DE69608122T3 - Mikroverkapselte dna zur impfung und gentherapie - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung DNS enthaltender Mikroteilchen.
  • Das biologisch abbaubare Polymer Poly-(DL-lactid-co-glycolid) (PLG) ist für viele Jahre von der pharmazeutischen Industrie eingesetzt worden, um Wirkstoffe und biologische Materialien in Form von Mikroteilchen in-vivo zu verabreichen. Die Federal Drug Authority der Vereinigten Staaten (FDA) hat in jüngerer Zeit ein 30-Tage-Übermittlungssystem mit PLG-Mikrokugeln für Leuprolidacetat (Lupran Depot (eingetragenes Warenzeichen)) zur Verwendung in der Behandlung von Prostatakrebs zugelassen. Ein nützlicher Review der Möglichkeiten der Polymer-Mikroverkapselungstechnologie für Vakzinanwendungen findet sich in Vakzine, 1994, Band 12, Nr. 1, Seiten 5–11, von William Morris et al.
  • Als eine Alternative zur Verkapselung ist es ebenso bekannt, Antigene in Liposome genannten Phospholipidvesikeln zu übermitteln, wie beispielsweise von D. A. Eppstein et al. in Crit. Rev. Ther. Drug Carrier System. 1988, 5 (2), Seiten 99–139, beschrieben. Es wird berichtet, dass eine Anzahl von Antigenen intraperitoneal unter Verwendung von Liposomen übermittelt worden sind, eingeschlossen das Choleratoxin, das Malaria-Sporozoid-Protein und das Tetanustoxoid, und dass das Influenzaantigen intranasal übermittelt worden ist.
  • Es ist außerdem bekannt, dass in bestimmten Umständen die Injektion von nackter DNS in Gewebe zur Expression eines von der DNS kodierten Genprodukts führen kann. Beispielsweise berichtete eine Arbeit am US-NHI 1984, dass die intrahepatische Injektion von nackter, clonierter PlasmidDNS der Eichhörnchen-Hepatitis sowohl eine virale Infektion als auch die Bildung von antiviralen Antikörpern in den Eichhörnchen erzeugte.
  • Die WO-A-95/05853 beschreibt Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen für die Verabreichung von nackten Polynucleotiden, die biologisch aktive Peptide kodieren. Diese veröffentlichte Anmeldung beschreibt unter anderem die Injektion von nackter DNS, die für ein immunogenes Antigen kodiert, mit dem Ziel, Antikörper im Empfänger der nackten DNS zu erzeugen.
  • Die liposomale Übermittlung von DNS ist ebenfalls bekannt und ist beispielsweise in der EP-A-0475178 beschrieben.
  • Ein alternatives Verfahren zum Erhalten der Expression eines gewünschten Genprodukts ist in der EP-A-0161640 beschrieben, in der ein bovines Wachstumshormon exprimierende Mäusezellen verkapselt und in eine Kuh implantiert werden, um in dieser die Milchproduktion zu erhöhen.
  • Die EP-A-0248531 beschreibt die Verkapselung von linearem Poly-(I:C) in Mikrokapseln und die Verwendung derselben zur Induktion der Produktion von Interferon.
  • WO-A-94/23738 soll ein DNS enthaltendes Mikroteilchen in Kombination mit einem Konjugat beschreiben, das die Aufnahme der DNS erleichtert und zellulär zielrichtet. In den Ausführungsbeispielen ist die Bombardierung von Zellen mit Wolfram enthaltenden Mikroteilchen beschrieben. Diese Beispiele scheinen sich wenig von der herkömmlichen Bombardierung von Zellen mit mit DNS beschichteten Metallteilchen zu unterscheiden. Weiterhin wird die Ultraschallbeschallung bei der Herstellung der Mikroteilchen vorgeschlagen, ein Schritt, von dem bekannt ist, dass er das Risiko der Beschädigung der DNS birgt; die vorliegenden Daten sind jedoch nicht angemessen und ungeeignet, um die Integrität der verkapselten DNS zu ermitteln.
  • In der vorliegenden Erfindung ist es erwünscht, DNS in-vivo zu übermitteln, die für Proteine mit immunogener, enzymatischer oder anders nützlicher biologischer Aktivität kodiert, üblicherweise unter der Kontrolle eines aktiven eukaryotischen Promotors. Die Aufgaben der Erfindung umfassen die Verbesserung von im Stand der Technik bekannten Impftherapien und die Verbesserung von Gentherapieverfahren des Standes der Technik.
  • Die Verbesserung von oder Alternativen zu vorhandenen Zubereitungen und Verfahren sind erwünscht, da diese vorhandenen Verfahren bekanntermaßen eine Anzahl von Nachteilen umfassen.
  • Die WO-A-95/05853 beschreibt die Verabreichung von nackten Polynucleotiden, die für die gewünschten Genprodukte kodieren. Die Zusammensetzungen und Verfahren in dieser Veröffentlichung sind jedoch nur für die Injektion geeignet, was sterile Vorgehensweisen erfordert und selbst eine unangenehme und schwierige Administrationsroute darstellt.
  • Die WO-A-94/23738 gibt vor, ein Verfahren bereitzustellen, in dem verkapselte DNS aus den Teilchen im Körper des Empfängers freigesetzt und anschließend von den Zellen aufgenommen wird, obwohl keine durchgeführten in-vivo Beispiele präsentiert werden.
  • Es ist bekannt, dass DNS leicht beschädigt wird, so dass sie die Expression eines Genprodukts nicht länger induzieren kann. Überraschenderweise haben die Erfinder erfolgreich ein Verfahren oder eine Technik zum Verkapseln von DNS in Polymerteilchen entwickelt, so dass die DNS ausreichend Integrität beibehält, um die Expression eines von ihr kodierten Genprodukts zu induzieren.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Verkapseln von DNS in einem Polymer bereit, so dass die biologische Aktivität der DNS in signifikantem Maß erhalten bleibt. In einer Ausführungsform des zweiten Aspekts umfasst ein Verfahren zum Verkapseln von DNS in einem Polymerteilchen, wobei die DNS die Expression einer kodierenden Sequenz in der DNS induzieren kann, die Herstellung einer (Wasser-in-Öl)-in-Wasser-Emulsion zur Bildung von Mikroteilchen und anschließendes Abtrennen der hergestellten, DNS enthaltenden Mikroteilchen mittels Zentrifugation. Die erhaltenen Mikroteilchen haben vorzugsweise Größen im Bereich von 0,01 'Am bis 10 gm, stärker bevorzugt 1 bis 10.
  • Das Verfahren der Erfindung wird unter Bedingungen durchgeführt, die sicherstellen, dass mindestens ein Teil der DNS während der Herstellung der Teilchen nicht beschädigt wird und dadurch seine Fähigkeit erhalten bleibt, die Expression des Gens seiner kodierenden Sequenz zu induzieren.
  • Es ist wesentlich, dass DNS in die Mikroteilchen inkorporiert wird, und die DNS-Inkorporation wird durch Herstellung einer Lösung der DNS mit einem Alkohol, Zufügen des Mikro-teilchenpolymeren und Bilden der Mikroteilchen aus demselben erhöht. Der Alkoholgehalt der Lösung variiert geeigneterweise zwischen 1% und 60%, vorzugsweise zwischen 5% und 40%. In spezifischen Ausführungsformen der Erfindung liegt der Alkoholgehalt um 15 bis 35%, spezieller 20 bis 30% für Mikroteilchen aus PLG, was eine DNS-Inkorporation von 25% und darüber bis zu 50 bis 60% erzeugt. Ethanol ist besonders geeignet; Methanol und Propanol sowie andere Alkohole, die DNS nicht denaturieren, sind ebenfalls geeignet, und bei dem Alkohol handelt es sich vorzugsweise um einen geradkettigen oder verzweigten C2-C10-Alkohol.
  • Es ist ebenso bevorzugt, dass der oder die Emulgationsschritte des Verfahrens unter Bedingungen verringerter Scherbelastung durchgeführt werden und dieses wird wahlweise durch Verwendung einer Emulgationsgeschwindigkeit erzielt, die ausreichend ist, um eine Emulsion zu erhalten und Mikroteilchen im gewünschten Größenbereich zu bilden, jedoch nicht so hoch ist, dass die gesamte DNS durch übermäßige Scherung beschädigt wird. In einer Ausführungsform der Erfindung, die unten beschrieben ist, wird die Geschwindigkeit des Mixers zum Emulgieren so modifiziert, dass mindestens 25% der DNS-Aktivität (getestet über die Transformation von kompetenten Bakterien oder die Transfektion kultivierter Zellen) in den erhaltenen Mikroteilchen, die DNS enthalten, erhalten bleibt. Geeignete Geschwindigkeiten liegen unterhalb von 8000 UpM, vorzugsweise unterhalb 6000 UpM und in einer unten beschriebenen spezifischen Ausführungsform beträgt die Geschwindigkeit etwa 3000 UpM.
  • Das Verfahren kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, was für Labor- und industrielle Zwecke günstig ist, und kann ebenso unterhalb von Raumtemperatur durchgeführt werden, was die Stabilität der Plasmid-DNS während des Verkapselungsvorganges verbessert. Die Temperatur des Verfahrens kann auf unterhalb von 20°C, unterhalb von 10°C oder sogar unterhalb von 5°C verringert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren unterhalb von Raumtemperatur durchgeführt, unter Anwendung einer geringeren Menge an Mikroteilchen-Precursor oder Mikroteilchen-Vorläufer, verglichen zu der bei Raumtemperatur verwendeten Menge.
  • Die Parameter des Verfahrens werden somit so gewählt, dass sie die Bildung von Mikroteilchen mit einem Durchmesser von 10 gm oder darunter fördern und dass sie die Inkorporation von DNS in die Mikroteilchen fördern und eine solche Beschädigung der DNS vermeiden, dass die DNS im Empfänger nicht mehr exprimiert werden kann.
  • Für jede spezielle Wahl von Polymer und DNS können Variationen im Verfahren notwendig sein, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Die Effizienz eines Verfahrens kann mittels Transformations- oder Transfektionstests überprüft werden. Im Transformationstest, der von den Erfindern verwendet wurde, wird die DNS aus den Mikroteilchen über Lösung mit einem organischen Lösungsmittel zurückgewonnen, quantifiziert und zur Transformation von Bakterien eingesetzt – Ampicillin-Selektion bestimmt erfolgreiche Transformanten. Im Transfektionstest wird die zurückgewonnene DNS verwendet, um eukaryotische Zellen in Kultur zu transfizieren, wobei die Kultur anschließend auf die Anwesenheit des Antigens oder Gentherapieprodukts getestet wird. Diese Tests haben gezeigt, dass die aus den Mikroteilchen zurückgewonnene DNS, die über das Verfahren der Erfindung hergestellt waren, 50 bis 60% und bis zu 80% der Aktivität der ursprünglichen DNS aufrechterhalten kann, was eine hohe Effizienz der Inkorporation von funktionaler DNS in die Mikroteilchen anzeigt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung bereitgestellt, umfassend die Herstellung eines DNS-Konstrukts zur Expression einer kodierenden Sequenz in dem Konstrukt und Ausbilden eines Polymerteilchens mit einer Größe zwischen 0,01 gm und 10 gra um das Konstrukt herum, worin das Konstrukt fähig bleibt, die Expression der kodierenden Sequenz zu induzieren. Bei der Verwendung induziert das Konstrukt dann, wenn es von dem Teilchen getrennt wird, die Expression der kodierenden Sequenz. Das Teilchen wird vorzugsweise durch Emulgieren einer Lösung eines Polymeren mit DNS und Alkohol gebildet.
  • Das Verfahren der Erfindung ist daran angepasst, pharmazeutische Zusammensetzungen des ersten Aspekts der Erfindung herzustellen. Die Schritte des Verfahrens sind so adaptiert, dass in einer erhaltenen Zusammensetzung, die viele DNS enthaltende Polymerteilchen enthält, ein geeigneter Anteil der Teilchen aktive DNS enthält, das heißt eine DNS, die nicht durch das Verfahren so beschädigt wurde, dass ihre Fähigkeit zur Induktion der Expression ihrer kodierenden Sequenz verloren geht. Die DNS-Aktivität wird als Prozentanteil der Aktivität vor dem Schritt der Teilchenbildung gemessen.
  • Ein annehmbares Maß bzw. ein annehmbarer Level an biologischer DNS-Aktivität liegt bei mindestens 10% und vorzugsweise mindestens 25%, obwohl für ganz besonders fragile DNS ein niedrigerer Prozentsatz annehmbar sein kann, solange sich bei der Anwendung eine therapeutische Wirkung von der Zusammensetzung zeigt.
  • In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wird eine Zusammensetzung durch Herstellen einer Lösung eines Plasmids doppelsträngiger, supercoiled DNS, umfassend eine kodierende Sequenz und einen eukaryotischen Promotor, hergestellt. Getrennt hiervon wird eine Polymerlösung hergestellt. Die zwei Lösungen werden zusammengemischt und mit einer Geschwindigkeit zwischen 1000 und 4000 UpM emulgiert. Eine Lösung eines Stabilisierungsmittels wird anschließend zugefügt und die neue Mischung mit einer Geschwindigkeit zwischen 1000 und 4000 UpM emulgiert. Nach Zentrifugation und Resuspension der Teilchen behält die DNS innerhalb 25% ihrer Aktivität bei.
  • In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung, die unten in einem Beispiel beschrieben ist, ist das Teilchenmaterial PLG. Die Größe der Teilchen, die über das Verfahren der Erfindung hergestellt werden, liegt im Allgemeinen im Bereich von 0,01 bis 10 gm, vorzugsweise 1 bis 10 gm. Andere geeignete Polymerformulierungen für DNS enthaltende Teilchen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Polymilchsäure, Polyhydroxybutyrat, Polyhydroxyvalerat, Poly(hydroxybutyrat/valerat), Ethylcellulose, Dextran, Polysaccharide, Polyalkylcyanoacrylate, Polymethylmethacrylat, Poly(e-caprolacton) und Mischungen all dieser Komponenten ein.
  • In Anwendung einer speziellen Ausführungsform der Erfindung, die unten in einem Beispiel beschrieben ist, umfasst eine Herstellung von Mikroteilchen gemäß der vorliegenden Erfindung für das Protein Luciferase kodierende DNS. Wie für den Fachmann ersichtlich ist, ist ein weiter Bereich von DNS-Sequenzen und -Konstrukten für die Anwendung in der Erfindung geeignet. Insbesondere kann die Erfindung durch Inkorporieren eines weiten Bereichs von im Stand der Technik wohlbekannten und charakterisierten Plasmidvektoren in die Praxis umgesetzt werden. Typischerweise wird ein in dieser Verwendung verwendeter Plasmidvektor eine cDNS umfassen, die für das gewünschte Genprodukt kodiert. Die Wahl weiterer Komponenten für die DNS-Sequenz wie Promotoren, Indikatorgene und Transkriptionsterminationssequenzen können vom Fachmann gemäß allgemeinem Wissen über die Konstruktion bekannter Plasmidvektoren getroffen werden.
  • Es ist bekannt, dass die Aufnahme von Mikroteilchen mit einer Größe von weniger als 10 gm unter anderem in den M-Zellen des Dünndarms auftritt und dass der Einschluss von DNS enthaltenden Teilchen in diesem Größenbereich vorteilhaft zum Fördern der Aufnahme an diesem Dünndarmort sein kann. Andere Modifikationen an der Natur und der Art und den Komponenten Polymeren können im Konzept der Erfindung vorgenommen werden.
  • Es folgt nun eine Beschreibung spezifischer Ausführungsformen der Erfindung, begleitet von Abbildungen, in denen:
  • 1 eine schematische Darstellung der Komponenten eines protein-exprimierenden Plasmids ist, geeignet für die Inkorporation in DNS enthaltenden Teilchen bzw. Partikeln gemäß der Erfindung;
  • 2 die Ergebnisse aus Beispiel 3, insbesondere die Induktion der luciferasespezifischen Serumantikörper über PLG-verkapselte Plasmid-DNS veranschaulicht, in der die linke Säule den Antikörpertiter nach drei Wochen und die rechte Säule den Antikörper nach sechs Wochen anzeigt (i.m. steht für intramuskulär, i.p. steht für intraperitoneal, der untere Teil jeder Säule repräsentiert IgG-Level, der obere Teil repräsentiert IgM-Level);
  • 3 zeigt Daten der Dosisantwort für injizierte und orale Dosen verkapselter DNS mit dem Titer von IgG, IgM und IgA in jedem Fall;
  • 4 zeigt: A – Agarose-Gelelektrophorese von PlasmidDNS nach Homogenisierung in einem Silverson-Mixer bei 2000 und 8000 UpM für 0 bis 300 Sekunden; und B Agarose-Gelelektrophorese von DNS vor und nach der Verkapselung;
  • 5 zeigt die Antiluciferase-IgA-Antwort auf DNS in PLG-Mikroteilchen im Stuhl;
  • 6 zeigt das Ergebnis der oralen Verabreichung von PLG-verkapselter DNS, die das N-Protein des Masernvirus exprimiert; und
  • 7 zeigt die Ergebnisse der oralen Verabreichung von PLG-verkapselter DNS, die das VP6-Gen des Rotavirus exprimiert: A – fäkale, rotavirus-spezifische IgA-Antwort, B – Rotavirus-Abstoßung nach Infektion oral immunisierter Mäuse.
  • Beispiel 1
  • Verfahren zur Verkapselung von Plasmid-DNS in PLGMikroteilchen
  • Ausstattung:
    • 1) Silverson-Labormixer mit 3/4'' Sonde, ausgestattet mit einem Emulgatorschirm.
    • 2) Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
    • 3) Übliche Laborglasartikel, Kolben, Messzylinder, Rührer usw.
  • Reagenzien:
    • 1) Poly(Lactid-co-Glycolid)-Lösung (PLG-Lösung) – 500 mg in 3 ml Dichlormethan.
    • 2) Plasmid-DNS (12 mg/ml in Wasser).
    • 3) Polyvinylalkohol-Lösung (PVA-Lösung) (8% Gewicht/Volumen in Wasser).
    • 4) Absoluter Ethanol.
    • 5) TEN-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, + 1 mM EDTA + 50 mMNaCl).
  • Verfahren:
    • 1) Mische 200 gl Plasmid-DNS-Lösung mit 250 gl TEN und füge 150 gl Ethanol unter Rühren hinzu; gut mischen.
    • 2) Gib dieses Gemisch zu 3 ml PLG-Lösung hinzu und emulgiere im Silverson-Mixer bei 3000 UpM für 2 Minuten.
    • 3) Füge diese Emulsion zu 100 ml PVA hinzu und emulgiere bei 3000 UpM für 2 Minuten.
    • 4) Füge die doppelte Emulsion zu 1 1 Wasser hinzu und rühre 1 Minute lang heftig.
    • 5) Verteile die Suspension der Mikroteilchen in Zentrifugenbehältern und zentrifugiere 30 Minuten lang mit 10.000 × gav.
    • 6) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser und homogenisiere mit einem handgetriebenen Homogenisator mit großer Toleranz (0,5 mm) zur Herstellung einer homogenen Suspension. Verdünne mit 200 ml Wasser und zentrifugiere nochmals wie oben.
    • 7) Wiederhole Schritt 6 3-mal.
    • 8) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser wie oben, überführe in ein für die Gefriertrocknung geeignetes Gefäß, rollschichtgefriere in einem Gemisch aus Isopropanol und Trockeneis und lyophilisiere für 48 Stunden.
  • In diesem Verfahren werden die Schritte 1–3 bei Raumtemperatur durchgeführt. Die DNS wurde in die Mikroteilchen mit einer Effizienz von etwa 25% inkorporiert.
  • Beispiel 2
  • Plasmide für die Expression von Proteinen nach in-vivo Übermittlung
  • Für die Verwendung in Mikroteilchen gemäß der Erfindung geeignete Plasmide, bestehend aus den folgenden Komponenten (siehe I):
    • 1. Plasmid-Rückgrat: Das Plasmid-Rückgrat weist einen Replikationsursprung und ein Antibiotika-Resistenzgen oder anderen selektierbaren Marker auf, um den Aufrechterhalt des Plasmids in dem bakteriellen Wirt zu gestatten. Rückgrate, die eine hohe Kopienzahl bereitstellen, erleichtern die Produktion der Plasmid-DNS. Ein Beispiel würde aus den pUC-Plasmidvektoren stammen.
    • 2. Transkriptionspromotorsequenz: Die Expression des gewünschten Proteins wird von einem typischerweise eukaryotischen Transkriptionspromotor getrieben, der die Synthese von mRNS initiiert. Im Allgemeinen sollen starke Promotoren, die in einem weiten Bereich von Gewebetypen und Tierspezies funktionieren, verwendet werden, beispielsweise der human Cytomegalovirus-Immediate-Early-Promotor (hCMV IE). Vorzugsweise kann jedoch für Gentherapieanwendungen ein gewebe- oder zelltyp-spezifischer Promotor angemessener sein.
    • 3. Kodierende Sequenz: Die kodierende Sequenz enthält die DNS-Sequenz, die für das interessierende Protein kodiert. Sie enthält das Translationsstartcodon ATG in Sequenzkontext, der für die Initiation der Proteinsynthese zu bevorzugen ist. Die zu kodierende Sequenz endet mit einem Translationsterminationscodon. Zu exprimierende Proteine umfassen a) Indikatorenzyme (beispielsweise Luciferase, β-Galactosidase); b) Komponenten pathogener Mikroorganismen, die eine schützende Immunantwort induzieren können (beispielsweise das NSI-Protein des Tick-Borne-Encephalitisvirus, die N-, H- oder F-Proteine des Masernvirus, das gp120-Protein des HIVI-Virus); c) Enzyme oder andere Proteine, die für die Behandlung genetischer Erkrankungen (beispielsweise Glucocerebrosidase für die Behandlung des Gaucher-Syndroms) intendiert sind.
    • 4. Transkriptionsterminationssequenz: Verbesserte Expressionslevel werden unter bestimmten Umständen erhalten, wenn die Termination der mRNS-Transkription verursachende Sequenzen downstream oder stromab der kodierenden Sequenz inkorporiert sind. Diese Sequenzen enthalten oft außerdem Signale, welche die Addition bzw. das Anfügen eines Poly-ASchwanzes (Poly-A-Tail) an das mRNS-Iranskript verursachen. Sequenzen, die in dieser Rolle eingesetzt werden können, können von dem hCMV-Major-Immediate-Early-Protein-Gen oder von der SV4O-viralen DNS oder von anderen Orten abgeleitet werden.
  • Beispiel 3
  • Wir haben ein Plasmid konstruiert, welches für das Insektenprotein Luciferase kodiert, unter transkriptionaler Kontrolle des human Cytomegalovirus-Immediate-Early-Promotors (hCMV IE) und haben eine Luciferase-Aktivität in den transfizierten Zellen in-vitro gezeigt.
  • Wir haben gereinigte Plasmid-DNS in PLG-Mikroteilchen um 2 Km Größe mit mäßiger (etwa 25%) Effizienz unter Verwendung des Protokolls aus Beispiel 1. Die Agarose-Gelelektrophorese zeigt an, dass ein Anteil der ursprünglich geschlossen zirkulären, supercoiled DNS sich einer Umwandlung zu einer langsamer wandernden Form unterzieht, wahrscheinlich entspannten Ringen, als Ergebnis des Scherstresses im Verkapselungsprozess. Die verkapselte DNS wurde aus den Teilchen freigesetzt und zeigte den Erhalt eines signifikanten Anteils ihrer in-vivo biologischen Aktivität in Tests der Bakterientransformation mittels Elektroporation und der Luciferaseexpression nach Transfektion in kultivierte Zellen.
  • Mikroverkapselte DNS (50 pg) wurde Mäusen mittels intraperitonealer (i.p.) Injektion und oral verabreicht. Kontrolltiere bekamen nicht verkapselte DNS über dieselben Wege und als positive Kontrolle über standard-intramuskuläre (i.m.) Injektion. Luciferase-spezifische Serumantikörper wurden über ELISA drei und sechs Wochen nach Verabreichung der DNS analysiert. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
  • Wie in 2 gezeigt, waren moderate spezifische IgG- und IgM-Antworten nach i.m.-Injektion zu sehen, was erwartet werden konnte. Verkapselte DNS rief starke IgG- und IgM-Antworten nach i.p.-Injektion hervor, während nicht verkapselte DNS wesentlich schwächere Antworten ergab. Gleichermaßen provozierte die oral verabreichte, verkapselte DNS eine gute IgG-Antwort, die von der nichtverkapselten DNS nicht erreicht wurde. Die IgG- und IgM-Antikörperantworten zeigen, dass nach der Verabreichung der in PLG-Mikroteilchen verkapselten Plasmid-DNS die Luciferase-Expression und Präsentation an das Immunsystem auftritt, mit einer Effizienz, die diejenige, die mit dem Standard-i.m.-Weg zu sehen ist, übersteigt und die diejenige übersteigt, die in der Vergleichsgabe von nicht verkapselter DNS zu sehen ist.
  • Beispiel 4
  • In weiteren Experimenten wurde die über das Verfahren des Beispiels 1 hergestellte, mikroverkapselte DNS in einem Dosisbereich (1 bis 50 lig DNS) einer Gruppe an draußen gezüchteten Mäusen über intraperitoneale (i.p.) Injektion oder oral verabreicht. Luciferasespezifische Serumantikörper der Klassen IgG, IgM und IgA wurden über ELISA 3, 6 und 9 Wochen nach Verabreichung der DNS analysiert.
  • In 3 ist ersichtlich, dass die i.p.-Injektion von PLGverkapselter DNS gute IgG- und IgM-Antworten und eine moderate IgA-Antwort hervorrief. Oral verabreichte verkapselte DNS rief gute Antworten in allen drei Antikörperklassen hervor. Es besteht eine Tendenz für den Anstieg der Antikörpertiter mit der Zeit nach der DNS-Verabreichung und die Antworten sind in größerem oder geringerem Umfang auch dosisabhängig. Es ist offensichtlich, dass DNS-Quantitäten bis hinab zu 1 ig in der Lage sind, signifikante Antworten zu provozieren, insbesondere nach längerer Zeit nach Verabreichung. Diese Antikörperantworten bestätigen wiederum, das die Luciferase-Expression nach Verabreichung der in PLG-Mikroteilchen verkapselten Plasmid-DNS auftritt, entweder über i.p.-Injektion oder oral, Sie belegen außerdem, dass das Antigen dem Immunsystem über diese Mittel auf eine solche Weise präsentiert wird, dass IgG-, IgM- und IgAKlassen von Antikörpern hervorgerufen werden.
  • Beispiel 5
  • Wir haben die Auswirkung von Homogenisierungsschritten mit hoher Geschwindigkeit, die zum Erzeugen der erforderlichen Wasser-Öl-Wasser-Emulsionen angewandt werden, die Intermediate im Verkapselungsprozess darstellen, auf die physikalische Integrität und biologische Funktion der Plasmid-DNS untersucht.
  • In den anfänglichen Experimenten wurde supercoiled PlasmidDNS auf Konzentrationen und Volumen eingestellt, die denjenigen vergleichbar sind, die in den Mikroverkapselungsexperimenten eingesetzt werden, und mit einem Silverson-Laborhomogenisator homogenisiert. Proben wurden nach Intervallen von 0 bis 300 Sekunden für die Analyse mittels Agarose-Gelelektrophorese entnommen (4A). Ein solches analytisches Verfahren ist in der Lage, zwischen supercoiled (sc) DNS, offen zirkulärer-(oc)-DNS, worin ein einzelner Strang gebrochen ist, und linearer (1) DNS zu unterscheiden, worin beide Stränge an benachbarten Stellen geschnitten wurden (siehe beispielsweise 2C in Garner und Chrambach 1992, Auflösung zirkulärer, gebrochener und linearer DNS, 4,4 kb in Länge, mittels Elektrophorese in Polyacrylamidlösungen, Electrophoresis 13, 176–178). Es ist klar, dass die Exposition an solche Bedingungen für Zeitspannen bis hinab zu 10 Sekunden zu einer Umwandlung von der sc- zur oc-Form führt. Bei 8000 UpM tritt eine weitere Umwandlung zur linearen Form und gegebenenfalls ein noch stärker Abbau auf. Bei der verringerten Geschwindigkeit von 2000 UpM ist die oc-Form der DNS jedoch relativ stabil über die Zeitspanne, die typischerweise zur Bildung der Emulsionsintermediate erforderlich ist, die in der PLG-Verkapselung involviert sind. Diese Untersuchungen zeigen somit, dass die Plasmid-DNS gegenüber einer Scherkraft induzierten Beschädigung anfällig ist und dass den genauen Bedingungen sorgfältig Beachtung geschenkt werden muss, zum Erhalt der Verkapselung einer minimal geänderten DNS.
  • Auf dieser Basis haben wir Bedingungen für die Verkapselung von gereinigter Plasmid-DNS in PLG-Mikroteilchen um 2 pm Größe mit moderater Effizienz (etwa 25%) entwickelt. Die Agarose-Gelelektrophorese (4B) zeigt, dass die anfänglich geschlossen zirkuläre supercoiled DNS eine Umwandlung zur oc-Form durchläuft als Ergebnis der Scherbelastung im Verkapselungsprozess. Die biologische Aktivität der aus den Mikroteilchen freigesetzten DNS wurde in Tests der Bakterientransformation über Elektroporation und der Luciferase-Expression nach Transfektion in kultivierte Zellen ermittelt. Die aus den Teilchen freigesetzte DNS behält einen signifikanten Anteil (etwa 25%) ihrer in-vitro-Aktivität in diesen beiden Tests bei.
  • Beispiel 6
  • Für die Luciferase kodierende, in PLG verkapselte DNS, hergestellt über das Verfahren aus Beispiel 3, ist außerdem in der Lage, eine mucosale Immunantwort gegen das exprimierte Protein hervorzurufen. Level von für Luciferase spezifischen IgG-, IgM- und IgA-Antikörpern wurden über ELISA in Kotproben von Mäusen ermittelt, die i.p. oder oral Dosen von 1, 5, 20 oder 50 gg PLG-verkapselte DNS erhielten. K-e-±-=-• „ler Signifikante Level für IgG- oder IgM-Antikörper wurden in Kotproben von keiner Gruppe der Mäuse gefunden. Eher beschränkte IgA-Antworten wurden bei den i.p.-injizierten Mäusen gesehen; die orale Verabreichung führte jedoch zu signifikanten Leveln an luciferase-spezifischen IgA-Antikörpern in den Kotproben (5). Diese erreichten außergewöhnlich hohe Level in denjenigen Mäusen, die 50 gg PLGverkapselte DNS erhielten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die orale Verabreichung einer einzelnen Dosis von PLG-verkapselter Plasmid-DNS in der Lage ist, eine mucosale wie auch eine systemische Antikörperantwort hervorzurufen. Dies kann ein nützliches Attribut eines PLG-verkapselten DNSVakzins in Anwendungen sein, in denen Schutz gegen Infektionen an mucosalen oder Schleimhaut-Oberflächen erwünscht ist, wie für Masern oder AIDS.
  • Beispiel 7
  • Wir haben ein Plasmid genutzt, welches das Nucleocapsidprotein (N) des Masernvirus (MV) exprimiert, um unsere Beobachtungen zu erweitern, dass die orale Verabreichung von Luciferase exprimierender verkapselter Plasmid-DNS in der Lage ist, eine systemische Antikörperantwort auszulösen. Das N-exprimierende Konstrukt ist demjenigen identisch, welches die Luciferase exprimiert (beschrieben in Beispiel 3), mit der Ausnahme, dass die kodierende Sequenz durch die N-kodierende Sequenz des Edmonston-Stamms MV ersetzt wurde. Die gereinigte Plasmid-DNS wurde PLG-verkapselt (unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens).
  • Eingekreuzte C3H-Mäuse wurden mit zwei Dosen immunisiert, suspendiert in 0,1 M Natriumbicarbonat, verabreicht über orale künstliche Ernährung, im Abstand von 13 Tagen; jede Dosis enthielt 50 gg DNS. Kontrollgruppen von Mäusen erhielten PBS alleine oder PLG-Teilchen, enthaltend Plasmidvektor-DNS, die keine kodierende Sequenz enthielt. Die Mäuse wurden in Intervallen zur Ader gelassen und Serumlevel von IgG, spezifisch für MV N, über ELISA ermittelt, unter Verwendung eines rekombinanten MV N, exprimiert in Insektenzellen als Antigen. Wie in 6A gezeigt, führte die Immunisierung mit PLG-verkapselter DNS, exprimierend MV N, zu signifikanten Leveln an N-spezifischem Antikörper. Die gezeigten Ergebnisse sind mittlere Absorptionen in 1:100 verdünnten Seren, entnommen 53 Tage nach der zweiten DNS-Verabreichung. Es scheint ein beträchtliches Maß an Variabilität in der Antwort der einzelnen Mäuse gegen die DNS-Immunisierung in diesen Experimenten vorzuliegen (siehe 6B), in einigen Tieren liegen jedoch sehr hohe Antikörperlevel vor (reziproke Titer übersteigen 104, ermittelt in Nachfolgeexperimenten). Diese Ergebnisse belegen, dass die orale Übermittlung von PLG-verkapselter DNS ein effektives Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen ein wichtiges Pathogen darstellt.
  • Beispiel 8
  • Ein weiteres Verfahren zur Verkapselung von Plasmid-DNS in PLG-Mikroteilchen
  • Ausstattung:
    • 1) Silverson-Labormixer mit 3/4'' Sonde, ausgestattet miteinem Emulgatorschirm.
    • 2) Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
    • 3) Normale Laborglasausstattung, Kühler, Messzylinder, Rührer usw.
  • Reagenzien:
    • 1) Poly(Lactid-co-Glycolid)-Lösung (PLG-Lösung) – 500 mg in 3 ml Dichlormethan.
    • 2) Plasmid-DNS (> 10 mg/ml in TE-Puffer).
    • 3) Polyvinylalkohol-Lösung (PVA-Lösung) (8% Gewicht/Volumen in Wasser).
    • 4) Absoluter Ethanol.
    • 5) TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, I mM EDTA + 50 mM NaCl).
  • Verfahren:
    • 1) Mische 450 gl Plasmid-DNS-Lösung mit 150 gl Ethanol unter Rühren; gut mischen.
    • 2) Gib dieses Gemisch zu 3 ml PLG-Lösung hinzu und emulgiere im Silverson-Mixer bei 2000 UpM für 2 35 Minuten.
    • 3) Gib diese Emulsion zu 100 ml PVA hinzu und emulgierebei 2000 UpM für 2 1 Minuten.
    • 4) Gib die doppelte Emulsion zu 1 1 Wasser hinzu und rühre 1 Minute lang heftig.
    • 5) Verteile die Suspension der Mikroteilchen in Zentrifugenbehältern und zentrifugiere 30 Minuten lang mit 10.000 × gav.
    • 6) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser und homogenisiere mit einem Hand-Homogenisator mit großem Spiel (0,5 mm) zur Herstellung einer homogenen Suspension. Verdünne mit 200 ml Wasser und rezentrifugiere wie oben.
    • 7) Wiederhole die Schritte 5 und 6 4-mal.
    • 8) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser wie oben, überführe in ein für die Gefriertrocknung geeignetes Gefäß, rollschichtgefriere in einem Gemisch aus Isopropanol und Trockeneis und lyophilisiere für 48 Stunden.
  • In diesem Verfahren werden die Schritte 1–3 bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Effizienz wurde im Vergleich zu Beispiel 1 auf bis zu 30 bis 40% Effizienz verbessert.
  • Beispiel 9
  • Ein weiteres Verfahren zur Verkapselung von Plasmid-DNS in PLG-Mikroteilchen
  • Ausstattung:
    • 1) Silverson-Labormixer mit 3/4'' Sonde, ausgestattet mit einem Emulgatorschirm.
    • 2) Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
    • 3) Normale Laborglasausstattung, Kühler, Messzylinder, Rührer usw.
  • Reagenzien:
    • 1) Poly(Lactid-co-Glycolid)-Lösung (PLG-Lösung) – 400 mg in 3 ml Dichlormethan.
    • 2) Plasmid-DNS (> 10 mg/ml in TE-Puffer).
    • 3) Polyvinylalkohol-Lösung (PVA-Lösung) (8% Gewicht/Volumen in Wasser).
    • 4) Absoluter Ethanol.
    • 5) TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, + 1 mM EDTA).
  • Verfahren:
    • 1) Mische 450 It1 Plasmid-DNS-Lösung mit 150Ethanol unter Rühren; gut mischen.
    • 2) Gib dieses Gemisch zu 3 ml PLG-Lösung hinzu und emulgiere im Silverson-Mixer bei 2000 UpM für 2 M Minuten.
    • 3) Gib diese Emulsion zu 100 ml PVA hinzu und emulgiere bei 2000 UpM für 2 M Minuten.
    • 4) Gib die doppelte Emulsion zu 1 1 Wasser hinzu und rühre 1 Minute lang heftig.
    • 5) Verteile die Suspension der Mikroteilchen in Zentrifugenbehältern und zentrifugiere 30 Minuten lang mit 10.000 × gav.
    • 6) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser und homogenisiere mit einem Hand-Homogenisator mit großem Spiel (0,5 mm) zur Herstellung einer homogenen Suspension. Verdünne mit 200 ml Wasser und rezentrifugiere wie oben.
    • 7) Wiederhole die Schritte 5 und 6 4-mal.
    • 8) Resuspendiere den Mikroteilchen-Niederschlag in 25 ml Wasser wie oben, überführe in ein für die Gefriertrocknung geeignetes Gefäß, rollschichtgefriere in einem Gemisch aus Isopropanol und Trockeneis und lyophilisiere für 48 Stunden.
  • In diesem Verfahren werden die Schritte 1–3 bei 4°C durchgeführt. Die Effizienz der Inkorporation der DNS in die Mikroteilchen betrug 50 bis 60%.
  • Beispiel 10:
  • Eine Plasmid-DNS (pCMVIA/VP6), exprimierend das VP6-Gen des Mäuse-Rotavirus (epizootisches Diarrhoevirus von heranwachsenden Mäusen (epizootic diarrhoea of infant mice virus (EDIM-Virus)) wurde an der University of Massachusetts Medical Center konstruiert. Das VP6-kodierende Gen wurde in einen Vektor (pJW4303) stromab von Sequenzen des ImmediateEarly-Transkriptionspromotors und des Introns A des humanen Cytomegalovirus und einer von tPA abgeleiteten Sekretionssignalsequenz invertiert. Dem Gen folgte eine Transkriptionsterminations- und eine Polyadenylierungssequenz, abgeleitet vom Wachstumshormongen des Rindes. Die gereinigte Plasmid-DNS wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens PLG-verkapselt.
  • Eingekreuzte gezüchtete Balb/c-Mäuse wurden durch orale Verabreichung mit einer Dosis, enthaltend 50 ilig VP6-exprimierende DNS, verkapselt in PLG-Mikroteilchen, immunisiert. Eine Kontrollgruppe der Mäuse erhielt eine vergleichbare Dosis verkapselter Vektor-DNS. Die Mäuse wurden auf intestinale rotavirus-spezifische IgA in Intervallen von 14 Tagen mittels ELISA unter Verwendung des EDIM-Virus als Antigen untersucht. Neun Wochen nach der Immunisierung wurden die Tiere mit dem EDIM-Virus herausgefordert bzw. infiziert und auf die Exkretion des Virus im Kot unter Verwendung eines ELISA auf Basis eines monoklonalen Antikörpers überwacht.
  • Wie in 7A gezeigt, führte die Immunisierung mit PLGverkapselter DNS, exprimierend VP6, im Vergleich zu den Kontrolltieren zu signifikanten Leveln des rotavirus-spezifischen intestinalen IgA-Antikörpers. Dies ist besonders bemerkenswert, da andere Routen der Verabreichung der VP6-exprimierenden Plasmid-DNS keinen nachweisbaren Level von intestinalen virusspezifischen IgA vor der Infektion mit dem Virus auslösen. Nach dem Infizieren mit dem EDIM-Virus verringerte sich die Rotavirus-Abgabe in den Mäusen, die die PLG-verkapselte VP6-exprimierende Plasmid-DNS erhalten hatten, verglichen mit der Kontrollgruppe (7B).
  • Diese Ergebnisse belegen, dass oral verabreichte PLG-verkapselte Plasmid-DNS in der Lage ist, (a) eine spezifische intestinale IgA-Antwort und (b) einen Schutz gegen Virusangriffe zu induzieren, wie über die Verringerung der Virusausscheidung belegt.
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung finden Anwendung in langsam freisetzenden Systemen für die Übermittlung von DNS-Vakzinen; die verlängerte Expression des Immunogens führt möglicherweise zu einer effizienten Initialreaktion und Auffrischung mit einer einzelnen Dosis mit anschließender effizienter Induktion der Langzeitgedächtnisantwort. Eine andere Anwendung besteht in einem Träger für die orale Übermittlung von Vakzinen; einfache und annehmbare Mittel für die Vakzin-Verabreichung verbessern wahrscheinlich die Vakzin-Aufnahmeraten; zusätzlich ist die gefriergetrocknete, verkapselte Plasmid-DNS sehr wahrscheinlich sehr stabil und unempfindlich gegenüber Umweltbedingungen. Eine weitere Anwendung besteht in einem langsam freisetzenden System für die Gentherapie; die verlängerte Freisetzung der DNS und die anschließende Expression verringert potenziell den Bedarf an wiederholten Behandlungen.

Claims (3)

  1. Verfahren zur Verkapselung von DNA in einem Polymer-Mikropartikel, wobei die DNA eine für ein Polypeptid codierende Sequenz umfasst und zur Induktion der Expression der codierenden Sequenz adaptiert ist, umfassend die Schritte: Herstellung eines Gemisches der DNA und einer Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion, die zur Bildung von Mikropartikeln geeignet ist, Herstellung von DNA-enthaltenden Mikropartikeln mit einem Durchmesser von 10 μm oder weniger und Trennung der DNA-enthaltenden Mikropartikel von dem Gemisch durch Zentrifugation, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA ihre Eignung zur Induktion der Expression ihrer codierenden Sequenz beibehält, und dass in den resultierenden Mikropartikeln mindestens 25% DNA-Aktivität, gemäß eines Tests betreffend Transformation kompetenter Bakterien oder Transfektion kultivierter Zellen, erhalten bleibt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Herstellung einer Lösung von DNA und Alkohol.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–2, umfassend die Durchführung des Verfahrens bei oder unter 10°C.
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