DE69435078T2 - Zellulase-Enzyme und Expressions-Systeme dafür - Google Patents

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    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hohen Spiegeln an neuen trunkierten Cellulaseproteinen im filamentösen Pilz Trichoderma longibrachiatum; Pilz-Transformanten, die aus Trichoderma longibrachiatum durch gentechnische Vorgehensweisen erzeugt werden; und neue Cellulase-Proteine, die von derartigen Transformanten hergestellt werden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Cellulasen sind Enzyme, welche Cellulose (β-1,4-D-Glucan-Bindungen) hydrolysieren und als Hauptprodukte Glukose, Cellobiose, Cellooligosaccharide und dergleichen herstellen. Cellulasen werden von einer Reihe von Mikroorganismen produziert und umfassen mehrere unterschiedliche Enzymklassifikationen, einschließlich denjenigen, welche als Exo-Cellobiohydrolasen (CBH), Endoglucanasen (EG) und β-Glukosidasen (BG) (Schulein, M., 1988, Methods in Enzymology 160: 235–242). Darüber hinaus können die Enzyme innerhalb dieser Klassifikationen in einzelne Komponenten unterteilt werden. Zum Beispiel besteht die Cellulase, welche von dem filamentösen Pilz Trichoderma longibrachiatum, hierin nachstehend T. longibrachiatum, hergestellt wird, aus mindestens zwei CBH-Komponenten, d. h. CBHI und CBHII, und mindestens vier EG-Komponenten, d. h. den Komponenten EGI, EGII, EGIII und EGV (Saloheimo, A., et al., 1993, in Proceedings of the second TRICEL symposium an Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases, Espoo, Finnland, hrsg. von P. Suominen & T. Reinikainen. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8: 139–146), und mindestens einer β-Glukosidase. Die Gene, welche diese Komponenten codieren, sind nämlich chb1, cbh2, eg11, eg12, eg13 bzw. eg15.
  • Das vollständige Cellulase-System, welches CBH-, EG- und BG-Komponenten umfasst, wirkt synergistisch, um kristalline Cellulose in Glukose umzuwandeln. Die zwei Exo-Cellobiohydrolasen und die vier derzeitig bekannten Endoglucanasen wirken zusammen, um Cellulose zu kleinen Cello-Oligosacchariden zu hydrolysieren. Die Oligosaccharide (hauptsächlich Cellobiosen) werden anschließend durch eine Haupt-β-Glukosidase (mit einer möglichen zusätzlichen Hydrolyse durch nebenrangige β-Glukosidasekomponenten) zu Glukose hydrolysiert.
  • Die Proteinanalyse der Cellobiohydrolasen (CBHI und CBHII) und der Haupt-Endoglucanasen (EGI und EGII) von T. longibrachiatum hat gezeigt, dass eine bifunktionelle Organisation in der Form einer katalytischen Kerndomäne und einer kleineren Cellulose-Bindungsdomäne existiert, welche durch einen Linker oder flexiblen Gelenkabschnitt von Aminosäuren getrennt sind, der reich an Prolin und Hydroxyaminosäuren ist. Gene für die zwei Cellobiohydrolasen CBHI und CBHII (Shoemaker, S., et al., 1983 Bio/Technology 1, 691–696, Teeri, T., et al., 1983, Bio/Technology 1, 696–699, und Teeri, T., et al., 1987, Gene 51, 43–52) und zwei Haupt-Endoglucanasen EGI und EGII (Penttila, M., et al., 1986, Gene 45, 253–263, Van Arsdell, J. N., et al., 1987, Bio/Technology 5, 60–64, und Saloheimo, M., et al., 1988, Gene 63, 11–21) sind aus T. longibrachiatum isoliert worden, und die Proteindomänen-Struktur ist bestätigt worden.
  • Eine ähnliche bifunktionelle Organisation von Cellulase-Enzymen wird bei bakteriellen Cellulasen gefunden. Die Cellulose-Bindungsdomäne (CBD) und der katalytische Kern von Endoglucanase A aus Cellulomonas fimi (C. fimi-Cen A) sind gründlich untersucht worden (Ong, E., et al., 1989, Trends Biotechnol. 7: 239–243, Pilz et al., 1990, Biochem J. 271: 277–280, und Warren et al., 1987, Proteins 1: 335–341). Genfragmente, welche die CBD und die CBD mit dem Linker codieren, sind kloniert und in E. coli exprimiert worden, und von ihnen wurde gezeigt, neue Aktivitäten gegenüber Cellulosefasern aufzuweisen (Gilkes, N. R., et al., 1991, Microbiol. Rev. 55: 305–315, und Din, N., et al., 1991, Bio/Technology 9: 1096–1099). Zum Beispiel zerstört isolierte CBD aus C. fimi-Cen A, welche genetisch in E. coli exprimiert wurde, die Struktur von Cellulosefasern und setzt kleine Partikel frei, aber besitzt keine nachweisbare hydrolytische Aktivität. CBD findet ferner breite Anwendung in der Proteinreinigung und Enzym-Immobilisierung. Andererseits zerstört die katalytische Domäne von C. fimi-Cen A, welche aus mit Protease gespaltener Cellulase isoliert wurde, die Fibrillenstruktur von Cellulose nicht und glättet anstatt dessen die Oberfläche der Faser.
  • Diese neuen Aktivitäten besitzen potenzielle Anwendungen in der Textil-, Nahrungsmittel- und Tierfutter-, Waschmittel- und der Zellstoff- und Papier-Industrie. Für eine industrielle Anwendung müssen jedoch hocheffiziente Expressionssysteme bereitgestellt werden, welche höhere Erträge an trunkierten Cellulaseproteinen erzeugen, als sie derzeitig verfügbar sind, um von irgendeinem kommerziellen Nutzen zu sein. Zum Beispiel sind die Trichoderma longibrachiatum-CBHI-Kerndomänen proteolytisch getrennt und gereinigt worden, aber es werden lediglich Milligramm-Mengen durch dieses biochemische Vorgehen isoliert (Offord, D., et al., 1991, Applied Biochem. and Biotech. 28/29: 377–386). Ähnliche Untersuchungen wurden in einer Analyse der Kern- und Bindungsdomänen von CBHI, CBHII, EGI und EGII, welche aus T. longibrachiatum nach einer biochemischen Proteolyse isoliert worden waren, durchgeführt, wobei jedoch lediglich genug Protein für eine strukturelle und funktionelle Analyse gewonnen wurde (Tomme, P., et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575–581, und Ajo, S., 1991, FERS 291: 45–49).
  • Um Stämme zu erhalten, welche höhere Spiegel an trunkierten Cellulaseproteinen exprimieren, als dies bisher realisiert wurde, wählen die Erfinder der vorliegenden Anmeldung T. longibrachiatum als den für eine Expression am stärksten bevorzugten Mikroorganismus, weil er für seine Fähigkeit allgemein bekannt ist, vollständige Cellulasen in großen Mengen zu sezernieren. Daher begannen die Erfinder, Stämme des oben genannten filamentösen Pilzes gentechnisch zu verändern, um hohe Spiegel an biotechnisch erzeugten trunkierten Cellulasen zu exprimieren.
  • Vor der Erfindung der vorliegenden Patentanmeldung blieb es unbekannt, ob die DNA, welche Bindungs- und Kerndomänen-Proteine der trunkierten Cellulase codiert, auf eine solche Weise in Trichoderma transformiert werden könnte, so dass neue trunkierte Cellulase-Gene, ohne Abbau in der Wirtszelle, zu funktionellen Proteinen überexprimiert werden. Kürzlich haben Nakari und Penttila gezeigt, dass es möglich ist, einen Trichoderma-Wirt gentechnisch zu verändern, um eine trunkierte Form der Trichoderma-EGI-Cellulase, spezifisch die katalytische Kerndomäne, zu exprimieren, wobei jedoch der Spiegel der Expression der EGI-Kerndomäne niedrig war (Nakari, T., et al., Zusammenfassung P1/63, 1. Europäische Konferenz über Pilz-Genetik (European Conference an Fungal Genetics), Nottingham, England, 20.–23. August 1992). Außerdem war es unbekannt, ob eine katalytische Kerndomäne von Trichoderma-Cellobiohydrolase durch rekombinante gentechnische Verfahren hergestellt werden konnte.
  • Folglich ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, DNA-Genfragmente in Stämme des Pilzes Trichoderma longibrachiatum einzubringen, um Transformanten-Stämme herzustellen, welche hohe Spiegel (Gramm/Liter-Niveau) von neuen trunkierten Cellulasen exprimieren, welche proteintechnisch aus den Bindungs- und Kerndomänen von Trichoderma-Cellulasen erzeugt werden. Die trunkierten Proteine werden korrekt prozessiert und extrazellulär in einer aktiven Form sezerniert.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Cellulaseproteins bereit, welches Exoglucanase-Aktivität aufzeigt, umfassend die folgenden Schritte:
    • (a) Bereitstellen einer Trichoderma-Wirtszelle, welche mit einem Expressionsvektor transformiert worden ist, der eine DNA-Sequenz enthält, die ein Cellulase-Protein codiert, wobei das Cellulase-Protein ein katalytisches CBHII-Kernprotein umfasst, das Exoglucanase-Aktivität aufzeigt und dem eine Cellulose-Bindungsdomäne fehlt; und
    • (b) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter solchen Bedingungen, dass das rekombinante Cellulase-Protein exprimiert wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Cellulase-Protein eine Sequenz auf, die aus der Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, welche den katalytischen CBHII-Kern codiert, in SEQ ID Nr. 10 dargestellt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Pilz-Wirtszelle um Trichoderma longibrachiatum.
  • Das Verfahren kann den Schritt des Isolierens des rekominanten Cellulase-Proteins umfassen.
  • Der Expressionsvektor kann in das Genom der Wirtszelle integriert sein. Das Verfahren kann ferner den Schritt des Transformierens der Wirtszelle mit dem Expressionsvektor unter solchen Bedingungen umfassen, dass der Expressionsvektor in das Genom der Wirtszelle integriert.
  • Der Trichoderma-Wirtszelle können eine oder mehrere Cellulase-Aktivitäten fehlen.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • Die 1 stellt die genomische DNA- und Aminosäure-Sequenz von CBHII, abgeleitet aus Trichoderma longibrachiatum, dar. Die Signalsequenz beginnt am Basenpaar 614 und endet am Basenpaar 685 (Seq ID Nr. 27). Die Cellulose-Bindungsdomäne beginnt am Basenpaar 686 und reicht bis zum Basenpaar 707 von Exon Eins und von Basenpaar 755 bis zum Basenpaar 851 von Exon Zwei (Seq ID Nr. 3). Die Linkersequenz beginnt am Basenpaar 852 und endet am Basenpaar 980 (Seq ID Nr. 19). Der katalytische Kern beginnt am Basenpaar 981, reicht bis zum Basenpaar 1141 von Exon Zwei, von Basenpaar 1199 bis zum Basenpaar 1445 von Exon Drei und von Basenpaar 1536 bis zum Basenpaar 2221 von Exon Vier (Seq ID Nr. 11). Die Seq ID Nr. 28, 4, 20 und 12 repräsentieren jeweils die Aminosäuresequenz der Signalsequenz, Bindungsdomäne, Linkerregion bzw. katalytischen Kerndomäne von CBHII.
  • Die 2 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids pTEX (Seq ID Nr. 39–41).
  • Ausführliche Beschreibung
  • Wie oben erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen die Klonierung und Expression von neuen trunkierten Cellulaseproteinen bei hohen Spiegeln im filamentösen Pilz T. longibrachiatum. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in weiterer Ausführlichkeit im Anschluss an eine Definition von hierin verwendeten Begriffen erörtert.
  • Der Begriff "Trichoderma" oder "Trichoderma sp." bezieht sich auf jedwede Pilzstämme, welche früher als Trichoderma klassifiziert worden sind oder welche derzeitig als Trichoderma klassifiziert werden. Vorzugsweise handelt es sich bei den Spezies um Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei oder Trichoderma viride.
  • Die Begriffe "cellulolytische Enzyme" oder "Cellulaseenzyme" beziehen sich auf fungale Exoglucanasen oder Exocellobiohydrolasen (CBH), Endoglucanasen (EG) und β-Glucosidasen (BG). Diese drei unterschiedlichen Typen von Cellulaseenzymen wirken synergistisch, um kristalline Cellulose in Glukose umzuwandeln. Eine Analyse der für CBHI, CBHII und EGI und EGII codierenden Gene zeigt eine Domänenstruktur, welche eine katalytische Kernregion (CCD), eine Gelenk- oder Linkerregion (hierin austauschbar verwendet) und eine Cellulose-Bindungsregion (CBD) umfasst.
  • Der Begriff "trunkierte Cellulasen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Kerndomänen der Cellobiohydrolasen, spezifisch CBHII.
  • Ein "Derivat" der trunkierten Cellulasen umfasst die Kerndomänen der Cellobiohydrolasen, spezifisch CBHII, aus Trichoderma sp., worin eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren an eines oder beide der C- und N-terminalen Enden der trunkierten Cellulase, eine Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der gesamten trunkierten Cellulase, eine Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren innerhalb oder an einem oder beiden Enden des trunkierten Cellulaseproteins, oder eine Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im trunkierten Cellulaseprotein vorhanden sein können, so dass Exoglucanase-Aktivitäten in den trunkierten Proteinen mit abgewandeltem katalytischem CBH-Kern beibehalten werden. Mit dem Begriff "Derivat einer trunkierten Cellulase" wird ebenfalls beabsichtigt, Kerndomänen der Exoglucanase-Enzyme einzuschließen, an welche eine oder mehrere Aminosäuren aus der Linker-Region angefügt sind.
  • Ein trunkiertes Cellulaseprotein-Derivat bezieht sich ferner auf ein Protein, welches hinsichtlich der Struktur und biologischen Aktivität im Wesentlichen ähnlich zu einer Cellulase-Kerndomäne ist, welche die in der Natur gefundenen cellulolytischen Enzyme umfassen, aber welches manipuliert worden ist, um eine modifizierte Aminosäuresequenz zu enthalten. Vorausgesetzt, dass die zwei Proteine eine ähnliche Aktivität besitzen, werden sie somit als "Derivate" angesehen, wie dieser Begriff hierin verwendet wird, selbst wenn die Primärstruktur von einem Protein nicht die identische Aminosäuresequenz zu derjenigen besitzt, welche im anderen gefunden wird.
  • Der Begriff "katalytische Cellulase-Kerndomänen-Aktivität" bezieht sich hierin auf eine Aminosäuresequenz der trunkierten Cellulase, umfassend die Kerndomäne der Cellobiohydrolase CBHII oder eines Derivates davon, welche in der Lage ist, celluloseartige Polymere, wie Zellstoff oder mit Phosphorsäure gequollene Cellulose, enzymatisch zu spalten.
  • Die Aktivität der trunkierten katalytischen Kernproteine oder Derivate davon, wie hierin definiert, kann durch im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren bestimmt werden (siehe Wood, T. M., et al. in Methods in Enzymology, Band 160, Herausgeber: Wood, W. A., und Kellogg, S. T., Academic Press, S. 87–116, 1988). Zum Beispiel können solche Aktivitäten durch Hydrolyse von mit Phosphorsäure gequollener Cellulose und/oder löslichen Oligosacchariden, gefolgt von Quantifizierung der freigesetzten reduzierenden Zucker bestimmt werden. In diesem Fall können die löslichen Zuckerprodukte, welche durch die Wirkung von katalytischen CBH-Domänen oder Derivaten davon freigesetzt wurden, mittels HPLC-Analyse oder durch die Verwendung von colorimetrischen Assays zum Messen von reduzierenden Zuckern nachgewiesen werden. Es wird erwartet, dass diese katalytischen Domänen oder Derivate davon mindestens 10% der Aktivität beibehalten werden, welche von dem intakten Enzym aufgezeigt werden, wenn jede unter ähnlichen Bedingungen geassayt und basierend auf ähnlichen Mengen an katalytischem Domänen-Protein dosiert wird.
  • Der Begriff "Cellulose-Bindungsdomänen-Aktivität" bezieht sich hierin auf eine Aminosäuresequenz der Cellulase, umfassend die Bindungsdomäne von Cellobiohydrolasen und Endoglucanasen, zum Beispiel EGI, EGII, CBHI oder CHBII oder eines Derivates davon, welche nicht-kovalent an ein Polysaccharid wie Cellulose bindet. Es wird angenommen, dass Cellulose-Bindungsdomänen (CBDs) unabhängig vom katalytischen Kern des Cellulaseenzyms funktionieren, um das Protein an Cellulose anzuheften.
  • Andere im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren, welche katalytische Cellulaseaktivität durch die physikalischen oder chemischen Eigenschaften von jeweiligen behandelten Substraten messen, können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Für Verfahren, welche physikalische Eigenschaften eines behandelten Substrates messen, wird beispielsweise das Substrat hinsichtlich Modifikation von Gestalt, Textur, Oberfläche oder Struktureigenschaften, Modifikation des "Nass"-Verhaltens, z. B. die Fähigkeit des Substrates, Wasser zu absorbieren, oder hinsichtlich Modifikation der Quellung analysiert. Andere Parameter, welche Aktivität bestimmen können, schließen die Messung der Änderung der chemischen Eigenschaften von behandelten festen Substraten ein. Zum Beispiel können die Diffusionseigenschaften von Farbstoffen oder Chemikalien nach Behandlung von festem Substrat mit dem trunkierten Cellulase-Bindungsprotein oder Derivaten davon, welche in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, untersucht werden. Geeignete Substrate zur Auswertung der Aktivität schließen zum Beispiel Avicel, Rayon, Zellstofffasern, Baumwolle- oder Ramie-Fasern, Papier, Kraft-Zellstoff oder Zellstoff aus zerkleinertem Holz ein (siehe auch Wood, T. M., et al., in "Methods in Enzymology", Band 160, Herausgeber: Wood, W. A., und Kellogg, S. T., Academic Press, S. 87–116, 1988).
  • Der Begriff "Linker- oder Gelenkregion" bezieht sich auf die kurze Peptidregion, welche die zwei getrennten funktionellen Domänen der Pilz-Cellulasen miteinander verknüpft, d. h. die Kerndomäne und die Bindungsdomäne. Diese Domänen sind in T. longibrachiatum-Cellulasen durch ein Peptid verknüpft, welches reich an Ser, Thr und Pro ist.
  • Eine "Signalsequenz" bezieht sich auf jedwede Sequenz von Aminosäuren, die an den N-terminalen Bereich eines Proteins gebunden ist, welche die Sekretion der reifen Form des Proteins zum Außenraum der Zelle erleichtert. Diese Definition einer Signalsequenz ist funktionell. Der reifen Form des extrazellulären Proteins fehlt die Signalsequenz, welche während des Sekretionsprozesses abgespalten wird.
  • Der Begriff "Variante" bezieht sich auf ein die CBH-Kerndomäne codierendes DNA-Fragment, welches ferner eine Addition von einem oder mehreren Nukleotiden intern oder am 5'- oder 3'-Ende des DNA-Fragmentes, eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden intern oder am 5'- oder 3'-Ende des DNA-Fragmentes oder eine Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden intern oder am 5'- oder 3'-Ende des DNA-Fragmentes enthält, wobei die funktionelle Aktivität der Kerndomäne beibehalten wird.
  • Es ist ferner beabsichtigt, dass ein Varianten-DNA-Fragment, das die Kerndomäne umfasst, angibt, dass eine Linker- oder Gelenk-DNA-Sequenz oder ein Bereich davon an die Kerndomänen-DNA-Sequenz entweder am 5'- oder 3'-Ende angefügt sein kann, wobei die funktionelle Aktivität des codierten trunkierten Kerndomänenproteins beibehalten wird.
  • Der Begriff "Wirtszelle" bedeutet sowohl die Zellen als auch Protoplasten, welche aus den Zellen von Trichoderma sp. erzeugt wurden.
  • Der Begriff "DNA-Konstrukt oder Vektor" (was hierin austauschbar verwendet wird) bezieht sich auf einen Vektor, welcher ein oder mehrere DNA-Fragmente oder DNA-Variantenfragmente umfasst, die ein beliebiges von den neuen trunkierten Cellulasen oder oben beschriebenen Derivaten codieren.
  • Der Begriff "funktionell verbunden mit" bedeutet, dass eine regulatorische Region, wie ein Promotor, Terminator, Sekretionssignal oder eine Enhancer-Region an ein Strukturgen angeheftet ist und die Expression dieses Gens steuert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von trunkierten Cellulasen durch Bereitstellen einer Wirtszelle, welche mit einem DNA-Konstrukt transformiert ist, das mindestens ein Fragment von DNA, codierend eine Kernregion von CBHII, umfasst, welches funktionell an einen Promotor angeheftet ist, Kultivieren der Wirtszelle zum Exprimieren der trunkier ten Cellulase und anschließendes Reinigen der trunkierten Cellulase bis zur wesentlichen Homogenität.
  • Kulturen von transformierten Mikroorganismen werden typischerweise bis zur stationären Phase wachsen gelassen, zur Entfernung der Zellen filtriert, und der verbleibende Überstand wird durch Ultrafiltration konzentriert, um eine trunkierte Cellulase oder ein Derivat davon zu erhalten.
  • Das zum Kultivieren der transformierten Wirtszellen verwendete Medium kann ein beliebiges Medium sein, welches für die Cellulase-Herstellung in Trichoderma geeignet ist. Die trunkierten Cellulasen oder Derivate davon werden aus dem Medium durch herkömmliche Techniken zurückgewonnen, einschließlich Trennungen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Fällung der Proteine im Überstand oder Filtrat mit Salz, zum Beispiel Ammoniumsulfat, gefolgt von Chromatographievorgehensweisen, wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen.
  • Alternativ dazu kann das letztendliche Proteinprodukt durch Bindung an ein Polysaccharidsubstrat oder eine Antikörpermatrix isoliert und gereinigt werden. Die (polyklonalen oder monoklonalen) Antikörper können gegen Cellulase-Kern- oder -Bindungsdomänen-Peptide herangezogen werden, oder synthetische Peptide können aus Bereichen der Kerndomäne oder der Bindungsdomäne hergestellt und zum Heranziehen von polyklonalen Antikörpern verwendet werden.
  • Die Trichoderma-Wirtszelle kann zuvor durch gentechnische Verfahren manipuliert worden sein, um jedwede Wirtsgene zu entfernen, welche intakte Cellulasen codieren, oder nicht.
  • In einer besonderen Ausführungsform werden trunkierte Cellulasen, Derivate davon oder kovalent verknüpfte Domänen-Derivate der trunkierten Cellulase in transformierten Trichoderma-Zellen exprimiert, bei welchen keine Gene daraus deletiert worden sind. Die oben aufgeführten, trunkierten Proteine werden zurückgewonnen und von gleichzeitig in den Wirtszellen exprimierten intakten Cellulasen durch oben erörterte herkömmliche Vorgehensweisen getrennt, einschließlich Größenbestimmungs-Chromatographie. Die Bestätigung der Expression von trunkierten Cellulasen oder Derivaten wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Immunoblot-Analyse bestimmt, um trunkierte von intakten Cellulaseproteinen zu unterscheiden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transformieren einer Trichoderma sp.-Wirtszelle, der eine oder mehrere Cellulaseaktivitäten fehlen, und Behandeln der Zelle unter Anwendung vom im Fachgebiet allgemein bekannten rekombinanten DNA-Techniken mit einem oder mehreren DNA-Fragmenten, welche eine trunkierte Cellulase, ein Derivat davon oder kovalent verknüpfte trunkierte Cellulasedomänen-Derivate codieren. Es wird in Betracht gezogen, dass das DNA-Fragment, welches den trunkier ten Cellulasekern codiert, beispielsweise durch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen innerhalb des Gens verändert werden kann, um eine Varianten-DNA herzustellen, welche ein aktives trunkiertes Cellulase-Derivat codiert.
  • Bei der vorliegenden Erfindung wird es ferner in Betracht gezogen, dass das die trunkierte Cellulase codierende DNA-Fragment funktionell mit einer Pilz-Promotorsequenz, zum Beispiel den Promotor des cbh1- oder eg11-Gens, verbunden sein kann.
  • Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird die Manipulation des Trichoderma sp.-Stammes durch Transformation, so dass ein DNA-Fragment, welches eine trunkierte Cellulase oder ein Derivat davon codiert, innerhalb des Genoms inseriert wird. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass mehr als eine Kopie eines trunkierten Cellulase-DNA-Fragmentes oder -DNA-Variantenfragmentes in den Stamm hinein rekombiniert werden kann.
  • Ein selektierbarer Marker muss zuerst so gewählt werden, dass die Detektion des transformierten Pilzes ermöglicht wird. Jedwedes selektierbare Markergen, welches in Trichoderma sp. exprimiert wird, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, so dass seine Gegenwart in den Transformanten deren Eigenschaften nicht materiell beeinflussen wird. Der selektierbare Marker kann ein Gen sein, welches ein durch einen Assay nachweisbares Produkt codiert. Der selektierbare Marker kann eine funktionelle Kopie eines Trichoderma sp.-Gens sein, welches, wenn es im Wirtsstamm fehlt, dazu führt, dass der Wirtsstamm einen auxotrophen Phänotyp aufzeigt.
  • Die verwendeten Wirtsstämme könnten Derivate von Trichoderma sp. sein, bei denen ein Gen oder Gene, entsprechend dem gewählten selektierbaren Marker, fehlen oder nicht funktionell sind. Wenn zum Beispiel der selektierbare Marker von pyr4 gewählt wird, dann wird ein spezifischer pyr-Derivatstamm als Empfänger im Transformationsvorgehen verwendet. Andere Beispiele von selektierbaren Marker, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen die Trichoderma sp.-Gene ein, welche äquivalent zu den Aspergillus nidulans-Genen argB, trpC, niaD und dergleichen sind. Der entsprechende Empfängerstamm muss daher ein Derivatstamm sein, wie argB–, trpC–, niaD– und dergleichen.
  • Der Stamm wird aus einem Ausgangs-Wirtsstamm abgeleitet, welcher ein beliebiger Trichoderma sp.-Stamm ist. Es wird jedoch bevorzugt, einen Cellulase-überproduzierenden T. longibrachiatum-Stamm, wie RL-P37, zu verwenden, welcher beschrieben wurde von Sheir-Neiss et al., in Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984), S. 46–54, weil dieser Stamm erhöhte Mengen an Cellulaseenzymen sezerniert. Dieser Stamm wird dann verwendet, um die im Transformationsverfahren verwendeten Derivatstämme herzustellen.
  • Der Derivatstamm von Trichoderma sp. kann durch eine Reihe von im Fachgebiet bekannten Techniken hergestellt werden. Ein Beispiel ist die Herstellung von pyr4–-Derivatstämmen durch Aussetzen der Stämme an Fluororotsäure (FOA). Das pyr4-Gen codiert Orotidin-5'-monophosphat-Decarboxylase, ein Enzym, welches für die Biosynthese von Uridin erforderlich ist. Stämme mit einem intakten pyr4-Gen wachsen in einem Medium, welchem Uridin fehlt, aber sind gegenüber Fluororotsäure empfindlich. Es ist möglich, pyr4 Derivatstämme zu selektieren, denen ein funktionelles Orotidinmonophosphat-Decarboxylase-Enzym fehlt und die Uridin für das Wachstum erfordern, indem man hinsichtlich FOA-Resistenz selektiert. Unter Anwendung der FOA-Selektionstechnik ist es ebenfalls möglich, Uridin erfordernde Stämme zu erhalten, denen eine funktionelle Orotat-Pyrophosphoribosyl-Transferase fehlt. Es ist möglich, diese Zellen mit einer funktionellen Kopie des Gens, welches dieses Enzym codiert, zu transformieren (Berges und Barreau, 1991, Curr. Genet. 19, S. 359–365). Da es einfach ist, Derivatstämme unter Anwendung der FOA-Resistenztechnik in der vorliegenden Erfindung zu selektieren, wird es bevorzugt, als einen selektierbaren Marker das pyr4-Gen zu verwenden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind bei Trichoderma-Wirtszellstämmen vor der Einbringung eines DNA-Konstrukts oder Plasmides, welches das für das trunkierte Cellulaseprotein von Interesse codierende DNA-Fragment enthält, ein oder mehrere Cellulasegene deletiert worden. Es wird bevorzugt, eine trunkierte Cellulase, ein Derivat davon oder kovalent verbundene trunkierte Cellulasedomänen-Derivate in einem Wirt zu exprimieren, welchem ein oder mehrere Cellulasegene fehlen, um die Identifizierung und anschließende Reinigungsvorgehen zu vereinfachen. Jedwedes Gen aus Trichoderma sp., welches kloniert worden ist, kann deletiert werden, wie etwa cbh1, cbh2, eg11, eg13 und dergleichen. Das Plasmid für die Gendeletion wird so ausgewählt, dass einmalige Restriktionsenzym-Stellen darin vorhanden sind, um zu gestatten, dass das Fragment von homologer Trichoderma sp.-DNA als ein einzelnes lineares Stück entfernt werden kann.
  • Das gewünschte Gen, welches aus der Transformante deletiert werden soll, wird durch im Fachgebiet bekannte Verfahren in das Plasmid inseriert. Das Plasmid, welches das zu deletierende oder disruptierende Gen enthält, wird dann an geeigneten Restriktionsenzym-Stelle(n), intern zu bzw. in der codierenden Region, geschnitten, die Gen-codierende Sequenz oder ein Teil davon kann daraus entfernt werden, und der selektierbare Marker wird inseriert. Flankierende DNA-Sequenzen aus dem Locus des zu deletierenden oder disruptierenden Gens, vorzugsweise zwischen etwa 0,5 bis 2,0 kb, verbleiben auf beiden Seiten des selektierbaren Markergens.
  • Ein einzelnes DNA-Fragment, welches das Deletionskonstrukt enthält, wird dann aus dem Plasmid isoliert und verwendet, um den geeigneten pyr–-Trichoderma-Wirt zu transformieren. Transformanten werden basierend auf ihrem Vermögen selektiert, das pyr4-Genprodukt zu exprimieren und somit die Uridin-Auxotrophie des Wirtstamms zu komplementieren. Dann wird eine Southern-Blot-Analyse an den resultierenden Transformanten ausgeführt, um ein Doppel- Crossover-Integrationsereignis zu identifizieren und zu bestätigen, welches einen Teil oder die Gesamtheit der codierenden Region des zu deletierenden Gens mit den selektierbaren pyr4-Markern ersetzt.
  • Obwohl oben spezifische Plasmidvektoren beschrieben werden, ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Herstellung dieser Vektoren eingeschränkt. Verschiedene Gene können in dem Trichoderma sp.-Stamm unter Anwendung der oben genannten Techniken deletiert und ersetzt werden. Beliebige verfügbare selektierbare Marker können verwendet werden, wie es oben erörtert wurde. Potenziell kann jedwedes Trichoderma sp.-Gen, welches kloniert und somit identifiziert worden ist, unter Anwendung der oben beschriebenen Strategie aus dem Genom deletiert werden. Alle diese Variationen sind innerhalb der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
  • Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung, welcher das inserierte DNA-Fragment oder Varianten-DNA-Fragment trägt, das die trunkierte Cellulase oder das Derivat davon der vorliegenden Erfindung codiert, kann jedweder Vektor sein, der zu autonomer Replikation in einem gegebenen Wirtsorganismus in der Lage ist, typischerweise ein Plasmid. In bevorzugten Ausführungsformen werden zwei Typen von Expressionsvektoren zum Erhalten einer Expression von Genen oder Trunkierungen davon in Betracht gezogen. Der Erste enthält DNA-Sequenzen, in welchen der Promotor, die codierende Region des Gens und die Terminatorsequenz alle aus dem zu exprimierenden Gen stammen. Die Gen-Trunkierung wird durch Fort-Deletieren der unerwünschten DNA-Sequenzen (welche für ungewünschte Domänen codieren) erhalten, wodurch die zu exprimierende Domäne unter der Steuerung ihrer eigenen transkriptionellen und translationalen Regulationssequenzen gelassen wird. Ein selektierbarer Marker ist ebenfalls auf dem Vektor enthalten, welcher die Selektion hinsichtlich Integration mehrerer Kopien der neuen Gensequenzen in den Wirt zulässt.
  • Der zweite Typ von Expressionsvektor ist im Voraus zusammengebaut und enthält Sequenzen, die für eine Transkription bei hohem Spiegel erforderlich sind, und einen selektierbaren Marker. Es wird in Betracht gezogen, dass die codierende Region für ein Gen oder ein Teil davon in diesen Allzweck-Expressionsvektor so inseriert werden kann, dass sie unter der transkriptionellen Steuerung der Promotor- und Terminatorsequenzen der Expressionskassette steht.
  • Zum Beispiel ist pTEX ein solcher Allzweck-Expressionsvektor. Gene, oder ein Teil davon, können stromabwärts des starken CBHI-Promotors inseriert werden. Es sind hierin offenbarte Beispiele eingeschlossen, in welchen gezeigt wird, dass katalytische Kern- und Bindungs-Domänen von Cellulase unter Verwendung dieses Systems exprimiert werden.
  • In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, welche die trunkierte Cellulase oder andere neue Proteine der vorliegenden Erfindung codiert, funktionstüchtig an transkriptionelle und translationale Sequenzen, d. h. eine geeignete Promotorsequenz und Signalsequenz, im Leseraster mit dem Strukturgen verknüpft sein. Der Promotor kann jedwede DNA-Sequenz sein, welche Transkriptionsaktivität in der Wirtszelle zeigt und kann aus Genen abgeleitet sein, welche hinsichtlich der Wirtszelle entweder homologe oder heterologe Proteine codieren. Das Signalpeptid sorgt für die extrazelluläre Expression der trunkierten Cellulase oder ihrer Derivate. Die DNA-Signalsequenz ist vorzugsweise die Signalsequenz, welche natürlich mit dem zu exprimierenden trunkierten Gen assoziiert ist, allerdings wird in der vorliegenden Erfindung die Signalsequenz aus beliebigen Cellobiohydrolasen oder Endoglucanase in Betracht gezogen.
  • Die zum Ligieren der DNA-Sequenzen, welche die trunkierten Cellulasen, Derivate davon oder andere neue Cellulasen der vorliegenden Erfindung codieren, mit dem Promotor und die Insertion in geeignete Vektoren, welche die notwendige Information für eine Replikation in der Wirtszelle enthalten, sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
  • Der/das oben beschriebene DNA-Vektor oder -Konstrukt kann gemäß bekannten Techniken in die Wirtszelle eingebracht werden, wie Transformation, Transfektion, Mikroinjektion, Mikroporation, Biolistik-Beschuss und dergleichen.
  • In der bevorzugten Transformationstechnik muss man berücksichtigen, dass die Aufnahme der gewünschten DNA-Sequenz, des Gens oder Genfragments bestenfalls minimal ist, weil die Permeabilität der Zellwand in Trichoderma sp. sehr gering ist. Es gibt eine Reihe von Verfahren, um die Permeabilität der Trichoderma sp.-Zellwand im Derivat-Stamm (d. h. ohne ein funktionales Gen, entsprechend dem verwendeten selektierbaren Marker) vor dem Transformationsverfahren zu erhöhen.
  • Das bevorzugte Verfahren in der vorliegenden Erfindung, um Trichoderma sp. für die Transformation vorzubereiten, beinhaltet die Herstellung von Protoplasten aus Pilzmyzel. Das Myzel kann aus gekeimten vegetativen Sporen erhalten werden. Das Myzel wird mit einem Enzym behandelt, welches die Zellwand verdaut, was zu Protoplasten führt. Die Protoplasten werden dann durch das Vorhandensein eines osmotischen Stabilisators im Suspendiermedium geschützt. Diese Stabilisatoren schließen Sorbitol, Mannitol, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und dergleichen ein. Üblicherweise variiert die Konzentration dieser Stabilisatoren zwischen 0,8 M bis 1,2 M. Es wird bevorzugt, eine Lösung von etwa 1,2 M Sorbitol im Suspensionsmedium zu verwenden.
  • Die Aufnahme der DNA in den Wirts-Trichoderma sp.-Stamm ist abhängig von der Calciumionenkonzentration. Im Allgemeinen werden zwischen etwa 10 mM CaCl2 und 50 mM CaCl2 in einer Aufnahmelösung verwendet. Neben der Notwendigkeit für das Calciumion in der Aufnahmelösung sind andere im Allgemeinen eingeschlossene Bestandteile ein Pufferungssystem, wie ein TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) oder 10 mM MOPS-Puffer mit pH 6,0 (Morpholinpropansulfonsäure) und Polyethylenglycol (PEG). Es wird angenommen, dass das Polyethylenglycol wirkt, um die Zellmembranen zu fusionieren, wodurch ermöglicht wird, dass der Inhalt des Mediums in das Zytoplasma des Trichoderma sp.-Stammes zugeführt wird, und die Plasmid-DNA zum Zellkern transferiert wird. Diese Fusion führt häufig dazu, dass mehrere Kopien der Plasmid-DNA tandemartig in das Wirtschromosom integriert werden.
  • Üblicherweise wird eine Suspension, enthaltend die Trichoderma sp.-Protoplasten oder -Zellen, welche einer Permeabilitätsbehandlung unterzogen worden sind, bei einer Dichte von 108 bis 109/ml, vorzugsweise 2 × 108/ml, in der Transformation verwendet. Diese Protoplasten oder Zellen werden der Aufnahmelösung zugegeben, zusammen mit dem gewünschten linearisierten selektierbaren Marker, welcher im Wesentlichen homologe flankierende Regionen auf beiden Seiten des Markers aufweist, um ein Transformationsgemisch zu bilden. Im Allgemeinen wird eine hohe Konzentration an PEG zu der Aufnahmelösung zugegeben. Es kann von 0,1 bis 1 Volumen an 25%igem PEG 4000 zu der Protoplastensuspension zugegeben werden. Allerdings wird es bevorzugt, etwa 0,25 Volumen zu der Protoplastensuspension zuzugeben. Zusatzsstoffe, wie Dimethylsulfoxid, Heparin, Spermidin, Kaliumchlorid und dergleichen, können ebenfalls zu der Aufnahmelösung zugegeben werden, und wirken bei der Transformation unterstützend.
  • Im Allgemeinen wird die Mischung dann bei ungefähr 0°C während einer Dauer von 10 bis 30 Minuten inkubiert. Zusätzliches PEG wird dann zu der Mischung zugegeben, um die Aufnahme des gewünschten Gens oder der gewünschten DNA-Sequenz weiter zu verstärken. Das 25%ige PEG 4000 wird im Allgemeinen in Volumina von dem 5- bis 15-Fachen des Volumens der Transformationsmischung zugegeben; allerdings können größere und kleinere Volumina geeignet sein. Das 25%ige PEG 4000 beläuft sich vorzugsweise auf etwa das 10-Fache des Volumens der Transformationsmischung. Nachdem das PEG zugegeben ist, wird die Transformationsmischung dann bei Raumtemperatur inkubiert, vor der Zugabe einer Lösung von Sorbitol und CaCl2. Die Protoplastensuspension wird dann ferner zu geschmolzenen Aliquots eines Wachstumsmediums gegeben. Dieses Wachstumsmedium gestattet nur das Wachstum von Transformanten. In der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges Wachstumsmedium verwendet werden, welches geeignet ist, um die gewünschten Transformanten zu kultivieren. Wenn Pyr+-Transformanten selektiert werden, ist es allerdings zu bevorzugen, ein Wachstumsmedium zu verwenden, das kein Uridin enthält. Die anschließenden Kolonien werden überführt und auf einem von Uridin freien Wachstumsmedium gereinigt.
  • Bei diesem Stadium wurden stabile Transformanten von instabilen Transformanten durch ihre rasche Wachstumsgeschwindigkeit und die Bildung von kreisförmigen Kolonien mit einem glatten anstatt einem gezackten Rand auf festem Kulturmedium ohne Uridin unterschieden. Darüber hinaus wurde in einigen Fällen ein weiterer Test hinsichtlich Stabilität durch Kultivieren der Transformanten auf festem nicht-selektiven Medium (d. h. mit Uridin), Ernten der Sporen aus diesem Kulturmedium und Bestimmten des Prozentsatzes dieser Sporen, welche anschließend auskeimen und auf Selektivmedium ohne Uridin wachsen werden, vorgenommen.
  • In einer besonderen Ausführungsform des oben genannten Verfahrens werden die trunkierten Cellulasen [entweder] als Ergebnis der geeigneten posttranslationalen Prozessierung der trunkierten Cellulase in einer aktiven Form aus der Wirtszelle gewonnen.
  • Die Verwendung der katalytischen Cellulase-Kerndomänen kann gegenüber der Verwendung des intakten Cellulase-Enzyms bei mehreren Anwendungen von Vorteil sein. Derartige Anwendungen beinhalten Stonewashing oder "Biopolishing", wobei es in Betracht gezogen wird, dass Farbstoff/Färbemittel/Pigment-Rückfärbung oder -Neuabscheidung durch Verwenden der neuen trunkierten Cellulasenzyme reduziert oder eliminiert werden kann, welche so modifiziert worden sind, dass ihnen eine Cellulose-Bindungsdomäne fehlt. Darüber hinaus wird in Betracht gezogen, dass die Aktivität gegenüber bestimmten Substraten von Interesse zum Beispiel in der Textil-, Waschmittel-, Zellstoff- & Papier-, Tierfutter-, Nahrungsmittel- und Biomassen-Industrie signifikant erhöht oder vermindert werden kann, wenn die Bindungsdomäne entfernt ist, so dass die Bindungsaffinität des Enzyms für Cellulose reduziert wird.
  • Es wird ferner in Betracht gezogen, dass die Expression und Verwendung von manchen katalytischen Domänen von Cellulase-Enzymen eine verbesserte Rückgewinnbarkeit des Enzyms, Selektivität, falls geringere Aktivität gegenüber einem stärker kristallinen Substrat gewünscht wird, oder Selektivität, falls eine hohe Aktivität gegenüber amorphem/löslichem Substrat gewünscht wird, vorsieht.
  • Darüber hinaus können katalytische Domänen von Cellulase-Enzymen nützlich sein, um die Synergie mit anderen Cellulase-Komponenten, Cellulase- oder Nicht-Cellulase-Domären und/oder anderen Enzymen oder Bereichen davon gegenüber celluloseartigen Cellulose-haltigen Materialien in Anwendungen, wie der Biomassen-Umwandlung, Reinigung, Stonewashing, Biopolishing von Textilien, Weichmachen, Zellstoff/Papierverarbeitung, Tierfutter-Verwertung, Pflanzenschutz und Schädlingsbekämpfung, Stärkeverarbeitung, oder Produktion von pharmazeutischen Zwischenstufen, Disacchariden oder Oligosacchariden, zu erhöhen.
  • Weiterhin können die Verwendungen von katalytischen Cellulase-Kerndomänen oder Derivaten davon einige der nachteiligen Eigenschaften, welche mit dem intakten Enzym assoziiert sind, gegenüber celluloseartigen Stoffen, wie Zellstoffen, Baumwolle oder anderen Fasern oder Papier, reduzieren. Eigenschaften von Interesse schließen Faser/Gewebe-Festigkeitsverlust, Faser/Gewebe-Gewichtsverlust, Fussel-Erzeugung und Fibrillierungs-Schädigung ein.
  • Es wird ferner in Betracht gezogen, dass katalytische Cellulase-Kerndomänen eine geringere Faseraufrauhung oder reduzierte Färbemittel-Neuabscheidung/Rückfärbung aufzeigen können. Fernerhin können diese trunkierten katalytischen Kern-Cellulasen oder Derivate davon eine Option für ein verbessertes Rückgewinnen/Recycling dieser neuen Cellulasen bieten.
  • Darüber hinaus wird es in Betracht gezogen, dass die katalytischen Cellulase-Kerndomänen selektive Aktivitätsvorteile enthalten können, wo eine Hydrolyse der löslichen oder amorpheren Cellulose-Regionen des Substrates gewünscht wird, aber eine Hydrolyse der kristallineren Region nicht gewünscht ist. Dies kann bei Anwendungen wie der Biokonversion von Bedeutung sein, worin die selektive Modifikation der Korn/Faser/Pflanzenmaterialien von Interesse ist.
  • Noch eine andere Anwendung für katalytische Cellulase-Kerndomänen oder Derivate besteht in der Erzeugung von mikrokristalliner Cellulose (MCC). Weiterhin wird es in Betracht gezogen, dass die MCC weniger gebundenes Enzym enthalten wird, oder dass das gebundene Enzym leichter entfernt werden kann.
  • Um die vorliegende Erfindung und deren Vorteile weiter zu veranschaulichen, sind die folgenden spezifischen Beispiele angegeben, wobei es sich versteht, dass sie zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung angeboten werden, und sie keineswegs als deren Umfang einschränkend ausgelegt werden sollten.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Klonierung und Expression von CBHII-Kerndomäne unter Verwendung des CBHI-Promotors, -Terminators und der Signalsequenz aus CBHII.
  • Teil 1. Konstruktion des T. longibrachiatum-Allzweckexpressionsplasmides PTEX.
  • Das Plasmid PTEX wurde unter Befolgung der Verfahren von Sambrook et al. (1989), siehe oben, konstruiert und ist in der 7 veranschaulicht. Dieses Plasmid ist als ein Mehrzweck-Expressionsvektor zur Verwendung im filamentösen Pilz Trichoderma longibrachiatum entworfen worden. Die Expressionskassette besitzt mehrere einzigartige Merkmale, welche sie für diese Funktion nützlich machen. Die Transkription wird unter Verwendung der Sequenzen für den starken Promotor und den Terminator des CBHI-Gens für T. longibrachiatum reguliert. Zwischen dem CBHI-Promotor und -Terminator befinden sich einmalige PmeI- und SstI-Restriktionsstellen, welche verwendet werden, um das zu exprimierende Gen zu inserieren. Das selektierbare T. longibrachiatum-pyr4-Markergen ist in den CBHI-Terminator inseriert worden, und die vollständige Expressionskassette (CBHI-Promotor-Insertionsstellen-CBHI-Terminator- pyr4-Gen-CBHI-Terminator) kann unter Verwendung der einmaligen NotI-Restriktionsstelle oder der einmaligen NotI- und NheI-Restriktionsstellen herausgeschnitten werden.
  • Dieser Vektor basiert auf dem bakteriellen Vektor pSL1180 (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey), welcher ein Vektor vom PUC-Typ mit einer verlängerten Mehrfachklonierungsstelle ist. Der Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, diesen Vektor basierend auf dem in der 2 veranschaulichten Flussdiagramm zu konstruieren (siehe auch die U. S.-Patentanmeldung 07/954 113 für die Konstruktion des PTEX-Expressionsplasmides).
  • Teil 2. Klonierung.
  • Das in der Konstruktion des CBHII-Kerndomänen-Expressionsplasmides, PTEX CBHII core, verwendete vollständige cbh2-Gen wurde aus dem Plasmid PUC219::CBHII (Korman, D., et al., 1990, Curr. Genet. 17: 203–212) erhalten. Die Cellulose-Bindungsdomäne, welche am 5'-Ende des cbh2-Gens positioniert ist, liegt zweckmäßigerweise zwischen einer XbaI- und SnaBI-Restriktionsstelle. Um die XbaI-Stelle zu verwenden, wurde eine weitere XbaI-Stelle im Polylinker zerstört. PUC219::CBHII wurde partiell mit XbaI verdaut, so dass der Großteil des Produktes linear war. Die XbaI-Überhänge wurden unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase aufgefüllt und unter Bedingungen zusammenligiert, welche die Selbstligation des Plasmides begünstigen. Dies besitzt den Effekt der Zerstörung der geglätteten Stelle, welche in 50% der Plasmide die XbaI-Stelle im Polylinker war. Ein solches Plasmid wurde identifiziert und mit XbaI und SnaBI verdaut, um die Cellulose-Bindungsdomäne freizusetzen. Die Vektor-CBHII-Kerndomäne wurde isoliert und mit den folgenden synthetischen Oligonukleotiden ligiert, welche entworfen waren, um die XbaI-Stelle mit der SnaBI-Stelle an der Signalpeptidase-Spaltungsstelle und dem Papain-Spaltungspunkt in der Linkerdomäne zu verknüpfen.
  • Figure 00160001
  • Das resultierende Plasmid pUCΔCBD CBHII wurde mit NheI verdaut, und die Enden wurden durch Inkubation mit T4-DNA-Polymerase und dNTPs geglättet. Hiernach wurde die lineare geglättete Plasmid-DNA mit BglII verdaut, und das Nhe(glattendig)-BglII-Fragment, welches die CBHII-Signalsequenz und Kerndomäne enthielt, wurde isoliert.
  • Das letztendliche Expressionsplasmid wurde durch Verdauen des Allzweck-Expressionsplasmides pTEX (offenbart in 07/954 113 und nachstehend beschrieben in Teil 3) mit SstII und PmeI und Ligieren des CBHII-NheI(glattendig)-BglII-Fragmentes stromabwärts vom cbh1-Promotor unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotides konstruiert, welches die Sequenz CGCTAG aufwies, um den BglII-Überhang mit dem SstII-Überhang aufzufüllen.
  • Teil 3. Transformation und Expression
  • Eine DNA-Präparation im großen Maßstab von pTEX-CBHIIcore wurde vorgenommen, und hieraus wurde das NotI-Fragment, enthaltend die CBHII-Kerndomäne unter der Steuerung der cbh1-Transkriptionselemente und das pyr4-Gen, durch präparative Gelelektrophorese isoliert. Das isolierte Fragment wurde in die Uridin-auxotrophe Version des quad-deletierten Stammes, 1A52 pyr13, transformiert und stabile Transformanten wurden identifiziert.
  • Um zu selektieren, welche Transformanten die cbh2-Kerndomäne exprimierten, wurde genomische DNA aus Stämmen im Anschluss an Wachstum auf Vogels +1% Glukose isoliert, und Southern-Blot-Experimente wurden durchgeführt, wobei ein isoliertes DNA-Fragment verwendet wurde, welches nur die cbh2-Kerndomäne enthielt. Es wurden Transformanten isoliert, bei welchen eine Kopie der cbh2-Kerndomänen-Expressionskassette in das Genom von 1A52 integriert war. Gesamt-mRNA wurde aus den zwei Stämmen in Anschluss an Wachstum während einem Tag auf Vogels +1% Lactose isoliert. Die mRNA wurde einer Northern-Analyse unter Verwendung der codierenden Region von cbh2 als Sonde unterzogen. Transformanten, welche die cbh2-Kerndomänen-mRNA exprimieren, wurden identifiziert.
  • Zwei Transformanten wurden unter den gleichen Bedingungen, wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben, in 14 1 großen Fermentern kultiviert. Die resultierende Nährlösung wurde konzentriert, und die darin enthaltenen Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getrennt, und das CBHII-Kerndomänenprotein wurde durch Western-Analyse identifiziert. Eine Transformante, #15, produzierte ein Protein der korrekten Größe und Reaktivität gegenüber polyklonalen CBHII-Antikörpern.
  • Es wurde anschließend geschätzt, dass die Proteinkonzentration des Fermentationsüberstands nach der Reinigung 10 g/l betrug, wovon 30–50% CBHII-Kerndomäne war (siehe Beispiel 2).
  • Beispiel 2
  • Reinigung des katalytischen CBHII-Kerns
  • Es wird vorhergesagt, dass sich der katalytische CBHII-Kern aufgrund seiner ähnlichen biochemischen Eigenschaften in einer ähnlichen Weise zu derjenigen von CBHII-Cellulase reinigen lassen wird. Der theoretische pI des CBHII-Kerns ist weniger als eine halbe pH-Einheit niedriger als jener von CBHII. Darüber hinaus macht der katalytische CBHII-Kern ungefähr 80% des Molekulargewichts von CBHII aus. Deshalb basiert das nachfolgend vorgeschlagene Reinigungsprotokoll auf dem für CBHII verwendeten Reinigungsverfahren. Die mit Diatomeen-Erde behandelte, ultrafiltrierte (UF) CBHII-Kern-Nährlösung wird in 10 mM TES, pH 6,8, zu einer Leitfähigkeit von < 0,7 mOhm verdünnt. Der verdünnte CBHII-Kern wird dann auf eine Anionenaustauschsäule (Q-Sepharose Fast Flow, Pharmacia, Kat.-Nr. 17 0510-01) aufgetragen, welche in 10 mM TES pH 6,8 äquilibriert wurde. Ein Salzgradient von 0 bis 1 M NaCl in 10 mM TES, pH 6,8, wird verwendet, um den CBHII-Kern aus der Säule heraus zu eluieren. Die Fraktionen, welche den CBHII-Kern enthalten, werden dann einem Pufferaustausch in 2 mM Natriumsuccinat-Puffer unterzogen und auf eine Kationenaustauschsäule (SP-Sephadex C-50) aufgetragen. Der CBHII-Kern wird als nächstes mit einem Salzgradienten von 0 bis 100 mM NaCl aus der Säule eluiert. SEQUENZAUFLISTUNG
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Claims (8)

  1. Verfahren zur Herstellung eines rekominanten Cellulase-Proteins, welches Exoglucanase-Aktivität aufzeigt, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Trichoderma-Wirtszelle, welche einen Expressionsvektor enthält, der eine DNA-Sequenz enthält, die ein Cellulase-Protein codiert, wobei das Cellulase-Protein ein katalytisches CBHII-Kernprotein umfasst, das Exoglucanase-Aktivität aufzeigt und dem eine Cellulose-Bindungsdomäne fehlt; und (b) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter solchen Bedingungen, dass das rekombinante Cellulase-Protein exprimiert wird.
  2. Verfahren von Anspruch 1, wobei das Cellulase-Protein eine Sequenz aufweist, die aus der Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist.
  3. Verfahren von Anspruch 2, wobei die DNA-Sequenz, welche den katalytischen CBHII-Kern codiert, in SEQ ID Nr. 10 dargestellt ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Pilz-Wirtszelle um Trichoderma longibrachiatum handelt.
  5. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, welches ferner das Isolieren des rekominanten Cellulase-Proteins umfasst.
  6. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Expressionsvektor in das Genom der Wirtszelle integriert ist.
  7. Verfahren von Anspruch 6, welches ferner den Schritt des Transformierens der Wirtszelle mit dem Expressionsvektor unter solchen Bedingungen umfasst, dass der Expressionsvektor in das Genom der Wirtszelle integriert.
  8. Verfahren von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Trichoderma-Wirtszelle eine oder mehrere Cellulase-Aktivitäten fehlen.
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ES (1) ES2160694T3 (de)
FI (2) FI116965B (de)
HK (1) HK1097163A1 (de)
NO (1) NO314562B1 (de)
NZ (1) NZ278373A (de)
PT (1) PT684770E (de)
WO (2) WO1995016360A1 (de)

Families Citing this family (248)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7005128B1 (en) 1993-12-17 2006-02-28 Genencor International, Inc. Enzyme feed additive and animal feed including it
US6268196B1 (en) 1993-12-17 2001-07-31 Genencor International, Inc. Method and compositions for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
US5861271A (en) * 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
FR2715802B1 (fr) * 1994-02-04 1996-03-15 Rhone Poulenc Nutrition Animal Utilisation d'enzymes dans l'alimentation des animaux pour réduire les rejets azotés.
GB9424661D0 (en) * 1994-12-07 1995-02-01 Biotal Ltd Enzymes, microorganisms and their use
CN101173263A (zh) 1995-03-17 2008-05-07 诺沃奇梅兹有限公司 新的内切葡聚糖酶
US5700686A (en) * 1995-06-06 1997-12-23 Iogen Corporation Protease-treated and purified cellulase compositions and methods for reducing backstaining during enzymatic stonewashing
TR199800402T1 (xx) 1995-09-08 1998-06-22 Novo Nordisk A/S Taşla yıkamada yeniden eski renge dönme olayının önlenmesi.
US5958083A (en) * 1995-09-08 1999-09-28 Novo Nordisk A/A Prevention of back-staining in stone washing
US6184019B1 (en) 1995-10-17 2001-02-06 Röhm Enzyme Finland OY Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
US6723549B2 (en) 1995-10-17 2004-04-20 Ab Enzymes Oy Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
US6190898B1 (en) * 1995-10-23 2001-02-20 Genencor International, Inc. Crystalline cellulase and method for producing same
CN1209838A (zh) * 1996-01-29 1999-03-03 诺沃挪第克公司 纤维素织物的脱浆方法
DE69730821T2 (de) * 1996-01-29 2005-09-29 Novozymes A/S Verfahren zum entfernen oder bleichen von verschmutzungen oder flecken aus zellulosekaltigem gewebe
US6277596B1 (en) * 1996-09-13 2001-08-21 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Regulatory sequence of cellulase cbh1 genes originating in trichoderma viride and system for mass-producing proteins or peptides therewith
US6451063B1 (en) * 1996-09-25 2002-09-17 Genencor International, Inc. Cellulase for use in industrial processes
US6017870A (en) * 1996-10-09 2000-01-25 Genencor International, Inc. Purified cellulase and method of producing
JP4463878B2 (ja) * 1996-10-28 2010-05-19 ノボザイムス アクティーゼルスカブ バチルス菌を用いたセルロース結合ドメインの細胞外発現
FI964692A0 (fi) * 1996-11-25 1996-11-25 Primalco Ltd Foerbaettrad cellulassammansaettning foer bioefterbehandling av textilmaterial som innehaoller cellulosa
US5866407A (en) * 1997-03-18 1999-02-02 Iogen Corporation Method and enzyme mixture for improved depilling of cotton goods
TW409035B (en) 1997-06-04 2000-10-21 Gist Brocades Bv Starch-based enzyme granulates
ATE282963T1 (de) * 1997-07-31 2004-12-15 Dsm Ip Assets Bv Zusammensetzung für brotverbesserung
US6294366B1 (en) * 1997-09-19 2001-09-25 Clariant Finance (Bvi) Limited Compositions and methods for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
US6287839B1 (en) 1997-11-19 2001-09-11 Genencor International, Inc. Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
GB9724629D0 (en) * 1997-11-20 1998-01-21 Genencor Int Bv Alpha/beta hydrolase-fold enzymes
AU1726299A (en) * 1997-12-16 1999-07-05 Genencor International, Inc. Novel egiii-like enzymes, dna encoding such enzymes and methods for producing such enzymes
CA2331199C (en) 1998-06-10 2012-10-23 Markus Sakari Kauppinen Isolated mannanases for use in treating cellulosic or synthetic fibers
US6407046B1 (en) 1998-09-03 2002-06-18 Genencor International, Inc. Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same
US6579841B1 (en) 1998-12-18 2003-06-17 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
US6268328B1 (en) * 1998-12-18 2001-07-31 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
US7977051B2 (en) 1999-04-10 2011-07-12 Danisco Us Inc. EGIII-like enzymes, DNA encoding such enzymes and methods for producing such enzymes
US7375197B2 (en) * 2002-01-14 2008-05-20 Midwest Research Institute Cellobiohydrolase I gene and improved variants
US8637293B2 (en) * 1999-07-13 2014-01-28 Alliance For Sustainable Energy, Llc Cellobiohydrolase I enzymes
DE60045255D1 (de) * 1999-12-23 2010-12-30 Genencor Int Cellulase von t. reesei mit verbesserter thermostabilität
AU2001250954A1 (en) * 2000-03-24 2001-10-08 Genencor International, Inc. Increased production of secreted proteins by recombinant eukaryotic cells
GB0011439D0 (en) * 2000-05-12 2000-06-28 Novartis Res Found Cancer diagnosis and assays for screening
US6623949B1 (en) 2000-08-04 2003-09-23 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
JP4557108B2 (ja) * 2000-08-11 2010-10-06 ライオン株式会社 キメラ酵素及び洗浄剤組成物
WO2002024882A2 (en) * 2000-09-25 2002-03-28 Iogen Energy Corporation Method for glucose production with a modified cellulase mixture
JP4242761B2 (ja) 2001-06-06 2009-03-25 ノボザイムス アクティーゼルスカブ エンド−β−１，４−グルカナーゼ
EP1441599B1 (de) * 2001-10-26 2007-07-18 Novozymes A/S Verfahren zur herstellung von esswaren
US8012721B2 (en) * 2002-03-15 2011-09-06 Iogen Energy Corporation Method for glucose production using endoglucanase core protein for improved recovery and reuse of enzyme
GB2389584A (en) * 2002-06-14 2003-12-17 Norsk Hydro As A fusion protein
DK1578943T3 (da) 2002-08-16 2012-01-09 Danisco Us Inc Nye variant-Hypocrea jecorina-CBH1-cellulaser
JP5427342B2 (ja) * 2003-04-01 2014-02-26 ジェネンコー・インターナショナル・インク 変異体フミコーラ・グリセアｃｂｈ１．１
US7604974B2 (en) 2003-04-29 2009-10-20 Genencor International, Inc. Bacillus 029cel cellulase
CA2523722A1 (en) 2003-04-30 2004-11-18 Genencor International, Inc. Novel bacillus bagcel cellulase
WO2004099370A2 (en) * 2003-04-30 2004-11-18 Genencor International, Inc. NOVEL BACILLUS mHKcel CELLULASE
WO2004111228A1 (en) 2003-05-02 2004-12-23 Novozymes Inc. Methods for producing secreted polypeptides
DK1627049T3 (da) * 2003-05-29 2010-05-31 Genencor Int Nye Trichoderma-gener
JP2007508802A (ja) 2003-06-25 2007-04-12 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 澱粉の加水分解法
EP1648996B1 (de) 2003-06-25 2012-03-14 Novozymes A/S Enzyme zur stärkeverarbeitung
CN1875097B (zh) 2003-10-28 2013-04-24 诺维信北美公司 杂交酶
ES2332592T3 (es) 2003-10-30 2010-02-09 Novozymes A/S Modulos de union a carbohidratos.
US7985569B2 (en) 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
CA2546451A1 (en) 2003-11-19 2005-06-09 Genencor International, Inc. Serine proteases, nucleic acids encoding serine enzymes and vectors and host cells incorporating same
JP5091484B2 (ja) 2003-11-21 2012-12-05 ジェネンコー・インターナショナル・インク トリコデルマにおける顆粒デンプン加水分解酵素の発現及び顆粒デンプン基質からグルコースシロップを製造する方法
BRPI0417686B1 (pt) 2003-12-19 2019-12-10 Novozymes As processos para a produção de uma infusão tendo filtrabilidade realçada e/ou rendimento melhorado do extrato depois da filtração
BRPI0509212A (pt) * 2004-03-25 2007-08-28 Genencor Int proteìna de fusão de celulase e construto de fusão de celulase heterólogo codificando a mesma
US8097445B2 (en) * 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
US7348172B2 (en) * 2004-04-16 2008-03-25 Ab Enzymes Oy Method and DNA constructs for increasing the production level of carbohydrate degrading enzymes in filamentous fungi
WO2005100557A1 (en) * 2004-04-16 2005-10-27 Ab Enzymes Oy Method and dna constructs for increasing the production level of carbohydrate degrading enzymes in filamentous fungi
MXPA06013600A (es) * 2004-05-27 2007-03-15 Genencor Int Alfa amilasas acidoestables con actividad hidrolizante de almidon granular y composiciones enzimaticas.
WO2005118800A1 (en) * 2004-05-27 2005-12-15 Genencor International, Inc. Heterologous expression of an aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase and applications in granular starch hydrolysis
US7332319B2 (en) * 2004-05-27 2008-02-19 Genencor International, Inc. Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus
EP1926753B1 (de) 2004-12-22 2010-11-24 Novozymes A/S Hybridenzyme, bestehend aus einer ersten endoamylaseaminosäuresequenz und einem kohlenhydratbindenden modul als zweiter aminosäuresequenz
ES2552635T3 (es) 2004-12-22 2015-12-01 Novozymes A/S Polipéptidos con actividad de glucoamilasa y codificación de polinucleótidos
MX2007007862A (es) 2004-12-30 2007-08-17 Genencor Int Proteasas fungales acidas.
DK2292747T3 (en) * 2004-12-30 2017-04-24 Danisco Us Inc CBH2 CELLULASE VARIETIES OF HYPOCREA JECORINA
EP2123746B1 (de) * 2005-04-12 2016-11-16 Danisco US Inc. Gen-inaktivierte Mutanten mit geänderter Proteinproduktion
UA95266C2 (uk) * 2005-12-15 2011-07-25 Кемджен Корпорейшн Композиції корму для тварин із ферментами, що знижують імунний стрес
EP2374877A3 (de) * 2006-03-30 2012-11-07 Novozymes A/S Polypeptide mit Endoglucanase-Aktivität und diese kodierende Polynukleotide
EP2495316A3 (de) 2006-06-21 2013-11-20 Novozymes North America, Inc. Entschlichtungs- und Auswaschungsverfahren
US8138321B2 (en) * 2006-09-22 2012-03-20 Danisco Us Inc. Acetolactate synthase (ALS) selectable marker from Trichoderma reesei
US9447397B2 (en) * 2006-10-10 2016-09-20 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
ES2386991T3 (es) 2006-12-18 2012-09-10 Danisco Us Inc. Nuevas composiciones de laccasas y sus procedimientos de utilización
US20080220498A1 (en) * 2007-03-06 2008-09-11 Cervin Marguerite A Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
US8143046B2 (en) 2007-02-07 2012-03-27 Danisco Us Inc., Genencor Division Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
WO2008112729A2 (en) * 2007-03-14 2008-09-18 Danisco Us Inc., Genencor Division TRICHODERMA REESEI α -AMYLASE IS A MALTOGENIC ENZYME
DK2147104T3 (en) * 2007-05-21 2015-12-14 Danisco Us Inc USING A ASPARAGINPROTEASE- (NSP24) SIGNAL SEQUENCE FOR heterologous protein EXPRESSION
DK2152892T3 (da) * 2007-05-21 2013-07-22 Danisco Us Inc Genencor Div Fremgangsmåde til indføring af nukleinsyrer i fungale celler
CN101730479A (zh) * 2007-06-29 2010-06-09 凯敏工业公司 用于反刍动物的酶产品
US8592194B2 (en) 2007-10-09 2013-11-26 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
DK2481796T3 (da) 2007-10-09 2014-08-04 Danisco Us Inc Glucoamylasevarianter
US7618801B2 (en) * 2007-10-30 2009-11-17 Danison US Inc. Streptomyces protease
AU2008318644B2 (en) * 2007-11-01 2013-05-02 Danisco Us Inc. Signal sequences and co-expressed chaperones for improving protein production in a host cell
JP5594899B2 (ja) 2007-11-20 2014-09-24 ダニスコ・ユーエス・インク 変更された性質を有するグルコアミラーゼ変異体
KR20100118973A (ko) 2007-12-13 2010-11-08 다니스코 유에스 인크. 이소프렌을 생성하기 위한 조성물 및 방법
CN102978258A (zh) * 2008-01-02 2013-03-20 丹尼斯科美国公司 应用嗜糖假单胞菌g4-淀粉酶和其变体获得乙醇的无葡糖淀粉酶的方法
EP2254591B1 (de) 2008-02-08 2017-07-26 Prothera, Inc. Hemmung und behandlung von gastrointestinalen biofilmen
DK2268806T3 (da) * 2008-02-11 2013-07-15 Danisco Us Inc Enzym med mikrobiel lyseaktivitet fra Trichoderma reesei
MX2010009146A (es) 2008-02-19 2010-09-22 Novozymes As Metodo para lavar con piedras tela utilizando celulasa.
MX2010009490A (es) * 2008-03-07 2010-09-24 Danisco Us Inc Expresion de catalasa en trichoderma.
US20090253173A1 (en) * 2008-04-08 2009-10-08 Danisco Us Inc., Genencor Division Filamentous fungi with inactivated protease genes for altered protein production
EP3118309B1 (de) 2008-04-18 2020-09-16 Danisco US Inc. Buttiauxella sp phytasevarianten
US8173410B2 (en) * 2008-04-23 2012-05-08 Danisco Us Inc. Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene
EP2636734A3 (de) 2008-06-06 2013-12-04 Danisco US Inc. Zusammensetzungen und Verfahren mit Cellulasevarianten mit verminderter Affinität gegenüber cellulosefreien Materialien
JP2011524166A (ja) 2008-06-06 2011-09-01 ダニスコ・ユーエス・インク 変異体微生物プロテアーゼを含む組成物及び方法
CN102791848B (zh) 2008-07-02 2017-11-10 丹尼斯科美国公司 用于在去偶联条件和/或安全操作范围下产生不含c5烃的异戊二烯的方法和组合物
US8569026B2 (en) * 2008-09-15 2013-10-29 Danisco Us Inc. Systems using cell culture for production of isoprene
SG169614A1 (en) * 2008-09-15 2011-04-29 Goodyear Tire & Rubber Conversion of prenyl derivatives to isoprene
SG169652A1 (en) * 2008-09-15 2011-04-29 Danisco Us Inc Reduction of carbon dioxide emission during isoprene production by fermentation
CA2737158A1 (en) * 2008-09-15 2010-03-18 Danisco Us Inc. Increased isoprene production using the archaeal lower mevalonate pathway
EP2337845A1 (de) * 2008-09-15 2011-06-29 Danisco US Inc. Erhöhte isoprenproduktion mittels mevalonatkinase und isoprensynthase
US8183024B2 (en) 2008-11-11 2012-05-22 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising a subtilisin variant
JP5508431B2 (ja) 2008-11-11 2014-05-28 ダニスコ・ユーエス・インク スブチリシン変異体を含む組成物及び方法
KR20110095260A (ko) 2008-11-11 2011-08-24 다니스코 유에스 인크. 하나 이상의 조합가능 돌연변이를 포함하는 바실러스 서브틸리신
EP2362897A2 (de) 2008-11-11 2011-09-07 Danisco US Inc. Zusammensetzungen und verfahren mit serinproteasevarianten
EP2626421B1 (de) 2008-12-10 2014-03-19 Direvo Industrial Biotechnology GmbH Verbesserte Enzyme für Biomasseumwandlung
DK2358873T4 (en) 2008-12-15 2018-05-28 Danisco Us Inc HYBRID ALPHA AMYLASER
MX2011006779A (es) 2008-12-24 2011-08-03 Danisco Us Inc Lacasas y metodos de uso de las mismas a temperatura baja.
CN102333866B (zh) 2008-12-30 2015-04-29 丹尼斯科美国公司 生产异戊二烯和共同产物的方法
BRPI1009153A2 (pt) 2009-03-03 2016-03-01 Danisco Us Inc método, composição e kits de partes para descoloração oxidativa de corantes com perácido gerado enzimaticamente
CA2759700A1 (en) 2009-04-23 2010-10-28 Danisco Us Inc. Three-dimensional structure of isoprene synthase and its use thereof for generating variants
ES2604666T3 (es) 2009-05-19 2017-03-08 Dupont Nutrition Biosciences Aps Polipéptidos de amilasa
RU2011154243A (ru) 2009-06-03 2013-07-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Целлюлазные варианты с улучшенной экспрессией, активностью и/или стабильностью и их применение
TW201412988A (zh) * 2009-06-17 2014-04-01 Danisco Us Inc 使用ｄｘｐ及ｍｖａ途徑之改良之異戊二烯製造
TWI434921B (zh) 2009-06-17 2014-04-21 Danisco Us Inc 從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統
TW201120213A (en) 2009-06-17 2011-06-16 Danisco Us Inc Polymerization of isoprene from renewable resources
WO2011022465A1 (en) 2009-08-19 2011-02-24 Danisco Us Inc. Combinatorial variants of glucoamylase with improved specific activity and/or thermostability
AR077942A1 (es) 2009-08-19 2011-10-05 Danisco Variantes de glucoamilasa
WO2011025861A1 (en) 2009-08-27 2011-03-03 Danisco Us Inc. Combined textile abrading and color modification
MX356282B (es) 2009-12-09 2018-05-22 Danisco Us Inc Composiciones y metodos que comprenden variantes de proteasa.
WO2011084599A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing bacillus subtilis lipase and methods of use thereof
JP2013515139A (ja) 2009-12-21 2013-05-02 ダニスコ・ユーエス・インク サーモビフィダ・フスカのリパーゼを含む洗剤組成物、及びその使用方法
CN102712880A (zh) 2009-12-21 2012-10-03 丹尼斯科美国公司 含有嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶的洗涤剂组合物及其使用方法
US9107440B2 (en) 2010-03-29 2015-08-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Polypeptides having transgalactosylating activity
AR080886A1 (es) 2010-04-15 2012-05-16 Danisco Us Inc Composiciones y metodos que comprenden proteasas variantes
MX336737B (es) 2010-05-06 2016-01-29 Danisco Us Inc Composiciones y metodos que comprenden variantes de proteasa serina.
AR081423A1 (es) 2010-05-28 2012-08-29 Danisco Us Inc Composiciones detergentes con contenido de lipasa de streptomyces griseus y metodos para utilizarlas
BR112012032276A2 (pt) 2010-06-17 2016-11-16 Danisco Us Inc composições de combustível compreendendo derivados de isopreno
US20120034659A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Danisco Us Inc. NEUTRAL pH SACCHARIFICATION AND FERMENTATION
EP2601300A1 (de) 2010-08-06 2013-06-12 Danisco US Inc. Herstellung von isopren unter neutralen ph-beduingungen
JP5810489B2 (ja) * 2010-08-20 2015-11-11 株式会社豊田中央研究所 セルラーゼ活性を有するタンパク質及びその利用
US20130142903A1 (en) 2010-08-24 2013-06-06 Danisco Us Inc Food product comprising a low temperature rice protein concentrate
JP5707494B2 (ja) * 2010-08-25 2015-04-30 ダニスコ・ユーエス・インク 粘性の表現型を変化させた糸状菌
EP2630291A1 (de) 2010-10-18 2013-08-28 Danisco US Inc. Lokale farbveränderung von gefärbten stoffen mit einem laccasesystem
WO2012058494A2 (en) 2010-10-27 2012-05-03 Danisco Us Inc. Isoprene synthase variants for improved production of isoprene
JP2014502844A (ja) 2010-12-22 2014-02-06 ダニスコ・ユーエス・インク 組み換え細胞による五炭糖の生物学的生産
BR112013018316A2 (pt) 2010-12-22 2018-09-11 Danisco Us Inc composições e métodos para produção aprimorada de isopreno usando dois tipos de enzimas ispg
US8802423B2 (en) 2010-12-30 2014-08-12 Novozymes A/S Method for treating textile with endoglucanase
GB201102857D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
GB201102865D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
US20140123404A1 (en) 2011-04-06 2014-05-08 Danisco Us Inc. Laccase variants having increased expression and/or activity
US9926547B2 (en) * 2011-04-28 2018-03-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
AR086215A1 (es) 2011-04-29 2013-11-27 Danisco Us Inc Composiciones detergentes que contienen mananasa de geobacillus tepidamans y metodos de uso de las mismas
BR112013026675A2 (pt) 2011-04-29 2016-11-29 Danisco Us Inc composições detergentes contendo mananase de bacillus sp., e métodos de uso das mesmas
US8802388B2 (en) 2011-04-29 2014-08-12 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing Bacillus agaradhaerens mannanase and methods of use thereof
CN103732756A (zh) 2011-04-29 2014-04-16 丹尼斯科美国公司 用于高密度葡萄糖浆的淀粉液化和糖化的单pH工艺
WO2012151480A2 (en) 2011-05-05 2012-11-08 The Procter & Gamble Company Compositions and methods comprising serine protease variants
JP6105560B2 (ja) 2011-05-05 2017-03-29 ダニスコ・ユーエス・インク セリンプロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法
US8951764B2 (en) 2011-08-05 2015-02-10 Danisco Us Inc. Production of isoprenoids under neutral pH conditions
EP2751263A1 (de) 2011-08-31 2014-07-09 Danisco US Inc. Zusammensetzungen und verfahren mit einer variante eines lipolytischen enzyms
CA2851308A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Bp Corporation North America Inc. Use of mammalian promoters in filamentous fungi
US9249418B2 (en) 2011-10-31 2016-02-02 Bp Corporation North America Inc. Use of plant promoters in filamentous fungi
EP2794866A1 (de) 2011-12-22 2014-10-29 Danisco US Inc. Zusammensetzungen und verfahren mit einer variante eines lipolytischen enzyms
US9163263B2 (en) 2012-05-02 2015-10-20 The Goodyear Tire & Rubber Company Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene
AU2013273507B2 (en) 2012-06-08 2018-11-29 Dupont Nutrition Biosciences Aps Polypeptides having transgalactosylating activity
MX2015002099A (es) 2012-08-22 2015-05-11 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes que tienen actividad glucoamilasa.
EP2904099B1 (de) 2012-10-05 2018-12-19 Novozymes A/S Verhindern von bakterienadhäsion
CN117586986A (zh) 2012-10-12 2024-02-23 丹尼斯科美国公司 包含脂解酶变体的组合物和方法
AU2013337255A1 (en) 2012-11-05 2015-04-02 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising thermolysin protease variants
CA2892786A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Danisco Us Inc. Variants of cellobiohydrolases
EP2935573A1 (de) 2012-12-19 2015-10-28 Danisco US Inc. Neuartige mannase, zusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
WO2014145768A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bp Corporation North America Inc. Use of non-fungal 5' utrs in filamentous fungi
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
WO2014194054A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
US20160108387A1 (en) 2013-05-29 2016-04-21 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
WO2014194034A2 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
EP3004314B1 (de) 2013-05-29 2018-06-20 Danisco US Inc. Neuartige metalloproteasen
EP3696264B1 (de) 2013-07-19 2023-06-28 Danisco US Inc. Zusammensetzungen und verfahren mit einer variante eines lipolytischen enzyms
EP3027743A1 (de) 2013-07-29 2016-06-08 Danisco US Inc. Enzymvarianten
EP3653707A1 (de) 2013-09-12 2020-05-20 Danisco US Inc. Zusammensetzungen und verfahren mit lg12-klade-protease-varianten
WO2015049370A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Novozymes A/S Detergent composition and use of detergent composition
CN103529024B (zh) * 2013-10-16 2015-12-23 天津博菲德科技有限公司 果胶酶在饲料原料中的最适添加量配方
CN116195628A (zh) 2013-12-11 2023-06-02 杜邦营养生物科学有限公司 用于制备具有稳定低聚半乳糖含量的乳制品的方法
US10533165B2 (en) 2013-12-13 2020-01-14 Danisco Us Inc Serine proteases of the bacillus gibsonii-clade
DK3080262T3 (da) 2013-12-13 2019-05-06 Danisco Us Inc Serinproteaser af bacillus-arter
RU2546889C1 (ru) * 2013-12-16 2015-04-10 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства Россельхозакадемии Способ кормления цыплят-бройлеров и кур-несушек
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
EP3119884B1 (de) 2014-03-21 2019-07-10 Danisco US Inc. Serinproteasen aus einer bacillus-spezies
US20170233710A1 (en) 2014-10-17 2017-08-17 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
US20180010074A1 (en) 2014-10-27 2018-01-11 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
WO2016069552A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases
EP3212782B1 (de) 2014-10-27 2019-04-17 Danisco US Inc. Serinproteasen
WO2016069544A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases
US20170335306A1 (en) 2014-10-27 2017-11-23 Danisco Us Inc. Serine proteases
AU2015341684B2 (en) 2014-11-07 2021-01-07 Dupont Nutrition Biosciences Aps Recombinant host cell expressing beta-galactosidase and/or transgalactosylating activity deficient in mannanase, cellulase and pectinase
MX2017007127A (es) * 2014-12-19 2017-08-18 Novozymes As Composiciones que comprenden polipeptidos que tienen actividad xilanasa y polipeptidos que tienen actividad arabinofuranosidasa.
RU2580154C1 (ru) * 2014-12-30 2016-04-10 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства" Способ выращивания молодняка свиней и мясной птицы
EP3611259A1 (de) 2015-03-12 2020-02-19 Danisco US Inc. Zusammensetzungen und verfahren mit lg12-klade-proteasevarianten
EP4219704A3 (de) 2015-05-13 2023-08-23 Danisco US Inc Aprl-clade-proteasevarianten und verwendungen davon
EP3298137A1 (de) 2015-05-22 2018-03-28 DuPont Nutrition Biosciences ApS Aldc-herstellungsverfahren
CN107636151B (zh) 2015-05-22 2023-04-04 杜邦营养生物科学有限公司 乙酰乳酸脱羧酶
WO2016201040A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc. Water-triggered enzyme suspension
WO2016201069A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Low-density enzyme-containing particles
WO2016201044A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Osmotic burst encapsulates
EP3310911B1 (de) 2015-06-17 2023-03-15 Danisco US Inc. Bacillus-gibboni-clade-serin-proteasen
MX2018002617A (es) 2015-09-02 2018-07-06 Dupont Nutrition Biosci Aps Glucosido hidrolasas y su uso en la prevencion y/o tratamiento de infeccion patogena en un animal.
EP4141113A1 (de) 2015-11-05 2023-03-01 Danisco US Inc Paenibacillus sp. mannanasen
CN108603183B (zh) 2015-11-05 2023-11-03 丹尼斯科美国公司 类芽孢杆菌属物种和芽孢杆菌属物种甘露聚糖酶
MX2018006206A (es) 2015-11-26 2018-08-01 Novozymes As Proceso de molienda.
US20180362946A1 (en) 2015-12-18 2018-12-20 Danisco Us Inc. Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof
TWI553121B (zh) * 2015-12-23 2016-10-11 基酵生物科技股份有限公司 提升耐溫性的纖維素酶
WO2017192692A1 (en) 2016-05-03 2017-11-09 Danisco Us Inc Protease variants and uses thereof
US20190136218A1 (en) 2016-05-05 2019-05-09 Danisco Us Inc Protease variants and uses thereof
CA3026064A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Danisco Us Inc. Protease variants and uses thereof
JP7152319B2 (ja) 2016-06-17 2022-10-12 ダニスコ・ユーエス・インク プロテアーゼ変異体およびその使用
DK3478831T3 (da) 2016-06-30 2021-04-19 Danisco Us Inc Asparaginproteaser
MX2019002934A (es) 2016-09-16 2019-06-17 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes de acetolactato descarboxilasa que tienen actividad especifica mejorada.
RU2763378C2 (ru) 2016-09-23 2021-12-28 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ ПРИ НИЗКОМ ЗНАЧЕНИИ pH АЛЬФА-1,4/1,6-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПЕРЕВАРИВАНИЯ КРАХМАЛА
WO2018085524A2 (en) 2016-11-07 2018-05-11 Danisco Us Inc Laundry detergent composition
WO2018093752A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Danisco Us Inc. Filamentous fungi with improved protein production
MX2019005945A (es) 2016-11-25 2019-08-29 Novozymes As Xilanasa gh10, arabinofuranosidasa gh62, proceso de molienda y otra aplicacion.
WO2018118950A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
WO2018118917A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Danisco Us Inc. Protease variants and uses thereof
WO2018164876A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Dupont Nutrition Biosciences Aps Novel fungal fucosidases and their use in preventing and/or treating a pathogenic infection in an animal
US11453871B2 (en) 2017-03-15 2022-09-27 Danisco Us Inc. Trypsin-like serine proteases and uses thereof
WO2018183662A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Danisco Us Inc Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents
US20200131456A1 (en) 2017-06-30 2020-04-30 Danisco Us Inc Low-agglomeration, enzyme-containing particles
WO2019108599A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Danisco Us Inc Subtilisin variants having improved stability
BR112020012584A2 (pt) 2017-12-21 2020-11-24 Danisco Us Inc. grânulos fundidos a quente contendo enzima que compreendem um dessecante termotolerante
EP3749107A1 (de) 2018-02-08 2020-12-16 Danisco US Inc. Wärmebeständige wachsmatrixteilchen zur verkapselung von enzymen
EP3775191A1 (de) 2018-04-09 2021-02-17 Novozymes A/S Polypeptide mit alpha-amylase-aktivität und dafür codierende polynukleotide
WO2019245704A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Danisco Us Inc Subtilisin variants
EP3799601A1 (de) 2018-06-19 2021-04-07 Danisco US Inc. Subtilisinvarianten
US20210189295A1 (en) 2018-08-30 2021-06-24 Danisco Us Inc Enzyme-containing granules
WO2020046613A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 Danisco Us Inc Compositions comprising a lipolytic enzyme variant and methods of use thereof
WO2020068486A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Danisco Us Inc Compositions for medical instrument cleaning
EP3887515A1 (de) 2018-11-28 2021-10-06 Danisco US Inc. Subtilisin-varianten mit verbesserter stabilität
EP3976776A1 (de) 2019-05-24 2022-04-06 Danisco US Inc. Subtilisin-varianten und verwendungsverfahren
CN114174486A (zh) 2019-06-06 2022-03-11 丹尼斯科美国公司 用于清洁的方法和组合物
WO2021146255A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Danisco Us Inc Compositions comprising a lipolytic enzyme variant and methods of use thereof
WO2021144356A1 (en) 2020-01-14 2021-07-22 Sanko Tekstil Isletmeleri San. Ve Tic. A.S. Process for dyeing textiles and enzymes used therein
EP4204553A1 (de) 2020-08-27 2023-07-05 Danisco US Inc. Enzyme und enzymzusammensetzungen zur reinigung
US20240117275A1 (en) 2021-01-29 2024-04-11 Danisco Us Inc. Compositions for cleaning and methods related thereto
WO2023278297A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Danisco Us Inc Variant lipases and uses thereof
WO2023034486A2 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Danisco Us Inc. Laundry compositions for cleaning
WO2023039270A2 (en) 2021-09-13 2023-03-16 Danisco Us Inc. Bioactive-containing granules
WO2023114936A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114932A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114939A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023168234A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
WO2023250301A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Danisco Us Inc. Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity
WO2024050339A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Mannanase variants and methods of use
WO2024050343A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods related thereto
WO2024050346A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Detergent compositions and methods related thereto
WO2024064653A1 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Dupont Nutrition Biosciences Aps Variant anti-viral polypeptides

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1338400C (en) * 1983-08-31 1996-06-18 David H. Gelfand Recombinant fungal cellulases
FR2555603B1 (fr) * 1983-11-29 1986-10-03 Inst Francais Du Petrole Procede de production d'enzymes cellulolytiques
FI841500A0 (fi) * 1984-04-13 1984-04-13 Valtion Teknillinen Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar.
US5298405A (en) * 1986-04-30 1994-03-29 Alko Limited Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production
US5340731A (en) * 1988-07-08 1994-08-23 University Of British Columbia Method of preparing a B-1,4 glycan matrix containing a bound fusion protein
US5137819A (en) * 1988-07-08 1992-08-11 University Of British Columbia Cellulose binding fusion proteins for immobilization and purification of polypeptides
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0458846B1 (de) * 1989-02-16 1996-10-02 Carlsberg A/S Thermostabile (1,3-1,4)-beta-glucanase
US5536655A (en) * 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
DK494089D0 (de) * 1989-10-06 1989-10-06 Novo Nordisk As
DK16490D0 (da) * 1990-01-19 1990-01-19 Novo Nordisk As Enzym
DK115890D0 (da) * 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
US5290474A (en) * 1990-10-05 1994-03-01 Genencor International, Inc. Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp
US5650322A (en) * 1990-10-05 1997-07-22 Genencor International, Inc. Methods for stonewashing fabrics using endoglucanases
US5475101A (en) * 1990-10-05 1995-12-12 Genencor International, Inc. DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase
CA2093421A1 (en) * 1990-10-05 1992-04-06 Michael Ward Trichoderma reesei containing deleted and/or enriched cellulase and other enzyme genes and cellulase compositions derived therefrom
WO1993005226A1 (en) * 1991-08-29 1993-03-18 University Of British Columbia Method for modification of polysaccharide fibres
EP0549062B1 (de) * 1991-12-23 1999-03-17 Gist-Brocades N.V. Eukaryotisches Expressionssystem
LT3208B (en) * 1992-04-10 1995-03-27 Ssv Dev Oy Enzyme products for use in the improvement of feed value and conservation of fibrous crops
US5861271A (en) * 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions

Also Published As

Publication number Publication date
EP0684770B1 (de) 2001-07-25
NZ278373A (en) 1997-10-24
FI962444A0 (fi) 1996-06-12
FI116965B (fi) 2006-04-28
US5874276A (en) 1999-02-23
DE69427812D1 (de) 2001-08-30
EP1700524B1 (de) 2008-02-27
HK1097163A1 (en) 2007-06-22
EP1700524A1 (de) 2006-09-13
NO953218D0 (no) 1995-08-16
EP0733115B1 (de) 2006-06-07
FI953867A0 (fi) 1995-08-16
ATE329039T1 (de) 2006-06-15
US6562340B1 (en) 2003-05-13
EP0733115A1 (de) 1996-09-25
EP0684770A1 (de) 1995-12-06
ES2160694T3 (es) 2001-11-16
CN1093379C (zh) 2002-10-30
FI119695B (fi) 2009-02-13
DE69427812T2 (de) 2002-06-06
FI953867A (fi) 1995-10-03
AU1383695A (en) 1995-07-03
DK0733115T3 (da) 2006-10-09
US5861271A (en) 1999-01-19
DE69434759D1 (de) 2006-07-20
NO314562B1 (no) 2003-04-14
DE69434759T2 (de) 2007-05-16
CN1118131A (zh) 1996-03-06
AU685210B2 (en) 1998-01-15
CA2156066C (en) 2005-07-12
NO953218L (no) 1995-10-16
ATE387104T1 (de) 2008-03-15
DE69435078D1 (de) 2008-04-10
WO1995016360A1 (en) 1995-06-22
CA2156066A1 (en) 1995-06-22
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