DE69737765T2 - Graphitnanorohre in lumineszierenden assays - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Anmeldung bezieht sich im Allgemeinen auf Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung von Bindungs-Assays, insbesondere auf solche, welche die Anwesenheit eines Analyten von Interesse durch Messung der durch eine oder mehrere markierte Komponenten des Assay-Systems emittierten Lumineszenz messen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf zielgerichtete, reproduzierbare, präzis homogene oder heterogene spezifische Bindungs-Assays mit verbesserter Empfindlichkeit, in welchen die lumineszierende Komponente in der Assay-Zusammen-setzung konzentriert und vor dem Auslösen einer Elektrochemilumineszenz auf dem Detektionssystem gesammelt wird.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Zahlreiche Verfahren und Systeme sind für die Detektion und Quantifizierung von interessanten Analyten in biochemischen und biologischen Substanzen entwickelt worden. Verfahren und Systeme, welche zur Messung von Spurenanteilen an Mikroorganismen, Pharma-zeutika, Hormonen, Viren, Antikörpern, Nukleinsäuren und anderen Proteinen geeignet sind, sind für Forscher und Klinikärzte von hohem Wert.
  • Ein sehr wesentlicher Teil der Techniken wurde auf den bekannten Bindungsreaktionen basierend entwickelt, z. B. Antigen-Antikörperreaktionen, Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken und Protein-Liganden Systeme. Der hohe Grad an Spezifität in vielen biochemischen und biologischen Bindungs-Systemen hat zu vielen Assay-Verfahren und Systemen von hohem Wert für Forschung und Diagnostik geführt.
  • Typischerweise wird die Existenz eines interessierenden Analyten durch die Präsenz oder Abwesenheit einer beobachtbaren "Markierung", welche an eines oder mehrere der Bindungsmaterialien angelagert ist, angezeigt. Von besonderem Interesse sind Markierungen, welche durch photochemische, chemische und elektrochemische Mittel zur Lumineszenz angeregt werden können. "Photolumineszenz" ist der Prozess, wonach ein Material, wenn es elektromagnetische Strahlung absorbiert, zum Lumineszieren angeregt wird. Fluoreszenz und Phosphoreszenz sind Typen der Photolumineszenz.
  • "Chemilumineszente" Prozesse verursachen die Bildung lumineszenter Spezies durch chemische Energieübertragung. "Elektrochemilumineszenz" verursacht die elektrochemische Bildung lumineszierender Spezies.
  • Es sind chemilumineszente Assay-Techniken entwickelt worden, in denen eine einen interessierenden Analyten enthaltende Probe mit einem Reaktanden, welcher mit einer chemilumineszenten Markierung markiert ist, gemischt wird. Die reaktive Mischung wird inkubiert und ein Teil des markierten Reaktanden bindet an den Analyten. Nach der Inkubation werden die gebundenen und ungebundenen Fraktionen der Mischung getrennt und die Konzentration der Markierung in einer oder beider Fraktionen kann durch chemilumineszente Techniken bestimmt werden. Der in einer oder beider Fraktionen bestimmte Grad an Chemilumineszenz zeigt die Menge an interessierendem Analyten in der biologischen Probe an.
  • Elektrochemilumineszente (ECL) Assay-Techniken sind eine Verbesserung gegenüber chemilumineszenten Techniken. Sie bieten eine empfindliche und genaue Messung der Präsenz und Konzentration eines interessierenden Analyten. In derartigen Techniken wird die inkubierte Probe einer voltamperemetrischen Arbeitselektrode ausgesetzt, um eine Lumineszenz auszulösen. In der passenden chemischen Umgebung wird eine solche Elektrochemilumineszenz durch eine an die Arbeitselektrode angelegte Spannung zu einer bestimmten Zeit und in einer bestimmten Weise ausgelöst. Das durch die Markierung erzeugte Licht wird gemessen und zeigt die Präsenz oder Menge des Analyten an. Für eine vollständigere Beschreibung solcher ECL-Techniken wird auf die veröffentlichte PCT-Anmeldung US 85/01253 ( WO 86/02734 ), die veröffentlichte PCT-Anmeldung US 87/00987 und die veröffentlichte PCT-Anmeldung US 88/03947 verwiesen.
  • Es ist gewünscht, Elektrochemilumineszenz-Assays ohne die Notwendigkeit eines Trennungsschrittes während des Assay-Verfahrensablaufs durchzuführen und die Signalmodulation bei verschiedenen Konzentrationen des Analyten zu maximieren, so dass genaue und empfindliche Bestimmungen gemacht werden können. Unter den Verfahren für Nicht-Trennungsassays aus dem Stand der Technik sind solche, welche in der Assay-Probe suspendierte mikropartikuläre Stoffe verwenden, um eine oder mehrere der Bindungskomponenten des Assays zu binden.
  • US-Anmeldung Nr. 539,389 (veröffentlichte PCT-Anmeldung US 89/04919 ) lehrt empfindliche, spezifische Bindungs-Assay Verfahren basierend auf einem Lumineszenzphänomen, wobei der inerte mikropartikuläre Stoff spezifisch an einen der Bindungsre-aktanden des Assay-Systems gebunden wird. Die Assays können in einem heterogenen (ein oder mehrere Trennungsschritte) Assay-Format durchgeführt werden und können besonders vorteilhaft in einem homogenen (Nicht-Trennungs-)Assay-Format verwendet werden. US 89/04919 bezieht sich auf eine Zusammensetzung für ein Assay, basierend auf einer Bindungsreaktion zur Bestimmung eines Lumineszenzphänomens, wobei die Zusammensetzung einer Vielzahl suspendierter Teilchen, welche eine zur Bindung an eine Komponente der Assay-Mischung geeignete Oberfläche aufweisen, enthält. Unter einem anderen Gesichtspunkt richtet sie sich auf eine Vorrichtung zur Detektion oder Quantifizierung eines interessierenden Analyten in einer Probe, wobei das System zur Durchführung der Assay-Verfahren unter Verwendung der Assay-Zusammensetzungen der Erfindung geeignet ist. Das System schließt Mittel zum Anregen von Lumineszenz in der Markierungsverbindung in dem Assay-Medium und zu lumineszierendes Mittel zum Messen der Lumineszenz, die Präsenz des interessierenden Analyten in der Probe zu detektieren, ein.
  • Man fand heraus, dass die Bindung dieser Komponente des Assay-Systems, an welchem ein elektrochemilumineszenter Teil gebunden ist, an suspendierte mikropartikuläre Stoffe die Intensität des Lumineszenz-Signals, welches durch den mit dieser Komponente verbundenen elektrochemilumineszenten Teil erzeugt wurde, stark moduliert und damit ein Mittel zur Überwachung der spezifischen Bindungsreaktion des Assay-Systems bereitstellt. Man stellte fest, dass die suspendierten Partikel geringe oder keine Auswirkung auf die Intensität des Lumineszenz-Signals, welches durch den mit der Komponente des Systems, welche an den suspendierten mikropartikulären Stoff ungebunden bleibt, verbundenen elektrochemielumiszenten Teil erzeugt worden ist, zeigt.
  • Damit ist die US 89/04919 auf Verfahren zur Detektion eines interessierenden Analyten in einer Probe gerichtet, wobei das Verfahren die Schritte des (1) Bildens einer Zusammensetzung umfassend (a) eine mutmaßlich einen interessierenden Analyten enthaltende Probe, (b) eine Assay-Performance Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) interessierendem Analyten oder Analogon des interessierenden Analyten, (ii) einem Bindungspartner des interessierenden Analyten oder seinem Analogon und (iii) einer reaktiven, zur Bindung mit (i) oder (ii) geeigneten Komponente, wobei eine der Substanzen mit einer Markierungsverbindung verbunden ist, welche einen zur Lumineszenz induzierbaren chemischen Teil aufweist, und (c) eine Vielzahl suspendierter Partikel, welche zur spezifischen Bindung mit dem Analyten und/oder einer Substanz wie in (b), (i), (ii) oder (iii) definiert, geeignet sind; (2) des Inkubierens der Zusammensetzung, um einen Komplex zu bilden, welcher ein Partikel und die Markierungsverbindung enthält; (3) des Induzierens der Markierungsverbindung zur Lumineszenz; und (4) des Messens der durch die Zusammensetzung emittierten Lumineszenz, um das Vorhandensein des interessierenden Analyten in der Probe zu detektieren, beinhaltet. Jene gleichen Verfahren können zur Quantifizierung der Menge an Analyten in einer Probe durch Vergleich der Lumineszenz der Assay-Zusammensetzung mit der Lumineszenz einer eine bekannte Menge an Analyten enthaltenden Zusammensetzung verwendet werden.
  • Analoga des interessierenden Analyten, welche natürlich oder synthetisch sein können, sind Verbindungen, welche dem Analyten vergleichbare Bindungseigenschaften aufweisen, aber ebenso Verbindungen höherer oder niedriger Bindungsfähigkeit umfassen. Geeignete Bindungspartner zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind wohlbekannt. Beispiele sind Antikörper, Enzyme, Nukleinsäuren, Lektine, Cofaktoren und Rezeptoren. Die reaktiven Komponenten, welche zur Bindung mit dem Analyten oder seinem Analogon und/oder mit einem Bindungspartner davon geeignet sind, können ein zweiter Antikörper oder ein Protein, wie beispielsweise Protein A oder Protein G oder Avidin oder Biotin oder eine andere aus dem Stand der Technik bekannte Komponente zum Eingehen von Bindungsreaktionen sein.
  • Vorteilhaft entsteht die Lumineszenz aus Elektrochemilumineszenz (ECL), induziert durch Aussetzen der Markierungsverbindung, ob gebunden oder ungebunden an spezifische Bindungspartner, einer voltamperemetrischen Arbeitselektrode. Durch eine an die Arbeitselektrode angelegte Spannung wird die ECL-reaktive Mischung ausgelöst, um kontrollierbar zu einer bestimmten Zeit und in einer bestimmten Weise Licht zu erzeugen. Obwohl die Emission von sichtbarem Licht ein vorteilhaftes Merkmal ist, kann die Zusammensetzung oder das System andere Arten elektromagnetischer Strahlung emittieren, wie beispielsweise infrarotes oder ultraviolettes Licht, Röntgenstrahlen, Mikrowellen usw. Verwendung der Begriffe "Elektrochemilumineszenz", "elektrochemilumineszent", "Elektrochemilumineszenz", "Lumineszenz", "lumineszent", und "nachleuchten" schließt die Emission von Licht und anderen Formen elektromagnetischer Strahlung ein. Die Verfahren aus der Lehre der US 89/04919 erlauben die Detektion und Quantifizierung von extrem kleinen Mengen an Analyten in einer Vielfalt von in Forschung und unter klinischen Bedingungen durchgeführten Assays. Die Anforderungen von Forschern und Klinikern machen es jedoch zwingend notwendig, die Detektionsgrenzen von Assays, welche nach diesen Verfahren durchgeführt werden, zu senken, um die Empfindlichkeit dieser Assays zu erhöhen und die Geschwindigkeit, mit welcher sie durchgeführt werden können, zu steigern.
  • Vielfältige Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt, um das Signal von markierten Spezies durch ein Aufkonzentrieren vor dem Schritt der Messung zu erhöhen. Beispielsweise werden im US-Patent Nr. 4,652,333 Partikel, welche mit Fluoreszenz-, Phosphoreszenz- oder atomarer Fluoreszenz-Markierungen markiert sind, durch Mikrofiltation aufkonzentriert, bevor der Schritt einer Messung durchgeführt wird. Es ist aus dem Stand der Technik auch bekannt, markierte immunochemische Spezies vor dem Schritt der Messung zu konzentrieren, beispielsweise durch das Anziehen magnetisch responsiver, markierter Partikel auf die Oberfläche eines Messgefäßes. in den US-Patenten US 4,731,337 , US 4,777,145 und US 4,115,535 werden beispielsweise solche Partikel zur Gefäßwand gezogen und dann zur Anregung einer fluorophoren Lichtemission bestrahlt.
  • Im US-Patent US 4,945,045 werden Partikel auf einer magnetischen Elektrode konzentriert. Eine elektrochemische Reaktion findet an der Elektrode statt, unterstützt durch einen markierten chemischen Vermittler. Die immunochemische Bindungsreaktion verändert die Effizienz des Vermittlers, was ein moduliertes Signal zur Folge hat, wenn die Bindung eingegangen wird.
  • Ohne an eine bestimmte mechanistische Erklärung von Oberflächenanregung, beispielsweise Elektrochemilumineszenz, gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Markierung auf dem Festphasen-Komplex an der Elektrode oxidiert werden muss. Dies erfordert, dass ein Elektron von der Markierung zur Elektrode wandert. Es wird angenommen, dass das Elektron diesen "Sprung" durch ein als Tunneln bekanntes Phänomen macht, wo sich das Elektron durch den Raum bewegt (eine Region, wo seine Potentialenergie sehr hoch ist, beispielsweise die Lösung), ohne dabei "über" die Potentialenergiebarriere gehen zu müssen. Es kann durch die Energiebarriere tunneln und sich damit von einem Molekül zu einem anderen bewegen oder sich von einem Molekül zu einer Elektrode bewegen, ohne zusätzliche Energiezufuhr. Jedoch wirkt das Tunnelphänomen nur auf sehr geringen Distanzen. Die Tunnelwahrscheinlichkeit fällt exponentiell ab, wenn die Distanz zwischen den beiden Spezies zunimmt. Die Wahrscheinlichkeit, dass es zwischen zwei Spezies zu einem Tunnelphänomen kommt, liegt vergleichsweise hoch, wenn die Distanz weniger als 25 Angström (2,5 nm) beträgt, ist jedoch ziemlich niedrig, wenn die Distanz größer ist. Die Distanz von 25 Å ist eine vom Fachmann verwendete Daumenregel, aber keine absolute Einschränkung.
  • Dementsprechend kann nur von solchen ECL-Markierungen innerhalb 25 Å von der Oberfläche der Elektrode erwartet werden, an dem ECL-Prozess teilzunehmen. Dass Gebiet des Teilchens, welches innerhalb 25 Å von der Oberfläche einer Elektrode liegt, ist typischerweise extrem klein.
  • Dementsprechend würde man nicht erwarten, dass ECL von einer Partikeloberfläche in irgendeinem signifikanten Ausmaß messbar wäre. Darüber hinaus muss das durch den ECL-Prozess erzeugte Licht durch das Partikel dringen, um zu dem Photomultiplier zu gelangen. Da die Partikel im Wesentlichen opak sind (eine konzentrierte Suspension davon erscheint schwarz) würde man nicht erwarten, dass, selbst wenn signifikante Mengen an Licht durch ECL erzeugt werden könnten, dass Licht durch das Partikel dringen könnte und durch den Photomultiplier gemessen werden könnte.
  • Seit den 1970ern sind graphitische Nanoröhren und Fibrillen als Materialien von Interesse für eine Vielfalt von Anwendungen identifiziert worden. Sub-mikron-graphitische Fibrillen werden gelegentlich als Gasphasen gezüchtete Kohlenstofffibern bezeichnet. Kohlenstofffibrillen sind vermikuläre Kohlenstoffablagerungen, welche Durchmesser von weniger als 1,0 μ, vorzugsweise weniger als 0,5 μ und besonders bevorzugt weniger als 0,2 μ aufweisen. Sie existieren in einer Vielfalt von Formen und sind durch die katalytische Zersetzung von verschiedenen Kohlenstoff-enthaltenden Gasen an Metalloberflächen hergestellt worden. Derartige vermikuläre Kohlenstoffablagerungen sind schon seit der Einführung der Elektronenmikroskopie beobachtet worden. Eine gute frühe Übersicht und Referenz findet sich in Baker und Harris, Chemistry and Physics of Carbon, Walker and Thrower ed., Vol. 14, 1978, S. 83. Vergleiche auch Rodriguez, N., J. Mater. Research, Vol. 8, S. 3233 (1993). 1976 klärten Endo et al. (siehe Obelin, A. and Endo, M., J. of Crystal Crowth, Vol. 32 (1976), S. 335-349) den grundlegenden Mechanismus, durch den derartige Kohlenstofffibrillen wachsen, auf. Sie entstehen offenbar von einem Metallkatalysatorpartikel, welches in der Gegenwart eines kohlenwasserstoffhaltigen Gases an Kohlenstoff übersättigt wird. Ein zylindrisch geordneter graphitischer Kern wird extrudiert, welcher gemäß Endo et al unmittelbar mit einer äußeren Schicht von pyroloytisch abgelagertem Graphit überzogen wird. Solche Fibrillen mit einem pyrolytischen Überzug weisen typischerweise Durchmesser größer 0,1 µ, bevorzugt 0,2-0,5 µ auf.
  • 1983 gelang Tennent, US-Patent Nr. US 4,663,230 , hiermit durch Querverweisung aufgenommen, die Züchtung von zylindrisch geordneten Graphitkernen, nicht kontaminiert mit pyrolytischem Kohlenstoff. Damit bereitete die Tennent-Erfindung Zugang zu Fibrillen kleineren Durchmessers, typischerweise 35-700 Å (0,0035-0,070 μ) und zu einer geordneten, "wie gewachsenen" graphitischen Oberfläche. Fibrillenartige Kohlenstoffe mit weniger perfekter Struktur, aber ebenso ohne eine äußere pyrolytische Kohelnstofffschicht, sind ebenfalls gezüchtet worden.
  • Fibrillen, Buckytubes und Nanofibern sind von kommerziell als Armierungsstoff erhältlichen, durchgehenden Kohlenstofffibern zu unterscheiden. Im Gegensatz zu Fibrillen, welche ein wünschenswert großes, aber unvermeidbar begrenztes Aspektverhältnis aufweisen, zeigen durchgehende Kohlenstofffibern Aspektverhältnisse (LID) von mindestens 104 und oftmals 106 oder mehr. Der Durchmesser von durchgehenden Fibern ist ebenfalls wesentlich größer als der von Fibrillen, immer größer als 1,0 μ und typischerweise 5-7 μ.
  • Durchgehende Kohlenstofffibern werden durch die Pyrolyse organischer Precursorfibern, üblicherweise Kunstseide, Polyacrylnitril (PAN) und Pech gewonnen. Daher können sie Heteroatome innerhalb ihrer Struktur enthalten. Die graphitische Natur von "wie hergestellt" durchgehenden Kohlenstofffibern variiert, aber sie können Gegenstand eines nachfolgenden Graphitisierungsschrittes sein. Unterschiede im Grad der Graphitisierung, Orientierung und Kristallinität der graphitischen Ebenen, soweit vorhanden, die potentielle Gegenwart von Heteroatomen und selbst die absolute Differenz im Substratdurchmesser machen Erfahrungswerte mit durchgehenden Fibern zu schwachen Prädiktoren in der Nanofiberchemie.
  • Tennent ( US Patent Nr. 4,663,230 ) beschreibt Kohlenstofffibrillen, welche frei von einem durchgehenden, thermischen Kohlenstoffüberzug sind und mehrlagige äußere graphitische Schichten aufweisen, welche im Wesentlichen parallel zur Fibrillen-Achse sind. Als solche können sie dadurch charakterisiert werden, dass ihre c-Achsen, jene Achsen welche senkrecht zu den Tangenten der gekrümmten Schichten des Graphits sind, im Wesentlichen senkrecht zu ihren zylindrischen Achsen sind. Sie weisen im Allgemeinen Durchmesser nicht größer 0,1 µ und Länge zu Durchmesser-Verhältnisse von mindestens 5 auf.
  • Wünschenswerterweise sind sie im Wesentlichen frei von einem durchgehenden, thermischen Kohlenstoff-Überzug, d.h. pyrolytisch abgelagerter Kohlenstoff entstanden aus thermischem Cracken der zu ihrer Herstellung verwendeten Gaszufuhr.
  • Tennent et al. ( US-Patent Nr. 5,171,560 ) beschreibt Kohlenstofffibrillen frei von thermischem Überzug, welche im Wesentlichen parallel zu den Firbrillenachsen graphitische Schichten aufweisen, sodass die Projektion der Schichten auf die Fibrillenachsen sich über eine Distanz von mindestens 2 Fibrillen-Durchmessern erstreckt. Typischerweise sind solche Fibrillen im Wesentlichen zylindrische, graphitische Nanoröhren von im Wesentlichen konstantem Durchmesser und umfassen zylindrische, graphitische Schichten, deren c-Achsen im Wesentlichen senkrecht zu ihren zylindrischen Achsen sind. Sie sind im Wesentlichen frei von pyrolytisch abgelagertem Kohlenstoff und weisen einen Durchmesser von weniger als 0,1 µ und ein Länge zu Durchmesser-Verhältnis von größer als 5 auf. Diese Fibrillen sind in der Erfindung von primärem Interesse. Weitere Details bezüglich der Bildung von Kohlenstofffibrillen-Aggregaten können in der Offenbarung durch Snyder et al., US-Patentanmeldung Nr. 149,573 , angemeldet 28. Januar 1988 und PCT-Anmeldung Nr. US 89/00322 , angemeldet am 28. Januar 1989 ("Carbon Fibrils"), WO 89/07163 und Moy et al., US-Anmeldung Nr. 413,837 , angemeldet 28. September 1989 und PCT-Anmeldung Nr. US 90/05498 angemeldet 27. September 1990 ("Fibril Aggregates and Method of Making Same") WO 91/05089 , welche alle dem gleichen Patentinhaber übertragen wurden wie diese Erfindung.
  • Moy et al., USSN 07/887,307 , angemeldet 22. Mai 1992, beschreibt Fibrillen, welche, als Aggregat hergestellt, verschiedene makroskopische Morphologien aufweisen (wie durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht), in denen sie wahllos miteinander verwickelte Bälle von Fibrillen bilden, welche Vogelnestern ähneln ("BN"); oder als Aggregate bestehend aus Bündeln gerader oder leicht gewölbter oder geknoteter Kohlenstofffibrillen, welche im Wesentlichen die gleiche relative Orientierung und das Erscheinungsbild von gekämmtem Garn ("CY") aufweisen. Beispielsweise erstreckt sich die Längsachse jeder Fibrille (trotz individueller Krümmung oder Knoten) in dieselbe Richtung wie die der umgebenden Fibrillen in den Bündeln, oder, wenn die Aggregate aus geraden oder leicht gekrümmten oder verknoteten Fibrillen bestehen, welche lose miteinander verwickelt sind und so eine "offenes Netz" – Struktur ("ON") bilden. In offenen Netzstrukturen ist der Grad an Fibrillen-Verflechtung größer als er in der gekämmten Garn-Aggregation beobachtet wird (in der die individuellen Fibrillen im Wesentlichen die gleiche relative Orientierung aufweisen), aber geringer als derjenige von Vogelnestern. CY- und ON-Aggregate werden leichter dispergiert als BN, was sie in der Verbundwerkstoff-Herstellung nützlich macht, wo uniforme Eigenschaften in der gesamten Struktur erwünscht sind.
  • Wenn sich die Projektion der graphitischen Schichten auf der Fibrillen-Achse über eine Distanz von weniger als 2 Fibrillen-Durchmessern erstreckt, nehmen die Kohlenstoffebenen der graphitischen Nanofiber im Querschnitt ein Fischgrat-Aussehen an. Diese werden als Fischgrät-Fibrillen bezeichnet. Geus, US-Patent Nr. 4,855,091 stellt ein Verfahren zur Herstellung von Fischgrät-Fibrillen, welche im Wesentlichen frei von einem pyrolytischem Überzug sind, zur Verfügung. Diese Fibrillen sind auch in der Anwendung der Erfindung von Nutzen.
  • Kohlenstoff-Nanoröhren mit einer Morphologie vergleichbar mit der von katalytisch gezüchteten Fibrillen, wie oben beschrieben, sind in einem Hochtemperatur-Kohlebogen gezüchtet worden (Iijima, Nature 354 56 1991). Es ist nun allgemein akzeptiert (Weaver, Science 265, 1994), dass diese bogen-gezüchteten Nanofibern die gleiche Morphologie aufweisen, wie die zuvor katalytisch gezüchteten Fibrillen nach Tennent. Bogen-gezüchtete Kohlenstofffibern sind ebenfalls in der Erfindung von Nutzen.
  • Ziele der Erfindung
  • Es ist daher ein Ziel dieser Erfindung, Lumineszenz-Assays unter Verwendung von Partikeln, welche eine große Oberfläche zur Immobilisierung von Assay-Performance Substanzen aufweisen, bereitzustellen, um vorteilhaft starke Licht-Emission zu erreichen.
  • Es ist auch ein Ziel dieser Erfindung, Zusammensetzungen und Assays unter Verwendung graphitischer Nanoröhren (Fibrillen), welche mit Verbindungen markiert werden können, die zur induzierbaren Lumineszenz geeignet sind, bereitzustellen.
  • Es ist ein weiteres Ziel, funktionalisierte Fibrillen zur Verwendung in derartigen Assays bereitzustellen.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Definition von Bezeichnungen
  • Die Bezeichnung "ECL-Teil", "Metall-enthaltender ECL-Teil", "Markierung", "Markierungsverbindung" und "Markierungs-Substanz" werden untereinander austauschbar verwendet. Es ist im Umfang der Erfindung, dass Spezies als "ECL-Teil", "Metall-enthaltender ECL-Teil", "organometallisch", als "Metall-Chelat", "Übergangsmetall-Chelat", "Seltenerdmetall-Chelat", "Markierungsverbindung", "Markierungs-Substanz" und "Markierung" an Moleküle gebunden sind, wie beispielsweise einen Analyten oder ein Analogon davon, einen Bindungspartner des Analyten oder ein Analogon davon sowie weitere Bindungspartner derartiger oben genannter Bindungspartner oder eine reaktive Komponente, welche zur Bindung mit dem Analyten geeignet ist, ein Analogon davon oder einem Bindungspartner, wie oben erwähnt. Die oben genannten Spezies können auch an eine Kombination von einem oder mehreren Bindungspartnern und/oder einer oder mehrerer reaktiver Komponenten gebunden sein. Darüber hinaus können die vorgenannten Spezies auch an einen Analyten oder sein Analogon, welches an einen Bindungspartner, eine reaktive Komponente oder eine Kombination von einem oder mehreren Bindungspartnern und/oder einer oder mehrerer reaktiver Komponenten gebunden ist, gebunden sein. Es ist auch im Umfang der Erfindung, dass eine Vielzahl der vorgenannten Spezies direkt oder über andere Moleküle, wie oben diskutiert, an einen Analyten oder sein Analogon gebunden ist. Zum Zwecke der Kürze werden diese Liganden als eine Assay-Performance/Substanz bezeichnet.
  • Die Bezeichnungen Detektion und Quantifizierung werden als "Messung" bezeichnet, wobei Quantifizierung die Präparation von Referenz-Zusammensetzungen und Kalibrierungen erfordern kann.
  • Die Bezeichnungen Sammeln und Konzentrieren des Komplexes können untereinander austauschbar verwendet werden, um die Konzentrierung eines Komplexes in der Assay-Zusammensetzung und das Sammeln des Komplexes an beispielsweise einer Elektrodenoberfläche zu beschreiben.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt eine schematische Zeichnung einer Zelle zur Durchführung der mikropartikulär-basierten Nicht-Trennungs- und Trennungs-Assays der Erfindung.
  • 2 zeigt ein vereinfachtes Diagramm eines Spannungssteuerungsgerätes zur Verwendung mit der Zelle aus 1.
  • 3 zeigt eine schematische Darstellung der spezifischen Enzym-Hydrolysestellen auf Ru(bpy)3 2+-markierten Peptid-Fibrillen.
  • 4 zeigt eine schematische Darstellung eines DNA-Test-Assays, welches Avidin-Fibrillen verwendet.
  • 5 zeigt eine schematische Darstellung eines Reaktions-Schemas zur Herstellung bifunktionaler Fibrillen durch die Addition von Nε-(tert-butoxycarbonyl)-L-Lysin.
  • 6 zeigt eine schematische Darstellung eines Reaktions-Schemas zur Synthese der ECL-basierten, bifunktionalen Biosensor-Fibrille.
  • 7 zeigt eine schematische Darstellung einer bifunktionalen, ECL-basierten Biosensor-Fibrille.
  • 8 zeigt eine schematische Darstellung der durch D-Glukose-o-Phosphat-Dehydrogenase katalysierten Reaktion.
  • 9 zeigt eine grafische Darstellung der ECL-Detektion von Glukose-o-Phosphat-Dehydrogenase unter Verwendung eines fibrillenunterstützten, ECL-basierten Biosensors.
  • 10 zeigt eine schematische Darstellung eines Alkoholdehydrogenase (ADH) basierten ECL-Biosensors.
  • 11 zeigt eine schematische Darstellung eines ADH-basierten Biosensors, welcher auf Dynal M450-Perlen immobilisiert ist (links) und welcher auf Alkyl-Fibrillen immobilisiert ist (rechts).
  • 12 zeigt eine grafische Darstellung der ECL-Detektion von Ethanol unter Verwendung eines auf Perlen und Fibrillen immobilisierten Enzym-Biosensors.
  • 13 zeigt eine grafische Darstellung eines Assays von Ru(bpy)3 2+ bindend an Carboxy-Fibrillen und PEG-modifizierte Fibrillen, welche durch zwei verschiedene Verfahren hergestellt wurden.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • In ihrer umfassendsten Ausführungsform besteht die Erfindung in einer Nanoröhre, an welche eine mit einer Markierungsverbindung verbundene Komponente, die zur Lumineszenz induzierbar ist, angelagert ist. Insbesondere ist die Nanoröhre eine graphitische Nanoröhre und die Lumineszenz ist Elektrochemilumineszenz. In einer Ausführungsform ist die Komponente ein Enzym-Biosensor.
  • Die Erfindung besteht auch in einer Zusammensetzung zur Detektion eines in einer Probe vorhandenen interessierenden Analyten, deren Zusammensetzung umfasst:
    • (i) eine Graphit-Nanoröhre enthaltend eine funktionelle Gruppe, und
    • (ii) eine mit der funktionellen Gruppe verbundenen Assay-Performance-Substanz, wobei die Assay-Performance-Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten geeignet ist.
  • In einer Ausführungsform ist die mit der funktionellen Gruppe verbundene Assay-Performance Substanz ihrerseits wieder an den Analyten gebunden. Die Zusammensetzung umfasst weiterhin eine zweite mit dem Analyten verbundene Assay-Performance Substanz, wobei die zweite Assay-Performance Substanz mit einer Markierungsverbindung verbunden ist, die zur Lumineszenz induzierbar ist.
  • Die Assay-Performance Substanz enthält mindestens eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
    • (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des Analyten;
    • (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analogons; und
    • (iii) einer reaktiven Komponente, die zur Bindung mit (i) oder (ii) geeignet ist. Eine der Substanzen (i), (ii), (iii) ist an eine Markierungsverbindung gebunden, welche einen zur Lumineszenz induzierbaren chemischen Teil aufweist.
  • Allgemein sind die Partikel funktionalisierte Fibrillen, d. h. Fibrillen, deren Oberfläche mit einer oder mehreren Substanzen reagiert hat oder kontaktiert wurde, um darauf aktive Stellen zur chemischen Substitution oder physikalischen Adsorption von verschiedenen chemischen Spezies bereitzustellen.
  • McCarthy et all., U.S. Patentanmeldung Nr. 351,967 angemeldet 15. Mai 1989, beschreibt Verfahren zur Oxidation der Oberfläche von Kohlenstoff-Fibrillen, welche das Kontaktieren der Fibrillen mit einem Oxidationsmittel enthaltend Schwefelsäure (H2SO4) und Kaliumchlorat (KClO3) unter Reaktionsbedingungen (z. B. Zeit, Temperatur und Druck), um hinreichend die Oberfläche der Fibrille zu oxidieren, einschließt. Die nach dem Verfahren von McCarthy et al. oxidierten Fibrillen sind nicht-uniform oxidiert, d. h. die Kohlenstoffatome sind mit einer Mischung aus Carboxyl, Aldehyd, Ketone, phenolischen und anderen Carbonyl- Gruppen substituiert.
  • Fibrillen sind auch durch Behandlung mit Salpetersäure nicht-uniform oxidiert worden. Die internationale Anmeldung PCT/US94/10168 offenbart die Bildung von oxidierten Fibrillen enthaltend eine Mischung von funktionellen Gruppen.
  • Hoogenvaad, M.S., et al. ("Metal Catalysts supported an a Novel Carbon Support", präsentiert auf der Sixth International Conference an Scientific Basis for the Preparation of Heterogeneous Catalysts, Brüssel, Belgien, September 1994) fanden es auch in der Herstellung von Fibrillen-unterstützten Edelmetallen hilfreich, die Fibrillenoberfläche zuerst mit Salpetersäure zu oxidieren. Solche Vorbehandlung mit Säure ist ein Standardschritt in der Herstellung von kohlenstoffunterstützten Edelmetallkatalysatoren, wo es, angesichts der üblichen Quellen solcher Kohlenstoffe, ebenso sehr der Reinigung der Oberfläche von unerwünschten Materialien wie auch ihrer Funktionalisierung dient.
  • In publizierten Arbeiten stellten McCarthy und Bening (Polymer Preprints ACS Div. of Polymer Chem. 30 (1) 420 (1990)) Derivate von oxidierten Fibrillen her, um zu zeigen, dass die Oberfläche eine Vielzahl oxidierter Gruppen umfasst. Die Verbindungen, die sie herstellten, Phenylhydrazone, haloaromatische Ester, Thalliumsalze usw. wurden wegen ihrer analytischen Nützlichkeit ausgewählt, da sie beispielsweise leuchtend gefärbt sind oder eine andere starke und leicht identifizierbare und differenzierbare Signalfunktion zeigen. Die Partikel sind vorzugsweise funktionalisierte Fibrillen, welche allgemein die Formel [CnHL]-Rm aufweisen, worin n eine ganze Zahl ist, L eine Zahl kleiner als Cm, m eine Zahl kleiner 0,5n, jedes von R ist gleich und ist ausgewählt aus
    SO3H, COOH, NH2, OH, CHO, CN, COCl, Halogonide, COSH, SH, COOR', SR', SiR'3, Si-(OR')-yR'3-y, Si-(O-SiR'2)-OR', R'', Li, AlR'2, Hg-X, TlZ2 and Mg-X,
    y ist eine ganze Zahl gleich oder weniger 3,
    R' ist Alkyl, Aryl, Cycloalkyl oder Aralkyl,
    R'' ist Fluoroalkyl, Fluoroaryl, Fluorocycloalkyl, Fluoroaralkyl oder Cycloaryl,
    X ist Halogenid, und
    Z ist Carboxylat oder Trifluoroacetat.
  • Die Kohlenstoffatome Cn sind Oberflächenkohlenstoffe einer im Wesentlichen zylindrischen, graphitischen Nanoröhre von im Wesentlichen konstantem Durchmesser. Die Nanoröhren schließen solche ein, welche ein Länge zu Durchmesser Verhältnis von größer 5 und einen Durchmesser von weniger als 0,5 µ aufweisen, bevorzugt weniger als 0,1 µ. Die Nanoröhren können auch im Wesentlichen zylindrische, graphitische Nanoröhren sein, welche im Wesentlichen frei von pyrolytisch abgelagertem Kohlenstoff sind, eher bevorzugt solche, welche durch eine Projektion der Graphitschichten auf die Fibrillen-Achse, welche sich über eine Distanz von mindestens 2 Fibrillen-Durchmessern erstreckt, charakterisiert sind und/oder solche, welche zylindrische, graphitische Schichten, deren c-Achsen im Wesentlichen senkrecht zu ihrer zylindrischen Achse aufweisen. Diese Zusammensetzungen sind uniform, in dem jedes R gleich ist.
  • Die Partikel schließen auch nicht-uniform substituierte Nanoröhren ein. Diese enthalten Zusammensetzungen der Formel [CnHL]-Rm worin n, L, m, R und die Nanoröhre selbst wie oben definiert sind, vorausgesetzt, dass jedes R keinen Sauerstoff enthält oder, wenn jedes R eine Sauerstoff enthaltende Gruppe ist, COOH nicht präsent ist.
  • Funktionalisierte Nanoröhren der Formel [CnHL]-Rm worin n, L, m, R und R' die gleiche Bedeutung wie oben haben und die Kohlenstoffatome Oberflächenkohlenstoffatome einer Fischgrät-Fibrille sind, welche eine Länge zu Durchmesser Verhältnis größer als 5 aufweisen, sind ebenfalls als Partikel innerhalb der Erfindung enthalten. Diese können uniform oder nicht-uniform substituiert sein. Vorzugsweise sind die Nanoröhren frei von thermischem Überzug und weisen Durchmesser weniger als 0,5 µ auf.
  • Ebenso als Partikel in der Erfindung enthalten sind funktionalisierte Nanoröhren der Formel [CnHL]-[R'-R]m worin n, L, m, R' und R die gleiche Bedeutung wie oben haben. Die Kohlenstoffatome Cn sind Oberflächenkohlenstoffe einer im Wesentlichen zylindrischen, graphitischen Nanoröhre von im Wesentlichen konstantem Durchmesser. Die Nanoröhren schließen solche ein, welche ein Länge zu Durchmesser-Verhältnis von größer als 5 aufweist und einen Durchmesser von weniger als 0,5 µ aufweisen, bevorzugt weniger als 0,1 µ. Die Nanoröhren können auch im Wesentlichen zylindrische, graphitische Nanoröhren sein, welche im Wesentlichen frei von pyrolytisch abgelagertem Kohlenstoff sind. Eher bevorzugt sind solche, welche durch eine Projektion der Graphitschichten auf die Fibrillen-Achse, welche sich über eine Distanz von mindestens 2 Fibrillen-Durchmessern erstreckt und/oder solche, welche zylindrische, graphitische Schichten, deren c-Achsen im Wesentlichen senkrecht zu ihrer zylindrischen Achsen sind, aufweisen.
  • In sowohl uniform als auch nicht-uniform substituierten Nanoröhren haben die Oberflächenatome Cn eine Reaktion eingegangen. Die meisten Kohlenstoffatome in der Oberflächenschicht einer graphitischen Fibrille sind, wie in Graphit, basal-planare Kohlenstoffe. Basal-planare Kohlenstoffe sind relativ innert gegenüber chemischen Angriffen. An Defektstellen, wo beispielsweise die graphitische Ebene gestört ist, sich vollständig um die Fibrille auszudehnen, gibt es Kohlenstoffatome analog zu den Kanten-Kohlenstoffatomen einer Graphit-Ebene (siehe Urry, Elementary Equilibrium Chemistry of Carbon, Wiley, New York 1989 für eine Diskussion von Kanten- und basal-planaren Kohlenstoffen).
  • An Defektstellen können Kanten- oder basal-planare Kohlenstoffe tieferer, innerer Schichten der Nanoröhre freigelegt werden. Die Bezeichnung Oberflächenkohlenstoff enthält alle jene Kohlenstoffe, basal-planar und kantig, der äußersten Schicht der Nanoröhre, ebenso wie Kohlenstoffe, sowohl basal-planar und/oder kantig, von tieferen Schichten, welche an Defektstellen der äußersten Schicht freigelegt werden können. Die Kanten-Kohlenstoffe sind reaktiv und müssen irgendein Heteroatom oder -gruppe enthalten, um Kohelnstoffvalenzen zu sättigen.
  • Die oben beschriebenen substituierten Nanoröhren können mit Vorteil weiter funktionalisiert sein. Derartige Zusammensetzungen enthalten Zusammensetzungen der Formel [CnHL]-Am worin die Kohlenstoffe Oberflächen-Kohlenstoffe einer Nanoröhre sind, n, L und m sind wie oben beschrieben,
    A ist ausgewählt aus
    Figure 00140001
    Y ist eine geeignete funktionelle Gruppe eines Proteins, eines Peptids, eines Enzyms, eines Antikörpers, eines Nukleotids, eines Oligonukleotids, eines Antigens oder eines Enzym-Substrates, Enzym-Inhibitors oder das Obergangszustand-Analogon eines Enzym-Substrates oder ist ausgewählt aus R'-OH, R'-NH2, R'SH, R'CHO, R'CN, R'X, R'SiR'3, R'Si(OR')yR'3-y, R'Si(O-SiR'2)OR', R'-R'', R'-N-CO, (C2H4O)wH, (C3H6O)wH, (C2H4O)w-R', (C3H6O)w-R' und R', und
    w ist eine ganze Zahl größer als eins und kleiner als 200.
  • Die Kohlenstoffatome Cn sind Oberflächenkohlenstoffe einer im Wesentlichen zylindrischen, graphitischen Nanoröhre von im Wesentlichen konstantem Durchmesser. Die Nanoröhren schließen solche ein, welche ein Länge zu Durchmesser-Verhältnis von größer 5 und einen Durchmesser von weniger als 0,1 µ aufweisen, bevorzugt weniger als 0,05 µ. Die Nanoröhren können auch im Wesentlichen zylindrische, graphitische Nanoröhren sein, welche im Wesentlichen frei von pyrolytisch abgelagertem Kohlenstoff sind, eher bevorzugt solche, welche durch eine Projektion der Graphitschichten auf die Fibrillen-Achse, welche sich über eine Distanz von mindestens 2 Fibrillen-Durchmessern erstreckt charakterisiert sind und/oder solche, welche zylindrische, graphitische Schichten, deren c-Achsen im Wesentlichen senkrecht zu ihrer zylindrischen Achse sind, aufweisen. Bevorzugt sind die Nanoröhren frei von thermischem Überzug und weisen Durchmesser kleiner 0,5 µ auf. Die funktionalen Nanoröhren der Struktur 7 [CnHL]-[R'-R]m können auch funktionalisiert sein, zur Herstellung von Zusammensetzungen der Formel [CnHL]-[R'-A]m worin n, L, m, R' und A wie oben definiert sind. Die Kohlenstoffatome Cn sind Oberflächenkohlenstoffe einer im Wesentlichen zylindrischen, graphitischen Nanoröhre von im Wesentlichen konstantem Durchmesser. Die Nanoröhren schließen solche ein, welche ein Länge zu Durchmesser Verhältnis von größer 5 und einen Durchmesser von weniger als 0,5 µ aufweisen, bevorzugt weniger als 0,1 µ. Die Nanoröhren können auch im Wesentlichen zylindrische, graphitische Nanoröhren sein, welche im Wesentlichen frei von pyrolytisch abgelagertem Kohlenstoff sind. Eher bevorzugt sind solche, welche durch eine Projektion der Graphitschichten auf die Fibrillen-Achse, welche sich über eine Distanz von mindestens zwei Fibrillen-Durchmessern erstreckt, charakterisiert sind und/oder solche, welche zylindrische, graphitische Schichten, deren c-Achsen im Wesentlichen senkrecht zu ihrer zylindrischen Achse sind, aufweisen. Bevorzugt sind die Nanoröhren frei von thermischem Überzug und weisen Durchmesser von weniger als 0,5 µ auf
  • Die Partikel der Erfindung schließen auch Nanoröhren ein, auf denen bestimmte zyklische Verbindungen absorbiert werden. Diese enthalten Zusammensetzungen von Stoffen der Formel [CnHL]-[X-Ra]m worin n eine ganze Zahl ist, L eine Zahl kleiner als 0,1n, m kleiner als 0,5n, a ist Null oder eine Zahl kleiner als 10, x ist ein polynuklearer, aromatischer, polyheteronuklearer aromatischer oder metallopoylheteronuklearer aromatischer Teil und R ist wie oben rezitiert. Die Kohlenstoffatome Cn sind Oberflächenkohlenstoffe einer im Wesentlichen zylindrischen, graphitischen Nanoröhre von im Wesentlichen konstantem Durchmesser. Die Nanoröhren schließen solche ein, welche ein Länge zu Durchmesser-Verhältnis von größer 5 und einen Durchmesser von weniger als 0,5 µ aufweisen, bevorzugt weniger als 0,1 µ. Die Nanoröhren können auch im Wesentlichen zylindrische, graphitische Nanoröhren sein, welche im Wesentlichen frei von pyrolytisch abgelagertem Kohlenstoff sind, eher bevorzugt solche, welche durch eine Projektion der Graphitschichten auf die Fibrillen-Achse, welche sich über eine Distanz von mindestens zwei Fibrillen-Durchmessern erstreckt charakterisiert sind, und/oder solche, welche zylindrische, graphitische Schichten, deren c-Achsen im Wesentlichen senkrecht zu ihrer zylindrischen Achse sind, aufweisen. Bevorzugt sind die Nanoröhren frei von thermischem Überzug und weisen Durchmesser von weniger als 0,5 µ auf.
  • Bevorzugte zyklische Verbindungen sind planare Makrozyklen, wie beschrieben auf S. 76 in Cotton and Wilkinson, Advanced Organic Chemistry. Eher bevorzugte zyklische Verbindungen zur Adsorption sind Porphyrine und Phthalocyanine.
  • Die adsorbierten zyklischen Verbindungen können funktionalisiert sein. Solche Zusammensetzungen enthalten Verbindungen der Formel [CnHL]-[X-Aa]m worin m, n, L, a, X und A wie oben definiert sind und die Kohlenstoffe Oberflächenkohlenstoffe einer im Wesentlichen zylindrischen graphitischen Nanoröhre wie oben beschrieben sind.
  • Die wie oben beschriebenen, funktionalisierten Kohlenstoff-Fibrillen können in eine Matrix eingebaut werden. Vorzugsweise ist die Matrix ein organisches Polymer (z. B. ein thermisch aushärtendes Kunstharz wie beispielsweise Epoxy, Bismaleimid, Polyamid, oder Polyesterharze; ein thermoplastisches Harz; ein Reaktions-Spritzgussharz oder ein Elastomer wie beispielsweise natürliches Gummi, Styrol-Butadien-Gummi oder cis-1,4-Polybutadien); ein anorganisches Polymer (z. B. ein polymeres anorganisches Oxid wie beispielsweise Glas), ein Metall (z. b. Blei oder Kupfer) oder ein keramisches Material (z. B. Portland-Zement).
  • Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, werden die funktionalisierten Fibrillen besser in Polymer-Systemen dispergiert, weil die modifizierten Oberflächeneigenschaften eher mit dem Polymer kompatibel sind oder, weil die modifizierten funktionellen Gruppen (insbesondere Hydroxyl- oder Amin-Gruppen) direkt als terminale Gruppen an das Polymer gebunden werden. Auf diese Weise binden Polymersysteme wie beispielsweise Polycarbonate, Polyurethane, Polyester oder Polyamide/imide direkt an die Fibrillen, sodass die Fibrillen leichter mit verbesserter Anhaftung dispergieren.
  • Funktionelle Gruppen werden auf die Oberfläche von Kohlenstoff-Fibrillen durch Kontaktieren der Kohlenstoff-Fibrillen mit einem starken Oxidationsmittel für eine Zeitdauer ausreichend, um die Oberfläche der Fibrillen zu oxidieren, aufgebracht und weiter durch Kontaktieren der Fibrillen mit einem Reaktanden, welcher zum Hinzufügen einer funktionellen Gruppe auf die oxidierte Oberfläche geeignet ist. Vorzugsweise umfasst das Oxidationsmittel eine Lösung eines Alkalimetall-Chlorates in einer starken Säure. In anderen Ausführungsformen ist das Alkalimetall-Chlorat Natriumchlorat oder Kaliumchlorat. In bevorzugten Ausführungsformen ist die verwendete starke Säure Schwefelsäure.
  • Hinreichende Zeitdauern zur Oxidation reichen von ungefähr 0,5 h bis ungefähr 24 h. Ein Netzwerk von Kohlenstoff-Fibrillen wird hergestellt durch Kontaktieren der Kohlenstoff-Fibrillen mit einem Oxidationsmittel für eine Zeitdauer hinreichend, die Oberfläche der Kohlenstoff-Fibrillen zu oxidieren, Kontaktieren der Oberflächen-oxidierten Kohlenstoff-Fibrillen mit einem Reaktanden geeignet zum Hinzufügen einer funktionellen Gruppe auf die Oberfläche der Kohlenstoff-Fibrillen und weiter Kontaktieren der Oberflächen-funktionalisierten Fibrillen mit einem Vernetzungsmittel, welches wirksam ein Netzwerk von Kohlenstoff-Fibrillen produziert. Ein bevorzugtes Vernetzungsmittel ist ein Polyol, Polyamin oder Polycarbonsäure.
  • Die funktionalisierten Fibrillen können auch in Form rigider Netzwerke von Fibrillen vorliegen. Ein wohl dispergiertes, drei-dimensionales Netzwerk von Säure-funktionalisierten Fibrillen kann z. B. durch Vernetzung der Säuregruppen (Inter-Fibrillen) mit Polyolen oder Polyaminen stabilisiert werden, um ein rigides Netzwerk zu bilden.
  • Die Fibrillen-Partikel enthalten auch drei-dimensionale Netzwerke, welche durch Vernetzung funktionalisierter Fibrillen gemäß der Erfindung gebildet werden. Diese Komplexe enthalten mindestens zwei funktionalisierte Fibrillen, welche durch ein oder mehrere Linker, umfassend eine direkte Bindung oder einen chemischen Teil, vernetzt sind. Diese Netzwerke umfassen poröse Medien von bemerkenswert einheitlich äquivalenter Porengröße.
  • Obwohl die Zwischenräume zwischen diesen Fibrillen sowohl in Größe als auch Form irregulär sind, können sie als Poren aufgefasst werden und durch Verfahren, welche zur Charakterisierung poröser Medien verwendet werden, charakterisiert werden. Die Größe der Zwischenräume in solchen Netzwerken kann durch die Konzentration und den Grad der Dispersion von Fibrillen und durch die Konzentration und Kettenlänge der Vernetzungsmittel kontrolliert werden.
  • Der die Partikel enthaltende Komplex kann beispielsweise auf einer Elektrodenoberfläche gesammelt werden, wo er angeregt wird und durch Anlegen einer Spannung an die Elektrode zur Elektrochemilumineszenz induziert wird. Während die Erfindung bevorzugt durch Sammlung des Komplexes in einer Messungszone, d. h. auf einer Oberfläche, an der er zur Lumineszenz gebracht werden kann, durchgeführt wird, umfasst die Erfindung auch Verfahren, in denen der Komplex in einer Messungszone gesammelt wird und anschließend werden Mittel zu dieser Zone gebracht oder andere Schritte zur Induktion und Messung der Lumineszenz eingeleitet.
  • Das Sammeln des Komplexes kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, einschließlich Sedimentation, Filtration, Zentrifugieren und magnetische Anziehung magnetisch responsiver Partikel, welche einen Teil des Komplexes bilden. Die verschiedenen Ausführungsformen werden im Folgenden genauer beschrieben.
  • Die Erfindung ist auch ein Verfahren zur Durchführung eines Bindungs-Assays für einen in einer Probe vorhandenen interessierenden Analyten, umfassend die Schritte:
    • (a) Bildung einer Zusammensetzung enthaltend
    • (i) die Probe;
    • (ii) eine Assay-Perfomance Substanz, welche eine mit einer Markierungsverbindung verbundene Komponente enthält, umfassend eine zur Lumineszenzenz induzierbare Markierungsverbindung und
    • (iii) eine Vielzahl von funktionalisierten Graphit-Nanoröhren, die an eine Assay-Performance Substanz gebunden sind;
    • (b) Inkubation der Zusammensetzung um einen Komplex zu bilden, welcher eine funktionalisierte Graphit-Nanoröhre und die Markierungsverbindung beinhaltet,
    • (c) Sammeln des Komplexes in einer Messzone;
    • (d) Einführen der Markierungsverbindung in den Komplex zum Lumineszieren durch Oberflächen-selektive Anregung
    • (e) Messung der emittierten Lumineszenz zur Bestimmung des Vorhandenseins des interessierenden Analyten in der Probe.
  • Insbesondere wird der Komplex durch Mittel zur Induktion von Lumineszenz und Messung der Lumineszenz an der Oberfläche gesammelt. Das Verfahren basiert vorteilhaft auf der Messung von Elektrochemilumineszenz, wobei der Komplex an einer Elektroden-Oberfläche gesammelt wird. Die Erfindung ist auch ein Verfahren zur Durchführung eines Bindungs-Assays für einen in einer Probe vorhandenen interessierenden Analyten, basierend auf der Messung von Elektrochemilumineszenz an einer Elektroden-Oberfläche umfassend die Schritte:
    • (a) Bildung einer Zusammensetzung enthaltend
    • (i) die Probe;
    • (ii) eine Assay-Performance Substanz, umfassend eine Komponente, welche mit einer zur Elektrochemilumineszenz induzierbaren Markierungsverbindung verbunden ist;
    • (iii) eine Vielzahl funktionalisierter Graphit-Nanoröhren, die an eine Assay-Performance Substanz gebunden sind; wobei die zweite Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder zur Konkurrierung mit dem Analyten geeignet ist;
    • b) Inkubation der Zusammensetzung, um einen Komplex zu bilden, welcher eine Graphit-Nanoröhre und die Markierungsverbindung enthält;
    • c) Sammeln des Komplexes;
    • d) Herbeiführen eines Kontaktes des gesammelten Komplexes mit einer Elektrodenoberfläche und Einführen der Markierungsverbindung in den Komplex zur Lumineszenz durch Anlegen einer Spannung an die Elektrode; und
    • e) Messung der emittierten Lumineszenz an der Elektrodenoberfläche, um das Vorhandensein des interessierenden Analyten in der Probe zu messen.
  • Die Erfindung ist auch ein Verfahren zur Durchführung eines Bindungs-Assays für einen in einer Probe vorhandenen interessierenden Analyten basierend auf der Messung der Elektrochemilumineszenz an einer Elektroden-Oberfläche, umfassend die Schritte:
    • (a) Bildung einer Zusammensetzung enthaltend
    • (i) die Probe,
    • (ii) eine Assay-Performance Substanz, umfassend eine Komponente, welche mit einer zur Elektrochemilumineszenz induzierbaren Markierungsverbindung verbunden ist, und
    • (iii) eine Vielzahl von magnetisch responsiven, suspendierten, funktionalisierten Graphit-Nanoröhren, die an die Assay-Performance-Substanz gebunden sind;
    • b) Inkubation der Zusammensetzung, um einen Komplex zu bilden, welcher eine Graphit-Nanoröhre und die Markierungsverbindung enthält;
    • c) Sammeln des Komplexes durch Anlegen eines Magnetfeldes an die Graphit-Nanoröhren;
    • d) Herbeiführen eines Kontaktes des gesammelten Komplexes mit einer Elektrodenoberfläche und Einführen der Markierungsverbindung in den Komplex zur Lumineszenz durch Anlegen einer Spannung an die Elektrode; und
    • e) Messung der emittierten Lumineszenz an der Elektrodenoberfläche, um das Vorhandensein des interessierenden Analyten in der Probe zu messen.
  • Das Anlegen des Magnetfeldes verursacht ein Sammeln des Komplexes an der Oberfläche der Elektrode. Zusätzlich besteht die Erfindung in einer Zusammensetzung von Stoffen zur Verwendung als Reagenz in einem mikropartikulär-basiertem Bindungs-Assay umfassend funktionalisierte graphitische Nanoröhren und mindestens eine weitere Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) Elektrolyten;
    • b) Markierungsverbindung, enthaltend einen ECL-Teil;
    • c) interessierendem Analyten oder einem Analogon des interessierenden Analyten
    • d) einem Bindungspartner des interessierenden Analyten oder seinem Analogon;
    • e) einer reaktiven Komponente, die zur Reaktion mit c) oder d) geeignet ist,
    • f) einem Reduktant; und
    • g) einem Elektrochemilumineszenz-Reaktionsverstärker;
    sofern jedoch keine beabsichtigten Assay zwei in jeglicher Verbindungszusammensetzung enthaltenen Komponenten miteinander während der Aufbewahrung reaktionsfähig sind, um so ihre Funktion in dem zu beeinträchtigen.
  • Das Reagenz kann magnetisch responsive Graphit-Nanoröhren enthalten.
  • Die Erfindung besteht auch in einem Assay-Reagenz für ein Assay basierend auf einer Bindungsreaktion und der Messung eines Elektrochemilumineszenzphänomens umfassend:
    • a) einen Elektrolyten;
    • b) eine Vielzahl von magnetisch responsiven, funktionalisierten Graphit-Nanoröhren, die eine an eine Assay-Performance-Substanz gebundene Oberfläche aufweisen; und
    • c) eine Bindungseigenschaften aufweisende Markierungssubstanz, wobei die Markierungssubstanz einen Elektrochemilumineszenz-Eigenschaften aufweisenden chemischen Teil enthält.
    • a) Bildung einer Zusammensetzung enthaltend
    • (i) die Probe und
    • (ii) eine funktionalisierte Graphit-Nanoröhre, die an eine Assay-Komponente gebunden ist, welche an eine zur Lumineszenz induzierbare Markierungsverbindung gebunden ist, wobei die Komponente ein Substrat des interessierenden Analyten ist;
    • b) Inkubation der Zusammensetzung unter Bedingungen, um dem Analyten die Spaltung der Komponente zu ermöglichen;
    • c) Abtrennung der funktionalisierten Graphit-Nanoröhre von der Zusammensetzung;
    • d) Induzieren der freien Markierungsverbindung zum Lumineszieren;
    • e) Messung der emittierten Lumineszenz, um das Vorhandensein des interessierenden Analyten in der Probe zu messen.
  • Während Batch-Assays durchgeführt werden können, können kontinuierliche oder halbkontinuierliche Assays in Durchfluss-Zellen durchgeführt werden. In einer Durchflusszelle verbleibt die Festphase in der Messzelle, während die Lösung die Zelle durchströmt und aus der Zelle austritt. Wenn die Festphase (z. B. Partikel) dichter als Wasser ist, d. h. eine Dichte größer als die von Wasser aufweist (größer 1,0 g/mL), bewirkt die Gravitationskraft auf den Partikeln ihr Absinken auf den Boden der Zelle. Die Zelle kann so konstruiert sein, dass sich die Partikel am Boden absetzen, während das Fluid die Zelle durchströmt oder die Zelle kann so konstruiert sein, dass ein Großteil der Probe in der Zelle in einem säulenartigen Raum über der Arbeitselektrode eines ECL-Systems enthalten ist. Hinreichende Verweilzeit in der Zelle muss gewährleistet sein, um ein Absetzten der Partikel auf die Oberfläche der Elektrode vor der ECL-Induktion zu ermöglichen.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Assay-Zusammensetzung, welche suspendierte Fibrillen mit einer Dichte größer als der des Restes der Assay-Zusammensetzung einem Zentrifugieren unterworfen werden, um die Teilchen zu einer Messungszone abzuziehen, wo sie anschließend in Kontakt mit beispielsweise einer Elektrode gebracht werden, um Elektrochemilumineszenz zu induzieren oder direkt in Kontakt mit einer Elektrode im Schritt des Zentrifugierens gebracht werden.
  • In dieser Ausführungsform ist die Messzelle mit Mitteln versehen, um die Probe und das Probengehäuse schnell zu rotieren. Zentrifugalkräfte veranlassen die Fibrillen in der Probe, sich aus der Drehachse des Probengehäuses herauszubewegen und an der äußeren Oberfläche des Probengehäuses anzusammeln. Die äußeren Oberflächen eines solchen Probengehäuses können in der Arbeitselektrode eines ECL-Messsystems bestehen. In einer dritten Ausführungsform können die Fibrillen durch Filtration aus der Assay-Zusammensetzung entfernt werden. In dieser Ausführungsform brauchen die Partikel keine Dichte größer als der Rest der Assay-Zusammensetzung aufzuweisen. Die Fibrillen werden von der Lösung getrennt und durch Ziehen der Lösung durch einen Filter konzentriert, beispielsweise durch Pumpen und Sammeln der Partikel auf der Oberfläche des Filters. Diese Oberfläche des Filters ist beispielsweise mit einem dünnen Metall-Film beschichtet, welcher als Arbeitselektrode in einem ECL-Detektionssystem dienen kann.
  • In einer anderen Ausführungsform sind die suspendierten Fibrillen magnetisch responsiv, beispielsweise sind sie paramagnetisch oder ferromagnetisch und werden in einer Messzone oder vorzugsweise direkt an der Oberfläche einer Elektrode durch Anlegen eines Magnetfeldes an die Partikel gesammelt. Die Messzelle ist mit einem Magneten ausgestattet. Das Magnetfeld übt eine Kraft auf die Partikel aus, während sie sich in einer Batch-Zelle befinden oder durch eine Durchflusszelle strömen, und verursacht ihre Trennung vom Volumen der Lösung auf die Oberfläche der Zelle, welche in nächster Nähe zum Magneten angeordnet ist. Ist der Magnet in geeigneter Orientierung und in Nähe zu der Arbeitselektrode eines ECL-Detektionssystems angeordnet, werden sich die Partikel an der Oberfläche der Arbeitselektrode konzentrieren.
  • Es können einige verschiedene heterogene und homogene Formate für Bindungs-Assays unter Verwendung der oben beschriebenen Methoden zum Sammeln und Konzentrieren des Komplexes auf der Oberfläche einer Elektrode realisiert werden. In einem heterogenen Bindungs-Assay wird der Komplex vor dem Messen der Lumineszenz der Markierung von der Zusammensetzung getrennt. In homogenen Assays wird keine Trennung der gebundenen (an die Festphase) und ungebundenen, markierten Reagenzien vorgenommen. Wird der Komplex in einem homogenen Assay an der Oberfläche der Arbeitselektrode konzentriert, ist das gemessene Signal der Markierung viel größer als es in Abwesenheit eines Sammlungsschrittes wäre. Das Signal von nicht-komplexierten, markierten Reagenzien wird im Gegensatz dazu nicht verändert. Deshalb ist trotz der Gegenwart der nicht-komplexierten, markierten Reagenzien in der Messzelle das Signal eines gesammelten Komplexes stärker als in einem Assay ohne Sammlung des Komplexes. Die Detektionsgrenze für das Bindungs-Assay wird als ein Resultat des Sammlungsverfahrens sehr verbessert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein in-situ Trennschritt in dem homogenen Bindungs-Assay Verfahren enthalten. Nachdem die Assay-Zusammensetzung, d. h. Probe, Assay-Performance Substanz und Partikel in die Messzelle gepumpt worden sind und der Komplex auf der Arbeitselektrode erfasst worden ist, wird ein zweites Fluid durch die Zelle gepumpt, welches frei von Markierungen oder markierten Reagenzien ist und damit ein in-situ Waschen und Trennen des Komplexes von ungebundenen Komponenten der Assay-Zusammensetzung vollzogen. Diese Assay-Methode ist technisch ein heterogenes Bindungs-Assay. Jedoch ist die Fähigkeit zur Durchführung der Trennung innerhalb der Messzelle von Vorteil, in dem sie keine zusätzliche Trennvorrichtung benötigt und das Verfahren gewöhnlich sehr viel schneller ist als externe Trennmethoden. Heterogene Bindungs-Assays werden in Anwendung der Erfindung durch Mischen der Komponenten der Assay-Zusammensetzung und dem Ermöglichen einer Reaktion für eine vorbestimmte Zeitdauer durchgeführt. Die Assay-Zusammensetzung wird dann einem Trennschritt unterworfen, wobei die Lösung von den Partikeln getrennt wird. Daraufhin wird Elektrochemilumineszenz entweder von dem Komplex oder der Lösung bestimmt. Das Messen der ECL des Komplexes nach einem Konzentrierungsschritt erlaubt eine Bestimmung des Analyten mit besserer Genauigkeit und mit einer niedrigeren Detektionsgrenze, als es ohne Konzentrierung möglich wäre.
  • Repräsentatives Beispiel
  • In einer repräsentativen Ausführungsform der Erfindung reagiert die funktionalisierte Fibrille des Weiteren mit Avidin (eine Assay-Performance Substanz), um sie für die Verwendung in einem ECL-Assay vorzubereiten. Die derart modifizierte Fibrille reagiert anschließend mit einem biotinyliertem Oligonucleotid (eine Assay-Performance Substanz) um einen Fibrille-Avidin-Biotin-Oligonucleotid-Komplex zur Verwendung in einem DNA-Test-Assay zu bilden. Dieser Komplex kann als eine Sonde für einen interessierenden Oligonucleotid-Analyten verwendet werden, welcher in einem Sandwich-Assay komplementär zu der Sonde ist und in der Gegenwart eines zweiten Oligonucleotids komplementär zu dem mit einem ECL-Teil markierten, interessierenden Analyten ist.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung, ebenso wie weitere Gegenstände und Merkmale davon, werden aus der folgenden Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen klarer und umfassender verstanden werden.
  • Die Erfindung kann im Allgemeinen auf interessierende Analyten angewendet werden, welche zum Eingehen von Bindungsreaktionen geeignet sind. Diese Reaktionen enthalten beispielsweise Antigen-Antikörper, Ligand-Rezeptor, DNA- und RNA-Wechselwirkungen und andere bekannte Reaktionen. Die Erfindung bezieht sich auf verschiedene Methoden und Assays zur qualitativen und quantitativen Detektion des Vorhandenseins solcher interessierender Analyten in einer Mehrkomponenten-Probe.
  • Die Proben
  • Die Probe, welche den interessierenden Analyten enthalten mag, kann in fester Form, als Emulsion, als Suspension, flüssig oder gasförmig sein, kann beispielsweise abgeleitet sein aus Zellen und Produkten abgeleitet aus Zellen, Wasser, Lebensmittel, Blut, Serum, Haar, Schweiß, Urin, Stuhl, Gewebe, Speichel, Öle, organische Lösungsmittel oder Luft. Die Probe kann weiterhin beispielsweise Wasser, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, n-Methyl-Pyrrolidon oder Alkohole oder Mischungen daraus umfassen.
  • Die Analyten
  • Typische interessierende Analyten sind eine ganze Zelle oder Oberflächen-Antigen, subzelluläres Partikel, ein Virus, Prion, Viroid, Antikörper, Antigen, Hapten, Fettsäure, Nukleinsäure, Protein, Lipoprotein, Polysaccharid, Lipopolysaccharid, Glycoprotein, Peptid, Polypeptid, zellulärer Metabolit, Hormon, pharmakologisches Mittel, synthetisches organisches Molekül, organometallisches Molekül, Tranquilizer, Barbiturat, Alkaloid, Steroid, Vitamin, Aminosäure, Zucker, Lectin, rekombinantes oder abgeleitetes Protein, Biotin, Avidin, Streptavidin oder ein anorganisches Molekül vorhanden in der Probe. Typischerweise liegt der interessierende Analyt in einer Konzentration von 10–3-molar oder weniger, beispielsweise so niedrig wie 10–12-molar oder weniger, vor.
  • Assay-Performance Substanz
  • Die Assay-Performance Substanz, welche mit der den Analyten enthaltenden Probe verbunden ist, enthält mindestens eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
    • (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder seinem Analogon, wie oben definiert,
    • (ii) einem Bindungspartner des interessierenden Analyten oder seine Analogon und
    • (iii) einer wie oben definierten, reaktiven, zur Bindung mit (i) oder (ii) geeigneten reaktiven Komponente, wobei eine der Substanzen an eine Verbindung oder einen Teil, beispielsweise ein ECL-Teil, welcher zur Lumineszenz induzierbar ist, gebunden ist. Die markierte Substanz kann eine ganze Zelle oder Oberflächen-Antigen, ein subzelluläres Partikel, Virus, Prion, Viroid, Antikörper, Antigen, Hapten, Lipid, Fettsäure, Nukleinsäure, Polysaccharid, Protein, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Glycoprotein, Peptid, Polypeptid, zellulärer Metabolit, Hormon, pharmakologisches Mittel, Tranquilizer, Barbiturat, Alkaloid, Steroid, Vitamin, Aminosäure, Zucker, nicht-biologisches Polymer (vorzugsweise löslich), Lectin, rekombinantes oder abgeleitetes Protein, synthetisches organisches Moleküle, organometallisches Molekül, anorganisches Molekül, Biotin, Avidin oder Streptavidin sein. In einer Ausführungsform ist das Reagenz ein elektrochemilumineszenter Anteil, gekoppelt an einen Antikörper, Antigen, Nukleinsäure, Hapten, kleine Nukleotid-Sequenz, Oligomer, Ligand, Enzym oder Biotin, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G oder Komplexe daraus oder andere sekundäre Bindungspartner, welche zur Bindung an einen primären Bindungspartner durch Proteinwechselwirkungen geeignet sind.
  • Analoga des Analyten von Interesse, welche natürlich oder synthetisch sein können, sind typischerweise Verbindungen, welche Bindungseigenschaften vergleichbar denen des Analyten aufweisen, aber auch Verbindungen von höherer oder niederer Bindungsfähigkeit sein können. Die reaktiven Komponenten, geeignet zur Bindung mit dem Analyten oder seinem Analogon und/oder mit einem Bindungspartner davon und durch welche der ECL-Anteil an den Analyten gebunden werden kann, sind entsprechend ein zweiter Antikörper oder ein Protein, wie beispielsweise Protein A oder Protein G oder Avidin oder Biotin oder eine andere aus dem Stand der Technik zum Eingehen von Bindungsreaktionen bekannte Komponente.
  • Die Markierungen
  • Vorteilhaft sind die ECL-Anteile Metallchelate. Das Metall dieses Chelates ist entsprechend jedes Metall, dessen Metallchelat unter den elektrochemischen Bedingungen, welche dem fraglichen Reaktionssystem auferlegt sind, lumineszieren wird. Das Metall eines solchen Metallchelates ist beispielsweise ein Übergangsmetall (wie z. B. ein d-Block Übergangsmetall) oder ein Seltenerdmetall. Das Metall ist bevorzugt Ruthenium, Osmium, Rhenium, Iridium, Rhodium, Platin, Indium, Palladium, Molybdenum, Technetium, Kupfer, Chrom oder Wolfram. Besonders bevorzugt sind Ruthenium and Osmium.
  • Die Liganden, welche an das Metall in solchen Chelaten gebunden sind, sind üblicherweise heterozyklischer oder organischer Natur und spielen eine Rolle in der Bestimmung, ob das Metallchelat in einer wässrigen Umgebung oder in einer organischen oder anderen nichtwässrigen Umgebung löslich ist oder nicht. Die Liganden können mehrzähnig sein und können substituiert sein. Mehrzähnige Liganden schließen aromatische und aliphatische Liganden ein. Geeignete aromatische, mehrzähnige Liganden schließen aromatische, heterozyklische Liganden ein. Bevorzugte aromatische, heterozyklische Liganden sind Stickstoff-enthaltend, wie beispielsweise Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl und Phenanthrolyl. Geeingnete Substituenten schließen beispielsweise Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl, substituiertes Aralkyl, Carboxylat, Carboxaldehyd, Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxy, Imino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Amidin, Guanidin, Ureide, Schwefel-enthaltende Gruppen, Phosphor-enthaltende Gruppen und die Carboxylat-Ester von N-Hydroxy-Succinimid ein. Die Chelate können einen oder mehrere einzähnige Liganden aufweisen, von denen eine breite Vielzahl aus dem Stand der Technik bekannt ist. Geeignete einzähnige Liganden schließen beispielsweise Kohlenmonoxid, Cyanid, Isocyanide, Halogenide und aliphatische, aromatische und heterocyclische Phosphine, Amine, Stilbene und Arsine ein.
  • Beispiele geeigneter Chelate sind Bis[(4,4 carbmethoxy)-2,2'-bipyridin] 2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-Dioxolan Ruthenium (II); Bis(2,2'bipyridin)[4-(butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]Ruthenium (II); Bis (2,2'-bipyridin)[4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)-Buttersäure]Ruthenium (II); Tris(2,2'bipyridin)Ruthenium (II); (2,2'-bipyridin)[bis-bis(1,2-diphenylphosphin)Ethylen] 2[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-Dioxolan Osmium (II); Bis (2,2'-bipyridin)[4-(4'-methyl-2,2'bipyridin)-Butylamin]Ruthenium (II); Bis (2,2'-bipyridin)[I-bromo-4(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)Butan]Ruthenium (II); Bis(2,2'-bipyridin)Maleimidohexansäure, 4-methyl-2,2'-bipyridin-4'Butylamid Ruthenium (II). Weitere ECL-Teile werden in der PCT-Offenlegungsschrift US 87/00987 und der PCT-Offenlegungsschrift 88/0394 beschrieben.
  • Die Funktion der ECL-Teile besteht darin, elektromagnetische Strahlung als ein Resultat der Einführung in das Reaktionssystem elektrochemischer Energie zu emittieren. Um das zu tun, müssen sie zur Anregung in einen angeregten Energiezustand und auch zur Emission elektromagnetischer Strahlung geeignet sein, beispielsweise einem Licht-Photon beim Herabfallen vom angeregten Zustand. Der theoretischen Analyse des Mechanismus der Beteiligung des ECL-Teils an der Elektrochemilumineszenz-Reaktion nicht wünschend verpflichtet zu sein, vermuten wir, dass er durch die Einführung der elektrochemischen Energie in das Reaktionssystem oxidiert wird und daraufhin, durch Wechselwirkung mit einem im System vorhandenen Reduktanden, in den angeregten Zustand konvertiert wird. Dieser Zustand ist relativ instabil und das Metallchelat fällt schnell in einen stabileren Zustand. So verfahrend gibt das Chelat elektromagnetische Strahlung ab, beispielsweise als Licht-Photon, welches detektierbar ist.
  • Die Menge an Metallchelat oder anderen Metall enthaltendem ECL-Teil, aufgenommen gemäß der Erfindung, wird von System zu System variieren. Allgemein ist die Menge eines solchen nutzbar gemachten Teils jene Menge, welche wirksam in der Emission einer detektierbaren, und wenn gewünscht, quantifizierbaren Emission elektromagnetischer Energie aus vorstehend genannter Zusammensetzung oder System resultiert. Die Detektion und/oder Quantifizierung eines interessierenden Analyten wird typischerweise aus einem Vergleich der Lumineszenz einer einen interessierenden Analyten enthaltenden Probe und einem ECL-Teil mit der Lumineszenz, welche durch einen mit bekannten Mengen des interessierenden Analyten und einem ECL-Teil ausgebildeten Eichstandard emittiert wird, bestimmt. Dies setzt ein homogenes Format voraus. Im homogenen Modus wird eine Trennung, wie zuvor diskutiert, vor der ECL-Analyse durchgeführt.
  • Wie der Fachmann verstehen wird, werden die Identität und die Menge des Metall enthaltenden ECL-Teils von einem zum anderen System variieren, in Abhängigkeit von den vorherrschenden Bedingungen. Der passende Metall enthaltende ECL-Teil und eine hinreichende Menge davon zur Erzielung des gewünschten Resultates kann durch den Fachmann, sobald mit den hierin enthaltenden Lehren ausgestattet, ohne übertriebenes Experimentieren empirisch bestimmt werden.
  • Graphit-Nanoröhren
  • Die Nanoröhren können als feste Träger in analytischen Anwendungen in verschiedenen Geometrien, einschließlich als dispergiert, als Aggregate, als Matten oder Filme, angefügt an größere Träger einschließlich Perlen oder mit einem anderen Material gemischt und als Komposit verwendet, beispielsweise in einer porösen Säule. Nanoröhren bestehen zunächst aus chemisch modifizierbarem graphitischen Kohlenstoff. Sie weisen im Allgemeinen Durchmesser von nicht größer als 0,1 µm und Länge zu Durchmesser-Verhältnisse von wenigstens 5 auf. Typischerweise weisen sie Durchmesser von 0,01 µm und Längen von 1-10 μm auf.
  • Funktionalisierte Nanoröhren
  • Vorteilhaft sind die Fibrillen funktionalisierte Fibrillen, d. h. Fibrillen, deren Oberflächen uniform oder nicht-uniform modifiziert sind, um so einen damit verbundenen funktionellen chemischen Teil aufzuweisen. Die Fibrillenoberflächen können durch Reaktionen mit Oxidationsmitteln oder anderen chemischen Medien funktionalisiert werden. Die Fibrillenoberflächen können entweder durch chemische Reaktion oder durch physikalische Adsorption von Spezies, welche ihrerseits eine chemische Reaktivität aufweisen, uniform modifiziert werden. Die Fibrillenoberflächen können beispielsweise durch Oxidation modifiziert werden und im Weiteren durch Reaktion mit anderen funktionellen Gruppen modifiziert werden. Die Fibrillenoberflächen können mit einem Spektrum funktioneller Gruppen modifiziert werden, sodass die Fibrillen chemisch reagieren oder physikalisch an chemische Gruppen in einer Vielzahl von Substraten, einschließlich Bindungskomponenten in Elektrochemilumineszenz-Assays, gebunden werden.
  • Komplexe Strukturen von Fibrillen können durch Verknüpfung funktioneller Gruppen auf den Fibrillen untereinander aus einer Auswahl von Verknüpfungs-Chemie erhalten werden. Es werden Verfahren zur chemischen Modifikation von Fibrillenoberflächen und Verfahren zur physikalischen Adsorption von Spezies auf den Oberflächen von Fibrillen beschrieben, um so für jeden Fall einen mit der Oberfläche der Fibrille assoziierten funktionalen Teil bereitzustellen.
  • Funktionalisierte Nanoröhren gebunden an Assay-Performance-Substanzen
  • Die funktionalisierten Fibrillen können mit verschiedenen Biomolekülen reagieren, um sie zur Verwendung in ECL-Assays zu präparieren. Verschiedene Assay-Performance Substanzen, beispielsweise Antikörper, Rezeptoren oder andere bindende Einheiten können mit den funktionalisierten Fibrillen reagieren, um sie zur Verwendung in ECL-Assays zu präparieren.
  • Die Partikel
  • Graphit-Nanoröhren können kovalent oder nicht-kovalent an größere feste Phasen, beispielsweise Partikel, angelagert sein.
  • Die Partikel umfassen vorteilhaft mikropartikuläre Stoffe, welche einen Durchmesser von 0,05 µm bis 200 µm, bevorzugt 0,1 µm bis 100 µm, besonders bevorzugt 0,5 µm bis 10 µm aufweisen sowie eine Oberflächen-Komponente, welche zur Bindung an den Analyten und/oder eine oder mehrere der in den Unterabschnitten (b) (i), (b) (ii) oder (b) (iii) definierten anderen Substanzen geeignet ist. Z. B. kann der mikropartikuläre Stoff quervernetze Stärke, Dextrane, Zellulose, Proteine, organische Polymere, Styrol-Copolymer wie beispielsweise Styrol/Butadien-Copolymer, Acrylnitril/Butadien/Styrol-Copolymer, Vinylacetylacrylat-Copolymer oder Vinylchlorid/Acrylat-Copolymer, inerte anorganische Partikel, Chromdioxid, Eisenoxide, Silica, Silica-Mischungen und proteinartige Stoffe, oder Mischungen daraus. Die Partikel werden wünschenswerterweise in dem ECL-System suspendiert.
  • Assay-Medien
  • Um ein System, in welches eine Elektrode elektrochemische Energie einführt, zu betreiben, ist es notwendig, einen Elektrolyten bereitzustellen, in welchen die Elektrode eingetaucht wird und welcher den ECL-Teil enthält. Der Elektrolyt ist eine Phase, durch welche Ladung mittels Ionen transportiert wird. Im Allgemeinen befindet sich der Elektrolyt in der flüssigen Phase und ist eine Lösung aus einem oder mehreren Salzen oder anderen Spezies in Wasser, eine organische Flüssigkeit oder eine Mischung organischer Flüssigkeiten oder eine Mischung aus Wasser und einem oder mehreren organischen Flüssigkeiten. Jedoch sind in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung andere Formen von Elektrolyten ebenfalls hilfreich. Beispielsweise kann der Elektrolyt eine Dispersion aus einer oder mehreren Substanzen in einem Fluid sein, z. B. eine Flüssigkeit, ein Dampf oder ein überkritisches Fluid oder eine Lösung von einer oder mehreren Substanzen in einem Festkörper, einem Dampf oder superkritischem Fluid.
  • Der Elektrolyt ist entsprechend eine Lösung eines Salzes in Wasser. Das Salz kann bevorzugt ein Natrium-Salz oder ein Kalium-Salz sein, aber in bestimmten Ausführungsformen ist die Aufnahme von Kationen ebenfalls angemessen, solange das Kation nicht mit der Elektrochemilumineszenz-Wechselwirkungssequenz interferiert. Das Anion des Salzes kann beispielsweise ein Phosphat sein, aber die Verwendung anderer Anionen ist in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ebenfalls zulässig – nochmals, solange das auserwählte Anion nicht mit der Elektrochemilumineszenz-Wechselwirkungssequenz interferiert.
  • Die Zusammensetzung kann auch nicht-wässrig sein. Während unter bestimmten Umständen superkritische Fluide vorteilhaft eingesetzt werden können, ist es eher kennzeichnend, einen Elektrolyten umfassend eine organische Flüssigkeit in einer nichtwässrigen Zusammensetzung zu verwenden. Wie der wässrige Elektrolyt ist auch der nichtwässrige Elektrolyt eine Phase, durch welche Ladung mittels Ionen transportiert wird. Normalerweise bedeutet dies, dass ein Salz in dem organischen, flüssigen Medium aufgelöst wird. Beispiele geeigneter organischer Flüssigkeiten sind Acetonitril, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), Methanol, Ethanol und Mischungen aus zwei oder mehreren der vorhergehenden. Konkretisierend werden Tetraalkylammoniumsalze, wie beispielsweise Tetrabutylammonium-Tetrafluoroborat, welche in organischen Flüssigkeiten löslich sind, können mit ihnen verwendet werden, um nicht-wässrige Elektrolyten zu bilden. Der Elektrolyt ist in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ein gepuffertes System. Oftmals sind Phosphat-Puffer von Vorteil. Beispiele sind eine wässrige Lösung von Natriumphosphat/Natriumchlorid und eine wässrige Lösung von Natriumphosphat/Natriumfluorid.
  • Andere Assay-Komponenten
  • Wie in der PCT-Offenlegungsschrift US 89/04859 beschrieben, betitelt als "Electochemilumineszent Reaction Utilizing Amine-Derived Reductant", ist es wünschenswert, ein Reduktionsmittel, typischerweise ein Amin oder eine Amineinheit (eines größeren Moleküls) mit aufzunehmen, welches oxidiert und spontan gespalten werden kann, um es in eine stark reduzierende Spezies umzuwandeln. Es wird angenommen, dass das Amin oder die Amin-Einheit durch die in das Reaktionssystem eingebrachte elektrochemische Energie ebenfalls oxidiert werden. Das Amin oder die Amin-Einheit verlieren ein Elektron, deprotonieren daraufhin oder lagern sich in ein starkes Reduktionsmittel um. Dieses Mittel tritt mit dem oxidierten, Metall-enthaltendem ECL-Teil in Wechselwirkung und veranlasst ihn, den oben diskutierten angeregten Zustand einzunehmen. Um ihre Funktion auszuüben, weisen das Amin oder der Amin-Teil vorzugsweise ein Kohlenstoff-zentriertes Radikal mit einem Elektron, welches von einem solchen Kohlenstoff gespendet werden kann, auf, sowie einen Alpha-Kohlenstoff, welcher dann als Protonen-Donor während der Deprotonierung agiert, um das Reduktionsmittel zu bilden. Das Amin-abgeleitete Reduktionsmittel stellt den notwendigen Stimulus zur Umwandlung des Metall enthaltenden ECL-Teils in seinen angeregten Zustand bereit, aus dem detektierbare elektromagnetische Strahlung emittiert wird.
  • Es können eine breite Auswahl an Aminen und korrespondierenden Amin-Einheiten zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Im Allgemeinen wird das Amin oder die Amin-Einheit in Übereinstimmung mit dem pH des zu analysierenden elektrochemilumineszenten Systems ausgewählt. Ein weiterer relevanter Faktor ist, dass das Amin oder die Amineinheit mit der Umgebung, in welcher sie während der Analyse wirken müssen, kompatibel sind, d. h., je nach Fall, kompatibel mit einer wässrigen oder nichtwässrigen Umgebung. Eine weitere Überlegung ist, dass das ausgewählte Amin oder die Amineinheit unter vorherrschenden Bedingungen ein Amin-abgeleitetes Reduktionsmittel bilden, welches stark genug ist, den oxidierten Metall-enthaltenden ECL-Teil in dem System zu reduzieren.
  • Amine (und daraus abgeleitete korrespondierende Einheiten), welche in der vorliegenden Erfindung mit Vorteil verwendet werden, sind aliphatische Amine, beispielsweise primäre, sekundäre und tertiäre Alkyl-Amine, von denen jede der Alkylgruppen 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweist, sowie substituierte aliphatische Amine. Tripropylamin ist ein besonders bevorzugtes Amin, da es zu einer vergleichsweise besonders hoch-intensiven Emission von elektromagnetischer Strahlung führt, welche in den Ausführungsformen, in denen es verwendet wird, die Sensitivität und Genauigkeit der Detektion und Quantifizierung erhöht. Ebenso passend sind Diamine, wie beispielsweise Hydrazin und Polyimine, beispielsweise Poly-(Ethylenimin). Beispiele weiterer Amine, welche zur Ausführung der Erfindung geeignet sind, sind Triethanolamin, Triethylamin, 1,4-Diazabicyclo-(2.2.2)-Octan, 1-Piperidin Ethanol, 1,4-Piperazin-bis-(ethan-Sulfonsäure), Tri-Isopropylamin und Poly-(Ethylenimin).
  • Typischerweise ist der in der vorliegenden Erfindung verwendete Metall-enthaltende ECL-Teil der reaktionsbestimmende Bestandteil. Entsprechend wird das Amin oder die Amin-Einheit typischerweise in einem stöchiometrischen Überschuss in Bezug darauf vorgelegt. Konkretisierend werden das Amin oder die Amin-Einheit in einer Konzentration von 50-150 mM eingesetzt. Zur Anwendung bei einem pH-Wert von ungefähr 7 ist häufig eine Konzentration von 100 mM vorteilhaft. In bestimmten Ausführungsformen ist die Obergrenze der Konzentration an Amin oder Amin-Einheit durch die maximale Löslichkeit des Amins oderder Einheit in der Umgebung, in welcher sie verwendet werden, beispielsweise Wasser, bestimmt. Im Allgemeinen ist die eingesetzte Menge an Amin oder Amin-Einheit derart, dass sie hinreichend wirksam die Transformation des oxidierten, Metall-enthaltenden ECL-Teils in seinen angeregten Zustand bewirkt, sodass Lumineszenz auftritt. Der Fachmann, ausgestattet mit den Lehren hierin, kann die Menge an Amin oder Amin-Einheit, welche vorteilhaft für das bestimmte zu untersuchende System verwendet wird, ohne unangemessenes Experimentieren empirisch bestimmen.
  • Wie in der PCT-Offenlegungsschrift US 89/04915 , betitelt "Enhanced Electochemilumineszent Reaction" beschrieben, werden die Assays der Erfindung wünschenswerterweise in Gegenwart eines Verstärkers, typischerweise eine Verbindung der Formel
    Figure 00300001
    ausgeführt, wobei R Wasserstoff ist oder CnHn2+1, R' ist CnH2n, x ist 0-70 und n ist von 1-20. Insbesondere ist n von 1-4. Spezifische Beispiele sind eine Substanz, welche kommerziell unter dem Namen Triton X-100 erhältlich ist, deren Formel
    Figure 00310001
    lautet, wobei x von 9-10 ist, sowie eine kommerziell erhältliche Substanz unter dem Namen Triton N-401 (NPE 40), deren Formel
    Figure 00310002
    ist, wobei x 40 ist. Der Verstärker wird im Allgemeinen in einer hinreichenden Menge eingesetzt, sodass in seiner Gegenwart die erwünschte Zunahme an Emission elektromagnetischer Strahlung eintritt. Typischerweise ist die Menge 0,01% bis 0,5%, insbesondere 0,1% bis 1,0%.
  • Der gemäß der vorliegenden Erfindung aufgenommene ECL-Teil wird durch Anregung in einen angeregten Zustand zur Emission elektromagnetischer Strahlung veranlasst. Dies wird durch Aussetzen des Systems, in welches der ECL-Teil aufgenommen ist, einer elektrochemischen Energie erreicht. Das Potential, bei welchem die Oxidation des ECL-Teils und der das starke Reduktionsmittel bildenden Spezies eintritt, hängt von deren genauer chemischer Struktur ab, ebenso wie von Faktoren wie beispielsweise der pH-Wert des Systems und der Art der Elektrode, welche zum Einbringen der elektrochemischen Energie verwendet wird. Es ist dem Fachmann wohlbekannt, wie das optimale Potential und die Emissionswellenlänge eines elektrochemilumineszenten Systems zu bestimmen sind. Bestimmte bevorzugte Verfahren zur Anregung des ECL-Systems sind in der PCT-Offenlegungsschrift US 89/01814 offenbart.
  • Vorrichtung zur Messung der Elektrochemilumineszenz
  • Eine Vorrichtung zur Ausführung der Assays der Erfindung ist in 1 und 2 beschrieben. 1 offenbart eine vorteilhafte ECL-Vorrichtung, jedoch sind die Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf die Anwendung in Vorrichtung 10 begrenzt, sondern können eher in anderen Typen von ECL-Vorrichtungen eingesetzt werden, welche eine Arbeitselektrode oder andere auslösende Oberflächen enthalten, um elektrochemische Energie zur Auslösung des ECL-Teils zur Elektrochemilumineszenz bereitzustellen. Während die Verfahren der Erfindung in einem statischen oder Durchfluss-Modus ausgeführt werden können, enthält Vorrichtung 10 eine Durchflusszelle, welche eindeutige Vorteile für viele Arten von Proben, einschließlich Bindungs-Assay-Proben, bietet. Weitere Details der Vorrichtung zur Ausführung des ECL-Assays der Erfindung sind in den PCT-Offenlegungsschriften US 89/04854 und US 90/01370 offenbart.
  • Vorrichtung 10 enthält eine elektrochemische Zelle 12, eine Lichtdetektionsmessungs-Vorrichtung 14, welche vorteilhaft eine Photomulitplier Röhre (PMT), Photodiode, Ladungskopplungsvorrichtung, photografischer Film oder Emulsion oder ähnliches sein kann, sowie eine Pumpe 16, welche vorteilhaft eine peristaltische Pumpe ist, um für einen Fluidtransport zur, durch und aus der Zelle 12 zu sorgen. Alternativ kann eine positive Verdrängungspumpe verwendet werden. Ein Verschlussmechanismus 18 wird zwischen Zelle 12 und PMT 14 bereitgestellt und wird kontrollierbar bedient, um nur soweit zu öffnen, dass während der ECL-Messdauer PMT 14 Zelle 12 ausgesetzt ist. Der Verschlussmechanismus kann beispielsweise während Instandhaltung geschlossen werden. Auch enthält Vorrichtung 10, jedoch nicht gezeigt in 1, ein lichtgeschütztes Gehäuse, um die verschiedenen Komponenten darin einzurichten und um PMT 14 vor jeglichem externen Licht während der ECL-Messungen abzuschirmen.
  • Zelle 12 selbst enthält einen ersten Trägerblock 20, durch den eine Einlassröhre 22 und eine Auslassröhre 24 verläuft und welche mit Vorteil aus rostfreiem Stahl gefertigt sein können. Aufbaublock 20 weist eine erste, äußere Oberfläche 26 und eine zweite, innere Oberfläche 28 auf, welche eine Seite des probenaufnehmenden Volumens 30 der Zelle 12 definiert, wobei Zelle 12 die Reinigungs- und/oder Aufbereitungs- und/oder Messlösungen während der entsprechenden Bedienung von Vorrichtung 10 aufnimmt. Einlass- und Auslassröhren 22, 24 verlaufen durch Aufbaublock 20 von der äußeren Oberfläche 26 zur inneren Oberfläche 28 und öffnen sich in das probenaufnehmende Volumen 30. Ein zweiter Aufbaublock 32, vorteilhaft aus rostfreiem Stahl gefertigt, weist ebenfalls eine erste, äußere Oberfläche 34 und zweite, innere Oberfläche 36 auf. Der zweite Aufbaublock 32 ist vom ersten Aufbaublock 20 durch einen ringförmigen Abstandhalter 38 getrennt und vorteilhaft aus Teflon oder anderem nicht-kontaminierbarem Material gefertigt. Damit begrenzt die äußere Oberfläche 34 von Aufbaublock 30 einen Teil der zweiten Seite des probenaufnehmendem Volumens 30. Abstandshalter 38 weist einen äußeren Teil 40 und eine zentrale Apertur 42 auf, deren innerer Rand 44 die Seitenwand des probenaufnehmenden Volumens 30 begrenzt. Der äußere Teil 40 dichtet die innere Oberfläche 28 des ersten Aufbaublockes 20 gegen die äußere Oberfläche 34 des zweiten Aufbaublockes 32 ab, um jedes Auslaufen von Lösung aus dem probenaufnehmenden Volumen 30 zwischen die beiden Oberflächen 28, 34 zu verhindern. Aufbaublock 32 weist ferner eine zentrale Apertur 46 auf, in welche ein Fenster 48 eingepasst ist, um den Rest der zweiten Seite des probenaufnehmenden Volumens 30 als eine Weiterführung der äußeren Oberfläche 34 zu definieren. Das Fenster 48 ist aus einem Material gebildet, welches im Wesentlichen bei der Wellenlänge des durch den ECL-Teil emittierten elektrochemilumineszenten Lichts transparent ist. Das Fenster 48 wird daher vorteilhaft aus Glas, Plastik, Quarz oder ähnlichem gebildet. Die Einlassröhre 22 kreuzt das probenaufnehmende Volumen 30 an einem ersten Ende 50 davon, benachbart zum Abstandshalter 38, und Auslassröhre 24 kreuzt das probenenaufnehmende Volumen 30 an einem zweiten Ende 52 davon, benachbart zu Abstandshalter 38. Die Kombination aus Einlassröhre 22, probenaufnehmendem Volumen 30 und Auslassröhre 24 bietet damit einen kontinuierlichen Durchflussweg für den schmalen, im Wesentlichen laminaren Fluss einer Lösung zu, durch und von Zelle 12. Angebracht an die innere Oberfläche 28 des ersten Aufbaublockes 20 ist ein Arbeitselektrodensystem 54, welches in der gezeigten Ausführung erste und zweite Arbeitselektroden 56 und 58 enthält. In anderen Ausführungsformen kann eine einzelne Elektrode vorteilhaft bereitgestellt werden oder lediglich Elektrode 56 kann eine Arbeitselektrode sein. Es sind die Arbeitselektroden 56, 58, wo die elektrochemischen und ECL-Reaktionen von Interesse stattfinden können. Die Arbeitselektroden 56, 58 sind feste voltammetrische Elektroden und können daher vorteilhaft aus Platin, Gold, Kohlenstoffen oder anderen Materialien gefertigt sein, welche für diesen Zweck wirksam sind. Die Drahtverbindungen 60, 62, verbunden mit den Arbeitselektroden 56 bzw. 58, verlaufen durch den ersten Aufbaublock 20 nach außen.
  • Die Verbindungsstücke 60, 62 sind beide mit einem ersten "Arbeitselektroden"-Anschluss 64 einer Spannungssteuerung 66 verbunden, wie in 2 dargestellt. Die Spannungssteuerung 66 arbeitet vorteilhaft nach Art eines Potentiostaten, um Spannungssignale an die Arbeitselektroden 56, 58 zu liefern und optional den davon fließenden Strom während einer ECL-Messung zu messen. Alternativ können die Verbindungsstücke 60, 62 mit separaten Anschlüssen der Spannungssteuerung 66 zur individuellen Bedienung verbunden sein. Der Potentiostat-Betrieb der Spannungssteuerung 66 wird ferner durch eine Gegenelektrode 68 sowie, optional, aber vorteilhaft, eine Referenzelektrode 70 zustande gebracht. In der gezeigten Ausführungsform ist der Aufbaublock 32 aus rostfreiem Stahl hergestellt und die Gegenelektrode 68 besteht aus den ausgestellten Oberflächen 72, 74 des Aufbaublockes 32. Gegenelektrode 72, 74 und Arbeitselektroden 56, 58 bieten die Trennfläche, um das Potential an die Lösung innerhalb des probenaufnehmenden Volumens 30 anzulegen, welches die chemischen Reaktionen antreibt und Elektrochemilumineszenz in der Probe hervorruft und/oder Energie zur Reinigung und Behandlung der Oberflächen von Zelle 12 bereitstellt. Gegenelektrode 72, 74 ist durch ein Drahtanschlussstück 76 mit einem zweiten "Gegenelektroden"-Anschluss 78 der Spannungssteuerung 66 verbunden.
  • Referenzelektrode 70 stellt eine Referenzspannung bereit, auf die sich die durch die Arbeitselektroden 56, 58 angelegte Spannung bezieht, beispielsweise +1,2 V gegen die Referenz. Die Referenzelektrode 70 ist vorteilhaft in der Auslassröhre 24 gelegen, an einer Position 80 beabstandet von Zelle 12 und ist durch einen Drahtanschluss 82 mit einem dritten "Referenzelektroden"-Anschluss 84 der Spannungssteuerung 66 verbunden. In dem Dreielektroden-Modus fließt durch Referenzelektrode 70 kein Strom. Referenzelektrode 70 kann in einem Dreielektroden-Modus der Bedienung verwendet werden, um eine ausgeglichene, bekannte und stabile Spannung zu liefern und ist deshalb aus Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl) aufgebaut oder ist eine gesättigte Calomel-Elektrode (SCE). Die Spannungssteuerung 66 kann in einem Zweielektroden-Modus der Bedienung betrieben werden durch Verwendung von lediglich der Arbeitselektrode 56 sowie der Elektrode 58 als Gegenreferenzelektrode. In diesem Zweielektroden-Modus der Bedienung ist die GegenrReferenzelektrode 58 elektrisch mit den Spannungssteuerungsanschlüssen 78 und 84 der Spannungssteuerung 66 verbunden. In diesem Falle arbeitet die Spannungssteuerung 66 im Wesentlichen als eine Batterie. Die Spannungssteuerung 66 liefert Spannungssignale an die Arbeits- und Gegenelektroden 56 und 58 und misst optional den durch die jeweiligen Elektroden fließenden Strom. Referenzelektrode 70 kann alternativ eine sogenannte "Quasi-Referenz"-Elektrode sein, welche aus Platin, Gold, rostfreiem Stahl oder anderem Material gefertigt ist und welche eine weniger stabile Spannung liefert, jedoch eine, die in Bezug auf die kontaktierte Lösung messbar ist. Sowohl im Zwei- als auch im Dreielektroden-Modus dienen die Referenzelektroden 70 oder 58 dem Zweck der Breitstellung einer Referenz, gegen welche die an die Arbeitselektroden 56 angelegte Spannung gemessen wird. Gegenwärtig wird die ausgeglichene Spannungsreferenz als eher vorteilhaft betrachtet. Die Spannungssteuerung 66 kontrolliert in ihrem Potentiostat-Betrieb die verschiedenen Elektroden durch Bereitstellung einer bekannten Spannung an den Arbeitselektroden 56, 58 mit Bezug zur Referenzelektrode 70, während sie den Stromfluss zwischen Arbeitselektroden 56, 58 und Gegenelektrode 72, 74 misst. Potentiostaten für diesen Zweck sind wohl bekannt und die interne Struktur der Spannungssteuerung 66 kann daher jedem konventionellen, kommerziell erhältlichen Potentiostat entsprechen, welcher die oben angegebenen Funktionen bietet und daher an sich keinen Teil der vorliegenden Erfindung bildet. Zwar kann Vorrichtung 10 alternativ ohne eine interne Spannungssteuerung 66 aufgebaut sein und kann zur Verbindung mit einem externen Potentiostaten angeglichen werden, welcher getrennt gesteuert wird, um die erforderlichen Spannungssignale an die Elektroden 56, 58, 72, 74 und 70 zu liefern. Diese Spannungssignale, angelegt in einer wie unten beschriebenen spezifischen Weise, liefern wiederholbare Anfangsbedingungen für die Oberflächen der Arbeitselektroden 56, 58 sowie vorteilhaft für die Oberflächen von Zelle 12 als Ganzes, ein Merkmal, welches signifikant zur verbesserten Genauigkeit in ECL-Messungen beiträgt.
  • Die Pumpe 16 ist mit Vorteil an der Auslassröhre 24 positioniert, um Lösung aus einem Probenvolumen in Richtung von Pfeil A in die Einlassröhre 22 zu "ziehen". Die Lösung wird durch die Einlassröhre 22, das probenaufnehmende Volumen 30 und die Auslassröhre 24 hinter der Referenzelektrode 70 und in Richtung von Pfeil B nach außen fließen. Alternativ kann die Pumpe 16 an Einlassröhre 22 positioniert werden, um die Lösung durch Vorrichtung 10 zu "drücken". Mit Vorteil kann dieser gleiche Durchflussweg durch Einlassröhre 22, probenaufnehmendes Volumen 30 und Auslassröhre 24 für alle Lösungen und Fluide verwendet werden, welche Zelle 12 durchlaufen, wobei jedes Fluid eine hydrodynamische Reinigung durch Hinausdrängen des vorherigen Fluids aus Zelle 12 vornimmt. Pumpe 16 kann gesteuert werden, um ihren Betrieb zu unterbrechen, um so eine bestimmte Lösung in Zelle 12 für jede Zeitdauer zu halten.
  • Der Durchfluss-Aufbau von Vorrichtung 10 erlaubt das Anlegen variabler Spannungen an die Arbeitselektroden oder, um fortlaufend auf einem prä-operativen Potential gehalten zu werden, während sie unaufhörlich einer oder mehrer Lösungen ausgesetzt sind, ohne dass die Arbeitselektroden 56, 58 (oder Gegen- und Referenzelektroden 72, 74, 70) der Luft ausgesetzt sind. Aussetzung an Luft, welche den Schaltkreis zur Referenzelektrode 70 öffnet, ermöglicht unbekannte, zufällige Spannungsfluktuationen, welche die Reproduzierbarkeit von Oberflächenbedingungen auf den Arbeitselektroden 56, 58 zunichte machen. Der Durchfluss-Aufbau gestattet den raschen Wechsel zwischen initialen Schritten, in denen das Elektrodensystem 54 gereinigt und aufbereitet wird und Messungsschritten, in denen eine oder mehrere Messungsspannungsformen oder Zeitablenkungen ECL hervorrufen.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf Reagenz-Zusammensetzungen. Allgemein können die Reagenz-Zusammensetzungen jede Komponente der Assay-Systeme der Erfindung sein, d. h. (a) Elektrolyt, (b) Markierungsverbindung enthaltend einen ECL-Teil, (c) funktionalisierte Fibrillen, an welche eine Assay-Performance Substanz gebunden ist, optional an Partikel gebunden, einschließlich magnetisch responsiever Partikel, (d) interessierende Analyt oder Analoga des interessierenden Analyten, (e) ein Bindungspartner des interessierenden Analyten oder seinem Analogon, (f) eine zur Reaktion mit (d) oder (e) geeignete reaktive Komponente, (g) ein Reduktionsmittel oder (h) ein Elektrochemilumineszenz-Reaktionsverstärker. Die Reagenzien können zum Vorteil der Anwendung miteinander kombiniert werden, d. h. zwei Komponenten, drei Komponenten und höhere Mehrkomponenten-Mischungen können präpariert werden, vorausgesetzt, dass die Komponenten während der Lagerung nicht miteinander reaktiv sind, um so ihre Funktion in dem bestimmungsgemäßen Assay zu beeinträchtigen. Wünschenswerterweise sind die Reagenzien zwei Komponenten oder Mehrkomponentenmischungen, welche Partikel ebenso wie eine oder mehrere andere Komponenten enthalten.
  • Die Erfindung ist auch auf Kits gerichtet. Die Kits können Gefäße umfassen, welche eine oder mehrere der Komponenten (a)-(h), wie oben angegeben, enthalten oder die Kits können Gefäße enthalten, welche eine oder mehrere Reagenz-Zusammensetzungen, wie oben beschrieben enthalten, umfassend Mischungen dieser Komponenten, alle zur Verwendung in den Assay-Verfahren und Vorrichtungen der Erfindung.
  • Verfahren zur Funktionalisierung von Fibrillen
  • Die funktionalisierten Fibrillen der Erfindung können direkt durch Sulfonierung, elektrophile Addition an sauerstofffreie Fibrillenoberflächen oder Metallisierung hergestellt werden. Wenn Bogen-gezüchtete Nanofibern verwendet werden, können sie vor der Funktionalisierung aufwändige Reinigung erfordern. Ebbesen et. al. (Nature 367 519 (1994)) geben eine Methode zu solcher Reinigung an.
  • Vorzugsweise werden die Kohlenstofffibrillen vor dem Kontaktieren mit dem Funktionalisierungsmittel aufbereitet. Eine derartige Aufbereitung kann das Dispergieren der Fibrillen in einem Lösungsmittel einschließen. In einigen Fällen können die Kohlenstofffibrillen dann vor weiterem Kontakt gefiltert und getrocknet werden.
  • 1. Sulfonierung
  • Grundlegende Techniken sind beschrieben in March, J. P., Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed. Wiley, New York 1985; House, H., Modern Synthetic Reactions, 2nd Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA 1972.
  • Aktivierte C-H (einschließlich aromatischer C-H) Bindungen können unter Verwendung von rauchender Schwefelsäure (Oleum), welches eine Lösung von konzentrierter Schwefelsäure enthaltend bis zu 20% SO3 ist, sulfoniert werden. Die konventionelle Methode verläuft über eine flüssige Phase bei T~80°C unter Verwendung von Oleum, jedoch können aktivierte C-H Bindungen auch unter Verwendung von SO3 in inerten, aprotischen Lösungsmitteln oder SO3 in der Gasphase sulfoniert werden. Die Reaktion lautet: -C-H + SO ----> -C- SO3H
  • Überreaktion resultiert in der Bildung von Sulfonen, entsprechend der Reaktion: 2 -C-H + SO3 ----> -C- SO2-C- + H2O
  • Darstellung A
  • Aktivierung von C-H Bindungen unter Verwendung von Schwefelsäure
  • Reaktionen wurden in der Gasphase und in Lösung durchgeführt, ohne signifikante Unterschiede in den Ergebnissen. Die Gasphasenreaktion wurde in einem horizontalen Quarzröhrenreaktor, beheizt durch einen Lindberg-Ofen, durchgeführt. Ein Mehrhalskolben enthaltend 20% SO3 in konzentrierter H2SO4, eingepasst mit Gaseinlass/-auslassröhren, wurde als SO3-Quelle verwendet.
  • Eine eingewogene Probe an Fibrillen (BN oder CC) in einem Porzellanschiffchen wurde in die 1''-Röhre, mit einem Gaseinlass eingepasst, eingebracht. Der Auslass war mit einer konzentrierten Schwefelsäure-Gasfalle verbunden. Argon wurde durch den Reaktor zur Entfernung aller Luft gespült und die Probe auf 300°C für eine Stunde erhitzt um Restfeuchte zu entfernen. Nach dem Trocknen wurde die Temperatur unter Argon der Reaktionstemperatur angepasst.
  • Als die gewünschte Temperatur stabilisiert war, wurde die SO3-Quelle mit der Reaktorröhre verbunden und ein Argon-Strom wurde verwendet, um SO3-Gase in den Quarzröhrenreaktor zu bringen. Die Reaktion wurde für die gewünschte Zeit bei einer gewünschten Temperatur durchgeführt, wonach der Reaktor im Argon-Strom gekühlt wurde. Die Fibrillen wurden dann bei 90°C unter 5'' Hg-Vakuum getrocknet, um die Zunahme an Trockengewicht zu bestimmen. Der Sulfonsäuregehalt (-SO3H) wurde durch Reaktion mit 0,100 N NaoH und Rücktitration mit 0,100 N HCl unter Verwendung von pH 6 als Endpunkt bestimmt. Die Flüssigphasenreaktion wurde in konzentrierter Schwefelsäure enthaltend 20% SO3 in einem 100 ml Mehrhalskolben, eingepasst mit einem Thermometer/Temperatursteuerung, und einem magnetischen Rührer durchgeführt. Ein Fibrillen-Schlamm in konzentrierter H2SO4 (50) wurde in den Kolben gebracht. Die Oleum-Lösung (20 cc) wurde auf ~60°C vorgeheizt, bevor die Zugabe zum Reaktor erfolgte. Nach der Reaktion wurde der Säure-Schlamm auf gebrochenes Eis gegeben und sofort mit 1 L DI Wasser verdünnt. Die Feststoffe wurden abgefiltert und ausgiebig mit DI-Wasser so lange gewaschen, bis keine Änderung im pH des Waschwassers zu beobachten war. Die Fibrillen wurden bei 100°C im 5" Hg-Vakuum getrocknet. Durch Transferverluste bei der Filtration konnten genaue Gewichtszunahmen nicht erhalten werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1 Zusammenfassung der Reaktionen
    X LAUF # REAKT PROBE Gew.g FIBRILLEN-TYP T°C Zeit Trocken-gew. Zunahme SO3H KONZ. Meq/g
    1A 118-60A Gas 0.20 CY 110 15 m 9.3% 0.50
    1B 118-61A Gas 0.20 BN 100 30 m 8.5% 0.31
    1C 118-61B Gas 0.20 BN 65 15 m 4.2% 0.45
    1D 118-56A Liq 1.2 CY 50 10 m 0.33
    1E 118-56B Liq 1.0 CY 25 20 m 0.40
  • Es gab keinen signifikanten Unterschied im Sulfonsäure-Gehalt durch Reaktion in der Gasphase oder der Flüssigphase. Es gab einen Temperatur-Effekt. Eine höhere Reaktionstemperatur (Gasphase) ergibt einen höheren Gehalt an Sulfonen. In 118-61B stimmte die 4,2% Gewichtszunahme mit dem Sulfonsäure-Gehalt überein (theoretisch waren 0,51 meq/g erwartet). Durchlauf 60A und 61A wiesen eine zu hohe Gewichtszunahme auf, um einzig dem Sulfonsäure-Gehalt zugerechnet werden zu können. Es wurde deshalb angenommen, dass nennenswerte Mengen an Sulfonen erzeugt wurden.
  • 2. Additionen an oxidfreie Fibrillenoberflächen
  • 3.
  • Grundlegende Techniken werden beschrieben in Urry, G., Elementary Equilibrium Chemstry of Carbon, Wiley, New York 1989.
  • Die Oberflächenkohlenstoffe in Fibrillen verhalten sich wie Graphit, d. h. sie sind in hexagonalen Schichten angeordnet, welche sowohl basale Flächen als auch Kanten-Kohlenstoffe enthalten. Während basal-planare Kohlenstoffe relativ innert gegenüber chemischem Angriff sind, sind Kanten-Kohlenstoffe reaktiv und müssen irgendein Heteroatom oder eine Gruppe enthalten, um die Kohlenstoffvalenz zu sättigen. Fibrillen weisen auch Oberflächendefektstellen auf, welche im Wesentlichen Kanten-Kohlenstoffe sind und Heteroatome oder Gruppen enthalten.
  • Die am häufigsten an Oberflächenkohlenstoffen von Fibrillen angelagerten Heteroatome sind Wasserstoff, die vorwiegende gasförmige Komponente während der Herstellung; Sauerstoff, in Folge seiner hohen Reaktivität und weil Spuren davon sehr schwer zu vermeiden sind; und H2O, welches wegen des Katalysators immer gegenwärtig ist. Pyrolyse bei ~1000°C in einem Vakuum wird die Oberfläche in einer komplexen Reaktion mit unbekanntem Mechanismus, aber bekannter Stöchiometrie, vom Sauerstoff befreien. Die Produkte sind CO und CO2 in einem 2:1 Verhältnis. Die resultierende Fibrillenoberfläche enthält Radikale in einer C1-C4-Ausrichtung, welche gegenüber aktivierten Olefinen sehr reaktiv sind. Die Oberfläche ist im Vakuum stabil oder in der Gegenwart eines innerten Gases, aber behält ihre hohe Reaktivität bei, sobald sie einem reaktiven Gas ausgesetzt ist. Daher können Fibrillen bei ~1000°C im Vakuum oder innerter Atmosphäre pyrolisiert werden, unter diesen gleichen Bedingungen abgekühlt werden und mit einem geeigneten Molekül bei niedrigerer Temperatur umgesetzt werden, um eine stabile funktionelle Gruppe zu bilden. Typische Beispiele sind:
    Figure 00390001
    gefolgt von:
    Figure 00390002
    RFS + Maleinsäureanhydrid ------> Fibrille-R' (COOH)2 RFS + Cyanogen ------> Fibrille-CN RFS + CH2=CH-CH2X ------> Fibrille-R'CH2X X=-NH2, -OH, -Halogen RFS + H2O ------> Fibrille=O (chinoid) RFS + CH2=CHCHO ------> Fibrille-R'CHO (aldehydisch) RFS + CH2=CH-CN ------> Fibrille-R'CN wobei R' ein Kohlenwasserstoffradikal ist (Alkyl, Cycloalkyl etc.)
  • Darstellung B
  • Darstellung funktionalisierter Fibrillen durch Reaktion von Acrylsäure mit oxidfreien Fibrillenoberflächen
  • Ein Gramm BN-Fibrillen wird in einem Porzellan-Schiffchen in einer horizontalen 1'' Quarzröhre platziert, in welche ein Temperaturfühler eingepasst ist, und die in einem Lindberg-Röhrenofen untergebracht ist. In den Enden sind Gaseinlass/Gasauslass eingepasst. Das Rohr wird mit trockenem, sauerstofffreiem Argon für 10 Minuten gespült, wonach die Temperatur des Ofens auf 300°C erhöht und für 30 Minuten gehalten wird.
  • Danach wird in einem kontinuierlichen Argonstrom die Temperatur in 100°C-Schritten auf 1000°C erhöht und für 16 Stunden gehalten. Am Ende dieser Zeit wird das Rohr im Argonstrom auf Raumtemperatur (RT) abgekühlt. Der Argonstrom wird dann abgeleitet, um durch einen Mehrhalskolben enthaltend hochreine Acrylsäure, bei 50°C und mit Gaseinlass/Gasauslass versehen zu strömen. Der Strom der Acrylsäure/des Argongases wird bei Raumtemperatur für 6 Stunden fortgesetzt. Am Ende dieser Zeit wird die verbleibende nicht-reagierte Acrylsäure entfernt, zunächst durch Spülen mit Argon, dann durch Vakuum-Trocknen bei 100°C in einem <5''-Vakuum. Der Carbonsäure-Gehalt wird durch Reaktion mit überschüssiger 0,100N NaOH und Rücktitration mit 0,100N HCl bis zu einem Endpunkt bei pH 7,5 bestimmt.
  • Darstellung C
  • Darstellung funktionalisierter Fibrillen durch Reaktion von Acrylsäure mit oxidfreien Fibrillenoberflächen
  • Die Vorgehensweise wird in ähnlicher Weise wie der obige Ablauf wiederholt, ausgenommen, dass die Pyrolyse und das Abkühlen in einem 10–4 Torr Vakuum durchgeführt werden. Gereinigte Acrylsäure-Dämpfe werden wie im vorherigen Ablauf mit Argon verdünnt.
  • Darstellung D
  • Darstellung funktionalisierter Fibrillen durch Reaktion von Maleinsäure mit oxidfreien Fibrillenoberlfächen
  • Die Vorgehensweise wird nach Darstellung B wiederholt, ausgenommen, dass der Reaktant bei Raumtemperatur gereinigtes Maleinsäureanhydrid (MAN) ist, welches dem Reaktor durch ein geschmolzenes MAN-Bad strömendes Argongas bei 80°C zugeführt wird.
  • Darstellung E
  • Darstellung funktionalisierter Fibrilen durch Reaktion von Acryloylchlorid mit oxidfreien Fibrillenoberflächen
  • Die Vorgehensweise wird nach Darstellung B wiederholt, ausgenommen, dass der Reaktant bei Raumtemperatur gereinigtes Acryloylchlorid ist, welches dem Reaktor durch über gereinigtes Acryloylchlorid strömendes Argon bei 25°C zugeführt wird. Der Säurechlorid- Gehalt wird durch Reaktion mit überschüssiger 0,100N NaOH und Rücktitration mit 0,100N HCl bestimmt.
  • Pyrolyse der Fibrillen im Vakuum entfernt den Sauerstoff auf den Fibrillenoberflächen. In einer TGA-Vorrichtung ergibt die Pyrolyse bei 1000°C entweder im Vakuum oder in einem gereinigten Argon-Strom einen durchschnittlichen Gewichtsverlust von 3% für drei Proben von BN-Fibrillen. Gaschromatographische Analysen detektierten lediglich CO und CO2 in einem entsprechenden ~2:1 Verhältnis. Die entstandene Oberfläche ist sehr reaktiv und aktivierte Olefine, wie beispielsweise Acrylsäure, Acryloylchlorid, Acrylamid, Acrolein, Maleinsäureanhyrid, Alylamin, Alylalkohol oder Alylhalogenide werden selbst bei Raumtemperatur unter Bildung reiner Produkte reagieren, welche lediglich jene an das aktivierte Olefin gebundene Funktionalität enthalten. Somit werden Oberflächen, welche nur Carbonsäuren enthalten, durch Reaktion mit Acrylsäure oder Maleinsäureanhydrid verfügbar; Oberflächen mit nur Säurechlorid durch Reaktion mit Acrylchlorid, nur Aldehyd durch Acroleine; nur Hydroxyl durch Alylalkohol; nur Amin durch Alylamin und nur Halogenid durch Alylhalogenid.
  • 4. Metallisierung
  • Grundlegende Techniken werden in March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., p.545 angegeben.
  • Aromatische C-H Bindungen können mit einer Vielzahl von organometallischen Reagenzien metallisiert werden, um Kohlenstoff-Metall Bindungen zu bilden (C-M). M ist gewöhnlich Li, Be, Mg, Al oder Tl, jedoch können auch andere Metalle verwendet werden. Die einfachste Reaktion besteht im direkten Ersatz von Wasserstoff in aktivierten Aromaten:
    • 1. Fibrillen-H + R-Li ------> Fibrillen-Li + RH
  • Die Reaktion kann zusätzlich eine starke Base, beispielsweise Kalium-t-butyloxid oder chelatbildende Diamine erfordern. Aprotische Lösungsmittel sind notwendig (Paraffine, Benzol).
  • Figure 00410001
  • Die metallisierten Derivate sind Beispiele für primäre, einfach-funktionalisierte Fibrillen. Jedoch können sie weiterreagieren, um andere primäre einfach-funktionalisierte Fibrillen zu bilden. Einige Reaktionen können sequentiell in der gleichen Apparatur ohne Isolierung von Zwischenprodukten durchgeführt werden.
  • Figure 00410002
  • Figure 00420001
  • Darstellung F
  • Darstellung von Fibrille-Li
  • Ein Gramm CC-Fibrillen werden in ein Porzellan-Schiffchen gegeben und in einen 1'' Quarzrohrenreaktor eingeführt, welcher in einem Lindberg-Rohrofen eingeschlossen ist. An den Enden der Röhre sind Gaseinlass/Gasauslass eingepasst. In einem kontinuierlichen H2-Strom werden die Fibrillen für 2 Stunden auf 700°C erhitzt, um alle Oberflächen-Sauerstoffverbindungen in C-H Bindungen umzuwandeln. Der Reaktor wird dann im H2-Strom auf RT abgekühlt.
  • Die hydrierten Fibrillen werden mit trockenem, sauerstoffbefreiten Heptan (mit LiAlH4) in einen 1-Liter runden Mehrhalskolben transferiert, welcher mit einem Argon-Spülsystem ausgestattet ist, um jede Luft zu entfernen und eine inerte Atmosphäre zu erhalten, einem Magnetrührer und Gummiseptum, durch welches Flüssigkeiten über eine Spritze zugefügt werden können. In einer Argon-Atmosphäre werden eine 2%-ige Lösung enthaltend 5 mmol Butyllithium in Heptan durch eine Spritze zugegeben und die flüssige Masse unter leichtem Rückfluss für 4 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit werden die Fibrillen in einer Argon-Atmosphäre-Glove Box durch Filtration separiert und einige Male auf dem Filter mit trockenem, sauerstoffbefreiten Heptan gewaschen. Die Fibrillen werden in einen 50 ml Rundkolben, versehen mit einem Sperrhahn, transferiert und im 10–4-Torr Vakuum bei 50°C getrocknet. Die Lithium-Konzentration wird durch Reaktion einer Fibrillen-Probe mit überschüssiger 0,100N HCl in DI-Wasser und Rücktitration mit 0,100N NaOH bis zu einem Endpunkt bei pH 5,0 bestimmt.
  • Darstellung G
  • Darstellung von Fibrillen-Tl (TFA)2
  • Ein Gramm CC-Fibrillen werden wie in Darstellung E hydriert und in einen Mehrhalskolben mit HTFA gegeben, welches durch wiederholtes Spülen mit trockenem Argon entgast wurde. Eine 5%-ige Lösung von 5 mmol Tl (TFA)3 in HTFA wird durch das Gummiseptum dem Kolben zugegeben und die flüssige Masse wird unter leichtem Rückfluss für 6 Stunden gerührt. Nach der Reaktion werden die Fibrillen wie in Darstellung A gesammelt und getrocknet.
  • Darstellung H
  • Darstellung von Fibrillen-OH
  • (Sauerstoffangereichertes Derivat, nur OH-Funktionalisierung enthaltend)
  • Ein halbes Gramm Li-Fibrillen, dargestellt in Darstellung F, wird mit trockenem, sauerstoffbefreitem Heptan in einer Argon Atmosphäre-Glove Tasche in einen 50 ml Einhalskolben, ausgestattet mit einem Absperrhahn und magnetischem Rührkern, transferiert. Der Kolben wird aus der Glove-Tasche entfernt und auf einem Magnetrührer gerührt. Der Sperrhahn wird dann zur Luft geöffnet und die flüssige Masse für 24 Stunden gerührt. Am Ende dieser Zeit werden die Fibrillen durch Filtration separiert und mit wässrigem MeOH gewaschen und bei 50°C in einem 5''-Vakuum getrocknet. Die Konzentration an OH-Gruppen wird durch Reaktion mit einer normalisierten Lösung aus Essigsäureanhydrid in Dioxan (0,252 M) bei 80°C bestimmt, um die OH-Gruppen in Essigsäureester umzuwandeln, sodass bei Freigabe eines Äquivalents von Essigsäure pro Mol Anydrid reagiert haben. Der Gesamtsäuregehalt, freie Essigsäure und nicht-reagiertes Essigsäureanhydrid, wird durch Titration mit 0,100N NaOH bis zu einem Endpunkt bei pH 7,5 bestimmt.
  • Darstellung I
  • Darstellung von Fibrillen-NH2
  • Ein Gramm Fibrillen-Tl werden nach Darstellung G hergestellt, die Fibrillen werden in Dioxan aufgeschlämmt und 0,5 g Triphenylphosphin, aufgelöst in Dioxan, werden zugegeben. Die flüssige Masse wird bei 50°C für einige Minuten gerührt, gefolgt von der Zugabe von gasförmigen Ammoniak bei 50°C für 30 Min. Die Fibrillen werden dann durch Filtration separiert, in Dioxan gewaschen, anschließend in DI-Wasser und dann bei 80°C unter 5''-Vakuum getrocknet. Die Aminkonzentration wird durch Reaktion mit überschüssigem Essigsäureanhydrid und Rücktitration der freien Essigsäure und nicht-reagiertem Anhydrid mit 0,100N NaOH bestimmt.
  • 5. Derivatisierte polynukleare aromatische, polyheteronuklzeare aromatische und planare makrozyklische Verbindungen
  • Die graphitischen Oberflächen von Fibrillen ermöglichen die physikalische Absorption aromatischer Verbindungen. Die Attraktion geschieht durch van der Waals-Kräfte. Diese Kräfte sind zwischen mehrringigen heteronuklearen aromatischen Verbindungen und den basalflächigen Kohlenstoffen graphitischer Oberflächen beträchtlich. Desorption kann unter Bedingungen stattfinden, wo kompetitive Oberflachenabsorbtion möglich ist oder wo das Adsorbat eine hohe Löslichkeit aufweist.
  • Darstellung J
  • Adsorption von Porphyrinen und Phthalocyaninen auf Fibrillen
  • Die bevorzugten Verbindungen zur physikalischen Absorption auf Fibrillen sind derivatisierte Porphyrine oder Phthalocyanine, welche bekanntermaßen stark auf Graphit oder Ruß absorbieren. Einige Verbindungen sind verfügbar, beispielsweise ein Tetracarbonsäure-Porphyrin, Kobalt (II), Phthalocyanin oder Dilithium-Phthalocyanin. Letztere beiden können in eine Carbonsäure-Form derivatisiert werden.
  • Die Bedeckungskapazität der Porphyrine oder Phthalocyanine kann durch Entfärben der Lösungen bestimmt werden, wenn sie schrittweise zugefügt werden. Die tiefen Farben der Lösungen (tief rosa für das Tetracarbonsäure-Porphyrin in MeOH, dunkles blaugrün für das Co-(II) oder das Dilithium-Phthalocyanin in Aceton oder Pyridin) werden ausgelöscht, da die Moleküle durch Adsorption auf die schwarze Oberfläche der Fibrillen entfernt werden. Beladungskapazitäten werden durch diese Methode bestimmt und die Beladungsflächen der Derivate werden aus ihren groben Messungen (~140 Å2) berechnet. Für eine durchschnittliche Oberfläche für Fibrillen von 250 m2/g wird die maximale Beladung ~0,3 mmol/g betragen.
  • Das Tetracarbonsäure-Porphyrin wurde durch Titration analysiert. Die Vollständigkeit der Adsorption wurde durch Farbfreisetzung in wässrigem System bei Raumtemperatur und erhöhten Temperaturen getestet. Die Fibrillenschlämme wurden zunächst gemischt (Waring-Mischer) und gerührt während der Bedeckung. Einige der Schlämme wurden Ultraschallbehandelt, nachdem die Farbe nicht mehr gelöscht wurde, jedoch ohne Wirkung.
  • Nach dem Beladen wurden die Durchgänge 169-11, -12, -14 und -19-1 (siehe Tabelle II) im selben Lösungsmittel gewaschen, um eingeschlossenes Pigment zu entfernen. Alle zeigten einen durchgehend blassen Farbton in der Waschflüssigkeit, sodass es schwierig war, den Sättigungspunkt genau zu bestimmen. Durchgänge 168-18 und -19-2 verwendeten die berechneten Mengen an Pigment zur Bedeckung und wurden nach der Bedeckung nur sehr leicht gewaschen.
  • Das Tetracarbonsäure-Porphyrin (aus Aceton) und die Co-Phthalocyanine (aus Pyridin) wurden zur weiteren Charakterisierung auf Fibrillen aufgebracht (Durchgänge 169-18 bzw. -19-2).
  • Analyse von Tetracarbonsäure-Porphyrin
  • Zugabe überschüssiger Base (pH 11-12) verursachte eine sofortige Rossfärbung in dem Titrationsschlamm. Während dies die Titration nicht beeinträchtigte, zeigte es, dass Porphyrin bei hohem pH desorbiert. Die Carbonsäure-Konzentration wurde durch Rücktitration überschüssiger NaOH unter Verwendung von pH 7,5 als Endpunkt bestimmt. Die Titration ergab eine Bedeckung von 1,10 meq/g an Säure, äquivalent zu 0,275 meq/g Porphyrin.
  • Analyse von Cobalt oder Dilithium-Porphyrin
  • Die Konzentrationen dieser Adsorbate wurden einzig aus Entfärbungsexperimenten abgeschätzt. Der Punkt, an dem der blaugrüne Farbton nicht nach 30 Minuten nachließ wurde als Sättigungspunkt angenommen.
  • Eine Anzahl von substituierten, polynuklearen, aromatischen oder polyheteronuklearen, aromatischen Verbindungen wurde auf Fibrillenoberflächen adsorbiert. Zur Adhäsion sollte die Zahl aromatischer Ringe größer als zwei Ringe pro anhängender funktioneller Gruppe sein. Somit können substituierte Anthrazene, Phenanthrene usw., enthaltend drei verschmolzene Ringe oder polyfunktionelle Derivate, enthaltend vier oder mehr verschmolzene Ringe anstatt der Porphyrin- oder Phthalocyanin-Derivate verwendet werden. Gleichermaßen können substituierte, aromatische Heterozyklen wie beispielsweise die Quinoline oder mehrfach substituierte Heteroaromaten, enthaltend vier oder mehr Ringe, verwendet werden.
  • Tabelle 11 fasst die Ergebnisse der Bedeckungsexperimente für die drei Porphyrin/Phthalocyanin-Derivate zusammen. Tabelle II Zusammenfassung der Absorptionsdurchgänge
    BSP. Durchgang # Adsorbat Gew. Fib.g Lsgm. Berechnung meq/g Titration
    g/g Form
    10A 169-11 TCAPorph 19,6 mg Acet 0,18 g/g Säure na
    10B 169-12 TCAPorph 33,3 mg H2O 0,11 Na Salz na
    10C 169-14 DiLiPhth 119,0 mg Acet 0,170 Li na
    10D 169-19-1 CoPhth 250,0 mg Pyr 0,187 Co 0,335 (cal)
    10E 169-18 TCAPorph 1,00 mg Acet 0,205 Säure 1,10 (T)
    10F 169-19-2 CoPhth 1,40 mg Pyr 0,172 Co 0,303 (cal
    • TCAPorph=Tetracarbonsäure-Porphyrin (cal)=berechnet
    • DiLiPhth=Dilithium-Phthalocyanin (T)=Titration
    • CoPhth=Cobalt(II)Phthalocyanin
  • 5. Chlorat- oder Salpetersäureoxidation
  • Literatur zur Oxidation von Graphit durch starke Oxidationsmittel wie beispielsweise Kaliumchlorat in konzentrierter Schwefelsäure oder Salpetersäure ist enthalten in R.N. Smith, Quarterly Review 13, 287 (1959); M.J.D. Low, Chem. Rev. 60, 267 (1960). Allgemein werden die Kanten-Kohlenstoffe (einschließlich Defektstellen) angegriffen, um Mischungen von Carbonsäuren, Phenolen und anderen sauerstoffangereicherten Gruppen zu bilden. Der Mechanismus ist komplex und mit Radikalreaktionen verbunden.
  • Darstellung K
  • Darstellung von Carbonsäure-funktionalisierten Fibrillen unter Verwendung von Chlorat
  • Die Probe von CC-Fibrillen wurde in konzentrierter H2SO4 durch Rühren mit einem Spatel aufgeschlämmt und dann zu einem Reaktionskolben transferiert, welcher mit Gaseinlass/Gasauslass und einem Kopfrührer versehen war. Durch Rühren und unter einem langsamen Strom von Argon wurde die Füllmenge an NaClO3 in Portionen bei RT während der Dauer des Durchlaufs zugegeben. Chlordämpfe wurden während des gesamten Ablaufs des Durchgangs erzeugt und wurden aus dem Reaktor in eine wässrige NaOH-Falle getrieben. Am Ende des Durchlaufs wurde der Fibrillenschlamm auf gebrochenes Eis gegeben und im Vakuum filtriert. Der Filterkuchen wurde dann zu einem Soxhlet-Finger transferiert und in einem Soxhlet-Extraktor mit destilliertem Wasser gewaschen, wobei frisches Wasser alle paar Stunden ausgetauscht wurde. Das Waschen wurde fortgesetzt, bis eine Fibrillenprobe, wenn zu frischem destilliertem Wasser gegeben, den pH-Wert des Wassers nicht mehr veränderte. Die Fibrillen wurden dann durch Filtration separiert und bei 100°C im 5''-Vakuum über Nacht getrocknet.
  • Der Carbonsäure-Gehalt wurde durch Reaktion einer Probe mit überschüssiger 0,100N NaOH und Rücktitration mit 0,100N HCl bis zu einem Endpunkt von pH 7,5 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgelistet. Tabelle III Zusammenfassung der direkten Oxidationsdurchläufe
    Bsp. Durchlauf # Komponenten, g Fibrillen NaClO3 conc. H2SO4 Zeit Stunden Wasch pH Rec. Gew Säure meg/g
    11A 168-30 10,0 8,68 450 24 5,7 10,0 0,78
    11 B 168-36 12,0 13,9 600 24 5,9 13,7 0,75
  • Darstellung L
  • Darstellung von Carbonsäure funktionalisierten Fibrillen unter Verwendung von Salpetersäure
  • Eine eingewogene Probe von Fibrillen wurde mit Salpetersäure von angemessener Stärke in einen gekerbten Mehrhalts-Reaktorkolben aufgeschlämmt, welcher mit einem Kopfrührer und einem Wasserkühler versehen war. Unter konstantem Rühren wurde die Temperatur angepasst und die Reaktion für die festgelegte Zeit durchgeführt. Braune Dämpfe wurden freigesetzt, kurz nachdem die Temperatur 70°C überstieg, unabhängig von der Säurestärke.
  • Nach der Reaktion wurde der Schlamm auf gebrochenes Eis gegeben und mit destilliertem Wasser verdünnt. Der Schlamm wurde filtriert und überschüssige Säure durch Waschen in einem Soxhlet-Extraktor entfernt, wobei der Behälter mit frischem, DI-Wasser alle paar Stunden ersetzt wurde, bis eine aufgeschlämmte Probe den pH von DI-Wasser nicht mehr veränderte. Die Fibrillen wurden bei 100°C im 5''-Vakuum über Nacht getrocknet. Eine eingewogene Menge an Fibrillen wurde mit normalisierter 0,100N NaOH zur Reaktion gebracht und der Carbonsäure-Gehalt durch Rücktitration mit 0,100N HCl bestimmt. Der Oberflächensauerstoffgehalt wurde durch XPS bestimmt. Die Dispersibilität in Wasser wurde bei 0,1 Gew.-% durch Mischen in einem Waring-Mischer auf hoch für zwei Minuten getestet. Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefasst. Tabelle IV Zusammenfassung der direkten Oxidationsdurchläufe
    Bsp. Komponenten Temp. °C Zeit Gew. Verlust COOH meg/g ESCA, C at% O Disp H2O
    Gms. Fibrillen cc Säure Säure conc.
    12A 1 (BN) 300 70% RT 24 h 0 <0,1 98 2 S
    126 1 (BN) 300 15 rflx 48 <5% <0,1 nicht analysiert S
    12C 20 (BN) 1,0 l 70 rflx 7 25% 0,8 nicht analysiert G
    12D 48 (BN) 1,0 l 70 rflx 7 25% 0,9 nicht analysiert G
    • S = Schwach; G = Gut
  • 6. Sekundäre Derivate funktionalisierter Fibrillen
  • Carbonsäure-funktionalisierte Fibrillen
  • Die Anzahl sekundärer Derivate, welche nur aus Carbonsäure dargestellt werden können, ist im Wesentlichen unbegrenzt. Alkohole oder Amine werden leicht an Säure gebunden, um stabile Ester oder Amide zu bilden. Wenn der Alkohol oder das Amin Teil eines di- oder polyfunktionellen Moleküls sind, dann hinterlässt die Bindung durch O- oder NH- die anderen Funktionalitäten als anhängende Gruppen. Typische Beispiele sekundärer Reagenzien sind:
    Allgemeine Formel Anhängende Gruppe Beispiele
    HO-R, R = Alkyl, Aralkyl, Aryl, Fluorethanol, Polymer, SiR'3 R- Methanol, Phenol, Trifluorcarbon, OH-terminierte Polyester, Silanole
    H2N-R R = wie oben R- Amine, Aniline, fluorierte Amine, Silylamine, Amin-terminierte Polyamide
    Cl-SiR3 SiR3- Chlorsilane
    HO-R-OH, R=Alkyl, ARalkyl, CH2O- HO- Ethylenglycol, PEG, Pentaerythritol, bis-Phenol A
    H2N-R-NH2, R=Alkyl, Aralkyl H2N- Ethylendiamin, Polyethylenamin
    X-R-Y R=Alkyl, usw.; X=OH oder NH2; Y=SH; CN, C=O, CHO, Alken, Alkine, Aromaten, Heterocyklen Y- Polyaminamide, Mercaptoethanol
  • Die Reaktionen können unter Verwendung irgendeiner der Methoden, welche zur Veresterung oder Aminierung von Carbonsäuren mit Alkoholen oder Aminen entwickelt wurden, durchgeführt werden. Von diesen wurden die Verfahren nach H.A. Staab, Angew. Chem. Internat. Edit., (1), 351 (1962) unter Verwendung von N,N'-Carbonyl-Diimidazol (CDI) als das acylierende Mittel für Ester oder Amide und nach G.W. Anderson, et al., J. Amer. Chem. Soc. 86, 1839 (1964), unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid (NHS) zur Aktivierung von Carbonsäuren zur Amidierung angewandt.
  • Darstellung M
  • Darstellung von sekundären Derivaten funktionalisierter Fibrillen
  • N,N'-Carbonyl-Diimidazol
  • Reine, trockene aprotische Lösungsmittel (z. B. Toluol oder Dioxan) sind für dieses Verfahren erforderlich. Stöchiometrische Mengen von Reagenzien sind ausreichend. Für Ester reagiert die Carbonsäure-Verbindung in einer inerten Atmosphäre (Argon) in Toluol mit einer stöchiometrischen Menge von CDI, gelöst in Toluol, bei RT für zwei Stunden. Während dieser Zeit entwickelt sich CO2.
  • Nach zwei Stunden wird der Alkohol zusammen mit katalytischen Mengen an Na-Ethoxid hinzubegeben und die Reaktion bei 80°C für vier Stunden fortgesetzt. Für normale Alkohole sind die Ausbeuten quantitativ. Die Reaktionen sind:
    Figure 00500001
  • Die Amidierung von Aminen erfolgt unkatalysiert bei RT. Der erste Schritt in dem Verfahren ist der gleiche. Nach der Entstehung von CO2 wird eine stöchiometrische Menge an Amin bei RT zugegeben und für 1-2 Stunden umgesetzt. Die Reaktion ist quantitativ. Die Reaktion ist:
    • 3. R-CO-Im + R'NH2 ------> R-CO-NHR + Him.
  • N-Hydroxysuccinimid
  • Die Aktivierung von Carbonsäuren zur Aminierung mit primären Aminen erfolgt durch den N-Hydroxysuccinamylester; Carbodiimid wird verwendet, um freigesetztes Wasser als einen substituierten Harnstoff zu binden. Der NHS-Ester wird anschließend bei Raumtemperatur durch Reaktion mit dem primären Amin in das Amid umgewandelt. Die Reaktionen sind:
    • 1. R-COOH + NHS ------> R-CONHS + Subst. Harnstoff
    • 2. R-CONHS + R'NH2 ------> R-CO-NHR'
  • Silylierung
  • Trialkylsilylchlorid oder Trialkylsilanole reagieren unmittelbar mit sauren H, entsprechend: R-COOOH + Cl-SiR'3 ------> R-CO-SiR'3 + HCl
  • Geringe Mengen von Diaza-1,1,1-Bicyclooctan (DABCO) werden als Katalysatoren verwendet. Geeignete Lösungsmittel sind Dioxan und Toluol.
  • Darstellung N
  • Darstellung von Ester/Alkohol-Derivaten aus Carbonsäure-funktionalisierten Fibrillen
  • Die Carbonsäure-funktionalisierten Fibrillen wurden wie in Darstellung K hergestellt. Der Carbonsäure-Gehalt war 0,75 meq/g. Die Fibrillen reagierten mit einer stöchiometrischen Menge an CDI in einer inerten Atmosphäre mit Toluol als Lösungsmittel bei R.T., bis die CO2- Entwicklung endete. Danach reagierte der Schlamm bei 80°C mit einem 10-fachen molaren Überschuss an Polyethylenglycol (MW 600) und einer geringen Menge an NaOEt als Katalysator. Nach zweistündiger Reaktion wurden die Fibrillen durch Filtration separiert, mit Toluol gewaschen und bei 100°C getrocknet.
  • Darstellung O
  • Darstellung von Amid/Amin-Derivaten aus Carbonsäure funktionalisierten Fibrillen (177-041-1)
  • 0,242 g an Chlorat-oxidierten Fibrillen (0,62 meq/g) wurden in 20 ml wasserfreiem Dioxan unter Rühren in einem 100 ml Rundkolben, versehen mit einem Serumsstopfen, suspendiert. Ein 20-fach molarer Überschuss an N-Hydroxysuccinimid (0,299 g) wurde hinzugegeben und gelöst. Dem folgte die Zugabe eines 20-fachen molaren Überschusses an 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDAC) (0,510 g) und fortgesetztem Rühren für zwei Stunden bei RT. Am Ende dieser Zeitdauer wurde das Rühren abgebrochen und der Überstand abgesaugt und die Feststoffe mit wasserfreiem Dioxan und MeOH gewaschen und durch eine 0,45 Mikron Polysulfon-Membran filtiert. Die Feststoffe wurden mit zusätzlichem MeOH auf der Filter-Membran gewaschen und vakuum-getrocknet, bis keine weitere Gewichtsabnahme beobachtet wurde. Die Ausbeute an NHS-aktivierten oxidierten Fibrillen war 100%, basierend auf der beobachteten 6% Gewichtszunahme.
  • 100 μl Ethylendiamin(en) wurden zu 10 ml 0,2 M NaHCO3-Puffer hinzugegeben. Ein äquivalentes Volumen an Essigsäure (HOAc) wurde hinzugegeben, um den pH nahe 8 zu halten. NS-Aktivierte oxidierte Fibrillen (0,310 g) wurden unter starkem Rühren hinzugegeben und für eine Stunde umgesetzt. Zusätzliche 300 μl an en und 300 μl an HOAc wurden für zusätzliche 10 Min hinzugegeben. Die Lösung wurde durch eine 0,45 Micron Polysulfon-Membran filtiert und nacheinander mit NaHCO3-Puffer, 1% HCl, DI-Wasser und EtOH gewaschen. Die Feststoffe wurden im Vakuum über Nacht getrocknet. Das HCl-Salz wurde zurück in das freie Amin durch Reaktion mit NaOH (177-046-1) zur weiteren Analyse und Reaktionen umgewandelt.
  • ESCA wurde durchgeführt, um die auf den aminierten Fibrillen (GF/NH2) vorhandene Menge an N zu quantifizieren. Die ESCA-Analyse von 177-046-1 zeigte 0,90 at% N (177-059). Um weiter zu beurteilen, wieviel von diesem N als sowohl zugängliche als auch reaktive Amin-Gruppen vorhanden ist, wurde ein Derivat aus der Gasphasen-Reaktion mit Pentafluorbenzaldehyd hergestellt, um die korrespondierenden Schiff-Base-Verbindungen mit verfügbaren primären Amingruppen herzustellen. Die ESCA-Analyse zeigte immer noch die 0,91 at% N, wie erwartet, und 1,68 at% F. Dies lässt sich umrechnen in 0,34 at% an N, gegenwärtig als reaktives primäres Amin auf den aminierten Fibrillen (5 F pro Pentafluorbenzaldehydmolekül). Eine Höhe von 0,45 at% N würde erwartet werden unter der Annahme einer vollständigen Reaktion mit den freien Enden von jedem N. Die beobachtete Höhe weist auf eine sehr hohe Ausbeute aus der Reaktion von N mit NHS-aktivierten Fibrillen und unterstreicht die Reaktivität der verfügbaren freien Amin-Gruppen.
  • Bei der Höhe von 0,34 at% N, vorhanden als freies Amin, berechnet aus den ESCA-Daten, gäbe es eine fast vollständige Bedeckung der Fibrillen durch die freien Amin-Gruppen, welche das Koppeln mit anderen Materialien ermöglichen.
  • Darstellung P
  • Darstellung von Silyl-Derivaten aus Carbonsäure funktionalisierten Fibrillen
  • Säure-funktionalisierte Fibrillen, hergestellt wie in Darstellung K, wurden in Dioxan in einer inerten Atmosphäre aufgeschlämmt. Unter Rühren wurde eine stöchiometrische Menge an Chlortriethyl-Silan hinzugegeben und für 0,5 Stunden umgesetzt, wonach einige Tropfen einer 5%-igen Lösung an DABCO in Dioxan hinzugegeben wurden. Das System reagierte für eine weitere Stunde, wonach die Fibrillen durch Filtration gesammelt und in Dioxan gewaschen wurden. Die Fibrillen wurden bei 100°C im 5''-Vakuum über Nacht getrocknet.
  • Tabelle V fasst die sekundären Derivat-Darstellungen zusammen. Die Produkte wurden durch ESCA auf C, O, N, Si und F im Oberflächengehalt analysiert. Tabelle V Zusammenfassung der sekundären Derivat-Darstellungen
    REAKTAND anhängige Gruppe ESCA-Analyse, Atom%
    S C N O Si F
    wie gezüchtet - - 98,5 - 1,5 - -
    Chlorat oxidiert -COOH, C=O, C-OH - 95,4 - 7,6 - -
    H2N-C2H4-NH2 -CONHC2H4NH2 - 99,10 0,90 - - -
    -CONHC2H4N=OC6F5 - 97,41 0,91 - - 1,68
  • Darstellung Q
  • Darstellung von Silyl-Derivaten aus Carbonsäure-funktionalisierten Fibrillen
  • Säure-funktionalisierte Fibrillen, hergestellt wie in Darstellung K, werden in Dioxan in einer innerten Atmosphäre aufgeschlämmt. Unter Rühren wird eine stöchiometrische Menge an Chlortriethylsilan hinzugegeben und für 0,5 Stunden umgesetzt, wonach einige Tropfen einer 5%-igen Lösung von DABCO in Dioxan hinzugegeben werden. Das System reagierte für eine weitere Stunde, wonach die Fibrillen durch Filtration gesammelt und in Dioxan gewaschen werden. Die Fibrillen werden bei 100°C in einem 5''-Vakuum über Nacht getrocknet.
  • Tabelle VI fasst die sekundären Derivat-Darstellungen zusammen. Produkte werden durch ESCA analysiert. Die Analyse bestätigt die Aufnahme der gewünschten anhängigen Gruppen. Die Produkte werden durch ESCA auf C, O, N, SI und F im Oberflächengehalt analysiert. Tabelle VI Zusammenfassung der sekundären Derivat-Darstellungen
    REAKTANT anhängige Gruppe ESCA-Analyse, Atom%
    S C N O Si F
    CFCH2OJ -COOCH2CF3 NICHT ANALYSIERT
    PolyEG-600 -CO-(OC2H4O-)H NICHT ANALYSIERT
    HO-C2H4-SH -COOC2H4SH
    Cl-SIEt3 -COSiEt3
  • Sulfonsäure-funktionalisierte Fibrillen
  • Arylsulfonsäuren, hergestellt wie in Darstellung A, können zur Erlangung sekundärer Derivate weiterreagieren. Sulfonsäuren können durch LiAlH4 oder die Kombination aus Triphenylphosphin und Jod (March, J.P., S. 1107) zu Mercaptanen reduziert werden. Sie können auch durch Reaktion mit Dialkyl-Ethern in Sulfonat-Ester umgewandelt werden, d. h. Fibrille–SO3H + R-O-R ----> Fibrille-SO2OR + ROH.
  • Fibrillen funktionalisiert durch elektrophile Addition an sauerstofffreie Fibrillenoberflächen oder durch Metallisierung
  • Die erhaltenden primären Produkte durch Addition aktivierter Elektrophile an sauerstofffreie Fibrillenoberflächen weisen anhängig -COOH, -COCl, -CN, -CH2NH2, -CH2OH, -CH2-Halogen oder HC=O auf. Diese können in sekundäre Derivate folgendermaßen umgewandelt werden: Fibrillen-COOH ------> siehe oben. Fibrillen-COCl (Säurechlorid) + HO-R-Y ----> F-COO-R-Y (Sec. 4/5) Fibrillen-COCl + NH2-R-Y ------> F-CONH-R-Y Fibrillen-CN + H2 ------> F-CH2-NH2 Fibrillen-CH2NH2 + HOOC-R-Y ------> F-CH2NHCO-R-Y Fibrillen-CH2NH2 + O=CR-R'Y ------> F-CH2N=CR-R'-Y Fibrillen-CH2OH + O(COR-Y)2 ------> F-CH2OCOR-Y Fibrillen-CH2OH + HOOC-R-Y ------> F-CH2OCOR-Y Fibrillen-CH2-Halogen + Y ------> F-CH2-Y + X–Y– = NCO–, -OR Fibrillen-C=O + H2N-R-Y ------> F-C=N-R-Y.
  • Fibrillen funktionalisiert durch Adsorption polynuklearer oder polyheteronuklearer aromatischer oder planarer, makrozyklischer Bindungen
  • Dilithium-Phtalocyanin:
  • Im Allgemeinen werden die beiden Li+-Ionen aus der Phthalocyanin-Gruppe (Pc) durch die meisten Metall- (insbesondere mehrbindige) Komplexe verdrängt. Daher ist das Ersetzen der Li+-Ionen durch ein Metallion gebunden an nicht-labile Liganden eine Methode, um stabile funktionelle Gruppen auf Fibrillenoberflächen zu bringen. Fast alle Übergangsmetall-Komplexe werden Li+ aus Pc verdrängen, um stabile, nicht-labile Chelate zu bilden. Der Punkt ist dann, dieses Metall mit einem geeigneten Liganden zu koppeln.
  • Cobalt (II) Phthalocyanin
  • Cobalt (II) Komplexe sind hierfür besonders geeignet. Das Co++-Ion kann die beiden Li+-Ionen ersetzen, um ein sehr stabiles Chelat zu bilden. Das Co++-Ion kann dann an einen Liganden wie beispielsweise Nikotinsäure koordiniert werden, welche einen Pyridin-Ring mit einer anhängenden Carbonsäuregruppe enthält und welche bekanntermaßen bevorzugt an die Pyridin-Gruppe bindet. In Gegenwart eines Überschusses an Nikotinsäure kann Co(II)Pc elektrochemisch zu Co(III)Pc unter Bildung eines nicht-labilen Komplexes mit der Pyridin-Einheit der Nikotinsäure oxidiert werden. Daher ist die freie Carbonsäure-Gruppe des Nikotinsäure-Liganden fest an die Fibrillenoberfläche angelagert.
  • Weitere geeignete Liganden sind die Aminopyridine oder Ethylendiamin (anhängendes NH2), Mercaptopyridin (SH), oder andere polyfunktionelle Liganden, enthaltend entweder eine Amino- oder Pyridil-Einheit an einem Ende und jede wünschenswerte Funktion an dem anderen.
  • 7. 3-dimensionale Strukturen
  • Die oxidierten Fibrillen werden leichter in wässrigen Medien dispergiert als nicht-oxidierte Fibrillen. Stabile, poröse, 3-dimensionale Strukturen mit Meso- und Makroporen (Poren >2 nm) sind als Katalysatorenträger oder Chromatographie-Säulen von großem Nutzen. Da Fibrillen auf einer individualisierten Basis dispergiert werden können, ermöglicht eine wohl-dispergierte Probe, die durch Quervernetzung stabilisiert ist, den Aufbau eines solchen Trägers/Säule. Funktionalisierte Fibrillen sind für diese Anwendung ideal, weil sie leicht in wässrigen oder polaren Medien dispergiert werden und die Funktionalität Quervernetzungs-Punkte bietet. Zusätzlich bietet die Funktionalität Punkte zur Unterstützung der katalytischen oder chromatographischen Stellen. Das Endergebnis ist eine rigide, 3-dimensionale Struktur, deren Gesamtoberfläche mit funktionellen Stellen zugänglich ist, auf denen das aktive Mittel trägt.
  • Typische Anwendungen für diese Träger in der Katalyse umfassen ihre Verwendung als hochporöse Träger für durch Imprägnierung aufgetragene Metallkatalysatoren, beispielsweise Edelmetall-Hydrierungskatalysatoren. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, molekulare Katalysatoren durch Anbinden an den Träger über die Funktionalität in Kombination mit der sehr hohen Porosität der Struktur, homogene Reaktionen in einer heterogenen Weise durchzuführen. Der angebundene molekulare Katalysator baumelt im Wesentlichen in einer kontinuierlichen flüssigen Phase, vergleichbar einem homogenen Reaktor, in welchem er die Vorzüge in Selektivitäten und Umsätzen, welche homogene Reaktionen begleiten, nutzen kann. Jedoch ermöglicht das Angebundensein an den festen Träger eine leichte Trennung und Rückgewinnung des aktiven und in vielen Fällen sehr teuren Katalysators.
  • Diese stabilen, rigiden Strukturen erlauben auch die Durchführung von vordem sehr schwierigen Reaktionen wie beispielsweise asymmetrische Synthesen oder Affinitäts-Chromatographie durch Anlagern eines geeigneten enantiomeren Katalysators oder selektiven Substraten an den Träger. Die Derivatisierung durch Metall-Pc oder Metall-Porphyrin-Komplexe gestattet außerdem die Rückgewinnung des an das Metall-Ion gebundenen Liganden und darüber hinaus jedes Moleküls, welches über die sekundären Derivate an den Liganden gebunden ist. Z. B. wird in dem Fall, wo die 3-dimensionale Struktur funktionalisierter Fibrillen eine Elektrode oder Teil einer Elektrode ist und die Funktionalisierung sich aus der Adsorption von Co(II)Pc ergeben hat, die elektrochemische Oxidation von Co(II) zu Co(III) in der Gegenwart von Nikotinsäure einen nicht-labilen Co(III)-Pyridil-Komplex mit einer Carbonsäure als die anhängige Gruppe bilden. Die Anlagerung eines geeigneten Antigens, Antikörpers, katalytischen Antikörpers oder anderen Stellen-spezifischen Haftmitteln wird selektive Trennungen von Molekülen (Affinitätschromatographie) ermöglichen, welche ansonsten nur sehr schwer zu erzielen sind. Nach Waschen der Elektrode zur Entfernung eingeschlossenen Materials kann der das Zielmolekül enthaltende Co(III)-Komplex elektrochemisch reduziert werden, um den labilen Co(II)-Komplex zurückzugewinnen. Der Ligand am Co(II), enthaltend das Zielmolekül, kann dann durch Massenwirkungssubstitution des labilen Co(II)-Liganden zurückgewonnen werden und damit eine Trennung und Rückgewinnung von Molekülen bewirken, welche ansonsten sehr schwierig oder kostenintensiv durchzuführen sind (z. B. chirale Arzneimittel).
  • Ein weiteres Beispiel 3-dimensionaler Strukturen sind Fibrillen-Keramik-Komposite.
  • Darstellung R
  • Darstellung von Aluminiumoxid-Fibrilllen-Kompositen (185-02-01)
  • Ein g Salpetersäure-oxidierter Fibrillen (185-01-02) wurde unter Verwendung eines U/S Desintegrators in 100 ml DI-Wasser stark dispergiert. Der Fibrillenschlamm wurde auf 90°C erhitzt und eine Lösung von 0,04 mol Aluminiumtributoxid aufgelöst in 20 ml Propanol wurde langsam zugegeben. Der Rückfluss wurde für vier Stunden fortgesetzt, wonach der Kühler entfernt wurde, um den Alkohol auszutreiben. Nach 30-Minuten wurde der Kühler wieder eingesetzt und der Schlamm bei 100°C refluxiert. Es wurde ein schwarzes Sol mit uniformem Erscheinungsbild erhalten. Das Sol wurde auf RT abgekühlt und nach einer Woche bildete sich ein schwarzes Gel mit einer glatten Oberfläche. Das Gel wurde bei 300°C an Luft für 12 Stunden erhitzt.
  • Die Aluminiumoxid-Fibrillen-Kompositen wurden mittels SEM untersucht. Die SEM-Aufnahmen rissiger Oberflächen zeigten eine homogene Dispersion von Fibrillen im Gel.
  • Darstellung S
  • Darstellung von Silica-Fibrillen-Kompositen (173-85-03)
  • Zwei g Salpetersäure-oxidierter Fibrillen (173-83-03) wurden in 200 ml Ethanol unter Verwendung von Ultraschall stark dispergiert. Eine Lösung von 0,1 mol Tetraethoxysilan aufgelöst in 50 ml Ethanol wurde langsam bei RT dem Schlamm hinzugegeben, gefolgt von 3 ml konzentrierter HCl. Die Mischung wurde auf 85°C erhitzt und bei dieser Temperatur gehalten, bis das Volumen auf 100 ml reduziert war. Die Mischung wurde abgekühlt und zur Seite gestellt, bis sich ein schwarzes, festes Gel bildete. Das Gel wurde an Luft auf 300°C erhitzt.
  • Die Silica-Fibrillen-Komposite wurde mittels SEM untersucht. SEM-Aufnahmen rissiger Oberflächen zeigten eine homogene Dispersion der Fibrillen in dem Gel. Vergleichbare Präparate mit anderen Keramiken wie beispielsweise Zirkonoxid, Titandioxid, Seltenerdoxide ebenso wie ternäre Oxide können hergestellt werden.
  • Wie in der vorhergehenden Beschreibung und den Beispielen veranschaulicht, findet die Erfindung Anwendung in der Formulierung einer breiten Vielfalt funktionalisierter Nanoröhren.
  • Die hier verwendeten Bezeichnungen und Ausdrücke werden als Bezeichnungen der Beschreibung und nicht der Begrenzung gebraucht und es besteht keine Absicht beim Gebrauch solcher Bezeichnungen oder Ausdrücke, irgendwelche Äquivalente der gezeigten Merkmale auszuschließen und als Teil davon zu schreiben. Es wird anerkannt, dass verschiedene Modifizierungen im Rahmen der Erfindung möglich sind.
  • Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung
  • Während eine breite Auswahl an Nanoröhren in den Assays der Erfindung eingesetzt werden kann, weisen die Nanoröhren im Allgemeinen eine Dichte von 1,0-5,0 g/mL und bevorzugt eine Dichte von 1,1-2 g/mL auf. Die Auswahl der optimalen Dichte liegt im Fachkönnen der Technik, die Sinkgeschwindigkeit in gravitätsgesteuerten Assays liegt im Kompromiss zwischen der Geschwindigkeit des Assays und dem Wunsch, eine uniforme Komplex-Schicht auf der Elektrodenoberfläche zu erzeugen.
  • Nanoröhren, welche eine breite Auswahl an mittleren Durchmessern aufweisen, können ebenfalls eingesetzt werden. Partikel, welche einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,001-100 µm aufweisen, können verwendet werden, bevorzugt weisen die Partikel einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,01-10 µm auf. Die Längen der Nanoröhren sind mindestens 5-fache des Durchmessers.
  • Ebenfalls kann ein großer Bereich an Partikel-Konzentrationen in der Assay-Zusammensetzung eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Konzentration von 1 × 10–9 bis 1 × 10–2 g/mL reichen, bevorzugt von 1 × 10–8 bis 1 × 10–3 g/mL. Wünschenswerter Weise wird die Dichte der Partikel, ihre Größe und ihre Konzentration derart ausgewählt, dass die Partikel mit einer Geschwindigkeit von mindestens 0,5 mm/min und bevorzugt mit einer höheren Geschwindigkeit sinken.
  • Beim Ausführen der Erfindung im Filtrations-Modus weisen die Filtrationsmittel eine Porengröße, gemessen als mittlerer Durchmesser, von etwa 0,01-90% des mittleren Durchmessers der Partikel und bevorzugt von 10-90% dieses Durchmessers auf. Die Nanoröhren können paramagnetisch oder ferromagnetisch sein und können mit verschiedenen Materialien, an welche Bindungs-Verbindungen gekoppelt sind, beschichtet werden, sodass das magnetische Partikel in Assays verwendet werden kann.
  • Wünschenswert weisen die in der Erfindung verwendeten magnetischen Nanoröhren eine Suszeptibilität von mindestens 0,001 cgs Einheiten auf und wünschenswert beträgt die Suszeptibilität mindestens 0,01 cgs Einheiten. Die magnetischen Nanoröhren können einen weiten Bereich von Dichten aufweisen, d. h. von wesentlich weniger als der von Wasser, 0,01, bis 5 g/mL und bevorzugt von 0,5-2 g/mL. Die Partikelgrößen können von 0,001-100 µm reichen und bevorzugt von 0,01-10 µm. Die Konzentration der Partikel kann allgemein von 1 × 10–9 bis 1 × 10–2 g/ml und bevorzugt von 1 × 10–8 bis 1 × 10–3 g/ml reichen.
  • Wünschenswert weisen die verwendeten magnetischen Nanoröhren eine geringe magnetische Remanenz auf, wie beispielsweise in der EP 0,180,384 beschrieben, sodass nach Entfernen des Magnetfeldes von der Elektrodenoberfläche die Nanoröhren entmagnetisieren und aus der Assay-Zelle gespült werden können. Wünschenswert sind die Dichte, Konzentration und Größe der magnetischen Nanoröhren derart gewählt, dass die Sinkgeschwindigkeit mindestens 0,5 mm/min ist und wünschenswert über dieser Geschwindigkeit liegt. Beim Betrieb der magnetischen Zelle ist es oft wünschenswert, die magnetischen Hilfsmittel von der Elektrodenoberfläche vor dem Induzieren der Elektrochemilumineszenz zu entfernen, um nicht den Betrieb der Photomuliplier-Röhre störend zu beeinflussen.
  • Assays
  • Eine Vielzahl von Assays kann unter Verwendung der Verfahren der Erfindung durchgeführt werden. Es wurde ein Assay unter Verwendung funktionalisierter Kohlenstoffnanoröhren durchgeführt. Das Assay umfasste eine ECL-Detektion hydrolytischer Enzyme unter Verwendung von Kohlenstoff-Nanoröhren (Fibrillen). Kohlenstoff-Nanoröhren (Fibrillen) wurden mit Substraten hydrolytischer Enzyme chemisch modifiziert. An dem Ende des Substrates, welches am weitesten von der Fibrille entfernt war, wurde ein Derivat von Ru(bpy)3 2+ angelagert. Die allgemeine Struktur der festen Phase war folgendermaßen: Fibrille-Substrat (spaltbare Bindung)-Ru(bpy)3 2+. In Gegenwart eines Enzyms, welches die spaltbare Bindung spaltet, wird das Ru(bpy)3 2+-Ende des Substrates durch die Aktivität des Enzyms in die Lösung freigesetzt. Im Anschluss an Mischung und Inkubation der Fibrillen mit dem Enzym werden die Fibrillen aus der Lösung entfernt (durch Filtrieren oder Zentrifugieren). Die ECL der verbleibenden Lösung wird gemessen. War das Enzym vorhanden, wird das Ru(bpy)3 2+-Ende des Substrates in der Lösung präsent sein und Licht emittieren. Daher führt das Vorhandensein des spezifischen Enzyms zu einer Lichtemission aus der Lösungsphase der Mischung. Das Assay ist ein neues ECL-Assay für Proteasen, weil es keine Antikörper umfasst (es ist kein Immunoassay). Damit weist es den Vorteil auf, eher ein Assay für Enzymaktivität als ein Assay für das Vorhandensein des Enzyms zu sein (das Enzym kann inaktiv sein). Zudem verwendet das Assay Fibrillen als einen festen Träger. Fibrillen erweisen sich wegen ihrer großen Oberfläche und der Zugänglichkeit beim Anlagern von Biomolekülen wie beispielsweise Enzymsubstrate als attraktiv. Des Weiteren können die funktionalisierten Fibrillen in einer Durchfluss-Membran ausgebildet sein (Vlies). Die Enzymmischung könnte rasch durchfliessen, um Ru(bpy)3 2+ freizusetzen und so das Assay schnell und praktisch gestalten.
  • Es wurde ein DNA-Test Assay unter Verwendung von Fibrillen und ECL durchgeführt. Kohlenstoff-Nanoröhren (Fibrillen) wurden als fester Träger in DNA-Test-Assays als Separationsmedien zur Trennung von Analyten von komplexen Mischungen, welche biologische Fluide und zugefügte Reagenzien umfassen können, verwendet. Fibrillen wurden mit Avidin (oder Streptavidin) modifiziert, entweder durch kovalente Bindung (über NHS-Ester) oder durch Adsorption an Alkyl-Fibrillen. Biotinylierte ssDNA (der "Analyt") band an die Avidin-Fibrille und wurde durch die ECL eines komplementären, einsträngigen Oligonucleotids, welches mit Ru(bpy)3 2+ markiert war, detektiert.
  • Eine Ausführung zur Detektion eines natürlichen (nicht-biotinylierten) DANN-Fragmentes besteht in einer Konkurrenzausführung, in der das Ru(bpy)3 2+-markierte Oligo entweder an die natürliche DNA oder an die eingeführte biotinylierte DNA binden kann. Je mehr Analyt daher vorhanden ist (nicht-biotinylierte DNA), desto weniger markiertes Oligo verbleibt, um an die biotinylierte DNA zu binden, welche beim Anhaften auf Avidin-Fibrillen ein ECL-Signal gibt.
  • Dies bedeutet das erste Mal, dass Kohlenstoff-Nanoröhren in DNA-Analyse verwendet wurden. Die Vorteile sind: (1) Kohlenstoff-Nanoröhren weisen eine sehr hohe Oberfläche auf, d. h., dass weniger fester Träger notwendig ist als mit anderen festen Trägern. (2) Fibrillen sind elektrisch leitfähig, welches eine attraktive Eigenschaft für einen festen Träger in ECL-Anwendungen darstellt, in denen der feste Träger an eine Elektrode anliegt. Durch ihre elektrische Leitfähigkeit ist ein größerer Teil der Oberfläche in elektrochemischem Kontakt als bei anderen Trägern, die nicht leitfähig sind.
  • Ein ECL-basiertes Immunoassay unter Verwendung immobilisierter Antikörper auf Kohlenstoff-Nanoröhren (Fibrillen) wäre vorteilhaft. Antikörper-Fibrillen könnten in ECL-Anwendungen in einer Konkurrenz Immunoassay-Ausführung verwendet werden (wo es eine Konkurrenz zwischen dem Analyten und dem Ru(bpy)3 2+-markierten Analyten zur Bindung an die Antikörper-Fibrille gibt) oder in einer Sandwich-Ausführung (wo ein Ru(bpy)3 2+-markierter sekundärer Antikörper an den Antikörper-Fibrille-Analyt-Komplex bindet). In beiden Fällen zeigt die ECL-Lichtemission das Vorhandensein oder die Abwesenheit des interessierenden Analyten an. Antikörper können auf Fibrillen durch verschiedene Methoden immobilisiert werden, durch kovalente oder nicht-kovalente Hilfsmittel. Zur nicht-kovalenten Immobilisierung wird der Antikörper auf nicht-modifizierte Fibrillen oder auf Fibrillen, welche zur Verstärkung der Adsorptions-Charakteristika modifiziert wurden, adsorbiert. Derartig modifizierte Fibrillen weisen hydrophobe Anhänge auf (Alkyl-Ketten oder Phenyl-Alkyl-Ketten). Die kovlaente Immobilisierung von Antikörpern auf Fibrillen kann durch drei verschiedene Methoden erzielt werden: durch NHS-Ester Aktivierung carboxylierter Fibrillen, durch reduktive Aminierung von Antikörper-Kohlenhydratgruppen und durch Sulfhydryl/Maleimido-Fibrillen, welche mit reduzierten oder Maleimido-modifizierten Antikörpern reagieren. Die Immobilisierung von Antikörpern auf Kohlenstoff-Fibrillen ist vorteilhaft. Anitkörper-Fibrillen weisen eine Anzahl einzigartiger Eigenschaften im Vergleich mit anderen festen Trägern für Antikörper auf. Diese Vorteile umfassen eine große Oberfläche pro Gewichtseinheit, elektrische Leitfähigkeit (besonders in ECL-Anwendungen) sowie chemische und physikalische Stabilität.
  • Kohlenstoffnanoröhren wurden als ECL-basierte Biosensoren verwendet. Bifunktionale Fibrillen wurden hergestellt, worin ein Derivat des Enzym-Cofaktors NAD+ an eine funktionelle Gruppe angelagert wurde und ein Derivat von Ru(bpy)3 2+ an die andere funktionelle Gruppe (COOH) angelagert wurde. Die Biosensor-Fibrillen wurden mit einer Lösung gemischt, welche den Analyten (eine Dehydrogenase, in diesem Fall G6PDH) und der Träger der Dehydrogenase wurde hinzugefügt (in diesem Fall Glucose-6-Phosphat). Nach einer für das Enzym hinreichenden Zeit, um mit seinem Träger zu reagieren und die NAD+-Gruppen auf den Fibrillen in NADH umzuwandeln, wurden die ECL der Fibrillen in einem ECL-Messgerät gemessen. Eine Änderung in den ECL-Eigenschaften der Biosensor-Fibrillen zeigte das Vorhandensein des Enzyms G6PDH an. Es wurden die folgenden Vorteile gefunden: (1) Die große Nähe der NAD+ und Ru(bpy)3 2+-Coreaktanden führen zu einer intramolekularen ECL-Reaktion, welche effizienter ist als intermolekulare ECL-Reaktionen. (2) Die ECL-aktiven Reagenzien (die NAD+ und Ru(bpy)3 2+-Coreaktanden) werden auf Fibrillen immobilisiert, welches ihnen ermöglicht, auf die ECL-Elektrode abzusinken oder magnetisch zu ihr hingezogen zu werden, welches zu verstärkter Lichtemission führt. (3) Fibrillen weisen eine extrem große Oberfläche auf, sodass große Mengen der Coreaktanden (NAD+ und Ru(bpy)3 2+) immobilisiert werden können und theoretisch den Licht-Output während der Detektion von Dehydrogenasen verstärken. (4) Fibrillen sind elektrisch leitfähig – wenn die Biosensoren die Elektrode erreichen, kann ein Großteil ihrer Oberfläche, welche nicht im tatsächlichen Kontakt mit der Elektrode ist, Spannung empfangen und an ECL-Reaktionen teilnehmen. (5) Der Biosensor ist ausgelegt, Dehydrogenasen, welche entweder NAD+ oder NADH als einen Cofaktor verwenden, zu detektieren. Viele dieser Enzyme existieren und könnten unter Verwendung dieser Erfindung detektiert werden.
  • Kohlenstoff-Fibrillen wurden als fester Träger für einen Enzym-Biosensor verwendet. Weil der Enzym-Biosensor wasserlöslich ist, kann er nur einmal verwendet werden, sofern er nicht immobilisiert wird (Immobilisierung ermöglicht seine Rückgewinnung aus der Analyten-Lösung). US Patentanmeldung Nr. 08/467,712 diskutiert und beansprucht die Immobilisierung auf einem festen Träger und auf einer (festen) Elektrode. Die vorliegende Anmeldung zeigt die Verwendung von Kohlenstofffibrillen als den festen Träger. Der Enzym- Biosensor kann durch Adsorption an die Fibrillen angelagert werden. Die Fibrillen können entweder unmodifizierte Fibrillen oder, bevorzugt, chemisch modifizierte Fibrillen sein. Chemische Modfizierung der Fibrillen erfolgt bevorzugt durch Alkylierung. Die Adsorption des Biosensors wird durch Inkubation mit Mischen des Enzym-Biosensors und den alkylierten Fibrillen durchgeführt. Fibrillen als fester Träger sind neu und attraktiv, weil: (1) sie weisen eine große Oberfläche der Immobilisierung auf, welche potentiell zu starker Lichtemission führt, (2) Proteine wie der Biosensor können bequem adsorbiert werden ohne kovalente Chemie, (3) Fibrillen sind elektrisch leitfähig, welches ECL verstärken kann, wenn in Kontakt mit einer Elektrode, (4) Fibrillen selbst können zu Elektroden werden, wobei in diesem Fall die Elektrode selbst ein Biosensor-Träger ist.
  • Magnetisch suszeptible Partikel sind als Hilfsmittel nützlich für Trennungen. Trennungen von beispielsweise einem spezifischen Analyten aus einer komplexen Mischung sind in der Diagnostik-Industrie hilfreich, wo ein Analyt in einer komplexen Mischung, wie beispielsweise Blut, vorliegen kann. Weil die komplexe Mischung die Analyse des Analyten beeinträchtigen kann, ist es erwünscht, den Analyten an eine feste Oberfläche zu binden, so dass die gesamte Mischung vom Analyten weggewaschen werden kann und somit seine Bestimmung ermöglicht, wenn der gewünschte Analyt spezifisch an ein magnetisch suszeptibles Partikel binden und dieses Partikel von einem Magneten gehalten werden kann, ermöglicht dies das Auswaschen der komplexen Mischung weg vom Analyten, welcher dann detektiert werden kann. Weil Fibrillen Partikel sind, welche spezifisch und effizient Biomoleküle binden können, werden magnetisch suszeptible Fibrillen vorteilhaft als Festphasen-Trennungselemente verwendet, besonders in ECL-Analysen. Fibrillen werden durch Behandlungen magnetisch suszeptibel gemacht, beispielsweise durch chemische Reaktionen oder Wechsel des Lösungsmittels, in dem sie suspendiert sind (z. B. von Wasser zu DMF). Es wird vermutet, dass derartige Manipulationen Änderungen in der physikalischen Aggregation multibler Fibrillen bewirken. Weil Fibrillen etwa Eisen in sich tragen (ungefähr 0,5 Gew.-%), haben sie die Fähigkeit, sobald sie aggregiert sind, im Wesentlich magnetisch suszeptibel zu sein. Einige Behandlungen wurden durchgeführt, welche die magnetische Suszeptibilität erhöhen. Von diesen Behandlungen wird postuliert, Änderungen in der Aggreagation von Fibrillen hervorzurufen, welches sie wiederum bewegt, effizient zu einem Magneten gezogen zu werden. Magnetisch suszeptible Fibrillen weisen mindestens zwei einzigartige Vorteile auf. Erstens weisen sie eine sehr große Oberfläche pro Gewichtseinheit auf. Dadurch werden weniger Fibrillen benötigt (verglichen mit beispielsweise Dynal-Perlen), um das gleiche Ergebnis zu erzielen. Zweitens sind Fibrillen elektrisch leitfähig. Dadurch weisen sie einen Vorteil in Anwendungen wie beispielsweise ECL auf, wo die magnetisch suszeptiblen Partikel an einer Elektrode festgehalten werden. Damit werden sie durch die elektrische Leitfähigkeit tatsächlich Teil der Elektrode und verstärken die Licht-Output-Effizienz.
  • Beispiele
  • (1) Messtechnik
  • Eine Durchfluss-Apparatur, enthaltend drei Elektroden wie in 1 und 2 beschrieben, wurde verwendet.
    • Arbeitselektrode – Au Scheibe, 3 mm Durchmesser
    • Gegenelektrode – Au Scheibe, 3 mm Durchmesser
    • Referenzelektrode – Ag/AgCl
    • Teflondichtung (0,15'' dick)
    • Plexiglas Abdeckung
    • Einlassrohrleitung = .042'' id Polypropylen
    • Ansauggeschwindigkeiten: variierend von 0,01 bis 5 mL/min
    • Potentiosat: Mikroprozessor-gesteuert
    • Luminometer: Hamamatus R374 PMT (gering verstärkende, rot sensitive Röhre); PMT Spannung 0-1400 V.
  • (2) ECL Messzyklus (drei Elektroden-Zellbetrieb)
  • Der ECL-Messzyklus bestehe aus drei Stufen: (1) Vorkonditionieren, (2) Messen, und (3) Reinigen. Der Vorkonditionierungs-Schritt umfasst das Anlegen einer Spannungs-Dreieckswelle von 0,0 V bis +2,2 V bis –1,0 V bis +0,6 V bei 2,0 V/sec. Der Messungsschritt umfasst das Anlegen einer Dreieckswelle von +0,6 V bis +2,8 V bis 2,0 V bei 1,0 V/s. Der Reinigungsschritt umfasst das Anlegen einer Spannungs-Rechteckwelle von +0,0 V bis +3,0 V bis –0,5 V bis 0,0 V. Alle Spannungen beziehen sich auf die Ag/AgCl Referenzelektrode.
  • Beispiel 1
  • Ruthenium markierte Peptid-Fibrillen-Synthese
  • Dieses Beispiel zeigt die Synthese eines Enzym-Detektionsreagenzes im ECL-Analyzer. Ruthenium-Pepitd-Fibrillen-Synthese:
    Das Tetrapeptid von FmocNH-Gly-Lys(Nε-CBZ)-Phe-Gly-COOH wurde mit konventionellen Flüssigphasenverfahren synthetisiert und dieses Peptid (71 mg, 0,093 mmol) wurde umgesetzt mit einer primären Amin-derivatisierten Version von Ru(bpy)3 2+ (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) (73 mg, 0,078 mmol), EDC (17,8 mg, 0,093 mmol) wurde als aktivierendes Reagenz mit HOBT (12,58 mg, 0,093 mmol) als Katalysator verwendet. Das Produkt FmocNH-Gly-Lys(Nε-CBZ)-Phe-Gly-CO-NH-Tag (170 mg, 0,223 mmol) wurde mit Piperidin (96 ml) und Methylenchlorid (1,1 ml) entschützt. Die Struktur der Tetrapeptid-Ru(bpy)3 2+-Verbindung wurde bestätigt durch 1 H-NMR. Zu der Lösung aus Tetrapeptid-Ru(bpy)3 2+ (5 mg, 0,003 mmol) in Methylenchlorid (2 ml) wurden Carboxyl-Fibrillen (54 mg) hinzugegeben. Dann wurden EDC (5,8 mg, 0,03 mmol) und HOBT (4 mg, 0,03 mmol) hinzugegegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. Die Fibrillen wurden extensiv mit Wasser, Methanol, Acetonitril und Methylenchlorid gewaschen. Die Produkt-Fibrillen wurden mit Trimethylsilyliodid (TMSI, 1 ml) in Acetonitril (4 ml) für drei Stunden bei 40°C behandelt. Die Endprodukt-Fibrillen wurden extensiv mit Wasser, Methanol, Acetonitril, IGEN-Standard ECL-Assay-Puffer (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) und Methylenchlorid gewaschen.
  • Beispiel 2
  • ECL-Assay von Trypsin und Chymotrypsin Aktivität unter Verwendung von Ru(bpy)3 2+ markierten Peptid-Fibrillen
  • Ein Ru(bpy)3 2+-markiertes Tetrapeptid (NH2-Gly-Lys-Phe-Gly-Ru(bpy)3 2+) wurde an carboxylierte Fibrillen konjugiert, wie beschrieben in Beispiel 1. Die Ru(bpy)3 2+-markierten Peptid-Fibrillen (RPF) wurden verwendet, um die Aktivitäten der hydrolytischen Enzyme Trypsin und Chymotrypsin zu detektieren. In Kürze, die RPF wurden zu einer wässrigen Lösung enthaltend eines oder beide der Enzyme hinzugegeben. Weil die Peptide ausgelegt waren, spezifische Spaltstellen für sowohl Trypsin als auch Chymotrypsin (3) zu enthalten und weil Fibrillen ein Festkörper sind, würde der Einfluss der Enzyme entweder Phe-Gly-Ru(bpy)3 2+ (Trypsin) oder Gly-Ru(bpy)3 2+ (Chymotrypsin) in die Lösung freisetzen. Nach einer angemessenen Inkubationszeit für die Enzyme zur Spaltung der Festphasen-Peptide, wurde die wässrige Lösung von den Fibrillen durch Standardverfahren wie beispieslweise Zentrifugieren, Filtieren oder Entfernen der Fibrillen mit einem Magnet abgetrennt. Die freigesetzten Phe-Gly-Ru(bpy)3 2+ oder Gly-Ru(bpy)3 2+ in der wässrigen Lösung werden dann durch ECL detektiert.
  • Wenngleich hier Assays von Trypsin und Chymotrypsin gezeigt werden, konnten weitere hydrolytische Enzyme unter Verwendung von Fibrillen, konjugiert mit dem geeigneten Ru(bpy)3 2+-markierten Enzym-Substrat, detektiert werden. Derartige Enzyme (und modifizierte Fibrillen) umfassen: Nukleasen (unter Verwendung von Fibrillen konjugiert mit -Ru(bpy)3 2+-markierter RNA, einsträngige DNA, oder doppelsträngige DNA), Glycosidasen (unter Verwendung von Fibrillen konjugiert mit Ru(bpy)3 2+-markierten Zuckern, Oligosacchariden oder Polysacchariden), oder Lipasen (unter Verwendung von Fibrillen konjugiert mit Ru(bpy)3 2+-markierten Lipiden).
  • Beispiel 3
  • ECL-Detektion von Trypsin und Verwendung von Fibrillen
  • Zu einer 2,97 ml Suspension von RPF (Fibrillen-Gly-Lys-Phe-Gly-Ru(bpy)3 2+) (2.2 mg/mL) in Standard ECL-Assay-Puffer (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) wurden entweder 30 μL von 58,9 μM Trypsin (Endkonzentration 0,59 μM) in 1 mM HCl oder 30 μl an 1 mM HCl hinzugegeben. Die beiden Suspensionen wurden dann bei Raumtemperatur einrotiert. Die Rotation wurde periodisch unterbrochen, die Suspension rasch zentrifugiert und die ECL der überstehenden wässrigen Lösung gemessen. Die ECL-Ergebnisse nach 30-minütiger Inkubation zeigten, dass die ECL-Verhältnisse der Proben (ECL mit Trypsin/ECL ohne Trypsin) 1,29 betrugen. Nach 44 Stunden war das ECL-Verhältnis 2,05. Diese Ergebnisse zeigen, dass Trypsin durch seine Fähigkeit, eine elektrochemilumineszente Ruthenium-Markierung hydrolytisch aus Fibrillen freizusetzen, detektiert werden konnte.
  • Beispiel 4
  • ECL-Detektion von Chymotrypsin unter Verwendung von Fibrillen
  • Zu einer 2,97 ml Suspension von RPF (Fibrillen-Gly-Lys-Phe-Gly-Ru(pby)3 2+) (0,15 mg/mL) in standardisiertem ECL-Assay-Puffer (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) wurden entweder 30 μl an 34,2 µm Chymotrypsin (Endkonzentration = 0,34 µm) in 1 mM HCl oder 30 μl an 1 μM HCl hinzugegeben. Die Suspensionen wurden bei Raumtemperatur rotiert. Die Rotation wurde periodisch unterbrochen, die Suspension schnell abzentrifugiert und die ECL der überstehenden wässrigen Lösung gemessen. Die ECL-Ergebnisse zeigten, dass anfangs (Zeit = 0) die ECL-Verhältnisse der Proben (ECL mit Chymotrypsin/ECL ohne Chymotrypsin) 1,06 betrugen. Nach 30-minütiger Inkubation stiegen die Verhältnisse auf 1,25 und nach 23-stündiger Inkubation stiegen die Verhältnisse auf 1,85. Diese Daten zeigen, dass Chymotrypsinaktivität durch die Fähigkeit des Enzyms, eine elektrochemilumineszente Markierung, Ru(bpy)3 2+, von einem festen Fibrillen-Träger freizusetzen, detektiert werden konnte.
  • Beispiel 5
  • Kovalente Anlagerung von Proteinen an Fibrillen über NHS-Ester
  • Um zu zeigen, dass Protein kovalent über NHS-Ester an Fibrillen gebunden werden kann, wurden Streptavidin, Avidin und Trypsin wie folgt an Fibrillen angelagert.
  • 0,5 mg NHS-Ester Fibrillen wurden mit 5 mM Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,1) gewaschen und die überstehende Lösung verworfen. 200 μl Streptavidin-Lösung (1,5 mg in demselben Puffer) wurde zu den Fibrillen gegeben und die Mischung bei Raumtemperatur für 5,5 Stunden rotiert. Die Fibrillen wurden dann mit 1 ml der folgenden Puffer in Reihenfolge gewaschen: 5 mM Natriumphosphat (pH = 7,1), PBS (0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH = 7,4), ORIGEN-Assay-Puffer (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) und PBS. Die Streptavidin-Fibrillen wurden in PBS-Puffer zur weiteren Verwendung gelagert.
  • 2,25 mg NHS-Ester Fibrillen wurden in 500 μl eines 5 mM Natriumphosphatpuffers (pH = 7,1) für 40 Minuten ultraschallbehandelt und die überstehende Lösung verworfen. Die Fibrillen wurden in 500 μl eines 5mM Natriumphosphat-Puffers (pH = 7,1) suspendiert und 300 μl einer Avidin-Lösung, hergestellt in dem gleichen Puffer, enthaltend 2 mg Avidin (Sigma, A-9390) hinzugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden rotiert, bei 4°C über Nacht gelagert und bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde einrotiert. Die Fibrillen wurden mit 1 ml eines 5mM Natriumphosphat-Puffers (pH = 7,1) viermal und im PBS-Puffer zweimal gewaschen. Die Avidin-Fibrillen wurden in 200 μl PBS-Puffer zur Lagerung suspendiert.
  • Trypsin-Fibillen wurden hergestellt durch Mischen von 1,1 mg NHS-Ester Fibrillen (behandelt wie in Avidin-Fibrillen) und 200 μl einer 1,06 mM Trypsin-Lösung hergestellt in 5 mM Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,1), und bei Raumtemperatur für 6,5 Stunden einrotiert. Die Trypsin-Fibrillen wurden dann mit 1 ml eines 5 mM Natriumphosphat-Puffers (pH = 7,1) dreimal gewaschen und in 400 μl des gleichen Puffers zur Lagerung suspendiert.
  • Beispiel 6
  • DNA-Test-Assay unter Verwendung eines ECL-Analysers
  • Um nicht-spezifische Bindung eines Analyten an Streptavidin (oder Avidin)-gebundene Fibrillen im ECL-Assay zu eliminieren, wurden diese Fibrillen durch 4 mg/ml BSA (bovine serum albumin) Lösung für 6 Stunden bei Raumtemperatur und über Nacht bei 4°C blockiert. Das DNA-Test-Assay ist in 4 dargestellt. Das Experiment wurde begonnen mit dem zweifachen Waschen von 115 μg BSA-blockierter Avidin-Fibrillen und Streptavidin-Fibrillen (aus Beispiel 5) mit 5mM Natriumphosphat-Puffer (pH = 7,1). Jede Fibrille wurde aliquot in zwei Röhren mit ~-57 μg in 100 μl des gleichen Puffers gegeben. Eine Röhre von (Strept) Avidin-Fibrillen wurde gemischt mit 4 μl einer 4 nM biotinylierten DNA (70 Nucleotide), welche an ein Ruthenium-markiertes Oligomer gebunden war. Der anderen Röhre wurden 4 μl eines Ruthenium-markierten Oligomers (gleiche Konzentration wie in der biotinylierten DNA-Probe) lediglich für ein Kontroll-Assay hinzugegeben. Die Reaktionsmischungen wurden bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert und sieben Mal mit 300 μl eines ORIGIN-Assay-Puffer (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) gewaschen. Die Fibrillen wurden dann in 600 μl ORIGIN-Assay-Puffers suspendiert und in zwei Röhren zu doppelter ECL-Zählung aliquotiert unter Nutzung des Gravitationssinkens der Fibrillen. Die Ergebnisse des ECL-Assays wurden wie folgt zusammengefasst:
    Probe ECL-Zählung
    Avidin-Fibrillen (Kontrolle) 161
    Avidin-Fibrillen (DNA-Test) 2212
    Streptavidin-Fibrillen (Kontrolle) 885
    Streptavidin-Fibrillen (DNA-Test) 4248
  • Das gleiche Assay wurde auch für Avidin-Fibrillen durchgeführt unter Verwendung des magnetischen Einfangens der Fibrillen. Das experimentelle Vorgehen war das Gleiche wie oben, außer, dass nach der Bindung der DNA an die Fibrillen kein Waschen vorgenommen wurde. Die Probe wurde in dem ECL-Analyzer in programmierten Schritten gewaschen. Die ECL-Zählung ergab 3835 für den Avidin-Fibrillen-DNA-Test gegenüber 205 der Kontrollprobe.
  • Avidin absorbiert auf C8-Fibrillen wurde ebenfalls mit dem DNA-Test-Assay unter Verwendung magnetischen Einfangens der Fibrillen wie oben beschrieben untersucht. Die ECL-Zählung ergab 15792 für den Avidin-Fibrillen-DNA-Test gegenüber 205 für die Kontroll-Probe.
  • Beispiel 7
  • Kovalente Immobilisierung von Antikörpern auf Kohlenstoff-Nanoröhren
  • Das Ziel des Beispiels ist es, Antikörper auf den Oberflächen von Kohlenstoff-Nanoröhren zu immobilisieren. Derartige Antikörper-modifizierte Nanoröhren können in verschiedenen Anwendungen, einschließlich Immunoassay-Detektion spezifischer Analyten und biospezifische Affinitäts-Trennungen, verwendet werden. Immunoassays konnten unter Verwendung Antikörper-modifizierter Nanoröhren als festem Träger durchgeführt werden. Die Verwendung eines festen Trägers ermöglicht Wasch-Schritte, sofern der feste Träger entweder fixiert oder andernfalls von der Lösungsphase separiert ist (beispielsweise durch Filtrieren, Zentrifugieren oder Magnetismus). Die Verwendung von Wasch-Schritten würde die Verwendung von Antikörper-modifizierten Nanoröhren in vielen Arten von Elektrochemilumineszenz-basierten Immunoassays gestatten. Die Antikörper-modifizierten Nanoröhren könnten als Ersatz für die konventionell verwendeten magnetischen Perlen verwendet werden oder auch als ein suspendierbarer Träger, geeignet zur Anlagerung durch Filtrieren oder als ein permanent fixierter Träger auf einem disponiblen Filtereinsatz.
  • Fibrillen-Antikörper Kopplung zwischen primären Amin und Carboxyl-Gruppen Bildung von NHS-Ester Fibrillen
  • Eine Suspension von 148,4 mg Kohlenstofffibrillen (Hyperion Catalysis International, Cambridge, MA) in einer CH2Cl2/Dioxan-Mischung wurde mit 239 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 399 mg EDC gemischt und für 4 Stunden umgesetzt. Die Ausbeute an resultierenden NHS-Ester-modifizierten Fibrillen (NHS-Fibrillen) betrug 214,7 mg.
  • Bildung Antikörper-modifizierter Fibrillen
  • NHS-Ester Fibrillen (84,5 mg) wurden mit 1,0 ml Kopplungs-Puffer (0,2 M NaHCO3, pH 8,1) vorbehandelt, dann in einem weiteren 1,0 ml Kopplungs-Puffer suspendiert (0,1 M Natriumphosphat 0,5 M NaCl, pH 7,5). Moniclonale Antiköper (Anti-Glucose Oxidase) (1,5 mg in 2,0 ml eines Kopplungs-Puffers) wurden zu den Fibrillen gegeben und die Suspension wurde für eine Stunde rotiert, um den NHS-Fibrillen die Umsetzung mit den Antikörpern zu ermöglichen (hauptsächlich mit Lysin-Seitenketten des Antikörpers). Die entstandenen Fibrillen wurden abfiltriert und wiederholt mit Kopplungs-Puffer gewaschen.
  • Bindung von Glucose-Oxidase an Antikörper-modifizierte Fibrillen
  • Nicht-Antikörper beschichtete Stellen auf Antikörper-modifizierten Fibrillen wurden durch Rotation für 10 Minuten mit 1% BSA, gelöst in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 6,0, blockiert. Glucose Oxidase wurde in der BSA-Lösung gelöst und diese Lösung wurde mit den Fibrillen über 1,5 Stunden gemischt. Schließlich wurden die Fibrillen mit pH-neutralem Phosphat-Puffer gewaschen, bis unter spektrophotometrischer Kontrolle des Waschwassers bei 280 nm kein eluierbares Protein mehr beobachtet wurde.
  • Detektion des Antikörpers auf Antikörper-modifizierten Fibrillen
  • Funktionale Antikörper-Moleküle auf den Fibrillen wurden durch die katalytische Aktivität gebundenen Antigens und Glucose Oxidase quanitfiziert. Die Glucose Oxidase Aktivität wurde spektrophotometrisch durch Zugabe einer Probe des Enzyms (entweder freies Enzym oder spezifisch an Antikörper-modifizierte Fibrillen gebundenes Enzym) in eine Küvette enthaltend 0,1 M Natriumphosphat (pH 6,0), 20 μM Glucose, 183 nM Meerrettich-Peroxidase und 30 μM 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin)-6-Sulfonsäure (ABTS) bestimmt. Die Aktivität der Glucose Oxidase wurde durch spektrophotometrische Bestimmung der Geschwindigkeit der Absorptionszunahme bei 414 nm bei 25°C (Bildung einer grünen Farbe) gemessen. Die Quantifizierung des gebunden Enzyms zeigte an, dass 1,52 μmol des funktionellen Antikörpers pro Gramm Fibrillen vorhanden waren.
  • Fibrillen-Antikörper-Kopplung zwischen primären Amin- und Kohlenhydratgruppen Bildung der Amino-Fibrillen
  • Eine Suspension von NHS-Fibrillen (214,7 mg) in frisch hergestellter 0,2 M NaHCO3, pH 8,1, wurde mit 1,2-Diaminoethan (100 μL) bei Raumtemperatur gemischt. Die Suspension wurde für ungefähr 5 Stunden gerührt. Die Mischung wurde dann in einen Büchner-Trichter abgesaugt und mit Wasser (3 × 10 mL) und Methanol (3 × 10 mL) gewaschen und im Vakuum über Nacht getrocknet. Die Ausbeute an Amino-Fibrillen betrug 144 mg. Ein Ninhydrin-Test zeigte, dass Diaminoethan (nicht-konjugiert) immer noch an die Fibrillen adsorbiert war. Die Fibrillen wurden in Wasser resuspendiert und für 90 Minuten ultraschallbehandelt. Ein Ninhydrin-Test zeigte an, dass die Fibrillen ausreichend frei von nicht-kovalent gebundenem Amin waren.
  • Bildung Antikörper-modifizierter Fibrillen
  • Eine NAP-5 Säule wurde mit 100 mM Acetat, pH 5,5, equilibriert und monoclonaler Antikörper (Anti-Glucose Oxidase, 1,5 mg in 300 μL Puffer) wurde hinzugegeben und mit Puffer eluiert (1 mL). Diese Lösung wurde mit 50 μL einer 20 mM NaIO4 (Endkonzentration NaIO4 1 mM) bei Raumtemperatur für zwei Stunden umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe zu einem vorequilibrierten NAP-10 (0,15 M KH2PO4, pH 6,0) beendet und mit dem gleichen Puffer eluiert. Das Eluent wurde in 10-ml-Röhrchen enthaltend Amino-Fibrillen und die Suspension gesammelt und für 2-3 Stunden reagieren gelassen.
  • Die Fibrillen wurden dann mit Reaktions-Puffer gewaschen und in 5 ml KH2PO4, pH 5,5 gelagert.
  • Detektion von Antikörpern auf Antikörper-modifizierten Fibrillen
  • Funktionale Antikörper-Moleküle auf den Fibrillen wurden durch die katalytische Aktivität gebundenen Antigens und Glucose Oxidase wie oben beschrieben quantifiziert. Die Quantifizierung des gebundenen Enzyms zeigte an, dass 3,6 μmol funktionale Antikörper pro Gramm Fibrillen vorhanden waren.
  • Fibrillen-Antikörper Kopplung zwischen Maleimid- und Sulfhydryl-Gruppen
    Figure 00690001
  • Reduktion monoclonaler Maus-Antikörper
  • Zu einer Antikörperlösung (24,7 mg, in 2,9 ml) wurden Dithiothreitol (DTT, 25 mg, 0,16 mmol) hinzugegeben und die Mischung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die reduzierten Antikörper wurden unter Verwendung einer PD-10 disponiblen Gel-Filtrationssäule (Pharmacia) gereinigt.
  • Kovalente Kopplung von Antikörper- und Maleimid-Fibrillen
  • Maleimid-Fibrillen (0,18 mg) und einfache Fibrillen (0,15 mg) wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur ultraschallbehandelt und für 30 Minuten bei 40°C inkubiert. Die Fibrillen wurden dann zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Fibrillen wurden dann mit reduziertem Antikörper (12,4 mg) in Natriumphosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,2, 1,1 ml) für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Quantifizierung von Antikörpern auf Antikörper-Fibrillen unter Verwendung von Meerrettich Peroxidase (HRP)-markierten Ziegen Anti-Maus Antikörpern
  • Maus Antikörper-Fibrillen wurden mit 0,1% PEG in Natriumphosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,5, 1 ml) für 30 Minuten bei 40°C vorinkubiert. Sie wurden dann zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Maus Antikörper-Fibrillen wurden mit HRP-markierten Ziege Anti-Maus Antikörper (0,01 mg) in Natriumphosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,5, 500 ml) enthaltend 0,1% PEG für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fibrillen wurden dann fünfmal mit 0,1% PEG in Natriumphosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,5, 1 ml) gewaschen. Die Menge an gebundenem HRP wurde durch spektrophotometrische Messung der katalytischen Aktivität des gebundenen Enzyms bestimmt. Die Enzym-Reaktion ist unten gezeigt:
    Figure 00700001
  • Die Ergebnisse zeigten, dass die Dichte des Maus-Antikörpers auf der Fibrille 1,84 mg Antikörper pro Gramm Fibrillen betrug und die Dichte des Maus-Antikörpers auf einfachen (Kontrolle) Fibrillen 0,48 mg Antikörper pro Gramm Fibrillen (das Ausmaß nicht spezifischer Bindung betrug etwa 26%) betrug.
  • Beispiel 8
  • Darstellung bifunktionaler Fibrillen durch Addition von Lysin
  • Synthese von Nα-CBZ-L-Lysine-Benzyl-Ester:
  • Die Reaktionssequenz wird in 5 gezeigt. Nε-(tert-Butoxycarbonyl)-L-Lysin (2g, 8,12 mmol) wurde in Methanol (40 ml) und Wasser (40 ml) gelöst und der pH mittels Triethylamin auf 8 eingestellt. Eine Lösung von N-(benzyloxycarbonyl-oxy)Succinimid in Dioxan (2,4 g, 9,7 mmol in 20 ml) wurden zu obiger Mischung hinzugegeben und der pH mit Triethylamin bei 8-9 gehalten. Die Reaktions-Mischung wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt, um rohes Nα-CBZ-Nε-(tert-Butoxycarbonyl)-L-Lysin zu erhalten. Nα-CBZ-Nε-(tert-Butoxycarbonyl)-L-Lysin wurde mit 0,2 M Calciumcarbonat (4 ml) behandelt und die wässrige Schicht wurde entfernt, um einen weißen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff wurde in N N-Dimethylformamid (40 ml) und Benzylbromid (1,16 ml) resuspendiert. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat und Wasser aufgearbeitet und die organische Schicht über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt, um rohes Nα-CBZ-Nε-(Tert-Butoxycarbonyl)-L-Lysin-Benzylester zu erhalten, welcher mittels Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von 25% Hexan in Ethylacetat als Lösungsmittel gereinigt wurde. Zu Nα-CBZ-Nε-(tert-Butoxycarbonyl)-L-Lysin-Benzylester (1 g, 2,2 mmol) in Methylenchlorid (10 ml) wurde Trifluoressigsäure bei 0°C gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 0°C gerührt, dann für weitere 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das Rohprodukt erhalten. Reiner Nα-CBZ-L-Lysine-Benzyl-Ester wurde durch Silicagel-Chromatographie erhalten.
  • Synthese von Nα-CBZ-L-Lysine-Benzyl-Ester-Fibrillen:
  • Zu einer Suspension von Carboxyl-Fibrillen (300 mg) in Methylenchlorid (18 ml) wurde eine Lösung von Nα-CBZ-L-Lysin-Benzylester (148 mg, 0,32 mmol in 20 ml Methylenchlorid und 176 μl Triethylamin) hinzugegeben. HOBT (43,3 mg, 0,32 mmol) und EDC (61,3 mg, 0,32 mmol) wurden danach hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um das Rohprodukt zu erhalten. Die Produkt-Fibrillen wurden umfassend mit Methanol, Methylenchlorid und Wasser gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.
  • Synthese bifunktionaler Fibrillen Fib-Lys (COOH)NH2:
  • Zu Nα-CBZ-L-Lysine-Benzylester-Fibrillen (113 mg) in Methanol (4 ml) wurde Natriumhydroxid (1 N, 4 ml) hinzugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Die Produkt Nα-CBZ-L-Lysine-Fibrillen wurden umfassend mit Wasser und Methanol gewaschen und die Fibrillen im Vakuum getrocknet. Zu einer Suspension von Nα-CBZ-L-Lysin-Fibrillen (50 mg) in Acetonitril (4 ml) wurde Trimethyl-Silyliodid (1 ml) hinzugegeben. Die Mischung wurde für 3 Stunden bei 40°C gerührt. Die endgültigen bifunktionalen Fibrillen wurden umfassend mit Wasser, Methanol, 0,5 N Natriumhydroxid, Acetonitril und Methylenchlorid gewaschen. Die Aminosäure-Anlayse zeigte 0,3 μmol Lysin pro Gramm Fibrillen. Hydroxyl- und Carboxyl (oder Amino) bifunktionale Fibrillen können durch eine ähnliche Methode wie der hier beschriebenen unter Verwendung von Serin, Threonin oder Tyrosin hergestellt werden. Thiolierte und Carboxyl- (oder Amino) bifunktionale Fibrillen können unter Verwendung von Cystein hergestellt werden. Carboxyl- und Amino- bifunktionale Fibrillen können unter Verwendung von Aspartam- oder Glutarsäure hergestellt werden.
  • Beispiel 9
  • Kohlenstoff-Nanoröhren als ECL-basierte Biosensoren
  • Zu einer Suspension bifunktionaler Fibrillen (113 mg) in Methylenchlorid (8 ml) wurden 4-Dimethylaminopyridin (DMAP, 19,5 mg, 0,16 mmol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 33 mg, 0,16 mmol) (6) hinzugegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten gerührt, danach wurde 4-Methyl-4'-(8-hydroxyoctyl)2,2'-Bipyridin (47 mg, 0,16 mmol) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandenen Produktfibrillen wurden umfassend nacheinander mit DMF, 50% Dioxan in Wasser, Methanol und Wasser gewaschen. Die Fibrillen wurden in einer Mischung aus Ethanol (4 ml) und Wasser (4 ml) suspendiert und cis-Dichlorbis(2,2'-bipyridin)Ruthenium(II)Dihydrat (45,2 mg, 0,087 mmol) wurden hinzugegeben. Die Mischung wurde 5,5 Stunden bei 110°C refluxiert. Die Ruthenium Komplex-modifizierten Fibrillen wurden umfassend mit Wasser, Standard-ECL-Assay-Puffer (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD), Toluol, 50% Dioxan in Wasser gewaschen und dann nacheinander in Acetonitril, Ethylenglycol und Methanol refluxiert. Die Ruthenium Komplex-modifizierten Fibrillen wurde mit TMSI (4 ml) in Acetonitril (4 ml) für 4 Stunden bei 40°C umgesetzt, um die CBZ-Gruppe zu entschützen und dann mit Methanol, Wasser und Natriumhydroxid (1 N) gewaschen. Das Endprodukt wurde im Vakuum getrocknet. Die Fibrillen wurden dann in Methylenchlorid (5 ml) suspendiert und Triethylamin (5 Tropfen) wurden hinzugegeben. Zu der Suspension wurde Succinsäureanhydrid (40 mg) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und das Produkt mit Methylenchlorid, Methanol und Wasser gewaschen, danach im Vakuum getrocknet. Die Carbonsäure/Ruthenium Komplex-modifizierten Fibrillen wurden in Dioxan (5 ml) resuspendiert, dann wurden N-Hydroxysuccinimid (100 mg) und EDC (167 mg) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandenen NHS-Ester/Ruthenium Komplex-modifizierten Fibrillen wurden mit Dioxan und Methanol gewaschen. Die NHS-Ester/Ruthenium Komplex-modifizierten Fibrillen wurden in Dioxan (2 ml) resuspendiert und eine Lösung von NAD-Analogon in Natriumbicarbonat (75 ml in 2 ml einer 0,2 M pH 8,6 NaHCO3) wurde hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Fibrillen wurden dann umfassend mit Wasser, Natriumbicarbonat (0,2 m) und Methanol gewaschen, dann im Vakuum getrocknet, um die Biosensor-Fibrillen zu erhalten.
  • Beispiel 10
  • Verwendung von Kohlenstoff-Nanoröhren als ECL-basierte Biosensoren
  • Ein ECL-basierter Biosensor wurde durch chemische Modifizierung von Fibrillen hergestellt. Die modifizierten Fibrillen wurden unter Verwendung von NH2/COOH-bifunktionalen Fibrillen (Beispiel 8) hergestellt. Zu einer funktionellen Gruppe (NH2) wurde ein NAD+-Analogon hinzugeben und zu der anderen funktionellen Gruppe (COOH) wurde ein Derivat von Ru(bpy)3 2+ hinzugegeben. Die Struktur der Biosensor-Fibrillen ist in 7 gezeigt. Der Biosensor wurde ausgelegt, um die Detektion von Dehydrogenase-Enzymen zu erleichtern, welche NAD(P)+/NAD(P)H als Cofaktor aufnehmen sowie Substrate von Dehydrogenase-Enzymen, welche NAD(P)+/NAD(P)H als Cofaktor aufnehmen. Es ist bekannt (E. Jameison et al., Analytical Chemistry, im Druck), dass NAD(P)+ und NAD(P)H grundlegend unterschiedliche Befähigungen aufweisen, um die Ru(bpy)3 2+-ECL zu befördern. Daher kann die Aktivität einer Dehydrogenase durch ihre Befähigung detektiert werden, NAD(P)+/NAD(P)H zu reduzieren/oxidieren, welches durch die Unterschiede in den Befähigungen von NAD(P)+ und NAD(P)H, bei Ru(bpy)3 2+ Elektrochemilumineszenz auszulösen (8), beobachtbar ist. In ähnlicher Weise, da die Einwirkung der Dehydrogenasen auf ihre Substrate stöchiometrisch durch die Umwandlung von NAD(P)+ zu NAD(P)H oder NAD(P)H zu NAD(P)+ begleitet ist, kann die Gegenwart ihrer Substrate ebenfalls durch Elektrochemilumineszenz detektiert werden.
  • Um den Fibrillen-gestützten ECL-basierten Biosensor zu verwenden, wird der Biosensor mit einer wässrigen Lösung enthaltend eine Dehydrogenase und eine unbekannte Menge des Dehydrogenase-Substrates (das Substrat ist der Analyt) oder einer wässrigen Lösung enthaltend ein Dehydrogenase-Substrat und eine unbekannte Menge an Dehydrogenase (die Dehydrogenase ist der Analyt) gemischt. Nach einer angemessenen Inkubationszeit, um die Enzym-Reaktion voranschreiten zu lassen und das auf den Fibrillen immobilisierte NAD(P)+ oder NAD(P)H zu reduzieren oder oxidieren, werden die Fibrillen in ein ECL-Messgerät eingezogen und die ECL der Fibrillen gemessen. Die ECL-Messung wird in einem Puffer durchgeführt, der keine nennenswerte Konzentrationen an Tripropylamin enthält (weil NAD(P)+/NAD(P)H in dieser Erfindung Tripropylamin-Ersatz sind).
  • Die attraktiven Merkmale dieses ECL-basierten Biosensors sind: Die große Nähe von NAD(P)+/NAD(P)H und Ru(bpy)3 2+ auf der gleichen bifunktionellen Gruppe auf den Fibrillen, welche die Effizienz des Elektronentransfers im elektrochemischen ECL-Mechanismus verstärken (intramolekularer Elektronentransfer ist effizienter als intermolekularer Elektronentransfer); die ECL-aktiven Reagentien NAD(P)+/NAD(P)H und Ru(bpy)3 2+ werden beide auf Fibrillen getragen, welche auf der ECL-Messgerät-Elektrode magnetisch festgehalten werden können, welches die Lichtemission erhöhen wird; Fibrillen weisen eine extrem große Oberfläche auf, welche die Immobilisierung einer hohen Dichte (pro Gewichteinheit) von NAD(P)+/NAD(P)H und Ru(bpy)32+ ermöglicht und welche mehr Licht zu emittieren gestattet; der Biosensor ist vielseitig, indem er viele verschiedene Analyten detektieren kann (jede Dehydrogenase, welche NAD(P)+/NAD(P)H als einen Cofaktor aufnimmt sowie die Substrate dieser Enzyme).
  • Beispiel 11
  • Detektion von Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase (G6PDH) unter Verwendung eines Fibrillen-getragenen ECL-basierten Biosensors
  • Sowohl mit NAD+-Analogon und Ru(bpy)3 2+-Analogon modifizierte Fibrillen werden kovalent an ein bifunktionales Adduct (ECL-Biosensor Fibrillen) angelagert und zur Detektion des Enzyms Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase verwendet. ECL-Biosensor Fibrillen (860 μg/mL) werden mit einer pH-neutral gepufferten Lösung enthaltend ungefähr 50 μM Glucose-6-Phosphat gemischt. In eine Röhre wurde G6PDH bis zu einer Konzentration von 3,6 μM gegeben. In eine zweite Kontrollröhre wurde deionisiertes Wasser gegeben. Unverzüglich wurde die ECL der Fibrillen gemessen. 9 zeigt, dass zur Zeit Null die ECL der Fibrillen mit (DH+) und ohne (DH–) G6PDH auf einem ähnlichen Niveau sind. Die vom Assay-Puffer herrührende Hintergrund-ECL (keine Fibrillen) ist ebenfalls dargestellt (A.B.). Nach 42 Stunden Inkubation (Rotieren bei Raumtemperatur) wurden weitere Fibrillen abgezogen und die ECL abermals gemessen. Wie in 9 gezeigt, ist die ECL des Assay-Puffers (A.B.) und der Fibrillen in Abwesenheit von G6PDH (DH–) ähnlich der zur Zeit Null beobachteten ECL. Jedoch war die ECL der G6PDH (DH+) enthaltenden Probe wesentlich geringer als zur Zeit Null. Die Ergebnisse zeigen an, dass G6PDH-Aktivität unter Verwendung von Fibrillen-gestützten ECL-Biosensoren detektiert werden konnte. Getrennte Arbeiten mit dem hier verwendeten bestimmten NAD+-Analogon (nicht-immobilisert) und Ru(bpy)3 2+ (nicht-immobilisiert) in Abwesenheit der Fibrillen bestätigten, dass die reduzierte (NADH)-Version des NAD+-Analogons weniger effizient ist, als die oxidierte (NAD+) Version im Auslösen von Elektrochemilumineszenz im Ru(bpy)3 2+
  • Beispiel 12
  • Verwendung von Kohlenstoffnanoröhren als ein Träger für einen ECL-basierten Enzym-Biosensor
  • Ein Enzym-Biosensor enthaltend ein Dehydrogenase-Enzym wurde hergestellt, an den sowohl ein Analogon eines Nicotinamid-Adenin Dinucleotids (NAD+) Enzymcofaktor und ein Analogon von Ruthenium(II)-Trisbipyridin (Ru(bpy)3 2+) konjugiert worden ist. Das NAD+-Analogon ist so angebunden, dass es an die Cofactor-Bindungsstelle des Enzyms binden kann und, wenn gebunden, sich natürlich verhält (d. h. es kann durch das Enzym in einem normalen chemischen Mechanismus in Gegenwart des natürliches Substrates des Enzyms reduziert werden).
  • Darüber hinaus ist das Ru(bpy)3 2+-Analogon so angebunden, dass es mit dem NAD+ in physikalischen Kontakt treten kann (10). In einem ECL-Messgerät wie beispielsweise ein IGEN Origen® Analyzer (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD), befördern NAD+ und seine reduzierte Form NADH, die Ru(bpy)3 2+-Elektrochemilumineszenz in verschiedenem Ausmaß. Basierend auf dem Licht-Output kann daher bestimmt werden, ob NAD+, NADH oder eine Mischung der beiden in einer Lösung vorhanden ist (vgl. F. Jameison et al., Analytical Chemistry, im Druck). Damit nutzt der Biosensor die Unterschiede zwischen den Wirkungsgraden der ECL-Reaktionen des Ru(bpy)3 2+, um das Ausmaß der Reduktion von NAD+ und damit die Gegenwart des Enzym-Substrates zu detektieren. Als ein Beispiel katalisiert Alkohol Dehydrogenase die unten gezeigte Reaktion; Ethanol (reduziert) + NAD+ (oxidiert) → Acetaldehyd (oxidiert) + NADH (reduziert).
  • Ein Alkohol Dehydrogenase-basierter ECL-Biosensor kann Ethanol in Acetaldehyd umwandeln, begleitend die Umwandlung von NAD+ in NADH. Weil die ECL-Eigenschaften des auf dem Biosensor immobiliserten Ru(bpy)3 2+ davon abhängen, ob NAD+ oder NADH immobilisiert ist, kann die ECL des Enzym-Biosensors die Gegenwart von Ethanol anzeigen. Ein attraktives Merkmal des Biosensor ist, weil während der ECL-Reaktion die NADH-Form des Cofaktors in die NAD+-Form reoxidiert wird, dass ein Biosensor-Molekül wiederholt verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Molekülen des Analyten zu detektieren. Da der Biosensor auf einem löslichen Enzym (eine Dehydrogenase) basiert und der Analyt (beispielsweise Ethanol) ebenfalls löslich ist, wäre es von Vorteil, den Biosensor zu immobilisieren, so dass er wiederholt zur Analyse verschiedener Analyt-enthaltender Proben verwendet werden könnte, ohne mit einer verbrauchten Analyt-enthaltenden Lösung ausgewaschen zu werden. Eine solche Immobilisierung wurde mit einem Alkohol Dehydrogenase (ADH) basierten ECL-Biosensor durchgeführt (schematisch dargestellt in 10). 11 zeigt die Immobilisierung des ADH-basierten Biosensors auf Dynal M450 Perlen (Lake Success, NY) (links) und die Immobilisierung auf Alkyl-Fibrillen (rechts). Keines der Diagramme ist maßstabsgerecht gezeichnet, so dass die Biosensor-Moleküle tatsächlich viel kleiner in Bezug auf die Größe der festen Träger sind. Die Alkyl-Fibrillen wurden durch Umsetzung oxidierter Fibrillen (tragend COOH-Gruppen) mit 1-Aminoctan hergestellt. In beiden Fällen (Perlen und Fibrillen) wurde der Enzym-Biosensor durch nicht-kovalente Adsorption in gepufferter wässriger Lösung immobilisiert.
  • Ethanol wurde unter Verwendung von sowohl Perlen- als auch Fibrillen-immobilsierten ECL ADH-basierten Biosensoren detektiert. Die Menge an Enzym- Biosensor adsorbiert an Perlen oder Fibrillen wurde durch Messung der Menge an verbleibendem (nicht-adsorbierten) Protein in Lösung durch das UV-Adsorptionsvermögen bei 280 nm bestimmt (das Adsorptionsvermögen bei 280 nm zeigt die Menge an Protein in Lösung an). Die Ergebnisse zeigten, dass 0,308 mg des ADH-Biosensors pro Milligramm Fibrillen gebunden waren, während 0,015 mg des ADH-Biosensors pro Milligramm an Perlen gebunden waren. Damit übersteigt, je Gewichtseinheit an festem Träger, die Adsorptionskapazität der Fibrillen die der Dynal-Perlen um das 20,5-fache.
  • Die ECL-Messung von Ethanol wurde durch Mischen der ADH-Biosensor adsorbierten Perlen (0,50-1,25 mg) oder Fibrillen (0,04-0,10 mg) mit einer Lösung enthaltend 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,2), 12 mM Semicarbizid durchgeführt. Einige Proben enthielten auch 0,5 mM des Analyten, Ethanol. Die mit dem Biosensor beschichteten festen Träger wurden in ein IGEN Origen®-ECL Analyzer (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) gebracht und die ECL wurde gemessen. Ergebnisse eines solchen Experimentes sind in 12 gezeigt. Sowohl mit Perlen als auch mit Fibrillen nahm das ECL-Signal des Enzym-Biosensors in Gegenwart von Ethanol ab. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit Ergebnissen erhalten aus Lösungsstudien (unter Verwendung nicht-immobilisierter NAD+/NADH und nicht immobilisierter Ru(bpy)3 2+) zum Effekt des Oxidations/Reduktions-Zustandes dieses NAD+-Analogons auf die Ru(bpy)3 2+-Elektrochemilumineszenz. Diese Ergebnisse zeigten, dass Fibrillen als Träger für Enzyme in ECL und insbesondere als ein Träger für Enzym-basierte ECL-Biosensoren verwendet werden können. Es ist auch anzumerken, dass die mit Fibrillen beobachteten Ergebnisse ähnlich den mit Dynal-Perlen beobachteten waren, obwohl zwanzigmal weniger Fibrillen verwendet wurden.
  • Beispiel 13
  • Biotinylierte Fibrillen und bifunktionale biotinylierte Alkyl-Fibrillen
  • Es wurde gefunden, dass Fibrillen-Oberflächen biotinyliert oder sowohl alkyliert als auch biotinyliert werden können. Die derartige Modifikationen enthaltenden Fibrillen können dann jede Streptavidin-konjugierte Substanz wie beispielsweise Streptavidin-Perlen und Streptavidin-Enzyme binden.
  • Fibrillen bieten als feste Träger große Vorteile wegen ihrer großen Oberfläche. Perlen, welche stark magnetisiert werden können, erweisen sich in Trennungs-Essays als sehr hilfreich. Die hier beschriebenen biotinylierten Fibrillen kombinieren die Vorteile sowohl der Fibrillen als auch der Perlen. Die biotinylierten Alkyl-Fibrillen sind eine Erweiterung des gleichen Konzeptes, aber weisen die zusätzliche Protein-Adorptionseigenschaft von Alkyl-Fibrillen auf.
  • Die Streptavidin- und Biotin-beschichteten Fibrillen können in der Diagnostik verwendet werden und können als Einfang-Mittel für Elektrochemilumineszenz-Assays genutzt werden.
  • Ein neues Merkmal dieser Erfindung ist die Kombination aus zwei festen Trägern auf einer Fibrille, um eine bifunktionale Fibrille zu erzeugen. Darüber hinaus vergrößert das offenbarte Verfahren die Oberfläche für Perlen und erhöht die Fibrillen-Magnetisierung.
  • Darstellung biotinylierter Fibrillen
  • Biotinylierte Fibrillen wurden durch Mischen von 2,4 mg Amino-Fibrillen, welche im Wesentlichen wie in Darstellung 0 beschrieben hergestellt wurden, und 9 mg NHS-Ester langkettiges Biotin in Puffer 0,2 NaHCO3 bei einem pH von 8,15 hergestellt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für vier Stunden rotiert und mit dem gleichen Puffer zweimal gewaschen.
  • Darstellung biotinylierter Alkyl-Fibrillen
  • Biotinylierte Alkyl-Fibrillen wurden durch eine 2-stufige Reaktion hergestellt. Zuerst wurden 4,25 mg der bifunktionalen Fibrillen (enthaltend sowohl Amin als auch Carboxyl) und 25 mg des NHS-Ester langkettigen Biotin-Gemisches. Die Fibrillen wurden gewaschen und im Vakuum getrocknet.
  • Die zweite Reaktion wurde durch Mischen von 4 mg der biotinylierten bifunktionalen Fibrillen mit 11 mg EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)Carbodiimid), 7,5 mg DMAP (4-Dimethylaminopyridin) und 10 μl NH2(CH2)7CH3 in 0,5 ml DMF durchgeführt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die endgültigen biotinylierten Alkyl-Fibrillen wurden mit CH2Cl2, MeOH und dH2O gewaschen.
  • Beispiel 14
  • Biotinylierte Fibrillen als fester Träger in ECL-Assays
  • Biotinylierte Fibrillen können in ECL-Assays umfassend Formate, welche Streptavidin-Biotin oder Avidin-Biotin Wechselwirkungen erfordern, verwendet werden. Biotinylierte Fibrillen können beispielsweise mit Streptavidin weiter derivatisiert werden. Kovalent an die Fibrillen gebundenes Biotin (siehe Beispiel 13) könnte starke nicht-kovalente Bindungswechselwirkungen mit Streptavidin eingehen. Weil Streptavidin ein tetrameres Protein mit vier äquivalenten Bindungsstellen ist, würde an biotinylierte Fibrillen gebundenes Streptavidin nahezu sicher unbesetzte Bindungsstellen aufweisen, an welche zusätzliche biotinylierte Reagenzien binden könnten. Damit würden biotinylierte Fibrillen in Streptavidin-beschichtete Fibrillen umgewandelt.
  • Es gibt eine Reihe analytischer Tests, welche mit derartigen Fibrille-Biotin-Streptavidin (FBS)-Trägern durchgeführt werden könnten. Beispielsweise könnte ein biotinylierter Anti-Analyt-Antikörper auf dem FBS-Träger (entweder bevor oder nachdem der Antikörper an den Analyten komplexiert wurde) eingefangen werden.
  • Assays, welche biotinylierte Anti-Analyt Antikörper verwenden, sind wohlbekannt. Derartige Assays umfassen Konkurrenz-Assays, wo der interessierende Analyt mit einem eingeführten Ru(bpy)3 2+-markierten Analyten um die Bindung an den Anti-Analyt Antikörper konkurriert. Freier (ungebundener) Analyt und freier (ungebundener) Ru(bpy)3 2+-markierter Analyt können von dem Fibrillen-immobilisiertem Antikörper gewaschen werden. Der Wasch-Schritt beruht darauf, dass die Fibrillen physikalisch von der Lösungsphase durch übliche Methoden umfassend Zentrifugieren, Filtrieren oder durch Anziehung an einen Magneten getrennt werden.
  • Neben einem Konkurrenz-Essay könnte auf den FBS-Trägern eine Art Sandwich-Immunoassay durchgeführt werden. Sandwich-Immunoassays sind auf dem Gebiet der Diagnostik im allgemeinen und in der ECL-Detektion im besonderen wohlbekannt. Derartige Assays umfassen einen gleichzeitig durch zwei Antikörper gebundenen Analyten; einen ersten „primären" Antikörper, der durch Markierung mit Biotin auf einer festen Oberfläche eingefangen wurde, sowie einem „sekundären" Antikörper, welcher nicht auf einer festen Oberfläche eingefangen ist, aber mit einer Reporter-Gruppe, wie beispielsweise Ru(bpy)3 2+ in ECL-Anwendungen, markiert ist. Ein solches Sandwich-Assay könnte unter Verwendung von Fibrillen als feste Einfang-Träger ausgeführt werden, wobei die Fibrillen, wie im vorigen Absatz beschrieben, eingefangen werden. Damit würde in einem solchen Assay die Fibrille kovalent mit Biotin verbunden sein, welches mit Streptavidin verbunden wäre, welches wiederum an einen biotinylierten primären Antikörper gebunden wäre, welcher an den Analyten (wenn vorhanden) gebunden wäre, welcher an einen Ru(bpy)3 2+-markierten sekundären Antikörper gebunden wäre.
  • In ähnlicher Weise könnten DNA-Test-Assays unter Verwendung von FBS-Trägern durchgeführt werden. Biotinylierte einsträngige DNA könnte an FBS-Träger gebunden sein und Konkurrenzhybridisierung kann zwischen komplementärem, einsträngigem, Analyten-DNA Molekül und komplementären Ru(bpy)3 2+-markierten Oligonukleotiden erfolgen.
  • Ein weiterer Typus biotinylierter Fibrillen, biotinylierte alkylierte Fibrillen, kann in Immunoassays und DNA-Test-Assays verwendet werden. Wie in Beispiel 13 beschrieben, können bifunktionale Fibrillen durch kovalente Anlagerung von Biotin an einen Typ funktioneller Gruppe und Alkylketten an den anderen Typ funktioneller Gruppen modifiziert werden. Die entstandenen alkylierten, biotinylierten Fibrillen können sowohl in spezifischer Assoziation mit Streptavidin oder Avidin (über Biotin) als auch zur Adsorption von Proteinen (über die Alkyl-Ketten) verwendet werden.
  • Alkyl-Fibrillen können in Verbindung mit anderen festen Trägern wie beispielsweise Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen einschließlich Dynal-magnetischen Perlen verwendet werden. Ein Vorteil der Fibrillen gegenüber derartigen Perlen besteht darin, dass sie eine viel größere Oberfläche aufweisen (je Gewichtseinheit). Wenn die Fibrillen an der äußeren Oberfläche der magnetischen Perlen angelagert werden könnten, würde dies die Oberfläche drastisch verbessern und damit die Bindungs-Kapazität der Perlen. Es ist vorgesehen, dass alkylierte, biotinylierte Fibrillen mit Streptavidin-beschichteten Perlen gemischt werden könnten, resultierend in starker Affinität von Streptavidin (Perle)-Biotin (Fibrille) Wechselwirkungen und damit Fibrillen-beschichteten Perlen mit einer extrem großen Oberfläche. Weil Alkyl-Fibrillen Proteine durch Adsorption binden können, könnten die Fibrillen-beschichteten Perlen mit adsorbierten Proteinen einschließlich Streptavidin und Antikörpern weiter derivatisiert werden. Wie oben beschrieben, können Streptavidin- oder Antikörper-beschichtete Fibrillen in Immunoassyas und DNA-Test-Assays verwendet werden. Damit könnten Fibrillen-beschichtete Perlen die Eigenschaften der Perlen durch drastische Zunahme der Oberfläche derart verbessern, dass weniger Perlen in einem gegebenen Assay benötigt würden, um das gleiche Ergebnis zu liefern.
  • Beispiel 15
  • Magnetisch-suszeptible Kohlenstoff-Nanoröhren
  • Fibrillen können magnetische Eigenschaften aufweisen. Der Grad, bis zu welchem Fibrillen magnetisiert oder nicht-magnetisiert werden können, wird durch die Menge an Katalysator, welcher in der Fibrille als Produkt aus dem Fibrillen-Herstellungsverfahren vorhanden ist, bestimmt. Derartige Verfahren werden in den US-Patenten US 4,663,230 , US 5,165,909 und US 5,171,560 offenbart.
  • Die magnetische Eigenschaft der Fibrillen wurde nach der Funktionalisierung der Fibrillen, d.h. Alkyl-Fibrillen, Protein-gebundene Fibrillen usw., beobachtet. Nach bestimmten Reaktionen (z.B. Alkylierung) wanderten die Fibrillen in besonderem Maße schneller zu einem Magneten als vor der Reaktion. Eine Hypothese für dieses Phänomen besteht darin, dass eine Art Aggregation während des Reaktionsprozesses erfolgen kann. Jedoch ist der richtige Mechanismus gegenwärtig unbestimmt.
  • Beispiel 16
  • Reduktion nicht-spezifischer Bindung von Ru(bpy)3 mit PEG-modifizierten Fibrillen
  • Vorratsdispersionen an Chlorat-oxidierten Fibrillen, mit PEG unter Verwendung von Benzoyl-Peroxid modifizierte Fibrillen sowie mit PEG durch NHS-Esterkopplung modifizierte Fibrillen wurden 1,0 mg/ml in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0 unter Ultraschall-Behandlung hergestellt. 2 ml von jeweils 10-facher Verdünnung wurden in jeweils einer von fünf Polypropylen-Röhren gebracht. 50 μl einer Vorratslösung an Ru(bpy)3 (ungefähr 10 μl) im gleichen Puffer wurden zu jedem Röhrchen hinzugegeben sowie zu drei Puffer-Blindproben. Drei Puffer-Röhrchen ohne Ru(bpy)3 wurden ebenfalls präpariert. Alle Röhrchen wurden auf einem Vortex-Mischer gemischt und über Nacht inkubiert. Alle Röhrchen wurden zur Abtrennung der Fibrillen zentrifugiert und 0,1 ml Aliquote des Überstandes wurden in neue Röhrchen transferiert und mit 1,0 ml von Origen®Assay Puffer (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) verdünnt und auf Ru(bpy)3 durch ECL unter Verwendung eines Magnalyzers® (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) analysiert. Der im Überstand verbliebene Anteil an Ru(bpy)3 galt als indirektes Maß für die Menge, welche nicht-spezifisch an die Fibrillen gebunden war ( 13). Für beide der PEG-modifizierten Fibrillen-Materialien verblieb im Wesentlichen das gesamte Ru(bpy)3 im Überstand bei Fibrillen-Anteilen bis zu 0,1 mg/ml. Es gab eine 20%-30% Abnahme an Ru(bpy)3 im Überstand bei 1,0 mg/ml an diesen Fibrillen. Im Gegensatz dazu verblieb nahezu kein Ru(bpy)3 für die Chlorat-oxidierten Fibrillen im Überstand bei 1,0 mg/ml und 20%-30% Abnahme an Ru(bpy)3 im Überstand bei 0,1 mg/ml dieser Fibrillen ohne die PEG-Modifizierung.
  • Referenzen
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Claims (63)

  1. Eine Graphit-Nanoröhre, an welche eine Komponente, die eine zur Lumineszenz induzierbare Markierungsverbindung umfasst, angelagert ist.
  2. Nanoröhre nach Anspruch 1, wobei die Nanoröhre graphitisch ist und die Lumineszenz Elektrochemilumineszenz ist.
  3. Nanoröhre nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Komponente ein Enzym-Biosensor ist.
  4. Nanoröhre nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanoröhre Kohlenstoff umfasst.
  5. Nanoröhre nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierungsverbindung ein Elektrochemilumineszenz-Marker ist.
  6. Nanoröhre nach Anspruch 5, wobei der Elektrochemilumineszenz-Marker ein Seltenerdmetall oder ein Übergangsmetall umfasst.
  7. Nanoröhre nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Elektrochemilumineszenz-Marker ein Metallatom umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus Ruthenium, Osmium und Rhenium ausgewählt ist.
  8. Nanoröhre nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierungsverbindung umfasst: a) ein Metallatom, das aus der Gruppe bestehend aus Ruthenium, Osmium und Rhenium ausgewählt ist; und b) einen Stickstoff enthaltenden heterozyklischen, aromatischen, mehrzähnigen Metallliganden.
  9. Nanoröhre nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Komponente eine Substanz, die aus der Gruppe bestehend aus (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des Analyten; (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analagons; und (iii) einer reaktiven, zur Bindung mit (i) oder (ii) geeigneten Komponente ausgewählt ist, umfasst.
  10. Nanoröhre nach Anspruch 9, wobei die Substanz einen Antikörper, einen Proteinrezeptor, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G, Biotin oder Nukleinsäure umfasst.
  11. Nanoröhre nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanoröhre magnetisch responsiv ist.
  12. Eine Graphit-Nanoröhre, die mit einem Elektrochemilumineszenz-Marker und einem Enzym verbunden ist.
  13. Eine Graphit-Nanoröhre, die mit einem Enzym-Biosensor verbunden ist, wobei der Enzym-Biosensor eine zur Elektrochemilumineszenz induzierbare Markierungsverbindung beinhaltet.
  14. Eine Zusammensetzung zur Detektion eines interessierenden, in einer Probe vorliegenden Analyten, wobei die Zusammensetzung umfasst: (i) eine Graphit-Nanoröhre enthaltend eine funktionelle Gruppe; und (ii) eine mit der funktionellen Gruppe verbundene Substanz, wobei die Substanz zur Bindung an den Analyten geeignet ist oder mit dem Analyten um Bindung an einen Bindungspartner des Analyten konkurriert, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten von Interesse oder zugefügtes Analogon des Analyten; und (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analogons.
  15. Eine Zusammensetzung zur Detektion interessierenden, in einer Probe vorliegenden Analyten, wobei die Zusammensetzung umfasst: (i) eine Graphit-Nnanoröhre enthaltend eine funktionelle Gruppe; und (ii) eine mit der funktionellen Gruppe verbundene Substanz, wobei die Substanz an den interessierenden Analyten gebunden ist, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (i) hinzugefügtem, interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des Analyten; (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analogons; und (iii) einer zur Bindung mit (i) oder (ii) geeigneten reaktiven Komponente
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, die weiterhin umfassend eine Assay-Performance Substanz, die an den Analyten gebunden ist, umfasst, wobei die Assay-Performance Substanz eine lumineszierende Markierungsverbindung umfasst.
  17. Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Substanz zur Bindung an den Analyten geeignet ist.
  18. Eine Zusammensetzung von Stoffen zur Verwendung als ein Reagens in einem mikropartikulär basierten Binding-Assay, umfassend funktionalisierte Graphit-Nanoröhren, die an eine Substanz und mindestens eine weitere Komponente gebunden sind, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Elektrolyten; b) Markierungsverbindung, enthaltend einen ECL-Teil; c) interessierendem Analyten oder einem Analogon des interessierenden Analyten; d) einem Bindungspartner des interessierenden Analyten oder seinem Analogon; e) einer reaktiven Komponente, die zur Reaktion mit c) oder d) geeignet ist, f) einem Reduktant; und g) einem Elektrochemilumineszenz-Reaktionsverstärker; sofern jedoch keine zwei in jeglicher Verbindungszusammensetzung enthaltenen Komponenten miteinander während der Aufbewahrung reaktionsfähig sind, um so ihre Funktion in dem beabsichtigten Assay zu beeinträchtigen, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des Analyten; (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analogons; und (iii) einer reaktiven Komponente, die zur Bindung mit (i) oder (ii) geeignet ist.
  19. Reagens nach Anspruch 18, enthaltend magnetisch responsive Graphit-Nanoröhren.
  20. Zusammensetzung nach Anspruch 14, die des Weiteren eine Assay-Performance Substanz, umfassend eine Markierungsverbindung, umfasst.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 20, wobei die Markierungsverbindung ein Elektrochemilumineszenz-Marker ist.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei der Elektrochemilumineszenz-Marker ein Seltenerdmetall oder ein Übergangsmetall umfasst.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 21, wobei die Markierungsverbindung ein Metallatom, das aus der Gruppe bestehend aus Ruthenium, Osmium und Rhenium ausgewählt ist, umfasst.
  24. Die Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 21, wobei die Markierungsverbindung umfasst: a) ein Metallatom, welches aus der Gruppe bestehend aus Ruthenium, Osmium und Rhenium ausgewählt ist; und b) einen Stickstoff enthaltenden heterozyklischen, aromatischen, mehrzähnigen Metallliganden.
  25. Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Substanz einen Antikörper, einen Proteinrezeptor, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G, Biotin oder Nukleinsäure umfasst.
  26. Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 21, wobei die Assay-Performance Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) spezifischen Bindungspartnern des interessierenden Analyten; und (ii) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des interessierenden Analyten, welche mit dem interessierenden Analyten um die Bindung an einen Bindungspartner des interessierenden Analyten konkurrieren.
  27. Zusammensetzung nach Anspruch 14, 15, 25 oder 26, wobei die Substanz kovalent an die funktionelle Gruppe gebunden ist.
  28. Zusammensetzung nach Anspruch 14, 15, 25, 26 oder 27, wobei die Substanz an die Nanoröhre über eine Bindung, die eine Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung umfasst, gebunden ist.
  29. Ein Verfahren zur Ausführung eines Binding-Assays für einen in einer Probe vorliegenden, interessierenden Analyten, welches die folgenden Schritte umfasst: a) Bildung einer Zusammensetzung enthaltend (i) die Probe; (ii) eine erste Assay-Perfomance Substanz umfassend eine zur Luminenzenz induzierbare Markierungsverbindung, wobei die Assay-Performance Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder zum Konkurrieren mit dem Analyten geeignet ist; und (iii) eine Vielzahl von funktionalisierten Graphit-Nanoröhren, die an eine zweite Substanz gebunden sind, wobei die zweite Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder zum Konkurrieren mit dem Analyten geeignet ist; b) Inkubation der Zusammensetzung um einen Komplex zu bilden, welcher eine Graphit-Nanoröhre und die Markierungsverbindung beinhaltet, c) Sammeln des Komplexes in einer Messzone; d) Einführen der Markierungsverbindung in den Komplex zur Lumineszenz, und e) Messung der emittierten Lumineszenz zur Bestimmung des Vorhandenseins des interessierenden Analyten in der Probe, wobei die zweite Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des Analyten; (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analogons; und (iii) einer reaktiven Komponente, die zur Bindung mit (i) oder (ii) geeignet ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die erste Assay-Performance Substanz und/oder die zweite Substanz ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: (i) spezifischen Bindungspartnern des interessierenden Analyten, und (ii) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügten Analoga des interessierenden Analyten, welche mit dem interessierenden Analyten um die Bindung an einen Bindungspartner des interessierenden Analyten konkurrieren.
  31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei die Markierungsverbindung ein Elektrochemilumineszenz-Marker ist.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-31, wobei die Markierungsverbindung ein Seltenerdmetall-Atom oder ein Übergangsmetall-Atom umfasst.
  33. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-32, wobei die Markierungsverbindung ein Metallatom, das aus der Gruppe bestehend aus Ruthenium, Osmium und Rhenium ausgewählt ist, umfasst.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-33, wobei die Markierungsverbindung umfasst: a) ein Metallatom, welches aus der Gruppe bestehend aus Ruthenium, Osmium und Rhenium ausgewählt ist; und b) einen Stickstoff enthaltenden, heterozyklischen, aromatischen, mehrzähnigen Metallliganden.
  35. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-34, wobei die erste Assay-Performance Substanz und/oder die zweite Substanz einen Antikörper, einen Proteinrezeptor, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G, Biotin oder eine Nukleinsäure umfassen.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-35, wobei die erste Assay-Performance Substanz an die Markierungsverbindung gebunden ist und/oder die zweite Substanz mit der Nanoröhre über eine Bindung, die eine Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung umfasst, verbunden ist.
  37. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-36, weiterhin umfassend den Schritt des Sammelns der Nanoröhre an einer Elektrodenoberfläche.
  38. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-37, wobei der interessierende Analyt ein Enzym ist und die erste Assay-Performance Substanz und/oder die zweite Substanz ein Substrat für das Enzym umfassen.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei das Enzym das Substrat spaltet, um so die Markierungsverbindung von der Nanoröhre abzulösen und/oder die zweite Substanz von der Nanoröhre abzulösen.
  40. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-39, wobei die Nanoröhren magnetisch responsiv sind.
  41. Ein Verfahren zur Ausführung eines Binding-Assays für einen in einer Probe vorliegenden, interessierenden Analyten, umfassend: a) Bildung einer Zusammensetzung enthaltend: (i) die Probe; (ii) eine erste Assay-Performance Substanz, die eine zur Lumineszenz induzierbare Markierungsverbindung umfasst, wobei die Assay-Performance Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder zum Konkurrieren mit dem Analyten geeignet ist; und (iii) eine Vielzahl von funktionalisierten Graphit-Nanoröhren, die an eine zweite Substanz gebunden sind, wobei die Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder zum Konkurrieren mit dem Analyten geeignet ist; b) Inkubation der Zusammensetzung, um einen Komplex zu bilden, welcher mindestens eine aus der Vielzahl der funktionalisierten Graphit-Nanoröhren sowie die Markierungsverbindung enthält, c) Einführen der Markierungsverbindung in den Komplex zur Lumineszenz; und d) Messung der emittierten Lumineszenz, um den interessierenden Analyten in der Probe zu messen oder zu detektieren, wobei die zweite Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des Analyten; (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analogons; und (iii) einer reaktiven Komponente, die zur Bindung mit (i) oder (ii) geeignet ist.
  42. Ein Verfahren nach Anspruch 41 basierend auf der Messung der Elektrochemilumineszenz, wobei der Komplex an einer Elektrodenoberfläche gesammelt wird.
  43. Ein Verfahren zur Ausführung eines Binding-Assays für einen in einer Probe vorliegenden, interessierenden Analyten, basierend auf der Messung der Elektrochemilumineszenz an einer Elektrodenoberfläche, umfassend die Schritte: a) Bildung einer Zusammensetzung enthaltend (i) die Probe, (ii) eine Assay-Performance Substanz, umfassend eine zur Elektrochemilumineszenz induzierbare Markierungsverbindung, wobei die Assay-Performance Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder zur Konkurrierung mit dem Analyten geeignet ist; (iii) eine Vielzahl funktionalisierter Graphit-Nanoröhren, die an eine zweite Substanz gebunden sind, wobei die zweite Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder zur Konkurrierung mit dem Analyten geeignet ist; b) Inkubation der Zusammensetzung, um einen Komplex zu bilden, welcher eine Graphit-Nanoröhre und die Markierungsverbindung enthält; c) Sammeln des Komplexes; d) Herbeiführen eines Kontaktes des gesammelten Komplexes mit einer Elektrodenoberfläche und Einführen der Markierungsverbindung in den Komplex zur Lumineszenz durch Anlegen einer Spannung an die Elektrode; und e) Messung der emittierten Lumineszenz an der Elektrodenoberfläche, um das Vorhandensein des interessierenden Analyten in der Probe zu messen, wobei die zweite Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des Analyten; (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analogons; und (iii) einer reaktiven Komponente, die zur Bindung mit (i) oder (ii) geeignet ist.
  44. Verfahren zur Ausführung eines Binding-Assays für einen in einer Probe vorliegenden, interessierenden Analyten, basierend auf der Messung der Elektrochemilumineszenz an einer Elektrodenoberfläche, die Schritte umfassend: a) Bildung einer Zusammensetzung enthaltend (i) die Probe, (ii) eine Assay-Performance Substanz, die eine zur Elektrochemilumineszenz induzierbare Markierungsverbindung umfasst, wobei die Assay-Performance Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder zum Konkurrieren mit dem Analyten geeignet ist, und (iii) eine Vielzahl von magnetisch responsiven, suspendierten Graphit-Nanoröhren, die an eine zweite Substanz gebunden sind, wobei die zweite Substanz zur direkten oder indirekt Bindung an den Analyten oder zum Konkurrieren mit dem Analyten geeignet ist; b) Inkubation der Zusammensetzung, um einen Komplex zu bilden, welcher eine Graphit-Nanoröhre und die Markierungsverbindung enthält; c) Sammeln des Komplexes durch Anlegen eines Magnetfeldes an die Graphit-Nanoröhren; d) Herbeiführen eines Kontaktes des gesammelten Komplexes mit einer Elektrodenoberfläche und Einführen der Markierungsverbindung in den Komplex zur Lumineszenz durch Anlegen einer Spannung an die Elektrode; und e) Messung der emittierten Lumineszenz an der Elektrodenoberfläche, um das Vorhandensein des interessierenden Analyten in der Probe zu messen, wobei die zweite Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des Analyten; (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analogons; und (iii) einer reaktiven Komponente, die zur Bindung mit (i) oder (ii) geeignet ist.
  45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei das Anlegen des Magnetfeldes den Komplex zur Sammlung an der Oberfläche der Elektrode veranlasst.
  46. Ein Verfahren zur Ausführung eines Assays für einen in einer Probe vorliegenden, interessierenden Analyten, umfassend die folgenden Schritte: a) Bildung einer Zusammensetzung enthaltend (i) die Probe, und (ii) eine funktionalisierte Graphit-Nanoröhre, die an eine Komponente gebunden ist, welche an eine zur Elektrochemilumineszenz induzierbare Markierungsverbindung gebunden ist, wobei die Komponente ein Substrat des interessierenden Analyten ist; b) Inkubation der Zusammensetzung unter Bedingungen, um dem Analyten die Spaltung der Komponente zu gestatten; c) Abtrennung der Graphit-Nanoröhre von der Zusammensetzung; d) Induzieren der freien Markierungsverbindung zum Lumineszieren; und e) Messung der emittierten Lumineszenz, um das Vorhandensein des interessierenden Analyten in der Probe zu messen.
  47. Ein Assay-Reagens für einen Assay, basierend auf einer Bindungsreaktion und der Messung eines Elektrochemilumineszenzphänomens, umfassend: a) einen Elektrolyten; b) eine Vielzahl von magnetisch responsiven, funktionalisierten Graphit-Nanoröhren, die an eine erste Substanz gebunden sind, wobei die erste Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder zum Konkurrieren mit dem Analyten geeignet ist; und c) eine Assay-Performance Substanz, die einen Elektrochemilumineszenz-Eigenschaften aufweisenden chemischen Teil umfasst, wobei die Assay-Performance Substanz zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder zum Konkurrieren mit dem Analyten geeignet ist, wobei die erste Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des Analyten; (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analogons; und (iii) einer reaktiven Komponente, die zur Bindung mit (i) oder (ii) geeignet ist
  48. Ein Assay-Reagens zur Durchführung eines Elektrochemilumineszenz Binding-Assays, in einem oder mehreren Containern, umfassend: a) eine Graphit-Nanoröhre, die an eine erste Substanz gebunden ist; und b) eine Assay-Performance Substanz umfassend eine Markierungsverbindung; wobei die erste Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) hinzugefügtem interessierenden Analyten oder hinzugefügtem Analogon des Analyten; (ii) einem Bindungspartner des Analyten oder einem Bindungspartner des Analogons; und (iii) einer reaktiven Komponente, die zur Bindung mit (i) oder (ii) geeignet ist.
  49. Assay-Reagens nach Anspruch 48, wobei die Markierungsverbindung ein Elektrochemilumineszenz-Marker ist.
  50. Assay-Reagens nach den Ansprüchen 48 oder 49, wobei die Markierungsverbindung ein Seltenerdmetallatom oder ein Übergangsmetallatom umfasst.
  51. Assay-Reagens nach einem der Ansprüche 48-50, wobei die Markierungsverbindung ein Metallatom, das aus der Gruppe bestehend aus Ruthenium, Osmium und Rhenium ausgewählt ist, umfasst.
  52. Assay-Reagens nach einem der Ansprüche 48-51, wobei die Markierungsverbindung umfasst: a) ein Metallatom, das aus der Gruppe bestehend aus Ruthenium, Osmium und Rhenium ausgewählt ist; und b) einen Stickstoff enthaltenden, heterozyklischen, aromatischen, mehrzähnigen Metallliganden.
  53. Assay-Reagens nach einem der Ansprüche 48-52, wobei die erste Substanz und/oder die Assay-Performance Substanz einen Antikörper, einen Proteinrezeptor, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G, Biotin oder eine Nukleinsäure umfasst.
  54. Das Assay-Reagens nach einem der Ansprüche 48-53, wobei die erste Substanz mit der Graphit-Nanoröhre und/oder die Assay-Perfomance Substanz mit der Markierungsverbindung über eine Bindung, die eine Biotin-Streptavidin Wechselwirkung umfasst, gebunden sind.
  55. Das Assay-Reagens nach einem der Ansprüche 48-54, wobei die Graphit-Nanoröhre magnetisch responsiv ist.
  56. Verwendung der Graphit-Nanoröhre nach einem der Ansprüche 1-13 in einem Lumineszenz-Assay.
  57. Verwendung der Graphit-Nanoröhre nach einem der Ansprüche 1-13 in einem Elektrochemilumineszenz-Assay.
  58. Verwendung der Graphit-Nanoröhre nach einem der Ansprüche 1-13 als ein ECL-basierten Biosensor.
  59. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14-28 in einem Lumineszenz-Assay.
  60. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14-28 in einem Elektrochemilumineszenz-Assay.
  61. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14-28 als ein ECL-basierter Biosensor.
  62. Verwendung eines Assay-Reagens nach einem der Ansprüche 47-55 in einem Elektrochemilumineszenz-Assay.
  63. Verwendung eines Assay-Reagens nach einem der Ansprüche 47-55 als ein ECL-basierter Biosensor.
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