DE69332829T2

DE69332829T2 - Enzymatisches verfahren dass enzyme die an der zellwand einer eukaryontischen mikrobiellen zelle durch schaffung eines fusionsproteins immobilisiert wurden verwendet.

Info

Publication number: DE69332829T2
Application number: DE69332829T
Authority: DE
Inventors: Maria Franciscus KLIS; Pleun Maarten SCHREUDER; York Holger TOSCHKA; Theodorus Cornelis Verrips
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1992-07-08
Filing date: 1993-07-07
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2013-07-08
Also published as: JPH07508652A; NZ254108A; CA2139670C; JP2004254700A; AU4565393A; WO1994001567A1; DK0673427T3; OA10123A; RU95105899A; PT673427E; EP0673427A1; DE69332829D1; ES2196009T3; CA2139670A1; US6027910A; FI950042A0; KR950702634A; FI950042A; EP0673427B1; JP3681385B2

Description

Hintergrund der Erfindung
In der Waschmittel-, Körperpflegemittel und Lebensmittelprodukte-Industrie besteht ein starker Trend zu natürlichen Inhaltsstoffen für diese Produkte und zu ökologisch akzeptablen Herstellungsverfahren. Enzymatische Umwandlungen sind zum Erfüllen dieser Forderung der Verbraucher sehr wichtig, da diese Verfahren auf vollständig natürliche Weise ablaufen können. Darüber hinaus sind enzymatische verfahren sehr spezifisch und daraus ergibt sich, dass nur Minimalmengen an Abfallprodukten produziert werden. Solche Verfahren können in Wasser bei milden Temperaturen und bei atmosphärischem Druck durchgeführt werden. Auf freien Enzymen basierende enzymatische Verfahren sind jedoch entweder aufgrund des Verlustes des Enzyms oder aufgrund der Notwendigkeit, teure Ausstattung, wie Ultramembran-Systeme, zum Einschließen der Enzyme, zu verwenden, recht teuer.
Alternativ können Enzyme entweder physikalisch oder chemisch immobilisiert werden. Das letztere Verfahren weist oft den Nachteil auf, dass die Kopplung unter Verwendung von nicht natürlichen Chemikalien und Verfahren durchgeführt wird, was vom ökologischen Standpunkt aus nicht attraktiv ist. Darüber hinaus ist die chemische Modifizierung von Enzymen in fast jedem Fall nicht sehr spezifisch, was bedeutet, dass die Kopplung die Aktivität des Enzyms auf negative Weise beein flussen kann.
Die physikalische Immobilisierung kann die Anforderungen der Verbraucher erfüllen. Auch die physikalische Immobilisierung kann jedoch die Aktivität des Enzyms in negativer Weise beeinflussen. Darüber hinaus steht ein physikalisch immobilisiertes Enzym mit dem freien Enzym im Gleichgewicht, was bedeutet, dass im kontinuierlichen Reaktoren, gemäß den Gesetzen der Thermodynamik, ein substantieller Verlust an Enzym unvermeidlich ist.
Es gibt nur wenige Publikationen über die Immobilisierung von Enzymen in Zellen von Mikroorganismen (siehe Referenz 1). Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen auf den Zellwänden der Zellen von Mikroorganismen auf sehr präzise Weise bereit. Zusätzlich erfordert die Immobilisierung keine chemischen oder physikalischen Kopplungsschritte und sie ist sehr effizient. Von einigen extrazellulären Proteinen weiß man, dass sie spezielle Funktionen aufweisen, die sie nur dann erfüllen können, wenn sie an die Zellwand der Wirtszelle gebunden bleiben. Dieser Typ von Protein weist häufig einen langen C-terminalen Teil auf, der es in der Zellwand verankert. Diese C-Terminalen Teile weisen sehr spezielle Aminosäure-Sequenzen auf. Ein typisches Beispiel ist das Verankern über C-Terminale Sequenzen, die in Bezug auf Prolin angereichert sind (siehe Referenz 2). Ein anderer Mechanismus zum Verankern von Proteinen in Zellwänden besteht darin, dass das Protein einen Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol (GPI)-Anker aufweist (siehe Referenz 3), und dass der C-terminale Teil des Proteins eine substantielle Anzahl an potentiellen Serin und Threonin-Glykosylierungsstellen aufweist. O-Glykosylierung dieser Stellen ergibt eine stabartige Konformation des C-terminalen Teils dieser Proteine. Ein anderes Merkmal dieser Manno-Proteine liegt darin, dass sie mit dem Glucan in der Zellwand niederer Eukaryoten verbunden zu sein scheinen, da sie nicht mit SDS aus der Zellwand extrahiert werden können, jedoch durch eine Glucanase-Behandlung freigesetzt werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines niederen Eukaryoten, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Hefen und Pilzen besteht, enthaltend ein exprimierbares erstes Polynucleotid, umfassend ein Struktur-Gen, das ein Protein mit katalytischer Aktivität kodiert, wobei das Protein im Außenbereich der Zellwand des niederen Eukaryoten immobilisiert ist, und mindestens ein Teil eines Gens, kodierend für ein Ankerprotein, das zum Verankern in der Zellwand des niederen Eukaryoten Fähig ist, wobei der Teil zumindest den Ankerteil des Ankerproteins kodiert, wobei der Ankerteil aus der C-terminalen Hälfte des Ankerproteins ableitbar ist, wobei das erste Polynucleotid entweder in einem Vektor oder an einem Chromosom des niederen Eukaryoten vorliegt, zum Durchführen eines enzymatischen Verfahrens, in dem ein Substrat für das die katalytische Aktivität aufweisende Protein mit dem niederen Eukaryoten in Kontakt gebracht wird.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines rekombinanten Polynucleotids, das ein Struktur-Gen umfasst, das ein Protein mit katalytischer Aktivität kodiert, und mindestens einen Teil eines Gens, das ein Protein kodiert, das zum Verankern in einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zellwand fähig ist, wobei der Teil mindestens den C-terminalen Teil des Verankerungsproteins kodiert, um ein enzymatisches Verfahren durchzuführen. Vorzugsweise umfasst das Polynucleotid darüber hinaus eine Sequenz, die ein Signalpeptid kodiert, das die Sekretion des Expressionsproduktes des Polynucleotids sicherstellt. Ein solches Signalpeptid kann aus einem Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol(GPI)-Verankerungsprotein, α-Faktor, α-Agglutinin, Invertase oder Inulinase, α-Amylase von Bacillus oder einer Proteinase von Milchsäurebakterien abgeleitet sein. Die DNA-Sequenz, die ein Protein kodiert, das zum Verankern in der Zellwand fähig ist, kann α-Agglutinin, AGA1, FLO1 oder Major-Cell-Wahl-Protein niederer Eukaryoten oder eine Proteinase von Milchsäurebakterien kodieren. Das rekombinante Polynucleotid ist operabel mit einem Promotor verbunden, vorzugsweise einem induzierbaren Promotor. Die ein Protein katalytischer Aktivität kodierende DNA-Sequenz kann ein hydrolytisches Enzym, z. B, eine Lipase, oder eine Oxidreduktase, z. B, eine Oxidase, kodieren. Ein andere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen rekombinanten Vektor, umfassend ein Polynucleotid, wie oben beschrieben. Falls ein solcher Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die ein Protein mit katalytischer Aktivität kodiert, wobei das Protein die katalytische Aktivität zeigt, wenn es in einer multimeren Form vorliegt, kann der Vektor darüber hinaus ein zweites Polynucleotid umfassen, das ein Struktur-Gen umfasst, kodierend für das gleiche Protein mit der katalytischen Aktivität in Kombination mit einer Sequenz, die ein Signalpeptid kodiert, das die Sekretion des Expressionsproduktes des zweiten Polynucleotids sicherstellt, wobei das zweite Polynucleotid operabel mit einem regulierbaren Promotor verbunden ist, vorzugsweise einem induzierbaren oder reprimierbaren Promotor.
Falls das eine katalytische Aktivität aufweisende Protein die katalytische Aktivität zeigt, wenn es in multimerer Form vorliegt, kann die Wirtszelle oder der Mikroorganismus darüber hinaus ein zweites Polynucleotid umfassen, das ein strukturelles Gen umfasst, das für das gleiche Protein kodiert, das die katalytische Aktivität bereitstellt, in Kombination mit einer Sequenz, die ein Signalpeptid kodiert, das die Sekretion des Expressionsproduktes des zweiten Polynucleotids sicherstellt, wobei das zweite Polynucleotid in operabler Weise mit einem regulierbaren Promotor verbunden ist, vorzugsweise einem induzierbaren oder reprimierbaren Promotor, und wobei das zweite Polynucleotid entweder in einem anderen Vektor oder in dem Chromosom des Mikroorganismus vorliegt. Vorzugsweise weist die Wirtszelle oder der Mikroorganismus mindestens eines der Polynucleotide im Chromosom integrierter Form auf. Als Ergebnis der Kultivierung solcher Wirtszellen oder Mikroorganismen stellt die Erfindung eine Wirtszelle, vorzugsweise eines Mikroorganismus, bereit, die ein Protein, wie oben beschrieben, auf ihrer Zellwand immobilisiert aufweist. Die Wirtszelle oder der Mikroorganismus kann ein niederer Eukaryot, insbesondere eine Hefe sein.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Durchführung eines enzymatischen Verfahrens unter Verwendung eines immobilisierten katalytisch aktiven Proteins bereit, wobei ein Substrat für das katalytisch aktive Protein mit der erfindungsgemäßen Wirtszelle oder dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus in Kontakt gebracht wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 DNA-Sequenz des 6057 bp HindIII-Fragments, enthaltend das komplette AGal-Gen von S. cerevisiae (siehe SEQ ID NR: 1 und 2). Die Position der einzigartigen NheI-Stelle und der HindIII-Stelle, die für die beschriebenen Konstruktionen verwendet wurden, ist in der Überschrift spezifiziert.
2 Schematische Darstellung der Konstruktion von pUR2969. Die Restriktionsstellen für die verwendeten Endonucleasen sind gezeigt. Verwendete Abkürzungen: AG-alpha-1: Gen zur Expression von α-Agglutinin aus S. cerevisiae.
amp: β-Lactamase-Resistenz-Gen
PGKp: Phosphoglyceratkinase-Promotor
PGKt: Terminator des gleichen Gens.
3 α-Galactosidase-Aktivität von S. cerevisiae MT302/lC-Zellen und Kulturflüssigkeit, transformiert mit pSY13 während einer Batch-Kultur:
A: U/1 α-Galactosidase pro Zeit; der OD₅₃₀ ist auch gezeigt
B: α-Galactosidase-Aktivität von freiem und gebundenem Enzym, ausgedrückt in U/OD.₅₃₀
4 α-Galactosidase-Aktivität von S. cerevisiae MT302/1C-Zellen und Kulturflüssigkeit, transformiert mit pUR2969 während einer Batch-Kultur: A: U/1 α-Galactosidase pro Zeit; der OD₅₃₀ ist auch gezeigt
B: α-Galactosidase-Aktivität von freiem und gebundenem Enzym, ausgedrückt in U/OD₅₃₀.
5 Western-Analyse mit anti-α-Galactosidaseserum von extrazellulärer Fraktionen von Zellen in der exponentiellen Phase (OD₅₃₀ = 2). Die analysierten Fraktionen sind äquivalent zu 4 mg Zellwänden (Frischgewicht):
A: MT302/1C exprimierend α-Galactosidase,
Spur 1, Wachstumsmedium
Spur 2, SDS-Extrakt von isolierten Zellwänden
Spur 3, Glucanase-Extrakt von SDS-extrahierten Zellwänden;
B: MT302/1C exprimierend α-Gal-AGα1-Fusionsprotein,
Spur 1, Wachstumsmedium
Spur 2, SDS-Extrakt von isolierten Zellwänden
Spur 3, Glucanase-Extrakt von SDS-extrahierten Zellwänden
Spur 4, Endo-H-behandeltes Glucanase-Extrakt.
6 Immunofluoreszenz-Markierung (anti-α-Galactosidase) von MT302/1C-Zellen in der exponentiellen Phase (OD₅₃₀ = 2), exprimierend das α-Gal-α-Agglutinin-Fusionsprotein. Phasenmikrograph von intakten Zellen A: Übersicht B: Detail.
7 Schematische Darstellung der Konstruktion von pUR2970A, pUR2971A, pUR2972A und pUR2973. Die Restriktionsstellen für die verwendeten Endonucleasen sind in der Figur gezeigt. Die PCR-Oligonucleotid-Sequenzen sind im Text erwähnt.
Verwendete Abkürzungen: AGal-cds: kodierende Sequenz für α-Agglutinin
a-AGG=AGa1: Gen, exprimierend α-Agglutinin aus S. cerevisiae
amp: β-Lactamase Resistenz-Gen Pga17=GAL7: GAL7-Promotor
Lipolase: Lipase-Gen von Humicola invSS: SUC2-Signalsequenz
a-MF: Prepro-α-Paarungsfaktor-Sequenz a-gal: α-Galactosidase-Gen
LEU2d: Verkürzter Promotor des LEU2-Gens;
LEU2: LEU2-Gen mit kompletter Promotor-Sequenz.
8 DNA-Sequenz eines Fragments, enthaltend die komplette kodierende Sequenz der Lipase B aus Geotrichum candidum-Stamm 335426 (siehe SEQ ID NR: 11 und 12). Die Sequenz der reifen Lipase B beginnt bei Nucleotid 97 der gegebenen Sequenz. Die kodierende Sequenz startet bei Nucleotid 40 (ATG).
9 Schematische Präsentation der Konstruktion von pUR2975 und pUR2976. Die Restriktionsstellen für die verwendeten Endonucleasen sind gezeigt. Verwendete Abkürzungen:
a-AGG: Gen-Expression für α-Agglutinin aus S. cerevisiae
amp: β-Lactamase-Resistenz-Gen Pgal7=GAL7: GAL7-Promotor invSS: SUC2-Signal-Sequenz a-MF: Prepro-α-Paarungsfaktor-Sequenz
LEU2d: verkürzter LEU2-Gen-Promotor Lipolase: Lipase-Gen aus Humicola
LipaseB: LipaseB aus Geotrichum candidum.
10 Schematische Präsentation der Konstruktion von pUR2981 und pUR2982. Die Restriktionsstellen für die verwendeten Endonucleasen sind gezeigt. Verwendete Abkürzungen:
a-AGG = AG-alpha 1: Gen, das α-Agglutinin aus S. cerevisiae exprimiert
Mucor-Lipase: Lipase-Gen aus Rhizomucor meihei 2u: 2 μm-Sequenz
Pgal7=GAL7: GAL7-Promotor invSS: SUC2-Signal-Sequenz
a-MF: Prepro-α-Paarungsfaktor-Sequenz Lipolase: Lipase-Gen aus Humicola
amp: β-Lactamase-Resistenz-Gen; LEU2d: verkürztes Promotor-LEU2-Gen
LEU2: LEU2-Gen mit kompletter Promotor-Sequenz.
11 DNA-Sequenz (2658 Basen) des 894-Aminiosäurekodierenden Teils des FLO1-Gens (siehe SEQ ID NR: 21 und 22), wobei die angegebene Sequenz mit dem Kodon für die erste Aminosäure startet und mit dem Stopp-Kodon endet.
12 Schematische Präsentation des Plasmids pUR2990. Einige Restriktionsstellen für Endonucleasen, die für das angegeben Klonierungsverfahren relevant sind, sind gezeigt.
13 Schematische Präsentation des Plasmids pUR7034.
14 Schematische Präsentation des Plasmids pUR2972B.
15 Immunofluoreszenz-Markierung (anti-Lipolase) von SU10-Zellen in der exponentiellen Phase (OD₅₃₀ = 0,5), exprimierend das Lipolase/-α-Agglutinin-Fusionsprotein.
A: Phasenmikrograph B: dazu passender Fluoreszenzmikrograph
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Immobilisierung eines Enzyms bereit, umfassend das Immobilisieren des Enzyms oder eines funktionellen Teils davon auf der Zellwand einer Wirtszelle, vorzugsweise einer mikrobiellen Zelle, unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken. Insbesondere wird der C-terminale Teil eines Proteins, das die Verankerung in der Zelle sicherstellt, mit einem Enzym oder einem funktionellen Teil eines Enzyms in einer solchen Weise verbunden, dass das Enzym auf oder gerade über der Zelloberfläche lokalisiert ist. Auf diese Art werden immobilisierte Enzyme auf der Oberfläche von Zellen erhalten. Die Verbindung wird auf der Stufe der Gene durchgeführt und ist dadurch charakterisiert, dass das für das Enzym kodierende Struktur-Gen mit mindestens einem Teil eines Gens gekoppelt ist, das ein Ankerprotein auf solche Art kodiert, dass in dem Expressionsprodukt das Enzym mit seinem C-terminalen Ende an den Cterminalen Teil des Ankerproteins gekoppelt ist. Dem chimären Enzym geht vorzugsweise eine Signal-Sequenz voraus, die die effiziente Sekretion des chimären Proteins sicherstellt.
Daher betrifft die Erfindung ein rekombinantes Polynucleotid, umfassend ein Struktur-Gen, das für ein Protein kodiert, das eine katalytische Aktivität bereitstellt und mindestens einen Teil eines Gens, das für ein Protein kodiert, das zum Verankern in einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zellwand fähig ist, wobei dieser Teil mindestens den C-terminalen Teil des Verankerungsproteins kodiert. Die Länge des C-terminalen Teils des Verankerungsproteins kann variieren. Obwohl das gesamte Struktur-Protein verwendet werden könnte, ist es bevorzugt, dass nur ein Teil verwendet wird, der zu einer effizienteren Exponierung des Enzymproteins in dem die Zelle umgebenden Medium führt. Der Verankerungsteil des Verankerungsproteins sollte vorzugsweise vollständig vorliegen. Zum Beispiel könnte etwa die C-terminale Hälfte des Verankerungsproteins verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Polynucleotid darüber hinaus eine Sequenz, die ein Signalpeptid kodiert, das die Sekretion des Expressionsprodukts des Polynucleotids sicherstellt. Das Signalpeptid kann vom GPI-Verankerungsprotein, α-Faktor, α-Agglutinin, Invertase oder Inulinase, α-Amylase von Bacillus oder einer Proteinase von Milchsäurebakterien abgeleitet sein. Das zum Verankern in der Zellwand fähige Protein ist vorzugsweise aus der Gruppe aus Agglutinin, AGA1, FLO1 (Flokkulationsprotein) oder dem Major-Cell-Wall-Protein von niederen Eukaryoten oder einer Proteinase von Milchsäurebakterien ausgewählt. Das erfindungsgemäße Polynucleotid ist vorzugsweise operabel mit einem Promotor verbunden, vorzugsweise einem regulierbaren Promotor, insbesondere einem induzierbaren Promotor.
Die Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Vektor, enthaltend das Polynucleotid, wie oben beschrieben, und eine Wirtszelle, die dieses Polynucleotid enthält, oder diesen Vektor. In einem Sonderfall, wenn das die katalytische Aktivität zeigende Protein die katalytische Aktivität zeigt, wenn es in multimerer Form vorliegt, wie es bei Oxidreduktasen der Fall sein kann, kann die Dimerisierung oder Multimerisierung der Monomeren eine Vorbedingung für die Aktivität sein. Der Vektor und/oder die Wirtszelle kann dann darüber hinaus ein zweites Polynucleotid umfassen, das ein. strukturelles Gen umfasst, das für das gleiche Protein mit katalytischer Aktivität kodiert, in Kombination mit einer Sequenz, die ein Signalpeptid kodiert, das die Sekretion des Expressionsproduktes des zweiten Polynucleotids sicherstellt, wobei das zweite Polynucleotid operabel mit einem regulierbaren Promotor verbunden ist, vorzugsweise einem induzierbaren oder reprimierbaren Promotor. Expression und Sekretion des zweiten Polynucleotids nach Expression und Sekretion des ersten Polynucleotids führt dann zur Bildung eines aktiven Multimers auf der Außenseite der Zellwand. Die Wirtszelle oder der Mikroorganismus enthält vorzugsweise das oben beschriebene Polynucleotid oder im Falle einer Kombination mindestens eines der Polynucleotide integriert in seinem Chromosom.
Die vorliegende Erfindung betrifft niedere Eukaryoten, wie Hefen, die sehr stabile Zellwände aufweisen, und Proteine aufweisen, von denen bekannt ist, dass sie in der Zellwand verankert sind, z. B. α-Agglutinin oder das Produkt des Gens FLO1. Geeignete Hefen gehören zu den Genera Candida, Debaryomyces, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia und Saccharomyces. Es können auch Pilze verwendet werden, insbesondere Aspergillus, Penicillium und Rhizopus. Für bestimmte Anwendungen sind auch Prokaryoten verwendbar.
Im Fall von Hefen betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere Gene, die chimäre Enzyme kodieren, die bestehen aus:

a. Die Signalsequenz, z. B. abgeleitet aus dem α-Faktor-, der Invertase-, dem α-Agglutinin- oder den Inulase-Genen;
b. Struktur-Gene, die hydrolytische Enzyme, wie α-Galactosidase, Proteasen, Peptidasen, Pektinasen, Pectylesterase, Rhamnogalacturonase, Esterasen und Lipasen, oder nicht-hydrolytische Enzyme, wie Oxidasen, kodieren; und
c. der C-Terminus von typischerweise Zellwand-gebundenen Proteinen, wie α-Agglutinin (siehe Referenz 4), AGAl (siehe Referenz 5) und FLO1 (siehe die nicht vorveröffentlichte Referenz 6).

Die Expression dieser Gene kann unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors stattfinden, aber stärker bevorzugt. sind regulierbare, d. h. reprimierbare oder induzierbare Promotoren, wie der GAL7-Promotor für Saccharomyces oder der Inulinase-Promotor für Kluyveromyces oder der Methanoloxidase-Promotor für Hansenula.
Vorzugsweise werden die Konstrukte auf solche Art hergestellt, dass die neue genetische Information auf stabile Weise in das Chromosom in der Wirtszelle integriert wird.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus eine Wirtszelle, insbesondere einen Mikroorganismus, der das oben beschriebene chimäre Protein immobilisiert auf seiner Zellwand aufweist. Sie betrifft die Verwendung solcher Mikroorganismen zum Ausführen eines enzymatischen Verfahrens durch Inkontaktbringen des Substrats für das Enzym mit dem Mikroorganismus. Ein solches Verfahren kann z. B. in einer gepackten Säule durchgeführt werden, wobei die Mikroorganismen auf einem Träger aus festen Partikeln vorliegen können oder in einem gerührten Reaktor. Die Reaktion kann wässerig oder nicht-wässerig sein. Falls notwendig, können zur Leistungsfähigkeit der Enzyme notwendige Additive zugesetzt werden, z. B. kann ein Kofaktor in das Reaktionsmedium eingeführt werden.
Nach wiederholter Verwendung des Systems natürlich immobilisierter Enzyme in Verfahren kann die Leistungsfähigkeit des Systems sinken. Dies wird entweder durch physikalische Denaturierung oder durch chemisches Vergiften oder Ablösen des Enzyms verursacht. Ein besonderes Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das System nach der Verwendung aus dem Reaktionsmedium durch einfache Zentrifugierung oder Membranfiltrationstechniken gewonnen werden kann, und die so gewonnenen Zellen in ein Wiederherstellungsmedium transferiert werden können, in dem die Zellen schnell wieder belebt werden und dementsprechend das chimäre Protein produzieren, so dass sichergestellt wird, dass die Oberfläche der Zellen von vollständig aktivem immobilisierten Enzym bedeckt ist. Dieses Regenerationsverfahren ist einfach und billig, und daher verbessert es die Wirtschaftlichkeit der enzymatischen Verfahren und kann dazu führen, dass eine wesentlich breitere Anwendung von Verfahren möglich ist, die auf den immobilisierten Enzym-Systemen beruhen.
In keiner Weise ist jedoch die vorliegende Erfindung auf die Wiederverwendbarkeit der immobilisierten Enzyme beschränkt.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen illustriert, ohne dass der Schutzbereich der Erfindung darauf beschränkt ist.
BEISPIEL 1 Immobilisiertes α-Galactosidase/α-Agglutinin auf der Oberfläche von S. cerevisiae
Das α-Agglutinin-kodierende Gen ist von Lipke et al. (siehe Referenz 4) beschrieben worden. Die Sequenz eines 6057 bp HindIII-Insert in pTZ18R, enthaltend das gesamte AGal-Gen, wird in 1 angegeben. Die kodierende Sequenz erstreckt sich über 650 Aminosäuren, einschließlich einer angenommenen Signal-Sequenz, die bei Nucleotid 3653 mit ATG beginnt. Die einzigartige NehI-Stelle schneidet die DNA bei Position 988 der angegebenen kodierenden Sequenz innerhalb des kodierenden Teils der Aminosäure 330, wodurch das α-Agglutinin in einen N-terminalen und einen C-terminalen Teil etwa der gleichen Größe getrennt wird.
Durch Verdau von pUR2968 (siehe 2) mit NheI/HindIII wurde ein 1,4 kb-Fragment abgetrennt, das die Sequenzinformation dse mutmaßlichen Zellwandankers enthält. Für die Fusion mit α-Galactosidase wurde das Plasmid pSY16 verwendet, ein episomaler Vektor auf Basis von YEplac 181, der die α-Galactosidase-Sequenz nach der SUC2-Invertase-Signal-Sequenz enthält und zwischen dem konstitutiven PGK-Promotor und dem PGK-Terminator platziert. Die StyI-Stelle, vorliegend in den letzten neun Basenpaaren des offenen Leserasters des α-Galactosidase-Gens, wurde mit der NheI-Stelle des AGaI-Genfragmentes ligiert. Um die Fusion innerhalb des Leserasters sicherzustellen, wurde die StyI-Stelle aufgefüllt und der 5'-Überhang der NehI-Stelle wurde entfernt, bevor die Ligation in den StyI/HindIII-verdauten pSY13 stattfand (siehe 2).
Um den korrekten Zusammenbau des neuen Plasmids zu verifizieren, wurde der Shuttle-Vektor in E. coli JM109 (recAI supE44 endAI insdRl7 gyrA96 RelA1 thi •(lac-proAB) F' (traD36 proAB⁺ lac^q lacZ•M15]) (siehe Referenz 7) durch das von Chung et al. (siehe Referenz 8) beschriebene Transformationsprotokoll transformiert. Einer der positiven Klone, bezeichnet als pUR2969 wurde weiter charakterisiert, die DNA wurde gemäß dem Quiagen-Protokoll isoliert und gereinigt und anschließend durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Die DNA-Sequenzierung wurde hauptsächlich wie von Sanger et al. (siehe Referenz 9) und Hsiao (siehe Referenz 10) beschrieben durchgeführt, in diesem Fall mit dem Sequenase-Version 2,0 Kit von United States Biochemical Company, gemäß dem Protokoll mit T7 DNA-Polymerase (Amersham International plc) und [³⁵S]dATPαS (Amersham International plc: 370 MBq/ml; 22 TBq/mmol) .
Dieses Plasmid wurde dann in S. cerevisiae-Stamm MT302/1C gemäß dem Protokoll von Klebe et al. (siehe Referenz 11) transformiert.
Hefe-Transformanten wurden auf Selektionsplatten selektiert, denen Leucin fehlte, auf die 40 μ1 (20 mg/ml DMF) X-α-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-α-D-glucose, Boehringer Mannheim) verteilt war, um direkt auf α-Galactosidase-Aktivität zu testen (siehe Referenz 12). Um die Expression, Sekretion, Lokalisation und Aktivität des chimären Proteins zu demonstrieren, wurden die folgenden Analysen durchgeführt:
1. Expression und Sekretion
S. cerevisiae-Stamm MT302/1C wurde entweder mit Plasmid pSY13, enthaltend das α-Galactosidase-Gen von Cyamopsis tetragonoloba oder dem Plasmid pUR2969, enthaltend das α-Galactosidase/α-Agglutinin-Fusionskonstrukt, transformiert.
In Batch-Kulturen wurden die α-Galactosidase-Aktivitäten für gewaschene Zellen und Wachstumsmedium bestimmt. Die Ergebnisse sind in den 3 und 4 angegeben. Die in Hefezellen mit dem Plasmid pSYl3 exprimierte α-Galactosidase lag fast ausschließlich im Wachstumsmedium vor (3A), während das α-Galactosidase-α-Agglutinin-Fusionsprotein fast ausschließlich zellassoziiert war (siehe 4A). Darüber hinaus hatte das immobilisierte Zellwand-assoziierte α-Galactosidase/α-Agglutinin-Fusionsenzym die komplette Aktivität über die gesamte Inkubationszeit erhalten, während das sekretierte und freigesetzte Enzym etwa 90% seiner Aktivität nach einer Inkubation über 65 Stunden verloren hatte. Dies zeigt an, dass die Immobilisierung des beschriebenen Enzyms auf der Zellwand der Hefe das Enzym gegen Inaktivierung vermutlich über Proteinasen schützt und dabei die Stabilität signifikant erhöht. Genaue Informationen über Lokalisierung der verschiedenen Genprodukte wurde durch Western-Analyse erhalten. Daher wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in 10 mM Tris.HCl, pH 7,8; 1 mM PMSF bei 0°C, gewaschen, und alle anschließenden Schritte wurden bei der gleichen Temperatur durchgeführt. 3 ml Isolationspuffer und 10 g Glaskügelchen wurden pro Gramm Zellen (Nassgewicht) zugesetzt. Die Mischung wurde in einem Griffin-Schüttler bei 50% seiner Maximalgeschwindigkeit für 30 Minuten geschüttelt. Der Überstand wurde isoliert und die Glaskügelchen wurden mit 1 mM NaCl und 1 mM PMSF gewaschen, bis die Waschflüssigkeit klar blieb. Der Überstand und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt. Die Zellwände wurden durch Zentrifugation gewonnen und anschließend in 1 mM PMSF gewaschen.
Nicht kovalent gebundene Proteine oder Proteine, die über Disulfid-Brücken gebunden waren, wurden von den Zellwänden durch Kochen für 5 Minuten in 50 mM Tris.HCl, pH 7,8; enthaltend 2% SDS, 100 mM EDTA und 40 mM β-Mercaptoethanol, abgelöst. Die SDS-extrahierten Zellwände wurden mehrmals in 1 mM PMSF gewaschen, um SDS zu entfernen. 10 mg Zellwand (Nassgewicht) wurden in 20 l 100 mM Natriumacetat, pH 5,0, enthaltend 1 mM PMSF, aufgenommen. Dazu wurden 0,5 mU β-1,3-Glucanase (Laminarase; Sigma L5144) als Quelle von β-1,3-Glucanase verwendet) zugesetzt, gefolgt von Inkubierung für 2 Stunden bei 37°C. Anschließend wurden weitere 0,5 mU β-1,3-Glucanase zugesetzt, gefolgt von Inkubierung für weitere 2 Stunden bei 37°C.
Die Proteine wurden vor einer Endo-H-Behandlung durch Kochen für 5 Minuten denaturiert. 2 mg Protein wurden mit 1 ml 50 mM Kaliumphosphat, pH 5,5, enthaltend 100 mM β-Mercaptoethanol und 0,5 mM PMSF, mit 40 mU Endo-H (Boehringer) für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 20 mU Endo-H zugesetzt, gefolgt von 24 Stunden Inkubation bei 37°C.
Die Proteine wurden durch SDS-PAGE gemäß Laemmli (siehe Referenz 13) in 2,2–20% Gradientgelen aufgetrennt. Die Gele wurden durch elektrophoretischen Transfer auf Immobilon-Polyvinylidendifluorid-Membran (Millipore) geplottet, wie durch Towbin et al. (siehe Referenz 14) beschrieben. Im Falle der hochglykosylierten Proteine wurde anschließend eine milde Periodatbehandlung in 50 mM Periodsäure, 100 mM Natriumace tat, pH 4,5, für mehrere Stunden bei 4°C durchgeführt. Alle anschließenden Inkubationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Blot wurde in PBS, enthaltend 0,5% Gelatine und 0,5% Tween-20, für 1 Stunde geblockt, gefolgt von Inkubierung für 1 Stunden in Proben-Puffer (PBS, 0,2% Gelatine, 0,1% Tween-20), enthaltend 1 : 200-verdünntes Serum. Der Blot wurde anschließend in Waschpuffer (PBS, 0,2% Gelatine, 0,5% Tween-20) gewaschen, gefolgt von Inkubation für 1 Stunde in Proben-Puffer, enthaltend ¹²⁵Iod-markiertes Protein A (Amersham). Nach mehrfachem Waschen in Wasch-Puffer wurde der Blot luftgetrocknet, in Saran (Dow) eingewickelt und auf X-omat-S-Film (Kodak) mit einem Intensivierungsschirm bei –70°C aufgelegt. Ein Omnimedia 6cx-Scanner und das Adobe-Photoshop-Programm wurden verwendet, um die Menge des markierten Proteins zu quantifizieren. Die Ergebnisse der verschiedenen Protein-Isolierungsverfahren für beide Transformanten sind in 5 angegeben. Während für die Transformanten, die das pSY13-Plasmid enthielten, die Gesamtmasse des Enzyms in dem Medium lokalisiert war, wobei nur kleine Mengen des Enzyms mehr auf der Zellwand festgehalten waren, als dass sie daran gebunden waren (5A), – diese konnten durch SDS-Extraktion komplett entfernt werden – war das Fusionsprotein fest an die Zellwand gebunden; wobei nur kleine Mengen des α-Galactosidase/α-Agglutinins in die umgebende Kulturflüssigkeit abgegeben wurden oder SDS-extrahierbar waren. Zu der Laminarinase-Extraktion von Zellwänden aus Zellen, die die freie α-Galactosidase exprimierten, bei der keine weitere Freisetzung an Enzym beobachtet wurde, führte die identische Behandlung von Fusionsenzym-exprimierenden Zellen zur Freisetzung der Hauptmenge des Enzyms. Dies zeigt an, dass das Fusionsprotein sofort mit dem Zellwand-Glucan in S. cerevisiae assoziiert, wie α-Agglutinin, während α-Galactosidase al- leine dies nicht tut. Die anschließend durchgeführte EndoH-Behandlung zeigte eine starke Glykosylierung des Fusionsproteins, ein Ergebnis, dass in vollständiger Übereinstimmung mit der beschriebenen starken Glykosylierung des C-terminalen Teils von α-Agglutinin steht.
2. Lokalisierung
Immunofluoreszenz-Markierung mit anti-α-Galactosidase-Serum wurde an intakten Zellen durchgeführt, um das Vorliegen und die Verteilung von α-Galactosidase/α-Agglutinin-Fusionsprotein in der Zellwand zu bestimmen. Es wurde eine Immunofluorenzenz-Markierung ohne Fixierung gemäß Watzele et al. (siehe Referenz 15) durchgeführt. Zellen mit OD₅₃₀ = 2 wurden iso liert und in TBS (10 mM Tris.HCl, pH, 7,8, enthaltend 140 mM NaCl, 5 mM EDTA und 20 μg/ml Cycloheximid) gewaschen. Die Zellen wurden in TBS + anti-α-Galactosidase-Serum für 1 Stunde inkubiert, gefolgt von mehrfachem Waschen in TBS. Die anschließende Inkubierung wurde mit FITC-konjugiertem anti-Kaninchen IgG (Sigma) für 30 Minuten durchgeführt. Nach Waschen in TBS wurden die Zellen in 10 mM Tris.HCl, pH 9,0, enthaltend 1 mg/ml p-Phenylendiamin und 0,1% Azid, aufgenommen und wurden auf einem Zeiss 68000-Mikroskop photographiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 6 angegeben und zeigen klar, dass das chimäre α-Galactosidase/α-Agglutinin auf der Oberfläche der Hefezelle lokalisiert ist. Knospungen von verschiedenen Größen, wobei sogar sehr kleine sehr gleichmäßig markiert sind, demonstrieren, dass das Fusionsprotein über den ganzen Zellzyklus hinweg kontinuierlich in die Zellwand eingebaut wird und sofort fest verbunden ist.
3. Aktivität
Um α-Galactosidase-Aktivität quantitativ zu testen, wurden 200 μl-Proben, enthaltend 0,1 M Natriumacetat, pH 4,5 und 10 mM p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranosid (Sigma), bei 37°C für exakt 5 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zentrifugierung von 1 ml 2% Natriumcarbonat gestoppt. Aus intakten Zellen und Zellwänden, entfernt durch Zentrifugation und isoliert und gewaschen wie beschrieben, wurde die α-Galactosidase-Aktivität unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von p-Nitrophenyl von 18,4 cm²/Mol bei 410 nm berechnet. Eine Einheit wurde definiert als die Hydrolyse von 1 μMol Substrat pro Minute bei 37°C.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Währen die große Mehrheit der α-Galactosidase in der Kulturflüssigkeit verteilt war, war der Hauptteil des Fusionsproteins mit den Zellen assoziiert, insbesondere mit der Zellwand. Aus den in den 3 bis 6 und in Tabelle 1 gezeigten Ergebnissen konnte in der Zusammenschau berechnet werden, dass die enzy matische α-Galactosidase-Aktivität des chimären Enzyms genauso gut ist wie die des freien Enzyms. Darüber hinaus hat in der stationären Phase die Aktivität der α-Galactosidase in dem Wachstumsmedium abgenommen, wohingegen die Aktivität des Zellwand-assoziierten α-Galactosidase-α-Agglutinin-Fusionsproteins konstant blieb, was anzeigt, dass das Zellassoziierte Fusionsprotein vor Inaktivierung oder einem proteolytischen Abbau geschützt ist.
N.B. Die wesentlichen Teile dieses BEISPIELS wurden im Prioritätsjahr von M.P. Schreuder et al. (siehe Referenz 25) publiziert.
BEISPIEL 2A Immobilisierte Humicola-Lipase/α-Agglutinin auf der Oberfläche von S. cerevisiae (induzierbare Expression von immobilisiertem Enzymsystem)
Die Konstruktion und Isolierung des 1,4 kb NehI/HindIII- Fragments, enthaltend den C-terminalen Teil des α-Agglutinins, ist in BEISPIEL 1 beschrieben worden. Das Plasmid pUR7021 enthält ein 894 bp langes synthetisch hergestelltes DNA-Fragment, kodierend die Lipase von Humicola (siehe Referenz 16 und SEQ ID NR: 7 und 8), kloniert in die Eco-RI/HindIII-Restriktionsstellen des kommerziell erhältlichen Vektors pZT18R (siehe 7). Für die richtige Ein-Schritt-Modifikation von sowohl dem 5'-Ende als auch dem 3'-Ende des DNA-Teils, der für die reife Lipase kodiert, kann die PCR-Technik angewendet werden. Daher können die DNA-Oligonucleotide Lipo1 (siehe SEQ ID NR: 3) und Lipo2 (siehe SEQ ID NR: 6) als Primer in einem Standard-PCR-Protokoll verwendet werden, wodurch ein 826 bp langes DNA-Fragment mit einer EagI- und HindIII-Restriktionsstelle an den Enden erzeugt wird, das mit dem größeren Teil des EagI/HindIII verdauten pUR2650 kombiniert werden kann, einem Plasmid, das das α-Galactosidase-Gen nach der Invertase-Signal-Sequenz enthält, wie vorhergehend in dieser Beschreibung erläutert, wodurch das das Plasmid pUR2970A (siehe 7) erzeugt wird.
PCR-Oligonucleotide für die Verbindung innerhalb des Leserasters von Humicola-Lipase und dem C-Terminus von α-Agglutinin.
a: PCR-Oligonucleotide für den Übergang zwischen SUC2-Signalsequenz und den N-Terminus von Lipase.
b: PCR-Oligonucleotide für den Übergang innerhalb des Rasters zwischen dem C-Terminus der Lipase und dem Cterminalen Teil von α-Agglutinin
Mittels des PCR-Verfahrens wird eine NheI-Stelle am Ende der kodierenden Sequenz der Lipase erzeugt, was die Verbindung innerhalb des Rasters zwischen der DNA, die für die Lipase kodiert, und der DNA, die für den C-terminalen Teil des α-Agglutinins kodiert, erlaubt. Das Plasmid pUR2970A kann dann mit NheI und HindIII verdaut werden und das 1,4 kb NheI/HindIII-Fragment, enthaltend den C-terminalen Teil von α-Agglutinin von Plasmid pUR2968, kann mit dem größeren Teil des NheI und HindIII behandelten Plasmids pUR2970A kombiniert werden, was zu Plasmid pUR2971A führt. Von diesem Plasmid kann das 2,2 kb EagI/HindIII-Fragment isoliert und in den EagI- und HindIII-behandelten pUR2741 ligiert werden, wobei das Plasmid pUR2741 ein Derivat von pUR2740 (siehe Referenz 17) ist, wobei die zweite EagI-Restriktionsstelle in dem bereits inaktiven Tet-Resistenz-Gen durch NruI/SalI-Verdau deletiert wurde. Die SalI-Stelle wurde vor der Religation aufgefüllt. Die Ligation resultiert dann in pUR2972A, enthaltend den GAL7-Promotor, die Invertase-Signal-Sequenz, das chimäre Lipase/α-Agglutinin-Gen, die 2 μm-Sequenz, den defektiven LEU2-Promotor und das Leu2-Gen. Dieses Plasmid kann zur Transformierung von S. cerevisiae verwendet werden und die transformierten Zellen können in YP-Medium kultiviert werden, enthaltend Galactose als Induzierer, ohne dass reprimierende Mengen von Glucose vorliegen, was die Expression des chimären Lipase/α-Agglutinin-Gens hervorruft.
Die Expression, Sekretion, Lokalisierung und Aktivität des chimären Lipase/α-Agglutinins kann unter Verwendung ähnlicher Verfahren analysiert werden, wie sie in BEISPIEL 1 angegeben sind.
Auf ähnliche Weise können Varianten der Humicola-Lipase, erhalten auf dem Wege von rDNA-Techniken, mit dem C-terminalen Teil des α-Agglutinins verbunden werden, wobei diese Varianten eine höhere Stabilität während des (Inter)veresterungsprozesses aufweisen können.
BEISPIEL 2B Immobilisiertes Humicola-Lipase/α-Agglutinin auf der Oberfläche von S. cerevisiae (induzierbare Expression von immobilisiertem Enzymsystem
BEISPIEL 2A beschreibt ein Protokoll zum Herstellen eines speziellen Konstrukts. Vor der Durchführung der Arbeiten kommt man zu dem Ergebnis, dass es zweckmäßiger wäre, den in BEISPIEL 1 beschriebenen Expressionsvektor zu verwenden, so dass der in BEISPIEL 2B angegebene Konstruktionsweg geringfügig von den in BEISPIEL 2A angegebenen Konstruktionsweg abweicht und die resultierenden Plasmide nicht mit denen in BEISPIEL 2A beschriebenen identisch sind. Das essentielle Gen-Konstrukt mit dem Promotor, der Signal-Sequenz und dem Struktur-Gen, das für das Fusionsprotein kodiert, ist jedoch in den BEISPIELEN 2A und 2B gleich.
1. Konstruktion
Die Konstruktion und Isolierung des 1,4 kb NheI/HindIII-Fragments, kodierend für den C-terminalen Teil des α-Agglutinin-Zellwand-Proteins, ist in BEISPIEL 1 beschrieben worden. Das Plasmid pUR7033 (ähnlich pUR7021 aus BEISPIEL 2A) wurde durch Behandeln des kommerziell erhältlichen Vektors pTZ18R mit EcoRI und HindIII und Ligieren des resultierenden Vektorfragments mit einem 894 pb langen synthetisch produzierten DNA-EcoRI/HindIII-Fragment hergestellt, das für die Lipase von Humicola kodiert (siehe SEQ ID NR: 7 und 8 und Referenz 16).
Für die Fusion der Lipase an die C-terminale Zellwand-Anker umfassende Domäne des α-Agglutinins wurde das Plasmid pUR7033 mit EagI und HindIII verdaut, und die Lipasekodierende Sequenz wurde isoliert und in den EagI- und HindIII-verdauten Hefe-Expressionsvektor pSY1 (siehe Referenz 27) ligiert, wodurch pUR7034 (siehe 13) erzeugt wurde. Dies ist ein 2 μm episomaler Expressionsvektor, enthaltend das in BEISPIEL 1 beschriebene α-Galactosidase-Gen, nach der Invertase (SUC2)-Signal-Sequenz unter der Kontrolle des induzierbaren GAL7-Promotors.
Parallel zu diesem Verdau wurde pUR7033 auch mit EcoRV und HindIII verdaut, wodurch ein 57 bp langes DNA-Fragment freigesetzt wurde, das die Kodons für die letzten 15 Carboxyterminalen Rminosäuren umfasste. Dieses Fragment wurde gegen ein kleines DNA-Fragment ausgetauscht, das durch die Hybridisierung von zwei chemische synthetisierten Desoxyoligonucleotiden SEQ ID NR: 9 und 10 erzeugt wurde. Nach Annealen der beiden DNA-Stränge haben diese beiden Oligonucleotide im wesentlichen den Rest der 3'-kodierenden Sequenz des anfänglichen Lipase-Gens rekonstruiert, aber zusätzlich stromabwärts von dem Lipase-Gen eine neue NheI-Restriktionsstelle eingeführt, gefolgt von einer HindIII-Stelle in der unmittelbaren Umgebung, wodurch die ersten drei Nucleotide der NheI-Stelle das Kodon der letzten Aminosäure der Lipase bilden. Das resultierende Plasmid wurde pUR2970B genannt. Anschließend wurde diese Zwischenkonstruktion mit EagI und NheI verdaut, das Lipase-kodierende Fragment wurde isoliert und zusammen mit dem 1,4 kb NheI/HindIII-Fragment von pUR2968 in den EagI- und HindIII-geschnittenen pSYl-Vektor ligiert. Das Ergebnis dieser 3-Punkt-Ligation wurde pUR2972B genannt (siehe 14), der endgültige Lipolase-α-Agglutinin-Hefe-Expressionsvektor.
Dieses Plasmid wurde zum Transformieren von S. cerevisiae Stamm SU10, wie in Referenz 17 beschrieben, verwendet und die transformierten Zellen wurden in YP-Medium kultiviert, das Galactose als Induzieren enthielt, ohne das reprimierende Mengen an Glucose vorlagen, was die Expression des chimären Lipase/α-Agglutinins verursachte.
2. Aktivität
Um die Lipase-Aktivität zu quantifizieren, wurden zwei Aktivitätsmessungen mit zwei unterschiedlichen Substraten durchgeführt. In beiden Fällen wurden SU10-Hefezellen mit entweder dem Plasmid pUR7034 transformiert oder pSYl diente als Kontrolle. Daher wurden Hefezellen-Transformanten, die entweder das Plasmid pSYl oder das Plasmid pUR7034 oder das Plasmid pUR2972B enthielten, für 24 Stunden in YNB-Glucose-Medium angezogen, das mit Histidin und Uracil ergänzt war, dann 1 : 10 in YP-Medium verdünnt, das mit 5% Galactose ergänzt war, und erneut kultiviert. Nach 24 Stunden Inkubation bei 30°C wurde eine erste Messung für beide Assays durchgeführt.
Der erste angewandte Assay war die pH-Stat-Methode. Bei diesem Assay wird eine Einheit an Lipase-Aktivität als die Menge des Enzyms definiert, die zur Freisetzung eines Mikromols Fettsäure pro Minute aus einem Triglycerid-Substrat unter Standard-Assay-Bedingungen fähig ist (30 ml Assay-Lösung, enthaltend 38 mM Olivenöl, das als reines Trioleat aufgefasst wurde, emulgiert mit 1 : 1 Gew./Gew. Gummiarabikum, 20 mM Calciumchlorid, 40 mM Natriumchlorid, 5 mM Tris, pH 9,0, 30°C) in einem Radiometer-pH-Stat-Apparat (pHM 84 pH-Meter, ABU 80-Autoburette, TTA 60-Titrationsaufbau). Die gebildeten Fettsäuren wurden mit 0,05 N NaOH titriert, und die gemessene Aktivität wurde auf den Alkalienverbrauch im Intervall zwischen 1 und 2 Minuten nach Zugabe des mutmaßlichen Enzym-Batches basiert. Um auf immobilisierte Lipase-Aktivität zu testen, wurde 1 ml jeder Kultur zentrifugiert, der Überstand wurde aufbewahrt, das Pellet wurde resuspendiert und mit 1 ml 1 M Sorbitol gewaschen, anschließend wieder zentrifugiert und in 200 μl 1 M Sorbitol resuspendiert. Für jeden Typ an Hefezellen wurden der erste Überstand und die gewaschenen Zellen auf Lipase-Aktivität getestet. A: Lipase-Aktivität nach 24 h (LU/ml)
B: Lipase-Aktivität nach 48 h (LU/ml)
Der Rest der Hefekulturen wurden weiter inkubiert und im wesentlichen wurde das gleiche Trennverfahren nach 48 Stunden durchgeführt. In Abhängigkeit von der anfänglich gemessenen Aktivität variierte das tatsächliche Volumen der gemessenen Proben zwischen 25 μl und 150 μl.
Diese Serie an Messungen zeigt an, dass Hefezellen, die das für das Lipase-α-Agglutinin-Fusionsprotein kodierende Plasmid umfassen, tatsächlich einige Lipase-Aktivität exprimieren, die mit den Hefezellen assoziiert sind.
Ein zusätzlicher zweiter Assay wurde durchgeführt, um die Immobilisierung der Lipase-Aktivität auf der Hefezellenoberfläche zusätzlich zu bestätigen. In Kürze wird bei diesem Assay die Genetik der PNP(= Paranitrophenyl)-Abspaltung aus PNP-Butyrat durch Messung der OD bei 400 nm bestimmt. Daher werden 10 ml Kulturen, die Hefezellen mit entweder pSYl, pUR7034 oder pUR2972B enthalten, zentrifugiert, und das Pellet wird in 4 ml Puffer A (0,1 M NaORc, pH 5,0 und 1 mM PMSF) resuspendiert, von diesen 4 ml werden 500 μl erneut zentrifugiert und in 500 μl PNB-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 20 mM CaCl₂, 25 mM NaCl) resuspendiert, erneut zentrifugiert, und schließlich in 400 μl PNB-Puffer resuspendiert. Diese Fraktion wurde verwendet, um die zellgebundene Fraktion der Lipase zu bestimmen.
Die verbleibenden 3500 μl wurden abzentrifugiert, das Pellet wurde in 4 ml A resuspendiert, zu jedem von diesen wurde 40 μl Laminarinase (aus Mollusc, 1,25 mU/μl) zugesetzt und zunächst 3 Stunden bei 37°C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 20°C. Dann wurde die Reaktionsmischung, die immer noch die intakten Zellen enthielt, erneut zentrifugiert und der überstand wurde verwendet, um die Menge an ursprünglich zellwandgebundenem Material zu bestimmen, das durch die Laminarinase-Inkubation freigesetzt worden war. Das End-Pellet wurde in 400 μl PNP-Puffer resuspendiert, um den noch zellassoziierten Teil zu berechnen. Die Leerreaktion eines definierten Volumens an spezifischer Kulturfraktion in 4 ml Assay-Puffer wurde bestimmt, und dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 80 μl Substratlösung (100 mM PNP-Butyrat in Methanol) gestartet, und die Reaktion wurde bei 25°C bei 400 nm in einem Spektrophotometer beobachtet.
Dieses Resultat zeigt positiv, dass eine signifikante Menge der Lipase-Aktivität auf der Oberfläche der Hefezellen immobilisiert ist, die das Plasmid pUR2972B enthalten. Erneut fand hier die Inkorporation auf eine solche Weise statt, dass die Reaktion durch Zellwand-insertierte Lipase von intakten Zellen katalysiert wurde, was die nach außen orientierte Immobilisierung anzeigt. Darüber hinaus zeigte das Freisetzen einer signifikanten Menge der Lipase-Aktivität nach der Inkubation mit Laminarinase erneut die vermutlich kovalente Inkorporation eines heterologen Enzyms durch Genfusion mit dem C-terminalen Teil von α-Agglutinin.
3. Lokalisierung
Die Expression, Sekretion und anschließende Inkorporation des Lipase-α-Agglutinin-Fusionsproteins in die Zellwand wurde auch durch Immunofluoreszenz-Markierung mit anti-Lipolase-Serum beschrieben, im wesentlichen wie in BEISPIEL 1 beschrieben, Punkt 2. Lokalisation.
Wie aus 15 ersehen werden kann, zeigt die Immunofluoreszenzfärbung im wesentlichen ein analoges Bild wie die α-Galactosidase-Immunofärbung, wobei klar detektierbare Reaktivität auf der Außenseite der Zelloberfläche vorliegt (siehe 15A, die einen klaren Hof um die Zellen zeigt, und B, die einen leichteren Ring auf der Oberfläche der Zelen zeigt), aber weder in dem Medium noch im Inneren der Zellen. Hefezellen, die pUR2972B exprimieren, das Humicola-Lipase-α-Agglutinin-Fusio-nsprotein, werden auf der Oberfläche homogen angefärbt, was zeigt, dass tatsächlich die Gesamtimmobilisierung des chimären Enzyms mit einem α-Agglutinin-C-Terminus auf der Außenseite der Hefezellen erfolgt. In dem durchgeführten Kontrollexperiment dienten SU10-Hefezellen, die das Plasmid pUR7034 enthielten, als Kontrolle, und hier konnte keine Zelloberflächen-gebundene Reaktivität gegen das eingesetzte anti-Lipase-Serum detektiert werden.
In ähnlicher Weise können Varianten von Humicola-Lipase, erhalten durch rDNA-Techniken mit dem C-terminalen Teil des α-Agglutinins verbunden werden, wobei diese Varianten während dse (Inter-)Veresterungsprozesses eine höhere Stabilität aufweisen können.
BEISPIEL 3
Immobilisierte Humicola-Lipase-α-Agglutinin auf der Oberfläche von S. cerevisiae (konstitutive Expression von immobilisiertem Enzymsystem)
Plasmid pUR2972, wie in Beispiel 2 beschrieben, kann mit EagI und HindIII behandelt werden und das etwa 2,2 kb-Fragment, das das Lipase/α-Agglutinin-Gen enthält, kann isoliert werden. Das Plasmid pSYl6 kann mit EagI und HindIII restrikti onsbehandelt werden und zwischen diese Stellen kann das 2,2 kb-Fragment, das das Lipase/α-Agglutinin-Fragment enthält, 1igiert werden, was zu pUR2973 führt. Der Teil dieses Plasmids, der in der Produktion des chimären Enzyms involviert ist, ist ähnlich dem pUR2972, mit Ausnahme der Signal-Sequenz. Während pUR2972 die SUC2-Invertase-Signal-Sequenz enthält, enthält pUR2973 die α-Paarungsfaktor-Signal-Sequenz (siehe Referenz 18). Darüber hinaus enthält das Plasmid pUR2973 das LEU2-Marker-Gen mit der kompletten Promotor-Sequenz anstelle der verkürzten Promotorversion von pUR2972.
BEISPIEL 4 Immobilisiertes Geotrichum-Lipase/α-Agglutinin auf der Oberfläche von S. cerevisiae
Die Konstruktion und Isolierung des 1,4 kb NheI/HindIII-Fragments, umfassend den C-terminalen Teil des AGa-1(α-Agglutinin)-Gens wurde in BEISPIEL 1 beschrieben. Für die Genfusion im Leseraster der DNA, die für den C-terminalen Membrananker des α-Agglutinins kodiert, mit der kompletten kodierenden Sequenz von Geotrichum candidum-Lipase B aus Stamm CMICC 335426 (siehe 8 und SEQ ID NR: 11 und 12), kann das Plasmid pUR2974 verwendet werden. Dieses Plasmid, abgeleitet aus dem kommerziell erhältlichen pBluescript II SK-Plasmid, enthält die für die komplette G. candidum-Lipase II kodierende cDNA auf einem 1850 bp langen EcoRI/XhoI-Insert (siehe 9).
Um einen Expressionsvektor für S. cerevisiae mit homologen Signal-Sequenzen zu entwickeln, wurde der N-Terminus der reifen Lipase B experimentell durch Standard-Techniken bestimmt. Die erhaltene Aminosäure-Sequenz von "Gln-Ala-Pro-Thr-Ala-Val..." ist in vollkommener Übereinstimmung mit der Spaltungs stelle der Signalpeptidase auf der G. candidum-Lipase II (siehe Referenz 19).
Für die Fusion der reifen Lipase B an die S. cerevisiae-Signal-Sequenz von SUC2 (Invertase) oder dem α-Paarungsfaktor (Prepro-αMF) einerseits und die Fusion im Leseraster mit dem 3'-Teil des AGal-Gens kann die PCR-Technik verwendet werden. Der PCR-Primer Lipo3 (siehe SEQ ID NR: 13) kann so konstruiert werden, dass die ursprünglich vorliegende EagI-Stelle im 5'-Teil der kodierenden Sequenz (umspannend die Kodons 5 bis 7 des reifen Proteins) inaktiviert wird, ohne dass eine Änderung der Aminosäure-Sequenz eintritt. Um das anschließende Klonierungsverfahren zu erleichtern, kann der PCR-Primer darüber hinaus eine neue EagI-Stelle am 5'-Ende enthalten, zur Ligation im Leseraster mit der SUC2-Signal-Sequenz bzw. der Prepro-α-MF-Sequenz. Der korrespondierende PCR-Primer Lipo4 (siehe SEQ ID NR: 16) enthält eine extra NheI-Stelle hinter den Nucleotiden, die für den C-Terminus der Lipase B kodieren, um die richtige Fusion des Cterminalen Teils des α-Agglutinins sicherzustellen.
PCR-Oligonucleotide für die Verbindung im Leseraster von G. candidum-Lipase II mit der SUC2-Signal-Sequenz des Cterminalen Teils von α-Agglutinin. a: N-terminaler Übergang zu entweder der Prepro-α-MF-Sequenz oder der SUC2-Signal-Sequenz
b: C-terminale Fusion des C-Teils von α-Agglutinin
Das PCR-Produkt mit den modifizierten Enden kann durch Standard-PCR-Protokolle erzeugt werden, unter Verwendung anstelle der normalen Ampli-Taq-Polymerase der neuen thermostabilen VENT-Polymerase, die auch eine Kontroll-Leseaktivität aufweist, um eine fehlerfreie DNA-Matrize sicherzustellen. Durch Verdau der vorhergehend beschriebenen Plasmids pUR2972 mit EagI (komplett) und NheI (Teil) kann das Humicola-Lipase-Fragment gegen das DNA-Fragment ausgetauscht werden, das für Lipase B kodiert, wodurch der End-S. cerivisiae-Expressionsvektor pUR2975 erzeugt wird (siehe 9).
Die Humicola-Lipase-α-Agglutinin-Fusionsprotein-kodierende Sequenz kann gegen das oben beschriebene Lipase B/α-Agglutinin-Fusionskonstrukt ausgetauscht werden, durch Verdau des beschriebenen Vektors pUR2973 mit EagI/HindIII, was zu pUR2976 führt (siehe 9).
BEISPIEL 5 Immobilisiertes Rhizomucor miehei-Lipase/α-Agglutinin auf der Oberfläche von S. cerevisiae
Die Konstruktion und Isolierung des 1,4 kb NheI/HindIII-Fragments, das den C-terminalen Teil des α-Agglutinins kodiert, ist in BEISPIEL 1 beschrieben worden. Das Plasmid pUR2980 enthält 1,25 kb cDNA-Fragment, kloniert in die SmaI- Stelle des kommerziell erhältlichen pUC18, wobei das (synthetisch synthetisierbare) Fragment die komplette kodierende Sequenz der Triglycerid-Lipase aus Rhizomucor miehei (siehe Referenz 20) kodiert, einem Enzym, das in einer Anzahl von Verfahren zur Umesterung von Triacylglycerolen (siehe Referenz 21) oder zur Herstellung von biologischen Tensiden (siehe Referenz 22) verwendet wird. Neben den 269 Kodons des reifen Lipasemoleküls enthält das Fragment auch Kodons für das 24 Aminosäure-Signalpeptid sowie 70 Aminosäuren des Propeptids. Die PCR kann einfach angewendet werden, um die richtige Fusion des reifen Lipase-kodierenden Gen-Fragments mit der SUC2-Signal-Sequenz oder der Prepro-α-Paarungsfaktor-Sequenz aus S. cerevisiae sicherzustellen, sowie die Fusion im Leseraster mit dem beschriebenen NheI/HindIII-Fragment. Die folgenden beiden Primer Lipo5 (siehe SEQ ID NR:17) und Lipo6 (siehe SEQ ID NR: 20) erzeugen ein 830 bp DNA-Fragment, das nach Proteinase K-Behandlung und Verdau mit EagI und NheI als ein 816 bp langes Fragment in die EagI/NheI-verdauten Plasmide pUR2972 bzw. pUR2973 kloniert werden kann (siehe 7).
Diese neuen S. cerevisiae-Expressionsplasmide enthalten den GAL7-Promotor, die Invertase-Signal-Sequenz (pUR2981) oder die Prepro-α-Paarungsfaktor-Sequenz (pUR2982), das chimäre Rhizomucor miehei-Lipase/α-Agglutinin-Gen, die 2 μm-Sequenz, den defektiven (verkürzten) Leu2-Promotor und das Leu2-Gen. Diese Plasmide können in S. cerevisiae transformiert werden und unter Verwendung von in vorherigen Beispielen beschriebenen Protokollen aufgezogen und analysiert werden.
BEISPIEL 6 Immobilisierte Aspergillus niger-Glucoseoxidase/GPI-verankerte Zellwandproteine auf der Oberfläche von S. cerevisiae
Glucoseoxidase (β-D: Sauerstoff 1-Oxidoreduktase, EC 1.1.3.4) aus Aspergillus niger katalysiert die Oxidation von β-D-Glucose zu Glucono-δ-lacton und die einhergehende Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid. Das fungale Enzym besteht aus einem Homodimer des Molekulargewichts 150.000, das zwei eng gebundene FAD-Kofaktoren enthält. Neben der Verwendung in Glucose-Detektionskits ist das Enzym als Quelle von Wasserstoffperoxid bei der Lebensmittelkonservierung verwendbar. Das Gen wurde sowohl von cDNA als auch von genomischen Bibliotheken kloniert, das einzige offene Leseraster enthält keine unterbrechende Sequenzen und kodiert ein Protein von 605 Aminosäuren (siehe Referenz 23).
Mit Hilfe von zwei geeigneten Oligonucleotiden wird der kodierende Teil der Sequenz in einer Ein-Schritt-Modifizierungsprozedur durch PCR so angepasst, dass ein Fusions-Genprodukt erhalten wird, das für Glucoseoxidase und den C-terminalen Zellwandanker des FLO1-Genprodukts oder α-Agglutinins kodiert. Daher können einige der in den vorhergehenden BEISPIELEN beschriebenen Plasmide verwendet werden, um die entsprechende Sequenz im Leseraster zwischen eine in den BEISPIELEN verwendete Signal-Sequenz und den NheI/HinIII-Teil des AGa1-Gens zu integrieren.
Da die Dimerisierung von zwei Monomeren eine Voraussetzung für Aktivität sein kann, kann in einem alternativen Ansatz die komplette kodierende Sequenz für Glucoseoxidase ohne den GPI-Anker in S. cerevisiae-Transformanten exprimiert werden, die bereits das Fusionskonstrukt enthalten. Dies kann durch konstitutive Expression des Fusionskonstruktes mit dem GPI-Anker mit Hilfe von z. B. dem GAPDH- oder dem PGK-Promotor ermöglicht werden. Das nicht-gebundene nicht verankerte Monomer kann durch Verwendung eines DNA-Konstruktes hergestellt werden, das einen induzierbaren Promotor umfasst, z. B. den GAL7-Promotor.
BEISPIEL 7 Verfahren zur Umwandlung von Raffinose, Stachyose und ähnlichen Zuckern in Soja-Extrakten mit α-Galactosidase/α-Agglutinin, immobilisiert
auf Hefen
Die mit dem Plasmid pUR2969 transformierte Hefe kann in großem Maßstab kultiviert werden. Die gewaschenen Zellen sollten in regelmäßigen Intervallen auf das Vorliegen von α-Galactosidase-Aktivität auf ihrer Oberfläche analysiert werden, und zwar mit in dem BEISPIEL 1 beschriebenen Methoden. Wenn sowohl die Zelldichte als auch die α-Galactosidase-Aktivität/Biomasse ihr Maximum erreichen, können die Hefezellen durch Zentrifugation geerntet und gewaschen werden. Die gewaschenen Zellen können dann zu Soja-Extrakten zugegeben werden. Die Endkonzentration der Hefezellen kann zwischen 0,1 und 10 g/l variieren, vorzugsweise würde die Konzentration über 1 g/l liegen. Die Temperatur des Soja-Extraktes sollte 8°C sein, um die metabolische Aktivität der Hefezellen zu reduzieren. Die Konversion von Raffinose und Stachyose kann mit HPLC-Verfahren analysiert werden, und nach 95% Konversion dieser Zucker können die Hefezellen durch Zentrifugation entfernt werden und ihre α-Galactosidase-Aktivität/g-Biomasse kann gemessen werden. Zentrifugate mit guter Aktivität können in einem anschließenden Konversionsverfahren verwendet werden, wobei Zentrifugate mit einer Aktivität von weniger als 50% der ursprünglichen Aktivität in dem Wachstumsmedium wiederbelebt werden können, und man kann die Zellen sich für 2 bis 4 Stunden erholen lassen. Danach werden die Zellen zentrifugiert, gewaschen und anschließend in einem darauf folgenden Konversionsverfahren verwendet.
BEISPIEL 8 Produktion von biologischen Tensiden unter Verwendung von Humicola-Lipase/α-Agglutinin, immobilisiert auf Hefen
Die mit dem Plasmid pUR2972 oder pUR2973 transformierte Hefe kann im großen Maßstab kultiviert werden. Zu regelmäßigen Intervallen während der Kultivierung können die gewaschenen Zellen auf das Vorliegen von Lipase-Aktivität auf ihrer Oberfläche nach den in BEISPIEL 1 beschriebenen Methoden analsiert werden. Wenn sowohl die Zelldichte als auch die Lipase-Biomasse ihr Maximum erreichen, können die Hefezellen durch Zentrifugation gewonnen und gewaschen werden. Die gewaschenen Zellen können in einer kleinen Menge Wasser suspendiert und zu einem Reaktortank zugesetzt werden, der eine Mischung aus Fettsäuren, vorzugsweise einer Kettenlänge zwischen 12 und 18 Kohlenstoffatomen, und Zuckern, vorzugsweise Glucose, Galactose oder Sucrose, zugesetzt werden. Die Gesamtkonzentration an Wasser (ausschließlich des Wassers in den Hefezellen) kann unter 0,1% liegen. Die Endkonzentration der Hefezellen kann zwischen 0,1 und 10 g/l variieren, vorzugsweise liegt die Konzentration über 1 g/l. Der Tank muss unter einer Atmosphäre von N₂ und CO₂ gehalten werden, um die Oxidation von (ungesättigten) Fettsäuren zu vermeiden und die metabolische Aktivität der Hefen zu minimieren. Die Temperatur der Mischung in dem Tank sollte zwischen 30 und 60°C liegen, in Abhängigkeit von dem Typ der verwendeten Fettsäure. Die Konversion der Fettsäuren kann mit GLC-Verfahren analysiert werden, und nach 95% Konversion dieser Fettsäuren können die Hefezellen durch Zentrifugation entfernt werden und ihre Lipase-Aktivität/g-Biomasse kann gemessen werden. Zentrifugate mit guter Aktivität können in einem anschließenden Umwandlungsverfahren verwendet werden, wobei Zentrifugate mit einer Aktivität von weniger als 50% der Originalaktivität in dem Wachstumsmedium wiederbelebt werden können und man kann die Zellen sich für 2 bis 8 Stunden erholen lassen. Danach können die Zellen wieder zentrifugiert, gewaschen und in einem anschließenden Konversionsverfahren verwendet werden.
BEISPIEL 9 Herstellung von speziellen Arten von Triacylglycerolen unter Verwendung von Rhizomucor miehei-Lipase/α-Agglutinin, immobilisiert auf Hefen
Die mit dem Plasmid pUR2981 oder pUR2982 transformierte Hefe kann in großem Maßstab kultiviert werden. Während der Kultivierung können die gewaschenen Zellen in regelmäßigen Intervallen nach dem in BEISPIEL 1 beschriebenen Verfahren auf das Vorliegen von Lipase-Aktivität auf ihrer Oberfläche analysiert werden. Wenn sowohl die Zelldichte als auch die Lipase/Biomasse ihr Maximum erreichen, können die Hefezellen durch Zentrifugation gewonnen und gewaschen werden. Die gewaschenen Zellen können in einer kleinen Menge Wasser suspen diert und in einen Reaktortank zugegeben werden, der eine Mischung aus verschiedenen Triacylglycerolen und Fettsäuren enthält. Die Gesamtkonzentration an Wasser (ausschließlich des Wassers in den Hefezellen) kann unter 0,1% liegen. Die Endkonzentration der Hefezellen kann zwischen 0,1 und 10 g/l variieren, vorzugsweise liegt die Konzentration über 1 g/l. Der Tank muss unter einer Atmosphäre aus N₂ und CO₂ gehalten werden, um eine Oxidation der (ungesättigten) Fettsäuren zu verhindern und die metabolische Aktivität der Hefen zu minimieren. Die Temperatur der Mischung in dem Tank sollte zwischen 30 und 70°C liegen, in Abhängigkeit von der Art von Triacylglycerolen und Fettsäuren, die verwendet werden. Der Grad der Umesterung kann mit GLC/MS-Verfahren analysiert werden und nach Bildung von mindestens 80% des theoretischen Wertes des erwünschten Typs an Triacylglycerol können die Hefezellen durch Zentrifugation entfernt und ihre Lipase-Aktivität/g-Biomasse kann gemessen werden. Zentrifugate mit guter Aktivität können in einem anschließenden Umwandlungsverfahren verwendet werden, wobei Zentrifugate mit einer Aktivität von weniger als 50% der Originalaktivität in dem Wachstumsmedium wiederbelebt werden können und man kann die Zellen sich für 2 bis 8 Stunden erholen lassen. Danach können die Zellen zentrifugiert, gewaschen und in einem anschließenden Umesterungsverfahren verwendet werden.
Bäckerhefen des Stamms MT302/1C, transformiert entweder mit dem Plasmid pSY13 oder dem Plasmid pUR2969 (beschrieben in BEISPIEL 1) wurden unter dem Budapester Vertrag bei dem Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) am 3. Juli 1992 unter den vorläufigen Nummern 330.92 bzw. 329.92 hinterlegt.
BEISPIEL 10 Immobilisierte Humicola-Lipase/FLO1-Fusion auf der Oberfläche von S. cerevisiae
Flokkulation, beschrieben als "die (reversible) Aggregation von dispergierten Hefezellen zu Flocken" (siehe Referenz 24), ist das wichtigste Merkmal von Hefestämmen in industriellen Fermentationen. Daneben ist dies auch von prinzipiellem Interesse, da es sich um eine Eigenschaft handelt, die mit den Zellwand-Proteinen assoziiert ist, und es handelt sich um eine quantitative charakteristische Eigenschaft. Eines der mit dem Flokkulations-Phenotyp in S. cerevisiae assoziierten Gene ist das FLO1-Gen. Das Gen ist etwa 24 kb vom rechten Ende des Chromosoms I lokalisiert und die DNA-Sequenz eines Klons, der große Teile des FLO1-Gens enthält, ist vor kurzem beschrieben worden (siehe Referenz 26). Die Sequenz wird in 11 und SEQ ID NR: 21 und 22 angegeben. Das geklonte Fragment scheint etwa 2 kb kürzer zu sein als die genomische Kopie, abgeschätzt aus Southern und Northern Hybridisierungen, aber es schließt beide Enden des FLO1-Gens ein. Analyse der DNA-Sequenzdaten zeigt, dass das mutmaßliche Protein am N-Terminus eine hydrophobe Region enthält, was das Vorliegen einer Signal-Sequenz für die Sekretion bestätigt, ein hydrophober C-Terminus, der vielleicht als Signal für das Anbringen eines GPI-Ankers dient, und viele Glykosylierungsstellen, insbesondere im C-Terminus, mit 46,6% Serin und Threonin im willkürlich definierten C-Terminus (aa 271–894). Es ist daher wahrscheinlich, dass das FLO1-Genprodukt in einer orientierten Art der Zellwand der Hefe lokalisiert ist, und es kann direkt in Verfahren zur Interaktion mit Nachbarzellen invol-viert sein. Die geklonte FLO1-Sequenz kann daher für die Immobilisierung von Proteinen oder Peptiden auf der Zelloberfläche durch verschiedene Arten von Zellwandankern geeignet sein.
Es können rekombinante DNA-Konstrukte erhalten werden, z. B. durch Verwendung der DNA., die für die Aminosäuren 271–894 des FLO1-Genproduktes kodiert, d. h. Polynucleotid 811–2682 aus 11. Durch Anwendung von zwei PCR-Primern pcrfio1 (siehe SEQ ID NR: 23) und pcrflo2 (siehe SEQ ID NR: 26) können NheI und HindIII-Stellen an beiden Erden der DNA-Fragments eingeführt werden. In einem zweiten Schritt kann das 1,4 kb NheI/HindIII-Fragment, das in pGR2972 (entweder A oder B) vorliegt, und den C-terminalen Teil des α-Agglutinins enthä1t, durch das 1,9 kb DNA-Fragment ersetzt werden, das für den C-Terminalen Teil des FLO1-Proteins kodiert, was zu Plasmid pUR2990 (siehe 12) führt, umfassend eine DNA-Sequenz, kodierend (a) die Invertase-Signal-Sequenz (SUC2) vor (b) dem Fusionsprotein, bestehend aus (b.1) der Lipase aus Humicola (siehe Referenz 16), gefolgt von (b.2) dem C-Terminus des FlO1-Proteins (aa 271–894).
PCR-Oligonucleotide für die Verbindung von Genen im Leseraster, die die Humicola-Lipase und den C-terminalen Teil des FLO1-Genproduktes kodieren.
Plasmid pUR2972 (entweder A oder B) kann mit NheI (teilweise) und HindIII einer Restriktionsbehandlung unterzogen werden, und das NheI/HindIII-Fragment, umfassend das Vektorgerüst und das Lipase-Gen, kann mit dem entsprechend verdauten PCR-Produkt des Plasmids ligiert werden, das die FlO1-Sequenz enthält; dies führt zu Plasmid pUR2990, enthaltend den GAL7-Promotor, die S. cerevisiae-Invertase-Signal-Sequenz, das chimäre Lipase/FLO1-Gen, die Hefe 2 μm-Sequenz, den defektiven Leu2-Promotor und das Leu2-Gen. Dieses Plasmid kann in S. cerevisiae transformiert werden und die transformierten Zellen können im YP-Medium kultiviert werden, das Galactose als Induktor einschließt.
Die Expression, Sektretion, Lokalisierung und Aktivität des chimären Lipase/FLO1-Proteins kann unter Verwendung von ähnlichen Verfahren analysiert werden, wie sie in Beispiel 1 angegeben sind.
Literatur Referenzen

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Sequenzauflistung

Claims

Verwendung eines niederen Eukaryoten, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Hefen und Pilzen besteht, enthaltend ein exprimierbares erstes Polynucleotid, umfassend ein Struktur-Gen, das ein Protein mit katalytischer Aktivität kodiert, wobei das Protein im Außenbereich der Zellwand des niederen Eukaryoten immobilisiert ist, und mindestens ein Teil eines Gens, kodierend für ein Ankerprotein, das zum Verankern in der Zellwand des niederen Eukaryoten fähig ist, wobei der Teil zumindest den Ankerteil des Ankerproteins kodiert, wobei der Ankerteil aus der C-terminalen Hälfte des Ankerproteins ableitbar ist, wobei das erste Polynucleotid entweder in einem Vektor oder in einem Chromosom des niederen Eukaryoten vorliegt, zum Durchführen eines enzymatischen Verfahrens, in dem ein Substrat für das die katalytische Aktivität aufweisende Protein mit dem niederen Eukaryoten in Kontakt gebracht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der niedere Eukaryot aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hefen besteht, die zu den Genera Candida, Debaryomyces, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia und Saccharomyces gehört, und Pilze verwendet werden können, die zu den Genera Aspergillus, Penicillium und Rhizopus gehören.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das zur Verankerung in der Zellwand fähige Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: AGR1 (=a-Agglutinin) von S. cerevisiae, FLO1 (= Flokkulationsprotein), Major-Cell-Wall-Protein von niederen Eukaryoten, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Hefen und Pilzen besteht.
Verwendung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das eine katalytische Aktivität bereitstellende Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus hydrolytischen Enzymen, einschließlich Lipasen, und Oxidreduktasen, einschließlich Oxidasen, besteht.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der niedere Eukaryot darüber hinaus eine Sequenz umfasst, die ein Signalpeptid kodiert, das die Sekretion des Expressionsproduktes des ersten Polynucleotids sicherstellt.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das die katalytische Aktivität bereitstellende Protein die katalytische Aktivität zeigt, wenn es in multimerer Form vorliegt, wobei der niedere Eukaryot darüber hinaus ein zweites Polynucleotid umfasst, umfassend ein Struktur-Gen, das das gleiche Protein mit katalytischer Aktivität in Kombination mit einer Sequenz kodiert, die für ein Signalpeptid kodiert, das die Sekretion des Expressionsproduktes des Polynucleotids sicherstellt, wobei das zweite Polynucleotid operabel mit einem regulierbaren Promotor verbunden ist.