DE69534228T2 - Nachweis von bestandteilen mittels der lumineszenz-dauer - Google Patents

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    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6445Measuring fluorescence polarisation

Description

  • Molekularer Sauerstoff ist eine kritische Bedingung für eine zellulare Funktion bei Lebewesen, während der Schutz vor O2 für die Funktion von Pflanzenenzymen, wie z.B. den Nitrogenasen, benötigt wird. Lebewesen und insbesondere Säugetiere sind in kritischer Weise von der kontinuierlichen Zufuhr und Verwendung von O2 bei den Prozessen abhängig, die ein Leben aufrechterhalten. Dies gilt insbesondere für Gewebe, die einen hohen O2-Verbrauch haben, wie z.B. Nervengewebe und Muskeln, sowohl gestreifte als auch glatte. Die Unterbrechnung der Sauerstoffzufuhr zu diesen Geweben für eine Zeitdauer so kurz wie Minuten, kann zu einem Tod der Zelle führen und zum Verlust von Funktionen, die für eine Organfunktion kritisch sind. Darüber hinaus ist es die Sauerstoffkonzentration innerhalb von Geweben, anstelle der innerhalb von Blut oder anderer Körperflüssigkeiten, die letztlich die zellulare Funktion unterstützt. Daher ist die Messung der Sauerstoffkonzentrationen von Körperflüssigkeit und Gewebe von zentraler Bedeutung in der klinischen Medizin, wobei eine eingeschränkte Sauerstoffzufuhr zu Geweben bei einer Vielzahl vaskulärer Erkrankungen auftritt, wie z.B. Arteriosklerose, Diabetes, Sichelzellenerkrankung und beeinträchtigte Wundheilung, um einige zu nennen. Es ist daher nicht überraschend, daß eine Vielzahl von Patenten für Verfahren und Vorrichtungen erteilt wurden, die die Sauerstoffkonzentration von Blut und Körperflüssigkeit messen, und das US-Patent Nr. 5,186,173 des Erfinders der vorliegenden Erfindung (nachfolgend das Zuckerman '173 Patent genannt) für die erste Messung einer Sauerstoffkonzentration in vivo.
  • Diese Patente, obwohl sie sich alle mit Problemen der nichtinvasiven Bestimmung von Körperflüssigkeit oder Gewebe-PO2 beschäftigen, leiden an Nachteilen, die ihre weite Anwendung in der klinischen Medizin ausschließen. Um die Anforderung einer nichtinvasiven Messung zu erreichen, haben sich ältere Patente optischen Methoden zugewandt, die das Unterdrücken einer Phosphoreszenz oder Fluoreszenz eines Farbstoffes durch O2 zum Gegenstand haben. Beispielsweise haben Patente wie das US-Patent Nr. 4,476,870 (Peterson et al.) Katheteranordnungen entwickelt, bei denen eine fluoreszierende Substanz, wie z.B. Perylen, in einem abgedichteten Katheter beherbergt ist, der in ein Blutgefäß eingesetzt werden kann und dessen Fluoreszenzunterdrückung durch O2 im Blut unter Verwendung von Faseroptiken gemessen wird. Diese Vorrichtung, obwohl sie die Fähigkeit zur Messung einer Körperflüssigkeit oder von Blut-PO2 liefert, leidet an zwei Nachteilen. Erstens kann das PO2 des Blutes nur nach einer externen Kalibrierung der Kathetersonde vor ihrem Einsetzen in ein Blutgefäß gemessen werden; und zweitens liefert diese Technik keine topographische Information, da das PO2 an einem einzigen Ort gemessen wird, nämlich an der Sondenspitze. In dem US-Patent Nr. 4,810,655 behaupten Khalil et al., das Erfordernis einer vorherigen Kalibrierung des Katheters vor dessen jeglicher Verwendung dadurch zu überwinden, daß die Lebensdauer der Phosphoreszenz gemessen wird, anstelle der Intensität. Obwohl in der Theorie ein direktes Lebensdauersystem das Erfordernis einer vorherigen Kalibrierung überwinden sollte, ändern sich in der Praxis, wie in Tabelle 4 des Khalil et al. Patentes gezeigt, die Lebensdauern der Phosphoreszenz des angewandten Porphyrins mit der Lichtbestrahlung, was eine Kalibrierung vor der Anwendung noch nötig macht. Zusätzlich wären die zeitauflösenden direkten Lebensdauersysteme mühsam umzusetzen und weniger genau als ein Ansatz mit stabilem Gleichgewichts-Zustand. Vanderkooi und Wilson (US-Patent Nr. 4,947,850) entwickelten ein Verfahren, das auf der Bestimmung der Lebensdauer der Phosphoreszenz einer O2-sensitiven Testsubstanz basiert, wie z.B. ein Metall-Porphyrin, das fest an Eiweiß gebunden ist, das auf einer Zeitskala in Bruchteilen von Millisekunden (10–3 sec) phosphoresziert und dessen Phosphoreszenzlebensdauer durch O2 reduziert (unterdrückt) ist. Hier ist die O2-sensitive Sonde ein phosphoreszierendes Molekül, das in den Blutstrom injiziert werden kann, wodurch die topographische Bestimmung des PO2 des Blutes innerhalb des Gefäßsystems eines abgebildeten Gewebes erlaubt. Allerdings können diese Sondenmoleküle aufgrund der Selbst-Unterdrückung der Metall-Porphyrine sowie der anderen bei Vanderkooi beschriebenen Substanzen nicht allein benutzt werden. Das heißt, die Selbst-Unterdrückung führt zu Änderungen der Abfallzeit der Probenkonzentrationsabhängigkeit, die größer ist als die von dem molekularen Sauerstoff induzierte. Da es unmöglich ist, die genaue Sondenkonzentration im Blut zu kennen, aufgrund von Lecks an der Injektionsseite und Änderungen des Blutvolumens bei verschiedenen Lebewesen oder Menschen, müssen sie die Sonde modifizieren, um die Selbst-Unterdrückung zu eliminieren. Wie in dem US-Patent Nr. 4,947,850 (Sp. 3, Z. 15) beschrieben "werden Porphyrine bevorzugt angewandt, und diese Zusammensetzungen werden vorzugsweise mit proteinhaltigen Zusammensetzungen gemischt, die sich an die phosphoreszierende Zusammensetzung binden...eiweißhaltige...Zusammensetzungen sind bevorzugt.". Wie in deren Publikation von Vanderkooi, J. et al. "An Optical Method for Measurement of Dioxygen Concentration Based Upon Quenching of Phosphorescene", J. Biol. Chem., 262(12): 5476–5482 (April 1987), wird diese Technik einfach nicht mit Eiweiß oder anderen Proteinen mit großer molekularer Masse, die an das Sondenmolekül gebunden sind, arbeiten. Wenn es intravenös in das Blut injiziert wird, verhindert das Protein mit großer molekularer Masse (M.W.=67,000), daß das Sondenmolekül die kleinen Verbindungen oder Lipidmembranen der Blutgefäßwand passieren und begrenzt dadurch die Messung der Sauerstoffkonzentration in dem Blut. Ähnlich beschreibt das US-Patent Nr. 4,579,430 (Bille) eine Erfindung, die die Bestimmung der Sauerstoffsättigung, des Prozentsatzes der Bindung von O2 an das Blut-Hemoglobin inner halb eines retinalen Blutgefäßes erlaubt. Bei einer Vielzahl von Krankheiten bleibt die Sauerstoffsättigung und die Sauerstoffkonzentration im Blut normal, wie in älteren Patenten offenbart, obwohl man annimmt, daß das Gewebe einen Sauerstoffmangel hat. Solche Krankheiten sind Diabetes, Retinopathie von Frühgeborenen und hypertonische und arteriosklerotische Krankheiten. In ähnlicher Weise wird bei langen Operationen, wie z.B. Bypass-Operationen, Halsschlagaderoperationen, und während längerer Intensivpflege die Sauerstoffsättigung und/oder -konzentration des Blutes sorgfältig überwacht und aufrechterhalten, jedoch moderat, da bekannt wurde, daß schwere Gehirnschädigungen aufgrund von Sauerstoffmangel auftreten. Es ist die Sauerstoffkonzentration innerhalb von Geweben, die für deren Funktionieren und Gesundheit maßgeblich ist, und die Gewebesauerstoffkonzentration hängt von der Sauerstoffverbrauchsrate des Gewebes, der Blutgeschwindigkeit und dem Gefäßdurchmesser ab, zusätzlich zur Sauerstoffkonzentration oder -sättigung des Blutes. Daher ist es von höchster Bedeutung, in der Lage zu sein, das PO2 des Gewebes räumlich und zeitlich zu messen.
  • Die nichtinvasive, topographische Messung des Gewebe-PO2 wurde in dem Zuckermann '173 Patent angesprochen. In diesem Patent wird eine hochfettlösliche Testsubstanz, wie z.B. Natrium-Pyrenbutyrat, intravenös oder intraperitoneal injiziert oder örtlich appliziert, wenn geeignet. Die fettlösliche, biokompatible Testsubstanz verläßt das Blut und häuft sich in den Lipid-Doppelschichten der Gewebezellen an. Hier ist die Testsubstanz im wesentlichen das Gewebe selbst, wenn sich Pyrenbutyrat innerhalb der Lipid-Doppelschichten ihrer Zellen anhäuft. Dieses und das digitale Abbildungssystem, das detailiert in dem Patent beschrieben ist, erlaubt eine erste topographische Bestimmung der Gewebesauerstoffkonzentration, die die Gesundheit und Funktion des Gewebes aufrechterhält. Die Konzentration von O2 wird in dem Zuckermann '173 Patent durch Messung der Fluoreszenzintensität bestimmt, entsprechend der Stern- Volmer-Gleichung, die in Ausdrücken der Fluoreszenzintensität geschrieben ist. Die Erfindung des Zuckermann '173 Patentes hat die zwei Nachteile, die ihre klinische Anwendung ausschließen und die derzeit ihre Anwendbarkeit bei Forschungen an Labortieren begrenzt, obwohl sie die erste nicht-invasive Bestimmung des Gewebe PO2 räumlich und zeitlich erlaubt. Die wesentlichste Einschränkung rührt von der Tatsache, daß die Fluoreszenzintensität sowohl durch die Konzentration des Pyrenbutyrat im Raum innerhalb des Gewebes bestimmt wird, die sich aufgrund der räumlichen Differenzen bei der Lipidzusammensetzung der Zellen innerhalb des Gewebes variiert als auch durch die räumliche Verteilung der Gewebesauerstoffkonzentration. Um dieses Problem zu umgehen und um die Sauerstoffkonzentrationen an einer Vielzahl von Orten zu extrahieren, wird die Fluoreszenzintensität an jedem Ort ins Verhältnis gesetzt gegenüber der Fluoreszenzintensität an demselben Ort, wenn das Gewebe auf ein PO2 von 0 mm Hg (in Abwesenheit von Sauerstoff) gebracht ist. Dies kann dadurch erreicht werden, daß das Lebewesen mit 100% N2 am Ende des Experimentes beatmet wird. Ein solches Vorgehen kann klinisch nicht bei Menschen angewandt werden, da es zweifellos zu einem Zelltod führen würde, der sich in einer Gehirnschädigung oder dem Tod zeigen würde. Der zweite Nachteil der Erfindung des Zuckermann '173 Patentes liegt in den optischen Filterungseffekten von Blut in Bezug auf die Fluoreszenzintensitäten bei der Emissionswellenlänge von Pyrenbutyrat. Dies kann in ähnlicher Weise in einer Laborsituation durch separate Messung der optischen Dichte des Blutes innerhalb des Gefäßsystems des abgebildeten Gewebes korrigiert werden.
  • Beide Nachteile der Vorrichtung und des Verfahrens des Zuckermann '173 Patentes können durch eine direkte Messung der Fluoreszenzlebensdauer (Abklingrate) anstelle der Fluoreszenzintensität vermieden werden. Die Messung der Fluoreszenzlebensdauer bei einem vorgegebenen PO2 und innerhalb eines vorgegebenen Gewebes kann, wenn es bei einer Laboreichung des Instrumentes bestimmt wird, die Anforderung vermeiden, das Gewebe auf ein PO2 von 0 mm Hg in der Klinik zu bringen, da die Fluoreszenzabklingkonstante unabhängig von der Pyrenbutyratkonzentration ist und da es in ähnlicher Weise durch Absorption von Blut innerhalb des Gefäßsystems unbeeinflußt ist. Allerdings tritt die Fluoreszenzlebensdauer auf einer Zeitskala von Nanosekunden (10–9 sec) auf und zusätzlich zu dem mühsamen und teuren erforderlichen Apparat, der für die direkte Messung derart kurzer Fluoreszenzlebensdauern an einer Vielzahl von Orten benötigt wird, würde eine intensive gepulste Lasererregung (Pulsdauer <20 Nanosekunden) des Gewebes mit einer ultravioletten Erregungswellenlänge nötig sein, um verwertbare Signal-Rausch-Verhältnisse zu erreichen. Da die Quanteneffizienz von Pyrenbutyrat und anderer fluoreszenter Testmoleküle generell kleiner als 0,5 beträgt, würde eine Photonenabsorption, die nicht in durch Fluoreszenz emittierte Strahlung umgewandelt wird, in Wärme umgewandelt, wodurch eine Zerstörung des Gewebes verursacht wird. Eine Gewebezerstörung, die auf einen intensiven Laserimpuls folgt, der bei einer zeitauflösenden direkten Fluoreszenzlebensdauerbestimmung verwendet wird, ist der hauptsächliche Nachteil bei der Anwendung dieses Ansatzes in vivo. Hieraus resultiert die Anforderung für ein Mittel für die topographische Messung der Sauerstoffkonzentration in vivo in einem Gleichgewichtszustand anstelle eines Zeitauflösungsverfahrens, das eine indirekte Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer liefert.
  • Im Hinblick auf die Nachteile des Standes der Technik ist es wünschenswert, ein Mittel zu haben, das in verschiedenen Formen angewandt werden kann und das die Bestimmung von PO2 in Körperflüssigkeit, Blut und Gewebe räumlich und zeitlich durch eine indirekte Bestimmung der Fluoreszenzlebenszeit erlaubt. Dieses Mittel würde die Konstruktion eines O2-sensitiven Katheters erlauben, der in ein Blutgefäß eingesetzt werden kann und der keine mühsame externe Kalibrierung vor jeglicher seiner Verwendung erfordert. In ähnlicher Weise würde ein solches Mittel mittels intravenöser Injektion einer biokompatiblen fettlöslichen fluoreszierenden Farbe und durch Anwendung digitaler Bildverarbeitungstechniken die topographische Bestimmung des Gewebe-PO2 erlauben, als auch die Bestimmung des Blut-PO2 innerhalb des Gefäßsystems des abgebildeten Gewebes. Durch eine Erweiterung würde die Anwendung von optischen seriellen Schnittmethoden die erste Bestimmung der Gewebe- und Blut-PO2-Bestimmungen in drei Dimensionen erlauben und zwar tomographisch innerhalb eines Volumens des abgebildeten Gewebes. Noch wichtiger ist es, daß ein solches Vorgehen für klinische Anwendungen eminent geeignet ist, die die Diagnose und Behandlung von vaskulären, metabolischen oder anderen Krankheiten bei Menschen bedingt. Darüber hinaus würde eine Methodik für die indirekte Gleichgewichtszustands-Bestimmung der Lumineszenzlebensdauer in gleicher Weise für die Messung der Konzentrationen vieler anderer Substanzen von biologischer und physikalischer Bedeutung anwendbar sein zusätzlich zu O2 und zwar zeitlich und räumlich.
  • Ziele der Erfindung
  • Dementsprechend ist es ein generelles Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung für die Bestimmung der Konzentration und räumlichen Verteilung verschiedener Substanzen von biologischer und physikalischer Bedeutung in vivo und in vitro durch eine Bestimmung der Lumineszenzlebensdauer im stationären Zustand zu schaffen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine Vorrichtung für die topographische Bestimmung der Sauerstoffkonzentration oder von PO2 von Gewebe und Körperflüssigkeit in vivo in einem abgebildeten Gewebe zu schaffen sowie auch eine Vorrichtung für die Messung von PO2 in Blut oder Körperflüssigkeit mit einem Faseroptikkatheter, der die Nachteile des Standes der Technik überwindet.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine in vivo-Vorrichtung für die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration in Gewebe und Körperflüssigkeit zu schaffen, die eine fluoreszierende Testsubstanz verwendet, deren Fluoreszenzlebensdauer durch molekularen Sauerstoff unterdrückt ist und bei dem die Sauerstoffkonzentration oder PO2 durch Messen der Fluoreszenz-Anisotropie der fluoreszierenden Testsubstanz bestimmt wird.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine in vivo-Vorrichtung für die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration von Gewebe und Körperflüssigkeit zu schaffen, die genau, nicht eindringend ist und reproduzierbare Resultate liefert.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese und weitere Aufgaben und Ziele der Erfindung werden dadurch erreicht, daß eine Vorrichtung für die Bestimmung der Konzentration und der Verteilung von vielen Substanzen mit biologischer und physikalischer Bedeutung in vivo und in vitro angegeben wird, mittels einer Bestimmung der Lumineszenzlebensdauer im stationären Zustand. Bei dem generellen Beispiel ist ein Fluorophore, dessen angeregter Zustand durch die betreffende Substanz unterdrückt wird, frei, eine Brown'sche Drehung auszuführen und zwar allein oder wenn mit einem Trägermolekül verbunden, innerhalb eines Mediums mit geeigneter Viskosität. Das Analysemedium wird mit kontinuierlichem, linear polarisiertem Licht mit einer Wellenlänge bestrahlt, die von dem Fluorophore stark absorbiert wird. Die emittierte Fluoreszenz wird in Vektorkomponenten parallel und senkrecht zur Ebene der Polarisation des Erregungslichtes aufgelöst, wodurch die Berechnung der Fluoreszenzanisotropie des bestrahlten Exemplars ermöglicht wird. Die Konzentration des Quenchers wird durch Anwendung einer mathematischen Funktion bestimmt, die die Fluoreszenzanisotropie des Fluorphores auf die Konzentration des Quenchers bezieht. Für die Bestimmung der Konzentration von Substanzen, die selbst angeregte Zustände nicht unterdrücken, wird eine Menge der zu messenden Substanz mit einem Löschmolekül konjugiert oder ein Energietransferakzeptormolekül und eine Konkurrenzreaktion werden installiert, bei der die luminiszierend markierte Substanz und die nicht markierte Substanz innerhalb der Probe an Seiten des markierten Trägermoleküls konkurrieren. In dem Ausmaß, in dem die Konzentration der unmarkierten Substanz in der Probe ansteigt und markiertes Material auf dem Trägermolekül verdrängt, wird die Lumineszenzlebensdauer des Träger-Fluorphores ansteigen. Die Fluoreszenzanisotropie wird bei dem Emissionsband der lumineszierenden Markierung auf dem Trägermolekül gemessen und die Konzentration der zu messenden Substanz wird durch Anwendung einer empirisch bestimmten mathematischen Funktion bestimmt, die die Fluoreszenzanisotropie auf die Konzentration der zu messenden Substanz bezieht.
  • Bei dem spezifischen Beispiel des Quencher-O2 werden die Ziele der Erfindung durch eine Vorrichtung für die topographische in vivo-Bestimmung der Konzentration von Sauerstoff oder PO2 von Gewebe und Körperflüssigkeit in einem abgebildeten Gewebe erreicht sowie eine Vorrichtung für die Messung von PO2 in Blut oder Körperflüssigkeit mit einem Faseroptikkatheter geschaffen. In dem ersten Ausführungsbeispiel wird eine lipid-lösliche, biokompatible fluoreszierende Testsubstanz einem Körper eines Lebewesens verabreicht und sammelt sich an den Lipid-Doppelschichten dessen Gewebezellen an. In dem zweiten Ausführungsbeispiel wird die fluoreszierende Testsubstanz mit einem Protein mit großer Molekularmasse konjugiert, was bewirkt, daß es in der Körperflüssigkeit, wie z.B. Blut, zurückgehalten wird. In dem dritten Ausführungsbeispiel mit einem Katheterdesign, bei dem das PO2 an der Katheterspitze gemessen wird, enthält die Spitze die fluoreszierende Testsubstanz, die in einem viskösen nicht-polarisierten Lösungsmittel aufgelöst ist. Bei allen beschriebenen Vorrichtungen wird eine fluoreszierende Testsubstanz bevorzugt, deren Fluoreszenzlebensdauer durch molekularen Sauerstoff unterdrückt wird und die Sauerstoffkonzentration oder PO2 wird durch Messen der Fluoreszenzanisotropie der fluoreszierenden Testsubstanz bestimmt. Die Körperflüssigkeit oder das Gewebe, die die biokompatible fluoreszierende Testsubstanz enthalten oder die fluoreszierende Testsubstanz in einem nicht-polarisierten Lösungsmittel innerhalb einer Katheterspitze werden mit kontinuierlichem linear polarisiertem ultraviolettem Licht mit einer Wellenlänge bestrahlt, die von dem Fluorphore stark absorbiert wird. Die emittierte Fluoreszenz wird in ihre Vektorkomponenten parallel und rechtwinklig zur Polarisationsebene des Anregungslichtes aufgeteilt, wodurch die Berechnung der Fluoreszenzanisotropie des bestrahlten Gegenstandes ermöglicht wird. PO2 des Gewebes und/oder von Körperflüssigkeit einer abgebildeten Substanz oder PO2 einer Flüssigkeit an der Spitze eines abgedichteten Katheters werden durch Anwendung einer mathematischen Funktion bestimmt, die die Fluoreszenzanisotropie eines durch O2 unterdrückbaren Fluorphors auf die Sauerstoffkonzentration oder den Partialdruck bezieht.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • Weitere Ziele und viele vorhandene Merkmale der vorliegenden Erfindung werden leicht verständlich, wenn sie unter Bezugnahme auf die nachfolgende Beschreibung im Zusammenhang mit den anhängenden Zeichnungen verstanden werden, in denen:
  • 1 ist ein theoretischer Graph der Fluoreszenzanisotropie eines durch O2 löschbaren Fluorphores, das in einem nicht-polaren Lösungsmittel aufgelöst ist, als Funktion des Sauerstoffpartialdruckes (PO2) der das Fluorphor enthaltenden Lösung. Eine Familie von Kurven ist aus der Gleichung 6 für den Bereich der Brown'schen Drehbewegung (R) abgeleitet, von der bekannt ist, daß sie in Lipiden lebender Gewebezellen auftritt. Die Fluoreszenzanisotropie steigt monoton mit ansteigendem PO2 bei allen Rotationsraten an.
  • 2 ist eine schematische Darstellung eines Abbildungsapparates, der zur Bestimmung der topographischen Verteilung von PO2 von Gewebe oder Körperflüssigkeit in einem abgebildeten Exemplar verwendet wird.
  • 3 ist eine Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung, die zur Messung der Sauerstoffkonzentration oder des PO2 eines Fluides verwendet wird, das die Spitze eines abgedichteten Faseroptikkatheters kontaktiert.
  • 4 ist eine schematische Darstellung eines Datenprozessors (im Mikroprozessordesign), der dazu verwendet werden kann, die notwendigen Berechnungen zur Bestimmung des PO2 an der Katheterspitze auszuführen. MUX ist ein Multiplexer, T ist die Temperatur und G ist eine empirische Konstante, die dazu verwendet wird, die dichroische Spiegelungstransmissions-Effizienz in den parallelen und rechtwinkligen Ebenen für linear polarisiertes Licht zu korrigieren. I1 und I2 sind die aufgelösten Intensitäten der Fluoreszenzemission parallel bzw. rechtwinklig zur Polarisationsebene des Anregungslichtes.
  • 5 ist eine graphische Darstellung der PO2 Pegel, die parallel (oberes Bild) und rechtwinklig (unteres Bild) an einer retinalen Arteriole innerhalb der Retina eines isolierten und durchstoßenen Rinderauges gemessen wurden. Der longitudinale PO2-Abfall parallel zur Arteriole paßt (durchgezogene Linie) zur angegebenen theoretischen Funktion, während das rechtwinklig zur Arteriole gemessene PO2 dem mathematischen Modell von Krogh entspricht (durchgezogene Linie). R2 ist der Koeffizient der Bestimmung.
  • Detailierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele
  • Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit mehreren Problemen, die im Stand der Technik vorhanden sind. Die Erfindung basiert auf dem gut akzeptierten physikalischen Prinzip, daß Absorption und Emission von Photonen durch Fluorphore durch elektrische Dipolübergangsmomente auftreten, die gut definierte Ausrichtungen innerhalb des Molekularrahmens des Fluorphores haben. In einem nicht-polaren Lösungsmittel oder einer Lipid-Doppelschicht, die zufällig orientierte Fluorphore enthält, können nur geeignet orientierte Moleküle durch linear polarisiertes Licht angeregt werden, wodurch ein Ungleichgewicht der Ausrichtung von angeregten und fluoreszierenden Molekülen geschaffen wird. Diese Anisotropie und ihre drehungsmäßige Auflösung werden in der Polarisation des emittierten Lichtes wiedergegeben. Der Fall einer zeit-auflösenden Fluoreszenz-Anisotropie, die durch einen Impuls von linear polarisiertem Licht induziert wurde, kann durch folgende Gleichung beschrieben werden: A(t) = A0e–6 R t (1)wobei A die Fluoreszenzanisotropie ist, t die Beobachtungszeit nach gepulster Anregung, R ist die mittlere molekulare Drehzeit in radian/sec, und A0 ist die Fluoreszenzanisotropie im "gefrorenen" Zustand, bei Abwesenheit einer Brown'schen Drehung. Allerdings ist, wenn die Fluoreszenzanisotropie in einem Gleichgewichtszustand gemessen wird, mit kontinuierlicher Erregung, A ein Mittelwert des zeit-aufgelösten Abfalls über der Zeit gewichtet mit dem Abfall der Intensität:
    Figure 00130001
    wobei τ die Fluoreszenzlebensdauer des Fluorphores ist. Führt man die Transformationsergebnisse in der Perringleichung aus:
    Figure 00130002
    die ein Ideal für sphärische Moleküle ist, erhält man:
    Figure 00130003
    wobei Rg die Gaskonstante, T die Temperatur, η die Viskosität und v das hydrodynamische Volumen des Fluorphores ist. Die vorliegende Erfindung berücksichtigt zum ersten Mal den Fall eines O2-unterdrückten Fluorphores, wie z.B. Natriumpyrenbutyrat, das innerhalb einer nicht-polaren Lösung oder einer Lipid-Doppelschicht angesammelt ist, wie es in allen Gewebezellen im Körper gefunden wird. Die Fluoreszenzlebensdauer des Fluorphores kann auf die Sauerstoffkonzentration oder den Partialdruck durch die folgende Form der Stern-Volmer-Gleichung bezogen werden:
    Figure 00140001
    wobei α der Bunsen-Löslichkeitskoeffizient ist, KD die dynamische Löschkonstante und τ0 die Fluoreszenzlebensdauer in Abwesenheit von O2 ist. Durch Kombinieren der Gleichungen 3 und 5 leiten wir eine mathematische Beziehung ab, die formal den Sauerstoffpartialdruck auf die Fluoreszenzanisotropie im Gleichgewichtszustand bezieht:
  • Figure 00140002
  • Folglich ist Gleichung 6 das zentrale und neue Konzept der vorliegenden Erfindung und demonstriert, daß Fluoreszenzanisotropiemessungen im Gleichgewichtszustand als ein präzises Verfahren verwendet werden können, die in einfachen Konfigurationen angewandt werden können um zu bestimmen (i) das PO2 von Geweben räumlich und zeitlich anschließend an die Ansammlung eines O2-löschbaren Fluorphores innerhalb von Lipid-Doppelschichten ihrer Gewebezellen, (ii) die topographische Verteilung des Blut-PO2 anschließend an die Ansammlung des Fluorphores innerhalb der Lipid-Doppelschichten von roten Blutzellen oder für ein Fluorphor, das einem Protein konjugiert ist, welches in den Blutstrom injiziert wurde und (iii) das PO2 an der Spitze eines einsetzbaren Katheters, dessen Spitze ein Fluorphor, wie z.B. ein Pyren in einer nicht-polaren Lösung, oder ein Lipid, wie z.B. ein Mineral oder Paraphinöl, enthält, das von der Probe durch eine O2-permeable Membran getrennt ist.
  • Die mathematische Beziehung, die in Gleichung 6 ausgedrückt ist, ist in 1 für den Bereich der Brown'schen Drehbewegung abgebildet, von der bekannt ist, daß sie in Lipiden von Gewebezellen auftritt. Wie in 1 dargestellt, steigt die Fluoreszenzanisotropie im Gleichgewichtszustand in systematischer Weise mit dem Anstieg der Werte von PO2 bei allen Drehraten an. Mit anderen Worten, in dem Maße, wie PO2 ansteigt, wird die Fluoreszenzlebensdauer des Fluorphores verkürzt (Gleichung 5), wodurch der Winkel, der von dem Fluorphor während dessen Lebensdauer verursacht wird, reduziert wird. Folglich steigt die Fluoreszenzanisotropie mit ansteigendem PO2 an. Die weiteren Variablen, die die Fluoreszenzanisotropie in einer solchen Situation zusätzlich zu dem PO2 beeinflussen, sind die Temperatur und die Viskosität der Lipid-Doppelschicht. Allerdings ist es wohl bekannt, daß im Falle eines abgebildeten Gewebes und/oder eines Gefäßsystems in vivo der Körper diese Variablen hervorragend regelt. In ähnlicher Weise wird ein Katheter mit einer O2-sensitiven Spitze mit kleinem Volumen schnell in ein Gleichgewicht mit der Temperatur des Blutes innerhalb eines Blutgefäßes, in das er eingesetzt ist, kommen. Darüber hinaus, wie in Gleichung 4 dargestellt, können kleine Veränderungen der Temperatur des Körpers oder der Katheterspitze, die bei manchen Krankheitsstadien auftreten, präzise kompensiert werden, durch gleichzeitige Temperaturmessung und die Anwendung dieser Gleichung auf die Berechnung des PO2 von Fluoreszenzanisotropiemessungen im Gleichgewichtszustand.
  • Die vorliegende Erfindung hat all die Vorteile eines direkten Fluoreszenzlebensdauersystems ohne die Notwendigkeit einer intensiven, gepulsten Lasererregung und deren mögliche schädigende Effekte auf das abgebildete Exemplar. Zusätzlich werden die mühsame und teure Ausrichtung, die für die Messung des Fluoreszenzabfalles im 40–135 Nanosekundenbereich benötigt werden, vermieden. In ähnlicher Weise, da kontinuierliche Fluoreszenzanisotropiebestimmungen im Gleichgewichtszustand der zeitliche Mittelwert einer enormen Anzahl von Fluoreszenzabfallereignissen sind, werden derartige Messungen im Gleichgewichtszustand präziser sein als irgendein zeitauflösendes Verfahren. Die vorliegende Erfindung bestimmt PO2 durch Messung der Fluoreszenzanisotropie im Gleichgewichtszustand, während im US-Patent Nr. 4,476,870 (Peterson) wie auch im Zuckermann '173 Patent die Fluoreszenzintensität die gemessene Variable ist. Weiterhin unterscheidet sich die vorliegende Erfindung von der im US-Patent Nr. 4,810,655 (Khalil et al) beschriebenen Erfindung und der des US-Patentes Nr. 4,947,850 (Vanderkooi) darin, daß beide Patente das PO2 aus direkten Messungen der Lebensdauer der phosphoreszierenden Substanzen bestimmen. Phosphoreszierende Substanzen haben sehr viel längere und damit einfacher zu messende Lebensdauern als die bevorzugten fluoreszierenden Substanzen, die bei der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Bei der vorliegenden Erfindung wird eine indirekte Messung der Fluoreszenzlebensdauer, nämlich die Fluoreszenzanisotropie angewandt in einfach umzusetzenden Konfigurationen, um Messungen von PO2 von Gewebe und Körperflüssigkeit in vivo zu liefern, ohne die Einschränkungen des Standes der Technik.
  • Obwohl oben für den spezifischen Fall einer Methodik für die Bestimmung der Sauerstoffkonzentration oder des Partialdruckes beschrieben, kann die mathematische Ableitung, die die Konzentration des Quencher-O2 auf die Fluoreszenzanisotropie bezieht, für den generellen Fall eines Fluorphores umgeschrieben werden, dessen erregter Zustand unterdrückt werden kann und bei dem die Konzentration des Quencher dadurch bestimmt wird. Betrachtet man diesen allgemeineren Fall, kann die Gleichung 5 für irgendein Fluorphor umgeschrieben werden, dessen Fluoreszenz durch eine Substanz gemäß der Stern-Volmer-Gleichung unterdrückt wird, wie nachfolgend gezeigt:
    Figure 00160001
    wobei [Q] die Konzentration des Quenchers eines gegebenen Fluorphores ist. In ähnlicher Weise kann die Gleichung 6 für die Beziehung der Fluoreszenzanisotropie auf die Quencherkonzentration wie folgt umgeschrieben werden:
  • Figure 00170001
  • Folglich sollte die vorliegende Erfindung, obwohl sie für den spezifischen Fall eines O2-Quenchers dargestellt wird, als eine Vorrichtung angesehen werden zur generellen Bestimmung der Konzentration eines Quenchers im angeregten Zustand. In der Praxis kann die Auflösung dieser Technik für ein gegebenes Fluorphor und ein Quencher dadurch optimiert werden, daß die Viskosität des Mediums eingestellt wird und folglich die Drehgeschwindigkeit des Fluorphores in Bezug auf die Fluoreszenzlebensdauer des Fluorphores in Abwesenheit des Quenchers. Dies kann für ein lipidlösliches Fluorphor dadurch erreicht werden, daß ein Lipid mit geeigneter Viskosität gewählt wird oder für ein nichtlipidlösbares Fluorphor durch Konjugieren des Fluorphores mit einem Trägermolekül von ausreichendem hydrodynamischem Volumen in einem Medium, dessen Viskosität durch Einstellung von Glycerinkonzentrationen in einer Glycerin-Wasser-Mischung oder der Rohrzucker-Konzentration in einem Rohrzucker-Wassermedium eingestellt wird. Obwohl nicht beabsichtigt ist, eine vollständige Liste der Klassen von Fluorphoren und Quenchern anzugeben, auf die die Erfindung angewandt werden kann, kann man eine Messung von pH für das Fluorphorefluoreszin im Gleichgewichtszustand oder ein Fluoreszin-Derivativ, dessen Fluoreszenzlebensdauer durch Protonen unterdrückt wird, in Betracht ziehen. In ähnlicher Weise können Chlorid-Konzentrationen bestimmt werden unter Anwendung derselben Methodik des Gleichgewichtszustands bei Verwendung des Fluorphores-Chinin oder der Konzentration von Jodit bei Verwendung des Fluorphores γ-Pyrenbutyr-Säure.
  • Es wird dann für einen Fachmann offensichtlich, daß die hier dargestellte generelle Methodik für eine Vielzahl von Ionen und anderen Quencherkonzentrationen angewandt werden kann, durch Auswahl einer geeigneten Fluorphor-Quencher-Kombination und durch Veränderung der Viskosität, wodurch die Drehgeschwindigkeit des Fluorphores auf den Bereich der Fluoreszenzlebensdauer eingestellt wird, die über den gewünschten Quencherkonzentrationsbereich auftritt.
  • Zusätzlich zur Anwendung der vorliegenden Erfindung auf die Bestimmung der Konzentration von Quenchern im angeregten Zustand kann die Vorrichtung auch zusätzlich verwendet werden, um die Bestimmung der Konzentration irgendeiner interessierenden Substanz in einer Probe auszuführen. In diesem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein Fluorphor mit einem größeren Trägermolekül konjugiert, das eine hohe Affinität zu der fraglichen Substanz hat. In ähnlicher Weise wird eine Menge der zu messenden Substanz mit einem Quencher für den angeregten Zustand des Trägerfluorphores gemessen. Die fluoreszierend markierte Substanz wird zusammen mit der Probe, die eine Menge einer zu bestimmenden nichtmarkierten Substanz enthält, zu einer Analysemixtur gegeben, was zu einer Konkurrenz der Seiten auf dem Trägermolekül führt. Diese Konkurrenz wird die Quencher-markierten Moleküle von dem Träger verdrängen, wodurch die Fluoreszenzlebensdauer des Trägerfluorphores vergrößert wird. Eine Vergrößerung der Lebensdauer des Trägerfluorphores wird umgekehrt die Fluoreszenzanisotropie der zu messenden Probe bei der Emissionswellenlänge des Trägerfluorphores reduzieren. Folglich wird bei diesem Ausführungsbeispiel der Erfindung die Fluoreszenzanisotropie abnehmen mit zunehmender Probenkonzentration der Substanz, deren Konzentration zu bestimmen ist. Mit anderen Worten, in dem Maße wie die Konzentration der zu analysierenden Substanz ansteigt, wird die Anzahl der Quencher auf dem Träger reduziert, wodurch folglich die Fluoreszenzlebensdauer des Trägerfluorphores ansteigt (Gleichung 7), wodurch der Winkel, der durch das Trägerfluorphor während dessen Laufzeit gedreht wird, ansteigt. Folglich verringert sich die Fluoreszenzanisotropie mit dem Anstieg der Konzentration der zu messenden Substanz.
  • Eine interessierende Wahl für die zwei Fluorphore, die bei dieser Methodik angewandt werden, sind Energiedonator und -akzeptormoleküle, die für einen Förster-Energietransfer geeignet sind. Das grundlegende Paradigma des Förster-Energietransfers beinhaltet die Erregung des Donator-Moleküls mit Licht von einer Wellenlänge, die innerhalb des Absorptionsbereiches des Donators liegt. Ein geringer Betrag der Erregungsenergie wird an die Umgebung in Form von Vibrationsenergie der Moleküle abgegeben (Übergang zum niedrigsten Vibrationszustand des elektronisch erregten Moleküls); der Rest kann entweder durch Emission von fluoreszierendem Licht oder durch Energietransfer zu dem Akzeptormolekül abgegeben werden. Die Effizienz des Energietransfers hängt von der Quantenausbeute des Donators ab, vom Grad der Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum des Donators und dem Absorptionsspektrum des Akzeptors und der Orientierung und Distanz zwischen dem Donator und dem Akzeptor. Abhängig von dem Ausmaß, in dem die obigen Bedingungen erfüllt sind, wird die Annäherung der Akzeptor- und Donatormoleküle im Raum zu einer Verkürzung der Fluoreszenzlebensdauer des Donator-Fluorphores führen. Wenn die Donator-Akzeptor-Paare gemäß der oben beschriebenen Methode verwendet werden, wird die Fluoreszenzanisotropie, die bei der Emissionswellenlänge des Donators gemessen wird, mit ansteigender Konzentration der gemessenen Substanz in der Probe ansteigen. Ein signifikanter Vorteil der Anwendung des Förster-Energietransfers von Donator-Akzeptor-Paaren ist die Fähigkeit, das Absorptionsband des Donators zu längeren Wellenlängen zu verschieben, wodurch die Verwendung von weniger teuren Lichtquellen möglich ist, wie z.B. lichtemittierender Dioden (LEDs) und Laserdioden.
  • Das Ausführungsbeispiel der Erfindung, das den Energietransfer von Donator-Akzeptor-Paaren verwendet, wird im Zusammenhang mit zwei nicht beschränkenden Ausführungsbeispielen erläutert. Zuerst wird ein Detektionssystem betrachtet, das dazu ausgebildet ist, die Quantität von Hormonen (Proteine) zu detektieren. Ein polyclonaler Antikörper, der gegen das Protein gewachsen ist, wird mit FITC (fluoreszierendes Isothiocyanat) markiert und dient so folglich als Donator, während eine Menge des Proteins mit malachitgrünem Isothiocyanat markiert wird, womit ein geeigneter Akzeptor geschaffen wird. Diese markierten Moleküle werden zusammen mit einem nicht markierten Protein in der Probe mit einem Glycerin-Wasser-Puffer gemischt, um eine geeignete Viskosität zu liefern. Die Mischung wird mit linear polarisiertem Licht bei der Absorptionswellenlänge für FITC bestrahlt und die Fluoreszenzanisotropie der Probe wird bei der Emissionswellenlänge des FITC (Donator-Emission) bestimmt. Wenn die Menge des unmarkierten Proteins (Hormons), das zu untersuchen ist, in der Probe ansteigt, wird es markiertes Protein mit Akzeptorfluorphoren verdrängen, wodurch die Fluoreszenzlebensdauer des Donators ansteigt. Folglich wird die Fluoreszenzanisotropie bei dem FITC-Emissionsband (Donatorwellenlängen) systematisch abnehmen als eine Funktion des Anwachsens der Konzentration des unmarkierten Proteins in der Probe. Als ein zweites Beispiel wird ein System betrachtet, das zum Messen des Blutzuckerwertes bestimmt ist. In diesem Falle kann man Konkanavalin A (ConA) als Trägermolekül verwenden, das eine hohe Affinität für Glykole hat, welches mit Cascade Blue als Donatorfluorphor markiert ist und eine Menge als Fluorphor markierten Glykole, wie z.B. 6-NBD-Glukosamin (6-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-6-Deoxyglukose) als Akzeptor. Bei diesem System wird die Glukose in dem Blut die fluoreszierend markierte Glukose verdrängen, woraus eine Abnahme der gemessenen Fluoreszenzanisotropie an dem Cascade Blue Emissionsband auftritt. Obwohl zwei nicht beschränkende Beispiele vorgeschlagen wurden, ist es für einen Fachmann offensichtlich, daß die hier beschriebene grundlegende Vorrichtung angepaßt werden kann, um die Konzentration einer Vielzahl von Substanzen, wie z.B. Saccharin, DNA-Fragmenten, Hormonen, Drogen und Immunogloboline zu bestimmen.
  • Die folgenden Figuren zeigen Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung für die topographische Messung des Gewebe-PO2 und der topographischen Bestimmung der Verteilung des Blut-PO2 innerhalb des Gefäßsystems eines abgebildeten Gewebes. Zusätzlich ist eine Katheterkonstruktion beschrieben, die keine Kalibrierung vor irgendwelcher Anwendung benötigt. Es wird von einem Fachmann leicht einzusehen sein, daß im Hinblick auf diese Offenbarung auch andere Proben, biologischer oder physikalischer Art untersucht werden können im Hinblick auf ihre Konzentration und räumliche Verteilung durch Veränderung des hier offenbarten Designs unter Verwendung der Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung.
  • Wie unten gezeigt, wird die Fluoreszenzanisotropie betriebsmäßig für den allgemeinen Fall definiert und formal beschrieben in dem spezifischen Fall für ein Quencher-O2 durch folgende Gleichung:
    Figure 00210001
    wobei I und I die Intensitäten der Fluoreszenzemission mit ihren elektrischen Vektoren parallel bzw. rechtwinklig zu der der linear polarisierten erregenden Strahlung sind und G ein empirischer Korrekturfaktor zum Korrigieren der dichroischen Spiegeltransmissionseffizient in den parallelen und rechtwinkligen Ebenen ist und wobei zusätzlich Symbole in der Form der Definition der Anisotropie – wie oben beschrieben – verwendet werden.
  • 2 ist eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 10, die für die topographische Abbildung von Gewebe- und Blut-PO2 in einem abgebildeten Gewebe konstruiert ist. Eine O2-unterdrückbare biokompatible Testsubstanz, wie z.B. Natrium-Pyrenbutyrat in einem geeigneten Lösungsmittel oder verbunden mit Liposomen, wird intravenös in einen Wirtsorganismus injiziert. Das Gewebe 12 wird mit nichtpolarisiertem sichtbarem Licht durch einen Faseroptikstrahler 14 beleuchtet unter Verwendung einer Wolframquelle 16. Die Strahlungsenergie einer Hochdruckquecksilberbirne 18 wird durch eine Kollektorlinse 20 gebündelt, durch einen Verschluß 22 unterbrochen und gelangt durch einen Glan-Thompson-Polarisator 24 (Ealing, Inc.). Das UV-Licht wird durch ein Erregungsfilter 26 (340 nm Spitze, 25 nm halber Bandpass) spektral geformt und dann durch einen dichroischen Spiegel 28 (Omega Optical) reflektiert, der Wellenlängen <400 nm durch eine Objektivlinse 30 zu dem abgebildeten Gewebe reflektiert. Emittierte Fluoreszenz (Wellenlängen >400 nm) von dem bestrahlten Gewebe 12 wird durch die Objektivlinse 30 gesammelt und gelangt durch den dichroischen Spiegel 28 und durch ein Emissionsfilter 32, das Wellenlängen von 400–420 nm zu einem Wollaston-Prismen-Polarisator 34 leitet, der die emittierte Fluoreszenz in ihre linear polarisierten Komponenten parallel 36 und rechtwinklig 38 zur Ebene der Anregungspolarisation auflöst. Die Vektorkomponenten (I und I) werden entsprechend und gleichzeitig durch CCD-Chips (ladungsgekoppelte Einrichtungen; charge coupled devices) von zwei Videokameras 40A und 40B (z.B. Xybion-Modell 250) detektiert. Es ist offensichtlich für einen Fachmann, daß alternative optische Detektoren mit ausreichender räumlicher Auflösung, wie z.B. langsam abtastende gekühlte CCD-Kameras, SIT- oder ISIT-Röhrenkameras oder Photodiodenarrays (nicht dargestellt) auch für die Detektion der zweidimensionalen Verteilung der parallelen und rechtwinkligen Komponenten der emittierten Fluoreszenz geeignet sind. Die Ausgänge der beiden Videokameras werden durch zwei digitalisierende Boards 42A und 42B (wie sie von Imaging Technologies oder unter der Bezeichnung Modell DT3851 von Data Translation verkauft werden) in einem Mikrocomputer 44 (z.B. ein IBM oder Clone Computer, vorzugsweise mit einem Prozessorchip, der von 33 bis 66 MHz arbeitet) digitalisiert. Eine solche Einrichtung ist ausreichend für die Aufgabe und für die anschließende Bildverarbeitung vor der Abbildung auf einem Monitor 46.
  • Der Computer verwendet eine Software, die von der Firma Biometric Imaging Inc. produziert wird und die das Urheberrecht daran hat, wie bekannt aus "Software for the Acquisition, Manipulation and Analysis of Video Images", Copyright 1993, Biometric Imaging, Inc. Der Quellcode für diese Software erlaubt, daß die Veränderung der Steigungen und der Verschiebungen an jedem Pixelort innerhalb des CCD-Array durch eine Korrekturdatei korrigiert wird, wodurch eine gleichförmige Ansprechbarkeit über das Detektorarray erreicht wird. In ähnlicher Weise erlaubt das Software-Paket, daß die Pixelintensität innerhalb des Array quantifiziert, gefiltert, gemittelt und deren Anisotropie an einer Vielzahl von Orten berechnet wird und zwar mittels der Gleichung 9 und in eine zweidimensionale Darstellung des Gewebe-PO2 durch Anwendung der Gleichung 6 auf jeden Pixelort konvertiert wird. Der vorliegende Prototyp des Apparates erlaubt eine Erfassung von mehr als 300 000 Werten von Gewebe-PO2 im Raum innerhalb von ungefähr 33 Millisekunden. Die Werte für die Konstanten in Gleichung 6 werden während Kalibrierungsexperimenten bestimmt, die die simultane Messung von Gewebe-PO2 durch eine Sauerstoff-Mikroelektrode beinhaltet sowie durch ein indirektes Lebensdauersystem (Anisotropie).
  • Sollte die Autofluoreszenz des Gewebes bei der Emissionswellenlänge einen gewissen Grad von Anisotropie zeigen, aufgrund der Anwesenheit endogener Fluorphore mit kurzer Fluoreszenzlebensdauer (< 20 Nanosekunden) und die daher durch die physiologischen Pegel des O2 nicht unterdrückt werden, kann eine solche "Auto-Anisotropie" abgebildet und auf eine Festplatte gesichert werden, bevor die biokompatible, O2-unterdrückbare fluoreszierende Probentestsubstanz injiziert wird. In diesem Fall kann nachfolgend an die Injektion der O2-unterdrückbaren Testsubstanz die totale Anisotropie (Ptotal) auf ihre Komponenten-Anisotropien ("Auto-Anisotropie" oder AGewebe und die O2-abhängige Anisotropie, AProbe) durch folgende Gleichung bezogen werden:
    Figure 00240001
    wobei a+b=1. Die O2-abhängige Anisotropie kann dann von der totalen Anisotropie durch Gleichung 11 separiert werden, wobei A(PO2) die PO2-abhängige Anisotropie ist und a eine Konstante ist, die empirisch in Experimenten ermittelt wird, bei denen die Gewebe-PO2 gleichzeitig mit einer O2-Mikroelektrode und durch optische Messungen der Fluoreszenzanisotropie bestimmt wird.
  • Figure 00240002
  • Diese Korrektur kann schnell und bequem auf Pixel-zu-Pixel-Basis durch Programme innerhalb des Software-Paketes durchgeführt werden.
  • Der unmittelbare Vorteil des vorliegenden Vorgehens im Vergleich zur Erfindung des Zuckermann '173 Patentes, das von der Messung der Fluoreszenzintensitäten anstelle der Anisotropie abhängt, sollte dem Fachmann offensichtlich sein. Das heißt, in diesem Patent können PO2-Messungen nur dann beginnen, nachdem die O2-unterdrückbare fluoreszente Testsubstanz Gleichgewichtskonzentrationen (stabil) innerhalb des abgebildeten Gewebes erreicht haben, da die Fluoreszenzintensität räumlich und zeitlich auf die Konzentration der Probe in dem Gewebe als auch auf das Gewebe-PO2 bezogen ist. Bei dem indirekten Lebensdauersystem, das hier abgebildet ist, wird die Fluoreszenzanisotropie, die gegenüber der Probenkonzentration unempfindlich ist, bestimmt anstelle der Intensität, die für die Gewebe PO2 bestimmend ist, wodurch ermöglicht wird, daß PO2-Messungen so frühzeitig beginnen, als ausreichende Testsubstanz angesammelt ist, um geeignete Signal-Rausch-Pegel zu liefern. In ähnlicher Weise ist die Anisotropie-Methode unempfindlich gegenüber zeitabhängigen Abschwächungen der Testsubstanz durch Metabolismus, wodurch ermöglicht wird, daß die Gewebe-PO2 topographisch für ausgedehnte Zeitperioden bestimmt wird.
  • In diesem Zusammenhang sollte hervorgehoben werden, daß Pseudokolorierungsprogramme in dem Software-Paket enthalten sind, die gestatten, daß optische Abbildungen des Gewebe-PO2 in zweidimensionalem Raum durch Zuweisung unterschiedlicher Farbtöne zu unterschiedlichen Werten des Gewebe-PO2 zugewiesen werden, wobei eine begleitende Skala eine schnelle Interpretation der Verteilung des Gewebe-PO2 durch Klinikpersonal ermöglicht. Die Programme, die zur Implementierung des indirekten Lebensdauersystems geschrieben sind, können im wesentlichen in "Echtzeit" ausgeführt werden, wodurch Klinikpersonal ermöglicht wird, die Effekte der Behandlungsmodalitäten unmittelbar zu sehen, die zur Vergrößerung der Sauerstoffzufuhr zum Gewebe vorgesehen sind (z.B. Laserbehandlung angewandt zur Vergrößerung des retinalen Gewebe-PO2, die häufig zur Behandlung diabetischer Netzhautentzündung (Retinopathie) angewandt wird).
  • Die Leistung des indirekten Lebensdauersystems bei der Abbildung des Gewebe-PO2 kann von zwei auf drei Dimensionen ausgedehnt werden, durch Implementierung einer seriellen optischen Schnittdarstellung, entweder durch konfokale Techniken oder durch Anwendung von Dekonvolutionsprogrammen, wie sie in diesem Programm enthalten sind. Auf diese Weise kann eine topographische Ansicht des Gewebe-PO2 durchgeführt werden, die es gestattet, Gewebe- und Blut-PO2 in drei Dimensionen innerhalb des Volumens des Gewebes abzubilden. Eine solche dreidimensionale Information kann einfach pseudokoloriert werden und mittels eines dreidimensionalen Rekonstruktionsalgorithmus auf einem Bildschirm dargestellt werden. Optische serielle Schnitte und 3-D-Rekonstruktionen gestatten dem Klinikpersonal abnormale Gebiete des Gewebe-PO2 zu detektieren und zu behandeln, die in unterschiedlichen Tiefen innerhalb des abgebildeten Gewebes lokalisiert sind.
  • 3 zeigt einen Apparat 50, der entsprechend der vorliegenden Erfindung konstruiert ist, um das indirekt Fluoreszenzlebensdauersystem in einem versiegelten Katheterdesign zu implementieren, das keine Kalibrierung vor jeglicher seiner Anwendung erfordert. Wie in dem zuvor beschriebenen Ausführungsbeispiel wird die Strahlungsenergie einer Hochdruckquecksilberlampe 52 durch eine Kollektorlinse 54 gesammelt, von einem Verschluß 56 abgesperrt und gelangt durch einen Glan-Thompson-Polarisator 58 (wie er von Ealing, Inc. unter der Bezeichnung der Katalognummer 34-5223 verkauft wird). Das W-Licht wird dann durch ein Anregungsfilter 60 (340 nm Spitze, 25 nm halber Bandpass) spektral geformt und wird dann durch einen dichroischen Spiegel 62 (wie er von Omega Optical unter der Bezeichnung 400DCLP verkauft wird), der Wellenlängen <400 nm reflektiert, durch eine Objektivlinse 64 reflektiert. Eine einmodenpolarisationsbehaltende Glasfaser 66 (wie sie von Ealing, Inc. unter der Bezeichnung Modell HB450 verkauft wird) ist am Fokuspunkt der Objektivlinse befestigt. Der Kerndurchmesser solcher Fasern liegt typischerweise <10 Mikron, wodurch die Konstruktion eines außerordentlich schmalen Katheters ermöglicht wird. Im Falle eines schmalen Submillimeter-Katheters gelangt das linear polarisierte Licht direkt zur O2-empfindlichen Spitze 68, während bei Kathetern mit größeren Durchmessern die Glasfaser 66 am Fokuspunkt einer Kollimationslinse 70 angebracht ist, die dazu verwendet wird, eine gleichmäßige Beleuchtung der Katheterspitze 68 zu bewirken. Die abgedichtete O2-empfindliche Spitze 68 enthält eine Quarzplatte 72, die die optischen Komponenten von dem nicht-polaren viskosen Medium 74 in der Spitze 68 trennt. Die Katheterspitze 68 enthält ein nicht-polares viskoses Medium 74, wie z.B. Paraffin oder Mineralöle, in denen pyrenbutyrische Säure oder Pyrene 76 gelöst ist. Pyrene hat eine Fluoreszenzlebensdauer von ungefähr dem zehnfachen der pyrenebutyrischen Säure oder deren Salzform, wodurch die Präzision der Messung vergrößert wird, mit einer möglichen Genauigkeit der PO2-Messung von <1 mm Hg. Die O2-unterdrückbare Testsubstanz, die in dem nicht-polaren viskosen Lösungsmittel gelöst ist, ist in dem Katheter durch eine O2-permeable Membran 78, wie z.B. Polyethylen abgedichtet. Ein Mikrothermistor 80 ist auch in die Spitze des Katheters 68 integriert, um eine gleichzeitige Messung der Temperatur zu gestatten, was ermöglicht, daß Temperaturkorrekturen entsprechend der Beziehung, die in Gleichung 4 beschrieben ist, ausgeführt werden. Da die Optiken reversibel sind, kehrt die linear polarisierte fluoreszierende Emission von der Testspitze 68 längs der ein-Moden-Polarisations-behaltenden Glasfaser zurück und wird durch die Objektivlinse 64 gesammelt. Wellenlängen <400 nm gelangen durch den dichroischen Spiegel 62 und Wellenlängen von 400–420 nm gelangen durch ein Emissionsfilter 82 zu einem Wollaston-Prismen-Polarisator 84, der die emittierte Fluoreszenz in ihre linear polarisierten Komponenten parallel 86A und rechtwinklig 86B zur Ebene der Anregungspolarisation auflöst. Die Vektorkomponenten (I und I) werden entsprechend und gleichzeitig durch zwei optische Detektoren 88A und 88B detektiert, die Photodioden oder Photovervielfachungsröhren sein können.
  • Da das Katheterdesign PO2-Messungen an einem einzigen Ort liefert, d.h, an der Katheterspitze, kann die Anisotropie aus Gleichung 9 berechnet und gemäß Gleichung 6 auf das PO2 bezogen werden und zwar mittels des einfachen Mikroprozessordesigns 90. Ein solches grundlegendes Mikroprozessordesign ist in 4 dargestellt. Darüber hinaus, da die Relationen und angewandten Konstanten in diesen Gleichungen bestimmt sind, können sie für jedes hergestellte Katheter festgelegt und angewandt werden und jedes Katheter braucht nicht individuell in der Fabrik kalibriert zu werden oder vor seiner Anwendung in einer klinischen Situation kalibriert werden. Dies bringt einen wesentlichen Vorteil des vorliegenden Katheterdesigns in Bezug auf frühere Designs, die eine konstante Neukalibrierung in der Fabrik als auch in der Praxis erfordern.
  • Beispiel
  • Zum Messen der topographischen Verteilung des Gewebe-PO2 in einem Retinagewebe wurde ein Abbildungsapparat wie folgt hergerichtet und wie es schematisch in 2 dargestellt ist. Ein Rinderauge wurde von einem lokalen Schlachthaus erhalten und auf Eis zu dem Laboratorium gebracht. Das isolierte Rinderauge wurde für eine normothermische arterielle Perfusion gemäß den Verfahren von Coo, Zonnenberg und Trap (Current Eye Research, 12(4), 293–301, 1993) vorbereitet unter Verwendung eines oxygenierten serumfreien MEM (minimal essential medium), das ursprünglich mit 108μM Natrium-Pyrenbutyrat ergänzt war. Nach einer Stunde der Perfusion mit dem MEM enthaltenden Natrium-Pyrenbutyrat erreichte die biokompatible fluoreszierende Testsubstanz eine Gleichgewichtskonzentration in dem Retina-Gewebe und das Auge wurde anschließend mit dem oxygenierten MEM alleine durchströmt während einer Zeitperiode, in welcher die Messungen des Gewebe-PO2 durchgeführt wurden. Eine Hornhautrefraktion wurde durch eine gängige Hintergrundlinse, die aus W-transmittierendem Glas (Optical Industries) hergestellt war, negiert und die Retina wurde zuerst mit sichtbarem Licht abgebildet und ein Gebiet der Retina ausgewählt, das eine retinale Arteriole enthält. Nachdem eine korrekte Ausrichtung hergestellt war, wurde das sichtbare Licht unterbrochen und das Retinagewebe wurde mit linear polarisiertem ultraviolettem Licht (UV) bestrahlt. Die Strahlungs energie einer Hochdruckquecksilberlampe wurde von einer Kollektorlinse gesammelt, durch einen Verschluß geleitet und gelangte durch einen Glan-Thompson-Polarisator (Ealing, Inc.). Das UV-Licht wurde durch ein Anregungsfilter (340 nm Spitze, 25 nm halber Bandpass) spektral geformt und wurde dann durch einen dichroischen Spiegel (Omega Optical) reflektiert, der Wellenlängen <400 nm durch eine Objektivlinse zu dem abgebildeten Retinagewebe reflektiert. Emittierte Fluoreszenz (Wellenlängen >400 nm) von dem angeregten Gewebe wurde durch die Objektivlinse gesammelt und durch den dichroischen Spiegel geleitet und durch ein Emissionsfilter, das Wellenlängen von 400–420 nm zu einem Wollaston-Prisma-Polarisator leitete, der die emittierte Fluoreszenz in ihre linear polarisierten Komponenten parallel und rechtswinklig zur Ebene der Anregungspolarisation auflöste. Die Vektorkomponenten (I und I) wurden entsprechend und gleichzeitig von dem CCD-Chip (charge coupled device) von zwei Videokameras (Xybion Modell 250) detektiert.
  • Die Vektorkomponenten der Fluoreszenzemission parallel und rechtwinklig zur Ebene der Anregungspolarisation wurden durch die zuvor genannten zwei digitalisierenden Boards innerhalb des zuvor bezeichneten Computers digitalisiert, der mit 66 MHz betrieben wurde und auf einer (nicht dargestellten) Festplatte gespeichert. Die Computer-Software wurde auf dem Computer laufen gelassen, um zu ermöglichen, daß die Variation der Steigungen und der Verschiebungen an jedem Pixelort innerhalb des CCD-Array durch eine Korrekturdatei in der Software korrigiert wurde, wodurch eine gleichförmige Ansprechempfindlichkeit an dem Detektorarray erreicht wurde. In ähnlicher Weise ermöglichte die Software, daß die Anisotropie an einer Vielzahl von Orten mittels der Gleichung 9 errechnet und in eine zweidimensionale Darstellung des Gewebe-PO2 durch Anwendung der Gleichung 6 an jedem Pixelort umgewandelt wurde. Dieses Vorgehen gestattete die Erfassung von mehr als 300 000 Werten im Raum des PO2 des Retinagewebes innerhalb ungefähr 33 Millisekunden. Die Werte für die Konstanten, die in Gleichung 6 verwendet wurden, wurden zuvor während Kalibrierungsexperimenten bestimmt, die die gleichzeitige Messung des Gewebe PO2 durch eine Sauerstoffmikroelektrode und durch das indirekte Lebensdauersystem (Anisotropie) verwendete. Zum Testen der Gültigkeit und Präzision des Systems und der resultierenden optischen Abbildung des PO2 des Retinagewebes wurden PO2-Gradienten gemessen und zwar sowohl parallel als auch rechtwinklig zur Retinaarteriole, da die mathematischen Funktionen, die diese Beziehungen beschreiben, aus der Mathematik der Sauerstoffverteilung vorhergesagt werden können und in der Literatur gut bekannt sind. Die Resultate der Messungen sind in 5 dargestellt. Die Mathematik der Sauerstoffverteilung sagt vorher, daß der PO2-Abfall in Längsrichtung des Gewebes parallel zur Arteriole einer linearen Beziehung folgen sollte, deren Steigung direkt proportional der Sauerstoffverbrauchsrate des Gewebes (M) und umgekehrt proportional der Geschwindigkeit (V) der Sauerstoff enthaltenden Lösung innerhalb der Arteriole mal dem Quadrat des arteriolen Durchmessers (D) ist. Wie im oberen Teil der 5 dargestellt, entsprechen die Messungen des Gewebe-PO2 in Längsrichtung der Arteriole exzellent dieser gut etablierten linearen Beziehung mit einem Bestimmungskoeffizienten (R2) für eine lineare Anpassung von 0,96, d.h. 96% der Varianz der Daten wurde für die erwartete lineare Anpassung errechnet. In ähnlicher Weise sollte der PO2-Gradient rechtwinklig zur Arteriole einer monoton abfallenden Funktion entsprechen, die mathematisch durch das Krogh-Modell beschrieben ist. In 5 (untere Abbildung) wurde eine Krogh-Modell-Anpassung auf die Daten mit einer Passungsgüte (R2) von 0,99 angewandt, d.h. 99% der Varianz dieser Daten wurde für die erwartete mathematische Relation ermittelt. Die Daten der 5 zeigen dann, daß das indirekte Fluoreszenzlebensdauersystem eine nicht invasive und gültige Vorrichtung für die räumliche und zeitliche Auswertung des Gewebe-PO2 liefert.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit bevorzugten Ausführungsbeispielen und dargestellten Beispielen beschrieben wurde, wird ein Fachmann nach Lesen der vorgehenden Beschreibung in der Lage sein, verschiedene Änderungen, Ergänzungen, Ersetzungen oder andere Abwandlungen des hier beschriebenen Apparates durchzuführen. Es ist daher beabsichtigt, daß der durch das Patent gewährte Schutz nur auf die in den anhängenden Ansprüchen und deren Äquivalenten enthaltenen Definitionen begrenzt ist.

Claims (8)

  1. Vorrichtung (50) zum Messen der Konzentration eines Stoffes, der in einem Medium gelöst ist, wobei die Vorrichtung Mittel (52, 54) zum Richten von polarisiertem Licht zu dem Medium aufweist, wobei das Medium eine Testsubstanz enthält, die bei Bestrahlung mit Licht lumineszierend wird, wobei die Testsubstanz so ausgewählt ist, daß ihre Lumineszenz durch den Stoff unterdrückt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung enthält: a) Mittel (84) zum Auflösen der von der Testsubstanz emittierten Lumineszenz in Vektorkomponenten, die parallel (86A) und rechtwinklig (86B) zu einer Polarisationsebene des genannten polarisierten Lichtes liegen, und zum Detektieren der Intensitäten der Vektorkomponenten, b) Mittel zum Berechnen einer Lumineszenz-Anisotropie als Funktion der Vektorkomponenten des bestrahlten Mediums, räumlich oder zeitlich, und c) Mittel zum Anwenden einer mathematischen Funktion, die die Lumineszenz-Anisotropie auf die Konzentration des Stoffes in dem Medium bezieht, wobei die mathematische Funktion in Form einer Gleichung vorliegt.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Berechnungsmittel Mittel zum Berechnen der Stoffkonzentration gemäß der folgenden Gleichung enthalten:
    Figure 00330001
    wobei A die Fluoreszenz-Anisotropie ist, die definiert ist als
    Figure 00330002
    wobei I und I die Intensitäten der Lumineszenz-Emission mit ihren elektrischen Vektoren parallel und rechtwinklig zu dem polarisierten Licht sind, das von den Lichterzeugungsmitteln stammt, G ein empirischer Korrekturfaktor ist, der verwendet wird, um die Transmissionswirksamtkeit in parallelen und rechtwinkligen Ebenen zu korrigieren, R die mittlere Molekularrotationszeit in radian/sec, A0 eine Fluoreszenz-Anisotropie im "gefrorenen" Zustand, bei Abwesenheit einer Brown'schen Drehung, KD eine dynamische Löschkonstante, τ0 eine Lumineszenz-Lebensdauer in Abwesenheit eines Löschers und [Q] die Konzentration des zu bestimmenden Stoffes ist.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung weiterhin Mittel zum Korrigieren von Anisotropie-Messungen bezüglich der Temperatur gemäß folgender Gleichung enthält:
    Figure 00330003
    wobei Rg eine Gaskonstante, T die Temperatur, η die Viskosität, V das hydrodynamische Volumen der Testsubstanz, A die Lumineszenz-Anisotropie, A0 eine Lumineszenz-Anisotropie in einem "gefrorenen" Zustand, bei Abwesenheit einer Brown'schen Drehung, und τ die Fluoreszenz-Lebensdauer ist.
  4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Testsubstanz in einem optischen Sensor angeordnet ist, wobei der optische Sensor Mittel (68) enthält zum Beherbergen der Testsubstanz.
  5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Sensor ein viskoses Medium (74) aufweist, wobei die Testsubstanz und das viskose Medium von dem Stoff durch eine Membran (78) getrennt sind, die für den Stoff permeabel ist.
  6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Sensor eine Spitze (68) und einen Thermistor (80) aufweist, wobei die Vorrichtung weiter Mittel (90) zum Korrigieren von Anisotropie-Messungen bezüglich der Temperatur der Spitze des Sensors gemäß folgender Gleichung enthält:
    Figure 00340001
    wobei Rg eine Gaskonstante, T die Temperatur, η die Viskosität, V das hydrodynamische Volumen der Testsubstanz, A die Lumineszenz-Anisotropie, A0 eine Lumineszenz-Anisotropie in einem "gefrorenen" Zustand, bei Abwesenheit einer Brown'schen Drehung, und τ die Fluoreszenz-Lebensdauer ist.
  7. Vorrichtung nach den Ansprüchen 4–6, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Sensor Mittel zum Beherbergen eines Trägers mit hoher Affinität zu dem Stoff aufweist, wobei der Träger mit Testmolekülen, die bei Bestrahlung lumineszent werden, konjugiert ist, wobei der optische Sensor auch eine bekannte Menge des Stoffes beherbergt, die mit einer Substanz konjugiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Löscher für Lumineszenz-Energie der Testmole küle und aus einem Energietransferakzeptor der Lumineszenz-Energie der Testmoleküle besteht, wobei der optische Sensor in einem Medium angeordnet ist, das eine unkonjugierte Form des Stoffes enthält.
  8. Vorrichtung nach den Ansprüchen 4–7, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Sensor ein viskoses Medium (74) enthält, das den Träger und den konjugierten Stoff enthält, wobei der Träger und der konjugierte Stoff von der unkonjugierten Form des Stoffes durch eine Membran (78) getrennt sind, die für den Stoff in seiner unkonjugierten Form permeabel, jedoch für den konjugierten Stoff impermeabel ist.
DE69534228T 1994-04-21 1995-04-19 Nachweis von bestandteilen mittels der lumineszenz-dauer Expired - Lifetime DE69534228T2 (de)

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PCT/US1995/004772 WO1995028875A1 (en) 1994-04-21 1995-04-19 Analyte detection from steady-state luminescence lifetime
US231191 2002-08-30

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Family Applications (1)

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DE69534228T Expired - Lifetime DE69534228T2 (de) 1994-04-21 1995-04-19 Nachweis von bestandteilen mittels der lumineszenz-dauer

Country Status (9)

Country Link
US (3) US5515864A (de)
EP (1) EP0758212B1 (de)
JP (1) JP3579424B2 (de)
CN (1) CN1150749A (de)
AT (1) ATE296052T1 (de)
AU (1) AU691285B2 (de)
CA (1) CA2187735C (de)
DE (1) DE69534228T2 (de)
WO (1) WO1995028875A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008011578A1 (de) * 2008-02-28 2009-09-03 Endress + Hauser Conducta Gesellschaft für Mess- und Regeltechnik mbH + Co. KG Photolumineszenz-Sensor

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5515864A (en) * 1994-04-21 1996-05-14 Zuckerman; Ralph Method and apparatus for the in vivo measurement of oxygen concentration levels by the indirect determination of fluoescence lifetime
US6032070A (en) * 1995-06-07 2000-02-29 University Of Arkansas Method and apparatus for detecting electro-magnetic reflection from biological tissue
DE69633573T2 (de) 1995-11-22 2005-10-06 Medtronic MiniMed, Inc., Northridge Detektion von biologischen molekülen unter verwendung von chemischer amplifikation und optischem sensor
US6766183B2 (en) 1995-11-22 2004-07-20 Medtronic Minimed, Inc. Long wave fluorophore sensor compounds and other fluorescent sensor compounds in polymers
US6002954A (en) * 1995-11-22 1999-12-14 The Regents Of The University Of California Detection of biological molecules using boronate-based chemical amplification and optical sensors
JP3718024B2 (ja) * 1996-03-19 2005-11-16 松下電器産業株式会社 蛍光診断装置
US5938595A (en) * 1996-05-24 1999-08-17 The Regents Of The University Of California Fiber optic D dimer biosensor
AU5446098A (en) 1996-11-21 1998-06-10 Lawrence Livermore National Laboratory Detection of biological molecules using boronate-based chemical amplification and optical sensors
US5830138A (en) * 1996-12-16 1998-11-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania Intravascular catheter probe for clinical oxygen, pH and CO2 measurement
US6274086B1 (en) * 1996-12-16 2001-08-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Apparatus for non-invasive imaging oxygen distribution in multi-dimensions
NL1005068C2 (nl) * 1997-01-23 1998-07-27 Ct Rrn Academisch Ziekenhuis U Cathetersysteem en een daarvan deel uitmakende catheter.
US5935076A (en) * 1997-02-10 1999-08-10 University Of Alabama In Huntsville Method and apparatus for accurately measuring the transmittance of blood within a retinal vessel
US5776060A (en) * 1997-02-20 1998-07-07 University Of Alabama In Huntsville Method and apparatus for measuring blood oxygen saturation within a retinal vessel with light having several selected wavelengths
US6124597A (en) * 1997-07-07 2000-09-26 Cedars-Sinai Medical Center Method and devices for laser induced fluorescence attenuation spectroscopy
US6071748A (en) 1997-07-16 2000-06-06 Ljl Biosystems, Inc. Light detection device
US6469311B1 (en) 1997-07-16 2002-10-22 Molecular Devices Corporation Detection device for light transmitted from a sensed volume
US6992761B2 (en) * 1997-09-20 2006-01-31 Molecular Devices Corporation Broad range light detection system
US6326605B1 (en) 1998-02-20 2001-12-04 Ljl Biosystems, Inc. Broad range light detection system
US6576476B1 (en) 1998-09-02 2003-06-10 Ljl Biosystems, Inc. Chemiluminescence detection method and device
WO2000006991A2 (en) 1998-07-27 2000-02-10 Ljl Biosystems, Inc. Apparatus and methods for spectroscopic measurements
US6297018B1 (en) 1998-04-17 2001-10-02 Ljl Biosystems, Inc. Methods and apparatus for detecting nucleic acid polymorphisms
US6825921B1 (en) 1999-11-10 2004-11-30 Molecular Devices Corporation Multi-mode light detection system
WO2000050877A1 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Ljl Biosystems, Inc. Frequency-domain light detection device
USH1843H (en) * 1997-10-17 2000-03-07 Bur; Anthony J. Optical sensor for measuring fluorescence anisotropy during polymer processing
US6230420B1 (en) 1997-11-26 2001-05-15 Macrosonix Corporation RMS process tool
US6070093A (en) 1997-12-02 2000-05-30 Abbott Laboratories Multiplex sensor and method of use
US6055451A (en) 1997-12-12 2000-04-25 Spectrx, Inc. Apparatus and method for determining tissue characteristics
US20030135122A1 (en) * 1997-12-12 2003-07-17 Spectrx, Inc. Multi-modal optical tissue diagnostic system
KR100618502B1 (ko) * 1998-03-16 2006-09-01 지이 헬스케어 바이오-사이언시즈 코프. 공초점 마이크로스코피 영상 시스템에서 사용하기 위한 전자기 방출의 집속 시스템 및 방법
WO1999047041A1 (en) * 1998-03-19 1999-09-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Fiber-optic confocal imaging apparatus and methods of use
CA2332833A1 (en) 1998-05-19 1999-11-25 Spectrx, Inc. Apparatus and method for determining tissue characteristics
NL1009565C2 (nl) 1998-07-06 2000-01-10 Academisch Ziekenhuis Utrecht Cathetersysteem en een daarin te gebruiken catheter.
AU5667599A (en) 1998-07-27 2000-02-21 Ljl Biosystems, Inc. Apparatus and methods for time-resolved spectroscopic measurements
US6447724B1 (en) 1998-08-11 2002-09-10 Caliper Technologies Corp. DNA sequencing using multiple fluorescent labels being distinguishable by their decay times
US6716394B2 (en) 1998-08-11 2004-04-06 Caliper Technologies Corp. DNA sequencing using multiple fluorescent labels being distinguishable by their decay times
JP4474050B2 (ja) * 1998-09-11 2010-06-02 スペクトルックス・インコーポレイテッド マルチモード光学組織診断システム
AT410718B (de) * 1998-10-28 2003-07-25 Schindler Hansgeorg Dr Vorrichtung zur visualisierung von molekülen
US6157037A (en) 1998-12-04 2000-12-05 Photosense, Llc Sensing device and method for measuring emission time delay during irradiation of targeted samples
US20040147843A1 (en) * 1999-11-05 2004-07-29 Shabbir Bambot System and method for determining tissue characteristics
US6734962B2 (en) 2000-10-13 2004-05-11 Chemimage Corporation Near infrared chemical imaging microscope
US6717668B2 (en) * 2000-03-07 2004-04-06 Chemimage Corporation Simultaneous imaging and spectroscopy apparatus
US6956646B1 (en) * 1999-09-11 2005-10-18 Lesley Davenport Direct method for the correction of pressure induced scrambling of polarized fluorescence intensities
WO2001020340A1 (en) * 1999-09-11 2001-03-22 Lesley Davenport A direct method for the correction of pressure induced scrambling effects on polarized light
US6682938B1 (en) 1999-09-15 2004-01-27 The Regents Of The University Of California Glucose sensing molecules having selected fluorescent properties
US6673625B2 (en) 1999-09-15 2004-01-06 The Regents Of The University Of California Saccharide sensing molecules having enhanced fluorescent properties
AU766128B2 (en) * 1999-10-14 2003-10-09 Oxygen Enterprises, Ltd Apparatus for measuring an oxygen concentration gradient and method of use thereof
US6395555B1 (en) 1999-10-14 2002-05-28 David F. Wilson Method and apparatus for determining the effect of a drug on cells
US6701168B1 (en) 1999-10-14 2004-03-02 Trustees Of The University Of Pennsylvania Apparatus for measuring an oxygen concentration gradient and method of use thereof
WO2001049874A1 (en) 2000-01-06 2001-07-12 Caliper Technologies Corp. Methods and systems for monitoring intracellular binding reactions
EP1256315A4 (de) * 2000-02-03 2004-07-28 Hamamatsu Photonics Kk Nichtinvasives, biologisches, optisches messinstrument, halterung für gemessenes objekt und verfahren zur herstellung desselben
US6687521B2 (en) 2000-02-03 2004-02-03 Hamamatsu Photonics K.K. Noninvasion biological optical measuring instrument, measured portion holding device, and method for manufacturing the same
JP4797233B2 (ja) * 2000-09-25 2011-10-19 パナソニック株式会社 小型試料濃度測定装置
WO2002066986A2 (en) * 2001-02-15 2002-08-29 Medtronic Minimed, Inc. Polymers functionalized with fluorescent boronate motifs
WO2002100805A2 (en) * 2001-06-13 2002-12-19 University Of Rochester Colorimetric nanocrystal sensors, methods of making, and use thereof
US7045361B2 (en) 2001-09-12 2006-05-16 Medtronic Minimed, Inc. Analyte sensing via acridine-based boronate biosensors
WO2003032808A2 (en) 2001-10-15 2003-04-24 University Of Massachusetts Tissue oxygen measurement system
AU2003219668A1 (en) * 2002-01-18 2003-09-02 Universiy Of Iowa Research Foundation Device and method for optical imaging of retinal function
US20040107986A1 (en) * 2002-12-06 2004-06-10 Neilson Andy C. High throughput microcalorimeter systems and methods
WO2004065618A2 (en) * 2003-01-16 2004-08-05 Thermogenic Imaging Methods and devices for monitoring cellular metabolism in microfluidic cell-retaining chambers
US6999807B2 (en) * 2003-01-23 2006-02-14 Scimed Life Systems, Inc. pH measuring balloon
US7276351B2 (en) * 2003-09-10 2007-10-02 Seahorse Bioscience Method and device for measuring multiple physiological properties of cells
US8658349B2 (en) 2006-07-13 2014-02-25 Seahorse Bioscience Cell analysis apparatus and method
US20070087401A1 (en) * 2003-10-17 2007-04-19 Andy Neilson Analysis of metabolic activity in cells using extracellular flux rate measurements
US7787923B2 (en) * 2003-11-26 2010-08-31 Becton, Dickinson And Company Fiber optic device for sensing analytes and method of making same
US7496392B2 (en) * 2003-11-26 2009-02-24 Becton, Dickinson And Company Fiber optic device for sensing analytes
JP5175092B2 (ja) 2004-06-01 2013-04-03 クワラタ トレーディング リミティド 幹細胞を用いるinvitro技術
US7394542B2 (en) 2004-08-18 2008-07-01 Chemimage Corporation Method and apparatus for chemical imaging in a microfluidic circuit
US20060098194A1 (en) * 2004-11-08 2006-05-11 David Tuschel Method and apparatus for determining change in an attribute of a sample during nucleation, aggregation, or chemical interaction
US7046359B2 (en) * 2004-06-30 2006-05-16 Chemimage Corporation System and method for dynamic chemical imaging
US7580126B2 (en) * 2004-06-30 2009-08-25 Chemimage Corp. Method and apparatus for producing a streaming Raman image of nucleation, aggregation, and chemical interaction
US7951357B2 (en) * 2004-07-14 2011-05-31 Glusense Ltd. Implantable power sources and sensors
US8497134B2 (en) 2004-08-19 2013-07-30 Blood Cell Storage, Inc. Fluorescent detector systems for the detection of chemical perturbations in sterile storage devices
US8183052B2 (en) * 2004-08-19 2012-05-22 Blood Cell Storage, Inc. Methods and apparatus for sterility testing
WO2006023725A2 (en) * 2004-08-19 2006-03-02 Blood Cell Storage, Inc FLUORESCENT pH DETECTOR SYSTEM AND RELATED METHODS
US8954134B2 (en) * 2005-09-13 2015-02-10 Children's Medical Center Corporation Light-guided transluminal catheter
US20070073160A1 (en) * 2005-09-13 2007-03-29 Children's Medical Center Corporation Light-guided transluminal catheter
DE502005009238D1 (de) * 2005-10-07 2010-04-29 Brainlab Ag Medizintechnische Markereinrichtung
US9044179B2 (en) * 2006-01-04 2015-06-02 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Oxygen sensor for internal monitoring of tissue oxygen in vivo
TW200734462A (en) * 2006-03-08 2007-09-16 In Motion Invest Ltd Regulating stem cells
US7749768B2 (en) * 2006-03-13 2010-07-06 Cryovac, Inc. Non-invasive method of determining oxygen concentration in a sealed package
US7569395B2 (en) * 2006-03-13 2009-08-04 Cryovac, Inc. Method and apparatus for measuring oxygen concentration
US8129105B2 (en) * 2006-04-13 2012-03-06 Ralph Zuckerman Method and apparatus for the non-invasive measurement of tissue function and metabolism by determination of steady-state fluorescence anisotropy
US8078264B2 (en) * 2006-07-11 2011-12-13 Case Western Reserve University Intra-operative molecular imaging
US20090093758A1 (en) * 2006-07-24 2009-04-09 Yossi Gross Fibroid treatment apparatus and method
US8417959B2 (en) * 2006-12-18 2013-04-09 Southwest Research Institute Biometric device based on luminescence
WO2008118042A1 (en) * 2007-03-23 2008-10-02 St. Jude Medical Ab Implantable medical device
EP2150176B1 (de) * 2007-04-27 2016-04-27 St. Jude Medical AB Implantierbarer konzentrationssensor und vorrichtung
EP1987762A1 (de) * 2007-05-03 2008-11-05 F.Hoffmann-La Roche Ag Oximeter
US9271653B2 (en) 2007-06-12 2016-03-01 Case Western Reserve University Intra-operative molecular imaging
US8192026B2 (en) 2007-06-20 2012-06-05 Tearscience, Inc. Tear film measurement
US20080318314A1 (en) * 2007-06-20 2008-12-25 Valentin Fulga Production from blood of cells of neural lineage
US7758190B2 (en) 2007-06-20 2010-07-20 Tearscience, Inc. Tear film measurement
US9042967B2 (en) 2008-05-20 2015-05-26 University Health Network Device and method for wound imaging and monitoring
US8202702B2 (en) * 2008-10-14 2012-06-19 Seahorse Bioscience Method and device for measuring extracellular acidification and oxygen consumption rate with higher precision
US9874520B1 (en) * 2008-11-07 2018-01-23 Mocon, Inc. Epi-fluoresence confocal optical analyte sensor
US20100160749A1 (en) * 2008-12-24 2010-06-24 Glusense Ltd. Implantable optical glucose sensing
EP2413699B1 (de) 2009-04-01 2019-11-20 Tearscience, Inc. Osi-apparat zur abbildung eines augentränenfilms
US9888839B2 (en) 2009-04-01 2018-02-13 Tearscience, Inc. Methods and apparatuses for determining contact lens intolerance in contact lens wearer patients based on dry eye tear film characteristic analysis and dry eye symptoms
US9642520B2 (en) 2009-04-01 2017-05-09 Tearscience, Inc. Background reduction apparatuses and methods of ocular surface interferometry (OSI) employing polarization for imaging, processing, and/or displaying an ocular tear film
US8915592B2 (en) 2009-04-01 2014-12-23 Tearscience, Inc. Apparatuses and methods of ocular surface interferometry (OSI) employing polarization and subtraction for imaging, processing, and/or displaying an ocular tear film
US8888286B2 (en) 2009-04-01 2014-11-18 Tearscience, Inc. Full-eye illumination ocular surface imaging of an ocular tear film for determining tear film thickness and/or providing ocular topography
US8403953B2 (en) * 2009-07-27 2013-03-26 Fibro Control, Inc. Balloon with rigid tube for occluding the uterine artery
WO2011082314A2 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Brockman Holdings Llc System, device, and method for determination of intraocular pressure
WO2011119343A1 (en) * 2010-03-25 2011-09-29 Mocon, Inc Luminescence lifetime based analyte sensing instruments and calibration technique
CN102095710B (zh) * 2010-12-09 2012-09-05 中国科学院安徽光学精密机械研究所 基于荧光寿命法的水体溶解氧浓度检测系统及方法
CN102175656A (zh) * 2010-12-30 2011-09-07 深圳大学 一种荧光显微成像方法及成像系统
US9040307B2 (en) 2011-05-27 2015-05-26 Blood Cell Storage, Inc. Fluorescent pH detector system and related methods
CN102353661B (zh) * 2011-06-29 2013-01-23 陕西师范大学 基于苝酰亚胺胆固醇衍生物荧光传感薄膜的制备方法
US9037205B2 (en) 2011-06-30 2015-05-19 Glusense, Ltd Implantable optical glucose sensing
CN104272089B (zh) * 2012-03-05 2017-05-10 松下知识产权经营株式会社 传感器设备
EP2674103A1 (de) 2012-06-15 2013-12-18 Fresenius Medical Care Deutschland GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Überwachung einer extrakorporalen Blutbehandlung eines Patienten
AU2013277946B2 (en) 2012-06-22 2018-07-12 Macquarie University Multiplex suspension assay/array using lifetime coding
US20140051974A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Aspect Imaging Ltd. System and method for mri imaging using polarized light
US8743355B2 (en) * 2012-10-16 2014-06-03 K Sciences Gp, Llc Simple sugar concentration sensor and method
US9494577B2 (en) 2012-11-13 2016-11-15 Seahorse Biosciences Apparatus and methods for three-dimensional tissue measurements based on controlled media flow
US9339177B2 (en) 2012-12-21 2016-05-17 Tearscience, Inc. Full-eye illumination ocular surface imaging of an ocular tear film for determining tear film thickness and/or providing ocular topography
EP2976033A4 (de) * 2013-03-19 2016-12-14 Surgisense Corp Vorrichtung, systeme und verfahren zur bestimmung der sauerstoffanreicherung von gewebe
CA2911294C (en) 2013-05-03 2022-08-30 Tearscience, Inc. Eyelid illumination systems and methods for imaging meibomian glands for meibomian gland analysis
US9597026B2 (en) * 2013-11-13 2017-03-21 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Endoscope for analyte consumption rate determination with single cell resolution for in vivo applications
US9795290B2 (en) 2013-11-15 2017-10-24 Tearscience, Inc. Ocular tear film peak detection and stabilization detection systems and methods for determining tear film layer characteristics
WO2015154094A1 (en) * 2014-04-05 2015-10-08 Zand Jason M Apparatus, systems, and methods for mapping of tissue oxygenation
WO2015187717A1 (en) 2014-06-02 2015-12-10 Seahorse Bioscience Single column microplate system and carrier for analysis of biological samples
CN115989999A (zh) 2014-07-24 2023-04-21 大学健康网络 用于诊断目的的数据的收集和分析
WO2016059635A1 (en) 2014-10-13 2016-04-21 Glusense Ltd. Analyte-sensing device
WO2017183030A1 (en) 2016-04-20 2017-10-26 Glusense Ltd. Fret-based glucose-detection molecules
AU2017316361B2 (en) * 2016-08-26 2020-01-30 Cardiac Pacemakers, Inc. Systems and methods for determining presence of an analyte using an implantable medical device
US10720755B2 (en) * 2018-02-07 2020-07-21 Elfi-Tech Ltd. Ensemble-averaged measurement of stochastic motion by current-modulating of VCSEL wavelength
CN112513620A (zh) 2018-07-13 2021-03-16 丹麦技术大学 用于执行偏振分辨拉曼光谱分析的设备
CN110873684B (zh) * 2018-08-30 2022-03-18 北京华泰诺安探测技术有限公司 一种生物气溶胶监测设备及其监测方法
CN112444508A (zh) * 2019-09-03 2021-03-05 天马日本株式会社 荧光图像分析装置
DE102019132525B3 (de) * 2019-11-29 2021-03-18 ICHORtec GmbH Verfahren und Optode zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probenflüssigkeit
CN117091997B (zh) * 2023-10-13 2023-12-22 四川省生态环境科学研究院 一种河道胶体纵向动力学分散系数直接测定方法及装置

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4115699A (en) * 1977-06-16 1978-09-19 Kabushiki Kaisha Nihon Kotai Kenkyujo Apparatus for sensitive detection and quantitative analysis of biological and biochemical substances
US4476870A (en) * 1982-03-30 1984-10-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Fiber optic PO.sbsb.2 probe
DE3245939C2 (de) * 1982-12-11 1985-12-19 Fa. Carl Zeiss, 7920 Heidenheim Vorrichtung zur Erzeugung eines Bildes des Augenhintergrundes
US4810655A (en) * 1985-07-03 1989-03-07 Abbott Laboratories Method for measuring oxygen concentration
US5120510A (en) * 1986-10-10 1992-06-09 Minnesota Mining And Manufacturing Company Sensor and method for sensing the concentration of a component in a medium
US4947850A (en) * 1988-03-11 1990-08-14 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method and apparatus for imaging an internal body portion of a host animal
US5039219A (en) * 1989-05-26 1991-08-13 Photon Technology Luminescence system and method for determining the nature of substances by measuring fluorescence and phosphorescence properties
DE69023496T2 (de) * 1990-08-13 1996-03-21 Hewlett Packard Gmbh Optische Sonde.
US5186173A (en) * 1990-08-14 1993-02-16 Drexel University Method for in vivo measurement of oxygen concentration levels
US5318023A (en) * 1991-04-03 1994-06-07 Cedars-Sinai Medical Center Apparatus and method of use for a photosensitizer enhanced fluorescence based biopsy needle
EP0515211A3 (en) * 1991-05-23 1993-04-07 Becton Dickinson And Company Apparatus and method for phase resolved fluorescence lifetimes of independent and varying amplitude pulses
US5281825A (en) * 1991-09-05 1994-01-25 The University Of Maryland School Of Medicine Phase fluorometry using a modulated electroluminescent lamp as a light source
US5341805A (en) * 1993-04-06 1994-08-30 Cedars-Sinai Medical Center Glucose fluorescence monitor and method
US5383452A (en) * 1993-07-01 1995-01-24 Buchert; Janusz Method, apparatus and procedure for non-invasive monitoring blood glucose by measuring the polarization ratio of blood luminescence
US5515864A (en) * 1994-04-21 1996-05-14 Zuckerman; Ralph Method and apparatus for the in vivo measurement of oxygen concentration levels by the indirect determination of fluoescence lifetime

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008011578A1 (de) * 2008-02-28 2009-09-03 Endress + Hauser Conducta Gesellschaft für Mess- und Regeltechnik mbH + Co. KG Photolumineszenz-Sensor

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