DE69534907T2

DE69534907T2 - Transgene schweine, die den menschlichen blutgerinnungsfaktor viii exprimieren

Info

Publication number: DE69534907T2
Application number: DE69534907T
Authority: DE
Inventors: Henryk Rockville LUBRON; N. William Springfield DROHAN; H. William Blacksburg VELANDER
Original assignee: American National Red Cross; Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Current assignee: American National Red Cross; Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 1995-09-21
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2015-09-22
Also published as: WO1996009377A1; EP1739170A3; EP1739170A2; CA2200610A1; ATE321785T1; CA2200610C; EP0807170A1; US5880327A; US6255554B1; JP2010017184A; JPH10506013A; ES2262143T3; DE69534907D1; EP0807170B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft allgemein transgene Tiere und deren Verwendung als Bioreaktoren für die Produktion klinisch nützlicher Mengen an Proteinen. Spezifischer gesagt betrifft diese Erfindung ein transgenes Schwein, das genetisch modifiziert ist, um rekombinantes menschliches Faktor-VIII-Protein zu exprimieren und um neu exprimiertes Protein in seine Milch zu sekretieren, aus der das Protein ohne Weiteres isoliert werden kann.
Bei Faktor VIII („F8") handelt es sich um ein Blutplasma-Glycoprotein von etwa 260 kDa Molekülmasse, das in der Leber von Säugern produziert wird. Es stellt eine entscheidende Komponente der Kaskade von Koagulationsreaktionen dar, die zur Blutgerinnung führen. Innerhalb dieser Kaskade befindet sich ein Schritt, bei dem Faktor IXa, in Verbindung mit F8, Faktor X zu einer aktivierten Form, dem Faktor Xa, umwandelt. F8 dient bei diesem Schritt als ein Kofaktor, der in Verbindung mit Calcium-ionen und Phospholipid für die Aktivität des Faktors IXa erforderlich ist. Die beiden häufigsten hämophilen Störungen werden durch einen Mangel an funktionellem F8 (Hämophilie A, etwa 80% aller Fälle) oder funktionellem Faktor IXa (Hämophilie B oder Christmas-Faktor-Krankheit) bewirkt.
Bis vor kurzem bezog die standardmäßige Behandlung der Hämophilie A häufige Infusionen von Präparaten aus F8-Konzentraten ein, die aus den Plasmas menschlicher Spender stammten. Zwar ist diese Ersatztherapie generell wirksam, doch setzt eine solche Behandlung die Patienten dem Risiko Virus-übertragbarer Krankheiten wie Hepatitis und AIDS aus. Obschon dieses Risiko durch weitere Reinigung des F8 aus Plasma durch eine Immunreinigung unter Verwendung monoklonaler Antikörper und durch Inaktivierung der Viren durch Behandlung entweder mit einem organischen Lösungsmittel oder mit Hitze reduziert worden ist, haben diese Präparate die Behandlungskosten stark heraufgesetzt und sind ebenfalls nicht risikolos. Aus diesen Gründen sind die Patienten episodisch und nicht prophylaktisch behandelt worden. Eine weitere Komplikation ist, dass etwa 15% der Patienten inhibitorische Antikörper gegen derart präparierten F8 entwickeln.
Einen wichtigen Fortschritt in der Behandlung der Hämophilie A stellte die Isolierung von cDNA-Klonen dar, die die vollständige Sequenz von 2.351 Aminosäuren des humanen F8 kodieren (siehe Wood et al., Nature, 312: 330 (1984) und United States Patent Nr. 4 757 006, 12. Juli 1988), und die Bereitstellung der humanen F8-Gen-DNA-Sequenz und rekombinanten Methoden für ihre Herstellung).
Die Analyse der abgeleiteten primären Aminosäuresequenz des humanen F8, wie aus der klonierten cDNA bestimmt, zeigt, dass es sich um ein aus einem größeren Vorläufer-Polypeptid prozessiertes Heterodimer handelt. Das Heterodimer besteht aus der C-terminalen Leichtkette von etwa 80 kDa in einer Metallionen-abhängigen Assoziation mit einem etwa 210 kDa N-terminalen Schwerketten-Fragment. Siehe den Überblick von Kauf man, Transfusion Med. Revs., 6: 235 (1992). Die physiologische Aktivierung des Heterodimers erfolgt durch proteolytische Spaltung der Proteinketten durch Thrombin (Faktor IIa). Thrombin spaltet die Schwerkette zu einem 90 kDa-Protein und daraufhin zu 54 kDa- und 44 kDa-Fragmenten. Thrombin spaltet außerdem die 80 kDa Leichtkette zu einen 72 kDa-Protein. Es handelt sich um letzteres Protein, und die beiden Schwerketten-Fragmente (obiges 54 kDa- und 44 kDa-Fragment), die, zusammengehalten durch Calciumionen, den aktiven F8 ausmachen. Die Inaktivierung erfolgt, wenn die 72 kDa- und 54 kDa-Proteine durch Thrombin, aktiviertes Protein C oder Faktor Xa weitergespalten werden. Im Plasma wird dieser F8-Komplex durch Assoziation mit einem 50-fachen Überschuss an von-Willebrand-Faktor-Protein („vWF") stabilisiert, was die proteolytische Zerstörung von F8 zu hemmen scheint.
Die Aminosäuresequenz von F8 ist in drei strukturellen Domänen organisiert: einer triplizierten A-Domäne von 330 Aminosäuren, einer einzelnen B-Domäne von 980 Aminosäuren und einer duplizierten C-Domäne von 150 Aminosäuren. Die B-Domäne weist keine Homologie zu anderen Proteinen auf und liefert 18 der 25 potentiellen Asparagin(N)-verknüpften Glycosylierungsstellen dieses Proteins. Obschon Schweine- und menschlicher F8 eine bemerkenswerte Abweichung in ihren B-Domänen zeigen, kann das Schweine-Protein zur Behandlung der Hämophilie A beim Menschen verwendet werden. Dies lässt annehmen, dass entweder die B-Kette für die biologische Aktivität des Holo-Moleküls nicht entscheidend ist oder dass mehrfache Versionen dieser Domäne ähnlich wirkungsvoll sind. Schweine- und Menschen-F8 zeige 80-85% Homologie in zwei der drei A-Domänen.
Obschon wahrscheinlich die Hepatocyte jener Zelltyp ist, der F8 in vivo produziert, sind bis heute keine natürlichen Zelllinien bekannt, die dieses Protein exprimieren. Kaufman, 1992, oben, und Wood et al. 1984, oben, transfizierten transformierte Hamster-Nierenzellen mit einem Vektor, der ein Gen enthielt, das F8 kodiert, und exprimierten dieses Protein. Kauf man, Nature 342: 207 (1989) exprimierte rekombinantes F8 in transformierten CHO-Zellen, doch war die Produktion und Sekretion von neu synthetisiertem Protein in das konditionierte Wachstumsmedium sehr gering. Dies wurde drei Faktoren zugeschrieben: Dem Erfordernis des Vorhandenseins von vWF in dem konditionierten Medium, das in diesen Kultursystemen verwendet wurde, um neu sekretierten F8 vor proteolytischer Zerstörung zu schützen (in Abwesenheit von vWF wurde Faktor VIII als unvollständige Ketten sekretiert, die anschließend abgebaut wurden); einer unvollständigen Sekretion des neu synthetisierten F8 aus den Zellen (die meisten verblieben im endoplasmatischen Reticulum); und einer geringen Menge an F8 mRNA als Folge eines posttranslationalen Ereignisses. Stabiler rekombinanter F8 wurde durch CHO-Zellen lediglich dann sekretiert, wenn das Gen für vWF gleichzeitig exprimiert wurde. Zusätzliche Nachteile der Verwendung von Säugergewebe-Kultursystemen für die Produktion von F8 in klinisch nützlichen Mengen sind die Kosten des Wachstumsmediums und die begrenzte Produktionskapazität der Säugergewebe-Kultursysteme.
Es verbleibt ein bedeutender Bedarf nach einer wirkungsvollen und relativ preiswerten Methode für die Produktion großer Mengen an menschlichem F8-Protein, das frei von infektiösen Partikeln ist und sich für die klinische Verwendung eignet. Das nachstehend beschriebene transgene Schweinesy stem, das menschlichen F8 rekombinant erzeugt, erfüllt diesen Bedarf.
Es ist geschätzt worden, zum Beispiel durch Paleyanda et al, in RECOMBINANT TECHNOLOGY IN HEMOSTASIS AND THROMBOSIS Hsg., Hoyer et al., (Plenum Press, NY 1991), dass der US-Markt für F8 etwa 600.000.000 Einheiten pro Jahr beträgt. Bei einer spezifischen Aktivität von 5.000 E/mg sind etwa 120 g pro Jahr erforderlich. Ausgehend von einer erreichbaren Expressionshöhe von 50 mg/l in der Milch eines transgenen Tieres der Erfindung und einem 50%-igen Verlust an Protein während der Reinigung ist geschätzt worden, dass etwa 1 Kuh (die etwa 6.000 l Milch pro Jahr erzeugt), 10 Ziegen, Schafe oder Schweine (die 500 l Milch pro Jahr erzeugen) oder 5.333 Kaninchen (die etwa 0,9 l Milch pro Jahr erzeugen) mehr als ausreichend wären, um den Gesamtbedarf dieses Landes an F8 zu decken ((Paleyanda et al., oben).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe dieser Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines transgenen weiblichen Schweins, das F8 produziert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Schaffung transgener Schweine mit dem zuvor genannten Charakteristikum.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Produzieren von biologisch aktivem F8 in kommerziell wertvollen Mengen, indem bei einem transgenen weiblichen Schwein das Sekretieren von exprimiertem F8 in seine Milch hervorgerufen wird und die ses Protein aus der Milch isoliert wird.
Wiederum eine andere Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines transgenen Schweines, in dessen Genom F8 kodierende DNA stabil integriert worden ist, sodass das Protein exprimiert und in die Milch des Tieres sekretiert wird.
Diese Aufgaben sind durch die Schaffung eines transgenen Schweines erfüllt worden, das ein vollständig biologisch aktives rekombinantes menschliches Faktor-VIII-Protein oder Polypeptidfragment oder Modifikation hiervon exprimiert, wobei die Fragmente und Modifikationen auch vollständig biologisch aktiv sind, und dass das exprimierte Protein in die Milch des Schweines sekretiert, wobei das transgene Schwein ein weibliches Schwein umfasst, in dessen Genom ein stabil integriertes DNS-Konstrukt eingefügt ist, wobei das DNS-Konstrukt einen Milchproteinpromotor umfasst, der operativ gekoppelt ist an eine exogene doppelsträngige DNS-Sequenz, die das Faktor-VIII-Protein oder das Fragment oder die Modifikation hiervon kodiert, die funktionell gekoppelt ist mit einer DNS, die ein Signalpeptid kodiert, wobei der Promotor spezifisch aktiv ist in Brustdrüsenzellen, wobei das Signalpeptid wirksam ist in der Einbringung von neu exprimiertem Faktor VIII in die Milch des weiblichen Schweins, und wobei die exogene doppelsträngige DNS-Sequenz Faktor-VIII-cDNS ist, die keine Faktor-VIII-Introne umfasst.
Diese Aufgaben können durch doppelsträngige DNS-Konstrukte erfüllt werden, die einen Milchproteinpromotor umfassen, der operativ gekoppelt ist an eine DNS-Sequenz, die F8 kodiert, oder eine DNS-Sequenz, die ein Signalpeptid kodiert, das neu exprimierten F8 in die Milch des Wirtstiers lenkt, welche Konstrukte zur Schaffung des transgenen Tiers verwendet werden.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen erkennbar werden. Selbstverständlich sollten jedoch die ausführliche Beschreibung und die nachstehend angegebenen Beispiele, obschon sie bevorzugte Ausführungsformen wiedergeben, in keinster Weise als Beschränkung verstanden werden.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigte eine schematische Darstellung eines menschlichen F8 cDNA-Konstrukts, die den Beitrag der genomischen Sequenzen von saurem Molkeprotein („WAP") zeigt. Ein 14,6 kb-Insert, das sich aus einem 2,6 kb 5' WAP-Gen, einer 7,5 kb humaner F8 cDNA und einem 4,6 kb 3' WAP-Gen zusammensetzt, kann durch Not I-Verdau des Plasmids ausgeschnitten werden, was den 2,1 kb pPoly III D-Vektor freisetzt.
2 zeigt eine schematische Darstellung der Erzeugung eines Maus-WAP-humane F8-cDNS-Hybridgens, die die Insertion einer 7,5 kb humane F8-cDNS an der Kpn I-Stelle des Maus-WAP-Gens in das p225.11-Plasmid zeigt.
3 zeigt einen Western-Blot von aus Milch abgetrennten Molkeproteinen, wie erhalten aus transgenen Mäusen, die zum Exprimieren von menschlichem F8 in ihre Milch induziert wurden. Die erste Bahn bon links zeigt Molekulargewichts-Marker. Die nächste Bahn zeigt authentischen menschlichen F8 mit Hauptbanden bei etwa 80 kDa und etwa 210 kDa. Die nächste Bahn zeigt die Proteine in der Kontrollmolke. Die mit F2 und F3 markierten Bahnen zeigen die Proteine in der Molke der transgenen Mäuse, die zum Exprimieren des rekombinanten menschlichen F8 induziert wurden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung besteht in einem transgenen Schwein, das ein vollständig biologisch aktives rekombinantes menschliches Faktor-VIII-Protein oder Polypeptidfragment oder Modifikation hiervon exprimiert, wobei die Fragmente und Modifikationen auch vollständig biologisch aktiv sind, und das das exprimierte Protein in die Milch des Schweines sekretiert, wobei das transgene Schwein ein weibliches Schwein umfasst, in dessen Genom ein stabil integriertes DNS-Konstrukt eingefügt ist, wobei das DNS-Konstrukt einen Milchproteinpromotor umfasst, der operativ gekoppelt ist an eine exogene doppelsträngige DNS-Sequenz, die das Faktor-VIII-Protein oder das Fragment oder die Modifikation hiervon kodiert, die funktionell gekoppelt ist mit einer DNS, die ein Signalpeptid kodiert, wobei der Promotor spezifisch aktiv ist in Brustdrüsenzellen, wobei das Signalpeptid wirksam ist in der Einbringung von neu exprimiertem Faktor VIII in die Milch des weiblichen Schweins, und wobei die exogene doppelsträngige DNS-Sequenz Faktor-VIII-cDNS ist, die keine Faktor-VIII-Introne umfasst.
Der Begriff „Tier" bezeichnet hierin alle Säugetiere mit Ausnahme des Menschen. Er umfasst auch ein individuelles Tier in allen Entwicklungsstadien, einschließlich embryonaler und fötaler Stadien. Ein „transgenes" Tier ist jegliches Tier, das Zellen enthält, die eine genetische Information tragen, die direkt oder indirekt durch bewusste genetische Manipulation auf dem subzellulären Niveau, wie etwa durch Mikroinjektion oder Infektion mit einem rekombinanten Virus, empfangen wurde.
„Transgen" im vorliegenden Zusammenhang umfasst nicht die klassische Kreuzzucht oder in vitro-Fertilisation, sondern kennzeichnet vielmehr Tiere, bei denen ein oder mehrere Zellen ein rekombinantes DNA-Molekül empfangen. Obschon es in hohem Maße bevorzugt ist, dass dieses Molekül innerhalb der Chromosomen des Tiers integriert wird, umfasst die Erfindung auch die Verwendung extrachromosomal replizierender DNA-Sequenzen, die z.B. in künstliche Hefechromosomen eingebaut werden könnten.
Der Begriff „Keimzellbahn-transgenes Tier" bezieht sich auf ein transgenes Tier, in das die genetische Information aufgenommen und in eine Keimzellbahn eingebaut worden ist, wodurch ihm die Fähigkeit zur Übertragung der Information auf die Nachkommen verliehen wird. Besitzen solche Nachkommen in der Tat einen Teil oder die Gesamtheit der Information, so sind auch sie transgene Tiere.
Die in das Tier einzuführende Information ist vorzugsweise für die Tier-Spezies, zu der der Empfänger zählt, fremd (d.h. „heterolog"), doch kann die Information auch nur für den bestimmten individuellen Empfänger fremd sein oder eine bereits vom Empfänger besessene genetische Information sein. Im letzteren Fall kann das eingeführte Gen zum nativen Gen verschieden exprimiert werden.
Die transgenen Tiere dieser Erfindung sind Schweine.
Es ist in hohem Maße bevorzugt, dass ein transgenes Tier der vorliegenden Erfindung durch Einführen in Einzellembry os geeigneter Polynukleotide, die humanen F8 oder Fragmente oder modifizierte Produkte hiervon kodieren, in einer Weise produziert werden, bei der diese Polynukleotide in die DNS der Keimbahnzellen des reifen Tiers stabil integriert werden und in normaler Mendelscher Weise vererbt werden.
Fortschritte in den Technologien für die Embryo-Mikromanipulation erlauben nun die Einführung von heterologer DNS in befruchtete Säuger-Eizellen. Zum Beispiel können totipotente oder pluripotente Stammzellen durch Mikroinjektion, Calciumphosphat-vermittelte Präzipitation, liposomale Fusion, retrovirale Infektion oder andere Methoden transformiert werden und die transformierten Zellen dann in den Embryo eingeführt werden, woraufhin der Embryo sich zu einem transgenen Tier entwickelt. Bei einer in hohem Maße bevorzugten Methode werden sich entwickelnde Embryos mit einem Retrovirus infiziert, das die gewünschte DNS enthält, und aus dem infizierten Embryo transgene Tiere erhalten. Bei der bevorzugtesten Methode jedoch werden die entsprechenden DNS in den Pronukleus oder das Zytoplasma von Embryonen, vorzugsweise im Einzellstadium, koinjiziert, woraufhin sich die Embryonen zu reifen transgenen Tieren entwickeln dürfen. Diese Techniken sind wohl bekannt. Siehe die Überblicke über die standardmäßigen Laborverfahren für die Mikroinjektion von heterologer DNS in befruchtete Säuger-Eizellen, einschließlich Hogan et al., MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, (Cold Spring Harbor Press 1986); Krimpenfort et al., Biotechnology 9: 844 (1991); Palmiter et al., Cell, 41: 343 (1985); Kraemer et al., GENETIC MANIPULATION OF THE EARLY MAMMALIAN EMBRYO, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985); Hammer et al., Nature, 315: 680 (1985); Wagner et al., US-Patent Nr. 5 175 385; Krimpenfort et al., US-Patent Nr. 5 175 384.
Humane F8-cDNS kann erhalten werden, indem sie aus einer geeigneten genomischen Quelle (d.h. menschliche Leber, die das natürliche Organ für die Produktion dieses Proteins ist) anhand verschiedener Methoden isoliert wird, zu denen die Präparierung von cDNS aus isolierten mRNS-Templaten, die direkte Synthese oder irgendeine Kombination davon zählen, wie beschrieben bei Wood et al. 1984 oben, und Toole et al. US-Patent Nr. 4 757 006.
Die cDNS, die F8 oder einzelne Fragmente oder modifizierte Proteine davon kodieren, kann, in einem geeigneten Leserahmen, mit entsprechenden regulatorischen Signalen fusioniert werden, wie nachstehend im Einzelnen beschrieben, um ein genetisches Konstrukt zu erzeugen, das dann beispielsweise durch Einbau in einen bakteriellen (z.B. E. coli) Plasmidvektor gemäß herkömmlicher Methoden amplifiziert wird. Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press 1989).
Das amplifizierte Konstrukt wird daraufhin aus dem Vektor ausgeschnitten und zur Verwendung in der Schaffung von transgenen Tieren gereinigt. Die Reinigung kann mittels eines oder mehrerer Zyklen einer anionischen HPLC erreicht werden; zu alternativen Techniken zählen die Ultrazentrifugation durch einen Sucrose- oder NaCl-Gradienten, die Gelelektrolution, gefolgt von Agarosebehandlung und Ethanolpräzipitation, oder die Niederdruckchromatographie. Eine Reinigung mittels mehrerer Zyklen einer HPLC ermöglicht bemerkenswert hohe Transformationsfrequenzen in der Größenordnung von 20% oder mehr bei Mäusen und Schweinen.
Obschon die vorliegende Erfindung bevorzugt die Verwendung von DNS-Konstrukten erfordert, die das erwünschte oder native humane F8-Protein als solches produzieren, kann das gewünschte Protein auch als ein Fusionsprotein erzeugt werden, das ein anderes Protein enthält. Zum Beispiel kann das gewünschte rekombinante Protein dieser Erfindung als Teil eines größeren rekombinanten Proteins produziert werden, um das gewünschte Protein zu stabilisieren oder um seine Ausreinigung aus Milch schneller und einfacher zu machen. Die Fusionspartner werden dann chemisch oder enzymatisch getrennt und das gewünschte Protein isoliert.
Rekombinanter humaner F8 („rhF8") kann auch mit der identischen Sequenz wie das native Molekül produziert werden oder kann als ein Fragment oder Modifikationen hiervon produziert werden. Eine Vielfalt modifizierter rhF8 oder Untereinheiten davon kann durch Verändern einer klonierten DNS unter Anwendung wohl bekannter Techniken der in vitro-Mutagenese erzeugt werden, wie etwa jenen, die in den oben angegebenen Literaturstellen dargestellt sind.
Die Produktion transgener Tiere, die das Gen für rhF8 enthalten, bezieht die Verwendung einer cDNS ein, die das Vorläufer-Protein oder heterodimeren rhF8 kodiert. Die Basensequenz der vollen Länge jeder Proteinkette ist in der zuvor genannten Veröffentlichung von Wood et al. und Toole et al., oben, beschrieben.
Die bei der vorliegenden Erfindung nützlichen DNS-Konstrukte weisen eine für rhF8 kodierende doppelsträngige DNS-Sequenz auf, die operativ gekoppelt ist an alle der cis-agierenden Signale, die für die Brustdrüsen-spezifische Expression dieses Proteins, die posttranslationale Glycosy lierung und die Sekretion des Proteins in Milch oder andere Körperflüssigkeiten und die Expression der vollständigen biologischen Aktivität erforderlich sind.
Modifizierte F8-Sequenzen können ebenfalls bei dieser Erfindung verwendet werden. Zu nützlichen Modifikationen in diesem Zusammenhang zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, jene, die posttranslationale Modifikationen, Größe oder Aktivstelle, verändern oder die dieses Protein oder Abschnitte davon an ein anderes Protein fusionieren. Diese Modifikationen können mittels in diesem Fachgebiet wohl bekannter Techniken eingeführt werden, wie etwa durch Synthetisieren von modifizierten Genen durch Ligation eines überlappenden Oligonukleotids oder durch Einführen von Mutationen in die klonierten Gene, beispielsweise durch Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese.
Zu den in der Erfindung nützlichen cis-agierenden regulatorischen Regionen zählen Promotoren, die in Brustdrüsenzellen spezifisch aktiv sind und die Milchproteine einbeziehen. Von diesen Promotoren sind kurze und lange WAP-, kurze und lange α-, β- und kappa-Casein-, α-Lactalbumin- und β-Lactoglobulin-(„BLG")-Promotoren in hohem Maße bevorzugt.
Die Promotoren können auf der Grundlage der Proteinzusammensetzungen verschiedener Milcharten ausgewählt werden. Zum Beispiel sind die WAP- und BLG-Promotoren mit transgenen Schweinen besonders nützlich. Die kurzen und langen Promotoren des Nager-WAP sind zum Exprimieren des Ratten-WAP-Gens, des menschlichen tPA-Gens und des CD4-Gens verwendet worden, wohingegen der Schaf-BLG-Promotor zum Exprimieren des Schaf-BLG-Gens, des menschlichen Alpha-1- Antitrypsin-Gens und des menschlichen Faktor-IX-Gens verwendet worden ist. Für Übersichten siehe Paleyanda et al.,1991, oben, und Clark et al., TIBTECH 5: 20 (1987).
Unter den Promotoren zur Ausführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind die Nager-Casein- und WAP-Promotoren, und die Casein-, α-Lactalbumin- und BLG-Promotoren von porcinem, bovinem, equinem und ovinem Ursprung (Schweine, Schafe, Ziegen, Kühe, Pferde), Kaninchen, Nagern und Haustieren (Hunden und Katzen). Die Gene für diese Promotoren sind isoliert und deren Charakterisierungen veröffentlicht worden. Für Übersichten siehe Clark et al. (1987), oben, und Henninghausen, Protein Expression and Purification 41: 3 (1990).
Der Promotor kann unter Durchführung herkömmlicher Restriktionsendonuklease- und Subklonier-Schritte isoliert werden. Ein Maus-WAP-Promotor, isoliert als ein 2,6 kb EcoR1-Kpn1-Fragment unmittelbar 5' zur WAP-Signalsequenz, ist bevorzugt, obschon auch der „lange" WAP-Promotor (der 5' Sau 3A-Kpn1-Promotor mit 4,2 kb des Maus-WAP-Gens, oder ein Fragment davon) ist ebenfalls zur Ausführung dieser Erfindung geeignet.
Wichtig für die vorliegende Erfindung sind regulatorische Sequenzen, die die Sekretion von Proteinen in die Milch und/oder andere Körperflüssigkeiten des transgenen Tiers lenken. In dieser Hinsicht sind sowohl homologe als auch heterologe regulatorische Sequenzen bei der Erfindung nützlich. Im Allgemeinen können regulatorische Sequenzen, die für das Lenken der Sekretion von Milchproteinen bekannt sind, wie etwa entweder Signalpeptide von Milchproteinen oder das naszente Zielpeptid, verwendet werden.
Zu den nützlichen Sequenzen, die die Transkription regulieren, zählen, über die oben erörterten Promotoren hinaus, Enhancer, Spleißsignale, Transkriptionsterminationssignale und Polyadenylierungsstellen. Besonders nützlich in dieser Hinsicht sind solche, die die Effizienz der Transkription der Gene für F8 in der Brustdrüse oder anderen oben aufgelisteten Zellen der transgenen Tiere erhöhen. Bevorzugt sind Transkriptions-regulatorische Sequenzen für Proteine, die in den Brustdrüsenzellen in hohem Maße exprimiert werden (siehe oben).
Vorzugsweise umfasst das Expressionssystem oder Konstrukt dieser Erfindung auch eine 3'-untranslatierte Region stromabwärts der DNA-Sequenz, die das gewünschte rekombinante Protein kodiert, oder das für die Regulation verwendete Milchproteingen. Diese Region stabilisiert offensichtlich das RNA-Transkript des Expressionssystems und erhöht damit die Ausbeute an dem gewünschten Protein. Zu den 3'-untranslatierten Regionen, die in diesem Hinsicht nützlich sind, zählen Sequenzen, die ein Poly A-Signal bereitstellen. Solche Sequenzen können z.B. vom SV 40-kleinen T-Antigen, der 3'-untranslatierten Casein-Region oder anderen 3'-untranslatierten Sequenzen, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, stammen. Vorzugsweise ist die 3'-untranslatierte Region von einem Milch-spezifischen Protein abgeleitet. Der stabilisierende Effekt des Poly A-Transkripts dieser Region ist zur Stabilisierung der mRNS der Expressionssequenz wichtig. Ebenfalls von Bedeutung für eine erhöhte Effizienz der Expression von F8 sind ribosomale Bindungsstellen. Dementsprechend sind Sequenzen, die die posttranslationale Modifikation von F8 regulieren, bei der Erfindung nützlich.
Somit wird gemäß dieser Erfindung eine doppelsträngige chimäre DNS, die das F8-Protein kodierende Gene umfasst, und die operativ gekoppelt ist an cis-agierende regulatorische Sequenzen, die eine wirksame Expression des ersteren in Milch fördern, in einen Embryo eingebracht, wo sie in das embryonale Genom integriert werden und zu einem Teil der vererbbaren genetischen Ausstattung aller Tierzellen, einschließlich der Keimbahnzellen, des ausgewachsenen Tieres, das aus dem Embryo reift, werden. Die auf diese Weise exprimierten und in die Milch sekretierten rekombinanten Proteine sind immunologisch reaktiv, wie mittels eines nachstehend beschriebenen IRMA-Assay messbar.
Wo die Synthese einer Kette aus F8-Untereinheiten eine Einschränkung für die Produktion des Holoproteins darstellen kann, kann die Expression dieser Kette durch Platzieren des Gens in einen anderen genemischen Ort erhöht werden. Dieser andere Ort kann eine DNS-Sequenz unter der selben oder einer unterschiedlichen regulatorischen Sequenz wie bei andere Sequenzen enthalten.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform bestehen die Transgene der Erfindung allgemein aus WAP-Milchproteinen, die stromaufwärts und stromabwärts die F8 cDNA/Signalpeptidsequenzen flankieren (1 und 2). Eine native 5'-WAP-regulatorische Sequenz, die in einer zugänglichen Restriktionsstelle unmittelbar vor/an dem ATG-Codon endet, kann an die Restriktionsstellen ligiert werden, die an dem ATG der translatierbaren Sequenzen ohne Linkersequenzen, die von den Ketten des menschlichen F8 abgeleitet sind, vorkommen. Jede der kombinierten 5'-regulatorischen und F8-translatierbaren Sequenzen, die in einer bestimmten Restriktionsstelle enden, können dann an eine entsprechende Restriktionsstelle ligiert werden, die am Beginn der 3'-untranslatierten Region von WAP vorkommt und an eine WAP 3'-flankierende Region angrenzt. Dieses Konstruktionsmotiv macht es möglich, dass native 5'-regulatorische und 3'-UTR der Milchproteingene ohne dazwischen liegende Sequenzen unmittelbar nebeneinander positioniert werden können. Spezielle Restriktionsstellen an den Enden aller Konstrukte können darauf hin ausgewählt werden, die Aneinanderkettung der Konstrukte in einer einzelne Domäne innerhalb des Tiergenoms zu erleichtern.
Obschon die obigen allgemeinen Beschreibungen der DNS-Konstrukte der Erfindung bezüglich des WAP-Promotors angegeben wurden, wird betont, dass andere geeignete Promotoren (für eine Erörterung siehe oben) an die F8-kodierenden Polynukleotide in einer ähnlichen Weise ligiert werden können. Die folgende Beschreibung erörtert anhand von Veranschaulichung die Verwendung des BLG-Promotors, um die Effizienz der Expression von F8 und F8-BLG-Fusionsproteinen in Brustdrüsen zu erhöhen.
Mittels der oben beschriebenen Techniken kann F8-kodierende cDNS in ein Schafs-BLG-Gen eingebaut werden. Um beispielsweise diese Konstruktion herzustellen, kann das 11,2 Kbp Schafs-BLG-Gen dahingehend modifiziert werden, dass es eine nur einmal vorkommende EcoRV-Stelle stromaufwärts des Initiator-ATG-Codons im Vektor pUCXSRV aufweist. Die Sequenz um diese Region wird wie folgt verändert:
Dies erlaubt die Klonierung von stumpfendigen Fragmenten stromaufwärts des BLG-Gens. Das 7,5 kbp-Fragment von einem Plasmid (z.B. p122, 2), das eine hF8 kodierende cDNS enthält, wird isoliert, daran stumpfe Enden mit T4 DNS-Polymerase geschaffen und das Produkt an EcoRV-gespaltenen pUCXSRV ligiert. Auf die Transformation von E. coli mit diesem Plasmid hin können Klone, die produziert werden, mittels Restriktionsanalyse der Plasmid-DNS, vorbereitet durch eine Mini-Prep-Methode, und durch Bestimmen der Nukleotidsequenz um die 5'- und 3'-Klonierungsjunktionen für die DNS charakterisiert werden. Klone mit der gewünschten Struktur können zur Schaffung transgener Nager, Schweine, Schafe, Kühe, Pferde und anderer landwirtschaftlicher Nutztiere und Haustiere (Hunde und Katzen), die ein F8-BLG-Fusionsprodukt in ihre biologischen Flüssigkeiten wie oben beschrieben sekretieren, verwendet werden.
Eine menschliche F8-Genomsequenz kann auch an den Schafs-BLG-Promotor fusioniert werden, wie in der folgenden Erörterung veranschaulicht. DNA-Sequenzen, die Schafs-BLG im Plasmid pUCXSRV kodieren, werden zur Generierung eines Vektors deletiert, der lediglich Schafs-BLG-Promotorsequenzen enthält (pUCSV). Wie bei pUCSRV, können stumpfendige Fragmente an diese Promotorregion durch Ligation an eine nur einmal vorkommende EcoRV-Stelle fusioniert werden. Die Se quenzen 5' zu dieser Stelle sind in beiden Plasmiden identisch.
Genomische F8-Sequenzen von größer als etwa 15 kbp können in transgene Tiere trotz ihrer Länge durch Verwendung von Cosmiden mit überlappenden F8-Sequenzen eingeführt werden, woraufhin die erforderliche Anordnung eines gesamten genomischen Polynukleotids, das hF8 kodiert, durch homologe Rekombination in vivo nach Mikroinjektion in eine Embryozelle erreicht wird. Bei Konstrukten, die im vorangegangenen Beispiel nützlich sind, wird ein Plasmid, in welchem die F8-genomischen Sequenzen an Schafs-BLG 3'-flankierende Sequenzen direkt nach dem F8-Translationsterminationscodon zur Gewährleistung einer korrekten Transkription, Termination und Polyadenylierung fusioniert sind, verwendet. Das an Schafs-BLG 3'-flankierende Sequenzen fusionierte hF8-Gen wird aus dem Plasmid ausgeschnitten, die 3'-Überhänge unter Verwendung von Klenow-Enzym repariert und das Produkt an EcoRV-gespaltenen pUCSR ligiert. Nach der Transformation von E. coli werden die resultierenden Klone durch Restriktions-DNA-Analyse und durch Bestimmung der Nukleotidsequenzen um die 5'- und 3'-Klonierungsjunktionen charakterisiert. Klone mit der gewünschten Struktur können in befruchtete Tier-Eizellen zur Schaffung der transgenen Tiere eingeführt werden.
Eine Vielfalt von Vektoren, basierend auf dem BLG-Gen, kann konstruiert werden. Bei auf diesem Ansatz basierenden Konstrukten werden die Sequenzen, die das Schafs-BLG-Protein kodieren, deletiert, die 5'-Promotorsequenzen jedoch beibehalten. Jedes kann ein unterschiedliches Komplement von Intronen aus dem Schafsgen und eine nur einmal vorkommende EcoRV-Stelle besitzen, was die Klonierung von stumpfendigen Fragmenten zwischen den Promotor und die 3'-flankierende Region des Gens erlaubt. Jedes enthält jedoch den BLG-Promotor, die EcoRV-Stelle und die BLG 3'-flankierende Sequenz. Für jede Rekombinante wird das 7,5 kbp KpnI-Fragment von p122 isoliert, werden stumpfe Enden wie oben erzeugt und das Produkt an EcoRV-gespaltene Vektorsequenzen ligiert. Diejenigen Konstrukte mit den geeigneten Strukturen (wie oben beschrieben bestimmt) können zum Exprimieren von F8 in der Milch transgener Tiere verwendet werden.
Doppelt-transgene Mäuse, die native BLG-genomische Sequenzen aufweisen, die als separate, in vivo zu verkettende Konstrukte als zusätzliche flankierende Sequenzen zum BLG-Ziel-cDNS-Konstrukt (wie z.B. BLG-Promotor-Intron I-EcoRV-Intron VI-BLG 3'-Flank plus BLG) injiziert werden, ergeben eine höhere Expression bei häufigerer Frequenz als bei der Verwendung von Konstrukten des BLG-Promotor-F8 cDNS-BLG-Gens oder BLG-Promotor-F8-genomischer Sequenz (± BLG 3'-Ende) beobachtet. Intakte oder native BLG-genomische Sequenzen, die an das BLG-cDNS-Ziel vorligiert sind, können den selben Vorteil ergeben. Dieses gleiche Prinzip kann auf WAP-genomische Sequenzen erweitert werden.
Der Erhalt von Milch von einem transgenen Tier gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt mittels herkömmlicher Methoden. Siehe z.B. McBurney et al., J. Lab. Clin. Med. 64: 485 (1964); Velander et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 89: 12003 (1992).
F8 oder Fragmente oder Proteinprodukte davon können aus der Milch mittels herkömmlicher Methoden ohne nachteiligen Einfluss auf die Aktivität isoliert und gereinigt werden. Eine bevorzugte Methode besteht aus einer Kombination von Anion austausch- und Immunchromatographien, Cryopräzipitationen, Zinkionen-induzierter Präzipitation von entweder Vollmilch- oder Milchmolke-(entfettete Milch)-Proteinen. Für diese Techniken siehe Bringe et al., J. Dairy Res. 56: 543 (1989).
Milch ist für ihren Gehalt an einer Anzahl von Proteasen bekannt, die das Potential zum Abbau von Fremdproteinen aufweisen. Zu diesen zählen hauptsächlich eine alkalische Protease mit tryptischen und chymotryptischen Aktivitäten, eine Serinprotease, ein Chymotrypsin-artiges Enzym, eine Aminopeptidase und eine Säureprotease. Clark et al. (1987), oben. Es mag daher erwünscht sein, neu sekretierten F8 oder Fragmente davon gegen einen proteolytischen Abbau zu schützen. Zu diesbezüglichen Vorsichtsmaßnahmen zählen eine schnelle Verarbeitung der Milch nach der Entnahme und die Zugabe zur Milch von wohl bekannten Inhibitoren der Proteolyse, wie sie etwa aufgelistet sind im SIGMA CHEMICAL CO. CATALOG (Auflage von 1993) auf Seite 850.
Wie oben erörtert, komplexiert vWF unter physiologischen Bedingungen mit zirkulierendem F8 und stabilisiert letzteren gegenüber einem Abbau. Die cDNS für vWF, die verfügbar ist von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, kann zu einem ähnlichen Konstrukt zusammengesetzt werden wie dem in 1 und 2 beschriebenen und zusammen mit dem F8-Konstrukt in einen Embryo mikroinjiziert werden. Unter solchen Bedingungen werden beide Proteine exprimiert und in die Milch sekretiert.
Zur Bestimmung des neu sekretierten F8 und/oder vWF in Milchmolke haben wir den immunoradiometrischen Assay im Wesentlichen gemäß Hoyer et al., Methods Enzymol. 84: 51, 56- 57 (1982) angewendet. F8-Antigene werden mit einem radioiodierten humanen Anti-F8-Fab'-Inhibitor-Antikörper gemessen, der von Patienten mit Autoantikörpern oder transfundierten Hämophilie-Patienten, die Inhibitoren entwickelt haben, stammt. vWF-Antigene werden mit Kaninchen-Antikörpern gemessen, die durch Immunisation mit gereinigtem F8 erhalten werden. Beide Assays verwenden einen radiomarkierten Antikörper, der aus Immunkomplexen ausgereinigt worden ist. Die Antigen-Messung bei diesen Assays basiert auf der differentiellen Löslichkeit der Antigen-Antikörper-Komplexe und des freien Antikörpers in Ammoniumsulfat-Lösungen.
Die folgenden Beispiele werden lediglich zur Veranschaulichung der Erfindung bereitgestellt und sollen nicht als Beschränkung des Rahmens der Erfindung, die in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen beschrieben ist, interpretiert werden.
BEISPIEL 1
Konstruktion von mWAP-hF8 cDNS-Hybridgen
Ein pPoly III-D-Vektor (p120 in 2) wurde mit Kpn 1 restriktiert, stumpfendig gemacht und religiert, um Vektor A ohne eine Kpn 1-Stelle zu erzeugen.
Ein 7,2 kb mWAP-Gen wurde aus dem p121-Plasmid mit Eco R1 ausgeschnitten, stumpfendig gemacht und in Vektor A ligiert, der mit Eco R1 linearisiert war. Das Produkt war ein 9,3 kb Plasmid (markierter p184), in dem das WAP-Gen durch Eco R1 und angrenzende Not 1-Restriktionsstellen flankiert war.
Der teilweise Verdau von Plasmid p122 mit Kpn 1 erzeugte eine 7,5 kb F8-cDNS, flankiert durch Kpn 1-Restriktionsstellen. Diese cDNS wurde dann in Plasmid p184 bei einer Kpn 1-Stelle innerhalb des mWAP-Gens inseriert, um Plasmid p225.11 zu erzeugen, ein 16,8 kb-Plasmid. Das humane F8-Gen flankierend befindet sich ein 2,6 kb 5' mWAP-Segment mit einer stromaufwärts gelegenen Not 1-Stelle und ein 4,6 kb 3' mWAP-Gen mit einer stromabwärts gelegenen Not 1-Stelle.
Wie in 1 gezeigt, kann das 14,7 kb-Insert, umfassend das 5' mWAP/hF8/3' mWAP-Hybridgen, durch Not 1-Verdau des p225.11-Plasmids ausgeschnitten werden, was den 2,1 kb pPoly III-D-Vektor freisetzt.
Das p225.11-Plasmid ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt worden (ATCC-Zugriffs-Nr._____). Die Anmelder sichern hiermit zu, dass: (1) während der Anhängigkeit dieser Patentanmeldung der Zugriff auf die hinterlegten Plasmide Personen ermöglicht werden wird, die durch den Commissioner of Patents and Trademarks korrekt benannt sind; (2) nach Erteilung dieses Patents die Plasmide der Öffentlichkeit ohne Einschränkung für die durchsetzbare Gültigkeitsdauer des Patents, oder für fünf Jahre nach der letzten Anfrage nach einer Probe, oder für dreißig Jahre, was immer am längsten währt, verfügbar gemacht werden; und (3) nicht-lebensfähige Plasmide ersetzt werden.
BEISPIEL 2
Assay für Faktor VIII-Protein in Milchmolke durch einen IR-MA-Assay
Der bei Hoyer (1982, ibid) beschriebene IRMA-Assay wurde zur Abschätzung der Konzentration des rekombinanten menschlichen Faktor VIII (hrF8) in der Milchmolke transgener Mäuse, die mit dem oben beschriebenen mWAP-Promotorsystem geschaffen wurden, angewendet.
Materialien:

Molke, Maus f2.1.9.10
Molke, Maus f2.13.9
Molke, Maus f2.1.13.13
Molke, Maus f2.1.22.8
Molke, Kontrollmaus D15

Die Ergebnisse des IRMA-Tests sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.

* Proben werden bei –20°C gelagert. Bei 2 Tieren führte die Lagerung der Milch bei 4°C zu verminderten IRMA-Werten.

Relativ zum Hintergrundwert für diese Methode (Kontrollmaus D15) war die Antigen-(F8)-Produktion im Durchschnitt um etwa 250% bei drei von vier Mäusen erhöht.
BEISPIEL 3
Western-Blots der Maus-Molkeproben
Milchmolken von zwei transgenen Mäusen (F2 und F3) wurden immungeblottet, um rekombinanten humanen Faktor VIII (rhF8) in den Proben zu identifizieren. Die Western-Blots sind in 3 gezeigt.
Thrombinpuffer: 0, 15M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 0, 01 Tween 80, pH 7,4.
Thrombin: 2 E/ml
TBS: 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0
TBS/T: TBS mit 0,05% Tween 20
TBS/T/NFDM: mit 5% fettfreier Trockenmilch Primärantikörper in 1X TBS/T/NFDM:
mAb 413 (2 μg/ml Endkonzentration; Anti-Schwerkette)
mAb 37 (5 μg/ml Endkonzentration; Anti-Leichtkette)
Sekundärantikörper, verdünnt 1:6000 in 1X TBS/T/Streptavidin, alkalische Phosphatase-Konjugat (GIBCO).
LumiPhos Luminescent Biotin-konjugiertes Entwicklungssystem (Boehringer Mannheim).
Verfahrensweise:

1) Molkeproben (200 μg Gesamtprotein) wurden mit Thrombin (130 μE/μl) für 5 min verdaut. Nach Zugabe eines gleichen Volumens an 2X Probenpuffer wurden die Proben für 5 min gekocht und schnell in Eis abgekühlt.
2) Nach Ablaufenlassen der Proben auf einem 1,2 mm dicken 7,5% Acrylamid-Laemmli-Gel wurden die Proteine auf eine Nitrocellulosemembran bei 12 V für 1,5 Std. elektrogeblottet. Die Membranen wurden in TBS bei 4°C gelagert.
3) Nach Blockieren der Membranen in TBS/T/NFDM für 1 Std. und dreimaligem Waschen in TBS/T wurde die Membran einem Primärantikörper für 2 Std. bei Raumtemperatur ausgesetzt, überschüssiger Antikörper entfernt und die Membran dreimal in TBS/T gewaschen.
4) Membranen wurden einem Sekundärantikörper für 15 min bei Raumtemperatur ausgesetzt, dann viermal mit TBS/T gewaschen.
5) Nach Inkubieren der Membranen in LumiPhos gemäß den Anleitungen des Herstellers für 20 min im Dunklen wurde ein Kodak XAR-5-Film mit den Membranen für 25 min belichtet und der Film in einem Densitometer ausgelesen.

Die erste Bahn auf der linken Seite besteht aus Molekulargewichts-Markern von 45 bis 200 kDa. Die zweite Bahn von links stellt einen standardmäßigen hF8 dar, der eine Hauptbande bei etwa 80 kDa und eine andere bei etwa 210 kDa zeigt. Die dritte Bahn von links zeigt Kontroll-Molkeproteine. Die F2- und F3-Bahnen zeigen transgene Milchmolken; es zeigten sich stark färbende neue Bande bei etwa 80 kDa relativ zur Kontrolle, parallel zum standardmäßigen hF8. Die F2- und F3-Bahnen zeigen ebenfalls intensiv färbende Bande bei etwa 120 kDa, eine Bande, die relativ blass bei der Kontrolle ist und bei standardmäßigem hF8 scheinbar abwesend ist. Ihre Identität ist unbekannt.
Zusammengefasst weisen die Daten aus Beispielen 2 und 3 nach, dass die transgenen Mäuse der Erfindung authentischen rekombinanten menschlichen F8 exprimierten und dieses Protein in die Milch der Tiere sekretierten.

Claims

Transgenes Schwein, das ein vollständig biologisch aktives rekombinantes menschliches Faktor-VIII-Protein oder ein Polypeptidfragment oder eine Modifikation hiervon exprimiert, wobei die Fragmente und Modifikationen auch vollständig biologisch aktiv sind, und das das exprimierte Protein in die Milch des Schweines sekretiert, wobei das transgene Schwein ein weibliches Schwein umfasst, in dessen Genom ein stabil integriertes DNS-Konstrukt eingefügt ist, wobei das DNS-Konstrukt einen Milchproteinpromotor umfasst, der operativ gekoppelt ist an eine exogene doppelsträngige DNS-Sequenz, die das Faktor-VIII-Protein oder das Fragment oder die Modifikation hiervon kodiert, die funktionell gekoppelt ist mit einer DNS, die ein Signalpeptid kodiert, wobei der Promotor spezifisch aktiv ist in Brustdrüsenzellen, wobei das Signalpeptid wirksam ist in der Einbringung von neu exprimiertem Faktor VIII in die Milch des weiblichen Schweins, und wobei die exogene doppelsträngige DNS-Sequenz Faktor-VIII cDNS ist, die keine Faktor-VIII Introne umfasst.
Transgenes Schwein nach Anspruch 1, bei dem das Faktor-VIII-Protein ein Vorläuferprotein oder ein Heterodimer ist.
Transgenes Schwein nach Anspruch 2, bei dem das Vorläuferprotein oder heterodimere Protein ein Glycoprotein von etwa 2332 Aminosäureresten umfasst, beinhaltend eine etwa 80 kDa C-Terminal-Aminosäuresequenz und eine etwa 210 kDA N-Terminal-Aminosäuresequenz.
Transgenes Schwein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der in dem Brustdrüsengewebe des transgenen Schweines aktive Milchproteinpromotor ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus saurem Molkeprotein, Kasein, Alpha-Laktalbumin und Beta-Laktoglobulin Promotoren.
Transgenes Schwein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das DNS-Konstrukt ferner eine 3'-untranslatierte Region stromabwärts der DNS-Sequenz, die das gewünschte rekombinante Protein kodiert, umfasst.
Transgenes Schwein nach Anspruch 5, bei dem die 3'-untranslatierte Region ein Poly-A-Signal bereitstellt.
Verfahren zur Herstellung eines vollständig biologisch aktiven rekombinanten menschlichen Faktor-VIII-Proteins, mit folgenden Schritten: (a) Bereitstellung eines transgenen weiblichen Schweines, in dessen Genom ein DNS-Konstrukt stabil integriert worden ist, wobei das DNS-Konstrukt einen Milchproteinpromotor umfasst, der operativ gekoppelt ist an eine exogene doppelsträngige DNS-Sequenz, die ein Faktor-VIII-Protein kodiert, sowie eine funktional gekoppelte DNS-Sequenz, die ein Signalpeptid kodiert, wobei der Promotor spezifisch aktiv ist in Brustdrüsenzellen des transgenen Schweines, wobei das Signalpeptid wirksam ist in der Einbringung von neu exprimiertem Faktor-VIII in die Milch des Schweines, und wobei die exogene doppelsträngige DNS-Sequenz Faktor-VIII cDNS ist, die keine Faktor-VIII Introne aufweist; (b) Bewirken, dass das weibliche Schwein laktiert; (c) Sammeln von Milch von dem weiblichen Schwein; und (d) Isolieren des Proteins aus der Milch.
Verfahren zur Herstellung eines transgenen weiblichen Schweines, das vollständig biologisch aktives rekombinantes menschliches Faktor-VIII-Protein oder ein Polypeptidfragments oder eine Modifikation hiervon erzeugt, wobei die Fragmente und Modifikationen auch vollständig biologisch aktiv sind, in dem Brustgewebe des Schweins, und das das Protein in die Milch des Schweines sekretiert, mit folgenden Schritten: (a) Bereitstellung eines DNS-Konstrukts mit einem Milchproteinpromotor, der operativ gekoppelt ist mit einer exogenen doppelsträngigen DNS-Sequenz, die das Faktor-VIII-Protein kodiert, das operativ gekoppelt ist mit einer DNS, die ein Signalpeptid kodiert, wobei der Promotor spezifisch aktiv ist in Brustdrüsenzellen des transgenen Schweines, wobei das Signalpeptid wirksam ist in der Einbringung von neu synthetisiertem Faktor-VIII in die Milch des Schweines, und wobei die exogene doppelsträngige DNS-Sequenz Faktor-VIII cDNS ist, die keine Faktor-VIII Introne aufweist; (b) Reinigen des DNS-Konstrukts; (c) Platzierung des gereinigten DNS-Konstrukts in einem Embryo eines weiblichen Schweines unter Bedingungen, bei denen das DNS-Konstrukt stabil in das Genom des Schweines integriert ist bzw. wird; und (d) Bewirken, dass der Embryo sich im Rahmen einer Schwangerschaft entwickelt, um ein transgenes Schwein zu erzeugen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, bei dem das DNS-Konstrukt als Plasmid enthalten ist.
Transformierte Zellen eines transgenen Schweines nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Menschliches Faktor-VIII-Protein, das durch die transformierten Zellen gemäß Anspruch 10 sekretiert ist.