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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
hohen Spiegeln an neuen trunkierten Cellulaseproteinen im filamentösen Pilz
Trichoderma longibrachiatum; Pilz-Transformanten, die aus Trichoderma
longibrachiatum durch gentechnische Vorgehensweisen erzeugt werden;
und neue Cellulase-Proteine, die von derartigen Transformanten hergestellt
werden.
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Hintergrund der Erfindung
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Cellulasen
sind Enzyme, welche Cellulose (β-1,4-D-Glucan-Bindungen)
hydrolysieren und als Hauptprodukte Glukose, Cellobiose, Cellooligosaccharide
und dergleichen herstellen. Cellulasen werden von einer Reihe von
Mikroorganismen produziert und umfassen mehrere unterschiedliche
Enzymklassifikationen, einschließlich denjenigen, welche als
Exo-Cellobiohydrolasen (CBH), Endoglucanasen (EG) und β-Glukosidasen (BG)
(Schulein, M., 1988, Methods in Enzymology 160: 235–242). Darüber hinaus
können
die Enzyme innerhalb dieser Klassifikationen in einzelne Komponenten
unterteilt werden. Zum Beispiel besteht die Cellulase, welche von
dem filamentösen
Pilz Trichoderma longibrachiatum, hierin nachstehend T. longibrachiatum,
hergestellt wird, aus mindestens zwei CBH-Komponenten, d. h. CBHI
und CBHII, und mindestens vier EG-Komponenten, d. h. den Komponenten
EGI, EGII, EGIII und EGV (Saloheimo, A., et al., 1993, in Proceedings
of the second TRICEL symposium an Trichoderma reesei Cellulases
and Other Hydrolases, Espoo, Finnland, hrsg. von P. Suominen & T. Reinikainen.
Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research
8: 139–146),
und mindestens einer β-Glukosidase. Die
Gene, welche diese Komponenten codieren, sind nämlich chb1, cbh2, eg11, eg12,
eg13 bzw. eg15.
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Das
vollständige
Cellulase-System, welches CBH-, EG- und BG-Komponenten umfasst,
wirkt synergistisch, um kristalline Cellulose in Glukose umzuwandeln.
Die zwei Exo-Cellobiohydrolasen und die vier derzeitig bekannten
Endoglucanasen wirken zusammen, um Cellulose zu kleinen Cello-Oligosacchariden
zu hydrolysieren. Die Oligosaccharide (hauptsächlich Cellobiosen) werden
anschließend
durch eine Haupt-β-Glukosidase
(mit einer möglichen
zusätzlichen
Hydrolyse durch nebenrangige β-Glukosidasekomponenten)
zu Glukose hydrolysiert.
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Die
Proteinanalyse der Cellobiohydrolasen (CBHI und CBHII) und der Haupt-Endoglucanasen
(EGI und EGII) von T. longibrachiatum hat gezeigt, dass eine bifunktionelle
Organisation in der Form einer katalytischen Kerndomäne und einer
kleineren Cellulose-Bindungsdomäne
existiert, welche durch einen Linker oder flexiblen Gelenkabschnitt
von Aminosäuren
getrennt sind, der reich an Prolin und Hydroxyaminosäuren ist. Gene
für die
zwei Cellobiohydrolasen CBHI und CBHII (Shoemaker, S., et al., 1983
Bio/Technology 1, 691–696,
Teeri, T., et al., 1983, Bio/Technology 1, 696–699, und Teeri, T., et al.,
1987, Gene 51, 43–52)
und zwei Haupt-Endoglucanasen
EGI und EGII (Penttila, M., et al., 1986, Gene 45, 253–263, Van
Arsdell, J. N., et al., 1987, Bio/Technology 5, 60–64, und
Saloheimo, M., et al., 1988, Gene 63, 11–21) sind aus T. longibrachiatum
isoliert worden, und die Proteindomänen-Struktur ist bestätigt worden.
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Eine ähnliche
bifunktionelle Organisation von Cellulase-Enzymen wird bei bakteriellen
Cellulasen gefunden. Die Cellulose-Bindungsdomäne (CBD) und der katalytische
Kern von Endoglucanase A aus Cellulomonas fimi (C. fimi-Cen A) sind
gründlich
untersucht worden (Ong, E., et al., 1989, Trends Biotechnol. 7: 239–243, Pilz
et al., 1990, Biochem J. 271: 277–280, und Warren et al., 1987,
Proteins 1: 335–341).
Genfragmente, welche die CBD und die CBD mit dem Linker codieren,
sind kloniert und in E. coli exprimiert worden, und von ihnen wurde
gezeigt, neue Aktivitäten
gegenüber
Cellulosefasern aufzuweisen (Gilkes, N. R., et al., 1991, Microbiol.
Rev. 55: 305–315,
und Din, N., et al., 1991, Bio/Technology 9: 1096–1099).
Zum Beispiel zerstört
isolierte CBD aus C. fimi-Cen A, welche genetisch in E. coli exprimiert
wurde, die Struktur von Cellulosefasern und setzt kleine Partikel
frei, aber besitzt keine nachweisbare hydrolytische Aktivität. CBD findet
ferner breite Anwendung in der Proteinreinigung und Enzym-Immobilisierung.
Andererseits zerstört
die katalytische Domäne
von C. fimi-Cen A, welche aus mit Protease gespaltener Cellulase
isoliert wurde, die Fibrillenstruktur von Cellulose nicht und glättet anstatt
dessen die Oberfläche
der Faser.
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Diese
neuen Aktivitäten
besitzen potenzielle Anwendungen in der Textil-, Nahrungsmittel-
und Tierfutter-, Waschmittel- und der Zellstoff- und Papier-Industrie.
Für eine
industrielle Anwendung müssen
jedoch hocheffiziente Expressionssysteme bereitgestellt werden,
welche höhere
Erträge
an trunkierten Cellulaseproteinen erzeugen, als sie derzeitig verfügbar sind,
um von irgendeinem kommerziellen Nutzen zu sein. Zum Beispiel sind
die Trichoderma longibrachiatum-CBHI-Kerndomänen proteolytisch
getrennt und gereinigt worden, aber es werden lediglich Milligramm-Mengen
durch dieses biochemische Vorgehen isoliert (Offord, D., et al., 1991,
Applied Biochem. and Biotech. 28/29: 377–386). Ähnliche Untersuchungen wurden
in einer Analyse der Kern- und Bindungsdomänen von CBHI, CBHII, EGI und
EGII, welche aus T. longibrachiatum nach einer biochemischen Proteolyse
isoliert worden waren, durchgeführt,
wobei jedoch lediglich genug Protein für eine strukturelle und funktionelle
Analyse gewonnen wurde (Tomme, P., et al., 1988, Eur. J. Biochem.
170: 575–581, und
Ajo, S., 1991, FERS 291: 45–49).
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Um
Stämme
zu erhalten, welche höhere
Spiegel an trunkierten Cellulaseproteinen exprimieren, als dies
bisher realisiert wurde, wählen
die Erfinder der vorliegenden Anmeldung T. longibrachiatum als den
für eine
Expression am stärksten
bevorzugten Mikroorganismus, weil er für seine Fähigkeit allgemein bekannt ist, vollständige Cellulasen
in großen
Mengen zu sezernieren. Daher begannen die Erfinder, Stämme des
oben genannten filamentösen
Pilzes gentechnisch zu verändern,
um hohe Spiegel an biotechnisch erzeugten trunkierten Cellulasen
zu exprimieren.
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Vor
der Erfindung der vorliegenden Patentanmeldung blieb es unbekannt,
ob die DNA, welche Bindungs- und Kerndomänen-Proteine der trunkierten
Cellulase codiert, auf eine solche Weise in Trichoderma transformiert
werden könnte,
so dass neue trunkierte Cellulase-Gene, ohne Abbau in der Wirtszelle,
zu funktionellen Proteinen überexprimiert
werden. Kürzlich
haben Nakari und Penttila gezeigt, dass es möglich ist, einen Trichoderma-Wirt
gentechnisch zu verändern,
um eine trunkierte Form der Trichoderma-EGI-Cellulase, spezifisch
die katalytische Kerndomäne,
zu exprimieren, wobei jedoch der Spiegel der Expression der EGI-Kerndomäne niedrig
war (Nakari, T., et al., Zusammenfassung P1/63, 1. Europäische Konferenz über Pilz-Genetik
(European Conference an Fungal Genetics), Nottingham, England, 20.–23. August
1992). Außerdem
war es unbekannt, ob eine katalytische Kerndomäne von Trichoderma-Cellobiohydrolase
durch rekombinante gentechnische Verfahren hergestellt werden konnte.
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Folglich
ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, DNA-Genfragmente in
Stämme
des Pilzes Trichoderma longibrachiatum einzubringen, um Transformanten-Stämme herzustellen,
welche hohe Spiegel (Gramm/Liter-Niveau) von neuen trunkierten Cellulasen
exprimieren, welche proteintechnisch aus den Bindungs- und Kerndomänen von
Trichoderma-Cellulasen erzeugt werden. Die trunkierten Proteine
werden korrekt prozessiert und extrazellulär in einer aktiven Form sezerniert.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten
Cellulaseproteins bereit, welches Exoglucanase-Aktivität aufzeigt,
umfassend die folgenden Schritte:
- (a) Bereitstellen
einer Trichoderma-Wirtszelle, welche mit einem Expressionsvektor
transformiert worden ist, der eine DNA-Sequenz enthält, die
ein Cellulase-Protein codiert, wobei das Cellulase-Protein ein katalytisches
CBHII-Kernprotein umfasst, das Exoglucanase-Aktivität aufzeigt
und dem eine Cellulose-Bindungsdomäne fehlt; und
- (b) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter solchen
Bedingungen, dass das rekombinante Cellulase-Protein exprimiert
wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
weist das Cellulase-Protein eine Sequenz auf, die aus der Aminosäuresequenz
besteht, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die DNA-Sequenz, welche den katalytischen CBHII-Kern codiert,
in SEQ ID Nr. 10 dargestellt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Pilz-Wirtszelle um Trichoderma longibrachiatum.
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Das
Verfahren kann den Schritt des Isolierens des rekominanten Cellulase-Proteins
umfassen.
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Der
Expressionsvektor kann in das Genom der Wirtszelle integriert sein.
Das Verfahren kann ferner den Schritt des Transformierens der Wirtszelle
mit dem Expressionsvektor unter solchen Bedingungen umfassen, dass
der Expressionsvektor in das Genom der Wirtszelle integriert.
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Der
Trichoderma-Wirtszelle können
eine oder mehrere Cellulase-Aktivitäten fehlen.
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Beschreibung der Zeichnungen
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Die 1 stellt die genomische DNA- und Aminosäure-Sequenz
von CBHII, abgeleitet aus Trichoderma longibrachiatum, dar. Die
Signalsequenz beginnt am Basenpaar 614 und endet am Basenpaar 685
(Seq ID Nr. 27). Die Cellulose-Bindungsdomäne beginnt am Basenpaar 686
und reicht bis zum Basenpaar 707 von Exon Eins und von Basenpaar
755 bis zum Basenpaar 851 von Exon Zwei (Seq ID Nr. 3). Die Linkersequenz beginnt
am Basenpaar 852 und endet am Basenpaar 980 (Seq ID Nr. 19). Der
katalytische Kern beginnt am Basenpaar 981, reicht bis zum Basenpaar
1141 von Exon Zwei, von Basenpaar 1199 bis zum Basenpaar 1445 von
Exon Drei und von Basenpaar 1536 bis zum Basenpaar 2221 von Exon
Vier (Seq ID Nr. 11). Die Seq ID Nr. 28, 4, 20 und 12 repräsentieren
jeweils die Aminosäuresequenz
der Signalsequenz, Bindungsdomäne,
Linkerregion bzw. katalytischen Kerndomäne von CBHII.
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Die 2 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids
pTEX (Seq ID Nr. 39–41).
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Ausführliche Beschreibung
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Wie
oben erwähnt,
betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen die Klonierung
und Expression von neuen trunkierten Cellulaseproteinen bei hohen
Spiegeln im filamentösen
Pilz T. longibrachiatum. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung
werden in weiterer Ausführlichkeit
im Anschluss an eine Definition von hierin verwendeten Begriffen
erörtert.
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Der
Begriff "Trichoderma" oder "Trichoderma sp." bezieht sich auf
jedwede Pilzstämme,
welche früher als
Trichoderma klassifiziert worden sind oder welche derzeitig als
Trichoderma klassifiziert werden. Vorzugsweise handelt es sich bei
den Spezies um Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei oder
Trichoderma viride.
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Die
Begriffe "cellulolytische
Enzyme" oder "Cellulaseenzyme" beziehen sich auf
fungale Exoglucanasen oder Exocellobiohydrolasen (CBH), Endoglucanasen
(EG) und β-Glucosidasen
(BG). Diese drei unterschiedlichen Typen von Cellulaseenzymen wirken
synergistisch, um kristalline Cellulose in Glukose umzuwandeln.
Eine Analyse der für
CBHI, CBHII und EGI und EGII codierenden Gene zeigt eine Domänenstruktur,
welche eine katalytische Kernregion (CCD), eine Gelenk- oder Linkerregion
(hierin austauschbar verwendet) und eine Cellulose-Bindungsregion (CBD)
umfasst.
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Der
Begriff "trunkierte
Cellulasen", wie
hierin verwendet, bezieht sich auf die Kerndomänen der Cellobiohydrolasen,
spezifisch CBHII.
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Ein "Derivat" der trunkierten
Cellulasen umfasst die Kerndomänen
der Cellobiohydrolasen, spezifisch CBHII, aus Trichoderma sp., worin
eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren an eines oder beide der
C- und N-terminalen Enden der trunkierten Cellulase, eine Substitution
von einer oder mehreren Aminosäuren
an einer oder mehreren Stellen in der gesamten trunkierten Cellulase,
eine Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren innerhalb oder an einem
oder beiden Enden des trunkierten Cellulaseproteins, oder eine Insertion
von einer oder mehreren Aminosäuren
an einer oder mehreren Stellen im trunkierten Cellulaseprotein vorhanden
sein können,
so dass Exoglucanase-Aktivitäten
in den trunkierten Proteinen mit abgewandeltem katalytischem CBH-Kern
beibehalten werden. Mit dem Begriff "Derivat einer trunkierten Cellulase" wird ebenfalls beabsichtigt,
Kerndomänen
der Exoglucanase-Enzyme einzuschließen, an welche eine oder mehrere
Aminosäuren
aus der Linker-Region angefügt
sind.
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Ein
trunkiertes Cellulaseprotein-Derivat bezieht sich ferner auf ein
Protein, welches hinsichtlich der Struktur und biologischen Aktivität im Wesentlichen ähnlich zu
einer Cellulase-Kerndomäne
ist, welche die in der Natur gefundenen cellulolytischen Enzyme
umfassen, aber welches manipuliert worden ist, um eine modifizierte
Aminosäuresequenz
zu enthalten. Vorausgesetzt, dass die zwei Proteine eine ähnliche
Aktivität
besitzen, werden sie somit als "Derivate" angesehen, wie dieser
Begriff hierin verwendet wird, selbst wenn die Primärstruktur
von einem Protein nicht die identische Aminosäuresequenz zu derjenigen besitzt,
welche im anderen gefunden wird.
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Der
Begriff "katalytische
Cellulase-Kerndomänen-Aktivität" bezieht sich hierin
auf eine Aminosäuresequenz
der trunkierten Cellulase, umfassend die Kerndomäne der Cellobiohydrolase CBHII
oder eines Derivates davon, welche in der Lage ist, celluloseartige
Polymere, wie Zellstoff oder mit Phosphorsäure gequollene Cellulose, enzymatisch
zu spalten.
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Die
Aktivität
der trunkierten katalytischen Kernproteine oder Derivate davon,
wie hierin definiert, kann durch im Fachgebiet allgemein bekannte
Verfahren bestimmt werden (siehe Wood, T. M., et al. in Methods
in Enzymology, Band 160, Herausgeber: Wood, W. A., und Kellogg,
S. T., Academic Press, S. 87–116,
1988). Zum Beispiel können
solche Aktivitäten
durch Hydrolyse von mit Phosphorsäure gequollener Cellulose und/oder
löslichen
Oligosacchariden, gefolgt von Quantifizierung der freigesetzten
reduzierenden Zucker bestimmt werden. In diesem Fall können die
löslichen
Zuckerprodukte, welche durch die Wirkung von katalytischen CBH-Domänen oder
Derivaten davon freigesetzt wurden, mittels HPLC-Analyse oder durch
die Verwendung von colorimetrischen Assays zum Messen von reduzierenden
Zuckern nachgewiesen werden. Es wird erwartet, dass diese katalytischen
Domänen
oder Derivate davon mindestens 10% der Aktivität beibehalten werden, welche
von dem intakten Enzym aufgezeigt werden, wenn jede unter ähnlichen
Bedingungen geassayt und basierend auf ähnlichen Mengen an katalytischem
Domänen-Protein dosiert wird.
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Der
Begriff "Cellulose-Bindungsdomänen-Aktivität" bezieht sich hierin
auf eine Aminosäuresequenz der
Cellulase, umfassend die Bindungsdomäne von Cellobiohydrolasen und
Endoglucanasen, zum Beispiel EGI, EGII, CBHI oder CHBII oder eines
Derivates davon, welche nicht-kovalent
an ein Polysaccharid wie Cellulose bindet. Es wird angenommen, dass
Cellulose-Bindungsdomänen (CBDs)
unabhängig
vom katalytischen Kern des Cellulaseenzyms funktionieren, um das
Protein an Cellulose anzuheften.
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Andere
im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren, welche katalytische
Cellulaseaktivität
durch die physikalischen oder chemischen Eigenschaften von jeweiligen
behandelten Substraten messen, können ebenfalls
in der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Für Verfahren, welche physikalische
Eigenschaften eines behandelten Substrates messen, wird beispielsweise
das Substrat hinsichtlich Modifikation von Gestalt, Textur, Oberfläche oder
Struktureigenschaften, Modifikation des "Nass"-Verhaltens,
z. B. die Fähigkeit
des Substrates, Wasser zu absorbieren, oder hinsichtlich Modifikation
der Quellung analysiert. Andere Parameter, welche Aktivität bestimmen
können,
schließen
die Messung der Änderung
der chemischen Eigenschaften von behandelten festen Substraten ein.
Zum Beispiel können
die Diffusionseigenschaften von Farbstoffen oder Chemikalien nach
Behandlung von festem Substrat mit dem trunkierten Cellulase-Bindungsprotein oder
Derivaten davon, welche in der vorliegenden Erfindung beschrieben
sind, untersucht werden. Geeignete Substrate zur Auswertung der
Aktivität
schließen
zum Beispiel Avicel, Rayon, Zellstofffasern, Baumwolle- oder Ramie-Fasern,
Papier, Kraft-Zellstoff oder Zellstoff aus zerkleinertem Holz ein
(siehe auch Wood, T. M., et al., in "Methods in Enzymology", Band 160, Herausgeber:
Wood, W. A., und Kellogg, S. T., Academic Press, S. 87–116, 1988).
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Der
Begriff "Linker-
oder Gelenkregion" bezieht
sich auf die kurze Peptidregion, welche die zwei getrennten funktionellen
Domänen
der Pilz-Cellulasen miteinander verknüpft, d. h. die Kerndomäne und die
Bindungsdomäne.
Diese Domänen
sind in T. longibrachiatum-Cellulasen durch ein Peptid verknüpft, welches reich
an Ser, Thr und Pro ist.
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Eine "Signalsequenz" bezieht sich auf
jedwede Sequenz von Aminosäuren,
die an den N-terminalen Bereich
eines Proteins gebunden ist, welche die Sekretion der reifen Form
des Proteins zum Außenraum
der Zelle erleichtert. Diese Definition einer Signalsequenz ist
funktionell. Der reifen Form des extrazellulären Proteins fehlt die Signalsequenz,
welche während
des Sekretionsprozesses abgespalten wird.
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Der
Begriff "Variante" bezieht sich auf
ein die CBH-Kerndomäne
codierendes DNA-Fragment, welches ferner eine Addition von einem
oder mehreren Nukleotiden intern oder am 5'- oder 3'-Ende
des DNA-Fragmentes, eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden
intern oder am 5'-
oder 3'-Ende des
DNA-Fragmentes oder eine Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden
intern oder am 5'-
oder 3'-Ende des
DNA-Fragmentes enthält,
wobei die funktionelle Aktivität
der Kerndomäne
beibehalten wird.
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Es
ist ferner beabsichtigt, dass ein Varianten-DNA-Fragment, das die
Kerndomäne
umfasst, angibt, dass eine Linker- oder Gelenk-DNA-Sequenz oder
ein Bereich davon an die Kerndomänen-DNA-Sequenz entweder
am 5'- oder 3'-Ende angefügt sein
kann, wobei die funktionelle Aktivität des codierten trunkierten
Kerndomänenproteins
beibehalten wird.
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Der
Begriff "Wirtszelle" bedeutet sowohl
die Zellen als auch Protoplasten, welche aus den Zellen von Trichoderma
sp. erzeugt wurden.
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Der
Begriff "DNA-Konstrukt
oder Vektor" (was
hierin austauschbar verwendet wird) bezieht sich auf einen Vektor,
welcher ein oder mehrere DNA-Fragmente oder DNA-Variantenfragmente
umfasst, die ein beliebiges von den neuen trunkierten Cellulasen
oder oben beschriebenen Derivaten codieren.
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Der
Begriff "funktionell
verbunden mit" bedeutet,
dass eine regulatorische Region, wie ein Promotor, Terminator, Sekretionssignal
oder eine Enhancer-Region an ein Strukturgen angeheftet ist und
die Expression dieses Gens steuert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von trunkierten
Cellulasen durch Bereitstellen einer Wirtszelle, welche mit einem
DNA-Konstrukt transformiert ist, das mindestens ein Fragment von DNA,
codierend eine Kernregion von CBHII, umfasst, welches funktionell
an einen Promotor angeheftet ist, Kultivieren der Wirtszelle zum
Exprimieren der trunkier ten Cellulase und anschließendes Reinigen
der trunkierten Cellulase bis zur wesentlichen Homogenität.
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Kulturen
von transformierten Mikroorganismen werden typischerweise bis zur
stationären
Phase wachsen gelassen, zur Entfernung der Zellen filtriert, und
der verbleibende Überstand
wird durch Ultrafiltration konzentriert, um eine trunkierte Cellulase
oder ein Derivat davon zu erhalten.
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Das
zum Kultivieren der transformierten Wirtszellen verwendete Medium
kann ein beliebiges Medium sein, welches für die Cellulase-Herstellung
in Trichoderma geeignet ist. Die trunkierten Cellulasen oder Derivate
davon werden aus dem Medium durch herkömmliche Techniken zurückgewonnen,
einschließlich
Trennungen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration,
Fällung
der Proteine im Überstand oder
Filtrat mit Salz, zum Beispiel Ammoniumsulfat, gefolgt von Chromatographievorgehensweisen,
wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen.
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Alternativ
dazu kann das letztendliche Proteinprodukt durch Bindung an ein
Polysaccharidsubstrat oder eine Antikörpermatrix isoliert und gereinigt
werden. Die (polyklonalen oder monoklonalen) Antikörper können gegen
Cellulase-Kern- oder -Bindungsdomänen-Peptide herangezogen werden,
oder synthetische Peptide können
aus Bereichen der Kerndomäne
oder der Bindungsdomäne
hergestellt und zum Heranziehen von polyklonalen Antikörpern verwendet
werden.
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Die
Trichoderma-Wirtszelle kann zuvor durch gentechnische Verfahren
manipuliert worden sein, um jedwede Wirtsgene zu entfernen, welche
intakte Cellulasen codieren, oder nicht.
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In
einer besonderen Ausführungsform
werden trunkierte Cellulasen, Derivate davon oder kovalent verknüpfte Domänen-Derivate
der trunkierten Cellulase in transformierten Trichoderma-Zellen exprimiert,
bei welchen keine Gene daraus deletiert worden sind. Die oben aufgeführten, trunkierten
Proteine werden zurückgewonnen
und von gleichzeitig in den Wirtszellen exprimierten intakten Cellulasen
durch oben erörterte
herkömmliche
Vorgehensweisen getrennt, einschließlich Größenbestimmungs-Chromatographie.
Die Bestätigung
der Expression von trunkierten Cellulasen oder Derivaten wird durch
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Immunoblot-Analyse bestimmt, um trunkierte
von intakten Cellulaseproteinen zu unterscheiden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transformieren
einer Trichoderma sp.-Wirtszelle, der eine oder mehrere Cellulaseaktivitäten fehlen,
und Behandeln der Zelle unter Anwendung vom im Fachgebiet allgemein
bekannten rekombinanten DNA-Techniken mit einem oder mehreren DNA-Fragmenten,
welche eine trunkierte Cellulase, ein Derivat davon oder kovalent
verknüpfte trunkierte
Cellulasedomänen-Derivate codieren.
Es wird in Betracht gezogen, dass das DNA-Fragment, welches den
trunkier ten Cellulasekern codiert, beispielsweise durch Deletionen,
Insertionen oder Substitutionen innerhalb des Gens verändert werden
kann, um eine Varianten-DNA herzustellen, welche ein aktives trunkiertes
Cellulase-Derivat codiert.
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Bei
der vorliegenden Erfindung wird es ferner in Betracht gezogen, dass
das die trunkierte Cellulase codierende DNA-Fragment funktionell
mit einer Pilz-Promotorsequenz, zum Beispiel den Promotor des cbh1- oder
eg11-Gens, verbunden sein kann.
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Ebenfalls
von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird die Manipulation
des Trichoderma sp.-Stammes durch Transformation, so dass ein DNA-Fragment,
welches eine trunkierte Cellulase oder ein Derivat davon codiert,
innerhalb des Genoms inseriert wird. Es wird ebenfalls in Betracht
gezogen, dass mehr als eine Kopie eines trunkierten Cellulase-DNA-Fragmentes oder -DNA-Variantenfragmentes
in den Stamm hinein rekombiniert werden kann.
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Ein
selektierbarer Marker muss zuerst so gewählt werden, dass die Detektion
des transformierten Pilzes ermöglicht
wird. Jedwedes selektierbare Markergen, welches in Trichoderma sp.
exprimiert wird, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
so dass seine Gegenwart in den Transformanten deren Eigenschaften
nicht materiell beeinflussen wird. Der selektierbare Marker kann
ein Gen sein, welches ein durch einen Assay nachweisbares Produkt
codiert. Der selektierbare Marker kann eine funktionelle Kopie eines
Trichoderma sp.-Gens sein, welches, wenn es im Wirtsstamm fehlt,
dazu führt,
dass der Wirtsstamm einen auxotrophen Phänotyp aufzeigt.
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Die
verwendeten Wirtsstämme
könnten
Derivate von Trichoderma sp. sein, bei denen ein Gen oder Gene,
entsprechend dem gewählten
selektierbaren Marker, fehlen oder nicht funktionell sind. Wenn
zum Beispiel der selektierbare Marker von pyr4 gewählt wird,
dann wird ein spezifischer pyr-Derivatstamm als Empfänger im
Transformationsvorgehen verwendet. Andere Beispiele von selektierbaren
Marker, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen die
Trichoderma sp.-Gene ein, welche äquivalent zu den Aspergillus
nidulans-Genen argB,
trpC, niaD und dergleichen sind. Der entsprechende Empfängerstamm
muss daher ein Derivatstamm sein, wie argB–,
trpC–,
niaD– und
dergleichen.
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Der
Stamm wird aus einem Ausgangs-Wirtsstamm abgeleitet, welcher ein
beliebiger Trichoderma sp.-Stamm ist. Es wird jedoch bevorzugt,
einen Cellulase-überproduzierenden
T. longibrachiatum-Stamm, wie RL-P37, zu verwenden, welcher beschrieben
wurde von Sheir-Neiss et al., in Appl. Microbiol. Biotechnology, 20
(1984), S. 46–54,
weil dieser Stamm erhöhte
Mengen an Cellulaseenzymen sezerniert. Dieser Stamm wird dann verwendet,
um die im Transformationsverfahren verwendeten Derivatstämme herzustellen.
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Der
Derivatstamm von Trichoderma sp. kann durch eine Reihe von im Fachgebiet
bekannten Techniken hergestellt werden. Ein Beispiel ist die Herstellung
von pyr4–-Derivatstämmen durch
Aussetzen der Stämme
an Fluororotsäure
(FOA). Das pyr4-Gen codiert Orotidin-5'-monophosphat-Decarboxylase,
ein Enzym, welches für
die Biosynthese von Uridin erforderlich ist. Stämme mit einem intakten pyr4-Gen
wachsen in einem Medium, welchem Uridin fehlt, aber sind gegenüber Fluororotsäure empfindlich.
Es ist möglich,
pyr4 Derivatstämme
zu selektieren, denen ein funktionelles Orotidinmonophosphat-Decarboxylase-Enzym
fehlt und die Uridin für
das Wachstum erfordern, indem man hinsichtlich FOA-Resistenz selektiert.
Unter Anwendung der FOA-Selektionstechnik ist es ebenfalls möglich, Uridin
erfordernde Stämme
zu erhalten, denen eine funktionelle Orotat-Pyrophosphoribosyl-Transferase
fehlt. Es ist möglich,
diese Zellen mit einer funktionellen Kopie des Gens, welches dieses
Enzym codiert, zu transformieren (Berges und Barreau, 1991, Curr.
Genet. 19, S. 359–365).
Da es einfach ist, Derivatstämme
unter Anwendung der FOA-Resistenztechnik in der vorliegenden Erfindung
zu selektieren, wird es bevorzugt, als einen selektierbaren Marker
das pyr4-Gen zu verwenden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind bei Trichoderma-Wirtszellstämmen vor der Einbringung eines
DNA-Konstrukts oder Plasmides, welches das für das trunkierte Cellulaseprotein
von Interesse codierende DNA-Fragment enthält, ein oder mehrere Cellulasegene
deletiert worden. Es wird bevorzugt, eine trunkierte Cellulase,
ein Derivat davon oder kovalent verbundene trunkierte Cellulasedomänen-Derivate
in einem Wirt zu exprimieren, welchem ein oder mehrere Cellulasegene
fehlen, um die Identifizierung und anschließende Reinigungsvorgehen zu
vereinfachen. Jedwedes Gen aus Trichoderma sp., welches kloniert
worden ist, kann deletiert werden, wie etwa cbh1, cbh2, eg11, eg13
und dergleichen. Das Plasmid für
die Gendeletion wird so ausgewählt,
dass einmalige Restriktionsenzym-Stellen darin vorhanden sind, um
zu gestatten, dass das Fragment von homologer Trichoderma sp.-DNA
als ein einzelnes lineares Stück
entfernt werden kann.
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Das
gewünschte
Gen, welches aus der Transformante deletiert werden soll, wird durch
im Fachgebiet bekannte Verfahren in das Plasmid inseriert. Das Plasmid,
welches das zu deletierende oder disruptierende Gen enthält, wird
dann an geeigneten Restriktionsenzym-Stelle(n), intern zu bzw. in
der codierenden Region, geschnitten, die Gen-codierende Sequenz
oder ein Teil davon kann daraus entfernt werden, und der selektierbare
Marker wird inseriert. Flankierende DNA-Sequenzen aus dem Locus des zu deletierenden
oder disruptierenden Gens, vorzugsweise zwischen etwa 0,5 bis 2,0
kb, verbleiben auf beiden Seiten des selektierbaren Markergens.
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Ein
einzelnes DNA-Fragment, welches das Deletionskonstrukt enthält, wird
dann aus dem Plasmid isoliert und verwendet, um den geeigneten pyr–-Trichoderma-Wirt
zu transformieren. Transformanten werden basierend auf ihrem Vermögen selektiert,
das pyr4-Genprodukt zu exprimieren und somit die Uridin-Auxotrophie
des Wirtstamms zu komplementieren. Dann wird eine Southern-Blot-Analyse
an den resultierenden Transformanten ausgeführt, um ein Doppel- Crossover-Integrationsereignis
zu identifizieren und zu bestätigen, welches
einen Teil oder die Gesamtheit der codierenden Region des zu deletierenden
Gens mit den selektierbaren pyr4-Markern
ersetzt.
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Obwohl
oben spezifische Plasmidvektoren beschrieben werden, ist die vorliegende
Erfindung nicht auf die Herstellung dieser Vektoren eingeschränkt. Verschiedene
Gene können
in dem Trichoderma sp.-Stamm unter Anwendung der oben genannten
Techniken deletiert und ersetzt werden. Beliebige verfügbare selektierbare
Marker können
verwendet werden, wie es oben erörtert
wurde. Potenziell kann jedwedes Trichoderma sp.-Gen, welches kloniert
und somit identifiziert worden ist, unter Anwendung der oben beschriebenen
Strategie aus dem Genom deletiert werden. Alle diese Variationen
sind innerhalb der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
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Der
Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung, welcher das inserierte
DNA-Fragment oder Varianten-DNA-Fragment trägt, das die trunkierte Cellulase
oder das Derivat davon der vorliegenden Erfindung codiert, kann
jedweder Vektor sein, der zu autonomer Replikation in einem gegebenen
Wirtsorganismus in der Lage ist, typischerweise ein Plasmid. In
bevorzugten Ausführungsformen
werden zwei Typen von Expressionsvektoren zum Erhalten einer Expression
von Genen oder Trunkierungen davon in Betracht gezogen. Der Erste enthält DNA-Sequenzen,
in welchen der Promotor, die codierende Region des Gens und die
Terminatorsequenz alle aus dem zu exprimierenden Gen stammen. Die
Gen-Trunkierung wird durch Fort-Deletieren der unerwünschten
DNA-Sequenzen (welche für
ungewünschte
Domänen
codieren) erhalten, wodurch die zu exprimierende Domäne unter
der Steuerung ihrer eigenen transkriptionellen und translationalen
Regulationssequenzen gelassen wird. Ein selektierbarer Marker ist
ebenfalls auf dem Vektor enthalten, welcher die Selektion hinsichtlich
Integration mehrerer Kopien der neuen Gensequenzen in den Wirt zulässt.
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Der
zweite Typ von Expressionsvektor ist im Voraus zusammengebaut und
enthält
Sequenzen, die für eine
Transkription bei hohem Spiegel erforderlich sind, und einen selektierbaren
Marker. Es wird in Betracht gezogen, dass die codierende Region
für ein
Gen oder ein Teil davon in diesen Allzweck-Expressionsvektor so
inseriert werden kann, dass sie unter der transkriptionellen Steuerung
der Promotor- und Terminatorsequenzen der Expressionskassette steht.
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Zum
Beispiel ist pTEX ein solcher Allzweck-Expressionsvektor. Gene,
oder ein Teil davon, können stromabwärts des
starken CBHI-Promotors inseriert werden. Es sind hierin offenbarte
Beispiele eingeschlossen, in welchen gezeigt wird, dass katalytische
Kern- und Bindungs-Domänen von
Cellulase unter Verwendung dieses Systems exprimiert werden.
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In
dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, welche die trunkierte Cellulase
oder andere neue Proteine der vorliegenden Erfindung codiert, funktionstüchtig an
transkriptionelle und translationale Sequenzen, d. h. eine geeignete
Promotorsequenz und Signalsequenz, im Leseraster mit dem Strukturgen
verknüpft
sein. Der Promotor kann jedwede DNA-Sequenz sein, welche Transkriptionsaktivität in der
Wirtszelle zeigt und kann aus Genen abgeleitet sein, welche hinsichtlich
der Wirtszelle entweder homologe oder heterologe Proteine codieren.
Das Signalpeptid sorgt für
die extrazelluläre
Expression der trunkierten Cellulase oder ihrer Derivate. Die DNA-Signalsequenz
ist vorzugsweise die Signalsequenz, welche natürlich mit dem zu exprimierenden
trunkierten Gen assoziiert ist, allerdings wird in der vorliegenden
Erfindung die Signalsequenz aus beliebigen Cellobiohydrolasen oder
Endoglucanase in Betracht gezogen.
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Die
zum Ligieren der DNA-Sequenzen, welche die trunkierten Cellulasen,
Derivate davon oder andere neue Cellulasen der vorliegenden Erfindung
codieren, mit dem Promotor und die Insertion in geeignete Vektoren,
welche die notwendige Information für eine Replikation in der Wirtszelle
enthalten, sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
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Der/das
oben beschriebene DNA-Vektor oder -Konstrukt kann gemäß bekannten
Techniken in die Wirtszelle eingebracht werden, wie Transformation,
Transfektion, Mikroinjektion, Mikroporation, Biolistik-Beschuss
und dergleichen.
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In
der bevorzugten Transformationstechnik muss man berücksichtigen,
dass die Aufnahme der gewünschten
DNA-Sequenz, des Gens oder Genfragments bestenfalls minimal ist,
weil die Permeabilität
der Zellwand in Trichoderma sp. sehr gering ist. Es gibt eine Reihe
von Verfahren, um die Permeabilität der Trichoderma sp.-Zellwand
im Derivat-Stamm (d. h. ohne ein funktionales Gen, entsprechend
dem verwendeten selektierbaren Marker) vor dem Transformationsverfahren
zu erhöhen.
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Das
bevorzugte Verfahren in der vorliegenden Erfindung, um Trichoderma
sp. für
die Transformation vorzubereiten, beinhaltet die Herstellung von
Protoplasten aus Pilzmyzel. Das Myzel kann aus gekeimten vegetativen
Sporen erhalten werden. Das Myzel wird mit einem Enzym behandelt,
welches die Zellwand verdaut, was zu Protoplasten führt. Die
Protoplasten werden dann durch das Vorhandensein eines osmotischen
Stabilisators im Suspendiermedium geschützt. Diese Stabilisatoren schließen Sorbitol,
Mannitol, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und dergleichen ein. Üblicherweise
variiert die Konzentration dieser Stabilisatoren zwischen 0,8 M
bis 1,2 M. Es wird bevorzugt, eine Lösung von etwa 1,2 M Sorbitol
im Suspensionsmedium zu verwenden.
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Die
Aufnahme der DNA in den Wirts-Trichoderma sp.-Stamm ist abhängig von
der Calciumionenkonzentration. Im Allgemeinen werden zwischen etwa
10 mM CaCl2 und 50 mM CaCl2 in
einer Aufnahmelösung verwendet.
Neben der Notwendigkeit für
das Calciumion in der Aufnahmelösung
sind andere im Allgemeinen eingeschlossene Bestandteile ein Pufferungssystem,
wie ein TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) oder 10 mM MOPS-Puffer
mit pH 6,0 (Morpholinpropansulfonsäure) und Polyethylenglycol
(PEG). Es wird angenommen, dass das Polyethylenglycol wirkt, um
die Zellmembranen zu fusionieren, wodurch ermöglicht wird, dass der Inhalt
des Mediums in das Zytoplasma des Trichoderma sp.-Stammes zugeführt wird,
und die Plasmid-DNA zum Zellkern transferiert wird. Diese Fusion
führt häufig dazu,
dass mehrere Kopien der Plasmid-DNA tandemartig in das Wirtschromosom
integriert werden.
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Üblicherweise
wird eine Suspension, enthaltend die Trichoderma sp.-Protoplasten
oder -Zellen, welche einer Permeabilitätsbehandlung unterzogen worden
sind, bei einer Dichte von 108 bis 109/ml, vorzugsweise 2 × 108/ml,
in der Transformation verwendet. Diese Protoplasten oder Zellen
werden der Aufnahmelösung zugegeben,
zusammen mit dem gewünschten
linearisierten selektierbaren Marker, welcher im Wesentlichen homologe
flankierende Regionen auf beiden Seiten des Markers aufweist, um
ein Transformationsgemisch zu bilden. Im Allgemeinen wird eine hohe
Konzentration an PEG zu der Aufnahmelösung zugegeben. Es kann von
0,1 bis 1 Volumen an 25%igem PEG 4000 zu der Protoplastensuspension
zugegeben werden. Allerdings wird es bevorzugt, etwa 0,25 Volumen
zu der Protoplastensuspension zuzugeben. Zusatzsstoffe, wie Dimethylsulfoxid,
Heparin, Spermidin, Kaliumchlorid und dergleichen, können ebenfalls
zu der Aufnahmelösung
zugegeben werden, und wirken bei der Transformation unterstützend.
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Im
Allgemeinen wird die Mischung dann bei ungefähr 0°C während einer Dauer von 10 bis
30 Minuten inkubiert. Zusätzliches
PEG wird dann zu der Mischung zugegeben, um die Aufnahme des gewünschten
Gens oder der gewünschten
DNA-Sequenz weiter zu verstärken.
Das 25%ige PEG 4000 wird im Allgemeinen in Volumina von dem 5- bis
15-Fachen des Volumens der Transformationsmischung zugegeben; allerdings
können größere und
kleinere Volumina geeignet sein. Das 25%ige PEG 4000 beläuft sich
vorzugsweise auf etwa das 10-Fache des Volumens der Transformationsmischung.
Nachdem das PEG zugegeben ist, wird die Transformationsmischung
dann bei Raumtemperatur inkubiert, vor der Zugabe einer Lösung von
Sorbitol und CaCl2. Die Protoplastensuspension
wird dann ferner zu geschmolzenen Aliquots eines Wachstumsmediums
gegeben. Dieses Wachstumsmedium gestattet nur das Wachstum von Transformanten.
In der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges Wachstumsmedium
verwendet werden, welches geeignet ist, um die gewünschten Transformanten
zu kultivieren. Wenn Pyr+-Transformanten selektiert
werden, ist es allerdings zu bevorzugen, ein Wachstumsmedium zu
verwenden, das kein Uridin enthält.
Die anschließenden
Kolonien werden überführt und
auf einem von Uridin freien Wachstumsmedium gereinigt.
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Bei
diesem Stadium wurden stabile Transformanten von instabilen Transformanten
durch ihre rasche Wachstumsgeschwindigkeit und die Bildung von kreisförmigen Kolonien
mit einem glatten anstatt einem gezackten Rand auf festem Kulturmedium
ohne Uridin unterschieden. Darüber
hinaus wurde in einigen Fällen
ein weiterer Test hinsichtlich Stabilität durch Kultivieren der Transformanten
auf festem nicht-selektiven Medium (d. h. mit Uridin), Ernten der
Sporen aus diesem Kulturmedium und Bestimmten des Prozentsatzes
dieser Sporen, welche anschließend
auskeimen und auf Selektivmedium ohne Uridin wachsen werden, vorgenommen.
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In
einer besonderen Ausführungsform
des oben genannten Verfahrens werden die trunkierten Cellulasen
[entweder] als Ergebnis der geeigneten posttranslationalen Prozessierung
der trunkierten Cellulase in einer aktiven Form aus der Wirtszelle
gewonnen.
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Die
Verwendung der katalytischen Cellulase-Kerndomänen kann gegenüber der
Verwendung des intakten Cellulase-Enzyms bei mehreren Anwendungen
von Vorteil sein. Derartige Anwendungen beinhalten Stonewashing
oder "Biopolishing", wobei es in Betracht
gezogen wird, dass Farbstoff/Färbemittel/Pigment-Rückfärbung oder
-Neuabscheidung durch Verwenden der neuen trunkierten Cellulasenzyme
reduziert oder eliminiert werden kann, welche so modifiziert worden
sind, dass ihnen eine Cellulose-Bindungsdomäne fehlt. Darüber hinaus
wird in Betracht gezogen, dass die Aktivität gegenüber bestimmten Substraten von
Interesse zum Beispiel in der Textil-, Waschmittel-, Zellstoff- & Papier-, Tierfutter-,
Nahrungsmittel- und Biomassen-Industrie signifikant erhöht oder
vermindert werden kann, wenn die Bindungsdomäne entfernt ist, so dass die
Bindungsaffinität
des Enzyms für
Cellulose reduziert wird.
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Es
wird ferner in Betracht gezogen, dass die Expression und Verwendung
von manchen katalytischen Domänen
von Cellulase-Enzymen eine verbesserte Rückgewinnbarkeit des Enzyms,
Selektivität,
falls geringere Aktivität
gegenüber
einem stärker
kristallinen Substrat gewünscht
wird, oder Selektivität,
falls eine hohe Aktivität
gegenüber
amorphem/löslichem
Substrat gewünscht
wird, vorsieht.
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Darüber hinaus
können
katalytische Domänen
von Cellulase-Enzymen nützlich
sein, um die Synergie mit anderen Cellulase-Komponenten, Cellulase-
oder Nicht-Cellulase-Domären
und/oder anderen Enzymen oder Bereichen davon gegenüber celluloseartigen
Cellulose-haltigen Materialien in Anwendungen, wie der Biomassen-Umwandlung,
Reinigung, Stonewashing, Biopolishing von Textilien, Weichmachen,
Zellstoff/Papierverarbeitung, Tierfutter-Verwertung, Pflanzenschutz
und Schädlingsbekämpfung,
Stärkeverarbeitung,
oder Produktion von pharmazeutischen Zwischenstufen, Disacchariden
oder Oligosacchariden, zu erhöhen.
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Weiterhin
können
die Verwendungen von katalytischen Cellulase-Kerndomänen oder
Derivaten davon einige der nachteiligen Eigenschaften, welche mit
dem intakten Enzym assoziiert sind, gegenüber celluloseartigen Stoffen,
wie Zellstoffen, Baumwolle oder anderen Fasern oder Papier, reduzieren.
Eigenschaften von Interesse schließen Faser/Gewebe-Festigkeitsverlust,
Faser/Gewebe-Gewichtsverlust, Fussel-Erzeugung und Fibrillierungs-Schädigung ein.
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Es
wird ferner in Betracht gezogen, dass katalytische Cellulase-Kerndomänen eine
geringere Faseraufrauhung oder reduzierte Färbemittel-Neuabscheidung/Rückfärbung aufzeigen
können.
Fernerhin können diese
trunkierten katalytischen Kern-Cellulasen oder Derivate davon eine
Option für
ein verbessertes Rückgewinnen/Recycling
dieser neuen Cellulasen bieten.
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Darüber hinaus
wird es in Betracht gezogen, dass die katalytischen Cellulase-Kerndomänen selektive Aktivitätsvorteile
enthalten können,
wo eine Hydrolyse der löslichen
oder amorpheren Cellulose-Regionen des Substrates gewünscht wird,
aber eine Hydrolyse der kristallineren Region nicht gewünscht ist.
Dies kann bei Anwendungen wie der Biokonversion von Bedeutung sein,
worin die selektive Modifikation der Korn/Faser/Pflanzenmaterialien
von Interesse ist.
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Noch
eine andere Anwendung für
katalytische Cellulase-Kerndomänen
oder Derivate besteht in der Erzeugung von mikrokristalliner Cellulose
(MCC). Weiterhin wird es in Betracht gezogen, dass die MCC weniger
gebundenes Enzym enthalten wird, oder dass das gebundene Enzym leichter
entfernt werden kann.
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Um
die vorliegende Erfindung und deren Vorteile weiter zu veranschaulichen,
sind die folgenden spezifischen Beispiele angegeben, wobei es sich
versteht, dass sie zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung
angeboten werden, und sie keineswegs als deren Umfang einschränkend ausgelegt
werden sollten.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Klonierung
und Expression von CBHII-Kerndomäne
unter Verwendung des CBHI-Promotors, -Terminators und der Signalsequenz
aus CBHII.
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Teil 1. Konstruktion des T. longibrachiatum-Allzweckexpressionsplasmides
PTEX.
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Das
Plasmid PTEX wurde unter Befolgung der Verfahren von Sambrook et
al. (1989), siehe oben, konstruiert und ist in der 7 veranschaulicht.
Dieses Plasmid ist als ein Mehrzweck-Expressionsvektor zur Verwendung im
filamentösen
Pilz Trichoderma longibrachiatum entworfen worden. Die Expressionskassette
besitzt mehrere einzigartige Merkmale, welche sie für diese
Funktion nützlich
machen. Die Transkription wird unter Verwendung der Sequenzen für den starken
Promotor und den Terminator des CBHI-Gens für T. longibrachiatum reguliert.
Zwischen dem CBHI-Promotor und -Terminator befinden sich einmalige
PmeI- und SstI-Restriktionsstellen,
welche verwendet werden, um das zu exprimierende Gen zu inserieren.
Das selektierbare T. longibrachiatum-pyr4-Markergen ist in den CBHI-Terminator
inseriert worden, und die vollständige
Expressionskassette (CBHI-Promotor-Insertionsstellen-CBHI-Terminator- pyr4-Gen-CBHI-Terminator)
kann unter Verwendung der einmaligen NotI-Restriktionsstelle oder
der einmaligen NotI- und NheI-Restriktionsstellen herausgeschnitten
werden.
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Dieser
Vektor basiert auf dem bakteriellen Vektor pSL1180 (Pharmacia Inc.,
Piscataway, New Jersey), welcher ein Vektor vom PUC-Typ mit einer
verlängerten
Mehrfachklonierungsstelle ist. Der Fachmann auf dem Gebiet wird
in der Lage sein, diesen Vektor basierend auf dem in der 2 veranschaulichten Flussdiagramm zu konstruieren
(siehe auch die U. S.-Patentanmeldung 07/954 113 für die Konstruktion
des PTEX-Expressionsplasmides).
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Teil 2. Klonierung.
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Das
in der Konstruktion des CBHII-Kerndomänen-Expressionsplasmides, PTEX
CBHII core, verwendete vollständige
cbh2-Gen wurde aus dem Plasmid PUC219::CBHII (Korman, D., et al.,
1990, Curr. Genet. 17: 203–212)
erhalten. Die Cellulose-Bindungsdomäne, welche am 5'-Ende des cbh2-Gens
positioniert ist, liegt zweckmäßigerweise
zwischen einer XbaI- und SnaBI-Restriktionsstelle.
Um die XbaI-Stelle zu verwenden, wurde eine weitere XbaI-Stelle
im Polylinker zerstört.
PUC219::CBHII wurde partiell mit XbaI verdaut, so dass der Großteil des
Produktes linear war. Die XbaI-Überhänge wurden
unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase aufgefüllt und unter Bedingungen zusammenligiert,
welche die Selbstligation des Plasmides begünstigen. Dies besitzt den Effekt
der Zerstörung
der geglätteten
Stelle, welche in 50% der Plasmide die XbaI-Stelle im Polylinker
war. Ein solches Plasmid wurde identifiziert und mit XbaI und SnaBI
verdaut, um die Cellulose-Bindungsdomäne freizusetzen. Die Vektor-CBHII-Kerndomäne wurde
isoliert und mit den folgenden synthetischen Oligonukleotiden ligiert,
welche entworfen waren, um die XbaI-Stelle mit der SnaBI-Stelle
an der Signalpeptidase-Spaltungsstelle
und dem Papain-Spaltungspunkt in der Linkerdomäne zu verknüpfen.
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Das
resultierende Plasmid pUCΔCBD
CBHII wurde mit NheI verdaut, und die Enden wurden durch Inkubation
mit T4-DNA-Polymerase und dNTPs geglättet. Hiernach wurde die lineare
geglättete
Plasmid-DNA mit BglII verdaut, und das Nhe(glattendig)-BglII-Fragment,
welches die CBHII-Signalsequenz und Kerndomäne enthielt, wurde isoliert.
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Das
letztendliche Expressionsplasmid wurde durch Verdauen des Allzweck-Expressionsplasmides pTEX
(offenbart in 07/954 113 und nachstehend beschrieben in Teil 3)
mit SstII und PmeI und Ligieren des CBHII-NheI(glattendig)-BglII-Fragmentes
stromabwärts
vom cbh1-Promotor
unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotides konstruiert,
welches die Sequenz CGCTAG aufwies, um den BglII-Überhang
mit dem SstII-Überhang
aufzufüllen.
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Teil 3. Transformation und Expression
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Eine
DNA-Präparation
im großen
Maßstab
von pTEX-CBHIIcore wurde vorgenommen, und hieraus wurde das NotI-Fragment,
enthaltend die CBHII-Kerndomäne
unter der Steuerung der cbh1-Transkriptionselemente und das pyr4-Gen,
durch präparative
Gelelektrophorese isoliert. Das isolierte Fragment wurde in die Uridin-auxotrophe
Version des quad-deletierten Stammes, 1A52 pyr13, transformiert
und stabile Transformanten wurden identifiziert.
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Um
zu selektieren, welche Transformanten die cbh2-Kerndomäne exprimierten,
wurde genomische DNA aus Stämmen
im Anschluss an Wachstum auf Vogels +1% Glukose isoliert, und Southern-Blot-Experimente
wurden durchgeführt,
wobei ein isoliertes DNA-Fragment verwendet wurde, welches nur die
cbh2-Kerndomäne
enthielt. Es wurden Transformanten isoliert, bei welchen eine Kopie
der cbh2-Kerndomänen-Expressionskassette
in das Genom von 1A52 integriert war. Gesamt-mRNA wurde aus den
zwei Stämmen
in Anschluss an Wachstum während
einem Tag auf Vogels +1% Lactose isoliert. Die mRNA wurde einer
Northern-Analyse unter Verwendung der codierenden Region von cbh2
als Sonde unterzogen. Transformanten, welche die cbh2-Kerndomänen-mRNA
exprimieren, wurden identifiziert.
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Zwei
Transformanten wurden unter den gleichen Bedingungen, wie zuvor
in Beispiel 1 beschrieben, in 14 1 großen Fermentern kultiviert.
Die resultierende Nährlösung wurde
konzentriert, und die darin enthaltenen Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
getrennt, und das CBHII-Kerndomänenprotein
wurde durch Western-Analyse identifiziert. Eine Transformante, #15,
produzierte ein Protein der korrekten Größe und Reaktivität gegenüber polyklonalen
CBHII-Antikörpern.
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Es
wurde anschließend
geschätzt,
dass die Proteinkonzentration des Fermentationsüberstands nach der Reinigung
10 g/l betrug, wovon 30–50%
CBHII-Kerndomäne
war (siehe Beispiel 2).
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Beispiel 2
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Reinigung des katalytischen CBHII-Kerns
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Es
wird vorhergesagt, dass sich der katalytische CBHII-Kern aufgrund
seiner ähnlichen
biochemischen Eigenschaften in einer ähnlichen Weise zu derjenigen
von CBHII-Cellulase reinigen lassen wird. Der theoretische pI des
CBHII-Kerns ist weniger als eine halbe pH-Einheit niedriger als
jener von CBHII. Darüber hinaus
macht der katalytische CBHII-Kern ungefähr 80% des Molekulargewichts
von CBHII aus. Deshalb basiert das nachfolgend vorgeschlagene Reinigungsprotokoll
auf dem für
CBHII verwendeten Reinigungsverfahren. Die mit Diatomeen-Erde behandelte,
ultrafiltrierte (UF) CBHII-Kern-Nährlösung wird in 10 mM TES, pH 6,8,
zu einer Leitfähigkeit
von < 0,7 mOhm
verdünnt.
Der verdünnte
CBHII-Kern wird dann auf eine Anionenaustauschsäule (Q-Sepharose Fast Flow,
Pharmacia, Kat.-Nr. 17 0510-01) aufgetragen, welche in 10 mM TES pH
6,8 äquilibriert
wurde. Ein Salzgradient von 0 bis 1 M NaCl in 10 mM TES, pH 6,8,
wird verwendet, um den CBHII-Kern aus der Säule heraus zu eluieren. Die
Fraktionen, welche den CBHII-Kern enthalten, werden dann einem Pufferaustausch
in 2 mM Natriumsuccinat-Puffer unterzogen und auf eine Kationenaustauschsäule (SP-Sephadex
C-50) aufgetragen. Der CBHII-Kern wird als nächstes mit einem Salzgradienten
von 0 bis 100 mM NaCl aus der Säule
eluiert. SEQUENZAUFLISTUNG