DE69434448T2 - Polymer-peptid konjugate - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polymer-Peptid-Konjugate und -Formulierungen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung.
  • Beschreibung verwandter Gebiete
  • Die Verwendung von Polypeptiden und Proteinen zur systemischen Behandlung von bestimmten Krankheiten hat sich in der medizinischen Praxis durchgesetzt. Die Rolle der Peptide bei Substitutionstherapien ist so wichtig, dass viele Forschungsaktivitäten auf die Synthese von großen Mengen durch DNA-Rekombinationsverfahren ausgerichtet sind. Viele dieser Polypeptide sind endogene Moleküle, die in Bezug auf die Ausführung ihrer biologischen Wirkungen sehr stark und spezifisch sind.
  • Ein wichtiger Faktor, der die Nützlichkeit dieser Substanzen in Bezug auf die gewünschte Anwendung einschränkt, ist, dass sie bei parenteraler Verabreichung leicht durch Plasmaproteasen metabolisiert werden. Der orale Verabreichungsweg dieser Substanzen wirft noch weitere Probleme auf, weil zusätzlich zur Proteolyse im Magen die hohe Azidität des Magens diese zerstört, bevor sie das gewünschte Zielgewebe erreichen. Polypeptide und Proteinfragmente, die durch die Wirkung von Verdauungs- und Pankreasenzymen erzeugt werden, werden durch Exo- und Endopeptidasen in der mit Mikrovilli besetzten Darmepithelzellenmembran gespalten, um Di- und Tripeptide zu erhalten, und sogar wenn eine Proteolyse durch Pankreasenzyme verhindert wird, werden Polypeptide durch Bürstensaumpeptidasen abgebaut. Jedes Peptid, das den Durchgang durch den Magen überlebt, wird in der Darmschleimhaut weiter metabolisiert, wo eine Penetrationsbarriere einen Eintritt in die Zellen verhindert.
  • Trotz dieser Hindernisse gibt es in der Literatur genug Beweise dafür, dass Nahrungsproteine und pharmazeutische Proteine durch die Darmschleimhaut absorbiert werden. Nahrungs- und Arzneimittel(poly)peptide, andererseits, werden durch spezi fische Peptidtransporter in den Darmschleimhautzellen absorbiert. Diese Erkenntnisse weisen darauf hin, dass richtig formulierte (Poly-)Peptide und Proteine auf oralem Weg verabreicht werden können, wobei ausreichend biologische Aktivität für ihren Verwendungszweck aufrechterhalten wird. Wenn es jedoch möglich wäre, diese Peptide so zu modifizieren, dass ihre physiologischen Aktivitäten vollständig oder zumindest in einem signifikanten Maß erhalten blieben, und sie gleichzeitig gegen proteolytische Enzyme zu stabilisieren und ihre Penetrationsfähigkeit durch die Darmschleimhaut zu erhöhen, dann wäre es möglich, sie richtig für den gewünschten Zweck einzusetzen. Das so erhaltene Produkt würde die Vorteile mit sich bringen, dass eine effizientere Absorption erreicht würde und gleichzeitig die Verwendung geringerer Dosen möglich wäre, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen.
  • Die Probleme in Zusammenhang mit oraler oder parenteraler Verabreichung von Proteinen sind in der pharmazeutischen Industrie allgemein bekannt, und es werden zahlreiche Strategien eingesetzt, um sie zu umgehen. Diese Strategien umfassen die Inkorporation von Penetrationsverstärkern, wie z.B. Salicylaten, Lipid-Gallensalz-Mischmizellen, Glyceriden und Acylcarnitinen, aber diese führen häufig zu ernsthaften lokalen Toxizitätsproblemen, wie z.B. lokaler Irritation und Toxizität, vollständiger Abschabung der Epithelschicht und Gewebsentzündungen. Diese Probleme treten auf, weil Verstärker normalerweise zusammen mit dem Peptidprodukt verabreicht werden und die Dosierungsform häufig Lecke aufweist. Andere Strategien zur Verbesserung der oralen Verabreichung umfassen das Vermischen der Peptide mit Proteaseinhibitoren, wie z.B. Aprotinin, Sojatrypsininhibitor und Amastatin, und zwar um den Abbau des verabreichten therapeutischen Wirkstoffs zu verhindern. Unglücklicherweise sind diese Proteaseinhibitoren nicht selektiv, und endogene Proteine werden ebenfalls gehemmt. Diese Wirkung ist aber nicht erwünscht.
  • Eine verstärkte Penetration von Peptiden durch Schleimhautmembranen wurde auch zu erreichen versucht, indem die physikochemischen Eigenschaften von möglichen Arzneimitteln modifiziert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass eine einfache Erhöhung der Lipophilie nicht ausreicht, um den parazellulären Transport zu erhöhen. Tatsächlich wurde vorgeschlagen, dass eine Spaltung der Peptid-Wasser- Wasserstoffbindungen die größte Energiebarriere darstellt, die beim Erreichen einer Peptiddiffusion über Membranen überwunden werden muss (R. A. Conradi, A. R. Hilgers, N. F. H. Ho und P. S. Burton, The Influence of Peptide Structure on Transport across Caco-2 Cells, Pharm. Res. 8, 1453–1460 (1991)). Proteinstabilisierung wurden von verschiedenen Autoren beschrieben. Abuchowski und Davis (Soluble Polymers-Enzyme Adducts, In: Enzymes as Drugs, Hrsg. Holcenberg und Roberts, J. Wiley and Sons, New York, NY, USA (1981)) offenbarten verschiedene Verfahren zur Derivatisierung von Enzymen, um wasserlösliche, nicht immunogene, in-vivo-stabilisierte Produkte bereitzustellen.
  • Über Proteinstabilisierung wurden zahlreiche Arbeiten veröffentlicht. Abuchowski und Davis offenbaren verschiedene Wege zur Konjugation von Enzymen mit polymeren Materialien (ibd.). Genauer gesagt handelt es sich bei diesen Polymeren um Destrane, Polyvinylpyrrolidone, Glykopeptide, Polyethylenglykol und Polyaminosäuren. Wie berichtet wird, behalten die resultierenden konjugierten Polypeptide ihre biologische Aktivitäten und ihre Löslichkeit in Wasser bei parenteralen Anwendungen bei. Dieselben Autoren offenbaren im US-Patent Nr. 4.179.337, dass das Polyethylenglykol Proteine löslich und nicht immunogen macht, wenn sie an solche Proteine gebunden werden. Diese polymeren Materialien enthielten aber weder Fragmente, die für eine Darmschleimhautbindung geeignet waren, noch Gruppierungen, die eine Membranpenetration erleichtern oder verstärken würden. Obgleich diese Konjugate wasserlöslich waren, waren sie nicht für eine orale Verabreichung bestimmt.
  • Meisner et al., US-Patent Nr. 4.585.754, lehren, dass Proteine stabilisiert werden können, indem sie mit Chondroitinsulfaten konjugiert werden. Produkte dieser Kombination sind üblicherweise polyanionisch, äußerst hydrophil und weisen keine Zellpenetrationsfähigkeit auf. Sie sind üblicherweise nicht zur oralen Verabreichung bestimmt.
  • Mill et al., US-Patent 4.003.792, lehren, dass bestimmte saure Polysaccharide, wie z.B. Pectin, Alginsäure, Hyaluronsäure und Carrageen, an Proteine gebunden werden können, um sowohl lösliche als auch unlösliche Produkte zu erzeugen. Solche Polysaccharide sind polyanionisch und stammen von Nahrungspflanzen. Sie besitzen keine Zellpenetrationsfähigkeit und sind normalerweise nicht für eine orale Verabreichung bestimmt.
  • In Pharmacological Research Communication 14, 11–120 (1982), offenbarten Boccu et al., dass Polyethylenglykol an ein Protein, wie z.B. Superoxiddismutase ("SOD"), gebunden werden kann. Das resultierende konjugierte Produkt wies erhöhte Stabilität gegen Denaturierung und enzymatische Verdauung auf. Die Polymere enthielten keine Gruppierungen, die für eine Membranwechselwirkung erforderlich sind, und brachten somit die gleichen Probleme wie oben mit sich, dass sie nämlich nicht für eine orale Verabreichung geeignet sind.
  • Andere Verfahren zur Stabilisierung von Peptid- und Proteinarzneimitteln, worin proteinhältige Arzneimittelsubstanzen mit Verbindungen mit relativ geringem Molekulargewicht, wie z.B. Aminolethicin, Fettsäuren, Vitamin B12 und Glykosiden, konjugiert werden, sind in den folgenden Artikeln offenbart: R. Igarishi et al, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Materials 17, 366 (1990); T. Taniguchi et al., ibd. 19, 104 (1992); G. J. Russel-Jones, ibd. 19, 102 (1992); M. Baudys et al., ibd. 19, 210 (1992). Die modifizierenden Verbindungen sind keine Polymere und enthalten demgemäß keine Gruppierungen, die erforderlich sind, um sowohl die Löslichkeit als auch die Membranaffinität bereitzustellen, die für die Bioverfügbarkeit nach einer oralen sowie parenteralen Verabreichung erforderlich sind. Viele dieser Präparate weisen keine orale Bioverfügbarkeit auf.
  • Ein weiterer Ansatz, der zur Verlängerung der In-vivo-Wirkungsdauer von proteinhältigen Substanzen verwendet wurde, ist das Einkapselungsverfahren. M. Saffan et al., Science 233, 1081 (1986), lehren die Einkapselung von proteinhältigen Arzneimitteln in einem Azopolymerfilm zur oralen Verabreichung. Wie berichtet wird überlebt der Film die Verdauung mit Magen, wird aber durch die Mikroflora im Dickdarm abgebaut, wo das eingekapselte Protein freigesetzt wird. Dieses Verfahren nutzt ein physikalisches Gemisch und vereinfacht die Absorption von freigesetztem Protein durch die Membran nicht.
  • Ecanow, US-Patent Nr. 4.963.367, lehrt, dass physiologisch aktive Verbindungen, einschließlich Proteine, durch einen durch Koazervation erhaltenen Film eingekapselt werden können und das Endprodukt für eine transmukosale Verabreichung geeignet sein kann. Andere Formulierungen derselben Erfindung können durch Inhalation, oral, parenteral und transdermal verabreicht werden. Diese Ansätze stellen keine intakte Stabilität gegenüber Azidität und proteolytischen Enzyme des Gastrointestinaltrakts bereit, eine Eigenschaften, die bei oraler Verabreichung erwünscht ist.
  • Ein weiterer Ansatz zur Stabilisierung von Proteinarzneimitteln zur oralen sowie parenteralen Verabreichung umfasst den Einschluss des therapeutischen Wirkstoffs in Liposomen. Eine Zusammenfassung dieses Verfahrens findet sich in Y. W. Chien, New Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, New York, NY, USA (1992). Liposom-Protein-Komplexe sind physikalische Gemische; ihre Verabreichung führt zu unregelmäßigen und unvorhersagbaren Ergebnissen. Ungewünschte Akkumulierung der Proteinkomponente in bestimmen Organen wurde bei der Verwendung solcher Liposom-Protein-Komplexe beobachtet. Neben diesen Faktoren gibt es auch in Zusammenhang mit der Verwendung von Liposomen weitere Nachteile, wie beispielsweise Kosten, schwierige Herstellungsverfahren, die komplexe Gefriertrocknungszyklen erfordern, und Lösungsmittelunverträglichkeiten. Außerdem wurden geänderte Biodistribution und Antigenitätsprobleme als einschränkende Faktoren bei der Entwicklung von klinisch nützlichen liposomalen Formulierungen angeführt.
  • Die Verwendung von "Proteinoiden" wurden vor kurzem beschrieben (N. Santiago, S. J. Milstein, T. Rivera, E. Garcia, T. C. Chang, R. A. Baughman und D. Bucher, Oral Immunization of Rats with Influenza Virus M Protein (M1) Microspheres, Abstract Nr. A 221, Proc. Int. Symp. Control Rel. Bioac. Mater 19, 116 (1992)). Die orale Verabreichung von verschiedenen Klassen von Therapeutika unter Verwendung dieses Systems wurde beschrieben, das das Arzneimittel von Interesse in einer Polymerhülle eingekapselt wurde, die aus stark verzweigten Aminosäuren bestand. Wie dies bei Liposomen der Fall ist, sind die Arzneimittel nicht chemisch an die Proteinoidhülle gebunden, weshalb das Arzneimittel aus den Dosierungsformkomponenten austreten kann.
  • Ein Peptid, auf das sich viel Synthesearbeit sowie zahlreiche Anstrengungen in Bezug auf Verbesserung seiner Verabreichung und Bioassimilierung konzentriert haben, ist Insulin.
  • Die Verwendung von Insulin zur Behandlung von Diabetes reicht bis 1922 zurück, als Banting et al. (Pancreatic Extracts in the Treatment of Diabetes Mellitus, Can. Med. Assoc. J. 12, 141–146 (1922)) zeigten, dass der aktive Extrakt von dem Pankreas in Hunden mit Diabetes Wirkung aufweist. Die Behandlung von Diabetespatienten im gleichen Jahr mit Pankreasextrakten führte zu einer dramatischen und lebensrettenden klinischen Verbesserung. Für eine umfassende Genesung sind tägliche Insulininjektionen erforderlich.
  • Das Insulinmolekül besteht aus zwei Aminosäureketten, die durch Disulfidbindungen verbunden sind; das Molekulargewicht von Insulin beträgt etwa 6.000. Die β-Zellen der Langerhansschen Inseln sekretieren einen einkettigen Vorläufer von Insulin, der als Proinsulin bekannt ist. Die Proteolyse von Proinsulin führt zur Entfernung von vier basischen Aminosäuren (Nr. 31, 32, 64 und 65 in der Proinsulinkette: Arg, Arg, Lys bzw. Arg) und des verbindenden ("C-")Peptids. Im resultierenden zweikettigen Insulinmolekül weist die A-Kette Glycin am Aminoterminus auf, und die B-Kette weist Phenylalanin am Aminoterminus auf.
  • Insulin kann als Monomer, Dimer oder Hexamer aus drei der Dimere vorliegen. Das Hexamer ist mit zwei Zn2+-Atomen koordiniert. Die biologische Aktivität ruht im Monomer. Obwohl bis vor kurzem fast ausschließlich Rinder- und Schweineinsulin zur Behandlung von Diabetes bei Menschen verwendet wurde, sind zahlreiche Unterschiede im Insulin verschiedener Spezies bekannt. Schweineinsulin ist dem menschlichen Insulin am ähnlichsten und unterscheidet sich nur dadurch, dass es einen Alanin- anstelle eines Threoninrestes am C-Terminus der B-Kette aufweist. Trotz dieser Unterschiede weist das Insulin fast aller Säugetiere vergleichbare spezifische Aktivität auf. Bis vor kurzem stellten Tierextrakte das gesamte Insulin dar, das zur Behandlung der Krankheit verwendet wurde. Mit dem Durchsetzen der Rekombinati onstechnologie ist es nun möglich, menschliches Insulin (z.B. HumulinTM-Insulin, im Handel erhältlich von Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA) im kommerziellen Stil herzustellen.
  • Obwohl Insulin schon mehr als 70 Jahre zur Behandlung von Diabetes eingesetzt wird, gab es bis auf zwei vor kurzem erschienene Publikationen nur wenige Studien zur ihrer Formulierungsstabilität (J. Brange, L. Langkjaer, S. Havelund und A. Vølund, Chemical Stability of Insulin, I. Degradation During Storage of Pharmaceutical Preparations, Pharm. Res. 9, 715–726 (1992); und J. Brange, S. Havelund und P. Hougaard, Chemical Stability of Insulin, 2. Formulation of Higher Molecular Weight Transformation Products During Storage of Pharmaceutical Preparations, Pharm. Res. 9, 727–734 (1992)). In diesen Publikationen beschreiben die Autoren die chemische Stabilität von mehreren Insulinpräparaten unter verschiedenen Temperatur- und pH-Bedingungen umfassend. Frühere Berichte konzentrierten sich fast ausschließlich auf die biologische Wirksamkeit als Maß der Insulinformulierungsstabilität. Die Entwicklung mehrerer neuer und leistungsstarker Analyseverfahren – diskontinuierliche Gelelektrophorese, Größenausschlusschromatographie und HPLC – ermöglicht eine detaillierte Untersuchung des chemischen Stabilitätsprofils von Insulin. Frühe chemische Untersuchungen der Insulinstabilität waren schwierig, weil das umkristallisierte Insulin, das untersucht wurde, eine Reinheit von nicht mehr als 80–90% aufwies. Seit kurzem gibt es Einkomponenteninsulin mit hoher Reinheit. Dieses Einkomponenteninsulin enthält Verunreinigungen nur in Mengen, die durch derzeitige Analyseverfahren nicht nachweisbar sind.
  • Formuliertes Insulin neigt zu zahlreichen Arten von Abbau. Nichtenzymatische Desamidierung findet statt, wenn eine Seitenkettenamidgruppe von einem Glutaminyl- oder Asparaginylrest zu einer freien Carbonsäure hydrolysiert wird. Es gibt sechs mögliche Stellen für solch eine Desamidierung: GlnA5, GlnA15, AsnA18, AsnA21, AsnB3 und GlnB4. Veröffentlichte Berichte lassen vermuten, dass die drei Asn-Reste anfälliger für solche Reaktionen sind.
  • Brange et al. (ibd.) berichteten, dass Insulin unter sauren Bedingungen rasch durch extensive Desamidierung an AsnA21 abgebaut wird. Im Gegensatz dazu findet die Desamidierung in neutralen Formulierungen bei AsnB3 und viel langsamer statt, unabhängig von der Insulinkonzentration und der Ursprungsspezies des Insulins. Temperatur und Formulierungsart spielen jedoch eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Hydrolysegeschwindigkeit an B3. Die Hydrolyse an B3 ist beispielsweise minimal, wenn das Insulin kristallin und nicht amorph ist. Anscheinend verlangsamt die reduzierte Flexibilität (tertiäre Struktur) in der kristallinen Form die Reaktionsgeschwindigkeit. Eine Stabilisierung der tertiären Struktur durch die Inkorporation von Phenol in neutrale Formulierungen führt zu verringerten Desamidierungsgeschwindigkeiten.
  • Neben den hydrolytischen Abbauprodukten in Insulinformulierungen werden auch Transformationsprodukte mit hohem Molekulargewicht gebildet. Brange et al. zeigten durch eine Größenausschlusschromatographie, dass die wichtigsten Produkte, die bei der Lagerung von Insulinformulierungen zwischen 4 und 45°C gebildet wurden, kovalente Insulindimere sind. In Formulierungen, die Protamin enthalten, werden auch kovalente Insulinprotaminprodukte gebildet. Die Formulierungsgeschwindigkeit von Insulindimer- und Insulinprotaminprodukten wird durch die Temperatur deutlich beeinflusst. Bei menschlichem oder Schweineinsulin (reguläres N1-Präparat) nimmt die Dauer der Bildung von 1% hochmolekularen Produkten von 154 Monaten auf 1,7 Monate bei 37°C im Vergleich zu 4°C ab. Bei Zinksuspensionspräparaten von Schweineinsulin würde die gleiche Transformation bei 4°C 357 Monate, bei 37°C aber nur 0,6 Monate dauern.
  • Diese Arten von Insulinabbau können für Diabetiker von großer Bedeutung sein. Obwohl die Bildung von hochmolekularen Produkten im Allgemeinen langsamer verläuft als die Bildung von oben beschriebenen hydrolytischen (chemischen) Abbauprodukten, können die Auswirkungen schwerwiegender sein. Es gibt überzeugende Beweise dafür, dass das Auftreten von immunologischen Antworten auf Insulin von der Gegenwart von kovalenten Insulinaggregate resultieren könnte (D. C. Robbins, S. M. Cooper, S. E. Fineberg und P. M. Mead, Antibodies to Covalent Aggregates of Insulin in Blood of Insulin-Using Diabetic Patients, Diabetes 36, 838–841 (1987); M. Maislos, P. M. Mead, D. H. Gaynor und D. C. Robbins, The Source of Circulating Aggregate of Insulin in Type I Diabetic Patients is Therapeutic Insulin, J. Clin. Invest. 77, 717–723 (1986); und R. E. Ratner, T. M. Phillips und M. Steinen, Persistent Cutaneous Insulin Allergy Resulting from High Molecular Weight Insulin Aggregates, Diabetes 39, 728–733 (1990)). Ganze 30% der Diabetiker, die Insulin erhalten, weisen spezifische Antikörper gegen kovalente Insulindimere auf. Bei nur 2% wurde berichtet, dass die Gegenwart von kovalenten Insulindimeren in allergischen Patienten eine hochsignifikante Antwort in der Form von Lymphozytenstimulation auslöst. Die Antworten waren nicht signifikant, wenn der Dimergehalt im Bereich von 0,3–0,6% lag. Folglich wird empfohlen, den Gehalt an kovalenten Insulindimeren in der Formulierung unter 1% zu halten, um klinische Manifestationen zu vermeiden.
  • Im Handel sind verschiedene Insulinformulierungen erhältlich; obwohl die Stabilität so weit verbessert wurde, dass es nicht länger notwendig ist, alle Formulierungen kühl zu lagern, besteht immer noch Bedarf an Insulinformulierungen mit erhöhter Stabilität. Ein modifiziertes Insulin, das nicht zur Bildung von hochmolekularen Produkten neigt, würde einen bedeutenden Fortschritt in der Pharmazeutik und Medizin darstellen, und Modifikationen, die diese Stabilität bereitstellen (und außerdem eine orale Verfügbarkeit von Insulin ermöglichen), würden einen wichtigen Beitrag zur Behandlung von Diabetes darstellen.
  • Neben der In-vivo-Verwendung von Polypeptiden und Proteinen als therapeutische Wirkstoffe finden Polypeptide und Proteine auch wesentliche und vermehrte Verwendung in Anwendungen als diagnostische Reagenzien. Bei vielen solchen Anwendungen werden Polypeptide und Proteine in Lösungsumgebungen verwendet, worin die (Poly-)Peptide und Proteine, wie z.B. Enzyme, Peptid- und Proteinhormone, Antikörper, Enzym-Protein-Konjugate für Immunassays, Antikörper-Hapten-Konjugate, Virusproteine, wie z.B. jene, die in zahlreichen Testverfahren zur Diagnose oder zum Screenen von Krankheiten wie AIDS, Hepatitis und Rubella verwendet werden, Peptid- und Proteinwachstumsfaktoren, die beispielsweise in Gewebekulturen verwendet werden, Enzyme aus der klinischen Chemie und unlösliche Enzyme, wie z.B. jene der Lebensmittelindustrie, zu thermischem und enzymatischem Abbau neigen. Ein weiteres spezifisches Beispiel ist alkalische Phosphatase, die gerne in Sets zur kolorimetrischen Detektion eines Antikörpers oder Antigens in biologischen Flüssigkeiten als Reagens eingesetzt wird. Obwohl solch ein Enzym im Handel in verschiedenen Formen erhältlich ist, einschließlich freier Enzyme und Antikörperkonjugate, ist seine Lagerstabilität und Löslichkeit häufig eingeschränkt. Folglich werden Konjugate von alkalischer Phosphatase oft gefriergetrocknet, und Additive, wie z.B. Rinderserumalbumin und Tween 20, werden eingesetzt, um die Stabilität der Enzympräparate zu verlängern. Solche Ansätze sind zwar in manchen Fällen vorteilhaft, um die Resistenz gegen den Abbau der Polypeptid- und Proteinwirkstoffe zu fördern, bringen jedoch in Bezug auf ihre allgemeine Anwendbarkeit mehrere Unzulänglichkeiten mit sich.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Polymer-Peptid-Konjugate und -Formulierungen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung.
  • Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung in einem allgemeinen Aspekt in Bezug auf die Zusammensetzung kovalent konjugierte Peptidkomplexe, worin das Peptid kovalent an ein oder mehrere Moleküle eines Polymers gebunden ist, das als integralen Teil eine hydrophile Gruppierung umfasst, wie beispielsweise ein lineares Polyalkylenglykol, und worin das Polymer eine lipophile Gruppierung als integralen Teil umfasst.
  • In einem speziellen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine physiologisch aktive Peptidzusammensetzung, die ein physiologisch aktives Peptid umfasst, dass kovalent an ein Polymer gebunden ist, das (i) eine lineare Polyalkylenglykolgruppierung und (ii) eine lipophile Gruppierung umfasst, worin das Peptid, die lineare Polyalkylenglykolgruppierung und die lipophile Gruppierung in Bezug auf die Konformation so zueinander angeordnet sind, dass das physiologisch aktive Peptid in der physiolo gisch aktiven Peptidzusammensetzung im Vergleich zum physiologisch aktiven Peptid alleine (d.h. in unkonjugierter Form ohne daran gebundenes Polymer) erhöhte In-vivo-Resistenz gegen enzymatischen Abbau aufweist.
  • Der Begriff "Peptid" wird hierin sehr allgemein verwendet und umfasst Polypeptide per se mit Molekulargewichten von bis zu etwa 10.000 sowie Proteine mit Molekulargewichten von mehr als 10.000, worin die Molekulargewichte zahlenmittlere Molekulargewichte darstellen. Der Begriff "kovalent gebunden" bedeutet hierin, dass die spezifizierten Gruppierungen entweder direkt kovalent aneinander gebunden sind oder dass sie durch eine oder mehrere dazwischenliegende Gruppierungen, wie z.B. eine Brücke, einen Spacer oder eine oder mehrere Bindungsgruppierungen, indirekt kovalent aneinander gebunden sind. Der Begriff "konjugativ gebunden" bedeutet, dass die spezifizierten Gruppierungen entweder kovalent aneinander gebunden sind oder nichtkovalent aneinander gebunden sind, beispielsweise durch eine Wasserstoffbrückenbindung, ionische Bindung, Van-der-Waals-Kräfte usw.
  • Die Erfindung umfasst somit unterschiedliche Zusammensetzungen für therapeutische (In-vivo-)Anwendungen, worin die Peptidkomponente des konjugierten Peptidkomplexes ein physiologisch aktives, oder bioaktives, Peptid ist. In solchen peptidhältigen Zusammensetzungen kann die Konjugation der Peptidkomponente an das Polymer, das hydrophile und lipophile Gruppierungen umfasst, durch direkte kovalente Bindung oder indirekte Bindung (durch geeignete Spacer-Gruppen) erfolgen, und die hydrophilen und lipophilen Gruppierungen können auch in der polymeren Konjugationsstruktur auf geeignete Weise zueinander strukturell angeordnet sein, wozu direkte oder indirekte kovalente Bindung zählen. Somit kann in einer weitgefassten Umsetzung der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl von Peptidspezies eingesetzt werden, je nach gewünschter therapeutischer Endanwendung.
  • In einem weiteren Aspekt können kovalent gebundene Peptidzusammensetzungen, wie beispielsweise die oben beschriebenen, Peptidkomponenten nutzen, die für diagnostische oder In-vitro-Anwendungen bestimmt sind, worin das Peptid beispielsweise ein diagnostisches Reagens, ein Komplement eines diagnostischen Konjugats für Immunassays oder andere diagnostische oder Nicht-In-vivo-Anwendungen sein kann. Bei solchen nichttherapeutischen Anwendungen stellen die Peptidkomplexe der Erfindung äußerst nützliche stabilisierte Zusammensetzungen dar, die beispielsweise in kompatiblen Lösungsmitteln oder anderen Formulierungen auf Lösungsbasis formuliert werden können, um stabile Zusammensetzungsformen bereitzustellen, die erhöhte Resistenz gegen Abbau aufweisen.
  • In den oben genannten therapeutischen und nichttherapeutischen (z.B. diagnostischen) Anwendungen betrifft die vorliegende Erfindung ein einem allgemeinen Aspekt in Bezug auf die Zusammensetzung kovalent konjugierte Peptidkomplexe, worin das Peptid kovalent an eine oder mehrere Moleküle eines Polymers gebunden ist, wobei das Polymer als integralen Teil eine hydrophile Gruppierung, z.B. eine Polyalkylenglykolgruppierung, und eine lipophile Gruppierung, z.B. eine Fettsäuregruppierung, umfasst. In einem bevorzugten Aspekt kann das Peptid durch kovalente Bindung an ein oder mehrere Moleküle eines linearen Polyalkylenglykolpolymers kovalent konjugiert sein, das als integralen Teil eine lipophile Gruppierung, z.B. eine Fettsäuregruppierung, aufweist.
  • In einem weiteren allgemeinen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung nichtkovalent konjugierte Peptidkomplexe, worin das Peptid nichtkovalent mit einem oder mehreren Molekülen eines Polymers assoziiert ist, das als integralen Teil eine hydrophile Gruppierung, wie z.B. eine Polyalkylenglykolgruppierung, und eine lipophile Gruppierung, wie z.B. eine Fettsäuregruppierung, umfasst. Das Polymer kann unterschiedliche Strukturen und Anordnungen aufweisen, ähnlich wie in der obigen Beschreibung des Polymers in den kovalent konjugierten Peptidkomplexen, wobei das Peptid zwar nicht auf kovalente Weise an das/die Polymermolekül(e) gebunden ist, aber trotzdem mit dem Polymer assoziiert ist, beispielsweise durch assoziative Bindung, wie z.B. Wasserstoffbrückenbindung, ionische Bindung oder Komplexbildung, Van-der-Waals-Bindung, Mizelleneinkapselung oder Assoziation (des spezifischen Peptids) usw.
  • Solche nichtkovalenten Assoziationen einer Peptidkomponente und einer oder mehrerer Polymergruppierungen kann beispielsweise eine Peptidkomponente für therapeutische (z.B. In-vivo-)Anwendungen sowie nichttherapeutische Peptidkomponenten, z.B. für diagnostische oder andere (In-vitro-)Anwendungen, nutzen.
  • In solch assoziativ konjugierten Peptidzusammensetzungen kann die Polymerkomponente auf geeignete Weise konstruiert, modifiziert oder auf geeignete Weise funktionalisiert werden, um ihr die Fähigkeit zur assoziativen Konjugation auf selektive Weise zu verleihen (beispielsweise um dem Polymer gegenüber dem Peptid Wasserstoffbrückenbindungsfähigkeit zu verleihen), und zwar durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren.
  • Andere Aspekte, Merkmale und Modifikationen der Erfindung sind aus der nachfolgenden Offenbarung und den beiliegenden Ansprüchen ersichtlich.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Diagramm der Serumglucose, in mg/dl, als Funktion der Zeit, in Minuten, bei der Verabreichung von Insulin per se und in komplexierten Formen.
  • 2 ist ein Diagramm der Serumglucose, in mg/dl, als Funktion der Zeit, in Stunden, bei der Verabreichung von Insulin in verschiedenen Formen.
  • 3 ist ein Diagramm der Chymotrypsinabbaus von Insulin und OT-Insulin als Funktion der Zeit.
  • 4 ist ein Diagramm des Serumcalciums in Ratten als Funktion der Zeit, wobei den Ratten Polymer-Calcitonin-Konjugate oral verabreicht wurden.
  • 5 ist ein Balkendiagramm, das die Serumcalciumwerte in Ratten als Funktion der Zeit zeigt, wobei den Ratten Polymer-Calcitonin-OT1-ct- oder OT2-ct-Polymer-Calcitonin-Konjugate oral verabreicht wurden.
  • 6 zeigt ein Balkendiagramm der Auswirkungen von Polymer-Insulin in einem Modell mit diabetischen Ratten.
  • 7 ist ein Diagramm, das die Auswirkungen von oral verabreichtem 001-Insulin in Javaneraffen als prozentuelle Änderung der Blutglucosewerte im Laufe der Zeit zeigt.
  • 8 ist ein Balkendiagramm, das die Auswirkungen von oral verabreichtem 001-Insulin in Javaneraffen als Wirkung der Dosis im Laufe der Zeit zeigt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die Modifikation von Peptiden mit nichttoxischen, nichtimmunogenen Polymeren kann bestimmte Vorteile mit sich bringen. Wenn Modifikationen so durchgeführt werden, dass die Produkte (Polymer-Peptid-Konjugate) ihre gesamte oder einen Großteil ihrer biologischen Aktivitäten beibehalten, können die folgenden Eigenschaften erhalten werden: die Epithelpenetrationsfähigkeit kann erhöht werden; das modifizierte Peptid kann vor proteolytischem Abbau und daraus folgendem Aktivitätsverlust geschützt werden; die Affinität für endogene Transportsysteme kann verbessert werden; chemische Stabilität gegenüber der Azidität im Magen kann verliehen werden; das Gleichgewicht zwischen Lipophilie und Hydrophobie der Polymere kann optimiert werden. Proteinhältige Substanzen, welche die oben beschriebenen verbesserten Eigenschaften aufweisen, können nach oraler oder parenteraler Verabreichung als Substitutionstherapie effektiv sein. Andere Verabreichungswege, wie z.B. nasal und transdermal, sind bei Verwendung des modifizierten Peptids ebenfalls möglich.
  • Bei nichttherapeutischen Anwendungen bringt die Konjugationsstabilisation von diagnostischen und/oder Reagensspezies von Peptiden, einschließlich Vorläufer und Zwischenprodukte von Peptiden oder anderen Produkten zur Endanwendung, entsprechende Vorteile mit sich, wenn die Peptidkomponente gemäß der vorliegenden Erfindung kovalent an ein Polymer gebunden ist. Das resultierende kovalent konju gierte Peptid ist resistent gegenüber Abbaufaktoren in der Umgebung, einschließlich lösungsmittel- oder lösungsvermittelter Abbauprozesse. Aufgrund der so erhöhten Abbauresistenz kann die Lagerbeständigkeit des aktiven Peptidbestandteils deutlich erhöht werden, was gleichzeitig Verlässlichkeit der peptidhältigen Zusammensetzung bei der spezifischen Endanwendung mit sich bringt.
  • Die kovalente Konjugation von Peptiden mit Polymeren gemäß der vorliegenden Erfindung minimiert den hydrolytischen Abbau effektiv und führt zu einer In-vitro- und In-vivo-Stabilisierung.
  • Analoge Vorteile werden beobachtet, als therapeutische, diagnostische oder Reagensspezies-Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung nichtkovalent, assoziativ mit einem oder mehreren Polymermolekülen konjugiert werden.
  • Wird Insulin, das kovalent an die Polymerkomponente gebunden ist, als veranschaulichendes Beispiel der Erfindung verwendet, dann ermöglicht die Art der Konjugation, die spaltbare kovalente chemische Bindungen umfasst, die Regelung der Zeit, die notwendig ist, um das Polymer vom Peptid (Insulin) abzuspalten. Diese Spaltung kann durch enzymatische oder chemische Mechanismen erfolgen. Der konjugierte Polymer-Peptid-Komplex ist von sich aus aktiv. Die volle Aktivität wird erreicht, nachdem das Polymer enzymatisch vom Peptid abgespalten wurde. Außerdem ermöglicht die chemische Modifikation die Penetration des angebundenen Peptids, z.B. Insulin, durch Zellmembranen. In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die membranpenetrationsfördernden Eigenschaften von lipophilen Fettsäureresten in den Körper des konjugierenden Polymers inkorporiert. In diesem Zusammenhang verbessern, wenn wieder Insulin als Peptid von Interesse verwendet wird, Fettsäurepolymerderivate von Insulin die Darmresorption von Insulin: die Carbamylierung der Aminogruppen von PheB1 und LysB29 mit langkettigen Fettsäurepolymeren ergibt Verbindungen, die einen gewissen Grad an hypoglykämischer Aktivität bereitstellen. Diese Derivatisierung erhöht die Stabilität von Insulin in der Darmschleimhaut und seine Absorption im Dünndarm.
  • Obwohl in der nachfolgenden Beschreibung vorwiegend auf die Verwendung von Insulin als Peptidkomponente in verschiedenen Zusammensetzungen und Formulierungen der Erfindung Bezug genommen wird, ist die Nützlichkeit der Erfindung nicht darauf beschränkt, sondern umfasst auch jede beliebige Peptidspezies, die kovalent oder assoziativ gemäß der Erfindung konjugiert werden kann, einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, die folgenden Peptidspezies: Calcitonin, ACTH, Glucagon, Somatostatin, Somatotropin, Somatomedin, Parathormon, Erythropoietin, im Hypothalamus gebildeter Releasingfaktor, Prolactin, Thyreotropin, Endorphine, Antikörper, Hämoglobin, lösliches CD-4, Gerinnungsfaktoren, Gewebeplasminogenaktivator, Enkephaline, Vasopressin, nicht natürlich vorkommende Opioide, Superoxiddismutase, Interferon, Asparaginase, Arginase, Arginindesaminase, Adenosindesaminase, Ribonuclease, Trypsin, Chemotrypsin und Papain, alkalische Phosphatase und andere geeignete Enzyme, Hormone, Proteine, Polypeptide, Enzym-Protein-Konjugate, Antikörper-Hapten-Konjugate, virale Epitope usw.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von geeigneten Polymeren zur Konjugation mit Peptiden, um die oben angeführten gewünschten Eigenschaften zu erreichen. Ein weiteres Ziel besteht in der Verwendung solcher modifizierter Peptide für eine anhaltende In-vivo-Abgabe des Peptids. Ein weiteres Ziel besteht in der Verwendung der Technologie zur oralen Zufuhr von Peptiden in ihrer aktiven Form.
  • Ein weiteres Ziel besteht in der Anwendung von assoziativ konjugierten Peptiden zur Verwendung in Immunassays, diagnostischen und anderen nichttherapeutischen (z.B. In-vitro-)Anwendungen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von stabilisierend konjugierten Peptidzusammensetzungen, einschließlich kovalent gebundener Zusammensetzungen, die auf unterschiedliche Weise für In-vivo- sowie Nicht-In-vivo-Anwendungen geeignet sind, und in der alternativen Bereitstellung von nichtkovalenten, assoziativ konjugierten Peptidzusammensetzung, die auf unterschiedliche Weise für In-vivo- sowie Nicht-In-vivo-Anwendungen geeignet sind.
  • Ein einzelnes Polymermolekül kann zur Konjugation mit zahlreichen Peptidspezies eingesetzt werden, und es kann bei der allgemeinen Umsetzung der Erfindung von Vorteil sein, verschiedene Polymere als Konjugationsmittel für ein vorgegebenes Peptid zu verwenden; Kombinationen solcher Ansätze können ebenfalls verwendet werden. Außerdem können stabilisierend konjugierte Peptidzusammensetzungen sowohl bei In-vivo- als auch Nicht-In-vivo-Anwendungen von Nutzen sein. Ferner zeigt sich, dass das/die konjugierenden Polymer(e) beliebige andere Gruppen, Gruppierungen oder konjugierte Spezies nutzen können, die für die Endanwendungen geeignet sind. Beispielsweise kann es in manchen Anwendungen von Nutzen sein, eine funktionelle Gruppierung kovalent an das Polymer zu binden, die dem Polymer UV-Abbauresistenz oder Antioxidations- oder andere Eigenschaften verleiht. Um ein weiteres Beispiel anzuführen, kann es bei manchen Anwendungen von Vorteil sein, das Polymer zu funktionalisieren, um es reaktiv oder vernetzbar zu machen, um verschiedene Eigenschaften oder Merkmale des gesamten konjugierten Materials zu verbessern. Demgemäß kann das Polymer jede beliebige Funktionalität, Grundgruppen, Bindungen oder andere Bestandteilstrukturen aufweisen, welche die Wirksamkeit der konjugierten Zusammensetzung in Bezug auf ihren Zweck nicht beeinträchtigt. Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Offenbarung und den beiliegenden Ansprüchen ersichtlich.
  • Veranschaulichende Polymere, die nützlich sind, um diese erwünschten Eigenschaften zu erreichen, werden nachstehend unter Bezugnahme auf ein Beispiel für ein Reaktionsschema erläutert. Bei Anwendungen von kovalent gebundenen Peptiden können die Polymere funktionalisiert und dann an eine oder mehrere freie Aminosäuren des Peptids oder der Peptide gebunden werden, um labile Bindungen zu bilden, die eine Beibehaltung der Aktivität bei intakten labilen Bindungen ermöglichen. Eine Entfernung der Bindung durch chemische Hydrolyse und Proteolyse fördert dann die Peptidaktivität.
  • Die in der Erfindung verwendeten Polymere können in ihre Moleküle Bestandteile, wie z.B. Speisefettsäuren (lipophiles Ende), Polyethylenglykole (wasserlösliches Ende), annehmbare Zuckergruppierungen (Rezeptorwechselwirkungsende) und Spacer zur Peptidbindung, geeignet inkorporieren. Von den möglichen Polymeren sind Polysorbate insbesondere bevorzugt und werden gewählt, um unterschiedliche Ausführungsformen der Erfindung in der nachfolgenden Erläuterung darzulegen. Der Schutzumfang dieser Erfindung ist natürlich nicht auf Polysorbate eingeschränkt, auch verschiedene andere Polymere mit den oben beschriebenen Gruppierungen können in der allgemeinen Umsetzung dieser Erfindung zweckdienlich eingesetzt werden. Manchmal ist es wünschenswert, eine dieser Gruppierungen zu eliminieren und andere in der Polymerstruktur zu behalten, ohne die Ziele zu beeinträchtigen. Wenn dies wünschenswert ist, sind die Gruppen, die ohne Beeinträchtigung der Ziele und Vorteile der Erfindung eliminiert werden können, vorzugsweise die Zuckerund/oder Spacer-Gruppierungen.
  • Vorzugsweise werden Polymere verwendet, deren Molekulargewicht zwischen 500 und 10.000 Dalton liegt.
  • Bei der Umsetzung der Erfindung können Polyalkylenglykolreste von C2-C4-Alkylpolyalkylenglykolen, vorzugsweise Polyethylenglykol (PEG), vorteilhafterweise in die Polymersysteme von Interesse inkorporiert werden.
  • Die Gegenwart dieser PEG-Reste verleiht dem Polymer und den entsprechenden Polymer-Peptid-Konjugaten hydrophile Eigenschaften. Die Erfindung umfasst deshalb Polymer-Peptid-Produkte, worin das Peptid, z.B. Insulin, mit entweder dem hydrophilen oder hydrophoben Rest des Polymers konjugiert ist. Der Fettsäureanteil des Polymers wird so bereitgestellt, dass er mit dem hydrophoben Bereich des Peptids assoziiert, wodurch eine Aggregation in Lösung verhindert wird. Die resultierenden Polymer-Peptid-Konjugate sind folglich: stabilisiert (gegenüber chemischer und enzymatischer Hydrolyse); wasserlöslich, aufgrund des PEG-Rests; und dank der Wechselwirkungen zwischen Fettsäure und hydrophoben Bereich nicht anfällig für Aggregationen.
  • Polyalkylenglykolderivatisierung bringt bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung eine Reihe von vorteilhaften Eigenschaften bei der Formulierung von Polymer- Peptid-Konjugaten mit sich, und zwar in Zusammenhang mit den folgenden Eigenschaften von Polyalkylenglykolderivaten: Verbesserung der Wasserlöslichkeit bei gleichzeitiger Vermeidung von antigenen oder immunogenen Reaktionen; hoher Grad an Biokompatibilität; keine biologischer Abbau der Polyalkylengylkolderivate in vivo; und leichtere Exkretion durch lebende Organismen.
  • Die bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendeten Polymere umfassen somit lipophile und hydrophile Gruppierungen, wodurch das resultierende Polymer-Peptid-Konjugate sowohl bei oraler und parenteraler Verabreichung als auch bei anderer physiologischer Verabreichung äußerst effektiv (bioaktiv) und bei nichtphysiologischen Anwendungen äußerst effektiv ist.
  • Nachstehend findet sich die Formel eines kovalent gebundenen Konjugats als veranschaulichendes Beispiel für Polymer-Peptid-Konjugate der vorliegenden Erfindung, das nachstehend als Konjugat 3 bezeichnet wird, worin "Ins" für Insulin steht und die spezifischen Werte für m, n, w, x und y in der nachfolgenden Erläuterung beschrieben werden.
  • Konjugat 3:
    Figure 00190001
  • Im Konjugat 3 ist der lipophile Fettsäurerest am nächsten zur Verknüpfungsstelle mit Insulin, und die hydrophile PEG-Region ist weit von der Verknüpfungsstelle entfernt, bei der es sich um eine Carbamatbindung handelt.
  • Im Konjugat 3 ist die Verknüpfungsstelle der Carbamatbindung zwischen den Polymeren vorzugsweise die Aminfunktion von GlyA1 Es ist möglich, wie schon erwähnt, dass mehr als eine Polymereinheit an jedes Molekül eines Peptids gebunden ist. Wenn beispielsweise ein zweites Polymer an Insulin gebunden ist, handelt es sich bei der Verknüpfungsstelle vorzugsweise um die Aminfunktion von PheB1. Zumindest in der Theorie könnte ein drittes Polymer an die Aminfunktion von LysB29 gebunden sein. Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, dass zwei Polymeranbindungen pro Insulinmolekül den praktischsten Derivatisierungsgrad darstellen, der auf vernünftige Weise erreichbar ist.
  • Bei der allgemeinen Umsetzung der Erfindung sind verschiedene Verfahren zur Bindung der Polymere an das Peptid verfügbar und werden hierin im Folgenden genauer diskutiert. Bei der Arbeit mit Proteinen und Polypeptiden sollte bedacht werden, dass bestimmte Restgruppen im Peptid aufgrund ihrer biologischen Gesamtintegrität von Bedeutung sind. Es ist wichtig, ein geeignetes Kopplungsmittel auszuwählen, das solche Reste nicht übermäßig beeinträchtigt. In manchen Fällen kann es schwierig sein, eine Bindung und folglich eine Maskierung der Aktivität dieser wichtigen Reste zu vermeiden, aber ein Teil der Aktivität kann gegen erhöhte Stabilität getauscht werden, wobei die vorhandenen vorteilhaften Eigenschaften aufrechterhalten bleiben. Bei In-vivo-Anwendungen kann somit beispielsweise die Dosierungshäufigkeit verringert werden, was zu geringeren Kosten und besserer Einhaltung durch Patienten führt.
  • Die bei der Protein/Peptid-Konjugation gemäß der Erfindung verwendeten Polymere sind so entworfen, dass sie gute physikalische Eigenschaften aufweisen, die es ihnen ermöglichen, die gewünschten Ziele zu erreichen. Absorptionsverstärker ermöglichen zwar eine Penetration von Peptiden durch die Zellmembran, verbessern aber die Stabilitätseigenschaften der Peptide nicht, und In-vivo-Anwendungen können deshalb die Polymer-Peptid-Konjugate der Erfindung in Formulierungen, denen solche Penetrationsverstärker fehlen, nutzen. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit die Inkorporation von Fettsäurederivaten in das Polymer, um Penetrationsverstärker nachzuahmen.
  • In den kovalent konjugierten Polymer-Peptid-Konjugaten der vorliegenden Erfindung kann das Peptid mithilfe einer labilen chemischen Bindung kovalent an das wasserlösliche Polymer gebunden werden. Diese kovalente Bindung zwischen dem Peptid und dem Polymer kann durch chemische oder enzymatische Reaktionen gespalten werden. Das Polymer-Peptid-Produkt behält ein akzeptables Ausmaß an Aktivität bei; die volle Aktivität der Peptidkomponente wird erreicht, wenn das Polymer vollständig vom Peptid abgespalten ist. Gleichzeitig sind Teile von Polyethylenglykol im konjugierenden Polymer vorhanden, um dem Polymer-Peptid hohe Wasserlöslichkeit und verlängerte Blutkreislauffähigkeit zu verleihen. Die oben beschriebenen Modifikationen führen zu verbesserter Löslichkeit, Stabilität und Membranaffinitätseigenschaften auf dem Peptid. Dank dieser verbesserten Eigenschaften umfasst die Erfindung die parenterale und orale Verabreichung der aktiven Polymer-Peptid-Spezies und, nach einer hydrolytischen Spaltung, die Bioverfügbarkeit des Peptids per se bei In-vivo-Anwendungen.
    Figure 00210001
    Pr = Peptide, Proteine, Proteinarzneimittel;
    R = Alkyl, C5 bis C18;
    n = 5 bis 120;
    m = 2 bis 15;
  • Figure 00220001
  • Bei der Synthese des Polymers G sollten die Hydroxylgruppierungen auf dem ersten und zweiten Kohlenstoff von Glycerin, z.B. Solketal, geschützt werden, wobei das geschützte Glycerin zuerst mit Estern von Fettsäuren umgesetzt wird, die am terminalen Kohlenstoff der Säure halogeniert wurden. Die verbleibende Hydroxylgruppe wird in einem inerten Lösungsmittel in das Natriumsalz übergeführt und mit dem halogenierten oder tosyliertem Polyethylenglykol umgesetzt, worin ein Ende des Polyethylenglykols als Ester geschützt wurde. Der Glycerinschutz wird entfernt, und die resultierenden zwei freien Hydroxylgruppen werden in die entsprechenden Natriumsalze übergeführt. Diese Salze werden in einem inerten Lösungsmittel mit Polyethylenglykol umgesetzt, das teilweise mit Fettsäuren derivatisiert wurde. Eine Reaktion findet statt, nachdem das freie Hydroxyl in das Tosylat oder Bromit übergeführt wurde.
  • In einem Fall dieser Ausführungsform wird das Polyethylenglykol mit zwei terminalen freien Hydroxylgruppen mit Natriumhydrid in einem inerten Lösungsmittel behandelt. Ein äquivalentes Gewicht eines primären Bromidderivats einer fettsäureähnlichen Gruppierung wird zum Polyethylenglykol-Lösungsmittel-Gemisch zugesetzt. Das gewünschte Produkt wird in einem inerten Lösungsmittel extrahiert und, wenn erforderlich, durch Säulenchromatographie gereinigt.
  • Figure 00220002
  • Wenn eine Carbamatbindung mit dem Polypeptid gebildet werden soll, wird das Carboxyl oder der Ester in eine Hydroxylgruppe übergeführt, und zwar durch ein auf dem Gebiet der Erfindung bekanntes Reduktionsverfahren. HO-(CH2)m-(OC2H4)nXR (Formel 13)
  • Die vorliegende Erfindung stellt Konjugate von biokompatiblen Polymeren mit biologisch aktiven Makromolekülen, diagnostischen Reagenzien usw. bereit, die beispielsweise aus Peptiden, Proteinen, Enzymen, Wachstumshormonen, Wachstumsfaktoren und dergleichen bestehen können. Solche makromolekularen Verbindungen können mit α-Aminosäuren geformt werden, die über eine Amidbindung angebunden sind, um Peptidoligomere und -polymere zu bilden. Je nach Funktionen dieser Substanzen können die Peptidkomponenten Proteine, Enzyme, Wachstumshormone usw. sein. Der Kürze wegen werden diese Substanzen hier kollektiv als Peptide bezeichnet und mit Pr abgekürzt. In allen Fällen enthalten biologisch aktive Peptide freie Amino- oder Carboxylgruppen. Die Bindung zwischen dem Polymer und den Peptiden wird im Allgemeinen durch freie Amino- oder Carboxylgruppen gebildet.
  • Die Peptide, die für die Veranschaulichung hierin gewählt wurden, sind vor allem im Bereich der Medizin, Landwirtschaft, Wissenschaft und Anwendungen im kleinen Rahmen sowie industrielle Anwendungen von Interesse. Diese können Enzyme sein, die in der Substitutionstherapie eingesetzt werden; Hormone zur Förderung von Wachstum bei Tieren oder von Zellwachstum in Zellkulturen; oder aktive proteinhältige Substanzen für verschiedene Zwecke, z.B. Biotechnologie und biologische und medizinische Diagnostik. Zu erwähnende Enzyme sind Superoxiddismutase, Interferon, Asparaginase, Glutamase, Arginase, Arginindesaminase, Adenosindesaminase, Ribonuclease, Trypsin, Chromotrypsin und Papin. Zu erwähnende Peptidhormone sind Insulin, Calcitonin, ACTH, Glucagon, Somatosin, Somatropin, Somatomedin, Parathormon, Erythropoietin, im Hypothalamus gebildeter Releasingfaktor, Prolactin, Thyreotropin, Endorphine, Enkephaline und Vasopressin.
  • Im Allgemeinen können verschiedene Verfahren vorteilhaft eingesetzt werden, um die Stabilitätseigenschaften der Polymer-Peptid-Konjugate der vorliegenden Erfindung zu verbessern, einschließlich der Funktionalisierung des Polymers mit Gruppen mit höherer Hydrolyseresistenz, z.B. die oben genannte Überführung von Estergruppen in Ethergruppen; der Modifikation des HLB-Wertes des konjugierten Polymers je nach Peptid, das durch das Polymer stabilisiert wird; und der Einstellung des Molekulargewichts des Polymers auf einen Wert, der für das Molekulargewicht des Peptids geeignet ist, das durch das Polymer stabilisiert werden soll.
  • Die einzigartige Eigenschaft von Polymeren, die von Polyalkylenglykol stammen und für therapeutische Anwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung von Wert sind, ist ihre allgemeine Biokompatibilität. Die Polymere weisen verschiedene Wasserlöslichkeitseigenschaften auf und sind nicht toxisch. Sie sind nichtantigen, nichtimmunogen und beeinträchtigen die biologischen Aktivitäten von Enzymen nicht. Sie zirkulieren lange im Blut und werden von lebenden Organismen leicht ausgeschieden.
  • Die Produkte der vorliegenden Erfindung erwiesen sich als nützlich beim Erhalt der biologischen Aktivität von Peptiden und können beispielsweise durch Lösen in Wasser oder einem geeigneten flüssigen Medium für eine therapeutische Verabreichung vorbereitet werden. Die Verabreichung erfolgt entweder auf parenteralem oder oralem Weg. Feine kolloidale Suspensionen können für eine parenterale Verabreichung hergestellt werden, um eine Depotwirkung zu erreichen, oder auf oralem Weg verabreicht werden.
  • Im trockenen, gefriergetrockneten Zustand weisen die Peptid-Polymer-Konjugate der vorliegenden Erfindung gute Lagerstabilität auf; Lösungsformulierungen der Konjugate der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls durch gute Lagerstabilität gekennzeichnet.
  • Die therapeutischen Polymer-Peptid-Konjugate der vorliegenden Erfindung können zur Prophylaxe oder Behandlung von Leiden oder Krankheiten eingesetzt werden, bei denen der Peptidbestandteil wirksam ist.
  • Außerdem können die Polymer-Peptid-Konjugate der vorliegenden Erfindung bei der Diagnose von Bestandteilen, Leiden oder Krankheiten in biologischen Systemen oder Proben sowie für Diagnosezwecke in nichtphysiologischen Systemen eingesetzt werden.
  • Ferner können die Polymer-Peptid-Konjugate der vorliegenden Erfindung bei der Prophylaxe oder Behandlung von Leiden oder Krankheiten in Pflanzensystemen von Nutzen sein. Die Peptidkomponente des Konjugats kann beispielsweise insektizide, herbizide, fungizide und/oder pestizide Wirksamkeit aufweisen, die für verschiedene Pflanzensysteme geeignet ist.
  • Und schließlich kann die Peptidkomponente der Konjugate der vorliegenden Erfindung für diagnostische, immunologische und/oder Testzwecke aus Antikörpern bestehen oder alternativ dazu antigenen Charakter aufweisen.
  • In Bezug auf therapeutische Anwendungen umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Tiers, das solch ein Leiden oder solch eine Krankheit aufweist oder latent dafür anfällig ist und solch eine Behandlung nötig hat, umfassend die Verabreichung einer effektiven Menge eines Polymer-Peptid-Konjugats der vorliegenden Erfindung, das in Bezug auf dieses Leiden oder diese Krankheit therapeutisch effektiv ist, an das Tier.
  • Patienten, die mithilfe des Polymer-Peptid-Konjugats der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen sowohl Menschen als auch Tiere (z.B. Vögel, Hunde, Katzen, Kühe, Pferde), vorzugsweise aber Säugetiere und insbesondere Menschen.
  • Je nach dem jeweiligen Leiden oder der jeweiligen Krankheit, die bekämpft werden soll, können Tieren Polymer-Peptid-Konjugate der Erfindung in jeder beliebigen therapeutisch wirksamen und sicheren Dosis verabreicht werden, die von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung leicht und ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden kann.
  • Im Allgemeinen liegen Dosen der Verbindungen der Formel (1), die geeignet sind, um therapeutische Wirkung zu erzielen, im Bereich von 1 Mikrogramm (μg) bis 100 Milligramm (mg) pro Kilogramm Körpergewicht des Rezipienten pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 10 μg bis 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag und insbesondere im Bereich von 10 μg bis 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag. Die gewünschte Dosis besteht vorzugsweise aus zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Subdosen, die in geeigneten Abständen über den Tag verteilt verabreicht werden. Diese Subdosen können in Einheitsdosierungsformen verabreicht werden, die beispielsweise 10 μg bis 1.000 mg, vorzugsweise 50 μg bis 500 mg, insbesondere 50 μg bis 250 mg, des aktiven Bestandteils pro Einheitsdosierungsform umfassen. Alternativ dazu können, wenn es der Zustand des Rezipienten erfordert, die Dosen als kontinuierliche Infusion verabreicht werden.
  • Die Art der Verabreichung und die Dosierungsformen wirken sich natürlich auf die therapeutischen Mengen der Verbindungen aus, die erwünscht und für die vorgegebene Behandlung wirksam sind.
  • Beispielsweise sind oral verabreichte Dosen mit gleichen aktiven Bestandteil typischerweise zumindest zweimal, z.B. 2- bis 10-mal, so groß wie die Dosierungen bei parenteralen Verabreichungsverfahren.
  • Die Polymer-Peptid-Konjugate der vorliegenden Erfindung können sowohl per se als auch in Form von pharmazeutisch annehmbaren Estern, Salzen und anderen physiologisch funktionalen Derivaten davon verabreicht werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem pharmazeutische Formulierungen, für Anwendungen sowohl in der Veterinär- als auch Humanmedizin, die als aktiven Bestandteil ein oder mehrere Polymer-Peptid-Konjugate der Erfindung umfassen.
  • In solchen pharmazeutischen und Medikamentformulierungen wird der aktive Bestandteil vorzugsweise zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern und gegebenenfalls beliebigen anderen therapeutischen Be standteilen verwendet. Der/die Träger müssen in dem Sinne pharmazeutisch annehmbar sein, dass sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für den Rezipienten nicht übermäßig schädlich sind. Der aktive Bestandteil wird in einer Menge bereitgestellt, die effektiv ist, um die gewünschte pharmakologische Wirkung zu erzielen, wie sie oben beschrieben ist, und in einer Menge, die geeignet ist, um die gewünschte tägliche Dosis zu erreichen.
  • Die Formulierungen umfassen solche, die zur parenteralen als auch nichtparenteralen Verabreichung geeignet sind, und spezifische Verabreichungsmodalitäten umfassen orale, rektale, bukkale, topische, nasale, ophthalmische, subkutane, intramuskuläre, intravenöse, transdermale, intrathekale, intraartikuläre, intraarterielle, subarachnoide, bronchiale, lymphatische, vaginale und intrauterine Verabreichung. Formulierungen, die zur oralen und parenteralen Verabreichung geeignet sind, sind bevorzugt.
  • Wenn der Wirkstoff in einer Formulierung verwendet wird, die eine flüssige Lösung umfasst, wird die Formulierung vorteilhafterweise oral oder parenteral verabreicht. Wenn der Wirkstoff in einer flüssigen Suspensionsformulierung oder als Pulver in einer biokompatiblen Trägerformulierung verwendet wird, wird die Formulierung vorteilhafterweise oral, rektal oder bronchial verabreicht.
  • Wenn der Wirkstoff direkt in Form eines pulverisierten Feststoffs verwendet wird, wird der Wirkstoff vorteilhafterweise oral verabreicht. Alternativ dazu kann er bronchial verabreicht werden, und zwar durch Zerstäubung des Pulvers in einem Trägergas, um eine gasförmige Dispersion des Pulvers zu bilden, die vom Patienten aus einem Atemkreislauf eingeatmet wird, der eine geeignete Zerstäubungsvorrichtung umfasst.
  • Die den Wirkstoff der vorliegenden Erfindung umfassenden Formulierungen können gut in Einheitsdosierungsformen vorliegen und durch ein im pharmazeutischen Bereich allgemein bekanntes Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren umfassen im Allgemeinen den Schritt des Assoziierens der aktiven Verbindung(en) mit einem Träger, der einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile darstellt. Typischerweise werden die Formulierungen hergestellt, indem die aktive(n) Verbindung(en) in gleichförmige und enge Assoziation mit einem flüssigen Träger, einem feinverteilten festen Träger oder beiden gebracht wird/werden, und das Produkt dann, falls erforderlich, zu Dosierungsformen aus den gewünschten Formulierungen geformt wird.
  • Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können in Form von separaten Einheiten, wie z.B. Kapseln, Cachets, Tabletten oder Pastillen, die jeweils eine vorgegebene Menge des Wirkstoffs als Pulver oder Granulat enthalten; oder in Form einer Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit oder einer nichtwässrigen Flüssigkeit vorliegen, wie z.B. eines Sirups, eines Elixiers, einer Emulsion oder eines Arzneitranks.
  • Eine Tablette kann durch Pressen oder Formen hergestellt werden, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Zusatzbestandteilen. Gepresste Tabletten können durch Pressen in einer geeigneten Maschine hergestellt werden, wobei die aktive Verbindung in frei fließender Form, z.B. als Pulver oder Granulat, vorliegt, das gegebenenfalls mit einem Bindemittel, Abbaumittel, Gleitmittel, inerten Verdünnen, Tensid oder Austragsmittel vermischt ist. Geformte Tabletten aus einem Gemisch der pulverisierten aktiven Verbindung mit einem geeigneten Träger können durch Formen in einem geeigneten Gerät hergestellt werden.
  • Ein Sirup kann hergestellt werden, indem die aktive Verbindung zu einer konzentrierten wässrigen Lösung von Zucker, z.B. Saccharose, zugesetzt wird, zu der dann noch beliebige Zusatzbestandteile zugesetzt werden können. Solche Zusatzbestandteile können Geschmacksstoffe, geeignete Konservierungsmittel, Mittel zur Verzögerung der Kristallisation des Zuckers und Mittel zur Erhöhung der Löslichkeit eines beliebigen anderen Bestandteils, wie beispielsweise ein Polyhydroxyalkohol, z.B. Glycerin oder Sorbit, sein.
  • Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen am besten ein steriles wässriges Präparat der aktiven Verbindung, die vorzugsweise mit dem Blut des Rezipienten isotonisch ist (z.B. physiologische Kochsalzlösung). Solche Formulierungen können Suspensionsmittel und Verdickungsmittel oder andere Mirkopartikelsysteme umfassen, die dazu dienen, die Verbindung auf Blutkomponenten oder eines oder mehrere Organe auszurichten. Die Formulierungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisform vorliegen.
  • Nasensprayformulierungen umfassen gereinigte wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen mit Konservierungsmitteln und isotonischen Mitteln. Solche Formulierungen werden vorzugsweise auf einen pH und einen isotonischen Zustand eingestellt, der mit den Schleimhautmembranen der Nase kompatibel ist.
  • Formulierungen zur rektalen Verabreichung können in Form eines Zäpfchens mit einem geeigneten Träger, wie z.B. Kakaobutter, gehärteten Fetten oder hydrierter Fettcarbonsäure, vorliegen.
  • Ophthalmische Formulierungen werden mithilfe eines ähnlichen Verfahrens hergestellt wie der Nasenspray, mit der Ausnahme, dass der pH und die isotonischen Faktoren vorzugsweise so eingestellt werden, dass sie den Werten des Auges entsprechen.
  • Topische Formulierungen umfassen die aktive Verbindung in einem oder mehreren Medien, wie z.B. Mineralöl, Petroleum, Polyhydroxyalkoholen oder anderen Basisstoffen, die für topische pharmazeutische Formulierungen verwendet werden, gelöst oder suspendiert.
  • Neben den oben genannten Bestandteilen können die Formulierungen dieser Erfindung außerdem einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile umfassen, die aus Verdünnern, Puffern, Geschmacksstoffen, Abbaumitteln, Tensiden, Verdickungsmitteln, Gleitmitteln, Konservierungsstoffen (einschließlich Antioxidanzien) und dergleichen ausgewählt sind.
  • Bei nichttherapeutischen Anwendungen der vorliegenden Erfindung kann das Polymer-Peptid-Konjugat eine kovalente Bindung oder alternativ dazu eine nichtkovalente Bindung zwischen den Peptid- und Polymerkomponenten aufweisen. Außerdem können assoziativ gebundene Peptid- und Polymerkomponenten bei der Verabreichung von therapeutischen Peptidwirkstoffen verwendet werden, wobei geeignete Verabreichungsverfahren eingesetzt werden, wie sie oben in Zusammenhang mit der veranschaulichenden Erläuterung von kovalent gebundenen Polymer-Peptid-Konjugaten der Erfindung beschrieben wurden.
  • Bei solchen nichttherapeutischen, assoziativ gebundenen Peptid-Polymer-Zusammensetzungen können die Peptid- und Polymer-Komponenten zu Beginn zusammen formuliert werden, um erhöhte Stabilität und Abbauresistenz bereitzustellen; alternativ dazu können diese Komponente beispielsweise separate Teile einer mehrteiligen Zusammensetzung darstellen, die zum Zeitpunkt der Verwendung gemischt wird und in Abwesenheit einer assoziativen Bindung zwischen dem Polymer und dem Peptid im resultierenden Gemisch für raschen Zerfall oder andere Abbaumöglichkeiten anfällig wäre. Ungeachtet der Form der assoziativ gebundenen Peptid-Polymer-Zusammensetzung umfasst die vorliegende Erfindung eine assoziative Bindung, welche einige Eigenschaften oder Aspekte des Peptids verbessert oder seine Nützlichkeit im Vergleich zur Peptidkomponente in Abwesenheit solch eines assoziativen Polymers auf andere Weise erhöht.
  • Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von geeigneten Polymeren zur In-vitro-Stabilisierung von Peptiden in Lösung als bevorzugte veranschaulichende nichttherapeutische Anwendung. Die Polymere können beispielsweise eingesetzt werden, um die thermische Stabilität und die Resistenz gegen enzymatischen Abbau des Peptids zu erhöhen. Eine Erhöhung der thermischen Stabilitätseigenschaften des Peptids durch Konjugation auf die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Weise stellt ein Mittel dar, um Lagerbeständigkeit, Raumtemperaturstabilität und Widerstandsfähigkeit von Diagnose- und Forschungsreagenzien und -sets, z.B. Immunassay-Sets, zu verbessern. Beispielsweise kann alkalische Phosphatase gemäß der Erfindung kovalent oder assoziativ an ein geeignetes Polymer gebunden werden, um dieser Phosphatase Stabilität zu verleihen, wenn sie als Reagens in Sets für kolorimetrische Detektion von Antikörpern oder Antigenen in biologischen Flüssigkeiten verwendet wird.
  • Die nachstehenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sind nicht als Einschränkung derselben zu verstehen.
  • Bezugsbeispiel I
  • Bezugskonjugat 1
  • Polysorbattrioleat-p-nitrophenylcarbonat
  • Zu einer Lösung von p-Nitrophenylchlorformiat (0.8 g, 4 mmol) in 50 ml wasserfreiem Acetonitril wird trockenes Polysorbattrioleat (7 g, 4 mmol) zugesetzt, gefolgt von Dimethylaminopyridin (0,5 g, 4 mmol). Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt, und der resultierende Niederschlag wird mit trockenem Benzol verdünnt und durch Celite filtriert. Der Rest wird über Nacht in trockenem Benzol kühl gelagert, und der zusätzliche Niederschlag wird abfiltriert. Da Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt, und das restliche Benzol wird bei niedrigem Druck evakuiert, um 6,4 g Polysorbattrioleat-p-nitrophenylcarbonat zu erhalten.
  • Kopplung von Insulin mit einem aktivierten Polymer
  • Zu einer Lösung von aktiviertem Polysorbattrioleat-p-nitrophenylchlorformiat (1 g) in destilliertem Wasser wird eine Lösung von Rinderinsulin (50 mg) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,8) zugesetzt. Der pH wird, falls erforderlich, durch den Zusatz von 1 N NaOH beibehalten. Das Reaktionsgemisch wird 2,5 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Gemisch einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephadex G-75 unterzogen. Eine Reinigung durch Elution mit 0,1 M pH 7,0 Phosphatpuffer und die Abnahme von Fraktionen mithilfe eines automatisierten Fraktionssammlers ergibt das Bezugskonjugat 1. Der Polymergehalt wird durch ei nen Trinitrobenzolsulfonsäure-(TNBS-)Test und die Proteinkonzentration durch das Biuret-Verfahren bestimmt. Das Molverhältnis zwischen Polymer und Insulin beträgt 1:1.
  • Beispiel I
  • Konjugat 1
  • Die terminale Hydroxylgruppe von Polyethylenglykolmonostearat wird durch Umsetzung mit p-Nitrophenylchlorformiat wie oben beschrieben aktiviert. Zu einer Lösung des aktivierten Polymers (1 g) in destilliertem Wasser wird Rinderinsulin (80 mg) zugesetzt, das in 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 8,8 gelöst ist. Der pH wird durch vorsichtige Einstellung mit 1 N NaOH beibehalten. Nach 3-stündigem Rühren wird das Reaktionsgemisch mit überschüssigem Glycin gequencht und einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephadex G-75 unterzogen. Das Insulin/Polymer-Konjugat wird gewonnen und gefriergetrocknet. Der Proteingehalt wird durch einen Biuret-Test bestimmt, der eine quantitative Ausbeute ergibt.
  • Beispiel II
  • Konjugat 2
  • Tetrahydro-2-(12-Bromdodecanoxy)-2H-pyran
  • Zu einer Lösung von 12-Brom-1-dodecanol (1 mol) in Dichlormethan, die Pyridinium-p-toluolsulfonat (P-TSA) enthält, wird Dihydropyran (2 mol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden lang gerührt und dann zweimal mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem MgSO4 getrocknet. Das Dichlormethan wird unter reduziertem Druck entfernt. Falls erforderlich wird das resultierende Produkt durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt.
  • Kopplung von Polyethylenglykol an das Tetrahydropyranderivat
  • Das oben beschriebene Tetrahydropyranderivat wird in trockenem Benzol gelöst zu einer Lösung von Polyethylenglykol (1 mol) in trockenem Benzol, das NaH (1 mol) enthält, zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Danach wird das Gemisch durch eine Silicagelsäule mit Benzol eluiert. Falls erforderlich wird eine weitere Reinigung durch Säulenchromatographie durchgeführt. Die Tetrahydropyranschutzgruppe wird durch eine Behandlung mit p-TSA bei Raumtemperatur entfernt. Falls erforderlich wird das Endprodukt durch Säulenchromatographie gereinigt. Die Hydroxylgruppe des Polymers wird durch Umsetzung mit p-Nitrophenylchlorformiat wie oben beschrieben aktiviert. Eine Konjugation mit Insulin wird wie für Bezugskonjugat 1 beschrieben durchgeführt.
  • Beispiel III
  • Vergleichsstudien unter Verwendung von Rinderinsulin wurden an Polymer-Insulin-Konjugaten und an nativem Insulin durchgeführt, um ihre relative Stabilität und Aktivität in Tiermodellen zu bestimmen. In den Tierstudien wurde die Wirksamkeit des Polymer-Insulins bei der Verringerung des Blutwerts mit der von nativem Insulin verglichen. Weibliche und männliche Albinomäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 25 g wurden über Nacht nüchtern gehalten und für jede Behandlung, die in mehreren Phasen über einen Zeitraum von zwei Tagen durchgeführt wurde, in Gruppen aus jeweils fünf Mäusen geteilt.
  • Jedes Versuchstier erhielt zum Zeitpunkt 0 eine einzelne Dosis von entweder nativem Insulin (Gruppe 1, 100 μg/kg, subkutan); nativem Insulin (Gruppe 2, 1,5 mg/kg, oral mithilfe einer Sonde); Bezugskonjugat 1 (Gruppe 3, 100 μg/kg, oral); oder Bezugskonjugat 1 (Gruppe 4, 100 μg/kg, subkutan). Eine weitere Gruppe (Gruppe 5) erhielt kein Insulin, wurde aber 30 Minuten vor der geplanten Probenentnahme mit Glucose provoziert. Die Tiere wurden vor der Behandlung über Nacht und für die Dauer der Behandlung nüchtern gehalten. Alle Testmaterialien wurden in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung, pH 7,4, hergestellt. Dreißig Minuten vor den geplanten Probenentnahmen von 0,5, 1, 2, 4, 8 und 24 Stunden nach der Behandlung mit Insulin wurden die Tiere mit einer Bolus-Dosis Glucose (5 g/kg, 50%ige Lösung, oral verabreicht) provoziert, sodass jedes Tier nur eine Dosis Insulin oder Bezugskonjugat 1 und eine Glucoseprovokation erhielt. Zum geplanten Zeitpunkt wurde eine Blutprobe aus der Schwanzvene entnommen und direkt mithilfe eines One Touch Digital Glucose Meter (Life Scan) auf ihren Glucosegehalt untersucht. Die Ergebnisse des Tests für die Gruppe 1–5 sind in 1 zu sehen.
  • Die Blutglucosewerte der Tiere der Gruppe 1 (natives Insulin, subkutan) betrugen nach 30 Minuten etwa 30% der Werte der Kontrolltiere (Gruppe 5, unbehandelt). Dieser hypoglykämische Effekt dauerte in den Tieren der Gruppe 1 nur etwa 3,5 Stunden an. Oral verabreichtes natives Insulin (Gruppe 2) verringerte die Blutglucosewerte auf ein Maximum von 60% der Kontrolle, wobei diese maximale Reaktion 30 Minuten nach der Behandlung mit Insulin auftrat. Im Gegensatz dazu wurden die Glucosewerte in den Tieren der Gruppe 3 (Bezugskonjugat 1, 100 μg/kg, p.o.) mit einer scheinbaren Verzögerung des Beginns der hypoglykämischen Aktivität verringert. Die hypoglykämische Aktivität in den Tieren der Gruppe 3 war stärker als in den Tieren der Gruppen 2, obwohl die Insulindosis, die der Gruppe 3 verabreicht wurde, nur ein Fünfzehntel jener betrug, die der Gruppe 2 verabreicht wurde. Zu jedem Zeitpunkt über 3 Stunden hinaus waren die Glucosewerte in den Tieren der Gruppe 3 niedriger als in jeder anderen Behandlungsgruppe, wobei der größte Unterschied bei der Probenentnahme nach vier und acht Stunden zu beobachten war. Die Glucosewerte in den Tieren der Gruppe 4 (Bezugskonjugat 1, 100 μg/kg, s.c.) folgten während den ersten vier Stunde der Studie dem gleichen Verlauf wie jenem der Tiere der Gruppe 1. Nach vier Stunden blieben die Glucosewerte der Gruppe 2 über den Kontrollwerten (unbehandelt, Gruppe 5), während die Glucosewerte der Gruppe 4 nach acht Stunden auf 62% der Werte der Gruppe 5 abnahmen und unter den Werten der Gruppe 5 blieben.
  • Beispiel IV
  • Eine Insulinwirksamkeitsstudie wurde an männlichen und weiblichen Albinomäusen durchgeführt, wobei als Testmaterialien Insulin in unkonjugierter Form und Bezugskonjugat 1 verwendet wurden. Ein Ziel dieser Studie bestand in der Bestimmung, ob Insulin in Form von Bezugskonjugat 1 auf die gleiche Weise auf die Blutglucosewerte Einfluss nehmen kann wie Insulin, wenn es subkutan verabreicht wird. Ein zweites Ziel bestand in der Bestimmung, ob der Insulinkomplex des Bezugskonjugats 1, anders als freies Insulin, den Blutglucosewert auch bei oraler Verabreichung verringern kann. Die Ergebnisse sind in 2 zusehen, worin "Insulinkomplex" das Bezugskonjugat 1 bezeichnet.
  • Von 10 nüchternen unbehandelten Albinomäusen (5 männliche und 5 weibliche) wurden Grundlinienblutproben für eine Serumglucoseanalyse entnommen; die Grundlinienwerte in 2 sind durch das Symbol "O" gekennzeichnet. Drei weitere Gruppen (jeweils fünf Männchen und fünf Weibchen) wurden über Nacht nüchtern gehalten, wonach ihnen Glucose alleine oral mithilfe einer Sonde verabreicht wurde (5 g/kg Körpergewicht). Zu jedem der drei folgenden Zeitpunkte wurde zehn Tiere getötet, um Blutproben für die Glucoseanalyse zu erhalten: 30, 60 und 120 nach der Verabreichung. Im Handel erhältliches Insulin und Bezugskonjugat 1 wurden jeweils oral (p.o.) und parenteral (s.c.) an Gruppen von nüchternen Mäusen (fünf männliche und fünf weibliche, zur Tötung und Blutanalyse zu den drei Zeitpunkten) verabreicht, um unterschiedliche Behandlungsregime zu erhalten. Die Behandlung, Verabreichungswege und Symbole für die Ergebnisse in 2 umfassen: (i) Glucose (5 g/kg, p.o.), Symbol: "•"; (ii) Insulin (100 μg/kg, s.c.) und Glucose (5 g/kg, p.o.), Symbol "∇"; (iii) Insulin (1,5 mg/kg, p.o.) und Glucose (5 g/kg, p.o.), Symbol: "∇"; (iv) Bezugskonjugat 1 (100 μg/kg, s.c.) und Glucose (5 g/kg, p.o.), Symbol "☐"; (v) Bezugskonjugat 1 (250 μg/kg, s.c.) und Glucose (5 g/kg, p.o.), Symbol "☐"; (vi) Bezugskonjugat 1 (1,5 mg/kg, s.c.) und Glucose (5 g/kg, p.o.), Symbol "Δ". Bei diesen Tests am Bezugskonjugat 1 betrug die Konzentration des Proteins in der verabreichten Lösung 0,1 mg Protein/ml Lösung; zu Vergleichszwecken wurde ein modifizier tes, kovalent gebundenes Insulin-Polymer-Konjugat mit einer Proteinkonzentration in der verabreichten Lösung von 0,78 mg Protein/ml Lösung verwendet, (vii) modifiziertes Bezugskonjugat 1 (100 μg/kg, s.c.) und Glucose (5 g/kg, p.o.), Symbol; "Δ".
  • Das Insulin wurde 15 Minuten vor der Glucosebelastung verabreicht.
  • Glucose wurde allen Tieren außer der Grundliniengrupppe in einer Dosis von 5 g/kg (10 mg/kg einer 50% (Gew./Vol.) Lösung in normaler Kochsalzlösung) oral mithilfe einer Sonde verabreicht. Als Insulin oral mithilfe einer Sonde verabreicht wurde, wurde es in einer Dosis von 1,5 mg/kg (18,85 ml/kg einer 0,008% (Gew./Vol.) Lösung in normaler Kochsalzlösung) verabreicht. Als Insulin subkutan verabreicht wurde, wurde es in einer Dosis von 100 μg/kg (2,5 ml/kg einer 0,004% (Gew./Vol.) Lösung in normaler Kochsalzlösung) verabreicht. Als der Polymer-Insulin-Komplex des Bezugskonjugats 1 oral mit einer Sonde verabreicht wurde, wurde er in einer Dosis von 1,56 mg/kg (2,0 ml/kg des unverdünnten Testmaterials) verabreicht. Als der Polymer-Insulin-Komplex des Bezugskonjugats 1 subkutan verabreicht wurde, wurde er in einer Dosis von 100 μg/kg (1,28 ml/kg einer 1:10-Verdünnung der erhaltenen 0,78-mg/ml-Lösung) oder 250 μg/kg (3,20 ml/kg einer 1:10-Verdünnung der erhaltenen Lösung) verabreicht. Das modifizierte Bezugskonjugat 1 enthielt 0,1 ml Insulin/ml und wurde in einer Rate von 1,0 ml/kg zugeführt, um eine Dosis von 100 μg/kg zu erhalten.
  • Glucose wurde unter Verwendung des Gemini Centrifugal Analyzer und im Handel erhältlicher Glucosereagenssets gemessen. Der Test war ein gekoppelter enzymatischer Test, der auf der Reaktion von Glucose und ATP, katalysiert durch Hexokinase, basierte, gekoppelt mit der Glucose-6-phosphatdehydrogenasereaktion, was NADH ergab. Duplikatproben wurden analysiert und der Mittelwert berechnet. Eine Verdünnung (1:2 oder 1:4) einiger Serumproben war notwendig, um die sehr hohe Glucosekonzentration in bestimmten Proben bestimmen zu können.
  • Nach der Glucosebelastung stieg der mittlere Serumglucosewert nach 30 Minuten auf einen hohen Wert an, nahm nach 60 Minuten wieder ab und befand sich nach 120 Minuten unter der Grundlinie. Als im Handel erhältliches Insulin subkutan (100 μg/kg Körpergewicht) verabreicht wurde, war es äußerst effektiv bei der Verhinderung eines Anstiegs des Blutglucosewerts. Als Insulin jedoch oral (in einer hohen Dosis von 1,5 mg/kg) verabreicht wurde, zeigte es keine Wirkung auf den Anstieg des Blutglucosewerts. Dies war zu erwarten, da Insulin, ein Protein, im Verdauungstrakt leicht hydrolysiert wird und nicht intakt in die Blutbahn absorbiert wird.
  • Als das Bezugskonjugat 1 entweder in einer Dosis von 100 oder 250 μg/kg subkutan verabreicht wurde, war es äußerst effektiv bei der Einschränkung des Anstiegs des Blutglucosewerts nach der Glucosebelastung. Die mittleren Serumglucosewerte waren sowohl nach 30 als auch nach 60 Minuten nach der 100-μg/kg-Dosis von Bezugskonjugat 1 deutlich niedriger als nach 100 μg/kg freiem Insulin. Die mittlere Serumglucose bei 250 μg/kg von Bezugskonjugat 1 war nach 30 Minuten niedriger, obwohl nicht signifikant niedriger, nach 60 Minuten signifikant niedriger und nach 120 Minuten zurück auf der Grundlinie. Sowohl bei 100 μg/kg freiem Insulin als auch bei 100 μg/kg Bezugskonjugat 1 lag der Glucosewert nach 120 Minuten unter der Grundlinie.
  • Die Verabreichung von 100 μg/kg modifiziertem Bezugskonjugat 1 führte zu einer deutlichen Verringerung des Blutglucosewerts nach 30 Minuten.
  • Bezugsbeispiel II
  • Herstellung von p-Nitrophenylcarbonat von Polysorbatmonopalmitat
  • Polysorbatmonopalmitat wird zuerst unter Verwendung von trockenem Benzol durch das azeotrope Verfahren getrocknet.
  • Zu einer Lösung des trockenen Polymers (2 g, 2 mmol) in 10 ml trockenem Pyridin wird p-Nitrophenylchlorformiat (0,6 g, 3 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch in Eis abgekühlt, mit trockenem Benzol verdünnt und durch eine Filtriehilfe filtriert. Das Ver fahren wird wiederholt, und schließlich wird das Lösungsmittel im Rotationsverdampfer entfernt. Spuren des Lösungsmittels werden im Vakuum entfernt. Die Ausbeute des Produkts beträgt 1,8 g.
  • Bezugsbeispiel III
  • Herstellung eines Polysorbatmonopalmitatkonjugats mit Insulin
  • In Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Konjugationsreaktionsverfahren aus Bezugsbeispiel 1, aber unter Verwendung von Polysorbatmonopalmitat in einer Menge von 1 g und Insulin in einer Menge von 80 g, und durch HPLC-Trennung des Reaktionsprodukts wird ein kovalent gebundenes Insulin-Polysorbatmonopalmitat-Konjugat erhalten.
  • Beispiel V
  • Herstellung von Enzym-Polymer-Konjugaten
  • Die Kopplung von alkalischer Phosphatase (AP) an ein Polymer wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie in Bezugsbeispiel 1 für Bezugskonjugat 1 beschrieben durchgeführt. Um außerdem zu bestimmen, ob ein höheres oder niedrigeres Verhältnis zwischen Polymer und Protein besser wäre, wurden Konjugate unter Verwendung von 140 mol Polymer/mol Enzym und 14 mol Polymer/mol Enzym hergestellt. Die Anzahl an Polymergruppen pro Molekül konjugierter AP betrug für das hohe und niedrige Polymerverhältnis 30 bzw. 5.
  • Die nachfolgenden Verfahren wurden durchgeführt, um etwa 5 Gruppen/Molekül alkalischer Phosphatase zu erhalten: 4,1 mg (salzfrei) wurden in 0,05 M Natriumbicarbonat gelöst. Zu dieser Lösung wurde aktiviertes Polymer (0,75) in Wasser/Dimethylsulfoxid zugesetzt, und die Lösung wurde 3 bis 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde in einem Dialyseschlauch (MG-Cutoff 12.000–14.000) über einen Zeitraum von 12 Stunden gegen eine Salzlösung (0,3 N NaCl) dialysiert, wobei die Dialyselösung 4 bis 6-mal ge wechselt wurde. Das gleiche Verfahren wurde für das hohe Verhältnis verwendet. Die Gesamtproteinkonzentration des dialysierten Materials wurde durch das Biuret-Verfahren bestimmt.
  • Aktivitätsmessung und Untersuchung der Stabilität
  • Der Phosphatasetest wurde gemäß dem Verfahren nach A. Voller et al., Bulletin WHO 53, 55 (1976), durchgeführt. Eine Aliquote (50 Mikroliter) wurde zu Mikrowells zugesetzt, mit 200 Mikroliter Substratlösung (10 g/l, 4-Nitrophenylphosphat in 20 Ethanolaminpuffer, pH 9,3) vermischt und bei Raumtemperatur 45 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wurden durch 50 Mikroliter 3 M NaOH gestoppt. Das Absorptionsvermögen bei 405 nm wurde in einem Mikroplattenlesegerät bestimmt.
  • Die Phosphataseaktivität wurde mit der eines nativen Enzyms bei unterschiedlichen Bedingungen verglichen.
  • Verdünnte Lösungen, die ähnliche Konzentrationen alkalische Phosphatase und Konjugate aus alkalischer Phosphatase und einem Polymer enthielten, wurden bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert. Die enzymatische Aktivität wurde regelmäßig getestet. Die beiden bei 5°C, 15°C, 35° und 55°C getesteten Polymere wurden mit der alkalischen Kontrollphosphatase verglichen, die bei 5°C gelagert wurde.
  • Wie aus Tabelle A ersichtlich ist, war die anfängliche enzymatische Aktivität beider Polymere etwa dreimal höher als die der Kontrolle. Beide Polymer-Enzym-Konjugate wiesen höhere thermische Stabilität auf als das native Enzym. Das war vor allem beim Konjugat klar erkennbar, das durch ein höheres Polymer-Enzym-Verhältnis gekennzeichnet war.
  • Tabelle A
    Figure 00400001
  • Beispiel VI
  • Konjugat 1A
  • Zu einer Lösung von Insulin (50 mg) in 0,05 M Natriumbicarbonatpuffer mit einem pH von 9,2 wird eine Lösung eines aktivierten Polymers (1 g) in Wasser/Dimethylsulfoxid zugesetzt und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Der pH des Gemischs wird durch vorsichtige Einstellung mit 1 N NaOH beibehalten. Das Reaktionsgemisch wird dann gegen 0,1 M pH 7,0 Phosphatpuffer dialysiert. Das gereinigte Produkt wird gefriergetrocknet. Der Proteingehalt (48 mg) wird mithilfe eines Biuret-Tests bestimmt. Die Anzahl an Polymerketten, die an das Insulin gebunden sind, wird durch einen TNBS-Test bestimmt, der ein Verhältnis von zwei mol Polymer pro einem mol Insulin ergibt.
  • Bezugsbeispiel IV
  • Calcitonin-OT50 wurde auf folgende Weise synthetisiert. Aktiviertes OT (160 mg) in Wasser (2,0 ml) wurde bei 5°C zu einer gerührten Lösung von Lachscalcitonin (5 mg, Becham) in entionisiertem Wasser (1,5 ml) und Boratpuffer zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde 1,5 h lang bei 20°C gerührt, und der pH der Lösung wurde auf 8,8 eingestellt. Die Reaktion wurde weitere 0,5 h gerührt, bevor der pH mit verdünnter (1 M) Salzsäure auf 3,8 gebracht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 5°C gelagert. Die Lösung wurde in einer Dialysemembran (MWCO 3500) anfangs gegen einen PBS-Puffer (pH 7,5, 2 l) und dann gegen einen PBS-Puffer (eingestellt auf pH 3,6, 4 × 1 l) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde durch einen 0,22-Mikrofilter filtriert und bei 5°C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde durch Biuret und HPLC bestimmt, wobei natives Calcitonin als Standard verwendet wurde. Die Reinheit wurde durch HPLC auf einer Größenausschlusssäule und unter Verwendung von 0,05 M Phosphatpuffer (eingestellt auf pH 3,8) analysiert.
  • Bezugsbeispiel V
  • Calcitonin-001 wurde auf folgende Weise synthetisiert. Aktiviertes 001 (130 mg) in Dimethylsulfoxid (1 ml) wurde bei 5°C zu einer gerührten Lösung von Lachscalcitonin (5 mg) in entionisiertem Wasser (2 ml) und Boratpuffer (1,5 ml, 0,1 M, pH 8,8) zugesetzt. Die Lösung wurde 1,5 h lang bei 20°C gerührt, und der pH wurde mit 1 N Salzsäure auf 8,8 eingestellt. Die Reaktion wurde eine weitere Stunde gerührt, bevor der pH auf 3,8 gebracht wurde, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 5°C gelagert. 4 ml entionisiertes Wasser wurden zum Reaktionsgemisch zugesetzt, und der Überstand wurde wieder in der Dialysemembran (MWCO 3500) gegen eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) (pH 7,4, 2 l) und dann viermal gegen PBS-Puffer (eingestellt auf pH 3,6) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde durch einen 0,22-μ-Filter filtriert und bei 5°C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde durch ein Biuret- und HPLC-Verfahren bestimmt, wobei natives Calcitonin als Standard verwendet wurde. Die Reinheit wurde durch HPLC unter Verwendung von C-8- Umkehrraum mit einer Gradientenelution mit Acetonitril/0,1% TFA (30 bis 55% über 25 Minuten) analysiert.
  • Beispiel VII
  • Insulin-OT wurde auf folgende Weise hergestellt. 2,0 g aktiviertes OT-Polymer wurde in einen 250 ml fassenden Rundkolben gewogen. Das OT-Polymer wurde vollständig in 10 ml wasserfreiem DMSO gelöst, und 20 ml entionisiertes Wasser wurden zugesetzt und 5 Minuten gerührt. Die resultierende OT-Lösung wurde auf 10°C abgekühlt. 100 mg Insulin (Sigma/Rinderpankreas/Zn), gelöst in 40 ml 0,1 M Natriumboratpuffer (pH 9,3), wurden auf einmal zur OT-Polymerlösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde hellgelb. Nach 30 Minuten wurde der pH der Lösung unter Verwendung von 2 N HCl auf 8,8 eingestellt. Die Reaktionslösung wurde weitere 1,5 h lang gerührt, und der pH wurde auf 8,4 eingestellt. Dann wurde das Reaktionsgemisch durch eine 0,8-μm-Filtermembran filtriert und in PBS-Puffer (pH 7,4) dialysiert. Das dialysierte Gemisch wurde durch einen 0,22-μm-Filter filtriert und eingeengt. Die eingeengte Probe wurde unter Verwendung von Sephadex G-75 (Eluent 0,05 M Natriumphosphatpuffer) chromatographiert. Säule: 2,5 cm Durchmesser × 32 cm Höhe. Die Analyse ergab eine quantitative Ausbeute an Insulinkonjugat mit 2 mol Polymer pro mol Insulin.
  • Beispiel VIII
  • 001-Insulin wurde einer Behandlungsgruppe aus glucoseprovozierten Javaneraffen in Dosen von 0,5 mg, 2 mg bzw. 5 mg oral verabreicht. Die AUC ("area under the curve", Fläche unter der Kurve) wurde für jede Behandlungsgruppe berechnet. Ausgehend von diesem Maß stellen niedrigere Werte die höchste Wirksamkeit bei der Verringerung der Blutglucosewerte dar. Die AUC-Ergebnisse sind in 8 zu sehen. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine einzelne oral verabreichte Dosis 001-Insulin bei Javaneraffen effektiv vor einer Erhöhung des Blutglucosewerts nach einer Glucoseprovokation schützt. Die AUC nach der oralen Verabreichung von 001-Insulin ist we niger als halb mal so groß wie die bei unbehandelten Tieren, was die signifikante hypoglykämische Aktivität von 001-Insulin bei Javaneraffen aufzeigt.
  • Bezugsbeispiel VI
  • Die hypokalzämische Aktivität von Polymer-Calcitonin-Konjugaten bei oraler Verabreichung wurde an einem hypokalzämischen Rattenmodell untersucht. Zwei Polymer-Calcitonin-Derivate (OT-Calcitonin und 001-Calcitonin) wurden auf folgende Weise beurteilt. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (mittleres Gewicht 54 g) wurden über Nacht nüchtern gehalten. Die Tiere wurden zufällig Behandlungsgruppen (5 pro Gruppe) zugeteilt, und für jede Gruppe wurden Grundlinien-Serumcalciumwerte bestimmt. Die Behandlungsgruppen erhielten dann eine einzelne Dosis von entweder unmodifiziertem Calcitonin in einer Dosis von 50 mg pro kg, OT-Calcitonin in einer Dosis von 2,5 mg pro kg und 001-Calcitonin in Dosen von 250 mg pro kg, 2,5 mg pro kg bzw. 25 mg pro kg. Die Dosen wurden auf oralem Weg verabreicht. Das Serumcalcium wurde 2 und 4 Stunden nach der Verabreichung bestimmt. Die Ergebnisse sind in 4 als Prozent der ursprünglichen Serumcalciumwerte in Bezug auf die Zeit dargestellt. ( ) steht für Calcitonin, ( ) steht für 001, 250 mg, ♢ steht für 001, 2,5 μg, Δ steht für 001, 25 mg, und • steht für OT, 2,5 μg. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Verringerung des Serumcalciums in Abhängigkeit von der Dosis. Es scheint, dass die Konjugate mehr als die anfänglich erwarteten 4 Stunden lang aktiv sind. Eine längere Wirkungsdauer könnte einer signifikanten Bioverfügbarkeit nach oraler Verabreichung entsprechen.
  • Bezugsbeispiel VII
  • Die hypokalzämische Aktivität von oral verabreichtem Polymer-Calcitoninin in einem Rattenmodell wurde auf folgende Weise nachgewiesen. Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem mittleren Gewicht von 54 g wurden über Nacht nüchtern gehalten. Die Tiere wurden zufällig Behandlungsgruppen (4 pro Gruppe) zugeteilt, und für jede Gruppe wurden Grundlinien-Serumcalciumwerte bestimmt. Die Kontrollgruppen er hielten eine einzelne Dosis unmodifiziertes Calcitonin (ct), entweder auf subkutanem (s.c.) Wege (50 mg pro kg) oder oral (25 μg pro kg). Die Behandlungsgruppen erhielten entweder OT1-ct oder OT2-ct (2,5 μg pro kg) auf oralem Wege. Das Serumcalcium wurde 2 und 4 Stunden nach der Verabreichung bestimmt. Die Ergebnisse sind in 5 als Prozent der ursprünglichen Serumcalciumwerte in Bezug auf die Zeit dargestellt. OT1-ct und OT2-ct sind Wiederholungspräparate des gleichen Calcitonin-Polymer-Konjugats, die nebeneinander evaluiert werden, um die Übereinstimmung der Reaktion von einer Charge zur nächsten aufzuzeigen. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Verringerung des Serumcalciums. Es scheint, dass die Konjugate mehr als die anfänglich erwarteten 4 Stunden lang aktiv sind.
  • Beispiel IX
  • Polymer-Insulin wird in einem diabetischen (BB-)Rattenmodell auf folgende Weise evaluiert. Die BB-Ratte ist ein verlässliches Modell für menschlichen insulinabhängigen Diabetes. Ohne tägliche subkutane (sc) Insulinverabreichung sterben BB-Ratten innerhalb von zwei Tagen. In einer 14-tägigen Studie wurde die sc Insulin-Verabreichung gestoppt, und die Tiere wurden auf eine Behandlung mit oral verabreichtem Polymer-Insulin in geringer (100 Mikrogramm pro Kilogramm pro Tag), mittlerer (3 Milligramm pro Kilogramm pro Tag) und hoher (6 Milligramm pro Kilogramm pro Tag) Dosis umgestellt. Die Ergebnisse (mittlere Überlebensdauer) sind in 6 zu sehen. Die plötzliche Umstellung von sc zu oraler Verabreichung stellt einen insbesondere schwierigen Test für das Polymer-Insulin dar. Die Ergebnisse zeigen, dass die Tiere mit der geringen Dosis nicht ausreichend Insulin erhielten, um überleben zu können; die Gruppe mit der mittleren Dosis überlebte etwas länger, und in der Gruppe mit der hohen Dosis überlebten einige Tiere die gesamte Dauer (14 Tage) der Studie, bei der Polymer-Insulin nur oral verabreicht wurde. Das Polymer-Insulin wurde mithilfe eines Sonde in einer nichtoptimierten Formulierung verabreicht. Diese Studie zeigt außerdem eine statistisch signifikante Verringerung der Blutglucosewerte am Nachmittag im Vergleich zum Vormittag, und diese konnten besser geregelt werden, wenn die Tiere mehrere Verabreichungen pro Tag erhielten und nicht einen einzigen Bolus. Die tägliche orale Verabreichung von Polymer-Insulin an normale (nichtdiabetische) Tiere führte zu einer signifikanten Verringerung der Blutglucosewerte am Vormittag.
  • Beispiel X
  • Die Wirkung von oral verabreichtem 001-Insulin in Javaneraffen wurde auf folgende Weise nachgewiesen. 6 Javaneraffen (3 männliche, 3 weibliche, mittleres Gewicht 2,5 Kilogramm) wurden über Nacht nüchtern gehalten. Grundlinien-Blutglucosewerte wurden bestimmt, bevor die Tiere eine Glucoseprovokation von 3 Gramm pro Kilogramm Körpergewicht erhielten, die oral mithilfe einer Sonde als 50%ige Lösung verabreicht wurde. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0–4 Stunden) wurden die Blutglucosewerte bestimmt. Zwei Tage später wurden die Tiere wieder nüchtern gehalten und erhielten eine Provokation mit 3 Gramm Glucose pro Kilogramm Körpergewicht. Diesmal erhielten die Tiere 001-Insulin (entspricht 5 Milligramm Insulin pro Kilogramm) auf oralem Wege. Die Blutglucosewerte wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt. Die Wirkung von Dosierungen von 2 Milligramm 001-Insulin pro Kilogramm und 0,5 Milligramm 001-Insulin pro Kilogramm an den gleichen Tieren und in der gleichen Arbeitsvorschrift wurden bestimmt, nachdem eine zweitägige Ausscheidungsperiode nach der Behandlung abgewartet wurde. Die Ergebnisse der einzelnen Behandlungen (Kontrolle, 0,5, 2 oder 5 Milligramm pro Kilogramm) wurden als prozentuelle Änderung der Blutglucose im Laufe der Zeit berechnet, und die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Darin steht für Glucose, für 5 Milligramm, für 2 Milligramm und für 0,5 Milligramm. 2 Stunden nach der Glucoseprovokation beträgt der mittlere Anstieg der Blutglucosewerte in der behandelten Gruppe ein Drittel des Anstiegs in der unbehandelten Gruppe.
  • Beispiel XI
  • Die Chymotrypsinverdauung von Insulin und OT-Insulin wurde auf folgende Weise gemessen. Chymotrypsin (gereinigter Sigma-Typ 1S) wurde bei 37°C entweder mit Insulin (Rind) oder einem in phosphatgepufferter Salzlösung mit einem pH von 8 gelösten OT-Insulin-Konjugat inkubiert. Aliquoten wurden in periodischen Abständen entfernt und durch den Zusatz eines Zehntel-Volumens 2% Trifluoressigsäure (TFA) sauer gemacht, um die Reaktion anzuhalten. Die Proben wurden durch HPLC analysiert, und die Ergebnisse sind in 3 dargestellt, worin OT-Insulin durch dargestellt ist und das Insulin durch dargestellt ist.
  • Beste Art der Durchführung der Erfindung
  • Die derzeit bevorzugten konjugationsstabilisierten Polypeptid-Polymer-Zusammensetzungen und -formulierungen der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf kovalent konjugierte Peptidkomplexe, worin das Peptid kovalent an ein oder mehrere Moleküle des Polymers gebunden ist, das als integralen Teil eine hydrophile Gruppierung aufweist, wie z.B. lineares Polyalkylenglykol, und worin das Polymer eine lipophile Gruppierung als integralen Teil aufweist.
  • Ein insbesondere bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine physiologisch aktive Peptidzusammensetzung, die ein physiologisch aktives Peptid umfasst, das kovalent an ein Polymer gebunden ist, das (i) eine lineare Polyalkylenglykolgruppierung und (ii) eine lipophile Gruppierung umfasst, worin das Peptid, die lineare Polyalkylenglykolgruppierung und die lipophile Gruppierung in Bezug auf die Konformation so zueinander angeordnet sind, dass das physiologisch aktive Peptid in der physiologisch aktiven Peptidzusammensetzung im Vergleich zum physiologisch aktiven Peptid alleine (d.h. in konjugierter Form ohne daran gebundenes Polymer) erhöhte In-vivo-Resistenz gegen enzymatischen Abbau aufweist.
  • Gewerbliche Anwendbarkeit der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von hierin offenbarten konjugationsstabilisierten Polypeptidzusammensetzungen, und zwar für orale Verabrei chungsdosen für die Vermittlung und Behandlung von Krankheiten, die Peptidmängel involvieren.

Claims (4)

  1. Polymer-Peptid-Konjugat mit der folgenden Formel: Pr-Z-(CH2)m(OC2H4)n-XR, wobei Pr = Peptide; R = Alkyl; n = 5 bis 120; m = 2 bis 15;
    Figure 00480001
  2. Polymer-Peptid-Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Peptid um Insulin handelt.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polymer-Peptid-Konjugat gemäß Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  4. Verwendung eines Polymer-Peptid-Konjugats gemäß Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines oralen Medikaments für die Behandlung eines Insulinmangels.
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