese Sonde können am effektivsten mit den Daten für die PNA-Sonde PNA003-15 verglichen werden, da nur der Donor-Fluorophor (Fluorescein zu Cy3) geändert wurde. Ein kursorischer Überblick über die Daten zeigt, dass wiederum mit allen drei Puffern ein positives Signal-Rausch-Verhältnis erhalten wird. Der dynamische Bereich des Signal-Rausch-Verhältnisses liegt ungefähr bei 6 bis 11, was gut zu den Daten für PNA003-15 passt, wodurch gezeigt wird, dass es keine wesentliche Abhängigkeit von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium oder eine wesentliche Abhängigkeit von der Ionenstärke gibt. Weiterhin belegen die Daten klar, dass keine substanzielle Überlappung zwischen der Emission der Donoreinheit und der Extinktion der Akzeptoreinheit in einem Linear Beacon benötigt wird, da das Signal-Rausch-Verhältnis im Wesentlichen dasselbe sowohl für PNA003-15 als auch für Cy3PNA003-15 ist, trotz den sehr unterschiedlichen spektralen Eigenschaften der Fluorescein- oder Cy3-Donoreinheiten des Donor/Akzeptor-Paares (Beacon-Satz).
Kurioserweise übertreffen jedoch die Puffer A und B Puffer C für die PNA-Sonde Cy3PNA003-15. Dieses Ergebnis ist wesentlich unterschiedlich von jenem, das mit sämtlichen der fluorescein-markierten Sonden (DNA oder PNA) beobachtet wurde. Folglich legten die Daten nahe, dass die Art der Markierungen oder des Markierungspaares (Beacon-Satz) der signifikanteste Faktor sein könnte, der den dynamischen Bereich der Signal-Rausch-Verhältnisse, die für eine einzelne Sonde in den unterschiedlichen Puffern beobachtet wurde, beeinflusst. Diese Daten tendieren dazu, nahe zu legen, dass der größte Teil des dynamischen Bereiches im Signal-Rausch-Verhältnis mit der Art der Markierungen in Beziehung gesetzt werden könnte, wodurch weiter das Argument verstärkt würde, dass die Struktur und Funktion von Linear Beacons im Vergleich mit DNA-Sonden ziemlich unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium und der Ionenstärke der Umgebung ist, da der größte Teil des dynamischen Bereiches, der in unterschiedlichen Puffern beobachtet wurde, wahrscheinlich der Art der Markierungen und nicht der Struktur oder Funktion des Linear Beacons zugeschrieben werden kann. Im Vergleich dazu zeigt der breite dynamische Bereich des Signal-Rausch-Verhältnisses und die Längenabhängigkeit des Rauschens (siehe Beispiel 17), was für die DNA-Sonden beobachtet wurde, dass die Zusammensetzung der Umgebung eine wesentliche Wirkung auf die Struktur und Funktion einer DNA-Sonde haben kann.
Beispiel 19: Nachweis von PCR-Amplicons unter Verwendung von Linear Beacons
Für dieses Beispiel wurde asymmetrische PCR für den Vergleich mit traditioneller PCR ausgewertet, da asymmetrische PCR einen signifikanten Überschuss einzelsträngiger Nucleinsäure ergibt. Da es durch die wohl überlegte Anpassung des Verhältnisses der 5'- und 3'-Primer möglich ist, zu wählen, welche der Stränge des Amplicons vorzugsweise amplifiziert werden, war es möglich, den Test so zu gestalten, dass die Zielsequenz, mit der das Linear Beacon hybridisiert, in der überproduzierten, einzelsträngigen Nucleinsäure des asymmetrischen PCR-Tests enthalten war.
Folglich wurde ein Linear Beacon gestaltet, um mit einem der Stränge eines Bereichs von dsDNA, die amplifiziert werden soll, zu hybridisieren. Das Linear Beacon wurde zu dem PCR-Cocktail vor dem Thermocycling hinzugefügt. Obwohl Linear Beacons mit der Zielsequenz während dem Thermocycling hybridisieren können, wurde eine signifikante Inhibition des Amplifikationsvorgangs nicht beobachtet. Folglich wurde die PCR-Amplifikation erfolgreich unter Verwendung des nachweisbaren Fluoreszenzsignales des Linear Beacons überwacht, welches in Antwort auf die Aktivität der PCR-Reaktion erzeugt worden war. Die vorgestellten Daten zeigen schlüssig die Durchführbarkeit der Verwendung von Linear Beacons für den Nachweis amplifizierter Nucleinsäure in einem Closed-Tube- (homogenen) Test, unabhängig davon, ob traditionelle oder asymmetrische PCR verwendet worden war.
Materialien und Methoden:
PCR-Reaktionen wurden in Mini-Eppendorf-Röhrchen in einem Perkin-Elmer-2400-Thermocycler durchgeführt. Das PCR-Protokoll schloss ein 5 Sekunden dauerndes Aufwärmen auf 94 °C (nur erster Zyklus), gefolgt von der Denaturierung bei 94 °C für 5 Sekunden, der Doppelstrangbildung bei 55 °C für 30 Sekunden und der Verlängerung bei 74 °C für 30 Sekunden, ein. Der Denaturierungs-Doppelstrangbildungs-Verlängerungs-Zyklus wurde für 45 Zyklen wiederholt. Proben von 10 μl wurden aus jeder PCR-Reaktion am Ende des 30 Sekunden dauernden Verlängerungsschrittes in den Zyklen 30, 35, 40 und 45 entnommen. Sämtliche 10μl-Proben wurden in eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit konischem Boden gegeben und die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Wallac 1420 Victor^TM Multilabel-Plattenlesegerätes überprüft. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität wurde in relativen Lichteinheiten (RLU) über 1,0 Sekunden aufgenommen (Exzitationsfilterwellenlänge 485 nm; Emissionsfilterwellenlänge 535 nm).
Sämtliche PCR-Reaktionen wurden aus einem einzelnen "Mastermix" abgeleitet, zu welchem entweder Plasmid (für positive Reaktionen) oder Plasmidpuffer (negative Reaktionen) hinzugefügt worden war. Es wurden PCR-Reaktionen zubereitet, die 1 μl Plasmid-DNA oder Plasmidpuffer (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) als eine Kontrolle, 50 pMol des 5'-Primers, variable Mengen des 3'-Primers, wie unten beschrieben, 1 μl 10 pmol/μl Linear Beacon, PNA003.MU (Tabelle 1B) in 50 % wässrigem N,N'-Dimethylformamid, 3 mM MgCl₂, 250 μM ATP, 250 μM CTP, 250 μM GTP, 250 μM TTP, 2,85 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase, 50 mM KCl und 10 mM TRIS-HCl, pH 8,3, in einem Gesamtvolumen von 50 μl enthielten. Das Verhältnis des 5'-Primers zum 3'-Primer war entweder 1:1 (50 pMol 3'-Primer), 10:1 (5 pMol 3'-Primer) oder 100:1 (0,5 pMol 3'-Primer).
Das Plasmid pKRASMU wurde durch Klonieren eines PCR-Amplicons aus menschlicher DNA in das pCR2.1-Plasmid (Invitrogen) erzeugt. Die menschliche DNA wurde aus einer Zelllinie Calu-1 zubereitet, welche eine Punktmutation an der Base 129 des K-ras-Gens enthält. Die Klone wurden durch Restriktionsfragmentanalyse gescreent und sequenziert. Große Zubereitungen des Plasmids wurden erzeugt und quantifiziert unter Verwendung von Standardtechniken. Der amplifizierte Bereich flankiert die K-ras-Mutation und war 111 bp lang. PCR-Reaktionen, die nicht dem Thermocycling unterzogen worden waren, wurden als Fluoreszenzkontrollen verwendet.
Sonden und Primer und Ziele:

5'-Primer 5' ATGACTGAATATAAACTTGT 3' Seq. ID Nr. 7
3'-Primer 5' CTCTATTGTTGGATCATATT 3' Seq. ID Nr. 8

dsDNA-Matrize (nur der amplifizierte Bereich)
Wie oben erläutert, wurde das Linear Beacon PNA003.MU so gestaltet, dass es nicht mit den Primerbereichen überlappt.
Ergebnisse und Diskussion:
Tabelle 4 stellt die Fluoreszenzdaten, die für PCR-Reaktionen bei den Zyklen 30, 35, 40 und 45 aufgenommen wurden. Für die Bequemlichkeit der Diskussion wurden den Tabellenzeilen die Nummern 1 bis 6 zugeschrieben und den Spalten die Buchstaben A bis G.
Der durchschnittliche Hintergrund aus Kontrollen, die keinem Thermocycling unterzogen worden waren, wurde von den in der Tabelle vorgestellten Daten subtrahiert. Tabelle 4: PCR-Daten
Mit Bezugnahme auf Tabelle 4, sind die Verhältnisse der 5'- bzw. 3'-Primer, die in jedem Test verwendet worden waren, in Zeile 1 aufgelistet. Das in Zeile 2 der Tabelle zu findende Symbol wurde verwendet, um die Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (-) von 1 fMol des pKRASMU-Plasmids (PCR-Matrize) in jedem Test anzuzeigen. Die Zeilen 3 bis 6 der Spalte A zeigen die Gesamtzahl an Zyklen (Rnds) an, die durchgeführt wurden, um die vorgestellten Daten zu erzeugen.
Die Daten für Reaktionen, die keine Matrize enthalten (Spalten B, D und F) liegen im Bereich von Werten von -280 bis 636, mit einem Durchschnitt von 338, wohingegen die Daten für die Reaktionen, die Matrize enthielten (Spalten C, E und G), in allen Fällen signifikant höher sind, mit der Ausnahme von Zeile 3, Spalte G. Zusätzlich zeigt die Intensität der Fluoreszenz von Proben, die Matrize enthielten, eine Korrelation zwischen dem Verhältnis der Primer und der Anzahl der PCR-Zyklen. Zum Beispiel zeigten die Daten für eine Standard-PCR-Reaktion (Spalte C), wo äquivalente Mengen von 5'- und 3'-Primern verwendet worden sind, eine ziemlich konsistente Fluoreszenzintensität bei sämtlichen Zyklen, für welche Daten aufgenommen worden waren. Im Vergleich dazu war die Fluoreszenz für asymmetrische PCR (Spalte E), worin das Verhältnis des 5'-Primers zum 3'-Primer 10:1 war, wesentlich intensiver. Diese Daten legen nahe, dass das 10:1-Verhältnis des 5'-Primers zum 3'-Primer die robuste Amplifikation erleichtert, welche signifikant die in der Zielsequenz enthaltene einzelsträngige Nucleinsäure überexprimiert.
Die Fluoreszenz für die asymmetrische PCR (Spalte G), worin das Verhältnis des 5'-Primers zum 3'-Primer 100:1 war, war nicht so intensiv im Vergleich mit den Daten in Spalte G. Die asymmetrische PCR zeigte jedoch eine deutliche Korrelation zwischen der steigenden Anzahl von PCR-Zyklen und der Intensität der Fluoreszenz. Die in einem Primer-Verhältnis von 100:1 beobachtete niedrigere Fluoreszenz ist wahrscheinlich das Ergebnis eines niedrigeren Gesamtvorkommens an Zielsequenz, die einzelsträngige Nucleinsäure enthält, was dadurch verursacht wird, dass zehnmal weniger 3'-Primer in den anfänglichen Zyklen der PCR-Amplifikationsreaktion anwesend ist im Vergleich mit der Probe, deren Daten in Spalte E vorgestellt sind.
5 ist eine Digitalaufnahme eines Fotos der Probe (~ 10 μl), die in den Röhrchen 3 und 4 nach 45 PCR-Zyklen verblieben war. Röhrchen 3 (links) entspricht den in Zeile 6, Spalte D, vorgestellten Daten und Röhrchen 4 (rechts) entspricht den in Zeile 6, Spalte E, vorgestellten Daten. Das Foto wurde unter einem UV-Transilluminator aufgenommen. Röhrchen 4, welches Matrize enthielt, ist durch die visuelle Ansicht fluoreszierend, wohingegen Röhrchen 3, welches eine Kontrolle war, das keine Matrize enthielt, nicht sichtbar fluoreszierend ist, wodurch ein negatives Ergebnis durch die bloße visuelle Inspektion bestätigt wurde.
Insgesamt genommen, belegen die in diesem Beispiel vorgestellten Daten, dass Linear Beacons verwendet werden können, um Nucleinsäure nachzuweisen, die in einem Closed-Tube- (homogenen) Test amplifiziert worden war. Für asymmetrische PCR-Reaktionen war die Intensität des Fluoreszenzsignals nicht nur wesentlich höher, sondern von asymmetrischer PCR wurde gezeigt, dass es eine Korrelation zwischen der Anzahl der durchgeführten Zyklen und der Signalintensität ausübt. Folglich war die Quantifizierung amplifizierter Nucleinsäuren unter Verwendung dieses Verfahrens möglich.
Beispiel 20: PNA-FISH mit Linear Beacons
Es wurden einzelne drei ml-Kulturen an Bakterien über Nacht in Tryptic Soy Broth (TSB) bei 30 °C wachsen gelassen. Es wurde der OD₆₀₀-Wert jeder Probe gemessen und dann wurde jede Kultur in frischer TSB auf einen OD₆₀₀-Wert von 0,5 verdünnt. Den Kulturen wurde ermöglicht, sich vor der Ernte drei- bis viermal zu verdoppeln. Zellen aus einer 20ml-Kultur wurden durch Zentrifugation bei 8000 rpm für 5 Minuten pelletiert, in 20 ml PBS (7 mM Na₂HPO₄, 3 mM NaH₂PO₄,130 mM NaCl) resuspendiert, wiederum pelletiert und in Fixierpuffer (3 % Paraformaldehyd in PBS) resuspendiert. Die Bakterien wurden bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Minuten inkubiert, bevor sie wiederum pelletiert wurden (Zentrifugation bei 8000 rpm für 5 Minuten), und sie wurden nach dem Entfernen der Fixierungslösung in 20 ml 50 % wässrigem Ethanol resuspendiert. Die fixierten Bakterien können entweder nach 30 minütiger Inkubation bei Umgebungstemperatur verwendet werden oder bei -20 °C für etliche Wochen vor der Verwendung gelagert werden.
Für jeden Test wurden 10 μl fixierte Zellen in 50 % wässrigem Ethanol in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei 8000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Das wässrige Ethanol wurde dann entfernt und das Pellet wurde in 100 μl steriler PBS resuspendiert und wiederum durch Zentrifugation bei 8000 rpm für 5 Minuten pelletiert. Die PBS wurde von dem Pellet entfernt und die Zellen wurden in 100 μl Hybridisierungspuffer (25 mM Tris-HCl, pH 9,0, 100 mM NaCl, 0,5 % SDS) resuspendiert, welcher die geeigneten Linear Beacon(s) in einer Konzentration von annähernd 30 pmol/ml enthielt. Die Hybridisierungsreaktion wurde bei 50 °C für 30 Minuten durchgeführt. Die Linear Beacons und ihre Zielorganismen sind in Tabelle 1C aufgelistet. Die Pseudomonas-Sonden wurden in einer Mischung von 1:1 für jede Hybridisierung verwendet, worin die Konzentration jeder Sonde 30 pmol/ml in jeder Hybridisierungsreaktion war.
Die Probe wurde dann bei 8000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Hybridisierungspuffer wurde entfernt und die Zellen wurden in 100 μl steriler TE-9,0 (10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 1 M EDTA) resuspendiert. Eine Aliquote von 2 μl dieser Suspension an Zellen wurde auf einen Glasträger gegeben, ausgestrichen und es wurde ihr ermöglicht, zu trocknen. Als Letztes wurden 2 μl Vectashield (Vector Laboratories, P/N H-1000) über den getrockneten Zellen aufgetragen und ein Deckglas wurde hinzugefügt und seine Position unter Verwendung von etlichen Tropfen Nagellack fixiert.
Die Objektträger wurden unter Verwendung eines Nikon-Fluoreszenz-Mikroskops, ausgestattet mit einem 60 ×Immersionsölobjektiv, einem 10 × Okular (Totalvergrößerung 600-fach) und mit Omega Optical (XF22 (grün) und XF34 (rot)) Lichtfiltern, gesichtet. Es wurden elektronische Digitalaufnahmen von Teilen der Objektträger gemacht unter Verwendung einer Spot-CCD-Kamera und von Software, erhalten von Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI (USA).
Die erhaltenen Digitalaufnahmen sind in 6A und 6B vorgestellt. Fixierte E. coli-, P. aeruginosa- und B. subtilis-Zellen wurden alle mit entweder einem P. aeruginosa- (6A) oder einem B. subtilis- (6B) Linear Beacon, wie oben beschrieben, hybridisiert. In beiden 6A und 6B stammen die roten Aufnahmen, die in den Bildern I, III und V vorgestellt werden, von Zellen, die mit Propidiumiodid gefärbt worden waren, welche sichtbar waren unter Verwendung des roten Mikroskopfilters. In beiden 6A und 6B stammen die grünen Aufnahmen, die in den Bildern II, IV und VI vorgestellt werden, von Zellen mit einer grünen Fluoreszenz, verursacht durch die Hybridisierung des mit Fluorescein markierten Linear Beacons an die rRNA-Zielsequenz, und welche sichtbar sind unter Verwendung des grünen Mikroskopfilters. Für Vergleichszwecke stammen die für jede Sonde untersuchten roten und grünen Aufnahmen aus demselben Abschnitt jedes Objektträgers und werden übereinander in den Figuren dargestellt.
Mit Bezugnahme auf 6A können die Zellen von E. coli, P. aeruginosa und B. subtilis in den in den Bildern I, III bzw. V vorgestellten roten Aufnahmen gesehen werden. Die Zellen sind rot, da das Propidiumiodid alle anwesenden Bakterien färben wird. Mit Bezugnahme auf die Bilder II, IV und VI von 6A sind die grünen Zellen am intensivsten nur in Bild IV sichtbar, wodurch bestätigt wird, dass das Linear Beacon verwendet werden kann, um spezifisch die Anwesenheit des Zielorganismus P. aeruginosa zu identifizieren.
Mit Bezugnahme auf 6B können wiederum die Zellen von E. coli, P. aeruginosa und B. subtilis in den roten Aufnahmen, vorgestellt in den Bildern I, III bzw. V, gesehen werden. Mit Bezugnahme auf die Bilder II, IV und VI von 6B sind die grünen Zellen am intensivsten nur in Bild VI sichtbar, wodurch bestätigt wird, dass das Linear Beacon verwendet werden kann, um spezifisch die Anwesenheit des Zielorganismus B. subtilis zu identifizieren.
Zusammengefasst sorgen die Linear Beacons, gerichtet gegen P. aeruginosa und Bacillus, für die unzweideutigen Nachweise von Zielorganismen, sogar wenn das Protokoll nicht irgendwelche Waschschritte einschließt, nachdem die Hybridisierungsreaktion durchgeführt worden ist.
Beispiel 21: Korrelation des Rauschens und des Signal-Rausch-Verhältnisses mit der Nucleobasensequenz
Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die von den Anmeldern beobachteten Phänomene sequenzabhängig waren. Folglich wurde die Nucleobasensequenz der PNA-Sonde Cy3PNA003-15 (siehe Tabelle 1B) umgeordnet, um die Sonde Cy3SCBL03-15 zu erzeugen (siehe Tabelle 1B).
Materialien und Methoden:
Die Zubereitung, Markierung und Reinigung von PNA-Oligomeren wurde beschrieben. Die Sonde Cy3SCBL03-15 wurde in den Puffern B und C untersucht, im Wesentlichen, wie in Beispiel 18 dieser Spezifikation beschrieben, unter Verwendung des DNA-Ziels SCBL-DNA (siehe Tabelle 2A). Die gewonnenen Daten sind grafisch in den 7A und 7B wiedergegeben.
Ergebnisse und Diskussion:
Mit Bezugnahme auf 7A werden das Rohsignal und die Rauschdaten für die beiden untersuchten Puffer dargestellt. Wie es für die Sonde Cy3PNA003-15 beobachtet wurde, scheinen die Ergebnisse für die Sonde Cy3SCBL03-15 im Wesentlichen unabhängig von dem Puffer zu sein, wodurch bestätigt wird, dass die Ionenstärke und eine minimale pH-Wertänderung die Ergebnisse nicht bewirkt. Mit Bezugnahme auf 7B ist das Signal-Rausch-Verhältnis annähernd 6 bis 8 nach Hybridisierung mit der Zielsequenz. Dies kor reliert gut mit den in 4E für die Sonde Cy3PNA003-15 vorgestellten Daten. Deswegen zeigen die Daten, dass die von den Anmeldern beobachteten Phänomene im Wesentlichen nicht von der Nucleobasensequenz des Linear Beacon abhängen.
ÄQUIVALENTE
Während diese Erfindung besonders gezeigt und beschrieben wurde mit Bezugnahme auf deren bevorzugte Ausführungsbeispiele, wird von Fachleuten verstanden werden, dass darin zahlreiche Änderungen in der Form und in den Details gemacht werden können, ohne von dem Geist und Umfang der Erfindung, wie er durch die angehängten Ansprüche definiert ist, abzuweichen. Fachleute werden in der Lage sein, unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten viele Äquivalente für die spezifischen Ausführungsbeispiele der hierin beschriebenen Erfindung sicherzustellen. Von solche Äquivalenten ist beabsichtigt, dass sie in dem Schutzumfang der Ansprüche umfasst sind. SEQUENZLISTE

Claims

Ein Polymer, umfassend: a) eine Nicht-Polynucleotid-Nucleobasen-Sondiersequenz zum Sondieren einer Zielsequenz, zu welcher die Nucleobasensequenz komplementär ist; b) wenigstens eine Energiedonoreinheit, die mit der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist; und c) wenigstens eine Energieakzeptoreinheit, die mit der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist, worin die wenigstens eine Energiedonoreinheit von der wenigstens einen Energieakzeptoreinheit durch wenigstens einen Teil der Nucleobasen-Sondiersequenz abgetrennt ist.
Polymer nach Anspruch 1, worin die Nucleobasen-Sondiersequenz 5 bis 30 Untereinheiten lang ist.
Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin jede der Untereinheiten der Nucleobasen-Sondiersequenz die Formel hat:
worin, jedes J dasselbe oder unterschiedlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: H, R¹, OR¹, SR¹, NHR¹, NR¹ ₂, F, Cl, Br und I; jedes K dasselbe oder unterschiedlich ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: O, S, NH, und NR¹; jedes R¹ dasselbe oder unterschiedlich ist und eine Alkylgruppe mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen ist, die optional ein Heteroatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe enthalten können; jedes A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Einzelbindung, einer Gruppe der Formel – (CJ₂)_S – und einer Gruppe der Formel – (CJ₂)_SC(O) -, worin J wie oben definiert ist und jedes s eine ganze Zahl von eins bis fünf ist: jedes t 1 oder 2 ist; jedes u 1 oder 2 ist; und jedes L dasselbe oder unterschiedlich ist und unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus J, Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uridin, 5-Methlcytosin, 2-Aminopurin, 2-Amino-6-chlorpurin, 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin, Pseudoisocytosin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymidin, andere natürlich vorkommende Nucleobasenanaloga, andere nicht natürlich vorkommende Nucleobasen, substituierte und unsubstituierte aromatische Einheiten, Biotin und Fluorescein.
Polymer nach Anspruch 3, worin jede PNA-Untereinheit aus einer natürlich oder einer nicht natürlich vorkommenden Nucleobase besteht, die an den Stickstoff eines N-[2-(Aminoethyl)]-glycin-Gerüstes durch eine Methylen-Carbonyl-Bindung angeheftet ist.
Polymer nach Anspruch 1, nach Anspruch 3 oder nach Anspruch 4, worin dieses Polymer keine Stamm-und-Schleifen-Haarnadel ausbildet und weiter gekennzeichnet ist dadurch, dass die Wirksamkeit des Übertragung der Energie zwischen diesen Donor- und Akzeptoreinheiten, wenn das Polymer in wässriger Lösung solvatisiert wird, im Wesentlichen unabhängig ist von wenigstens zwei Variablen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) der Nucleobasensequenzlänge, welche die wenigstens eine Donoreinheit von der wenigstens einen Akzeptoreinheit abtrennt; b) der spektralen Überlappung der wenigstens einen gekoppelten Donoreinheit und der wenigstens einen gekoppelten Akzeptoreinheit; c) der Anwesenheit oder Abwesenheit von Magnesium in der wässrigen Lösung; und der d) Ionenstärke der wässrigen Lösung.
Polymer nach Anspruch 5, worin die wenigstens eine Energiedonoreinheit mit einem Ende eines ersten oder zweiten Endes der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist und worin die wenigstens eine Energieakzeptoreinheit mit dem anderen Ende des ersten oder zweiten Endes der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist.
Polymer nach Anspruch 5 oder nach Anspruch 6, worin das Polymer eine PNA ist.
Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Donareinheit ein Fluorophor ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 5(6)-Carboxyfluorescein und dessen Derivaten, 5-(2'-Aminoethyl)-aminonaphtalen-1-sulfonsäure (EDANS), Bodipy und dessen Derivate, Rhodamin und dessen Derivate, Cy2, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, Texasrot und dessen Derivate.
Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Akzeptoreinheit 4-((-4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure (Dabcyl) ist.
Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin wenigstens eine Spacer-Einheit eine oder beide Donor- und Akzeptoreinheiten von der Nucleobasensequenz, an welche sie gekoppelt ist, trennt.
Polymer nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die Nucleobasen-Sondiersequenz perfekt komplementär zu der Zielsequenz ist.
Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Polymer auf einer Unterlage immobilisiert ist.
Polymer nach Anspruch 12, worin das Polymer ein Bestandteilspolymer einer Anordnung ist.
Verfahren für den Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz in einer Probe, wobei dieses Verfahren umfasst: a) in Kontakt bringen der Probe mit einem Polymer, umfassend: (i) eine Nicht-Polynucleotid-Nucleobase-n-Sondiersequenz, die komplementär ist zu der Zielsequenz; (ii) wenigstens eine Energiedonoreinheit, die mit der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist, und (iii) wenigstens eine Energieakzeptoreinheit, die mit der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist und die von der wenigstens einen Energieakzeptoreinheit durch wenigstens einen Teil der Nucleobasen-Sondiersequenz abgetrennt ist; und b) Nachweisen, Identifizieren oder Quantifizieren der Hybridisierung des Polymers mit der Zielsequenz unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen, worin die Anwesenheit, Abwesenheit oder die Menge der Zielsequenz, die in der Probe vorhanden ist, mit einer Änderung im nachweisbaren Signal im Zusammenhang mit wenigstens einer Donor- oder Akzeptoreinheit des Polymers in Beziehung gesetzt werden kann.
Verfahren für den Nachweis, die Identifizierung oder Quantifizierung einer Zielsequenz in einer Probe nach Anspruch 14, worin dieses Polymer keine Stamm und-Schleifen-Haarnadel ausbildet; und wobei dieses Polymer weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass die Wirksamkeit der Übertragung der Energie zwischen diesen Donor- und Akzeptoreinheiten, wenn das Polymer in wässriger Lösung solvatisiert wird, im Wesentlichen unabhängig ist von wenigstens zwei Variablen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (i) der Nucleobasensequenzlänge zwischen dieser wenigstens einen Energiedonoreinheit und dieser wenigstens einen Energieakzeptoreinheit; (ii) der spektralen Überlappung der wenigstens einen Donoreinheit und der wenigstens einen Akzeptoreinheit; (iii) der Anwesenheit oder dem Fehlen von Magnesium in der wässrigen Lösung; und der (iv) Ionenstärke der wässrigen Lösung.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die wenigstens eine Energiedonoreinheit mit einem Ende eines ersten oder zweiten Endes der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist und worin die wenigstens eine Energieakzeptoreinheit mit dem anderen Ende des ersten oder zweiten Endes der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 15 oder nach Anspruch 16, worin das Polymer eine PNA ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, worin das Verfahren verwendet wird, um eine Zielsequenz in einer Closed-Tube-(homogenen)-Untersuchung nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das Verfahren verwendet wird, um eine Nucleinsäure nachzuweisen, die eine Zielsequenz umfasst, worin diese Nucleinsäure in einer Reaktion, die in der Closed-Tube-(homogenen)-Untersuchung geschah, synthetisiert oder amplifiziert wurde.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Nucleinsäuresynthese- oder Nucleinsäureamplifikationsreaktion ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), Ligase-Ketten-Reaktion (LCR), Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA), Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) und Q-beta Replikase.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die PCR-Reaktion eine asymmetrische PCR-Reaktion ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die synthetisierte oder amplifizierte Zielsequenz in Echtzeit gemessen wird.
Ein In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, worin das Verfahren verwendet wird, um eine Zielsequenz in einer Zelle oder in einem Gewebe, ob lebend oder nicht, nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Zielsequenz in der Zelle oder dem Gewebe unter Verwendung von In-situ-Hybridisierung nachgewiesen, identifiziert oder quantifiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, worin die Probe mit diesem Polymer und mit einer oder mehreren Sperrsonden in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 25, worin Nachweis, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz die Anwesenheit oder Menge eines Organismus oder Virus in der Probe bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 25, worin Nachweis, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz die Anwesenheit oder die Menge einer oder mehrerer Arten eines Organismus in der Probe bestimmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 24, worin Nachweis, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz die Wirkung antimikrobieller Mittel auf das Wachstum eines oder mehrerer Mikroorganismen in der Probe bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 26, worin Nachweis, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz die Anwesenheit oder Menge einer taxonomischen Gruppe eines Organismus in der Probe bestimmt.
Ein In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 28, worin Nachweis, Identifizierung oder Quantifizierung der Zielsequenz eine Diagnose eines Zustandes, der medizinisch von Interesse ist, erleichtert.
Verfahren nach Anspruch 14 oder nach Anspruch 17, worin die Zielsequenz auf einer Oberfläche immobilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 17, worin das Polymer auf einer Oberfläche immobilisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 17, worin das Polymer ein Bestandteilspolymer einer Anordnung ist.
Anordnung, umfassend zwei oder mehrere auf dem Untergrund gebundene Polymere, worin wenigstens ein Polymer der Anordnung umfasst: a) eine Nicht-Polynucleotid-Nucleobasen-Sondiersequenz zum Sondieren einer Zielsequenz, zu der die Nucleobasen-Sondiersequenz komplementär ist; b) wenigstens eine Energiedonoreinheit, die mit der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist; und c) wenigstens eine Energieakzeptoreinheit, die mit der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist, worin die wenigstens eine Donoreinheit von der wenigstens einen Akzeptoreinheit durch wenigstens einen Teil der Nucleobasen-Sondiersequenz abgetrennt ist; und worin dieses Polymer geeignet ist für das Nachweisen, Identifizieren oder Quantifizie- ren einer Zielsequenz, die in einer Probe vorhanden ist.
Anordnung nach Anspruch 34, worin dieses Polymer keine Stamm-und-Schleifen-Haarnadel ausbildet und weiterhin gekennzeichnet ist dadurch, dass die Wirksamkeit der Energieübertragung zwischen diesen Donor- und Akzeptoreinheiten, wenn das Polymer in wässriger Lösung solvatisiert wird, im Wesentlichen unabhängig ist von wenigstens zwei Variablen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (i) der Nucleobasensequenzlänge, welche die wenigstens eine Donoreinheit von der wenigstens einen Akzeptoreinheit abtrennt; (ii) der spektralen Überlappung der wenigstens einen Donoreinheit und der wenigstens einen Akzeptoreinheit; (iii) der Anwesenheit oder dem Fehlen von Magnesium in der wässrigen Lösung; und der (iv) Ionenstärke der wässrigen Lösung; und worin dieses Polymer geeignet ist für das Nachweisen, Identifizieren oder Quantifizieren einer Zielsequenz, die in einer Probe vorhanden ist.
Anordnung nach Anspruch 34 oder 35, worin die wenigstens eine Energiedonoreinheit des wenigstens einen Polymers mit einem Ende eines ersten oder eines zweiten Endes der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist und worin die wenigstens eine Energieakzeptoreinheit des wenigstens einen Polymers mit dem anderen Ende des ersten oder zweiten Endes der Nucleobasen-Sondiersequenz gekoppelt ist.
Anordnung nach einem der Ansprüche 34 bis 36, worin die Anordnung geeignet ist für die Regeneration durch die Behandlung mit einem oder mehreren Regenerationskatalysatoren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hitze, Nucleaseenzym und chemischem Denaturierungsmittel.
Kit, geeignet für die Durchführung einer Untersuchung, die die Anwesenheit, das Fehlen oder die Menge einer Zielsequenz in einer Probe nachweist, worin dieser Kit umfasst: a) wenigstens ein Polymer mit wenigstens einer daran gekoppelten Energiedonoreinheit und wenigstens einer daran gekoppelten Einergieakzeptoreinheit, worin diese Donor- und Akzeptoreinheiten durch wenigstens einen Teil einer Nicht-Polynucleotid-Nucleobasen-Sondiersequenz abgetrennt werden, und worin dieses Polymer keine Stamm-und-Schleifen-Haarnadel ausbildet und weiter gekennzeichnet ist dadurch, dass die Wirksamkeit der Energieübertragung zwischen diesen Donor- und Akzeptoreinheiten, wenn das Polymer in wässriger Lösung solvatisiert wird, im Wesentlichen unabhängig ist von wenigstens zwei Variablen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (i) der Nucleobasensequenzlänge, welche die wenigstens eine Donoreinheit von der wenigstens einen Akzeptoreinheit abtrennt; (ii) der spektralen Überlappung der wenigstens einen Donoreinheit und der wenigstens einen Akzeptoreinheit; (iii) der Anwesenheit oder dem Fehlen von Magnesium in der wässrigen Lösung; und der (iv) Ionenstärke der wässrigen Lösung; und b) andere Reagenzien oder Zusammensetzungen, die notwendig sind, um die Untersuchung durchzuführen.
Kit nach Anspruch 38, worin eines oder mehrere der Polymere des Kits eine Nucleobasen-Sondiersequenz mit einer Länge von 11 bis 17 Untereinheiten hat.
Kit nach Anspruch 38 oder 39, worin zwei oder mehr Polymere mit unabhängig voneinander detektierbaren Einheiten markiert sind.
Kit nach Anspruch 40, worin die unabhängig voneinander detektierbaren Einheiten verwendet werden, um unabhängig wenigstens zwei unterschiedliche Zielsequenzen nachzuweisen, zu identifizieren oder zu quantifizieren, die in derselben Probe vorhanden sein könnten.
Kit nach einem der Ansprüche 38 bis 41, worin das Kit in einer In-situ-Hybridisierungsuntersuchung verwendet wird.
Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 38 bis 42, um Organismen in Lebensmitteln, Getränken, Wasser, pharmazeutischen Produkten, Toilettenartikeln, Molkereiprodukten oder Umweltproben nachzuweisen.
Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 38 bis 42, um Rohmaterialien, Produkte oder Verfahren zu untersuchen.
Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 38 bis 42, um klinische Proben wie klinische Muster oder Ausrüstung, Inventar und Produkte, die verwendet werden, um Menschen oder Tiere zu behandeln, zu untersuchen.
Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 38 bis 42, um in einer Probe eine Zielsequenz nachzuweisen, die spezifisch ist für eine genetisch begründete Erkrankung oder die spezifisch ist für eine Veranlagung für eine genetisch begründete Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 46, worin der Kit verwendet wird, um eine Zielsequenz, im Zusammenhang mit einer Krankheit nachzuweisen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus β-Thalassämie, Sichelzellenanämie, Faktor-V-Leiden, zystische Fibrose und auf Krebs bezogenen Zielen wie p53, p10, BRC-1 und BRC-2.
Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 38 bis 42, um in einer Probe eine Zielsequenz in einer Technik der Forensik, wie Pränataluntersuchung, Vaterschaftsuntersuchung, Identitätsbestätigung oder kriminalistische Untersuchung, nachzuweisen.