DE69636721T2

DE69636721T2 - Screeningverfahren für enzyme und enzymkits

Info

Publication number: DE69636721T2
Application number: DE69636721T
Authority: DE
Inventors: M. Jay Encinitas SHORT; Barry Kennett Square MARRS; L. Jeffrey San Diego STEIN
Original assignee: Verenium Corp
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2016-07-18
Also published as: DK0839185T3; AU6547796A; US20040005587A1; US6280926B1; JP2002514894A; US6677115B2; EP0839185B1; US6528249B1; EP1696025A3; DE69636721D1; CA2227342C; US20020086279A1; ES2277346T3; US6849395B2; US5958672A; EP1696025A2; CA2227342A1; ATE346148T1; WO1997004077A1; EP0839185A4

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung und Durchmusterung von Clon-Bibliotheken, die von Mikroorganismen stammende DNA umfassen, und Proteinbibliotheken, z.B. Enzymbibliotheken. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung Bibliotheken zur rekombinanten Enzymexpression und Bibliotheken rekombinanter Enzyme, in denen die rekombinanten Enzyme aus DNA erzeugt werden, die von Mikroorganismen erhalten worden ist.
In der Industrie ist der Bedarf an neuen Enzymen für eine breite Vielfalt industrieller Anwendungen erkannt worden. Als ein Ergebnis sind eine Vielzahl von Mikroorganismen durchmustert worden, um zu überprüfen, ob diese Mikroorganismen eine gewünschte Enzymaktivität aufweisen. Wenn solch ein Mikroorganismus eine gewünschte Enzymaktivität aufweist, wird das Enzym aus dem Mikroorganismus gewonnen.
Natürlich vorkommende Anhäufungen von Mikroorganismen umfassen oft eine erstaunliche Aufgebot an physiologischer und metabolischer Vielfalt. In der Tat liegen Schätzungen vor, dass bis heute weniger als ein Prozent der Organismen der Welt kultiviert worden sind. Es ist vermutet worden, dass ein großer Teil dieser Vielfalt auf Grund von Schwierigkeiten bei Anreicherung und Isolierung von Mikroorganismen in einer reinen Kultur bisher unerkannt geblieben ist. Daher ist es schwierig oder unmöglich gewesen, wertvolle Enzyme aus diesen Proben zu erkennen oder zu isolieren. Diese Einschränkungen legen den Bedarf an alternativen Ansätze nahe, um das physiologische und metabolische Potenzial, d.h. interessierende Aktivitäten von bisher noch nicht kultivierten Mikroorganismen zu charakterisieren, die bis heute nur durch Analysen von mittels PCR amplifizierten rRNA-Genfragmenten charakterisiert worden sind, die als Clon aus gemischten Nucleinsäure-Anhäufungen gewonnen wurden.
McCormick (Methods in Enzymology, Seiten 445–449, 1987) und Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual Bd. 2, Cold Spring Harbor, New York, Seiten 8.50–8.51, 1989) beschreiben eine Geschwister-Selektion „Sib-Selection" genanntes Verfahren. Dieses Verfahren beschäftigt sich mit dem Problem der Genisolierung aus einer Bibliothek aus DNA-Sequenzen. Geschwister-Selektion ist ein Verfahren der sequenziellen Fraktionierung einer heterogenen Probe, welches zur Isolierung einer Sequenz, eines Gens oder einer Genfamilie aus einer vollständigen Bibliothek angewendet werden kann. Fraktionen aus der Bibliothek, die positiv für eine bestimmte Aktivität sind, werden weiter subfraktioniert, bis ein einzelner positiver Clon erhalten wird.
Im Einklang mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Ansatz zum Erhalten von Enzymen zur weiteren Verwendung geliefert. Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung werden rekombinante Enzyme aus Mikroorganismen erzeugt und durch verschiedene Enzymmerkmale klassifiziert.
Ebenfalls hierin beschrieben ist eine rekombinante Expressionsbibliothek, die aus einer Vielzahl von Clonen zusammengesetzt ist, die in der Lage sind, rekombinante Enzyme zu exprimieren. Die Expressionsbibliothek wird hergestellt, indem DNA aus einem Mikroorganismus gewonnen wird, eine solche DNA in einen geeigneten Expressionsvektor cloniert wird, welcher dann verwendet wird, um einen geeigneten Wirtsorganismus zur Expression eines rekombinanten Proteins zu transfizieren oder zu transformieren.
Auf diese Weise kann zum Beispiel genomische DNA von einem entweder kultivierbaren oder nicht kultivierbaren Organismus gewonnen und verwendet werden, um eine geeignete rekombinante Expressionsbibliothek zur anschließenden Bestimmung von Enzymaktivität herzustellen; eine solche rekombinante Expressionsbibliothek kann ohne vorherige Durchmusterung des Organismus, aus dem die Bibliothek erzeugt wird, auf Enzymaktivität hergestellt werden.
Nach Herstellung einer Vielzahl rekombinanter Expressionsclon aus DNA, die aus einem Organismus isoliert worden ist, werden die Polypeptide, die von solchen Clonen exprimiert werden, auf Enzymaktivität und bestimmte Enzymmerkmale durchmustert, um rekombinante Clone, die Polypeptide produzieren, die die bestimmten Enzymmerkmale aufweisen, zu identifizieren und zu klassifizieren.
Ebenfalls hierin beschrieben ist ein Verfahren zur Durchmusterung von Clonen, die DNA eines nicht kultivierten Mikroorganismus besitzen, auf eine bestimmte Proteinaktivität, z.B. Enzymaktivität, wobei das Verfahren umfasst:
Durchmusterung einer Bibliothek aus Clonen auf eine bestimmte Proteinaktivität, z.B. Enzymaktivität, die hergestellt sind durch

(i) Gewinnen von DNA aus einer DNA-Population, die aus mindestens einem nicht kultivierten Mikroorganismus stammt; und
(ii) Transformieren eines Wirtsorganismus mit der gewonnenen DNA, um eine Bibliothek aus Clonen herzustellen, welche auf die bestimmte Proteinaktivität, z.B. Enzymaktivität, durchmustert werden.

Die Bibliothek wird aus DNA hergestellt, die ohne Kultivierung eines Organismus gewonnen wird, besonders wenn die DNA aus einer aus der Umwelt entnommenen Probe gewonnen wird, welche Mikroorganismen enthält, die nicht kultiviert werden oder werden können.
Bevorzugt wird die DNA in einen Vektor ligiert, besonders wenn der Vektor darüber hinaus Sequenzen zur Regulierung der Expression umfasst, welche die Produktion einer nachweisbaren Enzymaktivität aus der ligierten DNA kontrollieren und regulieren können.
Der f-Faktor (oder Fertilitätsfaktor) in E. coli ist ein Plasmid, welches sehr häufigen Transfer von sich selbst während der Konjugation und weniger häufigen Transfer des eigentlichen bakteriellen Chromosoms bewirkt. Um große DNA-Fragmente aus gemischten mikrobiellen Proben zu erhalten und stabil zu vermehren, stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform die Verwendung eines Clonierungsvektors dar, welcher einen f-Faktor-Replikationsursprung enthält, um genomische Bibliotheken zu erzeugen, die mit hoher Zuverlässigkeit repliziert werden können. Wird dieser in DNA aus einer gemischten, nicht kultivierten, aus der Umwelt entnommenen Probe integriert, ermöglicht dies, große genomische Fragmente in Form einer stabilen „aus der Umwelt entnommenen DNA-Bibliothek" zu erhalten.
Bevorzugt wird doppelsträngige DNA, die aus der nicht kultivierten DNA-Population erhalten worden ist, selektiert durch:
Umwandeln der doppelsträngigen genomischen DNA in einzelsträngige DNA;
Gewinnen von einzelsträngiger DNA mit spezifischer Bindung, wie etwa Hybridisierung, an eine Sonden-DNA-Sequenz aus der umgewandelten einzelsträngigen DNA; und
Umwandeln von gewonnener einzelsträngiger DNA in doppelsträngige DNA.
Die Sonde kann direkt oder indirekt an eine feste Phase gebunden sein, durch welche sie von einzelsträngiger DNA getrennt wird, die nicht hybridisiert oder in anderer Weise spezifisch an die Sonde gebunden ist.
Der Prozess kann auch einschließen, einzelsträngige DNA aus dieser Sonde freizusetzen, nachdem die hybridisierte oder auf andere Weise gebundene einzelsträngige DNA gewonnen worden ist, und die auf diese Weise freigesetzte einzelsträngige DNA vor ihrer Umwandlung in doppelsträngige DNA zu amplifizieren.
Ebenfalls hierin beschrieben ist ein Verfahren zur Durchmusterung von Clonen, die DNA eines nicht kultivierten Mikroorganismus besitzen, auf eine bestimmte Proteinaktivität, z.B. Enzymaktivität, wobei das Verfahren die Durchmusterung auf eine Aktivität eines bestimmten Gen-Cluster-Proteinprodukts in der Bibliothek von Clonen umfasst, die hergestellt wurde durch: (i) Gewinnen von DNA aus einer DNA-Population, die von mindestens einem nicht kultivierten Mikroorganismus stammt; und (ii) Transformieren eines Wirtsorganismus mit der gewonnenen DNA, um eine Bibliothek aus Clonen mit den Mustern für die bestimmte Proteinaktivität, z.B.
Enzymaktivität, herzustellen. Die Bibliothek wird aus Gen-Cluster-DNA hergestellt, welche ohne Kultivierung eines Organismus gewonnen wird, besonders wenn die DNA-Gen-Cluster aus einer aus der Umwelt entnommenen Probe gewonnen werden, welche Mikroorganismen enthält, die nicht kultiviert werden oder werden können.
Alternativ wird doppelsträngige Gen-Cluster-DNA, die aus der nicht kultivierten DNA-Population erhalten worden ist, selektiert, indem die doppelsträngige genomische Gen-Cluster-DNA in einzelsträngige DNA umgewandelt wird; aus der umgewandelten einzelsträngigen Gen-Cluster-Polycistron-DNA einzelsträngige DNA gewonnen wird, die spezifisch, etwa durch Hybridisierung, an eine Polynucleotid-Sondensequenz bindet; und gewonnene einzelsträngige Gen-Cluster-DNA in doppelsträngige DNA umgewandelt wird.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Berücksichtigung von besonders bevorzugten Ausführungsformen beschrieben und werden für Fachleute auf dem Gebiet aus den hierin gegebenen Lehren offensichtlich sein.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt einen Überblick über die Abläufe, die verwendet wurden, um eine Umwelt-Bibliothek aus einer gemischten Pikoplanktonprobe zu erzeugen, wie in Beispiel 3 beschrieben wird.
2 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform von verschiedenen Rängen chemischer Merkmale eines Enzyms, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wie in Beispiel 4 beschrieben wird.
3 ist eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform von verschiedenen Rängen chemischer Merkmale eines Enzyms, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wie in Beispiel 4 beschrieben wird.
4 ist eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform von verschiedenen Rängen chemischer Merkmale eines Enzyms, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wie in Beispiel 4 beschrieben wird.
5 ist eine schematische Darstellung noch einer weiteren Ausführungsform von verschiedenen Rängen chemischer Merkmale eines Enzyms, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wie in Beispiel 4 beschrieben wird.
6 zeigt die Ergebnisse der pH-Wert-Optima, die durch das Enzym ESL-001-01 in den in Beispiel 5 beschriebenen Experimenten produziert worden sind.
7 zeigt die Ergebnisse der Temperatur-Optima, die durch das Enzym ESL-001-01 in den in Beispiel 5 beschriebenen Experimenten produziert worden sind.
8 zeigt die Ergebnisse der Toleranz für organische Lösungsmittel, die durch das Enzym ESL-001-01 in den in Beispiel 5 beschriebenen Experimenten produziert worden sind.
Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
In Übereinstimmung mit einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die rekombinanten Enzyme sowohl durch physikalische als auch durch chemische Merkmale charakterisiert, und solche chemischen Merkmale werden bevorzugt in einer abgestuften Weise klassifiziert, so dass rekombinante Enzyme, die ein chemisches Merkmal gemeinsam haben, dann durch andere chemische Merkmale charakterisiert werden, welche selektivere oder spezifischere chemische Merkmale sein können oder nicht sein können und so werter, wie nachstehend genauer dargelegt wird.
Wie vorstehend dargelegt, werden die rekombinanten Enzyme ebenfalls bevorzugt durch physikalische Merkmale klassifiziert, und eine oder mehrere Ränge der Enzyme, die durch chemische Merkmale klassifiziert werden, können auch durch physikalische Merkmale klassifiziert werden oder anders herum.
Der hierin verwendete Ausdruck „chemisches Merkmal" eines rekombinanten Enzyms betrifft die Substrat- oder chemische Funktionalität, auf Grund derer das Enzym agiert und/oder die katalytische Reaktion durch das Enzym durchgeführt wird; z.B. kann die katalytische Reaktion eine Hydrolyse sein (Hydrolasen), und die chemische Funktionalität kann die Art der Bindung sein, auf Grund derer das Enzym agiert (Esterasen spalten Esterbindungen), oder sie kann die besondere Art der Struktur sein, auf Grund derer das Enzym agiert (eine Glycosidase, die auf glycosidische Bindungen einwirkt). Auf diese Weise kann zum Beispiel ein rekombinantes Enzym, das auf glycosidische Bindungen einwirkt, zum Beispiel im Einklang mit dem Rangsystem chemisch klassifiziert werden: Rang 1: Hydrolase; Rang 2: Acetal-Bindungen; Acetal 3: Glycosidase.
Der hierin verwendete Ausdruck „physikalisches Merkmal" im Hinblick auf ein rekombinantes Enzym betrifft eine Eigenschaft (eine andere als die chemische Reaktion) wie etwa pH-Wert; Temperaturstabilität; Temperaturoptimum für die katalytische Reaktion; Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln; Selektivität für Metallionen; Sensitivität für Detergenzien usw.
In einer Ausführungsform der Erfindung, in der ein Ansatz in Rängen verwendet wird, um die rekombinanten Enzyme nach chemischen und/oder physikalischen Merkmalen zu klassifizieren, können die Enzyme aus einer oder mehreren der chemischen Merkmalsordnungen auch nach einem oder mehreren physikalischen Merkmalen charakterisiert werden und umgekehrt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Enzyme sowohl nach physikalischen als auch nach chemischen Merkmalen klassifiziert, z.B. sowohl nach den individuellen Substraten, auf die sie einwirken, als auch nach physikalischen Merkmalen.
Auf diese Weise ist zum Beispiel als ein repräsentatives Beispiel für die Weise, in der ein rekombinantes Enzym im Einklang mit der vorliegenden Erfindung klassifiziert werden kann, ein rekombinantes Enzym, das eine Protease ist (in dieser Darstellung ist Rang 1 eine Hydrolase; Rang 2 ist ein Amid (Peptidbindung), das weiter in Rang 3 nach der letztendlichen Stelle in der Aminosäuresequenz, an der die Spaltung stattfindet, klassifiziert werden kann; z.B. Anion, Kation, stark hydrophob, schwach hydrophob. Jedes der rekombinanten Enzyme, das in Rang 3 nach der Seitenkette klassifiziert worden ist, kann auch darüber hinaus nach physikalischen Merkmalen, deren Art hierin vorstehend angegeben wurde, klassifiziert werden.
Auf diese Weise ist es möglich, aus der rekombinanten Bibliothek Enzyme zu selektieren, die ein bestimmtes chemisches Merkmal gemeinsam haben, z.B. alle Endopeptidasen (die auf interne Peptidbindungen wirken), und die ein bestimmtes physikalisches Merkmal gemeinsam haben, z.B. ist bei allen die Wirksamkeit bei einem pH-Wert innerhalb eines bestimmten Bereiches optimal.
Wie hierin vorstehend angegeben, wird eine Bibliothek für rekombinante Enzyme, die aus einem Mikroorganismus hergestellt worden ist, bevorzugt durch chemische Merkmale in einem Rang-Ansatz klassifiziert. Dies kann erreicht werden, indem zunächst die rekombinanten Polypeptide, die durch die Bibliothek erzeugt werden, in einem Durchmusterungsschritt mit geringer Selektivität, z.B. der katalytischen Reaktion, die von den Enzymen durchgeführt wird, untersucht werden. Dies kann auf herkömmliche Weise erreicht werden, indem auf eine oder mehrere der sechs IUB-Klassen, Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen, Ligasen, durchmustert wird.
Die rekombinanten Enzyme, die als positiv für eine oder mehrere der IUB-Klassen bestimmt wurden, können dann erneut auf eine spezifischere Enzymaktivität durchmustert werden.
Wenn die rekombinante Bibliothek zum Beispiel auf Hydrolase-Aktivität durchmustert wird, können dann auf diese Weise jene rekombinanten Clone, die positiv für Hydrolase-Aktivität sind, erneut auf eine speziellere Hydrolyse-Aktivität, d.h. die Art der Bindung, auf die die Hydrolase einwirkt, durchmustert werden. Auf diese Weise können zum Beispiel die rekombinanten Enzyme, die Hydrolasen sind, erneut durchmustert werden, um jene Hydrolasen zu bestimmen, die auf eine oder mehrere bestimmte chemische Funktionalitäten einwirken, wie etwa (a) Amide (Peptidbindungen), d.h. Proteasen; (b) Esterbindungen, d.h. Esterasen und Lipasen; (c) Acetale, d.h. Glycosidasen usw.
Die rekombinanten Enzyme, die durch die chemische Bindung, auf die sie einwirken, klassifiziert worden sind, können dann erneut durchmustert werden, um eine speziellere Aktivität dafür zu bestimmen, wie etwa den Substrattyp, auf den sie einwirken.
Auf diese Weise können zum Beispiel jene rekombinanten Enzyme, die als auf Esterbindungen einwirkend (Lipasen und Esterasen) klassifiziert worden sind, dann erneut durchmustert werden, um deren Fähigkeit zu bestimmen, optisch aktive Verbindungen zu erzeugen, d.h. die Fähigkeit, auf bestimmte Substrate einzuwirken, wie etwa Meso-Alkohole, zweibasige Meso-Säuren, chirale Alkohole, chirale Säuren usw.
Zum Beispiel können rekombinante Enzyme, die als auf Acetale einwirkend klassifiziert worden sind, erneut durchmustert werden, um jene rekombinanten Enzyme durch einen spezifischen Substrattyp, auf den sie einwirken, zu klassifizieren, z.B. (a) P1-Zucker wie Glucose, Galactose usw., (b) Glucose-Polymer (Exo-, Endo- oder beides) usw.
Enzym-Ränge
Auf diese Weise stellen die nachstehenden Ränge als ein repräsentatives Beispiel repräsentative Enzym-Ränge dar, sind aber nicht darauf begrenzt:
RANG 1.
Einteilungen beruhen auf der katalytischen Reaktion, die durch das Enzym durchgeführt wird, z.B. Hydrolyse, Reduktion, Oxidation usw. Die sechs IUB-Klassen werden verwendet: Oxidoreduktase, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen, Ligasen.
RANG 2.
Sowohl Lipasen als auch Esterasen spalten die Esterbindung: die Unterscheidung rührt daher, ob das natürliche Substrat in eine Membran eingefügt ist (Lipasen) oder in Lösung dispergiert ist (Esterasen).
RANG 3.
Einteilungen und Untereinteilungen beruhen auf den Unterschieden zwischen individuellen Substratstrukturen, die kovalent an die Funktionalität, die eine Reaktion durchläuft, wie in Rang 2 definiert, gebunden sind. Zum Beispiel Acetal-Hydrolyse: ist das Acetal ein Teil der Glucose oder Galactose; oder ist das Acetal das α- oder β-Anomer? In dieser Art erfolgen die Einteilungen, die in RANG 3 vorgenommen werden. Die Einteilungen, die auf Substratspezifität beruhen, sind für jede einzelne Enzymreaktion einzigartig: es werden unterschiedliche Substrateinteilungen bestehen, abhängig davon, ob das Enzym zum Beispiel eine Protease oder eine Phosphatase ist.
RANG 4.
Einteilungen beruhen darauf, welches der beiden möglichen enantiomeren Produkte das Enzym herstellt. Dies ist ein Maß für die Fähigkeit des Enzyms, selektiv mit einem der beiden Enantiomere zu reagieren (kinetische Auflösung) oder die Fähigkeit des Enzyms, mit einer meso-bifunktionalen Verbindung zu reagieren, um selektiv eines der beiden enamtiomeren Reaktionsprodukte zu erzeugen.
RANG 5/ORTHOGONALER RANG/RANG DER PHYSIKALISCHEN MERKMALE
Der fünfte Rang ist orthogonal zu den anderen Rängen. Er beruht auf den physikalischen Eigenschaften der Enzyme, anstatt auf den chemischen Reaktionen als solchen: der fünfte Rang bildet eine zweite Dimension, durch die die Enzyme zu klassifizieren sind. Der fünfte Rang kann mit jeder der anderen Ränge zusammen angewendet werden, wird aber am meisten mit dem dritten Rang zusammen angewendet.
Auf diese Weise wird im Einklang mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Expressionsbibliothek zufällig aus der DNA eines Mikroorganismus, insbesondere der genomischen DNA oder cDNA des Mikroorganismus hergestellt, und die rekombinanten Proteine oder Polypeptide, die von solch einer Expressionsbibliothek produziert werden, werden durchmustert, um die rekombinanten Enzyme nach verschiedenen Enzymmerkmalen zu klassifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die rekombinanten Proteine auf ein oder mehrere bestimmte chemische Merkmale durchmustert, und die Enzyme, die als solche Merkmale besitzend identifiziert wurden, werden dann erneut auf ein spezifischeres chemisches Merkmal durchmustert, und dieses erneute Durchmustern kann einmal oder mehrere Male wiederholt werden. Zusätzlich werden die rekombinanten Enzyme in einer bevorzugten Ausführungsform ebenfalls durchmustert, um solche Enzyme nach einem oder mehreren physikalischen Merkmalen zu klassifizieren. Auf diese Weise werden die rekombinanten Enzyme, die aus der DNA eines Mikroorganismus erzeugt worden sind, sowohl nach chemischen als auch nach physikalischen Merkmalen klassifiziert, und es ist daher möglich, rekombinante Enzyme von einem oder mehreren verschiedenen Organismen zu selektieren, die ein oder mehrere chemische Merkmale und/oder ein oder mehrere physikalische Merkmale gemeinsam aufweisen. Da solche Enzyme rekombinante Enzyme sind, ist es darüber hinaus möglich, diese Enzyme in beliebigen Mengen und in einer beliebigen Reinheit zu produzieren.
Der Rang-Ansatz der vorliegenden Erfindung ist nicht auf einen Rang-Ansatz beschränkt, in dem zum Beispiel die einzelnen Ränge enger begrenzt sind. Zum Beispiel ist der Rang-Ansatz auch anwendbar, indem ein Rang-Ansatz verwendet wird, in dem zum Beispiel der erste Rang „Holz abbauende Enzyme" umfasst. Der zweite chemische Rang könnte dann zum Beispiel aus dem Typ des Enzyms, welches ein „Holz abbauendes" Enzym ist, bestehen.
In ähnlicher Weise könnte der erste Rang oder jeder andere Rang die physikalischen Merkmale umfassen, und der nächste Rang könnte durch bestimmte chemische Merkmale spezifiziert sein.
Auf diese Weise ist die vorliegende Erfindung allgemein für die Bereitstellung von rekombinanten Enzymen und Bibliotheken aus rekombinanten Enzymen anwendbar, bei denen unterschiedliche Enzyme nach verschiedenen chemischen und/oder physikalischen Merkmalen klassifiziert werden.
Die Mikroorganismen, aus denen die rekombinanten Bibliotheken hergestellt werden können, umschließen prokaryontische Mikroorganismen wie etwa Eubakterien und Archaebakterien und niedere eukaryontische Mikroorganismen wie etwa Pilze, einige Algen und Protozoen. Die Mikroorganismen können kultivierte Mikroorganismen oder nicht kultivierte Mikroorganismen sein, die aus aus der Umwelt entnommenen Proben stammen, und solche Mikroorganismen können Extremophile wie etwa Thermophile, Hyperthermophile, Psychrophile, Psychrotrophe usw. sein.
Bevorzugt wird die Bibliothek aus DNA hergestellt, die ohne Kultivierung eines Organismus gewonnen wird, besonders wenn die DNA aus einer aus der Umwelt entnommenen Probe gewonnen wird, die Mikroorganismen enthält, welche nicht kultiviert sind oder werden können. Quellen für DNA von Mikroorganismen als eine Startmaterial-Bibliothek, aus der DNA gewonnen wird, umschließen ausdrücklich aus der Umwelt entnommenen Proben wie etwa mikrobielle Proben, die aus arktischen oder antarktischen Eis-, Wasser- oder Permafrostquellen, aus Materialien vulkanischen Ursprungs, Materialien aus Erde- oder Pflanzenquellen in tropischen Gebieten stammen usw. Auf diese Weise kann zum Beispiel genomische DNA aus entweder nicht kultivierten oder nicht kultivierbaren Organismen gewonnen und verwendet werden, um eine geeignete Bibliothek aus Clonen für die anschließende Bestimmung der Enzymaktivität herzustellen.
Bakterien und viele Eukaryonten besitzen einen koordinierten Mechanismus zur Regulierung von Genen, deren Produkte an verwandten Prozessen beteiligt sind. Die Gene liegen gehäuft in Strukturen, die als „Gen-Cluster" bezeichnet werden, auf einem einzelnen Chromosom und werden zusammen unter der Kontrolle einer einzelnen Regulierungssequenz, einschließlich eines einzelnen Promotors, der die Transkription des gesamten Clusters einleitet, transkribiert. Das Gen-Cluster, der Promotor und zusätzliche Sequenzen, die in der Regulierung alle zusammenwirken, werden als „Operon" bezeichnet und können bis zu 20 oder mehr Gene, gewöhnlich von 2 bis zu 6 Genen, umfassen. Auf diese Weise ist ein Gen-Cluster eine Gruppe von benachbarten Genen, die entweder identisch oder miteinander verwandt sind, gewöhnlich entsprechend ihrer Funktion.
Einige Genfamilien bestehen aus identischen Mitgliedern. Clusterbildung ist eine Voraussetzung zur Beibehaltung der Identität unter Genen, obgleich Gene in Clustern nicht notwendigerweise identisch sind. Gen-Cluster reichen von Extremen, bei denen eine Verdopplung von benachbarten verwandten Genen erzeugt wird, bis zu Fällen, bei denen Hunderte von identischen Genen in einer Tandem-Anordnung liegen. Manchmal ist keine Bedeutung in einer Wiederholung eines bestimmten Gens zu erkennen. Ein vorrangiges Beispiel hierfür sind die exprimierten doppelten Insulin-Gene bei einigen Arten, während ein einzelnes Insulin-Gen bei anderen Säugerarten ausreicht.
Es ist wichtig, Gen-Cluster und das Ausmaß, in dem die volle Länge des Clusters für die Expression der hieraus entstehenden Proteine notwendig ist, weiter zu erforschen. Darüber hinaus unterliegen Gen-Cluster einer fortlaufenden Umorganisation, und daher ist die Fähigkeit, heterogene Bibliotheken von Gen-Clustern von zum Beispiel bakteriellen oder anderen prokaryontischen Quellen zu erzeugen, wertvoll für die Bestimmung von Quellen für neue Proteine, besonders einschließlich der Proteine, z.B. Enzyme, wie zum Beispiel die Polyketid-Synthasen, die für die Synthese von Polyketiden verantwortlich sind, die einen weiten Bereich an nützlichen Aktivitäten aufweisen. Andere Proteintypen, die das (die) Produkt(e) von Gen-Clustern sind, werden ebenfalls in Betracht gezogen, einschließlich, zum Beispiel, Antibiotika, antivirale Mittel, Antitumormittel und Regulationsproteine wie etwa Insulin.
Polyketide sind Moleküle, die eine extrem reiche Quelle an Bioaktivitäten darstellen, einschließlich Antibiotika (wie etwa Tetracycline und Erythromycin), Antikrebsmittel (Daunomycin), Immunsuppressiva (FK506 und Rapamycin) und Veterinärprodukte (Monesin). Viele Polyketide (produziert von Polyketid-Synthasen) sind wertvolle therapeutische Mittel. Polyketid-Synthasen sind multifunktionale Enzyme, die die Biosynthese einer großen Vielfalt an Kohlenstoffketten, die in Länge und Funktionalitäts- und Ringbildungsmustern variieren, katalysieren. Polyketid-Synthase-Gene fallen in die Gen-Cluster, und mindestens ein Typ (als Typ bezeichnet) der Polyketid-Synthasen hat Gene und Enzyme von großer Größe, was genetische Manipulation und in vitro-Studien dieser Gene/Proteine erschwert.
Die Fähigkeit, gewünschte Bestandteile aus einer Bibliothek von Polyketid- und Postpolyketid-Biosynthese-Genen zur Erzeugung neuer Polyketide zu Studienzwecken zu selektieren und zu kombinieren, ist verlockend. Die Verwendung des Verfahrens oder der Verfahren der vorliegenden Erfindung erleichtert das Clonieren von neuen Polyketid-Synthasen, besonders wenn man die auf dem f-Faktor basierenden Vektoren verwendet, die das Clonieren von Gen-Clustern erleichtern.
Bevorzugt wird die DNA des Gen-Clusters in einen Vektor ligiert, besonders wenn ein Vektor darüber hinaus Sequenzen zur Regulation der Expression umfasst, welche die Produktion einer nachweisbaren Proteinaktivität oder Aktivität einer Proteinverbundenen Anordnung des ligierten Gen-Clusters kontrollieren und regulieren kann. Verwendung von Vektoren, die eine außerordentlich große Kapazität für die Einführung exogener DNA besitzen, sind für die Verwendung mit solchen Gen-Clustern besonders geeignet und werden als Beispiel zum Einschluss des f-Faktors (oder Fertilitätsfaktors) von E. coli hierin beschrieben. Dieser f-Faktor von E. coli ist ein Plasmid, welches hochfrequenten Transfer seiner selbst während der Konjugation bewirkt, und ideal geeignet ist, große DNA-Fragmente zu erhalten und stabil zu vermehren, wie etwa Gen-Cluster aus gemischten mikrobiellen Proben.
Der Ausdruck „abstammend" oder „isoliert" bedeutet, dass Material aus seiner ursprünglichen Umwelt entfernt ist (z.B. der natürlichen Umwelt, wenn es in der Natur vorkommt). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorkommt, nicht isoliert, das selbe Polynucleotid oder Polypeptid aber, das von einem Teil oder den gesamten koexistierenden Stoffen in dem natürlichen System getrennt wird, ist isoliert.
Wie hierin vorstehend dargestellt, kann die Expressionsbibliothek aus Proben, die aus der Umwelt entnommen wurden, hergestellt werden, in diesem Fall kann DNA ohne Kultivierung eines Organismus gewonnen werden, oder die DNA kann aus einem kultivierten Organismus gewonnen werden.
Für die Herstellung der Expressionsbibliothek kann genomische DNA entweder aus einem kultivierten Organismus oder aus einer der Umwelt entnommenen Probe (zum Beispiel Erde) durch verschiedene Verfahren gewonnen werden. Die gewonnene oder isolierte DNA wird dann in eine Größe fragmentiert, die für die Herstellung einer Expressionsbibliothek geeignet ist und die eine vernünftige Wahrscheinlichkeit eröffnet, dass gewünschte Gene exprimiert und durchmustert werden, ohne dass die Notwendigkeit der Durchmusterung einer übermäßigen Anzahl von Clonen gegeben ist. Wenn das durchschnittlich durch Scherkräfte produzierte Genfragment 4,5 kB groß ist, sollten auf diese Weise zum Beispiel für ein 1,8 MBp großes Genom etwa 2000 Clone durchmustert werden, um eine Wahrscheinlichkeit von etwa 90 % für das Erhalten eines bestimmten Gens zu erreichen. In einigen Fällen, besonders in denen die DNA ohne Kultivierung gewonnen wird, wird die DNA nach dem Scheren amplifiziert (zum Beispiel durch PCR).
Die nach der Größe fraktionierte DNA wird in einen geeigneten Expressionsvektor cloniert und in einen geeigneten Wirtsorganismus, bevorzugt einen bakteriellen Wirtsorganismus und besonders E. coli transformiert. Obgleich E. coli bevorzugt ist, kann eine große Vielzahl an anderen Wirtsorganismen für die Herstellung einer Expressionsbibliothek verwendet werden.
Der Expressionsvektor, der verwendet wird, ist bevorzugt einer, der einen Promotor einschließt, von dem bekannt ist, dass er in dem Fall, dass der natürliche genomische Promotor in dem Wirtsorganismus nicht funktioniert, in dem ausgewählten Wirtsorganismus funktioniert.
Als repräsentative Beispiele für Expressionsvektoren, die für die Herstellung einer Expressionsbibliothek verwendet werden können, können Phagen, Plasmide, Phagemide, Cosmide, Phosmide, künstliche bakterielle Chromosomen, künstliche P1-basierende Chromosomen, künstliche Chromosomen der Hefe und alle anderen Vektoren genannt werden, die spezifisch für interessierende spezifische Wirtsorganismen (wie Bacillus, Aspergillus, Hefe usw.) sind. Der Vektor kann auch einen Marker eines auf dem Fachgebiet bekannten Typs einschließen, um die Reinigung zu erleichtern.
Im Nachstehenden wird eine allgemeine Vorgehensweise zur Herstellung von Expressionsbibliotheken sowohl von kultivierbaren als auch von nicht kultivierbaren Organismen dargestellt.
KULTIVIERBARE ORGANISMEN

Gewinnen von Biomasse
Isolierung der DNA (CTAB)
Scheren der DNA (25-Gauge-Nadel)
Erzeugung glatter Enden bei der DNA (Mungbohnen-Nuclease)
Methylieren (EcoRI-Methylase)
Ligieren an EcoRI-Linker (GGAATTCC)
Rückschneiden der Linker (Ec RI-Restriktionsendonuclease)
Größenfraktionierung (Saccharosegradient)
Ligieren an Lambda-Vector (Lambda ZAP II and gt11)
Verpacken (in vitro-Lambda-Verpackungsextrakt) Plattieren auf E. coli-Wirtszellen und amplifizieren.

NICHT KULTIVIERBARE ORGANISMEN

Gewinnen von Biomasse
Isolieren von DNA (verschiedene Verfahren)
Erzeugung glatter Enden bei der DNA (Mungobohnen-Nuklease)
Ligieren an einen Adapter, der eine NotI-Stelle enthält und an magnetische Perlen konjugiert ist,
Ligieren von nicht konjugiertem Adapter an das andere Ende der DNA
Amplifizieren der DNA in einer Reaktion, die hohe Genauigkeit zulässt und die Adaptersequenzen als Primer verwendet.
Schneiden der DNA mit NotI
Größenfraktionierung (Saccharosegradient oder Sephacryl-Säule)
Ligieren an Lambda-Vector (Lambda ZAP II and gt11)
Verpacken (in vitro-Lambda-Verpackungsextrakt)
Plattieren auf E. coli-Wirtszellen und amplifizieren.

Die Sonden-DNA, die zur selektiven Gewinnung von interessierender DNA aus der DNA, die von mindestens einem nicht kultivierbaren Mikroorganismus stammt, verwendet wird, kann eine DNA-Sequenz einer Codierungsregion in voller Länge oder ein Teil einer DNA-Sequenz einer Codierungsregion für ein Enzym mit bekannter Aktivität, eine phylogenetische Markierung oder eine andere identifizierte DNA-Sequenz sein. Für die ursprüngliche DNA-Bibliothek verwendet man bevorzugt zur Sondierung Sondengemische, die mindestens einen Abschnitt der DNA-Sequenz, die die bestimmte Aktivität codiert, umfassen. Diese Sonden oder Sonden-Bibliotheken sind bevorzugt einzelsträngig, und die mikrobielle DNA, die sondiert wird, ist bevorzugt in die einzelsträngige Form umgewandelt worden. Die Sonden, die besonders geeignet sind, sind jene, die von DNA abstammen, die Enzyme mit einer Aktivität codiert, die ähnlich oder identisch mit der spezifischen Enzymaktivität ist, die durchmustert werden soll.
Die Sonden-DNA sollte mindestens etwa 10 Basen und bevorzugt mindestens 15 Basen umfassen. In einer Ausführungsform kann die gesamte Codierungsregion als Sonde verwendet werden. Bedingungen für die Hybridisierung, in der DNA durch die Verwendung von mindestens einer DNA-Sonde selektiv isoliert wird, werden entworfen, um eine Hybridisierungsstringenz von mindestens 50 % Sequenzidentität, genauer eine Stringenz, die eine Sequenzidentität von mindestens 70 % liefert, zu erhalten.
Hybridisierungstechniken zur Verwendung von Sonden in einer mikrobiellen DNA-Bibliothek, um DNA von potentiellem Interesse zu isolieren, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und jedes der in der Literatur beschriebenen Verfahren ist für die Verwendung hierin geeignet, besonders jene, die eine an eine feste Phase gebundene, direkt oder indirekt gebundene Sonden-DNA verwenden, um die Trennung von der verbleibenden, von dem Mikroorganismus stammenden DNA zu erleichtern.
Bevorzugt ist die Sonden-DNA mit einem Partner eines spezifischen Bindungspaars (d.h. einem Liganden) „markiert", und der andere Partner des Paars ist an eine feste Matrix gebunden, um die Trennung des Zielobjektes von seiner Quelle zu erleichtern. Der Ligand und sein spezifischer Bindungspartner können, in beiden Richtungen, aus den Nachstehenden ausgewählt werden: (1) ein Antigen oder Hapten und ein Antikörper oder ein spezifisches Bindungsfragment hiervon; (2) Biotin oder Iminbiotin und Avidin oder Streptavidin; (3) ein Zucker und ein für diesen spezifisches Lektin; (4) ein Enzym und ein Inhibitor dafür; (5) ein Apoenzym und Kofaktor; (6) komplementäre homopolymere Oligonucleotide; und (7) ein Hormon und ein Rezeptor dafür. Die feste Phase wird bevorzugt ausgewählt aus: (1) einer Glas- oder Polymeroberfläche; (2) eine gepackten Säule aus Polymer-Perlen; und (3) magnetischen oder paramagnetischen Partikeln.
Die Bibliothek der Clone, die, wie vorstehend beschreiben, hergestellt worden ist, kann direkt auf eine gewünschte, z.B. enzymatische, Aktivität durchmustert werden, ohne dass Kulturexpansion, Amplifizierung oder andere zusätzliche Verfahren notwendig sind. Es wird jedoch in einer bevorzugten Ausführung als wünschenswert angesehen, die aus den einzelnen Clonen gewonnene DNA zu amplifizieren, etwa durch PCR.
Darüber hinaus ist es optional, aber wünschenswert, eine Amplifizierung der Ziel-DNA, die isoliert worden ist, vorzunehmen. In dieser Ausführungsform wird die selektiv isolierte DNA nach der Isolierung von der Sonden-DNA getrennt. Sie wird dann amplifiziert, bevor sie zur Transformierung von Wirtsorganismen verwendet wird. Die doppelsträngige DNA, die ausgewählt wird, um als wenigstens einen Teil davon eine vorher bestimmte DNA-Sequenz einzuschließen, kann zum Einzelstrang umgeformt, der Amplifizierung unterworfen und wieder aneliert werden, um amplifizierte Anzahlen der selektierten doppelsträngigen DNA zu liefern. Zahlreiche Amplifizierungsverfahren sind inzwischen auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die selektierte DNA wird dann verwendet, um eine Bibliothek zur Durchmusterung durch Transformieren eines geeigneten Organismus bereitzustellen. Wirtsorganismen, besonders jene, die hierin spezifisch als bevorzugt genannt werden, werden durch künstliches Einführen der Vektoren, die die Ziel-DNA enthalten, durch Einimpfen unter Bedingungen, die eine solche Transformation ermöglichen, transformiert.
Als repräsentative Beispiele für Expressionsvektoren, die verwendet werden können, können virale Partikel, Baculovirus, Phage, Plasmide, Phagemide, Cosmide, Phosmide, künstliche bakterielle Chromosomen, virale DNA (z.B. Vaccinia, Adenovirus, Geflügel-Pockenvirus, Pseudorabies und Derivate von SV40), P1-basierende künstliche Chromosomen, Hefe-Plasmide, künstliche Hefe-Chromosomen und alle anderen Vektoren, die für spezifische Wirtsorganismen von Interesse spezifisch sind (wie etwa Bacillus, Aspergillus, Hefe usw.) genannt werden. Auf diese Weise kann zum Beispiel die DNA in jedem von einer Reihe von verschiedenen Expressionsvektoren zur Expression eines Polypeptids eingeschlossen sein. Solche Vektoren umschließen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen. Eine große Anzahl von geeigneten Vektoren sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und käuflich zu erwerben. Die nachstehenden Vektoren werden als Beispiele genannt: Bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SK, pBluescript KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eukaryontisch: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Es kann jedoch jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, solange sie im Wirtsorganismus replizierbar und lebensfähig sind.
Ein besonders bevorzugter Vektortyp zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung enthält einen f-Faktor-Ursprung für die Replikation. Der f-Faktor (oder Fertilitätsfaktor) in E. coli ist ein Plasmid, welches während der Konjugation einen hochfrequenten Transfer seiner selbst und einen weniger häufigen Transfer des Bakterienchromosoms selbst verursacht. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist, Clonierungsvektroen zu verwenden, die als „Fosmide" oder künstliche bakterielle Chromosom (BAC)-Vektoren bezeichnet werden. Diese stammen vom f-Faktor von E. coli und sind in der Lage, große Segmente an genomischer DNA stabil zu integrieren. Wenn mit DNA aus einer gemischten nicht kultivierten, aus der Umwelt entnommenen Probein die Vektoren integriert ist, wird es möglich, große genomische Fragmente in der Form einer stabilen „Bibliothek mit aus der Umwelt entnommenen DNA" zu erhalten.
Die von einem Mikroorganismus stammende DNA kann durch eine Vielzahl von Verfahren in den Vektor inseriert werden. Allgemein wird die DNA-Sequenz mit Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, in eine geeignete Stelle(n) für eine Restriktionsendonuclease inseriert. Solche Verfahren und andere werden als innerhalb des Rahmens des Stands der Technik erachtet.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor wird funktionell an (eine) geeignete Sequenz(en) zur Kontrolle der Expression (Promotor) gebunden, um die mRNA-Synthese zu steuern. Besonders erwähnte bakterielle Promotoren umschließen IacI, IacZ, T3, T7, gpt, lambda P_R, P_L und trp. Eukaryontische Promotoren umschließen sehr frühen CMV, HSV-Thymidinkinase, frühen und späten SV40, LTRs vom Retrovirus und Maus-Metallthionein-I. Die Selektion von geeignetem Vektor und Promotor ist Fachleuten auf dem Gebiet leicht möglich. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomen-Bindungsstelle für den Start der Translation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zur Amplifizierung der Expression enthalten. Promotor-Regionen können aus jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markierungen ausgewählt werden.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren bevorzugt einen oder mehrere selektierbare Markierungsgene, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion der transformierten Wirtszellen zu bekommen, wie etwa Dihydrofolat-Reduktase oder Neomycin-Resistenz für eine eukaryontische Zellkultur oder solche wie Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz bei E. coli.
Allgemein werden rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Markierungen, die die Transformation der Wirtszelle gestatten, z.B. das Gen für Ampicillin-Resistenz von E. coli und das TRP1-Gen von S. cerevisiae, und einen Promotor einschließen, der von einem hoch exprimierten Gen stammt, um die Transkription einer abwärts gelegenen Struktursequenz zu steuern.
Solche Promotoren können von Operons stammen, die glycolytische Enzyme katalysieren, wie etwa unter anderen 3-Phosphoglycerat-kinase (PKG), α-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschock-Proteine. Die heterologe Struktursequenz wird in einer geeigneten Phase mit Sequenzen für Start und Beendung der Translation und bevorzugt einer Leadersequenz, die in der Lage ist, die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Medium zu steuern, zusammengesetzt.
Die, wie hierin vorstehend beschrieben, selektierte und isolierte DNA wird in einen geeigneten Wirtsorganismus eingeführt, um eine Bibliothek herzustellen, die auf eine gewünschte Enzymaktivität durchmustert wird. Bevorzugt befindet sich die selektierte DNA bereits in einem Vektor, der geeignete Kontrollsequenzen einschließt, wobei die selektierte DNA, die ein Enzym codiert, zum Nachweis der gewünschten Aktivität exprimiert werden kann. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle wie etwa eine Säugerzelle oder eine niedere eukaryontische Zelle wie etwa eine Hefezelle sein, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie etwa eine Bakterienzelle sein. Die Einführung der Konstruktion in die Wirtszelle kann durch Transformation, Calcuimphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, DMSO- oder Elektroporation erreicht werden (Davis, L. Dibner, M. Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirtsorganismen können genannt werden: bakterielle Zellen wie etwa E. coli, Bacillus, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen wie etwa Hefe; Insektenzellen wie etwa Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, Tierzellen wie etwa CHO, COS oder Bowes-Melanom; Adenoviren; Pflanzenzellen usw. Die Auswahl eines geeigneten Wirtsorganismus werden Fachleute auf dem Gebiet aus den hier genannten Lehren treffen können.
Wirtszellen werden mit gentechnischen Mitteln mit den Vektoren versehen (transduziert oder transformiert oder transfiziert). Die gentechnisch hergestellten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien kultiviert werden, das in der Weise abgewandelt ist, wie es zur Aktivierung von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifizierung von Genen geeignet ist. Die Kultivierungsbedingungen wie etwa Temperatur, pH-Wert und dergleichen sind jene, die zuvor bei den Wirtszellen, die zur Expression ausgewählt worden sind, verwendet wurden und werden dem Fachmann bekannt sein.
Die rekombinanten Enzyme in der Bibliothek, die wie hierin beschrieben, klassifiziert sind, können sequenziert oder nicht sequenziert werden und können in einer gereinigten Form oder nicht gereinigt vorliegen. Daher ist es im Einklang mit der vorliegenden Erfindung möglich, eines oder mehrere der rekombinanten Enzyme vor oder nach Erhalten der Sequenz des Enzyms oder vor oder nach der Reinigung des Enzyms auf die notwendige Homogenität zu klassifizieren.
Die Durchmusterung nach chemischen Merkmalen kann mit einzelnen Expressionsclonen durchgeführt werden, oder sie kann zu Beginn mit einem Gemisch aus Expressionsclonen durchgeführt werden, um sicherzustellen, ob das Gemisch eine oder mehrere bestimmte Enzymaktivitäten aufweist oder nicht. Wenn das Gemisch eine bestimmte Enzymaktivität aufweist, können die einzelnen Clone auf diese Enzymaktivität oder auf eine spezifischere Aktivität erneut durchmustert werden. Wenn ein Clon-Gemisch zum Beispiel Hydrolase-Aktivität aufweist, können auf diese Weise die einzelnen Clone gewonnen und durchmustert werden, um zu bestimmen, welcher dieser Clone Hydrolase-Aktivität aufweist.
Ebenfalls hierin beschrieben sind Enzym-Kits zur Verwendung bei weiterer Durchmusterung und/oder Forschung. Auf diese Weise wird ein Reagenz-Päckchen oder Kit zusammengestellt, indem in dem Kit oder Päckchen, z.B. in geeigneten Behältern, mindestens drei verschiedene rekombinante Enzyme zusammengestellt werden, wobei jedes der mindestens drei verschiedenen rekombinanten Enzyme mindestens zwei Enzym-Merkmale gemeinsam besitzt. Bevorzugt ist ein gemeinsames Merkmal ein chemisches Merkmal oder eine chemische Eigenschaft und das andere gemeinsame Merkmal ein physikalisches Merkmal oder eine physikalische Eigenschaft; es ist jedoch möglich, Kits zusammenzustellen, die zwei oder mehr chemische Merkmale oder Eigenschaften gemeinsam besitzen und keine physikalischen Merkmale oder Eigenschaften gemeinsam besitzen und anders herum.
Daher ist es im Einklang mit der vorliegenden Erfindung möglich, eine Bibliothek mit rekombinanten Enzymen von einem oder mehreren Mikroorganismen zu liefern, die durch eine Vielzahl von chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften klassifiziert ist, eine Vielzahl von Enzym-Kits oder Päckchen kann hergestellt werden, die eine Vielzahl von ausgewählten chemischen und/oder physikalischen Merkmalen besitzen, die in der Weise formuliert werden können, dass drei oder mehr rekombinante Enzyme enthalten sind, von denen mindestens drei und bevorzugt alle der rekombinanten Enzyme mindestens ein chemisches Merkmal gemeinsam aufweisen und mindestens ein physikalisches Merkmal gemeinsam aufweisen. Der Kit sollte eine geeignete Markierung beinhalten, die solche gemeinsamen Merkmale spezifiziert.
Zum Beispiel haben mindestens drei rekombinante Enzyme in dem Kit das spezifischste chemische Merkmal, das in den Anweisungen angegeben ist, gemeinsam. Der Ausdruck „Anweisungen" wird in seinem weitesten Sinne verwendet und umschließt Packungsbeilagen oder Literatur, die dazugehört oder in Verbindung mit dem Kit oder Päckchen verteilt wird. Wenn der Kit zum Beispiel in dieser Weise für ein bestimmtes Substrat ausgewiesen ist (eines der vorstehenden Beispiele für Ordnung 3), würden zum Beispiel mindestens drei der Enzyme aus dem Kit auf einem solchen Substrat aktiv sein.
Die Kits werden bevorzugt mehr als drei Enzyme enthalten, zum Beispiel fünf, sechs oder mehr Enzyme, und in einer bevorzugten Ausführungsform werden mindestens drei und bevorzugt eine Mehrheit und in einigen Fällen alle rekombinanten Enzyme aus dem Kit mindestens zwei Enzymeigenschaften oder -Merkmale gemeinsam haben, wie hierin vorstehend beschrieben.
Die rekombinanten Enzyme in den Kits können zwei oder mehr Enzyme in einem einzelnen Behälter oder einzelne Enzyme in einzelnen Behältern oder verschiedene Kombinationen davon enthalten.
Die Bibliothek kann auf eine bestimmte Enzymaktivität mit Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, durchmustert werden. Zum Beispiel kann die Enzymaktivität auf eine oder mehrere der sechs IUB-Klassen: Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen durchmustert werden. Die rekombinanten Enzyme, die als positiv für eine oder mehrere (UB-Klassen bestimmt werden, können dann auf eine spezifischere Enzymaktivität erneut durchmustert werden.
Alternativ kann die Bibliothek auf eine speziellere Enzymaktivität durchmustert werden. Statt allgemein auf Hydrolase-Aktivität zu durchmustern, kann die Bibliothek zum Beispiel auf eine speziellere Aktivität, d.h. auf den Typ der Bindung, auf den die Hydrolase einwirkt, durchmustert werden. Auf diese Weise kann die Bibliothek zum Beispiel durchmustert werden, um jene Hydrolasen zu ermitteln, die auf eine oder mehrere bestimmte chemische Funktionalitäten wie etwa: (a) Amid (Peptidbindungen), d.h. Proteasen; (b) Esterbindungen, d.h. Esterasen und Lipasen; (c) Acetale, d.h. Glycosidasen usw., einwirken.
Die Clone, bei denen die bestimmte Enzymaktivität identifiziert worden ist, können dann sequenziert werden, um die DNA-Sequenz zu identifizieren, die ein Enzym codiert, welches die bestimmte Aktivität besitzt. Auf diese Weise ist es im Einklang mit der vorliegenden Erfindung möglich, (i) DNA, die ein Enzym codiert, das eine bestimmte Aktivität besitzt; (ii) Enzyme, die eine solche Aktivität besitzen (einschließlich ihrer Aminosäuresequenz) zu isolieren und zu identifizieren und (iii) rekombinante Enzyme, die eine solche Aktivität besitzen, zu produzieren.
Die Durchmusterung auf Enzymaktivität kann bei einzelnen Expressionsclonen durchgeführt werden, oder sie kann zuerst in einem Gemisch aus Expressionsclonen durchgeführt werden, um zu ermitteln, ob das Gemisch eine oder mehrere bestimmte Enzymaktivitäten aufweist oder nicht. Wenn das Gemisch eine bestimmte Enzymaktivität aufweist, können die einzelnen Clone auf eine solche Enzymaktivität oder auf eine spezifischere Aktivität erneut durchmustert werden. Wenn ein Clon-Gemisch zum Beispiel Hydrolase-Aktivität aufweist, können dann auf diese Weise die einzelnen Clone gewonnen und durchmustert werden, um zu bestimmen, welcher dieser Clone Hydrolase-Aktivität besitzt.
Die Expressionsbibliotheken können auf ein oder mehrere chemische Merkmale durchmustert werden. Ausgewählte repräsentative chemische Merkmale werden nachstehend beschrieben, diese Merkmale begrenzen die vorliegende Erfindung aber nicht. Darüber hinaus können die Expressionsbibliotheken auf einige oder auf alle Merkmale durchmustert werden. Auf diese Weise können einige der hierin beschriebenen chemischen Merkmale in allen Bibliotheken, in keiner der Bibliotheken oder nur in einigen der Bibliotheken bestimmt werden.
Die rekombinanten Enzyme können auch auf physikalische Eigenschaften untersucht und anhand dessen klassifiziert werden. Zum Beispiel können die rekombinanten Enzyme nach physikalischen Eigenschaften klassifiziert werden, etwa wie folgt:
pH-Wert-Optima

< 3
3–6
6–9
9–12
> 12

Temperaturoptima

> 90°C
75–90°C
60–75°C
45–60 °C
30–45°C
15–30 °C
0–15°C

Temperaturstabilität

Halbwertszeit bei: 90°C 75°C 60°C 45°C

Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln

mit Wasser mischbar (DMF) 90 % 75 % 45 % 30 %
nicht mit Wasser mischbar Hexan Toluol

Metallionen-Selektivität

EDTA – 10 mM
Ca⁺² – 1 mM
Mg⁺² – 100 μM
Mn⁺² – 10 μM
Co⁺³ – 10 μM

Detergenz-Sensibilität

neutral (Triton)
anionisch (Desoxycholat)
kationisch (CHAPS)

Die rekombinanten Enzyme der Bibliotheken der vorliegenden Erfindung können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, und die vorliegende Erfindung erlaubt durch das Bereitstellen von einer Vielzahl von rekombinanten Enzymen, die durch eine Vielzahl von verschiedenen Enzym-Merkmalen klassifiziert sind, ein schnelles Durchmustern von Enzymen für eine Reihe von verschiedenen Anwendungen. So wird zum Beispiel die Zusammenstellung von Enzym-Kits beschrieben, die eine Vielzahl von Enzymen umfassen, die in der Lage sind, auf eine spezifische Bindung oder ein spezifisches Substrat unter bestimmten Bedingungen einzuwirken, um auf diese Weise die Durchmusterung von Enzymen für eine Reihe von verschiedenen Anwendungen zu ermöglichen. Als repräsentative Beispiele für solche Anwendungen mögen genannt werden:
1. Lipase/Esterase

a. Enantioselektive Hydrolyse von Estern (Lipiden)/Thioestern 1) Auflösung von racemischen Gemischen 2) Synthese von optisch aktiven Säuren oder Alkoholen aus meso-Diestern
b. Selektive Synthesen 1) Regiospezifische Hydrolyse von Kohlenhydratestern 2) Selektive Hydrolyse von zyklischen sekundären Alkoholen
c. Synthese von optisch aktiven Estern, Lactonen, Säuren, Alkoholen 1) Transveresterung von aktivierten/nicht aktivierten Estern 2) Interveresterung 3) Optisch aktive Lactone von Hydroxyestern 4) Regio- und enantioselektive Ringöffnung von Anhydriden
d. Detergezien
e. Fett/Öl-Umwandlung
f. Käsereifung

2. Protease

a. Ester/Amid-Synthese
b. Peptidsynthese
c. Auflösung von racemischen Gemischen von Aminosäureestern
d. Synthese von nicht natürlichen Aminosäuren
e. Detergenz/Protein-Hydrolyse

3. Glycosidase/Glycosyl-Transferase

a. Zucker/Polymer-Synthese
b. Spaltung von glycosidischen Bindungen, um mono-, di- und Oligosaccharide zu bilden
c. Synthese von komplexen Oligosacchariden
d. Glycosidsynthese unter Verwendung von UDP-Galactosyl-Transferase
e. Transgycosylierung von Disacchariden, Glycosylfluoriden, Arylgalactosiden
f. Glycosyl-Transfer bei Oligosaccharidsynthese
g. Diastereoselektive Spaltung von β-Glucosylsulfoxiden
h. Asymmetrische Glycosylierung
j. Papierverarbeitung

4. Phosphatase/Kinase

a. Synthese/Hydrolyse von Phosphatestern 1) Regio-, enantioselektive Phosphorylierung 2) Einführung von Phosphatestern 3) Synthetisieren von Phospholipid-Vorläufern 4) Kontrollierte Polynucleotidsynthese
b. Aktivieren des biologischen Moleküls
c. Bildung selektiver Phosphat-Bindung ohne schützende Gruppen

5. Mono/Dioxygenase

a. Direkte Oxyfunktionalisierung von nicht aktivierten organischen Substraten
b. Hydroxylierung von Alkan, Aromaten, Steroiden
c. Epoxidation von Alkenen
d. Enantioselektive Sulphoxidation
e. Regio- und stereoselektive Bayer-Villiger-Oxidationen

6. Haloperoxidase

a. Oxidative Addition eines Halogenidions an nukleophile Stellen
b. Addition von unterhalogenigen Säuren an Olefin-Bindungen
c. Ringspaltung von Cyclopropanen
d. Umwandlung von aktivierten aromatischen Substraten in ortho- und para-Derivate
e. Umwandlung von 1,3-Diketonen in 2-Halogen-Derivate
f. Heteroatom-Oxidation von Schwefel und Stickstoff enthaltenden Substraten
g. Oxidation von Enolacetaten, Alkinen und aktivierten aromatischen Ringen

7. Lignin-Peroxidase/Diarylpropan-Peroxidase

a. Oxidative Spaltung von C-C-Bindungen
b. Oxidation von Benzylalkoholen zu Aldehyden
c. Hydroxylierung von Benzylkohlenstoffen
d. Phenol-Dimerisierung
e. Hydroxylierung von Doppelbindungen zur Bildung von Diolen
f. Spaltung von Lignin-Aldehyden

8. Epoxid-Hydrolase

a. Synthese von enantiomer einheitlichen bioaktiven Verbindungen
b. Regio- und enantio-selektive Hydrolyse von Epoxiden
c. Aromatische und olefine Epoxidierung durch Monooxygenasen zur Bildung von Epoxiden
d. Auflösung von racemischen Epoxiden
e. Hydrolyse von Steroidepoxiden

9. Nitril-Hydratase/Nitrilase

a. Hydrolyse von aliphatischen Nitrilen zu Carboxamiden
b. Hydrolyse von aromatischen, heterozyklischen, ungesättigten aliphatischen Nitrilen zu den zugehörigen Säuren
c. Hydrolyse von Acrylnitril
d. Herstellung von Aromaten und Carboxamiden, Carbonsäuren (Nicotinamid, Picolinamid, Isonicotinamid)
e. Regioselektive Hydrolyse von Acryldinitril
f. α-Aminosäuren von α-Hydroxynitrilen

10. Transaminase

a. Übertragung von Aminogruppen in Oxo-Säuren

11. Amidase/Acylase

a. Hydrolyse von Amiden, Amidinen und anderen C-N-Bindungen
b. Auflösung und Synthese von nicht natürlichen Aminosäuren

Die Erfindung wird mit Bezug auf die nachstehenden Beispiele weiter beschrieben; der Rahmen der vorliegenden Erfindung wird hierdurch jedoch nicht beschränkt. Soweit nicht anders angegeben, gelten für alle Teile Gewichtsangaben.
Beispiel 1
Herstellung der Expressionsbibliothek
Im Nachfolgenden wird eine repräsentative Vorgehensweise zur Herstellung einer Expressionsbibliothek zur Durchmusterung nach dem Rangansatz der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Ein Gramm eines Thermococcus GU5L5-Zellpellets wurde lysiert, und die DNA wurde durch in der Literatur angegebene Verfahren isoliert (Current Protocols in Molecular Biology, 2.4.1, 1987). Etwa 100 μg der isolierten DNA wurde in TE-Pufferlösung resuspendiert und kräftig durch eine 25-Gauge-Doppelhub-Nadel gedrückt, bis die gescherten Fragmente einen Größenbereich von 0,5–10,0 kB (3,0 kB im Mittel) aufwiesen. Die DNA-Enden wurden mit Mungbohnen-Nuclease poliert oder glatt (300 Einheiten, 37°C, 15 Minuten), und EcoRI-Spaltungsstellen in der Ziel-DNA wurden mit EcoRI-Methylase geschützt (200 Einheiten, 37°C, 1 Stunde). EcoRI-Linker [GGAATTCC] wurden an die glatt gemachte/geschützte DNA ligiert, wobei 10 pMol Linker-Enden für 1 pMol Ziel-DNA-Ende verwendet wurden. Die Linker wurden mit EcoRI-Restriktionsendonuklease (200 Einheiten, 37°C, 1,5 Stunden) zurückgeschnitten, und die DNA wurde durch Saccharose-Gradienten nach der Größe fraktioniert (Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J., Molecular Cloning. Gold Spring Harbor Press, New York, 1982). Die hergestellte Ziel-DNA wurde in den Lambda-ZAP^® II-Vektor (Stratagene) ligiert, unter Verwendung von in vitro-Lambda-Verpackungsextrakten verpackt und auf dem E. coli-Stamm XL1-Blue MRF' nach Angaben des Herstellers gezüchtet. Die pBluescript^®-Phagemide wurden aus der Lambda-Bibliothek ausgeschnitten und nach dem Verfahren von Hay und Short (Hay und Short, J. Strategies. 5:16. 1992) in dem E. coli-Stamm DH10B F'kan gezüchtet. Die entstandenen Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern aufgenommen und verwendet, um jede Vertiefung der 11 Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (insgesamt 1056 Clone) einzeln anzuimpfen. Die Vertiefungen enthielten 250 μl LB-Kulturmedien mit 100 μg/ml Ampicillin, 80 μg/ml Methicillin und 10 % Vol/Vol Glycerin (LB Amp/Meth. Glycerin). Die Zellen wurden über Nacht ohne Schwenken bei 37°C gezüchtet. Hierauf gründete sich die Erzeugung der „Quellenbibliothek"; jede Vertiefung der Quellenbibliothek enthielt somit eine Stammkultur an E. coli-Zellen, von der jede ein pBluescript-Phagemid mit einer einzigartigen DNA-Insertion enthielt.
Beispiel 2
Herstellung einer DNA-Bibliothek
Das Nachstehende stellt die Vorgehensweisen dar, die verwendet wurden, um eine Genbibliothek aus einer Probe der äußeren Oberfläche eines Walknochens zu erzeugen, der in 1240 Metern Tiefe im Santa-Catalina-Becken während einer Tauchexpedition gefunden worden war.
Isolieren der DNA.
IsoQuick-Verfahren nach Angaben des Herstellers.
Scheren der DNA

1. DNA etwa 500-mal kräftig durch eine 25-GaugeDoppelhub-Nadel und 1-cc-Spritzen drücken und ziehen.
2. Eine kleine Menge (0,5 pg) auf einem 0,8 % Agarosegel testen, um sicherzustellen, dass der größte Teil der DNA im gewünschten Größenbereich liegt (etwa 3–6 kB).

Glätten der DNA

1. Zugeben von:

H₂O	auf ein Gesamtvolumen von 405 μl
45 μl	10 × Mungbohnen-Pufferlösung
2,0 μl	Mungbohnen-Nuclease (150 u/μl)

2. Inkubieren bei 37°C, 15 Minuten.
3. Phenol/Chloroform-Extraktion einmal.
4. Chloroform-Extraktion einmal.
5. Zugeben von 1 ml eisgekühltem Ethanol zum Ausfällen.
6. Lagern auf Eis über 10 Minuten.
7. Zentrifugieren in Mikrofuge. Hohe Geschwindigkeit. 30 Minuten.
8. Waschen mit 1 ml 70 % Ethanol.
9. Zentrifugieren in Mikrofuge. Hohe Geschwindigkeit. 10 Minuten Lufttrocknung

Methylieren der DNA

1. DNA vorsichtig in 26 μl TE resuspendieren.
2. Zugeben von:

4,0 μl	10 × EcoR I-Methylase-Pufferlösung
0,5 μl	SAM (32 mM)
5,0 μl	EcoRI-Methylase (40 u/μl)

3. Inkubieren bei 37°C, 30 Minuten.

Sicherstellen von glatten Enden

1. Zugeben zu der Methylierungsreaktion:

5,0 μl	100 mM MgCl₂
8,0 μl	dNTP-Gemisch (jeweils 2,5 mM dGTP, dATP, dTTP, dCTP)
4,0 μl	Klenow (5 u/μl)

2. Inkubieren bei 12 °C, 30 Minuten.
3. Zugeben von 450 μl 1 × STE.
4. Phenol/Chloroform-Extraktion einmal.
5. Chloroform-Extraktion einmal.
6. Zugeben von 1 ml eisgekühltem Ethanol zur Fällung und Lagern auf Eis über 10 Minuten.
7. Zentrifugieren in Mikrofuge. Hohe Geschwindigkeit. 30 Minuten.
8. Waschen mit 1 ml 70 % Ethanol.
9. Zentrifugieren in Mikrofuge. Hohe Geschwindigkeit. 10 Minuten und Trocknen.

Ligierung des Linkers

1. DNA vorsichtig in 7 μl Tris-EDTA (TE) resuspendieren.
2. Zugeben von:

14 μl	phosphorylierten EcoR 1-Linkern (200 ng/μl)
3,0 μl	10 × Ligierungspufferlösung
3,0 μl	10 mM rATP
3,0 μl	T4-DNA-Ligase (4WG/μl) („Weiss-Einheit/μl")

3. Inkubieren bei 4°C über Nacht.

Zurückschneiden von EcoRI

1. Hitzestopp der Ligierungsreaktion bei 68°C, 10 Minuten.
2. Zugeben von:

237,9 μl	H₂O
30 μl	10 × EcoRI-Pufferlösung
2,1 μl	EcoRI-Restriktions-Enzym (100 u/μl)

3. Inkubieren bei 37°C, 1,5 Stunden.
4. Zugeben von 1,5 μl 0,5 M EDTA.
5. Lagern auf Eis.

Größenfraktionierung im Saccharosegradienten (2,2 ml)

1. Erhitzen der Probe auf 65°C, 10 Minuten.
2. Vorsichtig auf einen 2,2-ml-Saccharosegradienten laden.
3. Zentrifugieren in Mini-Ultrazentrifuge, 45K, 20°C, 4 Stunden (keine Bremse).
4. Sammeln der Fraktionen durch Punktieren des Bodens des Gradient-Röhrchens mit einer 20G-Nadel und Ermöglichen, dass die Saccharose durch die Nadel fließt. Sammeln der ersten 20 Tropfen in einem Falcon 2059-Röhrchen, dann Sammeln von 10 I-Tropfen-Fraktionen (mit 1–10 markiert). Jeder Tropfen hat ein Volumen von etwa 60 μl.
5. Laufenlassen von 5 μl aus jeder Fraktion auf einem 0,8 % Agarosegel, um die Größe zu überprüfen.
6. Zusammengeben der Fraktionen 1–4 (–10–1,5 kB) und, in einem separaten Gefäß, Zusammengeben der Fraktionen 5–7 (etwa 5–0,5 kB).
7. Zugeben von 1 ml eisgekühltem Ethanol zur Fällung und Lagerung auf Eis über 10 Minuten.
8. Zentrifugieren in Mikrozentrifuge. Hohe Geschwindigkeit. 30 Minuten.
9. Waschen mit 1 ml 70 % Ethanol.
10. Zentrifugieren in Mikrofuge. Hohe Geschwindigkeit. 10 Minuten und Trocknen.
11. Resuspendieren in jeweils 10 μl TE-Pufferlösung.

Testen der Ligierung an Lambda-Arme

1. Plattieren der Testlösung, um eine geeignete Konzentration zu erhalten. Tupfen von 0,5 μl der Probe auf Agarose, die Ethidiumbromid enthält zusammen mit den Standards (DNA-Proben mit bekannter Konzentration). Sichten unter UV-Licht und Bestimmen der Konzentration im Vergleich mit den Standards. Fraktion 1–4 = > 1,0 μg/μl. Fraktion 5–7 = 500 ng/μl.
2. Herstellen der nachfolgenden Ligierungsreaktionen (5-μl-Reaktionen) und Inkubieren über Nacht:

Probe	H₂O	10 × Ligase-Pufferlösung	10 mM rATP	Lambda-Arme (gt11 und ZAP)	Insertions-DNA	T4-DNA-Ligase (4 WE/μl)
Fraktion 1–4	0,5 μl	0,5 μl	0,5 μl	1,0 μl	2,0 μl	0,5 μl
Fraktion 5–7	0,5 μl	0,5 μl	0,5 μl	1,0 μl	2,0 μl	0,5 μl

Testen der Verpackung und Plattieren

1. Verpacken der Ligierungsreaktionen nach den Angaben des Herstellers. Verpacken von 2,5 μl pro Verpackungsextrakt (2 Extrakte pro Ligierung).
2. Stoppen der Verpackungsreaktionen mit 500 μl SM-Pufferlösung und Zusammengeben von Verpackungen, die aus der selben Ligierung stammen.
3. Titrieren von jeweils 1,0 μl auf einen geeigneten Wirtsorganismus (OD₆₀₀ = 1,0) [XL1-Blue MRF für ZAP und Y1088 für gt11]. Zugeben von 200 μl des Wirtsorganismus (in mM MgSO₄) in die Falcon 2059-Röhrchen. Beimpfen mit 1 μl verpacktem Phagen Inkubieren bei 37°C, 15 Minuten Zugeben von etwa 3 ml Top-Agar mit 48 °C [50 ml Stammlösung, die 150 μl IPTG (0,5 M) und 300 μl X-Gal (350 mg/ml) enthalten] Plattieren auf 100 mm-Platten und Inkubieren bei 37°C über Nacht.
4. Ergebnisse zur Wirksamkeit: gt11: 1,7 × 10⁴ Rekombinanten mit 95 % Hintergrund ZAP II: 4,2 × 10⁴ Rekombinanten mit 66 % Hintergrund.

Verunreinigungen in der DNA-Probe können die enzymatischen Reaktionen gehemmt haben, obgleich der Saccharosegradient und die organischen Extraktionen sie entfernt haben können. Da die DNA-Probe wertvoll war, wurde ein Versuch unternommen, die Enden für eine Clonierung zu „fixieren".
Erneutes Glattmachen der DNA

1. Zusammengeben aller übrig gebliebenen DNA, die nicht an die lambda-Arme ligiert worden ist (Fraktionen 1–7) und Zugeben von H₂O bis zu einem Endvolumen von 12 μl. Dann Zugeben von:

143 μl	H₂O
20 μl	10 × Pufferlösung 2 (vom cDNA Synthesis Kit von Stratagene)
23 μl	dNTP zum Glattmachen (vom cDNA Synthesis Kit von Stratagene)
2,0 μl	PbE (vom cDNA Synthesis Kit von Stratagene)

2. Inkubieren bei 72°C, 30 Minuten.
3. Phenol/Chloroform-Extraktion einmal.
4. Chloroform-Extraktion einmal.
5. Zugeben von 20 μl 3 M NaOAc und 400 μl eisgekühltem Ethanol zur Fällung.
6. Lagern bei –20°C über Nacht.
7. Zentrifugieren in Mikrofuge. Hohe Geschwindigkeit. 30 Minuten.
8. Waschen mit 1 ml 70 % Ethanol.
9. Zentrifugieren in Mikrofuge. Hohe Geschwindigkeit. 10 Minuten und Trocknen.

(DNA NICHT methylieren, da sie bereits in der ersten Runde der Verarbeitung methyliert worden ist)
Ligierung des Adapters

1. Sanftes Resuspendieren der DNA in 8 μl EcoRI-Adaptern (vom cDNA Synthesis Kit von Stratagene)
2. Zugeben von:

1,0 μl	10 × Ligierungspufferlösung
1,0 μl	10 mM rATP
1,0 μl	T4-DNA-Ligase (4 WE/μl)

3. Inkubieren bei 4°C, 2 Tage

(NICHT zurückschneiden, da in diesem Fall ADAPTER verwendet werden. Stattdessen müssen sie phosphoryliert werden.)
Phosphorylieren der Adapter

1. Hitzestopp der Ligierungsreaktion bei 70°C, 30 Minuten. Zugeben von:

1,0 μl	10 × Ligierungspufferlösung
2,0 μl	10 mM rATF
6,0 μl	H₂O
1,0 μl	PNK (vom cDNA Synthesis Kit von Stratagene)

3. Inkubieren bei 37°C, 30 Minuten.
4. Zugeben von 31 μl H₂O und 5 μl 10 × STE.
5. Größenfraktionieren auf einer Sephacryl S-500-Spin-Säule (Zusammengeben der Fraktionen 1–3).
6. Phenol/Chloroform-Extraktion einmal.
7. Chloroform-Extraktion einmal.
8. Zugeben von eisgekühltem Ethanol zur Fällung.
9. Lagern auf Eis über 10 Minuten.
10. Zentrifugieren in Mikrofuge. Hohe Geschwindigkeit. 30 Minuten.
11. Waschen mit 1 ml 70 % Ethanol.
12. Zentrifugieren in Mikrofuge. Hohe Geschwindigkeit. 10 Minuten und Trocknen.
13. Resuspendieren in 10,5 μl TE-Pufferlösung.

Den Test nicht plattieren. Stattdessen wie vorstehend direkt an die Arme ligieren, mit der Änderung der Verwendung von 2,5 μl DNA und ohne Wasser.
Verpacken und Titrieren wie vorstehend
Ergebnisse der Wirksamkeit:

gt11: 2,5 × 10⁶ Rekombinanten mit 2,5 % Hintergrund

ZAP II: 9,6 × 10⁵ Rekombinanten mit 0 % Hintergrund
Amplifizierung von Bibliotheken (5,0 × 10⁵ Rekombinante aus jeder Bibliothek)

1. Zugeben von 3,0 ml Wirtszellen (OD₆₆₀ = 1,0) zu zwei konischen 50-ml-Gefäßen.
2. Beimpfen mit 2,5 × 10⁵ PbE pro konisches Gefäß.
3. Inkubieren bei 37°C. 20 Minuten.
4. Zugeben von Top-Agar zu jedem Gefäß zu einem Endvolumen von 45 ml.
5. Plattieren der Röhrchen über fünf 150-mm-Platten.
6. Inkubieren bei 37°C. 6–8 Stunden oder bis die Plaques etwa die Größe eines Stecknadelkopfes haben.
7. Überschichten mit 8–10 ml SM-Pufferlösung und Lagern bei 4°C über Nacht (mit sanftem Schwenken, wenn möglich).

Ernten des Phagen

1. Gewinnen der Phagensuspension durch Abgießen der SM-Pufferlösung von jeder Platte in ein konisches 50-ml-Gefäß.
2. Zugeben von 3 ml Chloroform, kräftig Schütteln und Inkubieren bei Zimmertemperatur, 15 Minuten.
3. Zentrifugieren mit 2K UpM, 10 Minuten, um Zelltrümmer zu entfernen.
4. Abgießen des Überstandes in eine sterile Flasche, Zugeben von 500 μl Chloroform.
5. Lagern bei 4°C.

Titrieren der amplifizierten Bibliothek

1. Erstellen von Verdünnungsreihen: 10^–5 = 1 μl amplifizierter Phage in 1 ml SM-Pufferlösung 10^–6 = 1 μl der 10^–3-Verdünnung in 1 ml SM-Pufferlösung
2. Zugeben von 200 μl Wirtsorganismus (in 10 mM MgSO₄) in zwei Röhrchen.
3. Beimpfen eines Röhrchens mit 10 μl 10^–6-Verdünnung (10^–5).
4. Beimpfen des anderen Röhrchens mit 1 μl 10^–6-Verdünnug (10^–6).
5. Inkubieren bei 37°C, 15 Minuten.
6. Zugeben von etwa 3 ml Top-Agar mit 48°C. [50 ml Stammlösung, die 150 μl IPTG (0,5 M) und 375 μl X-GAL (350 mg/ml) enthalten]
7. Plattieren auf 100-mm-Platten und Inkubieren bei 37°C, über Nacht.
8. Ergebnisse:

gt11: 1,7 × 10¹¹/ml

ZAP II: 2,0 × 10¹⁰/ml
Ausschneiden der ZAP II-Bibliothek zur Schaffung der pBluescript-Bibliothek.
Beispiel 3
Herstellung einer DNA-Bibliothek eines nicht kultivierten Prokaryonten
1 zeigt einen Überblick über die verwendeten Verfahren zur Erstellung einer Umwelt-Bibliothek aus einer gemischten Pikoplankton-Probe. Das Ziel war, eine stabile Bibliothek mit großer Insertions-DNA zu erstellen, die genomische DNA von Pikoplankton repräsentiert.
Sammlung der Zellen und Herstellung der DNA.
Agarose-Stopfen, die konzentrierte Pikoplanktonzellen enthielten, wurden aus Proben hergestellt, die auf einer ozeanografischen Schifffahrt von Newport, Oregon, nach Honolulu, Hawaii, gesammelt worden waren. Seewasser (30 l) wurde in Niskin-Flaschen gesammelt, durch 10-μm-Nitex durchmustert und durch Hohlfaser-Filtration (Amicon DC10) durch Polysulfon-Filter mit 30.000 MG-Ausschluss konzentriert. Die konzentrierten Bakterioplankton-Zellen wurden auf einem 0,22 μm-Durapore-Filter mit 47 mm Durchmesser gesammelt und in 1 ml 2 × STE-Pufferlösung (1 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, pH-Wert 8,0) auf eine Enddichte von etwa 1 × 10¹⁰ Zellen pro ml resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit einem Volumen von 1 % geschmolzener Seaplaque-LMP-Agarose (FMC) vermischt, auf 40°C gekühlt und dann sofort in einer 1 ml-Spritze aufgezogen. Die Spritze wurde mit Parafilm versiegelt und über 10 Minuten auf Eis gelagert. Der Zellen enthaltende Agarose-Stopfen wurde in 10 ml Lysierungspufferlösung (10 mM Tris, pH-Wert 8,5, 50 mM NaCl, 0,1 M EDTA, 1 % Sarkosyl, 0,2 % Kaliumdesoxycholat, ein mg/ml Lysozym) herausgedrückt und bei 37°C über eine Stunde inkubiert. Der Agarose-Stopfen wurde dann in 40 ml ESP-Pufferlösung (1 % Sarkosyl, 1 mg/ml Proteinase-K in 0,5 M EDTA) übertragen und bei 55°C über 16 Stunden inkubiert. Die Lösung wurde abgegossen und durch frische ESP-Pufferlösung ersetzt und bei 55°C über eine weitere Stunde inkubiert. Die Agarose-Stopfen wurden dann in 50 mM EDTA gelegt und bei 4°C über die Dauer der ozeanografischen Schifffahrt an Bord gelagert.
Einen Streifen eines Agarose-Stopfens (72 μl), der aus einer vor der Küste von Oregon gesammelten Probe hergestellt worden war, wurde über Nacht bei 4°C gegen 1 ml Pufferlösung A (100 mM NaCl, 10 mM Bis, Tris-Propan-HCl, 100 μg/ml acetyliertes BSA, pH-Wert 7,0 @ 25°C) in einem 2-ml-Mikrozentrifugen-Gefäß dialysiert. Die Lösung wurde durch 250 μl frische Pufferlösung A ersetzt, die 10 mM MgCl₂ und 1 mM DTT enthielt, und auf einer Schüttelplatte über 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Lösung wurde dann zu 250 μl der selben Pufferlösung, die 4 E Sau3A1 (NEB) enthielt, äquilibriert auf 37°C in einem Wasserbad, verändert, und dann auf einer Schüttelplatte in einem 37°C-Inkubator über 45 Minuten inkubiert. Der Stopfen wurde in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugengefäß übertragen und bei 68°C über 30 Minuten inkubiert, um das Protein, z.B. Enzym, zu inaktivieren und die Agarose zum Schmelzen zu bringen. Die Agarose wurde abgebaut und die DNA unter Verwendung von Gelase beziehungsweise HK-Phosphatase (Epicentre) nach den Empfehlungen des Herstellers dephosphoryliert. Das Protein wurde durch sanfte Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt, und die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt, pelletiert und dann mit 70 % Ethanol gewaschen. Diese zum Teil gespaltene DNA wurde in sterilem H₂O auf eine Konzentration von 2,5 ng/μl zur Ligierung in den pFOS1-Vektor resuspendiert.
Ergebnisse von PCR-Amplifizierungen von einigen der Agarose-Stopfen (Daten nicht dargestellt) ließen auf die Anwesenheit von signifikanten Mengen von DNA aus Archaea schließen. Quantitative Hybridisierungsexperimente unter Verwendung von rRNA, extrahiert aus einer Probe, die in 200 m Tiefe vor der Küste von Oregon gesammelt worden war, wiesen darauf hin, dass planktonische Archaea in dieser Zusammenstellung etwa 4,7 % der gesamten Biomasse des Pikoplankton umfassten (diese Zusammenstellung entspricht „PAC1"-200 m in Tabelle 1 von DeLong et al., high abundance of Archaea in Antarctic marine picoplankton, Nature, 371:695–698, 1994). Ergebnisse einer PCR-Amplifizierung von auf Archaea basierender rDNA, durchgeführt auf Agarose-Stopfen-Lysaten, bestätigten die Anwesenheit relativ großer Mengen an DNA von Archaea in dieser Probe. Agarose-Stopfen, die aus dieser Pikoplankton-Probe hergestellt worden waren, wurden zur nachfolgenden Herstellung einer Fosmid-Bibliothek ausgewählt. Jeder 1 ml-Agarose-Stopfen von dieser Stelle enthielt etwa 7,5 × 10⁵ Zellen, daher waren etwa 5,4 × 10⁵ Zellen in dem 72 μl-Streifen enthalten, der für die Herstellung der zum Teil gespaltenen DNA verwendet worden war.
Vektor-Arme wurden, wie beschrieben, aus pFOS1 hergestellt (Kim et al., Stable propagation of casmid sized human DNA inserts in an F factor based vector, NucI. Acids Res., 20:10832–10835, 1992). In Kürze, das Plasmid wurde vollständig mit AstII gespalten, mit HK-Phosphatase dephosphoryliert und dann mit BamHI gespalten, um zwei Arme zu erzeugen, von denen jeder eine cos-Stelle in der richtigen Ausrichtung zur Clonierung und Verpackung von ligierter DNA mit einer Größe von 35–45 kBp enthielt. Die zum Teil gespaltene Pikoplankton-DNA wurde über Nacht an die PFOS1-Arme in einer 15-μl-Ligierungsreaktionlösung ligiert, die je 25 ng Vektoren und Insertionen und 1 E T4-DNA-Ligase (Boehringer-Mannheim) enthielt. Die ligierte DNA in vier Mikrolitern dieser Reaktionslösung wurde in vitro unter Verwendung des Gigapack XL-Verpackungssystems (Stratagene) verpackt, die Fosmid-Partikel wurden in den E. coli-Stamm DH10B (BRL) transfiziert, und die Zellen wurden auf LB_cm15-Platten ausgestrichen. Die entstandenen Fosmid-Clone wurden in Mikroliterplatten mit 96 Vertiefungen übertragen, die LB_cm15, ergänzt mit 7 % Glycerin, enthielten. Rekombinante Fosmide, von denen jedes eine etwa 40 kB große Pikoplankton-DNA-Insertion enthielt, ergaben eine Bibliothek von 3552 Fosmid-Clonen, die etwa 1,4 × 10⁸ Basenpaare an clonierter DNA enthielten. Alle der untersuchten Clone enthielten Insertionen, die von 38 bis zu 42 kBp reichten. Diese Bibliothek wurde tiefgefroren bei –80°C zur späteren Analyse gelagert.
Beispiel 4
Untersuchung der enzymatischen Aktivität
Nachstehendes ist ein repräsentatives Beispiel für ein Verfahren zum Durchmustern einer Expressionsbibliothek, die im Einklang mit Beispiel 2 hergestellt worden ist. Im Nachstehenden sind die chemischen charakteristischen Ränge wie folgt:

Rang 1: Hydrolase
Rang 2: Amid, Ester und Acetal
Rang 3: Einteilungen und Untereinteilungen beruhen auf den Unterschieden zwischen einzelnen Substraten, die kovalent an die Funktionalität des Rang 2, die eine Reaktion durchläuft, gebunden sind; wie auch auf der Substratspezifität.
Rang 4: Die beiden möglichen enantiomeren Produkte, die das Enzym aus einem Substrat herstellen kann.

Obgleich das nachstehende Beispiel spezifisch auf die vorstehend genannten Ränge ausgerichtet ist, sind die allgemeinen Verfahrensschritte zur Untersuchung verschiedener chemischer Merkmale allgemein bei anderen Substraten als jenen, auf die speziell in diesem Beispiel Bezug genommen wird, anwendbar.
Durchmusterung auf Rang 1-Hydrolase; Rang 2-Amid.
Die elf Platten der Quellenbibliothek wurden verwendet, um eine einzelne Platte vielfach zu beimpfen (die „Kondensierte Platte"), die in jeder Vertiefung 200 μl LB-Amp/Meth, Glycerin enthielt. Dieser Schritt wurde unter Verwendung des High Density Replicating Tool (HDRT) von Beckman Biomek mit einem 1 % Bleich-, Wasser-, Isopropanol-, Lufttrocknungs-Sterilisationszyklus zwischen jeder Beimpfung durchgeführt. Jede Vertiefung der Kondensierten Platte enthielt auf diese Weise 11 unterschiedliche pBluescript-Clone aus jeder der elf Quellenbibliothek-Platten. Die Kondensierte Platte wurde über 2 h bei 37°C kultiviert und dann verwendet, um zwei weiße Dynatech-Mikrotitertochterplatten mit 96 Vertiefungen zu beimpfen, die in jeder Vertiefung 250 μl LB Amp/Meth, Glycerin enthielten. Die ursprüngliche kondensierte Platte wurde bei 37°C über 18 h inkubiert und dann bei –80°C gelagert. Die beiden kondensierten Tochterplatten wurden bei 37°C ebenfalls über 18 h inkubiert. Die kondensierten Tochterplatten wurden dann auf 70°C über 45 min erhitzt, um die Zellen abzutöten und die Enzyme des E. coli-Wirtes zu inaktivieren. Eine Stammlösung aus 5 mg/ml Morphoharnstoffphenylalanyl-7-amino-4-triflourmethyl-kumarin (MuPheAFC, das „Substrat") in DMSO wurde auf 600 μM mit 50 mM Hepes-Pufferlösung, pH-Wert 7,5, die 0,6 mg/ml Detergenz Dodecylmaltosid enthielt, verdünnt.
50 μl der 600 μM MuPheAFC-Lösung wurde in jede der Vertiefungen der weißen kondensierten Platten mit einem 100-μl-Mischzyklus unter Verwendung des Biomek zugegeben, um eine Endkonzentration an Substrat von ~100 mM zu erhalten. Die Fluoreszenzwerte (Anregung = 400 nm. Emission = 505 nm) wurden mit einem Plattenlese-Fluorometer unmittelbar nach Zugabe des Substrates (t = 0) aufgezeichnet. Die Platte wurde bei 70°C über 100 min inkubiert, man ließ sie dann zusätzliche 15 Minuten auf Umgebungstemperatur abkühlen. Die Fluoreszenzwerte wurden wiederum aufgezeichnet (t = 100). Die Werte bei t = 0 wurden von den Werten bei t = 100 substrahiert, um zu bestimmen, ob ein aktiver Clon vorlag.
Diese Daten zeigten, dass einer der elf Clone in Vertiefung G8 das Substrat hydrolysierte. Um den individuellen Clon, der die Aktivität aufwies, zu bestimmen, wurden die elf Platten der Quellenbibliothek aufgetaut und die einzelnen Clone verwendet, um einzeln eine neue Platte zu beimpfen, die LB Amp/Meth, Glycerin enthielt. Wie vorstehend wurde die Platte bei 37°C inkubiert, um die Zellen wachsen zu lassen, auf 70°C erhitzt, um die Enzyme der Wirtszellen zu inaktivieren, und 50 μl 600 μM MuPheAFC wurden unter Verwendung des Biomek zugegeben. Zusätzlich wurden drei andere Substrate untersucht. Das Methylumbelliferonheptanoat, das CBZ-Arginin-Rhodamin-Derivat und Fluorescein-konjugiertes Casein (~3,2 Mol Fluorescein pro Mol Casein).
Umbelliferon und Rhodamin wurden als 600 μM Stammlösungen in 50 μl Hepes-Pufferlösung zugegeben. Das Fluorescein-konjugierte Casein wurde ebenfalls in 50 μl in einer Stammkonzentration von 20 und 200 mg/ml zugegeben. Nach Zugabe der Substrate wurden die t = 0-Fluoreszenzwerte aufgezeichnet, die Platte wurde bei 70°C inkubiert, und die Werte für t = 100 min wurden wie vorstehend aufgezeichnet.
Diese Daten zeigten, dass sich der aktive Clon auf Platte 2 befand. Das Arginin-Rhodamin-Derivat wurde durch diese Aktivität ebenfalls umgesetzt, aber das Lipase-Substrat, Methylumbelliferonheptanoat, und das Protein, Fluorescein-konjugiertes Casein, dienten nicht als Substrate.
Auf den vorstehenden Daten beruhend ergibt die Klassifizierung nach Rang 1 „Hydrolase" und die Klassifizierung nach Rang 2 ergibt Amidbindung. Es besteht keine Kreuzreaktion mit der Ester-Klassifizierung in Rang 2.
Wie in 2 dargestellt, kann ein rekombinanter Clon aus der Bibliothek, der in Rang 1 als Hydrolase und in Rang 2 als Amid charakterisiert worden ist, in Rang 3 auf verschiedene Spezifitäten untersucht werden. In 2 folgt den verschiedenen Klassen des Rangs 3 ein parenthetischer Code, der die Substrate der Tabelle 1 identifiziert, die zur Identifizierung solcher Spezifitäten in Rang 3 verwendet werden.
Wie in den 3 und 4 dargestellt, kann ein rekombinanter Clon, der in Rang 1 als Hydrolase und in Rang 2 als Ester charakterisiert worden ist, in Rang 3 auf verschiedene Spezifitäten untersucht werden. In den 3 und 4 folgt den verschiedenen Klassen des Rangs 3 ein parenthetischer Code, der die Substrate der Tabellen 2 und 2 identifiziert, die zur Identifizierung solcher Spezifitäten in Rang 3 verwendet werden. In den 3 und 4 repräsentiert R₂ den Alkohol-Abschnitt des Esters, und R₁ repräsentiert den Säure-Abschnitt des Esters.
Wie in 5 dargestellt, kann ein rekombinanter Clon aus der Bibliothek, der in Rang 1 als Hydrolase und in Rang 2 als Acetal charakterisiert worden ist, in Rang 3 auf verschiedene Spezifitäten untersucht werden. In 5 folgt den verschiedenen Klassen des Rangs 3 ein parenthetischer Code, der die Substrate der Tabelle 4 identifiziert, die zur Identifizierung solcher Spezifitäten in Rang 3 verwendet werden.
Enzyme können in Rang 4 nach der Chiralität des Produktes (der Produkte), das durch die Enzyme erzeugt wird, klassifiziert werden. Zum Beispiel können chirale Aminoester bestimmt werden, indem mindestens die nachstehenden Substrate verwendet werden:
Für jedes Substrat, das umgesetzt worden ist, wird der enantioselektive Wert, E, nach der nachstehenden Gleichung bestimmt:
worin ee_p = der enantiomere Überschuss (ee) des hydrolysierten Produktes und c = die prozentuale Umsetzung der Reaktion ist. Vgl. Wong und Whitesides, Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, 1994, Elsevier, Tarrytown, NY, S. 9–12.
Der enantiomere Überschuss wird entweder durch chirale Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder durch chirale Kapillarelektrophorese (CE) bestimmt. Die Untersuchungen werden wie folgt durchgeführt: 200 μl der geeigneten Pufferlösung werden in jede Vertiefung einer weißen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben, gefolgt von 50 μl partiell oder vollständig gereinigter Enzymlösung: 50 μl Substrat wird zugegeben, und der Anstieg der Fluoreszenz gegen die Zeit wird beobachtet, bis 50 % des Substrates verbraucht worden sind oder die Reaktion stoppt, was auch immer zuerst eintritt.
Enantioselektivität wurde für eine der Esterasen, die wie folgt identifiziert wurde, bestimmt. Für die Reaktion zur Bildung (Transveresterung) oder Spaltung (Hydrolyse) von α-Methylbenzylacetat wurde die Enantioselektivität des Enzyms erhalten, indem bestimmt wurde: ee c (der enantiomere Überschuss (ee) des nicht umgesetzten Substrates), ee_p (der ee des hydrolysierten Produktes) und c (die prozentuale Umsetzung der Reaktion). Der enantiomere Überschuss wurde durch chirale Hochleistungsgaschromatographie (GC) bestimmt. Die Bedingungen für die Chromatographie waren wie folgt:

Herstellung der Probe: Die Proben wurden durch einen 0,2-μm- PTFE-Filter mit einem Durchmesser von 13 mm gefiltert.
Säule: Supelco β-DEX 120, 0,25 mm ID. 30 m, 0,25 μm d_f.
Ofen: 90°C über 1 min, dann 90°C bis 150 °C zu 5°C/min.
Trägergas: Helium, 1 ml/min über 2, dann 1 ml/min bis 3 ml/min zu 0,2 ml/min. Detektor: FID, 300°C.
Injektion: 1 μl (1 mM Substrat in Reaktionslösungsmittel), Aufteilung (1:75), 200°C.

Die Transveresterungsreaktion wurde nach der in: Organic solvent tolerance. Water immiscible solvents beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt. Vgl. nachstehend.
Transveresterung mit Enzym ESL-001-01 ergab die nachstehenden Ergebnisse:

Lösungsmittel % ee_s % ee_p % c

n-Heptan 10,9 44,3 19,8

Toluol 3,2 100 3,1
Die Hydrolysereaktion wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt: 50 μl einer 10 mM Lösung aus α-Methylbenzylacetat in 10 % wässrigem DMSO (Vol./Vol.) wurde zu 200 μl 100 mM Phosphatpufferlösung, pH-Wert 6,9, zugegeben. Zu dieser Lösung wurden 250 μl Enzym ESL-001-01 (2 mg/ml in 100 mM Phosphatpufferlösung, pH-Wert 6,9) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde auf 70°C über 15 min erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde nach der nachstehenden Verfahrensweise aufgearbeitet: Entfernen von 250 μl des Hydrolyse-Reaktionsgemisches und Zugeben in ein 1-ml-Eppendorf-Röhrchen. Zugeben von 250 μl Ethylacetat und kräftiges Schütteln über 30 Sekunden. Zulassen der Phasentrennung über 15 Minuten. Abpipettieren von 200 μl der obenauf liegenden organischen Phase und Filtern durch einen 0,2-μm-PTFE-Filter mit 4 mm Durchmesser. Analysieren durch chirale GC wie vorstehend.
Hydrolyse mit Enzym ESL-001-01 ergab die nachstehenden Ergebnisse:

% ee_s % ee_p %c

99,3 100 0,7
Beispiel 5
Untersuchen eines rekombinanten Clons auf physikalische Merkmale
Dieses Beispiel beschreibt Vorgehensweisen zur Untersuchung eines rekombinanten Clons aus einer Bibliothek auf bestimmte physikalische Merkmale.
pH-Wert-Optima.
200 μl 4-Methylumbelliferyl-2,2-dimethyl-4-pentenoat wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zugegeben und von Säule 1 bis 12 seriell verdünnt. 50 μl der geeigneten 5 × pH-Wert-Pufferlösung wurden zu jeder Reihe der Platte zugegeben, so dass die Reaktionsgeschwindigkeit bei acht verschiedenen pH-Werten auf einer einzigen Platte untersucht wurde. 20 μl Enzym ESL-001-01 (Verdünnung 1:3000 aus einer 1 mg/ml-Stammlösung) wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, um die Reaktion zu starten. Der Anstieg der Absorption bei 370 nm bei 70°C wurde verfolgt, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen; die Geschwindigkeit gegen Substratkonzentration wurde in die Michaelis-Menten-Gleichung eingesetzt, um V_Max für jeden einzelnen pH-Wert zu bestimmen.
Das Enzym ESL-001-01 ergab die in 6 dargestellten Ergebnisse.
Temperatur-Optima.
In eine 1-ml-Thermostat-Küvette wurden 930 μl 50 mM-Hepes-Pufferlösung, pH-Wert 7,5, gegeben; nach Temperaturäquilibrierung 50 μl Enzym ESL-001-01 (Verdünnung 1:8000 von einer 1-mg/ml-Stammlösung in Hepes-Pufferlösung) und 20 μl 5 mM 4-Methyl-umbelliferyl-heptanoat, das 30 mg/ml Dodecylmaltosid enthielt. Die Anstiegsrate der Absorption bei 370 nm wurde bei 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 und 90°C gemessen.
Enzym ESL-001-01 ergab die in 7 dargestellten Ergebnisse.
Temperaturstabilität.
Proben mit 1 ml des Enzyms ESL-001-01 (Verdünnung 1:4000 aus einer 1-mg/ml-Stammlösung in Hepes-Pufferlösung) wurden bei 70, 80 und 90°C inkubiert. Zu ausgewählten Zeitpunkten wurden 25-μl-Aliquots entnommen und wie vorstehend auf einer Miktotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit 200 μl 100 μM 4-Methyl umbelliferyl-palmitat und 0,6 mg/ml Dodecylmaltosid untersucht. Diese Daten wurden verwendet, um die Halbwertszeit für die Inaktivierung des Enzyms zu bestimmen.
Enzym ESL-001-01 ergab die nachstehenden Ergebnisse:

Temperatur Halbwertszeit

90 23 min

80 32 min

70 110 h
Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln.
Mit Wasser vermischbare Lösungsmittel (Dimethylsulfoxid (DMSO) und Tetrahydrofuran (THF)).
30 μl 1 mM 4-Methylumbelliferyl-butyrat in dem organischen Lösungsmittel wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. 240 μl Gemisch aus Pufferlösung und organischem Lösungsmittel (vgl. nachstehende Tabelle) wurden in die Vertiefungen der Platte zugegeben, gefolgt von 30 μl eines Enzyms ESL-001-01 (Verdünnung 1: 50.000 aus einer 1 mg/ml-Stammlösung in 50 mM MOPS-Pufferlösung, pH-Wert 6,9) und Inkubation bei 70°C. Der Anstieg der Fluoreszenz (Ex = 360 nm; EM = 440 nm) wurde gegenüber der Zeit aufgezeichnet, um die relativen Aktivitäten zu bestimmen.

μl organisches Lösungsmittel μl Pufferlösung Endgehalt an organischem Lösungsmittel in %

240 0 90

195 45 75

150 90 60

120 120 50

90 150 40

60 180 30

30 210 20

0 240 10
Enzym ESL-001-01 OI ergab die in 8 dargestellten Ergebnisse.
Nicht mit Wasser vermischbare Lösungsmittel (n-Heptan, Toluol).
1 ml des Lösungsmittels wurde in ein Gefäß gegeben, der 1 mg lyophilisiertes Enzym ESL-001-01 und einen Rührstab enthielt. 10 μl 100 mM 1-Phenethylalkohol und 10 μl 100 mM Vinylacetat wurden in den Kolben zugegeben, und der Kolben wurde in einem Heizblock bei 70°C über 24 h gerührt. Die Probe wurde durch einen 0,2 μm-PTFE-Filter mit 4 mm Durchmesser gefiltert und mit chiraler GC wie vorstehend analysiert. Vgl. den vorstehenden Abschnitt für die Daten.
Spezifische Aktivität.
Die spezifische Aktivität wurde bestimmt, indem 100 μM 4-Methylumbelliferyl-heptanoat bei 90°C in MOPS-Pufferlösung, pH-Wert 6,9 verwendet wurde. Die für Enzym ESL-001-01 erhaltene spezifische Aktivität betrug 1662 μMol/min·mg.
Beispiel 6
Untersuchen eines rekombinanten Clons auf Substratspezifität
Dieses Beispiel beschreibt Vorgehensweisen zur Untersuchung eines rekombinanten Clons aus einer Bibliothek auf Substratspezifität.
Fingerabdruck des Substrats.
Von jedem der nachstehenden Substrate wurden 1 und 1/4 millimolare Lösungen, die 1 mg/ml Dodecylmaltosid in 50 mM MOPS-Pufferlösung, pH-Wert 6,9, enthielten, hergestellt:
4-Methylumbelliferyl-acetat (A)
4-Methylumbelliferyl-propanoat (B)
4-Methylumbelliferyl-butyrat (C)
4-Methylumbelliferyl-heptanoat (D)
4-Methylumbelliferyl-α-methylbutyrat (E)
4-Methylumbelliferyl-β-methylcrotonoat (F)
4-Methylumbelliferyl-2,2-dimethyl-4-pentenoat (G)
4-Methylumbelliferyl-Adipinsäure-Monoester (H)
4-Methylumbelliferyl-1,4-cyclohexan-dicarboxylat (I)
4-Methylumbelliferyl-benzoat (M)
4-Methylumbelliferyl-p-trimethylammonium-cinnamat (N)
4-Methylumbelliferyl-4-guanidinbenzoat (O)
4-Methylumbelliferyl-α-methylphenylacetat (P)
4-Methylumbelliferyl-α-methoxyphenylacetat (Q)
4-Methylumbelliferyl-palmitat (S)
4-Methylumbelliferyl-stearat (T)
4-Methylumbelliferyl-oleat (U)
4-Methylumbelliferyl-elaidat (W).
200 μl von jeder der vorstehenden Lösungen wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben, gefolgt von 50 μl Enzym ESL-001-01 (Verdünnung 1:2000 aus einer 1 mg/ml-Stammlösung in MOPS-Pufferlösung) und Inkubation bei 70°C über 20 Minuten. Die Fluoreszenz (EX = 360 nm, EM = 440 nm) wurde gemessen, und die Fluoreszenz auf Grund der nicht-enzymatischen Hydrolyse wurde subtrahiert. Tabelle 5 stellt die relative Fluoreszenz für jedes der vorstehenden Substrate dar.
Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind im Lichte der vorstehenden Lehren möglich; daher kann die Erfindung innerhalb des Rahmens der Ansprüche auch anders als im Einzelnen beschrieben durchgeführt werden. Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5

VERBINDUNG RELATIVE FLUORESZENZ

A 60.6

B 73.6

C 100.0

D 84.2

E 29.1

F 5.4

G 7.1

H 0.9

I 0.0

M 9.4

N 0.5

O 0.5

P 4.0

Q 11.3

S 0.6

T 0.1

U 0.3

W 0.2

Claims

Verfahren zum Gewinnen einer rekombinanten Enzymbibliothek, die von verschiedenen Mikroorganismen abgeleitet ist, umfassend: Screenen rekombinanter Proteine, die von einer Vielzahl von Expressionsclonen hergestellt sind, die von verschiedenen Mikroorganismen abgeleitet sind, wobei das Screenen durchgeführt wird, um die Clone, die rekombinante Enzyme herstellen, zu bestimmen, und um eine Vielzahl verschiedener Enzymeigenschaften für die rekombinanten Enzyme zu bestimmen; und Klassifizieren der rekombinanten Enzyme anhand der Enzymeigenschaften, wodurch die rekombinante Enzymbibliothek gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Screenen einschließt: Screenen der rekombinanten Enzyme hinsichtlich einer chemischen Eigenschaft, und erneutes Screenen der rekombinanten Enzyme, die die chemische Eigenschaft haben, hinsichtlich einer zweiten chemischen Eigenschaft.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Screenen einschließt: Screenen der rekombinanten Enzyme hinsichtlich einer oder mehrerer Eigenschaften ausgewählt aus Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Screenen des weiteren erneutes Screenen der rekombinanten Enzyme hinsichtlich einer oder mehrerer spezifizierter chemischer Funktionalitäten einschließt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, wobei das Screenen ein Screenen der rekombinanten Enzyme hinsichtlich einer oder mehrerer physikalischer Eigenschaften einschließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, des weiteren umfassend den Schritt des Identifizierens der Clone, die die rekombinanten Enzyme herstellen.
Verfahren nach Anspruch 6, des weiteren umfassend den Schritt des Sequenzierens der identifizierten Clone, um die das Enzym codierende DNA-Sequenz zu identifizieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Mikroorganismen nicht-gezüchtete Mikroorganismen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Mikroorganismen einer Umweltprobe entnommen sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Mikroorganismen Extremophile sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Extremophilen Thermophile, Hyperthermophile, Psychrophile und Psychrotrophe sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Umweltprobe aus arktischem oder antarktischem Eis, Wasser, Permafrost, Vulkanen, Erde oder Pflanzen in tropischen Regionen entnommen ist.