DE69434224T2

DE69434224T2 - Orales Verabreichungssystem für Desferrioxamin, Insulin und Cromolyn-Natrium

Info

Publication number: DE69434224T2
Application number: DE69434224T
Authority: DE
Inventors: Sam J. Milstein; Evgueni N. Barantsevitch
Original assignee: Emisphere Technologies Inc
Current assignee: Emisphere Technologies Inc
Priority date: 1993-10-26
Filing date: 1994-10-24
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2014-10-25
Also published as: EP1072255B1; AU8093694A; CA2174961A1; EP0726771A1; IL111385A0; DE69429729D1; EP1072255A2; EP0726771A4; CA2174961C; EP1072255A3; ES2234487T3; DE69429729T2; US5447728A; JPH09504300A; EP1072255B8; ES2171471T3; EP0726771B1; WO1995011690A1; ATE286383T1; DE69434224D1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen zur Herstellung von Medikamenten, wobei die Verbindungen ein orales Verabreichungssystem ausbilden, und insbesondere modifizierte Aminosäuren für die Verwendung als ein Verabreichungssystem für Desferrioxamin zum Absenken der Eisenkonzentration; Insulin zur Behandlung von Diabetes; und Cromolyn-Natrium zur Behandlung von Atemwegserkrankungen. Die modifizierten Aminosäuren kapseln die aktiven Wirkstoffe ein und sind geeignet zur oralen Verabreichung an Säuger.
Hintergrund der Erfindung
Herkömmliche Arten zur Verabreichung pharmazeutischer und therapeutischer Substanzen an Säuger sind häufig durch chemische oder physikalische Barrieren oder beide, die vom Körper auferlegt sind, stark beschränkt. Die orale Verabreichung vieler biologisch aktiver Substanzen wäre die Route der Wahl, falls nicht chemische oder physikochemische Barrieren, wie extreme pH-Werte im Darm, Einwirkung von wirksamen Verdauungsenzymen und Undurchlässigkeit von gastrointestinalen Membranen für den aktiven Wirkstoff vorliegen. Unter den zahlreichen pharmakologischen Substanzen, die als ungeeignet zur oralen Verabreichung bekannt sind, sind biologisch aktive Peptide und Proteine, wie Insulin. Diese Substanzen werden im Darm durch Säurehydrolyse und/oder proteolytische Enzyme rasch zerstört.
Frühere Verfahren zur oralen Verabreichung empfindlicher pharmakologischer Substanzen haben sich gestützt auf die Co-Abreichung von Adjuvanzien (z. B. Resorcine und nicht ionische, oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyethylenoleylether und n-Hexadecylpolyethylenether), um die Permeabilität der Darmwände künstlich zu erhöhen; und auf die Co-Verabreichung von enzymatischen Inhibitoren (z. B. pankreatischer Trypsininhibitor, Diisopropylfluorphosphat (DFF) und Trasylol), um einen enzymatischen Abbau zu vermeiden. Liposomen, wie Wirkstoff-Verabreichungssysteme für Insulin und Heparin, sind ebenfalls beschrieben worden, vgl. z. B. die US-Patentschrift Nr. 4,239,754; Patel et al. (1976), FEBS LETTERS, Bd. 62, Seite 60; und Hashimoto et al. (1979), Endocrinol. Japan, Bd. 26, Seite 337. Die breitere Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren als Wirkstoff-Verabreichungssysteme sind jedoch aus Gründen ausgeschlossen, welche umfassen: (1) die Verwendung von toxischen Mengen von Adjuvanzien oder Inhibitoren; (2) den engen Bereich von Beladungen mit niedrigem Molekulargewicht; (3) die geringe Stabilität des Systems und die nicht angepasste Lagerfähigkeit; (4) die Schwierigkeit bei der Herstellung; und (5) das Versagen des Verfahrens zum passenden Schutz des aktiven Wirkstoffs oder zur Förderung seiner Absorption.
In letzter Zeit sind künstliche Aminosäurepolymere oder Proteinoide, welche Mikrokugeln bilden, zum Einkapseln von Arzneimitteln beschrieben worden. So beschreibt z. B. die US-Patentschrift Nr. 9,925,673 (das '673-Patent) sowohl solche Mikrokugel-Konstrukte als auch Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung. Die Proteinoid-Mikrokugeln des '673-Patents sind zum Einkapseln einer Anzahl von aktiven Substanzen verwendbar, die Herstellungsverfahren führen jedoch zu einer komplexen Mischung von peptidartigen Polymeren mit hohem Molekulargewicht (MW) (> 1000 Dalton) und niedrigem Molekulargewicht (≤ 1000 Dalton), die schwierig zu trennen sind und relativ geringe Mengen der Mikrokugel bildenden Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht ergeben.
US 4,442,090 offenbart pharmazeutische Verbindungen zur rektalen Verabreichung sowie ein Verfahren zur Förderung der Absorption von pharmakologisch aktiven Substanzen durch den Mastdarm ins Blut.
Es besteht somit ein Bedarf in der Technik für ein einfaches und billiges Verabreichungssystem, welches einfach herzustellen ist und welches aktive Substanzen, wie proteinartige Wirkstoffe, einkapseln kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Verwendungen von Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung von biologisch aktiven Wirkstoffen, die modifizierte Aminosäuren, Aminosäurederivate, Peptide und Peptidderivate beinhalten, zur Herstellung von Medikamenten werden bereitgestellt. Diese Zusammensetzungen umfassen

(a) eine biologisch aktive Substanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desferrioxamin, Insulin und Cromolyn-Natrium (Natrium- oder Dinatriumcromoglycat);
(b) und eine acylierte Aminosäure als Träger, wie unten spezifiziert.

Im Detail stellt die vorliegende Erfindung folgendes bereit: die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend

(a) einen biologisch aktiven Wirkstoff, der Desferrioxamin ist; und
(b) einen acetylierten Aminosäureträger, verschieden von Phenylalanin, das eine Salicylolylgruppe aufweist,

Die Verwendung einer Zusammenfassung, umfassend

(a) einen biologisch aktiven Wirkstoff, der Insulin ist; und
(b) einen acetylierten Aminosäureträger verschieden von Phenylalanin, das eine Salicyloylgruppe aufweist,

Die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend

(a) einen biologisch aktiven Wirkstoff, der Chromolyn-Natrium ist; und
(b) einen acetylierten Aminosäureträger, verschieden von Phenylalanin, das eine Salicyloylgruppe aufweist,

Nur zur Erläuterung der Erfindung, jedoch nicht beansprucht ist ein Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen, welches das Vermischen von wenigstens einer biologisch aktiven Substanz mit wenigstens einem Träger, wie vorstehend beschrieben, und optional einem Dosiervehikel umfasst.
Diese nicht toxische Träger können oral an Tiere als Teil eines Verabreichungssystems durch Vermischen der Träger mit der biologisch aktiven Substanz vor der Verabreichung verabreicht werden. Die Träger können auch Mikrokugeln in Gegenwart der aktiven Substanz bilden. Die Mikrokugeln, welche die aktive Substanz enthalten, werden dann oral verabreicht. In der folgenden Erfindung werden ebenfalls orale Dosiereinheitsformen betrachtet, welche folgendes umfassen:

(a) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend
(I) einen biologisch aktiven Wirkstoff, welcher Desferrioxamin ist, Insulin oder Chromolyn-Natrium;
(II) einen acetylierten Aminosäureträger, der eine Salicyloylgruppe aufweist, wobei die Aminosäure verschieden von Phenylalanin ist; und
(III) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger bzw. ein Verdünnungsmittel; und
(b) (I) einen Hilfsstoff,
(II) ein Verdünnungsmittel,
(III) ein Sprengmittel,
(IV) ein Gleitmittel,
(V) einen Weichmacher,
(VI) einen Farbstoff,
(VII) ein Dosiervehikel oder
(VIII) irgendeine Kombination davon.

Modifizierte Aminosäuren können hergestellt werden durch Umsetzen von einzelnen Aminosäuren oder Mischungen von zweien oder mehreren Arten von Aminosäuren mit einem acetylierenden oder sulfonierenden Agens, welches mit den freien Aminogruppen, vorhanden in den Aminosäuren reagieren, um Amide bzw. Sulfonamide auszubilden. Die modifizierten Aminosäuren werden dann aus der Mischung zurückgewonnen.
Die modifizierten Aminosäuren sind nicht toxisch und können oral an Säuger als Wirkstoff-Verabreichungssystem verabreicht werden, wobei die modifizierte Aminosäure mit einer aktiven Substanz vor der Verabreichung lediglich vermischt wird. Alternativ kann die modifizierte Aminosäure in Mikrokugeln in Gegenwart der aktiven Substanz umgewandelt werden. Die Mikrokugeln, welche die eingekapselte aktive Substanz enthalten, werden dann oral verabreicht.
Beschreibung der Zeichnungen
1 erläutert Calciumspiegel im Rattenserum nach oraler Verabreichung von zwei Dosiereinheiten einer modifizierten Aminosäuren-Mikrokugelpräparation, enthaltend Calcitonin in verkapselter Form sowie eine lösliche Präparation, enthaltend einen modifizierten Aminosäureträger und Calcitonin nach Vordosierung mit einer Natriumbicarbonatlösung, wie im Beispiel 5 beschrieben.
2 erläutert die Induktion der Eisenausscheidung bei Cebus-Affen nach der oralen Verabreichung von eingekapseltem gegenüber nicht eingekapseltem Desferrioxamin (DFO).
3 zeigt die Eisenausscheidung bei Ratten nach der oralen Verabreichung von eingekapseltem DFO.
4 bis 8 sind grafische Darstellungen der Prüfung der oralen, künstlichen Sondenernährung bei Ratten mit Insulin und Salicyloylphenylalanin als Träger.
9 ist eine grafische Darstellung der Ergebnisse der Prüfung der intraduodenalen Injektion bei Ratten mit Insulin und Salicyloylphenylalanin als Träger.
10 und 11 sind grafische Darstellungen der Ergebnisse der Prüfung der oralen, künstlichen Sondenernährung bei Ratten mit Dinatriumcromoglycat und Salicyloylphenylalanin als Träger.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Im Falle von Widersprüchlichkeiten wird die vorliegende Offenbarung, einschließend die Definitionen, die Oberhand behalten.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, dass Aminosäuren in der modifizierten Formverwendet werden können, um empfindliche biologisch aktive Substanzen, z. B. Peptidhormone, wie Insulin, oral zu verabreichen, die aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegen die Denaturierungsbedingungen des Gastrointestinaltrakts (GI-Trakt) als nicht oral verabreichbar angesehen würden. Die modifizierte Aminosäure kann als Träger verwendet werden, indem sie mit der aktiven Substanz vermischt wird, oder sie kann in Mikrokugeln umgewandelt werden, welche den eingekapselten bioaktiven Wirkstoff enthalten. Im Gegensatz zu der modifizierten Aminosäure, verwendet in der Erfindung, ergeben nicht modifizierte, freie Aminosäuren eine unzureichende Schutzwirkung für labile, bioaktive Substanzen gegen den Abbau in dem GI-Trakt.
Insulin enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen sind für Säuger verwendbar, die an Diabetes leiden.
Cromolyn-Natrium, ein Antiallergikum, enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen sind für Säuger verwendbar, die an Atemwegserkrankungen, wie Asthma oder Heuschnupfen, leiden.
Die Verwendung von leicht erhältlichen und billigen Ausgangsmaterialien und ein kostenwirksames Verfahren zur Herstellung und Isolierung von modifizierten Aminosäuren, sind einfach durchzuführen und sind der industriellen Scale-up-Produktion zugänglich.
Die modifizierten Aminosäuren, verwendet in der vorliegenden Erfindung können durch Umsetzen der einzelnen Aminosäuren oder von Aminosäureestern mit einem Amin-Modifizierungsmittel hergestellt werden, das mit freien Aminogruppen reagiert, die in den Aminosäuren vorhanden sind, um Amide zu bilden. Die Aminosäuren und die Aminosäureester sind im Handel von einer Anzahl von Quellen erhältlich, wie Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA); Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA); und Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, NY, USA).
Die Aminosäuren werden in einer wässrigen, alkalischen Lösung eines Metallhydroxids, z. B. Natrium- oder Kaliumhydroxid, aufgelöst und auf eine Temperatur im Bereich zwischen etwa 5°C und etwa 70°C, vorzugsweise zwischen etwa 10°C und etwa 40°C, für eine Zeit im Bereich zwischen etwa 1 Stunde und etwa 4 Stunden, vorzugsweise etwa 2,5 Stunden, erwärmt. Die pro Äquivalent von NH₂-Gruppen in den Aminosäuren verwendete Alkalimenge liegt allgemein zwischen etwa 1,25 und etwa 3 mmol, vorzugsweise zwischen etwa 1,5 und etwa 2,25 mmol pro Äquivalent von NH₂. Der pH der Lösung liegt allgemein im Bereich zwischen etwa 8 und etwa 13, vorzugsweise im Bereich zwischen etwa 10 und etwa 12.
Danach wird dann ein Amino-Modifiziermittel zu der Aminosäurelösung unter Rühren zugesetzt. Die Temperatur der Mischung wird bei einer Temperatur gehalten, die allgemein im Bereich zwischen etwa 5°C und etwa 70°C, vorzugsweise zwischen etwa 10°C und etwa 40°C, liegt, für eine Zeit, die im Bereich zwischen etwa 1 bis etwa 4 Stunden liegt. Die Menge des Amino-Modiziermittels, das im Verhältnis zu der Menge der Aminosäuren verwendet wird, basiert auf den Molen der gesamten freien NH₂-Gruppen in den Aminosäuren. Im Allgemeinen wird das Amino-Modifiziermittel in einer Menge verwendet, die im Bereich zwischen etwa 0,5 bis etwa 2,5 Moläquivalenten, vorzugsweise zwischen etwa 0,75 und etwa 1,25 Äquivalenten, pro Moläquivalent der gesamten NH₂-Gruppen in den Aminosäuren liegt.
Beispiele von Amino-Modifiziermitteln, die nur zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung offenbart werden, umfassen sulfonierende Agentien, wie z. B. Benzensulfonylchlorid und acylierende Agentien wie z. B. Benzylchlorid, Hippurylchlorid, Salicyloylchlorid, und Carbodiimidderivate von Aminosäuren, speziell von hydrophoben Aminosäuren, wie Phenylalanin, Tryptophan und Thyrosin.
Die Reaktion wird durch Einstellen des pH-Werts der Mischung mit einer geeigneten Säure, z. B. konzentrierter Salzsäure, bis der pH einen Wert zwischen etwa 2 und etwa 3 erreicht, gequencht. Die Mischung fällt beim Stehen bei Raumtemperatur aus und bildet eine durchsichtige obere Schicht und einen weißen oder weißlichen Niederschlag. Die obere Schicht wird verworfen, und die modifizierten Aminosäuren werden aus der unteren Schicht durch Filtration oder Dekantieren gesammelt. Die rohen, modifizierten Aminosäuren werden dann in Wasser bei einem pH gelöst, der im Bereich zwischen etwa 9 bis etwa 13, vorzugsweise zwischen etwa 11 und etwa 13, liegt. Unlösliche Materialien werden durch Filtration entfernt, und das Filtrat wird unter vermindertem Druck getrocknet. Die Ausbeute an modifizierten Aminosäuren liegt allgemein im Bereich zwischen etwa 30 und etwa 60% und beträgt gewöhnlich etwa 45%.
Falls erwünscht, können Aminosäureester, wie Methyl- oder Ethylester von Aminosäuren, verwendet werden, um die modifizierte Aminosäure der Erfindung herzustellen. Die Aminosäureester, die in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Pyridin, gelöst sind, werden mit dem Amino-Modifiziermittel bei einer Temperatur, die im Bereich zwischen etwa 5°C und etwa 70°C, vorzugsweise bei etwa 25°C, liegt, für eine Zeit umgesetzt, die im Bereich zwischen etwa 7 und etwa 24 Stunden liegt. Die Mengen der Amino-Modifiziermittel, die im Verhältnis zu den Aminosäureestern verwendet werden, sind die gleichen, wie vorstehend für die Aminosäuren beschrieben wurde.
Danach wird das Reaktionslösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, und die Esterfunktionalität wird entfernt durch Hydrolysieren des modifizierten Aminosäureesters mit einer geeigneten alkalischen Lösung, z. B. 1 N Natriumhydroxid, bei einer Temperatur im Bereich zwischen etwa 50°C und etwa 80°C, vorzugsweise bei etwa 70°C, für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um die Estergruppe durch Hydrolyse abzuspalten und die modifizierte Aminosäure mit einer freien Carboxylgruppe zu bilden. Die Hydrolysemischung wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt und angesäuert, z. B. mit einer wässrigen Lösung von 25%-iger Chlorwasserstoffsäure, bis auf einen pH im Bereich zwischen etwa 2 und etwa 2,5. Die modifizierte Aminosäure fällt aus der Lösung aus und wird durch übliche Maßnahmen, wie Filtration oder Dekantieren, isoliert.
Die modifizierten Aminosäuren können durch Umkristallisieren oder durch Fraktionieren auf festen Säulenträgern gereinigt werden. Geeignete Lösungsmittelsysteme für die Umkristallisation umfassen Acetonitril, Methanol und Tetrahydrofuran. Die Fraktionierung kann durchgeführt werden auf einem geeigneten festen Säulenträger, wie Aluminiumoxid, unter Verwendung von Methanol/n-Propanol-Mischungen als mobile Phase; auf Umkehrphasen-Säulenträgern unter Verwendung von Trifluoressigsäure/Acetonitril-Mischungen als mobile Phase; und durch Ionenaustauscher-Chromatografie unter Verwendung von Wasser als mobiler Phase. Wenn eine Anionenaustauscher-Chromatografie durchgeführt wird, wird ein anschließender 0–500 mM Natriumchlorid-Gradient verwendet. Die modifizierten Aminosäuren können auch durch Extraktion mit einem niedrigeren Alkohol, wie Methanol, Butanol oder Isopropanol, gereinigt werden, um Material mit niedrigerem Molekulargewicht, das keine Kugeln bildet, zu entfernen.
Die modifizierten Aminosäuren, verwendet in der vorliegenden Erfindung sind löslich in alkalischer, wässriger Lösung (pH ≥ 9,0); teilweise löslich in Ethanol, n-Butanol und 1 : 1 (v/v) Toluol/Ethanol-Lösung und unlöslich in neutralem Wasser. Die titrierbaren funktionellen Gruppen, die in den modifizierten Aminosäuren zurückbleiben, sind wie folgt: Carbonsäuregruppen (COOH), die allgemein im Bereich zwischen etwa 1,5 und etwa 3,5 Milliäquivalent/g, vorzugsweise bei etwa 2,3 Milliäquivalent/g liegen; und Aminogruppen (NH₂), die allgemein im Bereich zwischen etwa 0,3 und etwa 0,9 Milliäquivalent/g, vorzugsweise bei etwa 0,5 Milliäquivalent/g liegen.
Falls gewünscht, können Mischungen von Aminosäuren zur Durchführung der Erfindung verwendet werden. Geeignete Aminosäuremischungen schließen synthetische Mischungen von zweien oder mehreren Arten von Aminosäuren und fertig verfügbare sauer oder via Enzym hydrolysierte Pflanzenproteine ein. Quellen von hydrolysierten flüssigen pflanzlichen Proteinen schließen Ajinomoto USA, Inc. (Teaneck, NJ 0766, USA); Central Soya Co., Inc. (Fort Wayne, IN, USA); und Champlain Industries, Inc. (Clifton, NJ, USA) und weitere Firmen, aufgeführt in "Food Engineering Master", an annual publication of Chilton Co., Radnor, PA 19089 ein. Vor der Modifikation wird die hydrolysierte Proteinlösung getrocknet und die Aminosäuremischung wird vom getrockneten Rückstand extrahiert und zwar mit einem geeigneten organischen Solvens, beispielsweise Methanol oder Tetrahydrofuran, gefolgt vom Eindampfen des Lösungsmittelextrakts.
Ein besonders bevorzugtes hydrolysiertes pflanzliches Protein zur Verwendung bei der Durchführung dieser Erfindung ist verfügbar von Ajinomoto USA unter dem Handelsnamen AJI-EKI. Dieses Produkt ist ein sauer hydrolysiertes flüssiges Sojabohnenprotein, das abgeleitet ist von entfettetem Sojabohnenmehl und hält im Allgemeinen titrierbare Carboxylsäuregruppen (COOH) im Bereich zwischen ungefähr 3 und ungefähr 8 Milliäquivalenten/g, vorzugsweise zwischen ungefähr 4 und ungefähr 6 Milliäquivalenten/g, total freie Aminogruppen (NH₂) in einem Bereich zwischen ungefähr 3 und ungefähr 9 Milliäquivalenten/g, vorzugsweise in einem Bereich von ungefähr 4 und ungefähr 6 Milliäquivalenten/g NH₂. Das molekulare Gewicht des pflanzlichen Proteins liegt zwischen ungefähr 100 D und ungefähr 2000 D, vorzugsweise zwischen ungefähr 100 und ungefähr 500 D. Die modifizierten Aminosäuren, verwendet in der vorliegenden Erfindung, sind stabil und können für die weitere Verwendung gelagert werden.
Die modifizierten Aminosäuren können als ein Wirkstoff-Verabreichungsträger durch einfaches Vermischen der modifzierten Aminosäure mit dem aktiven Bestandteil vor der Verabreichung verwendet werden. Alternativ kann die modifizierte Aminosäure verwendet werden, um Einkapselungs-Mikrokugeln zu bilden, welche die aktive Wirksubstanz enthalten. Die modifizierten Aminosäuren der Erfindung sind insbesondere für die orale Verabreichung von bestimmten pharmakologischen Substanzen verwendbar, z. B. kleinen Peptidhormonen, die selbst langsam oder überhaupt nicht durch die gastrointestinale Schleimhaut wandern und/oder einer chemischen Spaltung durch Säuren und Enzyme in dem Gastrointestinaltrakt unterliegen. Nicht limitierende Beispiele solcher Agenzien schließen menschliche oder von Rindern stammende Wachstumshormone, Interferon und Interleukin-II, Calcitonin, den atriellen naturetischen Faktor (atrial naturetic factor), Antigene und monoklonale Antikörper ein.
Wenn die modifizierten Aminosäuren als Träger für einen aktiven Bestandteil verwendet werden, wird eine wässrige Lösung der modifizierten Aminosäuren mit einer wässrigen Lösung des aktiven Bestandteils unmittelbar vor der Verabreichung vermischt. Die Lösungen können Additive enthalten, wie Phosphatpuffersalze, Citronensäure, Essigsäure, Gelatine und Akaziengummi.
Eine Lösung der modifizierten Aminosäuren wird durch Vermischen der Aminosäuren in wässriger Lösung in einer Menge, die im Bereich zwischen etwa 1 mg und etwa 2.000 mg, vorzugsweise im Bereich zwischen etwa 300 mg und etwa 800 mg, pro ml der Lösung liegt, hergestellt. Die Mischung wird dann auf eine Temperatur im Bereich zwischen etwa 20 und etwa 50°C, vorzugsweise auf etwa 40°C, erwärmt, bis die modifizierte Aminosäure aufgelöst ist. Die letztendliche Lösung enthält zwischen etwa 1 mg und etwa 2.000 mg modifizierte Aminosäuren pro ml der Lösung, vorzugsweise zwischen etwa 300 und etwa 800 mg pro ml. Die Konzentration der aktiven Substanz in der Endlösung variiert und hängt von der erforderlichen Dosis für die Behandlung ab.
Die modifizierten Aminosäuren können verwendet werden, um Mikrokugeln zum Einkapseln aktiver Wirksubstanzen herzustellen. Ein verwendbares Verfahren ist wie folgt: Modifizierte Aminosäure wird in entionisiertem Wasser in einer Konzentration, die im Bereich zwischen etwa 75 und etwa 200 mg/ml, vorzugsweise bei etwa 100 mg/ml, liegt, und bei einer Temperatur, die zwischen etwa 25°C und etwa 60°C, vorzugsweise bei etwa 40°C, liegt, aufgelöst. In der Lösung zurückbleibendes teilchenförmiges Material kann durch übliche Maßnahmen, wie Filtration über Filterpapier, entfernt werden.
Danach wird die Aminosäurelösung, die auf einer Temperatur von etwa 40°C gehalten wird, im Verhältnis 1 : 1 (V/V) mit einer wässrigen Säurelösung (die ebenfalls bei 40°C gehalten wird) mit einer Säurekonzentration, die im Bereich zwischen etwa 0,05 N und etwa 2 N, vorzugsweise bei etwa 1,7 N, liegt, vermischt. Die erhaltene Mischung wird weiter bei 40°C für eine Zeitdauer inkubiert, die zur Bildung von Mikrokugeln wirksam ist, was durch Lichtmikroskopie beobachtet wird. Bei der Durchführung dieser Erfindung ist die bevorzugte Reihenfolge der Zugabe die Zugabe der Aminosäurelösung zu der wässrigen Säurelösung.
Geeignete Säuren umfassen jede Säure, welche (a) die modifizierten Aminosäuren nicht nachteilig beeinflusst, z. B. durch chemische Zersetzung; (b) die Bildung der Mikrokugeln nicht stört; (c) die Einkapselung der Beladung in die Mikrokugeln nicht stört; und (d) nicht mit der Beladung in nachteiliger Weise wechselwirkt. Bevorzugte Säuren zur Verwendung in dieser Erfindung umfassen Essigsäure, Citronensäure, Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Äpfelsäure und Maleinsäure.
Zur Verwendung der Zusammensetzung der Erfindung wird vor der Bildungsstufe der Mikrokugeln ein die Mikrokugeln stabilisierendes Additiv vorzugsweise in die wässrige Säurelösung oder in die Aminosäurelösung eingebracht werden. Die Anwesenheit solcher Additive fördert die Stabilität und Dispergierbarkeit der Mikrokugeln in Lösung.
Die Additive können in einer Konzentration verwendet werden, die im Bereich von etwa 0,1 und 5% (W/V), vorzugsweise bei etwa 0,5% (W/V), liegt. Geeignete, nicht beschränkende Beispiele von die Mikrokugeln stabilisierenden Additiven umfassen Akaziengummi, Gelatine, Polyethylenglycol und Polylysin.
Unter diesen Bedingungen bilden die modifizierten Aminosäuremoleküle hohle Mikrokugeln mit einem Durchmesser von weniger als 10 Mikron. Wenn die modifizierten Aminosäuren-Mikrokugeln in Gegenwart eines löslichen Materials, z. B. einer pharmazeutischen Substanz in der vorstehend genannten wässrigen Säurelösung, gebildet werden, wird dieses Material in den Hohlräumen der Mikrokugeln eingekapselt und innerhalb der Aminosäurewand, die durch die kugelförmige Struktur definiert ist, festgehalten. Auf diese Weise kann man pharmakologisch aktive Materialien einkapseln, wie sowohl Peptide, Proteine und Polysaccharide als auch geladene organische Moleküle, z. B. antimikrobielle Substanzen, die über den oralen Weg eine geringe Bioverfügbarkeit haben. Die Menge der pharmazeutischen Substanz, die durch die Mikrokugel eingekapselt werden kann, hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, welche sowohl die Konzentration der Substanz in der Einkapselungslösung als auch die Affinität der Beladung zu dem Träger umfassen.
Die modifizierten Aminosäuren-Mikrokugeln, verwendet in der Erfindung, sind pharmakologisch unschädlich und ändern die physiologischen und biologischen Eigenschaften der aktiven Substanz nicht. Weiterhin ändert das Einkapselungsverfahren die pharmakologischen Eigenschaften der aktiven Substanz nicht. Obwohl jede pharmakologische Substanz in den Aminosäuren-Mikrokugeln eingekapselt werden kann, sind sie besonders wertvoll zur Verabreichung chemischer oder biologischer Substanzen, die sonst durch die im Körper des Säugers, an welchen sie verabreicht wird, vorliegenden Bedingungen zerstört oder weniger wirksam gemacht würde, bevor die Mikrokugel ihr Zielgebiet erreicht (d. h. das Gebiet, in welchem die Inhalte der Mikrokugel freizusetzen sind) und die im Gastrointestinaltrakt schwach absorbiert werden.
Die Teilchengröße der Mikrokugeln spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Freisetzung der aktiven Substanz in dem Zielgebiet des Gastroindestinaltrakts. Mikrokugeln mit Durchmessern zwischen etwa ≤ 0,1 Mikron und etwa 10 Mikron, vorzugsweise zwischen etwa 5,0 Mikron und etwa 0,1 Mikron, die aktive Substanzen einkapseln, sind ausreichend klein, um die aktive Wirksubstanz in dem Zielgebiet im Gastrointestinaltrakt wirksam freizusetzen. Kleine Mikrokugeln können auch parenteral verabreicht werden, indem sie in einer geeigneten Trägerflüssigkeit (z. B. isotronischer Kochsalzlösung) suspendiert und in das Kreislaufsystem oder subkutan injiziert werden. Große Aminosäure-Mikrokugeln (> 10 Mikron) neigen dazu, weniger wirksam als orale Verabreichungssysteme zu sein.
Die Größe der durch Kontaktieren von modifizierter Aminosäure mit Wasser oder einer wässrigen Lösung, die aktive Substanzen enthält, gebildeten Mikrokugeln kann durch Verändern einer Vielzahl von physikalischen oder chemischen Parametern, wie dem pH-Wert, der Osmolarität oder Ionenstärke der Einkapselungslösung, und durch die Auswahl der in dem Einkapselungsverfahren verwendeten Säure geregelt werden.
Die Aminosäure-Mikrokugeln, verwendet in der Erfindung, werden oral allein als Feststoffe in Form von Tabletten, Pellets, Kapseln und Granulaten verwendet, die zur Suspension in Flüssigkeiten, wie Wasser oder essbaren Ölen, geeignet sind. In ähnlicher Weise können die Mikrokugeln zu einer Zusammensetzung formuliert werden, die einen oder mehrere physiologisch verträgliche Träger oder Excipienzien enthält, und die auf oralem Weg verabreicht werden kann. Diese Zusammensetzungen können übliche Bestandteile enthalten, wie Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, und Füllstoffe, wie Stärke und Methylcellulose.
Die Menge der aktiven Wirkubstanz in der Zusammensetzung ist typischerweise eine pharmakologisch oder biologisch wirksame Menge. Die Menge kann jedoch geringer sein als eine pharmakologisch oder biologisch wirksame Menge, wenn die Zusammensetzung in einer Dosiseinheitsform, wie einer Kapsel, einer Tablette oder einer Flüssigkeit, verwendet wird, da die Dosiseinheitsform eine Vielzahl von Zusammensetzungen aus Träger und biologisch aktiver Substanz enthalten kann oder eine unterteilte pharmakologisch oder biologisch wirksame Menge enthalten kann. Die wirksamen Gesamtmengen werden durch kumulative Einheiten verabreicht, welche die gesamten pharmakologisch und biologisch aktiven Mengen der biologisch aktiven Substanz enthalten.
Die Gesamtmenge der zu verwendenden biologisch aktiven Substanz kann vom Fachmann bestimmt werden. Es hat sich jedoch überraschenderweise gezeigt, dass mit bestimmten biologisch aktiven Substanzen die Verwendung der vorliegend beschriebenen Träger eine äußerst wirksame Verabreichung ergibt. Daher können geringere Mengen der biologisch aktiven Substanz als diejenigen, die in früheren Dosiseinheitsformen oder Verabreichungssystemen verwendet wurden, dem betreffenden Lebewesen verabreicht werden, wobei die gleichen Blutspiegel und therapeutischen Wirkungen erzielt werden.
Die Menge des Trägers in der vorliegenden Erfindung ist eine für die Verabreichung wirksame Menge und kann für jeden Träger oder jede biologisch aktive Substanz durch Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Dosiseinheitsformen können ebenfalls Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel, Sprengmittel, Gleitmittel, Weichmacher, Färbemittel, und Dosisvehikel, einschließlich aber nicht beschränkt auf Wasser, 1,2-Propandiol, Ethanol, Olivenöl oder jede Kombination davon, enthalten.
Die Verabreichung der vorliegenden Zusammensetzungen oder Dosiseinheitsformen erfolgt oral.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, sollen aber nicht den Bereich der Erfindung beschränken, soweit Ausführungsformen der Erfindung betroffen sind.
Beispiel 1: Modifikation von Aminosäuren mit Benzensulfonylchlorid
Eine Mischung von sechzehn Aminosäuren wurde vor der chemischen Modifikation hergestellt. Die Bestandteile der Mischung sind in Tabelle 1 zusammengefasst. 15 g der Aminosäuremischung (Gesamtkonzentration von [-NH₂]-Gruppen = 0,61 mol) wurde in 760 ml von 1 N Natriumhydroxidlösung (0,7625 Äquivalente) bei Raumtemperatur aufgelöst. Nach Rühren für 20 Minuten wurde Benzolsulfonylchlorid (78 ml, 1 Äquivalent) über einen 20-Minuten-Zeitraum hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann für 2,5 Stunden gerührt, ohne Erhitzen. Als etwas Niederschlag auftrat, wurde weitere NaOH-Lösung (2 N) zur Lösung hinzugefügt, bis sie einen pH-Wert von 9,3 erreichte. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Mischung angesäuert unter Verwendung von verdünnter Salzsäure (38%, 1 : 4) und ein cremefarbenes Material fiel aus. Der resultierende Niederschlag wurde isolierte durch Dekantieren und Auflösen in Natriumhydroxid (2 N). Diese Lösung wurde in Vacuo reduziert und ergab einen gelben Feststoff, welcher in einem Gefriertrockner getrocknet wurde (34,5 g).
Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung
Beispiel 2: Herstellung von modifizierter Aminosäure/Lachs-Calcitonin Zusammensetzungen
(a) Herstellung von modifizierten Aminosäuren-Mikrokugeln, enthaltend verkapseltes Lachscalcitonin
Die modifizierte Aminosäuremischung, hergestellt in Übereinstimmung mit Beispiel 1 wurde bei 40°C in destilliertem Wasser (pH 7,2) in einer Konzentration von 100 mg/ml aufgelöst. Die Lösung wurde filtriert mit einem 0,2 Mikron Filter und die Temperatur wurde bei 40°C beibehalten. Lachs-Calcitonin (Sandoz Corp., Basil, Schweiz) wurde aufgelöst in einer wässrigen Lösung von Zitronensäure (1,7 N) und Gelatine (5%) bei einer Konzentration von 150 mg/ml. Die Lösung wurde dann auf 40°C erhitzt. Die beiden er hitzten Lösungen wurden dann 1 : 1 (V/V) vermischt. Die resultierende Mikrokugelsuspension wurde dann filtriert mit Glaswolle und zentrifugiert für 50 Minuten bei 1000 g. Der Niederschlag wurde resuspendiert mit 0,85 N Zitronensäure auf ein Volumen, das 5- bis 7-fach weniger als das Originalvolumen war. Die Lachs-Calcitonin-Konzentration des resuspendierten Niederschlages wurde durch HPLC bestimmt. Weitere Mikrokugeln wurden gemäß der oben dargelegten Prozedur hergestellt, ohne Lachs-Calcitonin. Diese "leeren Mikrokugeln" wurden verwendet, um die verkapselte Lachs-Calcitonin-Mikrokugel-Präparation zu verdünnen auf eine letztendliche Dosiersuspension für den Tierversuch.
(b) Herstellung eines löslichen modifizierten Aminosäureträger/Lachscalcitonin-Systems
Eine lösliche Aminosäure-Dosierungspräparation, enthaltend Lachscalcitonin, wurde hergestellt durch Auflösen des modifizierten Aminosäurematerials in destilliertem Wasser (pH 8) und einer geeigneten Konzentration. Die Lösung wurde auf 40°C erhitzt und anschließend mit einem 0,2 Mikron Filter filtriert. Lachscalcitonin, auch aufgelöst in destilliertem Wasser, wurde dann zur modifizierten Aminosäurelösung vor der oralen Verabreichung hinzugegeben.
Beispiel 3: In vivo Evaluation der Calcitonin-Präparationen in Ratten
Die in-vivo-Evaluation der modifizierten Aminosäure-Mikrokugeln, enthaltend verkapseltes Calcitonin und ein lösliches modifiziertes Aminsäureträger-/Calcitoninsystem, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde in Ratten evaluiert. Ratten wurden per Sondenernährung mit den oralen Dosierungspräparierungen versorgt und Blutproben wurden zu bestimmten verschiedenen Zeitintervallen zur Bestimmung der Serum-Calcium-Konzentration genommen.
Neun Ratten wurden in drei Gruppen wie folgt eingeteilt:

1. Calcitonin-Mikrokugeln: 10 μg Calcitonin/kg Körpergewicht durch orale Sondenfütterung (3 Ratten);
2. Calcitonin-Mikrokugeln: 30 μg Calcitonin/kg Körpergewicht durch orale Sondenfütterung (3 Ratten); und
3. Lösliches (nicht verkapseltes) modifiziertes Aminosäure-/Calcitoninsystem: 30 μg Calcitonin/kg Körpergewicht durch orale Sondenfütterung (3 Ratten). Die Ratten wurden vordosiert mit 0,7 meq einer wässrigen Natriumbicarbonatlösung vor der Verabreichung des löslichen Systems.

Die orale Sondenfütterungsdosierung der Ratten wird durchgeführt.
Die Calcitonin-Mikrokugeln werden hergestellt unmittelbar vor dem Dosieren und die erste Gruppe von Ratten und die zweite Gruppe von Ratten erhalten jeweils eine geeignete Dosierung der Mikrokugelsuspension. Die Ratten der Gruppe 3 erhalten das nicht verkapselte Calcitonin/modifizierte Aminosäuresystem. Etwa 0,5 ml an Blut wird einer jeden Ratte unmittelbar vor der Dosierung (Zeitpunkt "0") sowie 1 Stunde, 2 Stunden und 3 Stunden nach dem Dosieren abgenommen. Das Serum der Blutproben wird bei –20°C gelagert.
Die Calciumspiegel von aufgetautem Serum, genommen von den Ratten der Gruppe 1 bis 3 werden in konventionellen Verfahren analysiert. Die experimentellen Resultate in Ratten haben einen signifikanten Anstieg in der pharmakologischen Aktivität (d. h. Abnahme der Serumcalciumspiegel) gezeigt, wenn Calcitonin oral verabreicht wird, entweder verkapselt in modifizierten Aminosäure-Mikrokugeln oder in einer Mischung mit modifizierten Aminosäuren im Vergleich zu Basisspiegeln. Wie in 1 gezeigt, zeigte die modifizierte Aminosäurelösung, enthaltend Lachs-Calcitonin, einen signifikanten Anstieg in der pharmakologischen Aktivität (d. h. eine Abnahme der Serum-Calcium-Spiegel) im Vergleich zu Basisspiegeln nach der oralen Verabreichung. Die Ergebnisse zeigen, dass oral verabreichtes Calcitonin einen relativ größeren biologischen Effekt hervorrief, wenn es in seiner nicht verkapselten Form verabreicht wurde mit modifizierter Aminosäure als Träger.
Beispiel 4: Modifikation einer Mischung von fünf Aminosäuren unter Verwendung von Benzolsulfonylchlorid
Eine Mischung von 86,1 g (0,85 mol an NH₂) von Aminosäuren (siehe Tabelle 1) wurde in 643 ml (1,5 Äquivalenten) einer wässrigen 2 N Natriumhydroxidlösung aufgelöst. Nach Rühren für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde Benzolsulfonylchlorid (108 ml, 0,86 mol) portionsweise zur Aminosäurelösung über eine Zeitspanne von 15 Minuten hinzugegeben. Nach Rühren für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wurde der pH-Wert der Reaktionsmischung (pH 5) auf einen pH-Wert von pH 9 mit einer weiteren 2 N Natriumhydroxidlösung eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert der Reaktionsmischung auf pH 2,5 durch Zugabe von wässriger Salzsäurelösung (4 : 1, H₂O : HCl) eingestellt und ein Niederschlag an modifizierten Aminosäuren bildete sich aus. Die obere Schicht wurde verworfen und das resultierende gelbe Präzipitat wurde isoliert durch Dekantieren, gewaschen mit Wasser und aufgelöst in 2 N Natriumhydroxid (2 N). Die Lösung wurde in Vacuo reduziert, und resultierte in einem gelben Feststoff, welcher über Nacht gefriergetrocknet wurde. Die Ausbeute des Rohprodukts der modifizierten Aminosäuren betrug 137,9 g.
Tabelle 2
Beispiel 5: Modifikation einer Mischung von fünf Aminosäuren unter Verwendung von Benzoylchlorid
Eine Mischung von 86 g (0,85 mol an NH₂) von Aminosäuren (siehe Tabelle 2 in Beispiel 4) wurde in 637 ml (1,5 Äquivalenten) an wässriger 2 N Natriumhydroxidlösung aufgelöst. Nach Rühren für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde Benzoylchlorid (99 ml, 0,85 mol) portionsweise in die Aminosäurelösung über eine 10-Minuten-Zeitspanne hinzugegeben. Nach Rühren für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wurde der pH-Wert der Reaktionsmischung (pH 12) auf einem pH von 2,5 eingestellt unter Verwendung von verdünnter Salzsäure (4 : 1, H₂O : HCl). Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert der Reaktion eingestellt auf einen pH von 2,5 durch Zugabe von wässriger Salzsäurelösung (4 : 1, H₂O : HCl) und ein Niederschlag von modifizierten Aminosäuren bildete sich aus. Nach Sedimentieren für eine Stunde wurde der resultierende Niederschlag durch Dekantieren isoliert, mit Wasser gewaschen und in Natriumhydroxid (2 N) aufgelöst. Die Lösung wurde dann im Vacuo reduziert, was zu einem Rohprodukt modifizierter Aminosäuren in Form eines weißen Feststoffes (220,5 g) führte.
Beispiel 6: Modifikation von L-Valin unter Verwendung von Benzolsulfonylchlorid
L-Valin (50 g, 0,43 mol) wurde in 376 ml (1,75 Äquivalenten) einer wässrigen 2 N Natriumhydroxidlösung aufgelöst durch Rühren bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Benzolsulfonylchlorid (48,7 mol, 0,38 mol, 1,25 Äquivalente) wurde zur Aminosäurelösung über einen Zeitraum von 20 Minuten bei Raumtemperatur hinzugegeben. Nach Rühren für 2 Stunden bei Raumtemperatur trat ein Niederschlag auf. Der Niederschlag wurde durch Zugabe von 200 ml von weiterer 2 N Natriumhydroxidlösung aufgelöst. Nach Rühren für weitere 30 Minuten wurde verdünnte wässrige Salzsäurelösung (4 : 1, H₂O : HCl) hinzugegeben, bis der pH der Reaktionsmischung 12,6 erreichte. Der Niederschlag der modifizierten Aminosäuren bildete sich aus und wurde durch Dekantieren isoliert. Dieses Material wurde in 2 N Natriumhydroxid aufgelöst und in Vacuo getrocknet, was zu einem weißen Feststoff führte. Die Ausbeute des Rohprodukts modifizierter Aminosäuren war 84,6 g, 67%.
Beispiel 7: Modifikation von Phenylalaninmethylester unter Verwendung von Hippurylchlorid
L-Phenylalaninmethylester-Hydrochlorid (15 g, 0,084 mol) wurde in Dimethylformamid (DMF) (100 ml) aufgelöst, und zu dem ganzen wurde Pyridin (30 ml) hinzugegeben. Eine Lösung von Hippurylchlorid (16,6 g, 0,084 mol in 100 ml DMF) wurde sofort zur Aminosäureesterlösung hinzugegeben und zwar in zwei Portionen. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann in Vacuo reduziert und in 1 N wässriger Natriumhydroxidlösung aufgelöst. Die Lösung wurde bei 70°C für 3 Stunden erhitzt, um den Methylester zu einer freien Carboxylgruppe zu hydrolysieren. Anschließend wurde die Lösung angesäuert auf einen pH von 2,25 unter Verwendung einer verdünnten wässrigen Salzsäurelösung (1 : 3, HCl/H₂O), Ein gummiar tiger Niederschlag bildete sich aus und wurde isoliert und aufgelöst in 1 N Natriumhydroxid. Die Lösung wurde in Vacuo reduziert, und ergab 18,6 g an rohem Produkt modifizierter Aminosäure (Ausbeute: 18,6 g). Nach Rekristallisieren aus Acetonitril wurde reines modifiziertes Phenylalanin (12 g) als ein weißes Pulver isoliert. Schmelzpunkt 223–225°C.
Beispiel 8: Modifizierung von Phenylalanin unter Verwendung von Acetylsalicyloylchlorid
10 ml Pyridin wurden zu einer Mischung von Acetylsalicyloylchlorid (10 g, 50,4 mmol) und Phenylalaninbenzylester-Toluolsulfonat (21,4 g, 50 mmol) zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht gerührt und durch Dünnschichtchromatografie (TLC) überwacht. Die Reaktionsmischung wurde mit 1 N Chlorwasserstoffsäure (100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit MgSO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, um ein Öl zu ergeben. Das Öl wurde durch Flash-Chromatografie auf Kieselgel (30% EtOAc/Hexan) gereinigt, um 16,9 g (80,9%) reines Diesterprodukt zu ergeben, Fp. 56–57°C, Rf = 0,35 (20% EtOAc/Hexan).
Der Diester, Acetylsalicyloylphenylalaninbenzylester (30 mg, 71,9 mmol) wurde zu einer gesättigten wässrigen Lösung von NaHCO₃ (50 ml), Aceton (200 ml) und Methanol (125 ml) zugesetzt. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur gerührt und durch TLC überwacht, bis kein Ausgangsdiester zurückblieb. Die Entfernung der Lösungsmittel unter vermindertem Druck ergab eine ölige Suspension, die mit Methylenchlorid (3 × 80 ml) extrahiert wurde. Die Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen und mit MgSO₄ getrocknet. Die getrockneten Extrakte wurden filtriert und konzentriert, um das Benzylesterprodukt zu ergeben, das durch Flash-Chromatografie auf Kieselgel (30% EtOAc/Hexan) gereinigt wurde.
Der Salicyloylphenylalaninbenzylester (16,9 g, 45 mmol) wurde in Methanol (400 ml) in ein Reaktionsgefäß verbracht, und ein Palladium/Kohlenstoff-Katalysator wurde zugesetzt. Das Gefäß wurde mit Stickstoff (3 mal) gespült, und Wasserstoffgas (1,7 g) wurde eingeführt. Die Reaktion wurde durch TLC überwacht und war nach etwa 4 Stunden vollständig. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und mit Methanol gewa schen. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab eine quantitative Ausbeute des reinen Salicyloylphenylalanins, Fp. 52–53°C.
Eigenschaften sind nachstehend aufgeführt:
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 13 (s, 1H), 12 (d, 1H), 9 (d, 1H), 8 (dd, 1H), 7,4 (m, 1H), 7,2 (q, 5H), 6,9 (t, 2H), 4,7 (m, 1H), 3,1 (m, 2H).
Analyse: berechnet für C₁₆H₁₅NO₄: C 67,36; H 5,30; N 4,91
gefunden: C 67,15; H 5,27; N 4,84.
Beispiel 9: Herstellung und Bewertung von Desferrioxamin (DFO) enthaltenden Mikrokugeln
In diesem Beispiel wurde eine Studie durchgeführt, um die relative Wirksamkeit des Eisenkomplexbildners Desferrioxamin B (DFO) zu bewerten, wenn dieser oral mit modifizierten Aminosäuren als Träger verabreicht wurde. Derzeit muss DFO parenteral verabreicht werden, um eine Eisenüberladung in Säugern zu behandeln. Die derzeit akzeptierte Behandlungsart (subkutane Infusion von DFO) ergibt Probleme der Compliance, insbesondere bei Patienten, bei denen eine Komplexbildungstherapie für lange Zeiträume aufrecht erhalten werden muss, und sie ist ebenfalls schwierig in Ländern der Dritten Welt mit nicht optimalen medizinischen Einrichtungen durchzuführen. Es besteht somit ein Bedürfnis nach einer bequem oral verabreichbaren Form von DFO. Wirksame Mengen von DFO sind im Stand der Technik bekannt und liegen im Bereich zwischen etwa 10 und etwa 50 mg/kg/Tag (oder zwischen etwa 0,4 bis etwa 2,0 g/Tag insgesamt).
Die Herstellung von DFO in modifizierten Aminosäuren als Träger wurde in der gleichen Weise wie vorstehend durchgeführt. DFO wurde von Ciba-Geigy (Basel, Schweiz) unter dem Handelsnamen DESFERAL erhalten. DFO mit modifizierten Aminosäuren als Träger wurden mit Salicyloyl-Phe modifizierter Aminosäure hergestellt, und die Endsuspension mit modifizierter Aminosäure als Träger enthielt 125 mg/ml DFO.
Die Wirksamkeit des DFO mit der modifizierten Aminosäure als Träger wurde sowohl in dem Eisen-Clearance-Modellsystem bei Cebus-Affen (Bergeron et al., Sixth Cooley's Anemia Symposium, Ann. N.Y. Acad. Sci. 612: 378 (1991)) als auch bei Ratten mit einer Kanüle im Gallengang (Bergeron et al., Blood 79: 1882 (1992)) bewertet.
Experimentelles Verfahren
A. Cebus-Affen
Acht Tage vor der Wirkstoffverabreichung wurden Cebus-Affen mit Ketamin (7–10 mg/kg intramuskulär) anästhesiert, wonach eine Blutprobe für eine Grundlinie erhalten wurde. Die Tiere wurden dann in Stoffwechselkäfige überführt, und es wurde mit einer flüssigen Diät mit niedrigem Eisengehalt begonnen. Ein Tag vor der Verabreichung wurden die Tiere hungern gelassen. Am Tag 0 wurden die Tiere anästhesiert, und der Wirkstoff wurde in einer Dosis von 200 mg/kg unter Verwendung eines Pillen-Schussapparates verabreicht. Eine zusätzliche Blutprobe wurde am Tag 5 erhalten.
Fäkal- und Urinproben wurden in 24 h-Intervallen zwischen dem Tag –3 und dem Tag +5 gesammelt. Das Urinvolumen und das Nassgewicht der Fäzes wurden bestimmt, wonach die Proben autoklaviert wurden. Die Urinproben wurden dann mit Salpetersäure mit niedrigem Eisengehalt angesäuert. Die Fäzesproben wurden 48 h gefriergetrocknet, wonach ihr Trockengewicht gemessen wurde; sie wurden dann 48 h unter Rückfluss mit Salpetersäure mit niedrigem Eisengehalt gekocht. Der Eisengehalt der angesäuerten Urin- und Fäzesproben wurde dann dreifach auf einem Atomabsorptiansspektrofotometer gemessen. Die Eisen-Clearance-Raten wurden auf dem Basis eines 1 : 1 DFO-Eisenkomplexes berechnet. Die Eisenabgabe während 4 Tagen vor der Verabreichung des Wirkstoffs wurde gemittelt und von der Eisen-Clearance nach der Verabreichung subtrahiert; dieser Wert wurde durch die theoretische Abgabe dividiert, um die Wirksamkeit der Clearance zu berechnen.
Die Oralverabreichung von DFO ohne modifizierte Aminosäuren als Träger induzierte, falls überhaupt, eine geringe Clearance von Eisen in einem Zeitraum von 48 h nach der Verabreichung (2). Im Gegensatz dazu induzierte DFO, das mit der modifizierten Aminosäure der vorliegenden Erfindung als Träger vor der Verabreichung hergestellt wurde, einen raschen Spitzenwert der Eisensekretion sowohl im Urin als auch in den Fäzes, entsprechend einer 4% Clearance-Rate während dieses Intervalls. Subkutan verabreichtes DFO induzierte eine 5%-ige Clearance-Rate. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine einzige Dosis von DFO mit modifizierter Aminosäure als Träger im Wesentlichen so wirksam war wie parenteral verabreichtes DFO bei der Bereitstellung einer therapeutisch aktiven, bioverfügbaren Dosis von DFO.
B. Ratten
Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden anästhesiert, wonach ihre Gallengänge mit einer Kanüle versehen wurden, derart, dass kontinuierliche Gallenproben gesammelt werden konnten, während die Tiere sich frei in ihren Käfigen bewegen konnten. Die Ratten wurden 24 h hungern gelassen, wonach der Wirkstoff durch künstliche Sondenernährung in einer Dosis von 45 mg/kg verabreicht wurde. Gallenproben wurden in 3 h-Intervallen gesammelt und Urinproben wurden alle 24 h genommen. Der Eisengehalt der Gallen- und der Urinproben wurden durch Atomabsorptionsspektrometrie gemessen, im Wesentlichen wie in Teil A. beschrieben.
3 zeigt die Ausscheidung von Eisen in Ratten über die Galle und durch den Urin nach oraler Verabreichung von DFO mit modifizierter Aminosäure als Träger. Die Stimulation der Eisenausscheidung durch oral verabreichtes DFO mit modifizierter Aminosäure als Träger ist äquivalent zu derjenigen, die beobachtet wird, wenn freies DFO über einen subkutanen Weg verabreicht wurde (Bergeron et al., Blood, ibid.).
Beispiel 10: Herstellung eines Insulin-Verabreichungssystems
In einem Prüfrohr wurden 1.800 mg Salicyloylphenylalanin als Träger zu 4 ml Wasser zugesetzt. Die Lösung wurde gerührt, und der pH wurde auf 8,0 bis 8,5 mit NaOH (1,0 N) oder HCl (1,0 N) eingestellt.
Insulin wurde durch Zugabe von 20 mg Insulin zu 2 ml einer NaHCO₃-Lösung (40 mg/ml NaHCO₃) hergestellt. Die Konzentration des Insulins betrug 10 mg/ml.
0,900 ml der Insulinlösung wurden zu der Trägerlösung zugesetzt. Wasser wurde zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf 6,0 ml zu bringen. Die Probe hatte eine Trägerkonzentration von 300 mg/ml. Die gesamte Insulinkonzentration betrug 1,5 mg/ml.
Beispiel 11 In Vivo-Versuche mit Insulin bei Ratten
Nach dem Verfahren in Beispiel 10 wurden Präparationen aus Insulin und Träger mit 3 mg/kg Insulin mit 60 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger, 600 mg/kg Salycyloyl-Phe als Träger bzw. 1200 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger hergestellt. Ausgehungerte Ratten wurden mit Ketamin (14 mg/kg) anästhesiert. Den ausgehungerten Ratten wurde durch eine orale Sonde ein Dosiervolumen von zwei (2) ml/kg von einer der Präparationen verabreicht. Blutproben wurden durch Einschneiden der Schwanzspitze gesammelt, und ein Bluttropfen wurde mit einem ONE TOUCH II Glucose Analyzer (erhältlich von Life Scans, Inc., Mipitsas, CA, USA) analysiert.
Die Ergebnisse sind in 4 erläutert.
Beispiel 12 In Vivo-Versuch mit Insulin
Nach dem Verfahren in Beispiel 10 wurden Präparationen aus Insulin und Träger hergestellt, und einer ersten Gruppe von ausgehungerten Ratten wurde durch eine Oralsonde 0,5 mg/kg Insulin, vermischt mit 600 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger verabreicht. Einer zweiten Gruppe von ausgehungerten Ratten wurde 600 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger ohne Insulin verabreicht. Blutproben wurden gesammelt und analysiert wie in Beispiel 11 beschrieben.
Die Ergebnisse sind in 5 erläutert.
Beispiel 13 In Vivo-Versuch mit Insulin
Nach dem Verfahren in Beispiel 10 wurden Präparationen aus Insulin und Träger hergestellt, und einer ersten Gruppe von ausgehungerten Ratten wurde durch eine Oralsonde 0,5 mg/kg Insulin, vermischt mit 600 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger, verabreicht. Einer zweiten Gruppe von ausgehungerten Ratten wurde 3 mg/kg Insulin ohne einen Träger verabreicht. Blutproben wurden gesammelt und analysiert wie in Beispiel 11 beschrieben.
Die Ergebnisse sind in 6 erläutert.
Beispiel 14 In Vivo-Versuch mit Insulin
Nach dem Verfahren in Beispiel 10 wurden Präparationen aus Insulin und Träger hergestellt, und einer ersten Gruppe von ausgehungerten Ratten wurde durch eine Oralsonde 1,0 mg/kg Insulin, vermischt 600 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger, verabreicht. Einer zweiten Gruppe von ausgehungerten Ratten wurde 600 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger ohne Insulin verabreicht. Blutproben wurden gesammelt und analysiert wie in Beispiel 11 beschrieben.
Die Ergebnisse sind in 7 erläutert.
Beispiel 15 In Vivo-Versuch mit Insulin
Nach dem Verfahren in Beispiel 10 wurden Präparationen von Insulin und Träger hergestellt und einer ersten Gruppe von ausgehungerten Ratten wurde durch eine Oralsonde 3,0 mg/kg Insulin, vermischt mit 1.200 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger verabreicht. Einer zweiten Gruppe von ausgehungerten Ratten wurde durch eine Oralsonde Dosen von 1.200 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger ohne Insulin verabreicht. Blutproben wurden gesammelt und analysiert wie in Beispiel 11 beschrieben.
Die Ergebnisse sind 8 erläutert.
Beispiel 16 In Vivo-Versuch mit Insulin
Nach dem Verfahren in Beispiel 10 wurden Präparationen von Insulin und Träger hergestellt, und einer ersten Gruppe von ausgehungerten Ratten wurde durch intraduodenale Injektion 1,0 mg/kg Insulin, vermischt mit 300 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger, verabreicht. Einer zweiten Gruppe von Ratten wurde durch intraduodenale Injektion 1,0 mg/kg Insulin, vermischt mit 300 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger und 6 mg/kg Harnstoff, verabreicht. Blutproben wurden gesammelt und analysiert wie in Beispiel 11 beschrieben.
Die Ergebnisse sind in 9 erläutert.
Beispiel 17
In Vivo-Bewertung von Cromoglycat-Präparationen bei Ratten
Eine Präparation von 100 mg/ml Salicyloyl-Phe-Lösung in 0,85 N Citronensäure und 0,5% Akaziengummi und 25 mg/ml Dinatriumcromoglycat wurde hergestellt.
Ausgehungerten Ratten wurden durch ein Oralsonde Dosen der Präparation, die 50 mg/kg Dinatriumcromoglycat, vermischt mit 200 mg/kg Träger, enthält, in einem Dosiervolumen von zwei (2) ml/kg verabreicht. Die Verabreichung wurde unter Verwendung des Verfahrens bewertet, das von A. Yoshimi in Pharmcobio-Dyn., 15, Seiten 681–686, (1992) beschrieben ist.
Die Ergebnisse sind 10 erläutert.
Beispiel 18
In Vivo-Bewertung von Cromoglycat-Präparationen bei Ratten
Nach dem Verfahren in Beispiel 17 wurde eine Dinatriumcromoglycat-Präparation hergestellt, ausgehungerten Ratten wurden durch eine Oralsonde eine Mischung von 50 mg/kg Dinatriumcromoglycat und 400 mg/kg Salicyloyl-Phe als Träger in einem Dosiervolumen von zwei (2) ml/kg verabreicht.
Die Ergebnisse sind in 11 erläutert.
Wie durch die Daten in den Beispielen und Figuren klar erläutert, zeigt die Verwendung von Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung signifikante Vorteile bei der Verabreichung von biologisch aktiven Substanzen.

Claims

Die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend (a) einen biologisch aktiven Wirkstoff, welcher Desferrioxamin ist; und (b) einen acylierten Aminosäureträger, verschieden von Phenylalanin, das eine Salicyloylgruppe aufweist, zum Herstellen eines Medikaments zum Absenken der Eisenkonzentration in einem Säuger durch orale Verbreichung.
Die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend (a) einen biologisch aktiven Wirkstoff, welcher Insulin ist; und (b) einen acylierten Aminosäureträger, verschieden von Phenylalanin, das eine Salicyloylgruppe aufweist, zum Herstellen eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes in einem Säuger durch orale Verbreichung.
Die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend (a) einen biologisch aktiven Wirkstoff, welcher Cromolyn-Natrium ist; und (b) einen acylierten Aminosäureträger, verschieden von Phenylalanin, das eine Salicyloylgruppe aufweist, zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von Atemwegserkrankungen in einem Säuger durch orale Verbreichung.
Eine orale Dosierungseinheitform, umfassend (a) eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend (I) einen biologisch aktiven Wirkstoff, welcher Desferrioxamin ist, Insulin oder Cromolyn-Natrium; (II) einen acylierten Aminosäureträger, verchieden von Phenylalanin, das eine Salicyloylgruppe aufweist, (III) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein Verdünnungsmittel; und (b) (I) einen Hilfsstoff, (II) ein Verdünnungsmittel, (III) ein Sprengmittel, (IV) ein Gleitmittel, (V) einen Weichmacher, (VI) ein farbgebendes Mittel, (VII) ein Dosiervehikel, oder (VIII) irgendeine Kombination davon.