DE69307351T3

DE69307351T3 - Langhaltende wässrige Dispersionen oder Suspensionen von druckfesten, gasgefüllten Mikrovesikeln und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE69307351T3
Application number: DE69307351T
Authority: DE
Inventors: Michel Schneider; Feng Dr. Yan; Pascal Grenier; Jerome Puginier; Marie-Bernadette Barrau
Original assignee: Bracco International BV
Current assignee: Bracco Suisse SA
Priority date: 1992-01-24
Filing date: 1993-01-19
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2013-01-20
Also published as: CN1079678C; ES2098015T5; DK0554213T3; HU219340B; ZA9210127B; NZ245724A; DE69307351D1; CA2085525A1; KR100221950B1; KR930016105A; HUT65225A; CN1074619A; CA2085525C; AU3186093A; EP0554213A1; IL104084A; DE69307351T2; EP0554213B2; NO930041L; NO930041D0

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft stabile Dispersionen oder Zusammensetzungen Gas-gefüllter Mikrovesikel in wäßrigen Trägerflüssigkeiten. Diese Dispersionen sind allgemein für die meisten Anwendungsarten verwendbar, welche in Flüssigkeiten homogen dispergierte Gase erfordern. Eine bemerkenswerte Anwendung für solche Suspensionen ist die Injektion in Lebewesen, z. B. für die Ultraschallsonographie oder andere medizinische Anwendungen. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Zusammensetzungen, einschließlich einiger an den Herstellungen beteiligter Materialien, z. B. druckresistente, Gas-gefüllte Mikroblasen, Mikrokapseln und Mikroballons.
Hintergrund der Erfindung
Es ist allgemein bekannt, daß Mikrokörper oder Mikrokügelchen aus Luft oder Gas (hierin als Mikrovesikel definiert), z. B. Mikrobläschen oder Mikroballons, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, außergewöhnlich effiziente Ultraschallreflektoren für die Sonographie darstellen. In dieser Offenbarung bezeichnet der Begriff "Mikrobläschen" speziell hohle Kugeln oder Kügelchen, die mit Luft oder einem Gas gefüllt sind, suspendiert in einer Flüssigkeit, welche im allgemeinen aus dem Einbringen von Luft oder Gas in feinverteilter Form in die Flüssigkeit resultieren, wobei die Flüssigkeit vorzugsweise auch oberflächenaktive Stoffe oder Tenside enthält, um die Oberflächeneigenschaften und die Stabilität der Blasen zu kontrollieren. Der Begriff "Mikrokapsel" oder "Mikroballon" bezeichnet vorzugsweise Luft- oder Gas-gefüllte Körper mit einer materiellen Grenze oder Hülle, d. h. einer polymeren Membranwand. Sowohl Mikrobläschen als auch Mikroballons sind als Ultraschallkontrastmittel geeignet. Zum Beispiel führt die Injektion von Suspensionen Luft-gefüllter Mikrobläschen oder Mikroballons (im Bereich von 0,5 bis 10 μm) in einer Trägerflüssigkeit in den Blutstrom lebender Körper zu einer deutlichen Verstärkung der bildgebenden Ultraschallsonographie und hilft so bei der Sichtbarmachung innerer Organe. Die bildgebende Untersuchung von Gefäßen und inneren Organen kann bei der medizinischen Diagnose von großer Hilfe sein, beispielsweise bei der Detektion kardiovaskulärer oder anderer Erkrankungen.
Die Bildung von Suspensionen von Mikrobläschen in einem injizierbaren flüssigen Träger, die für die Sonographie geeignet sind, kann durch die Freisetzung eines Gases, das unter Druck in der Flüssigkeit gelöst wurde, oder durch eine chemische Reaktion, die gasförmige Produkte erzeugt, oder durch das Mischen der Flüssigkeit mit löslichen oder unlöslichen Feststoffen erfolgen, die eingeschlossene oder adsorbierte Luft oder Gas enthalten.
Zum Beispiel wird in der US-A-4 446 442 (Schering) eine Reihe unterschiedlicher Techniken zur Herstellung von Suspensionen von Gasmikrobläschen in einem sterilisierten, injizierbaren, flüssigen Träger offenbart, die (a) eine Lösung eines Tensids (oberflächenaktiver Stoff) in einer Trägerflüssigkeit (wäßrig) und (b) eine Lösung eines Mittels zur Erhöhung der Viskosität als Stabilisator verwenden. Die dort zur Herstellung von Blasen offenbarten Techniken umfassen das Pressen einer Mischung aus (a), (b) und Luft mit hoher Geschwindigkeit durch eine kleine Öffnung; oder die Injektion von (a) in (b), zusammen mit einem physiologisch verträglichen Gas, kurz vor der Verwendung; oder den Zusatz einer Säure zu (a) und eines Carbonats zu (b), wobei beide Komponenten kurz vor der Verwendung gemischt werden und die Säure mit dem Carbonat unter Bildung von CO₂-Blasen reagiert; oder den Zusatz eines unter Überdruck stehenden Gases zu einer gelagerten Mischung aus (a) und (b), wobei das Gas zu dem Zeitpunkt in Form von Mikrobläschen freigesetzt wird, an dem die Mischung zur Injektion verwendet wird.
Die EP-A-131 540 (Schering) offenbart die Herstellung von Mikroblasensuspensionen, bei der eine stabilisierte, injizierbare Trägerflüssigkeit, z. B. eine physiologische wäßrige Salzlösung oder eine Lösung eines Zuckers, wie Maltose, Dextrose, Lactose oder Galaktose, mit festen Mikropartikeln (im 0,1 bis 1 μm Bereich) derselben Zucker gemischt wird, welche eingeschlossene Luft enthalten. Um die Suspension der Blasen in dem flüssigen Träger zu entwickeln, werden Flüssigkeit und feste Komponenten unter sterilen Bedingungen für einige Sekunden zusammen geschüttelt, und einmal hergestellt, muß die Suspension sofort verwendet werden, d. h. für echographische Messungen sollte sie innerhalb von 5 bis 10 Minuten injiziert werden. Da sie vergänglich sind, wird die Blasenkonzentration nach diesem Zeitraum tatsächlich zu gering, um praktikabel zu sein.
In einem Versuch, das Problem der Vergänglichkeit zu beheben, wurden Mikroballons, d. h. Mikrovesikel mit einer materiellen Wand, entwickelt. Während Mikrobläschen lediglich eine immaterielle oder vergängliche Hülle haben, d. h., daß sie nur durch eine Wand aus Flüssigkeit umgeben sind, deren Oberflächenspannung durch die Anwesenheit eines oberflächenaktiven Stoffes modifiziert wurde, wie oben ausgeführt wurde, haben die Mikroballons oder Mikrokapseln eine greifbare Hülle, die aus einem Substantiven Material gemacht sind, z. B. eine Polymermembran mit definierter mechanischer Stärke. Anders ausgedrückt, handelt es sich um Mikrovesikel aus einem Material, in denen Luft oder Gas mehr oder weniger fest verkapselt ist.
Zum Beispiel offenbart die US-A-4 276 885 (Tickner et al.) die Verwendung von gashaltigen Oberflächenmembran-Mikrokapseln zur Verstärkung von Ultraschallbildern, wobei die Membran eine Vielzahl nicht-toxischer und nicht-antigener organischer Moleküle einschließt. In einer offenbarten Ausführungsform haben diese Mikroblasen eine Gelatinemembran, welche der Koaleszenz widersteht, und ihre bevorzugte Größe ist 5 bis 10 μm. Die Membran dieser Mikroblasen soll zum Anfertigen echographischer Messungen ausreichend stabil sein.
Luft-gefüllte Mikroballons ohne Gelatine werden in der US-A-4 718 433 (Feinstein) offenbart. Diese Mikrovesikel werden durch Beschallen (5 bis 30 kHz) von Proteinlösungen wie 5% Serumalbumin hergestellt und haben Durchmesser im Bereich von 2 bis 20 μm, hauptsächlich 2 bis 4 μm. Die Mikrovesikel werden durch Denaturieren der membranbildenden Proteine nach dem Beschallen stabilisiert, z. B. durch Anwendung von Hitze oder durch chemische Mittel, z. B. durch Reaktion mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd. Die Konzentration der durch diese Technik erhaltenen, stabilen Mikrovesikel soll etwa 8 × 10⁶/ml im Bereich von 2 bis 4 μm, etwa 10⁶/ml im Bereich von 4 bis 5 μm und weniger als 5 × 10⁵ im Bereich von 5 bis 6 μm betragen. Die Stabilitätszeit dieser Mikrovesikel soll 48 Stunden oder länger betragen, und sie gestatten nach intravenöser Injektion die praktische bildgebende Untersuchung des linken Herzens. Zum Beispiel sind die beschallten Albumin-Mikroblasen zur transpulmonalen Passage fähig, wenn sie in eine periphere Vene injiziert werden. Dies führt zu einer echokardiographischen Opazifizierung der linken Kammerhöhle sowie des myokardialen Gewebes.
Kürzlich wurden weiter verbesserte Mikroballons für die Injektionsultraschallsonographie in EP-A-324 938 (Widder) beschrieben. In diesem Dokument werden hohe Konzentrationen (mehr als 10⁸/ml) Luft-gefüllter, proteinbegrenzter Mikrovesikel kleiner als 10 μm offenbart, welche Lebensdauern von einigen Monaten oder mehr haben. Wäßrige Suspensionen dieser Mikroballons werden durch Ultraschallkavitation von Lösungen hitzedenaturierter Proteine, z. B. humanem Serumalbumin, hergestellt, wobei dieser Vorgang auch zu einem Grad an Schäumen des membranbildenden Proteins und seiner anschließenden Härtung durch Hitze führt. Andere Proteine, wie Hämoglobin oder Kollagen, sollen für dieses Verfahren auch geeignet sein. Die hohe Lagerstabilität der in der EP-A-0 324 938 offenbarten Mikroballonsuspensionen erlaubt es, diese als solches zu vermarkten, d. h. mit der flüssigen Trägerphase, was einen großen kommerziellen Vorteil darstellt, da die Herstellung vor der Verwendung nicht länger erforderlich ist.
Ähnliche Vorteile wurden kürzlich im Zusammenhang mit der Herstellung wäßriger Mikrobläschensuspensionen entdeckt, d. h. es wurden lagerstabile, trockene, pulverförmige Zusammensetzungen entdeckt, welche nach Zusatz von Wasser langlebige Blasensuspensionen bilden. Dies wird in der Anmeldung WO-A-91/15244 offenbart, in der Liposomen, die membranbildende Lipide enthalten, gefriergetrocknet werden, und die gefriergetrockneten Lipide ergeben, nachdem sie für einen Zeitraum der Luft oder einem Gas ausgesetzt wurden, nach einfacher Zugabe eines wäßrigen, flüssigen Trägers langlebige Blasensuspensionen. Tatsächlich offenbart diese Publikation Kontrastmittel für die bildgebende Ultraschalluntersuchung des menschlichen oder tierischen Körpers, die eine Suspension von Luft- oder Gasmikrobläschen, in denen Mikrobläschen durch mindestens einen filmbildenden, oberflächenaktiven Stoff stabilisiert werden, der mindestens teilweise in lamellarer oder laminarer Form vorliegt. Die Gase in den Mikrobläschen umfassen harmlose, physiologisch verträgliche Gase, wie CO₂, Stickstoff, N₂O, Methan, Butan, Freon und Mischungen daraus und radioaktive Gase, wie Xenon oder Krypton, welche in der Nuklearmedizin für Messungen der Blutzirkulation, die Lungen-Szintillographie etc. von Interesse sind.
Die EP-A-0 458 745 (Sintetica) offenbart Luft- oder Gas-gefüllte Mikroballons, die durch eine an der Grenzfläche abgeschiedene Polymermembran begrenzt werden, welche zur Injektion in Lebewesen in wäßrigen Trägerflüssigkeiten dispergiert oder für therapeutische oder diagnostische Zwecke oral, rektal und urethral verabreicht werden können. Die Eigenschaften der Polymermembran der Mikroballons (Elastizität, Permeabilität, biologische Abbaubarkeit) können nach Wunsch durch die Wahl des Polymers, die Bedingungen des Abscheidens an der Grenzfläche und die Polymer additive kontrolliert werden. Als geeignete Gase werden physiologisch verträgliche Gase wie CO₂, N₂O, Methan, Freon, Helium und andere Edelgase offenbart.
Trotz der vielen Fortschritte, die bezüglich der Lagerstabilität wäßriger Mikrobläschensuspensionen erzielt wurden, entweder auf der Vorläufer- oder auf der letzten Herstellungsstufe, blieb bis heute noch das Problem der Haltbarkeit der Vesikel, wenn die Suspensionen Überdruck ausgesetzt werden, z. B. den nach der Injektion in den Blutstrom eines Patienten auftretende und den Herzschlägen folgende Druckschwankungen, insbesondere in der linken Kammer. Tatsächlich haben die jetzigen Erfinder beobachtet, daß z. B. bei anästhetisierten Kaninchen die Druckschwankungen nicht ausreichend sind, um die Blasenzahl für einen Zeitraum nach der Injektion wesentlich zu verändern. Demgegenüber fallen bei Hunden und menschlichen Patienten typische Mikrobläschen oder Mikroballons, die mit gewöhnlichen Gasen wie Luft, Methan oder CO₂ gefüllt sind, innerhalb von Sekunden nach der Injektion aufgrund der Wirkung des Blutdrucks vollständig zusammen. Diese Beobachtung wurde durch andere bestätigt. Zum Beispiel haben S. GOTTLIEB et al., J. Am. Soc. of Echocardiography 3 (1990) 238, berichtet, daß vernetzte Albumin-Mikroballons, die nach der Beschallungsmethode hergestellt wurden, alle echogenen Eigenschaften verloren, wenn sie einem Überdruck von 60 Torr ausgesetzt wurden. Es wurde somit wichtig, das Problem zu lösen und die nutzbare Lebenszeit von Suspensionen von Mikrobläschen und durch von Membranen begrenzten Mikroballons unter Druck zu erhöhen, um sicherzustellen, daß echographische Messungen in vivo sicher und reproduzierbar durchgeführt werden können.
Es sollte an dieser Stelle erwähnt werden, daß eine andere Kategorie von Verstärkungsmitteln für echogene, bildgebende Untersuchungen vorgeschlagen wurde, welche Überdrücken widerstehen, da sie aus einfachen Mikrokügelchen mit einer porösen Struktur bestehen, wobei der Porenraum Luft oder ein Gas enthält. Solche Mikrokügelchen werden z. B. in der WO-A-91/12823 (DELTA BIOTECH NOLGY), EP-A-327 490 (SCHERING) und EP-A-458 079 (HOECHST) offenbart. Der Nachteil der einfachen, porösen Mikrokügelchen ist, daß der eingekapselte, Gas-gefüllte, freie Raum im allgemeinen zu klein für ein gutes echogenes Signal ist und die Kugeln keine angemessene Elastizität aufweisen. Somit bleibt die Bevorzugung hohler Mikrovesikel im allgemeinen bestehen, und eine Lösung für das Problem des Kollabierens wurde gesucht.
Die WO 92/17212 offenbart SF₆ oder CF₄ enthaltende Mikroballons mit einer Hülle aus nicht proteinhaltigen, vernetzten oder polymerisierten, amphiphilen Komponenten.
Die WO 92/17213 offenbart SF₆ oder CF₄ enthaltende Mikroballons mit einer Hülle aus Protein mit biologisch abbaubaren, vernetzenden Gruppen.
Die WO 92/17212 und die WO 92/17213 sind Stand der Technik nach Artikel 54(3) EPÜ und sind Grund des Disclaimers in den Ansprüchen.
Offenbarung der Erfindung
Erfindungsgemäß wurde dieses Problem nun durch ein Kontrastmittel zur Ultraschallsonographie gelöst, das als Suspension in einer wäßrigen, flüssigen Trägerphase mit Gas oder einer Gasmischung gefüllte Mikrovesikel enthält, bei denen es sich entweder um Mikrobläschen mit einer immateriellen oder vergänglichen Hülle, d. h. sie sind lediglich von einer Flüssigkeitswand umgeben, deren Oberflächenspannung durch die Anwesenheit eines oberflächenaktiven Stoffes modifiziert ist, oder Mikroballons handelt, die durch eine materielle Hülle begrenzt sind, die aus einer organischen Polymermembran hergestellt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Gasmischung mindestens ein physiologisch verträgliches, halogeniertes Kohlenwasserstoffgas oder ein stabiles, fluoriertes Chalcogenid enthält, dessen Verhältnis von Wasserlöslichkeit, ausgedrückt in Liter Gas pro Liter Wasser unter Standardbedingungen, zur Quadratwurzel des Molekulargewichts, in Dalton, kleiner als 0,0027 ist, wobei SF₆ oder CF₄ erhaltende Mikroballons ausgenommen sind, die eine Hülle aus vernetzten oder polymerisierten, amphiphilen Nicht-Proteinkomponenten oder Protein, das mit biologisch abbaubaren vernetzenden Gruppen vernetzt ist, aufweisen.
In Kürze, es wurde gefunden, daß dann wenn die echogenen Mikrovesikel in Anwesenheit eines Gases hergestellt wurden bzw. mindestens zum Teil mit einem Gas gefüllt sind, daß physikalische Eigenschaften in Übereinstimmung mit der unten stehenden Gleichung hat, die Mikrovesikel nach der Injektion für eine Zeit, die ausreichend ist, um reproduzierbare echographische Messungen zu erhalten, einem Druck von > 80·10² N/m² (> 60 Torr) außergewöhnlich gut widerstehen:
In der vorangehenden Gleichung bezeichnet "s" die Löslichkeiten in Wasser, ausgedrückt als die "BUNSEN"-Koeffizienten, d. h. als das Gasvolumen, das unter Standardbedingungen (1 bar, 25°C) und unter einem Partialdruck des gegebenen Gases von 1 atm (siehe Gas Encyclopaedia, Elsevier 1976) durch eine Volumeneinheit Wasser gelöst wird. Da bei solchen Bedingungen und Definitionen die Löslichkeit von Luft 0,0167 und die Quadratwurzel ihres durchschnittlichen Molekulargewichts (Mw) 5,39 ist, vereinfacht sich die obige Beziehung zu:
In den hierin später aufgeführten Beispielen wird die Untersuchung echogener Mikrobläschen und Mikroballons (siehe Tabellen) offenbart, die mit einer Anzahl verschiedener Gase und Mischungen davon gefüllt sind, und deren entsprechender Widerstand gegen Druck nimmt sowohl in vivo als auch in vitro zu. In den Tabellen wurden die Wasserlöslichkeitsfaktoren auch aus der zuvor zitierten Gas Encyclopaedia von "L'Air Liquide", Elsevier Publisher (1976) entnommen.
Die erfindungsgemäßen gashaltigen Mikrovesikel in wäßriger Suspension umfassen die meisten Mikrokügelchen und Mikroballons, die bisher als Kontrastmittel für die Echographie offenbart wurden. Die bevorzugten Mikroballons sind die in der EP-A-324 938, PCT/EP91/01706 und EP-A-458 745 offenbarten. Die bevorzugten Mikrobläschen sind die der PCT/EP91/00620. Diese Mikrobläschen werden vorteilhafterweise aus einer wäßrigen Flüssigkeit und einem trockenen Pulver (Mikrovesikelvorläufer) hergestellt, das lamellarisierte, gefriergetrocknete Phospholipide und Stabilisatoren enthält. Die Mikrobläschen werden durch Bewegen des Pulvers, in Mischung mit dem wäßrigen, flüssigen Träger, entwickelt. Die Mikroballons der EP-A-458 745 weisen eine elastische, an der Grenzfläche präzipitierte Polymermembran mit kontrollierter Porosität auf. Sie werden im allgemeinen durch Emulgieren von Polymerlösungen als Mikrotröpfchen in wäßrigen Flüssigkeiten erhalten, wobei das Polymer anschließend zum Präzipitieren aus seiner Lösung gebracht wird, um eine filmförmige Membran an der Tropfen/Flüssigkeitsgrenzfläche zu bilden, wobei das Verfahren zur anfänglichen Bildung von Flüssigkeitsgefüllten Mikrovesikeln führt, deren Flüssigkeitskern schließlich durch ein Gas ersetzt wird.
Um das Verfahren der jetzigen Erfindung auszuführen, d. h. um Mikrovesikel, deren Suspensionen in wäßrigen Trägern die gewünschten echogenen Additive darstellen, mit den Gasen gemäß der vorangehenden Beziehung zu bilden oder zu füllen kann man entweder, als erste Ausführungsform, einen zweistufigen Weg verwenden, der (1) das Herstellen von Mikrovesikeln aus geeigneten Startmaterialien auf irgendeine geeignete konventionelle Technik in Anwesenheit irgendeines geeigneten Gases und (2) dem Austausch dieses ursprünglich zur Herstellung der Mikrovesikel verwendeten Gases (erstes Gas) durch ein neues Gas (zweites Gas) gemäß der Erfindung umfaßt (Gasaustauschtechnik).
Andererseits kann man gemäß einer zweiten Ausführungsform die gewünschten Suspensionen direkt durch geeignete herkömmliche Methoden unter einer Atmosphäre des neuen Gases gemäß der Erfindung herstellen.
Wenn man den zweistufigen Weg verwendet, kann das anfängliche Gas zuerst aus den Vesikeln entfernt (z. B. durch Evakuieren unter Unterdruck) und danach ersetzt werden, indem man das zweite Gas mit dem evakuierten Produkt in Kontakt bringt, oder alternativ können die noch das erste Gas enthaltenden Vesikel mit dem zweiten Gas unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, unter denen das zweite Gas das erste Gas in den Vesikeln ersetzt (Gassubstitution). Zum Beispiel können die Vesikelsuspensionen oder vorzugsweise Vorstufen davon (Vorstufen können hierin Materialien bedeuten, aus denen die Hüllen der Mikrovesikel hergestellt sind, oder Materialien, welche beim Bewegen mit einer wäßrigen Trägerflüssigkeit die Bildung von Mikrobläschen in dieser Flüssigkeit erzeugen oder entwickeln) vermindertem, Druck ausgesetzt werden, um das zu entfernende Gas zu evakuieren und dann kann der Umgebungsdruck mit dem gewünschten Gas zur Substitution wieder hergestellt werden. Dieser Schritt kann ein- oder mehrfach wiederholt werden, um einen vollständigen Austausch des ursprünglichen Gases durch das neue sicherzustellen. Diese Ausführungsform eignet sich besonders gut für trocken aufbewahrte Vorstufenzubereitungen, z. B. trockenen Pulvern, welche die Blasen des echogenen Additivs beim Mixen mit einer Menge flüssigen Trägers regenerieren oder entwickeln. Somit ist es gemäß einem bevorzugten Fall, bei dem Mikrobläschen aus einer wäßrigen Phase und trockenen, laminarisierten Phospholipiden, z. B. Pulvern von dehydratisierten, lyophilisierten Liposomen und Stabilisatoren gebildet werden sollen, wobei die Pulver anschließend unter Rühren in einer flüssigen, wäßrigen Trägerphase dispergiert werden sollen, vorteilhaft, dieses trockene Pulver unter einer Atmosphäre eines gemäß der Erfindung ausgewählten Gases zu lagern. Eine Zubereitung dieser Art hält sich unbegrenzt in dieser Form und kann zu jeder Zeit zur Diagnose verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie vor der Injektion in sterilem Wasser dispergiert wird.
Andererseits, und daß ist besonders dann so, wenn der Gasaustausch an einer Suspension von Mikrovesikeln in einer flüssigen Trägerphase vorgenommen wird, wird letztere mit dem zweiten Gas solange gespült, bis der Austausch (teilweise oder vollständig) für die gewünschten Zwecke ausreichend ist. Das Spülen kann durch Einleiten mit einer Gasleitung oder, in einigen Fällen, durch einfaches Spülen der Oberfläche der die Vesikel enthaltenden Flüssigkeit unter sanftem Bewegen mit einem Strom (kontinuierlich oder diskontinuierlich) des neuen Gases erfolgen. In diesem Fall kann das Austauschgas nur einmal zu dem Kolben gegeben werden, der die Suspension enthält, und als solches für eine weile stehen gelassen werden, oder es kann ein- oder mehrfach erneuert werden, um sicherzustellen, daß der Grad der Erneuerung (Gasaustausch) mehr oder weniger vollständig ist.
Alternativ kann man, in einer zweiten Ausführungsform wie zuvor gesagt, die vollständige Herstellung der Suspension der echogenen Additive bewirken, indem man mit den üblichen Vorläufern davon (Ausgangsmaterialien), wie im Stand der Technik angegeben, beginnt und gemäß den üblichen Mitteln des Stands der Technik arbeitet, jedoch in Anwesenheit des gewünschten Gases oder der Mischung von Gasen gemäß der Erfindung anstelle desjenigen des Standes der Technik, welcher gewöhnlich Gase wie Luft, Stickstoff, CO₂ und dergleichen aufzählt.
Es sollte erwähnt werden, daß im allgemeinen die Herstellungsart unter Verwendung einer ersten Gasart zur Herstellung der Mikrovesikel und die anschließende Substitution des ursprünglichen Gases durch eine zweite Gasart, die den Mikrovesikeln unterschiedliche echogene Eigenschaften verleihen soll, den folgenden Vorteil hat. Wie am besten an den Ergebnissen der nachfolgenden Beispiele gesehen werden kann, hat die Art des zur Herstellung der Mikrovesikel, insbesondere der Mikroballons mit einer Polymerhülle, verwendeten Gases einen entscheidenden Einfluß auf die Gesamtgröße (d. h. den durchschnittlichen mittleren Durchmesser) der Mikrovesikel. Zum Beispiel kann die Größe von Mikroballons, die unter Luft bei präzise eingestellten Bedingungen hergestellt werden, genau kontrolliert werden, so daß sie in den gewünschten Bereich fällt, z. B. in den für die echographische Untersuchung der linken und rechten Herzkammern geeigneten 1 bis 10 μm Bereich. Dies ist mit anderen Gasen nicht so leicht, insbesondere mit den Gasen in Übereinstimmung mit den Erfordernissen der vorliegenden Erfindung. Wenn man somit Mikrovesikel in einem gegebenen Größenbereich zu erhalten wünscht, die jedoch mit Gasen gefüllt sind, deren Natur die direkte Herstellung unmöglich oder schwierig machen würde, wird man sich vorteilhafterweise auf den zweischrittigen Herstellungsweg verlassen, d. h. man stellt zuerst die Mikrovesikel mit einem Gas her, das eine genauere Kontrolle des Durchmessers und der Zahl gestattet, und ersetzt danach das erste Gas durch das zweite Gas durch Gasaustausch.
In der Beschreibung des folgenden experimentellen Teils (Beispiele) wurden in Wasser oder anderen wäßrigen Lösungen suspendierte, Gas-gefüllte Mikrovesikel Drücken oberhalb des Umgebungsdrucks ausgesetzt. Es wurde festgestellt, daß die Mikrovesikel zu kollabieren beginnen wenn der Überdruck einen bestimmten Wert erreichte (welcher im allgemeinen für einen Satz von mikrosphären Parametern und Arbeitsbedingungen wie Temperatur, Kompressionsrate, Art der Trägerflüssigkeit und ihr Gehalt an gelösten Gasen (die relative Bedeutung dieses Parameters wird hiernach genauer beschrieben), Art des Gasfüllstoffs, Art des echogenen Materials, usw., typisch ist), wobei die Blasenzahl mit weiterer Erhöhung des Druckes fortschreitend abnimmt, bis ein vollständiges Verschwinden des Schallreflektoreffekts auftritt. Dieses Phänomen konnte optisch besser verfolgt werden (nephelometrische Messungen), da es parallel durch eine entsprechende Änderung der optischen Dichte begleitet wird, d. h. die Transparenz des Mediums nimmt mit zunehmendem Kollabieren der Blasen zu. Hierzu wurde die wäßrige Suspension der Mikrovesikel (oder eine geeignete Verdünnung davon) in eine bei 25°C (Standardbedingungen) gehaltene spektrophotometrische Zelle gebracht und die Absorption kontinuierlich bei 600 oder 700 nm gemessen, während ein positiver hydrostatischer Überdruck angelegt und graduell erhöht wurde. Der Druck wurde durch eine peristaltische Pumpe (GILSON's Mini-puls) erzeugt, welche eine mit der lecksicher versiegelten spektrophotometrischen Zelle verbundene Flüssigkeitssäule mit variabler Höhe speiste. Der Druck wurde mit einem in Torr kalibrierten Quecksilbernanometer gemessen. Es wurde gefunden, daß die zeitliche Kompressionsrate mit der Pumpengeschwindigkeit (UpM) linear korreliert war. Es wurde gefunden, daß die Absorption in dem vorgenannten Bereich proportional zur Konzentration der Mikrovesikel in der Trägerflüssigkeit war.
1 ist ein Graph, der die Blasenkonzentration (Blasenzahl), ausgedrückt als optische Dichte in dem zuvor genannten Bereich, und den an die Blasensuspension angelegten Druck miteinander in Beziehung setzt. Die Daten zur Anfertigung des Graphen wurden den in Beispiel 4 beschriebenen Experimenten entnommen.
Figur 1
1 zeigt graphisch, daß die Änderung der Absorption in Abhängigkeit vom Druck durch eine sigmoidal geformte Kurve dargestellt wird. Die Kurve ist bis zu einem bestimmten Druckwert nahezu flach, was zeigt, daß die Blasen stabil sind. Dann tritt ein relativ schneller Fall der Absorption auf, welcher das Vorhandensein eines relativ engen kritischen Bereichs anzeigt, in dem jede Druckerhöhung eine ziemlich dramatische Wirkung auf die Blasenzahl hat. Wenn alle Mikrovesikel verschwunden sind, flacht die Kurve wieder ab. In der Mitte zwischen den höheren und niedrigeren optischen Ablesungen, d. h. zwischen den Messungen für "volle" Blasenzahl (OD max) und "keine" Blasen (OD min), wurde ein kritischer Punkt auf der Kurve gewählt, der tatsächlich dem entsprach, an dem etwa 50% der anfänglich vorhandenen Blasen verschwunden waren, d. h. an dem die Anzeige für die optische Dichte etwa die Hälfte der ursprünglichen Anzeige betrug, der im Graphen relativ zu der Höhe gesetzt wurde, an der die Transparenz der unter Druck gesetzten Suspension maximal ist (Basislinie). Dieser Punkt, der auch in dem Bereich liegt, an dem die Steigung der Kurve maximal ist, wird als der kritische Druck PC definiert. Es wurde gefunden, daß für ein gegebenes Gas PC nicht nur von den zuvor genannten Parametern sondern insbesondere auch von der tatsächlichen Konzentration des Gases (oder der Gase) abhängt, das (die) bereits in der Trägerflüssigkeit gelöst ist (sind). Je höher die Gaskonzentration ist, desto höher ist der kritische Druck. In diesem Zusammenhang kann man daher die Widerstandsfähigkeit der Mikrovesikel gegen das Kollabieren unter Druck erhöhen, indem man die Trägerphase mit einem löslichen Gas sättigt, das dasselbe sein kann oder nicht (d. h. ein anderes Gas) wie dasjenige, das die Vesikel füllt. Zum Beispiel konnten Luft-gefüllte Mikrovesikel gegen Überdrücke von > 160·10² N/m² (> 120 Torr) beständig gemacht werden, indem als Trägerflüssigkeit eine gesättigte CO₂-Lösung verwendet wurde. Unglücklicherweise ist diese Beobachtung auf dem diagnostischen Gebiet von begrenztem Wert, da das Kontrastmittel, sobald es in den Blutstrom eines Patienten injiziert wurde (dessen Gasgehalt natürlich außerhalb der Kontrollmöglichkeiten liegt), darin in einem solchen Ausmaß verdünnt wird, daß der Effekt des ursprünglich in der injizierten Probe gelösten Gases vernachlässigbar wird.
Ein anderer leicht zugänglicher Parameter, um die Wirkungsweise verschiedener Gase als Füller für Mikrosphären zu vergleichen, ist die Breite des Druckintervalls (ΔP), das durch die Druckwerte begrenzt wird, bei denen die Blasenzahlen (ausgedrückt als die optischen Dichten) 75% und 25% der ursprünglichen Blasenzahl entsprechen. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei Gasen, bei denen die Druckdifferenz DP = P₂₅ – P₇₅ einen wert von etwa 33 bis 40·10² N/m² (25 bis 30 Torr) übersteigt, der Zerstörungseffekt des Blutdrucks auf die Gas-gefüllten Mikrovesikel minimiert wird, d. h. die tatsächliche Abnahme der Blasenzahl ist ausreichend gering, um die Signifikanz, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der echographischen Messungen nicht zu beeinträchtigen.
Es wurde außerdem gefunden, daß die Werte für PC und ΔP auch von der Rate der Erhöhung des Drucks in den Testexperimenten, die durch 1 veranschaulicht werden, abhängen, d. h. das in einem bestimmten Intervall von Druckerhöhungsraten (z. B. im Bereich von einigen 10 bis zu einigen 100 Torr/Minuten) die Werte für PC und ΔP um so größer sind, je höher die Rate ist. Aus diesem Grunde wurden die unter Standardtemperaturbedingungen durchgeführten Vergleiche auch bei einer konstanten Erhöhungsrate von 100 Torr/Minute durchgeführt. Es sollte jedoch bemerkt werden, daß dieser Effekt der Druckerhöhungsrate auf die Messungen der PC- und ΔP-Werte bei sehr hohen Raten abflacht. Zum Beispiel sind die bei Raten von einigen 100 Torr/Minute gemessenen Werte nicht signifikant von den unter den durch die Herzschläge vorgegebenen Bedingungen gemessenen verschieden.
Obwohl die genauen Gründe, warum bestimmte Gase den zuvor genannten Eigenschaften gehorchen und andere nicht, nicht vollständig geklärt wurden, scheint es, daß möglicherweise eine gewisse Beziehung besteht, an der zusätzlich zum Molekulargewicht und zur Wasserlöslichkeit die Lösungskinetiken und vielleicht andere Parameter beteiligt sind. Jedoch ist es nicht erforderlich, diese Parameter zu kennen, um die vorliegende Erfindung ausüben zu können, da das in Frage kommende Gas leicht gemäß den vorgenannten Kriterien bestimmt werden kann.
Die erfindungsgemäßen Gase sind halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Freone, und stabile fluorierte Chalcogenide, wie SF₆.
Es wurde oben erwähnt, daß der Grad der Gassättigung der als Träger für die erfindungsgemäßen Mikrovesikel verwendete Flüssigkeit Bedeutung für die Stabilität der Vesikel bei Druckänderungen hat. Tatsächlich wird die Widerstandsfähigkeit der Mikrovesikel gegen das Kollabieren bei Druckänderungen merklich erhöht, wenn die Trägerflüssigkeit, in der die Mikrovesikel zur Herstellung der erfindungsgemäßen echogenen Suspensionen dispergiert sind, bis zum Gleichgewicht mit einem Gas gesättigt ist, vorzugsweise dem gleichen Gas, mit dem die Mikrovesikel gefüllt sind. Somit ist es, wenn das als Kontrastmittel zu verwendende Produkt in trockener Form verkauft wird, um kurz vor der Anwendung mit einer Trägerflüssigkeit (siehe z. B. die in der zuvor erwähnten PCT/EP91/00620 offenbarten Produkte) gemischt zu werden, ziemlich vorteilhaft, zum Dispergieren einen Gas-gesättigten wäßrigen Träger zu verwenden. Wenn alternativ gebrauchsfertige Mikrovesikelsuspensionen als Kontrastmittel für die Sonographie vermarktet werden, verwendet man vorteilhafterweise als Trägerflüssigkeit für die Zubereitung eine Gas-gesättigte wäßrige Lösung. In diesem Fall wird die Lagerbeständigkeit der Suspensionen beträchtlich erhöht, und das Produkt kann für ausgedehnte Zeiträume, z. B. einige Wochen bis zu einigen Monaten und in einigen Fällen selbst über 1 Jahr im wesentlichen unverändert (keine wesentliche Veränderung der Blasenzahl) aufbewahrt werden. Das Sättigen der Flüssigkeit mit einem Gas kann am einfachsten durchgeführt werden, indem Gas für einen Zeitraum bei Raumtemperatur durch die Flüssigkeit durchperlen gelassen wird.
Die folgenden Beispiele schließen Ausführungsformen ein, die nicht unter die Ansprüche fallen.
Beispiel 1
Mit Luft oder verschiedenen Gasen gefüllte Albumin-Mikrovesikel wurden wie in EP-A-324 938 beschrieben unter Verwendung einer mit 5% humanem Serumalbumin (HSA) gefüllten, kalibrierten 10 ml-Spritze, die vom Blut Transfusions Service, Rote Kreuz Organisation, Bern, Schweiz, erhalten wurde, hergestellt. Eine Sonikatorsonde (Sonifier Model 250 von Branson Ultrasonic Corp., USA) wurde in die Lösung bis zur 4 ml-Marke der Spritze gesenkt und die Beschallung für 25 Sekunden (Energie-Einstellung = 8) durchgeführt. Dann wurde die Sonikatorsonde über den Pegel der Flüssigkeit bis zur 6 ml-Marke angehoben und das Beschallen im Pulsmodus (Zyklus = 0,3) für 40 Sekunden wiederaufgenommen. Nach Stehen über Nacht bei 4°C hatte sich durch den Auftrieb eine Oberschicht gebildet, die die meisten der Mikrovesikel enthielt, und die Bodenschicht, die nicht-verwendeten Albuminabfall aus denaturiertem Protein und andere unlösliche Stoffe enthielt, wurde verworfen. Nach dem Resuspendieren der Mikrovesikel in frischer Albuminlösung wurde die Mischung bei Raumtemperatur wieder klären gelassen und schließlich die obere Schicht gesammelt. Wenn die vorgenannten Sequenzen unter der Umgebungsatmosphäre durchgeführt wurden, wurden Luft-gefüllte Mikroballons erhalten. Um mit anderen Gasen gefüllte Mikroballons zu erhalten, wurde die Albuminlösung zuerst mit einem neuen Gas gespült und dann die vorgenannten Arbeitssequenzen unter einem Strom dieses Gases durchgeführt, der auf die Oberfläche der Lösung strömte. Am Ende der Arbeitsoperationen wurde die Suspension dann in eine Glasflasche gebracht, welche vor dem Versiegeln extensiv mit dem gewünschten Gas gespült wurde.
Die mit unterschiedlichen Gasen gefüllten verschiedenen Mikroballonsuspensionen wurden 1 : 10 mit destilliertem Wasser verdünnt, das bis zum Gleichgewicht mit Luft gesättigt war, dann wurden sie wie oben beschrieben in eine optische Zelle gebracht und die Absorption aufgezeichnet, während der Druck über der Suspension kontinuierlich erhöht wurde. Während der Messungen wurde die Temperatur der Suspensionen bei 25°C gehalten.
Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 gezeigt und als Werte für den kritischen Druck PC ausgedrückt, der für eine Serie von Gasen aufgezeichnet wurde, die durch Namen oder Formeln definiert sind, die charakteristischen Parameter dieser Gase, d. h. Mw und Wasserlöslichkeit sind angegeben, sowie die ursprüngliche Blasenzahl und durchschnittliche Blasengröße (mittlerer Durchmesser im Volumen) definiert.
TABELLE 1
An den Ergebnissen der Tabelle 1 ist zu sehen, daß der kritische Druck PC für Gase mit geringer Löslichkeit und hohem Molekulargewicht zunimmt. Es kann daher erwartet werden, daß mit solchen Gasen gefüllte Mikrovesikel in vivo dauerhaftere echogene Signale ergeben. Es ist auch zu sehen, daß die durchschnittliche Blasengröße im allgemeinen mit der Gaslöslichkeit zunimmt.
Beispiel 2
Anteile (1 ml) von einigen der in Beispiel 1 hergestellten Mikroballonsuspensionen wurden in die Jugularvene von Versuchskaninchen injiziert, um die Echogenität in vivo zu testen. Bildgebende Untersuchungen der linken und rechten Herzkammern wurden unter Verwendung eines Acuson 128-XP5 Sonographiegeräts und eines 7,5 MHz Transducers im Graumaßstab-Modus (grey scale modes) durchgeführt. Die Dauer der Kontrastverstärkung in der linken Kammer wurde durch Aufzeichnen des Signals für einen Zeitraum bestimmt. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 2 gezeigt, welche auch den PC der verwendeten Gase zeigt.
TABELLE 2
An den obigen Ergebnissen kann man das Vorhandensein einer definierten Beziehung zwischen dem kritischen Druck der getesteten Gase und der zeitlichen Persistenz des echographischen Signals sehen.
Beispiel 3
Eine Suspension echogener, Luft-gefüllter Galaktose-Mikropartikel (Echovist^® von SCHERING AG) wurde erhalten, indem 3 g der festen Mikropartikel in 8,5 ml einer 20%igen Galaktoselösung für 5 Sekunden geschüttelt wurden. In anderen Zubereitungen wurde die Luft über einem Teil der Echovist^®-Partikel evakuiert (27 N/m² (0,2 Torr)) und durch eine SF₆-Atmosphäre ersetzt, wobei, nach Zugabe der 20%igen Galaktoselösung, eine Suspension von Mikropartikeln erhalten wurde, die assoziiertes Schwefelhexafluorid enthielt. Anteile (1 ml) der Suspensionen wurden Versuchskaninchen verabreicht (durch Injektion in die Jugularvene) und bildgebende Untersuchungen des Herzens wie im vorigen Beispiel beschrieben durchgeführt. In diesem Fall passieren die echogenen Mikropartikel nicht die Lungenkapillaren, und daher ist die bildgebende Untersuchung auf die rechte Kammer beschränkt, und die Persistenz des Gesamtsignals hat keine besondere Signifikanz. Die Ergebnisse der unten stehenden Tabelle 3 zeigen den Wert der Signalspitzenintensität einige Sekunden nach der Injektion.
TABELLE 3
Es ist zu sehen, daß Schwefelhexafluorid als Inertgas mit geringer Wasserlöslichkeit echogene Suspensionen ergibt, welche stärkere echogene Signale ergeben als vergleichbare Luft-gefüllte Suspensionen. Diese Ergebnisse sind insbesondere im Hinblick auf die Lehren des EP-A-441 468 und 357 163 (SCHERING) interessant, welche die Verwendung von Mikropartikeln für echographische Zwecke offenbaren, bzw. mit verschiedenen Gasen, einschließlich SF₆, gefüllten Kavitat- bzw. Clathratverbindungen. Diese Dokumente beschreiben jedoch nicht die besonderen Vorteile von SF₆ gegenüber anderen gewöhnlicheren Gasen hinsichtlich des echogenen Verhaltens.
Beispiel 4
Eine Reihe echogener Suspensionen Gas-gefüllter Mikrobläschen wurde gemäß dem folgenden allgemeinen Verfahren hergestellt:
1 g einer Mischung aus gesättigtem Sojalecithin (von Nattermann Phospholipids GmbH, Deutschland) und Dicetylphosphat (DCP), im molaren Verhältnis 9/1, wurde in 50 ml Chloroform gelöst und die Lösung in einen 100 ml Rundkolben eingebracht und an einem Rotationsverdampfer zur Trockne evaporiert. Dann wurden 20 ml destillierten Wassers zugesetzt und die Mischung bei 75°C für 1 Stunde langsam gerührt. Dies führte zur Bildung einer Suspension multilamellarer Liposomen (MLV), welche danach bei 75°C hintereinander durch 3 μm und 0,8 μm Polycarbonatmembranen (Nucleopore^®) extrudiert wurde. Nach dem Abkühlen wurden 1 ml Anteile der extrudierten Suspension mit 9 ml konzentrierter Lactoselösung (83 g/l) verdünnt und die verdünnten Suspensionen bei –45°C gefroren. Die gefrorenen Proben wurden danach unter Hochvakuum in einem Gefäß, das schließlich mit Luft oder einem Gas gefüllt wurde, das wie in der unten stehenden Tabelle 4 gezeigt einer Auswahl von Gasen entnommen wurde, zu einem freifließenden Pulver gefriergetrocknet. Die pulverförmigen Proben wurden dann in 10 ml Wasser als Trägerflüssigkeit resuspendiert, wobei dies unter einem Strom desselben Gases durchgeführt wurde, das zum Füllen des Gefäßes verwendet wurde. Suspensionen wurden durch heftiges Schütteln für 1 Minute auf einem Vortex-Mischer hergestellt.
Die verschiedenen Suspensionen wurden 1 : 20 mit destilliertem Wasser verdünnt, das zuvor mit Luft bei 25°C äquilibriert wurde, und die Verdünnungen wurden dann wie in Beispiel 1 beschrieben durch Messen der optischen Dichte in einer spektrophotometrischen Zelle, die einem zunehmend anwachsenden hydrostatischen Druck ausgesetzt wurde, bis alle Blasen kollabiert waren, bei 25°C druckgetestet. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 4 gesammelt, welche zusätzlich zum kritischen Druck PC auch die ΔP-Werte (siehe 1) zeigt.
TABELLE 1
Die vorangehenden Ergebnisse zeigen deutlich, daß die höchste Widerstandsfähigkeit gegen Druckerhöhungen durch die am wenigsten wasserlöslichen Gase erreicht wird. Das Verhalten der Mikroblasen ist in dieser Hinsicht daher dem der Mikroballons ähnlich. Die weniger wasserlöslichen Gase mit den höheren Molekulargewichten ergeben auch die flachesten Blasenkollabierungs-/Druckkurven (d. h. ΔP ist am weitesten), was, wie oben ausgeführt wurde, auch ein wichtiger Faktor für die in vivo Beständigkeit des echogenen Signals ist.
Beispiel 5
Einige der Mikroblasensuspensionen aus Beispiel 4 wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, in die Jugularvene von Versuchskaninchen injiziert und die bildgebende Untersuchung der linken Herzkammer wie zuvor beschrieben durchgeführt. Die Beständigkeit des Zeitraums, in dem ein nützliches echographisches Signal gemessen wurde, wurde aufgezeichnet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 unten gezeigt, in der C₄F₈ Octafluorcyclobutan bezeichnet.
TABELLE 5
Diese Ergebnisse zeigen, wieder im Fall von Mikrobläschen, daß die Gase gemäß den Kriterien der vorliegenden Erfindung für einen sehr viel längeren Zeitraum als die meisten bisher verwendeten Gase ein Ultraschallechosignal ergeben.
Beispiel 6
Mikrobläschensuspensionen wurden unter Verwendung verschiedener Gase genau wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, jedoch wurde der Lecithinphospholipidbestandteil durch ein molares Äquivalent Diarachidoylphosphatidylcholin (C₂₀-Fettsäurerest) ersetzt, das von Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama, USA erhältlich ist. Das molare Verhältnis von Phospholipid zu DCP betrug immer noch 9/1. Die Suspensionen wurden wie in Beispiel 4 druckgetestet. Die Ergebnisse, zusammengestellt in Tabelle 6A unten, sind mit denen aus Tabelle 4 zu vergleichen.
TABELLE 6A
Die obigen Ergebnisse zeigen beim Vergleich mit denen aus Tabelle 4, daß man zumindest bei Gasen mit geringer Löslichkeit durch Verlängern der Kette der Phospholipidfettsäurereste die Stabilität der echogenen Suspension gegen Druckerhöhungen dramatisch erhöhen kann. Dies wurde durch Wiederholung der vorangehenden Experimente weiter bestätigt, bei denen die Phospholipidkomponente durch ihr höheres Homologes, d. h. Dibehenoylphosphatidylcholin (C₂₂-Fettsäurerest) ersetzt wurde. In diesem Fall wurde die Widerstandsfähigkeit der Mikrobläschensuspensionen gegen das Kollabieren unter Druck noch weiter erhöht.
Einige der Mikrobläschensuspensionen dieses Beispiels wurden an Hunden getestet, wie zuvor für Kaninchen beschrieben (bildgebende Untersuchung der Herzkammern nach Injektion von 5 ml-Proben in die vordere Schädelvene). Eine signifikante Verstärkung des nützlichen echogenen in vivo Meßwerts wurde im Vergleich mit dem Verhalten der in Beispiel 4 offenbarten Zubereitungen festgestellt, d. h. die Erhöhung der Kettenlänge des Fettsäurerests in der Phospholipidkomponente erhöht die nützliche in vivo-Lebensdauer des echogenen Mittels.
In der nächsten Tabelle unten ist die relative Stabilität der Mikrobläschen (SF₆) in der linken Herzkammer von Kaninchen gezeigt, die aus Suspensionen einer Reihe von Phospholipiden hergestellt wurden, deren Fettsäurereste unterschiedliche Kettenlängen haben, (injizierte Dosis: 1 ml/Kaninchen).
Tabelle 6B
Es wurde oben bereits erwähnt, daß für die in diesem Beispiel beschriebene Messung der Widerstandsfähigkeit gegen Druck, eine konstante Druckerhöhungsrate von 133·10² N/m²·min (100 Torr/min) aufrechterhalten wurde. Dies wird durch die unten gezeigten Ergebnisse gerechtfertigt, welche die Variationen der PC-Werte für verschiedene Gase als Funktion der Druckerhöhungsrate zeigen. In diesen Proben wurde DMPC als Phospholipid verwendet.
Beispiel 7
Eine Reihe von Albumin-Mikroballons wurden als Suspensionen in Wasser unter Luft auf eine die Kugelgröße kontrollierende Weise unter Verwendung der in Beispiel 1 gegebenen Anweisungen hergestellt. Dann wurde die Luft in einigen der Proben durch ein anderes Gas durch die Gasaustauschspülmethode bei Umgebungsdruck ersetzt. Dann, nach dem gewöhnlichen 1 : 10 Verdünnen mit destilliertem Wasser, wurden die Proben wie in Beispiel 1 dem Drucktest unterworfen. An den in Tabelle 7 unten gesammelten Ergebnissen ist zu erkennen, daß die Zwei-Schrittherstellungsmethode in einigen Fällen echoerzeugende Mittel mit einer besseren Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck als das Ein-Schrittverfahren von Beispiel 1 ergibt.
TABELLE 7
Beispiel 8
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde auf ein Experiment, wie es im Stand der Technik beschrieben ist, z. B. in Beispiel 1 der WO 92/11873, angewendet. 3 g Pluronic^® F68 (ein Copolymer aus Polyoxyethylen-Polyoxypropylen mit einem Molekulargewicht von 8400), 1 g Dipalmitoylphosphatidylglycerin (Natriumsalz, AVANTI Polar Lipids) und 3,6 g Glycerin wurden zu 80 ml destilliertem Wasser gegeben. Nach dem Erhitzen auf etwa 80°C wurde eine klare, homogene Lösung erhalten. Die Tensidlösung wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und das Volumen auf 100 ml abgeglichen. In einigen Experimenten (siehe Tabelle 8) wurde Dipalmitoylphosphatidylglycerin durch eine Mischung aus Diarachidoylphosphatidylcholin (920 mg) und 80 mg Dipalmitoylphosphatidsäure (Natriumsalz, AVANTI Polar Lipids) ersetzt.
Die Blasensuspensionen wurden unter Verwendung von 2 Spritzen erhalten, die durch ein Drei-Wegeventil miteinander verbunden waren. Eine Spritze war mit 5 ml der Tensidlösung gefüllt, während die andere mit 0,5 ml Luft oder Gas gefüllt war. Das Drei-Wegeventil wurde mit der Tensidlösung gefüllt, bevor es mit der das Gas enthaltenden Spritze verbunden wurde. Durch abwechselndes Betätigen der Kolben wurden die Tensidlösungen zwischen den beiden Spritzen hin und zurück transferiert (5mal in jede Richtung), milchige Suspensionen wurden gebildet. Nach dem Verdünnen (1 : 10 bis 1 : 50) mit destilliertem Wasser, das bis zum Gleichgewicht mit Luft gesättigt war, wurde die Widerstandsfähigkeit der Zubereitungen gegen Druck gemäß Beispiel 1 bestimmt. Die Druckerhöhungsrate betrug 319·10² N·m² (240 Torr/min). Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
TABELLE 8
Es folgt, daß durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und durch das Austauschen von Luft gegen andere Gase, z. B. SF₆, selbst bei bekannten Zubereitungen erhebliche Verbesserungen, d. h. Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegen Druck, erreicht werden können. Dies gilt sowohl im Fall von negativ geladenen Phospholipiden (z. B. DPPG) als auch im Fall von Mischungen aus neutralen und negativ geladenen Phospholipiden (DAPC/DPPA).
Die obigen Experimente zeigen weiter, daß das anerkannte Problem der Empfindlichkeit von Mikrobläschen und Mikroballons gegenüber dem Kollabieren beim Unterdrucksetzen, d. h. wenn Suspensionen in Lebewesen injiziert werden, durch das Verfahren der Erfindung vorteilhaft gelöst wurde. Suspensionen mit Mikrobläschen oder Mikroballons mit größerer Widerstandsfähigkeit gegenüber dem Kollabieren und größerer Stabilität können vorteilhaft hergestellt werden, wobei Suspensionen mit besserer Reproduzierbar keit und verbesserte Sicherheit der in vivo am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommenen sonographischen Messungen bereitgestellt werden.

Claims

Kontrastmittel zur Ultraschallsonographie, enthaltend als Suspension in einer wäßrigen, flüssigen Trägerphase mit Gas oder einer Gasmischung gefüllte Mikrovesikel, bei denen es sich entweder um Mikrobläschen mit einer immateriellen oder vergänglichen Hülle, d. h. sie sind lediglich von einer Flüssigkeitswand umgeben, deren Oberflächenspannung durch die Anwesenheit eines oberflächenaktiven Stoffes modifiziert ist, oder Mikroballons handelt, die durch eine materielle Hülle begrenzt sind, die aus einer organischen Polymermembran hergestellt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Gasmischung mindestens ein physiologisch verträgliches, halogeniertes Kohlenwasserstoffgas oder ein stabiles, fluoriertes Chalcogenid enthält, dessen Verhältnis von Wasserlöslichkeit, ausgedrückt in Liter Gas pro Liter Wasser unter Standardbedingungen, zur Quadratwurzel des Molekulargewichts, in Dalton, kleiner als 0,0027 ist, wobei SF₆ oder CF₄ erhaltende Mikroballons ausgenommen sind, die eine Hülle aus vernetzten oder polymerisierten, amphiphilen Nicht-Proteinkomponenten oder Protein, das mit biologisch abbaubaren vernetzenden Gruppen vernetzt ist, aufweisen.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, worin das halogenierte Kohlenwasserstoffgas oder das stabile fluorierte Chalcogenid SF₆ oder ein Freon ist, das unter CF₄, C₄F₈, CClF₃, C₂F₆, C₂ClF₅, CBrClF₂, C₂Cl₂F₄ oder C₄F₁₀ ausgewählt ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, worin die Mikrovesikel Mikrobläschen sind und worin die wäßrige Phase einen gelösten, filmbildenden, oberflächenaktiven Stoff in lamellarer oder laminarer Form enthält, der ein oder mehrere Phospholipide enthält.
Kontrastmittel nach Anspruch 3, worin zumindest ein Teil der Phospholipide in Form von Liposomen vorliegt.
Kontrastmittel nach Anspruch 4, worin die flüssige Trägerphase zusätzlich Stabilisatoren enthält.
Kontrastmittel nach Anspruch 3, worin mindestens eines der Phospholipide eine Diacylphosphatidylverbindung ist, worin die Acylgruppe ein C₁₆-Fettsäurerest oder ein höheres Homologes davon ist.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, worin die Polymere der Membran aus Polymilchsäure oder Polyglycolsäure und deren Copolymeren, vernetztem Serumalbumin, vernetztem Hämoglobin, Polystyrol und Estern von Polyglutamin- und Polyasparaginsäure ausgewählt sind.
Kontrastmittel nach Anspruch 7, worin die Mikrovesikel mit SF₆ gefüllt sind.
Kontrastmittel nach Anspruch 1, worin das Gas in den Mikrovesikeln aus CF₄, C₄F₈, CClF₃, C₂F₆, C₂ClF₅, CBrClF₂, C₂Cl₂F₄ oder C₄F₁₀ ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung von Kontrastmitteln enthaltend die Suspensionen gasgefüllter Mikrovesikel in einer wäßrigen, flüssigen Trägerphase gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch das Bilden der Mikrovesikel in einer Atmosphäre einer Gasmischung enthaltend mindestens ein physiologisch verträgliches, halogeniertes Kohlenwasserstoffgas oder ein stabiles, fluoriertes Chalcogenid, dessen Verhältnis von Löslichkeit in Wasser, ausgedrückt in Liter Gas pro Liter Wasser unter Standardbedingungen, zur Quadratwurzel des Molekulargewichts, in Dalton, unter 0,0027 liegt.
Verfahren zur Herstellung von Kontrastmitteln enthaltend die Suspensionen gasgefüllter Mikrovesikel in einer wäßrigen, flüssigen Trägerphase gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch das Füllen bereits hergestellter Mikrovesikel mit einer Gasmischung enthaltend mindestens ein physiologisch verträgliches, halogeniertes Kohlenwasserstoffgas oder ein stabiles, fluoriertes Chalcogenid, dessen Verhältnis von Löslichkeit in Wasser, ausgedrückt in Liter Gas pro Liter Wasser unter Standardbedingungen, zur Quadratwurzel des Molekulargewichts, in Dalton, unter 0,0027 liegt.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin der wäßrige Träger gelöste lamellarisierte Phospholipide und Stabilisatoren enthält, welche die Mikrobläschen stabilisieren.
Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die Mikrovesikel in zwei Schritten gebildet werden, einem ersten Schritt, in welchem die Mikrovesikel oder trockene Vorstufen davon in einer Atmosphäre eines ersten Gases vorgeformt werden, und einem zweiten Schritt, in dem dann mindestens ein Teil des ersten Gases durch das physiologisch verträgliche, halogenierte Kohlenwasserstoffgas oder ein stabiles, fluoriertes Chalcogenid ersetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das Herstellen der Mikrovesikel mit der Gasmischung dadurch bewirkt wird, daß die trockenen Vorstufen davon abwechselnd reduziertem Druck unterworfen werden und dann der Druck mit der Gasmischung wiederhergestellt wird und schließlich die Vorläufer in einem flüssigen Träger dispergiert werden.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das erste Gas Luft, Stickstoff oder CO₂ ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 10 bis 15, worin das halogenierte Kohlenwasserstoffgas oder das stabile fluorierte Chalcogenid SF₆ oder ein Freon ist, das aus CF₄, C₄F₈, CClF₃, C₂F₆, C₂ClF₅, CBrClF₂, C₂Cl₂F₄ oder C₄F₁₀ ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das erste Gas vollständig durch das zweite physiologisch verträgliche, halogenierte Kohlenwasserstoffgas oder das stabile, fluorierte Chalcogenid ersetzt wird, das aus CF₄, C₄F₈, CClF₃, C₂F₆, C₂ClF₅, CBrClF₂, C₂Cl₂F₄ oder C₄F₁₀ ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Füllen der Mikrovesikel mit der Gasmischung dadurch bewirkt wird, daß die Suspension der Mikrovesikel mit der Gasmischung gespült wird.
Kontrastmittelvorläufer bestehend aus einem trockenen Pulver, enthaltend lyophilisierte Liposomen und Stabilisatoren, wobei das Pulver in einem wäßrigen flüßigen Träger unter Bildung einer echogenen Suspension gasgefüllter Mikrovesikel gemäß Anspruch 1 dispergierbar ist, wobei das Pulver in einer Atmosphäre einer Gasmischung gelagert wird, die mindestens ein physiologisch verträgliches, halogeniertes Kohlenwasserstoffgas oder ein stabiles, fluoriertes Chalcogenid enthält, dessen Verhältnis von Löslichkeit in Wasser, ausgedrückt in Liter Gas pro Liter Wasser unter Standardbedingungen, zur Quadratwurzel des Molekulargewichts, in Dalton, unter 0,0027 liegt.
Kontrastmittelvorläufer, bestehend aus einem trockenen Pulver, enthaltend lyophilisierte Liposomen und Stabilisatoren, wobei das Pulver in einem wäßrigen flüssigen Träger unter Bildung einer echogenen Suspension gasgefüllter Mikrovesikel gemäß Anspruch 1 dispergierbar ist, wobei das Pulver in einer Atmosphäre eines physiologisch verträglichen, halogenierten Kohlenwasserstoffgases oder eines stabilen fluorierten Chalcogenids gelagert wird, dessen Verhältnis von Löslichkeit in Wasser, ausgedrückt in Liter Gas pro Liter Wasser unter Standardbedingungen zur Quadratwurzel des Molekulargewichts, in Dalton, unter 0,0027 liegt.
Kontrastmittelvorläufer nach Anspruch 19 oder 20, worin die Liposomen Phospholipide enthalten, deren Fettsäurereste 16 oder mehr Kohlenstoffatome enthalten.
Kontrastmittelvorläufer nach Anspruch 19 oder 20, worin das halogenierte Kohlenwasserstoffgas oder das stabile, fluorierte Chalcogenid SF₆ oder ein Freon ist, das aus CF₄, C₄F₈, CClF₃, C₂F₆, C₂ClF₅ oder CBrClF₂, C₂Cl₂F₄ oder C₄F₁₀ ausgewählt ist.
Kontrastmittel nach den Ansprüchen 1 bis 9 zur Verwendung bei der bildgebenden Untersuchung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Verwendung von Kontrastmittelvorläufern gemäß den Ansprüchen 19 bis 22 zur Herstellung von Ultraschallkontrastmitteln.