DE60130452T2 - Referenzvorrichtung zur Evaluierung der Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops, sowie Verfahren und System zur Durchführung der Evaluierung - Google Patents

Referenzvorrichtung zur Evaluierung der Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops, sowie Verfahren und System zur Durchführung der Evaluierung Download PDF

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    • G02B21/0076Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Description

  • Anwendungsgebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft eine Referenzvorrichtung zur Evaluierung der Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops.
  • Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine Referenzvorrichtung zur Evaluierung der Funktion eines Typs konfokaler Laserscanmikroskope, der dazu geeignet ist, eine zweidimensionale quantitative Fluoreszenzmessung an einem Testmaterial durchzuführen, das auf einer flachen Oberfläche eines ersten Glassubstrats verteilt ist, insbesondere bei einem DNA Bindungsarray oder dergleichen, beispielsweise einem DNA-Bindungsarray des Typs, der in dem US-Patent 5,143,854 beschrieben ist.
  • Die Erfindung richtet sich auch auf ein Verfahren zur Evaluierung der Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops, insbesondere eines konfokalen Laserscanmikroskops des vorstehend erläuterten Typs.
  • In besonderem Maße betrifft die Erfindung eine Evaluierungsmethode, die es ermöglicht, ein konfokales Laserscanmikroskop der vorstehend erläuterten Art hinsichtlich der quantitativen Signaldetektionsempfindlichkeit, hinsichtlich der Detektionsgrenze, hinsichtlich der Gleichmäßigkeit des konfokalen Volumens über das Scan-Bildfeld, hinsichtlich der räumlichen Auflösung bei dem Scanprozess und hinsichtlich des dynamischen Verhaltens des gemessenen Signals über das Scan-Bildfeld zu überprüfen, wobei das gemessene Signal dem empfangenen Fluoreszenzlicht entspricht.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung ein System zur Evaluierung der Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops das dazu ausgebildet ist, eine zweidimensionale quantitative Fluoreszenzmessung eines Testmaterials durchzuführen, das auf einer flachen Oberfläche eines Substrats verteilt ist.
  • Hintergrund
  • Referenzvorrichtungen zur Evaluierung der Funktion von Instrumenten zur Durchführung optischer Messungen sind beispielsweise in den US-Patenten 5,581,631 und 4,662,745 beschrieben.
  • Das US-Patent 5,581,631 beschreibt eine Vorrichtung zum Testen der Linearität des Bildaufnahmesystems in einem zytologischen System, beispielsweise einem System, welches ein Transmissionsmikroskop und biologische Mikroskopobjektive umfasst. Bei dieser Vorrichtung ist in der Objekt-Fokalebene des Bildaufnahmesystems ein Primitivbild (image primitive) positioniert, welches eine periodische Struktur aufweist, beispielsweise ein Kalibrationsplättchen wie zum Beispiel eine Glasplatte mit einem darauf angebrachten Barcode. Es wird ein Bild des Primitivbildes erzeugt und die Bildinformation wird verarbeitet, beispielsweise zur Überprüfung der Linearität des Systems, wobei "Linearität" definiert ist als die Änderung der Ausgangsspannung des Systems bezüglich der Intensität des Licht-Inputs, oder zur Überprüfung der Frequenzabhängigkeit des System unter Benutzung einer Modulations-Transferfunktion und/oder zur Bestimmung des Signal-/Rausch-Verhältnisses für bestimmte Bereiche des Frequenzspektrums.
  • In dem US-Patent 4,662,745 ist eine Kalibrationsplatte beschrieben, die sowohl hinsichtlich der Reflektion als auch hinsichtlich der Lumineszenz eine bekannte Charakteristik aufweist. Sie dient dazu, ein Instrument im Einsatz zu testen, welches dazu geeignet ist, Lichtenergie zu messen, die von einem Photolumineszenz-Target innerhalb eines engen Frequenzbandes im sichtbaren und nahe-sichtbaren Bereich des Spek trums abgestrahlt wird. Die in dem US-Patent 4,662,745 beschriebene Kalibrationsplatte wird hergestellt, indem man auf die Oberfläche eines starren Substrats, beispielsweise einer Stahlplatte, eine keramische Beschichtung oder eine Glasbeschichtung aufbringt, wobei die Beschichtung ein photolumineszierendes Material einer seltenen Erde enthält. Die keramische Beschichtung wird anschließend mit feinem Abrieb sandgestrahlt.
  • Das Prinzip eines konfokalen Laserscanmikroskops zur zweidimensionalen quantitativen Fluoreszenzmessung ist in den 1 und 2 dargestellt. 1 zeigt den optischen Aufbau eines konfokalen Laserscanmikroskops des Typs "2-D flying spot", wobei zur Fluoreszenzanregung ein Laserstrahl 11 verwendet wird. Außerdem weist die Anordnung einen dichroischen Strahlteiler 12, eine zweidimensionale Scanmaschine 13 zur räumlichen Strahlablenkung in zwei zueinander orthogonale Richtungen (X-Y) und eine Linse 14 zur Fokusierung des Laserstrahls in eine Objektebene 15 auf. Durch die Anregung von fluoreszierenden Molekülen in der Objektebene 15 wird Fluoreszenzlicht erzeugt, welches eine längere Wellenlänge als der Anregungslaser 11 hat.
  • Fluoreszenzlicht, welches von Fluorophoren in der Objektebene 15 des abgetasteten Gebietes emitiert wird, wird von einer Linse 14 gesammelt und dann mittels der Scanmaschine 13 und des dichroischen Strahlteilers 12 als Fluoreszenzlichtstrahl 17, der mittels einer Linse 18 fokusiert ist, in eine Lochblende 19 transmitiert, welche in einer Konjugatebene 21 vor einem einer Photodetektoreinrichtung 22 angeordnet ist.
  • Das Konzept der konfokalen Bilderzeugung, welches derzeit dazu verwendet wird, die im allgemeinen schwachen Fluoreszenzsignale von der Hintergrundstrahlung zu diskriminieren, ist in 2 dargestellt. Nur optische Strahlung, die aus dem konfokalen Volumen Vc stammt, das heißt das Fluoreszenzsignal, wird von dem Photodetektor 22 detektiert. Vc ist dabei definiert durch die optische Transferfunktion der Detektionsoptik (OTFem) und durch die Größe des Detektor-Blendenlochs 19 in der Konjugatebene 21. Je kleiner das konfokale Volulmen Vc ist, desto besser ist die Unterdrückung des Hintergrundsignals.
  • Die Größe des Scan-Sichtfeldes liegt typischerweise in der Größenordnung von 20 × 20 Quadratmillimeter. Das konfokale Volumen liegt im allgemeinen in der Größenordnung von Vc = 5 × 5 × 50 Kubikmikrometer, wobei Ac = 5 × 5 Quadratmikrometer und zc = 50 Mikrometer ungefähr die Spotgröße beziehungsweise den Rayleigh Bereich des fokusierten Laserstrahls beschreiben. Die Pixelgröße der Scanmaschine 13 beim Abtasten mittels des Laserstrahls 11 in dem Sichtfeld beträgt typischerweise 1 bis 20 Mikrometer.
  • DNA-Bindungsarrays, beispielsweise diejenigen, die in dem US-Patent 5,143,854 dargestellt sind, bestehen aus einem Glasplättchen, welches ein chemisches System trägt, wobei das Plättchen in benachbarte Zellen unterteilt ist, die üblicherweise als Features bezeichnet werden. Die Features sind durch spezifische Sonden (probes) charakterisiert. Spezifische Nukleinsäuresequenzen werden durch die Sonden immobilisiert (gefangen) und mittels eines Fluoreszenzfarbstoffes markiert. Die Menge der gefangenen Nukleinsäure an einem bestimmten Feature wird mittels einer quantitativen Fluoreszenzmessung detektiert (der Fluoreszenzfarbstoff emitiert Licht, wenn er mit Licht einer vorgegebenen Wellenlänge angeregt wird), wobei ein sequenzielles pixelweises Lesen (scannen) der Features durchgeführt wird. Durch die Scanprozedur werden die Features räumlich über-abgetastet (oversampled, d.h. die Zahl der Pixel ist größer als die Zahl der Features) um eine genaue räumliche Bezugnahme innerhalb des Glasplättchens zu ermöglichen, wobei eine numerische Datenanalyse durchgeführt wird und wobei zur Verbesserung der Feature-Signalqualität eine Mittelwertbildung der physikalisch gemessenen Lichtintensitäten durchgeführt wird. Typische Pixelgrößen liegen in der Größenordnung von 1 bis 20 Mikrometer.
  • Bei der konfokalen Lasermikroskopie ist das Verhältnis zwischen dem Scan-Bildfeld und dem Querschnitt Ac des konfokalen Volumens typischerweise hoch, d. h. "Scan-Bildfeld"/"Querschnit Ac des konfokalen Volumens" >> 1. Dies führt ohne weiteres zu einer von der x-y Position abhängenden optischen Tranferfunktion OTF (x, y) = OTFex·OTFem, wobei OTFex und OTFem die optischen Transferfunktionen der Anregungsoptik beziehungsweise der Emissionsoptik sind. Die Abhängigkeit von der x-y Position resultiert hauptsächlich aus mechanischer Missjustierung sowie aus Imperfektionen der optischen und optomechanischen Komponenten, beispielsweise der zum Abtasten verwendeten Scanmaschine. Daraus resultiert eine inhomogene Empfindlichkeit innerhalb des Scan-Bildfeldes, wie sie in den 3a, 3b und 3c dargestellt wird. Dies wiederum führt zu fehlerhaften quantitativen Fluoreszenzmessungen. Beispielsweise zeigt 4 schematisch das abgetastete Bild eines DNA-Bindungsarray, z. B. des in dem US-Patent 5,143,854 beschriebenen Typs, wobei dieses Array ein Schachbrettmuster hat. Wie nachfolgend unter Bezugnahme auf 4 beschrieben wird, hat das gescannte Bild in der rechten oberen Ecke eine geringere Signalstärke, wobei dies entweder auf eine inhomogene Fluorophordichte des gescannten Objektes oder auf eine inhomogene Sensitivität des konfokalen Laserscanmikroskops über das Scan-Bildfeld zurückzuführen ist.
  • Auf dieser Grundlage besteht ein Bedürfnis nach einer verlässlichen quantitativen Messung und Evaluierung der Sensitivität eines konfokalen Laserscanmikroskops des beschriebenen Typs über dessen Scan-Bildfeld.
  • Wenn ein geeignetes Referenz-Standardtarget verfügbar wäre, bestünde die Möglichkeit, zwischen Beiträgen zu der beispielsweise in 1 dargestellten Ungleichmäßigkeit zu differenzieren, welche einerseits durch das Instrument und andererseits durch das gescannte Objekt (z. B. ein DNA-Bindungsarray des in dem US-Patent 5,143,854 beschriebenen Typs) verursacht werden. Es liegen aber keine Berichte über ein Referenz-Targetobjekt vor, das dazu geeignet ist, die entscheidenden Leistungsmerkmale eines konfokalen Laserscanmikroskops, das heißt dessen Empfindlichkeit und Detektionsgrenze sowie dessen Verhalten hinsichtlich Gleichmäßigkeit, räumlicher Auflösung und Signaldynamik über das Scan-Bildfeld zu charakterisieren.
  • Es besteht deshalb ein Bedürfnis nach einem geeigneten Referenz-Standard-Targetobjekt, das es ermöglicht, zwischen Beiträgen zu differenzieren, die einerseits von dem Instrument und andererseits von dem gescannten Objekt herrühren und dem in 4 beispielhaft dargestellten Typ zuzurechnen sind.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Auf dieser Grundlage verfolgt die Erfindung das Ziel, eine Referenzvorrichtung, ein Verfahren und ein System der oben erläuterten Art zur Verfügung zu stellen, durch die es ermöglicht wird, die Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskopes, das zur Durchführung zweidimensionaler quantitativer Fluoreszenzmessungen geeignet ist, quantitativ zu evaluieren.
  • Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird dieses Ziel durch eine Referenzvorrichtung, die die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist, erreicht.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird das vorstehend erläuterte Ziel durch ein Verfahren gemäß Anspruch 6 erreicht.
  • Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird das vorstehend erläuterte Ziel durch ein System gemäß Anspruch 10 erreicht.
  • Wichtige Vorteile, die mit einer Referenzvorrichtung, einem Verfahren und einem System gemäß der Erfindung erreicht werden können, bestehen darin, dass diese eine quantitative und sehr genaue Evaluierung der Funktion eines konfokalen Lasermikroskopes, das zum Scannen von DNA-Bindungsarrays der oben erläuterten Art geeignet ist, ermöglichen; und dass diese Evaluierung die Möglichkeit bietet, Messergebnisse, die durch Scannen mit einem solchen Mikroskop gewonnen werden, quantitativ zu evaluieren, also zum Beispiel eine DNA- Bindungsarray einer zu analysierenden Probe. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, sich zu verdeutlichen, dass eine erfindungsgemäß ausgeführte Evaluierung die Messung folgender Charakteristika umfasst:
    • a) die quantitative Signaldetektionsempfindlichkeit,
    • b) die quantitative Signaldetektionsgrenze,
    • c) die Gleichmäßigkeit des konfokalen Volumens über das Scan-Bildfeld,
    • d) die räumliche Auflösung des Scanprozesses, und
    • e) das dynamische Verhalten des gemessenen Signals über das Scan-Bildfeld, wobei das gemessene Signal dem empfangenen Fluoreszenzlicht entspricht.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Nachfolgend werden bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert. Darin zeigen:
  • 1 Eine schematische Darstellung des grundlegenden Aufbaus eines konfokalen Laserscanmikroskops zur Durchführung einer zweidimensionalen quantitativen Fluoreszenzmessung;
  • 2 eine schematische Darstellung eines konfokalen Volumens Vc in einer Objektebene;
  • 3a, 3b 3c schematische Darstellungen verschiedener Formen einer Nicht-Gleichmäßigkeit des gescannten konfokalen Volumens über das Scan-Bildfeld;
  • 4 eine schematische Darstellung eines gescannten Bildes eines DNA-Bindungsarrays;
  • 5a eine Aufsicht auf eine erste Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Referenzvorrichtung;
  • 5b ein Querschnitt durch eine Ebene A-A der Ausführungsform gemäß 5a;
  • 6 die Form eines representativen elektrischen Signals, welches gemessen wird, wenn man das Fluoreszenzlicht misst, das von den fluoreszierenden Zonen ausgesandt wird, die in einer Reihe des in den 5a und 5b dargestellten Arrays angeordnet sind;
  • 7a eine Aufsicht auf eine zweite Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Referenzvorrichtung;
  • 7b ein Querschnitt der in 7a dargestellten Ausführungsform.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Nachfolgend wird die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben. Diese Ausführungsformen sollen dazu dienen, das Verständnis der Erfindung zu verbessern, sind aber nicht beschränkend zu verstehen.
  • 1 zeigt schematisch den grundsätzlichen Aufbau eines konfokalen Laserscanmikroskops zur zweidimensionalen quantitativen Fluoreszenzmessung für den Fall eines zweidimensionalen Flying Spot. Ein Anregungslaserstrahl 11, der durch einen dichroischen Strahlteiler 12 transmitiert wird, macht mittels einer zweiachsigen Scanmaschine 13, beispielsweise mittels eines Galvo-Scanners, eine räumliche Abtastbewegung entlang zweier Achsen X und Y, die senkrecht zueinander verlaufen. Er wird mittels einer Linse 14 in eine Objektebene 15 fokusiert, welche parallel zu der X-Y Ebene verläuft, die durch die Achsen X und Y definiert wird. Die Objektebene 15 verläuft senkrecht zu einer dritten Achse Z, die sich im rechten Winkel zu der X-Y Ebene erstreckt.
  • Fluorophore innerhalb des konfokalen Volumens Vc in der Objektebene 15 werden von dem fokusierten Laserspot 16 angeregt und das durch die Anregung erzeugte Fluoreszenzlicht 17 dieser Fluorophore wird gesammelt und mittels einer Linse 18 in ein Detektor-Blendenloch 19 in der Konjugatebene 21 abgebildet und von dem Photodetektor 22 detektiert.
  • 2 zeigt schematisch ein konfokales Volumen Vc (wobei Vc = Ac·zc) in der Objektebene 15. Idealerweise ist das konfokale Volumen Vc ein zylindrisches Volumen, dessen Rotationsachse parallel zu der Z-Achse verläuft und das einen kreisförmigen Querschnitt hat. Das konfokale Volumen Vc ist definiert durch die optische Transferfunktion (OTFem) der Detektionsoptik und die Größe und Form der Detektor-Lochblende 19 in der Konjugatebene 21. Nur optische Strahlung, die aus dem konfokalen Volumen Vc kommt, wird von dem Photodetektor 22 detektiert. Das Konzept der konfokalen Abbildung ermöglicht hohe Untergrund-Unterdrückungsraten zur Detektion schwacher Signalintensitäten, wie sie üblicherweise bei Fluoreszenzmessungen auftreten.
  • Die 3a, 3b und 3c zeigen schematische Darstellungen in der Y-Z Ebene von Nicht-Gleichmäßigkeiten des gescannten konfokalen Volumens Vc, mit anderen Worten von Abweichungen der Form des Volumens von der in 2 dargestellten idealen Form. Solche Abweichungen verursachen Inhomogenitäten der Amplitude des Intensitätssignals des Fluoreszenzlichts, das über die gescannte Fläche gemessen wird.
  • 3a zeigt ein gescanntes konfokales Volumen 24, das relativ zu einem idealen oder nominalen konfokalen Volumen 23 geneigt ist. 3b zeigt ein gescanntes konfokales Volumen 25 das keine konstante Breite hat und das insofern nicht-gleichmäßig im Vergleich zu dem nominalen konfokalen Volumen 23 ist. 3c zeigt ein gescanntes konfokales Volumen 26 das eine verbogene Form im Vergleich zu dem nominalen konfokalen Volumen 23 hat.
  • Hauptursache der Nicht-Gleichmäßigkeiten der in den 3a, 3b und 3c dargestellten konfokalen Volumina sind mechanische. Missjustierung und Imperfektionen optischer und optomechanischer Komponenten.
  • 4 zeigt eine schematische Darstellung eines gescannten Bildes eines DNA-Bindungsarray 31 des in dem US-Patent 5,143,854 beschrie benen Typs. Das Array 31 hat eine schachbrettförmige Anordunung fluoreszierender Punkte, die dazu ausgebildet sind, Fluoreszenzlicht zu emitieren, wenn sie mit Anregungslicht bestrahlt werden. Für die Zwecke der nachfolgenden Erfindung ist es vorteilhaft, zwei Zonen des Arrays 31 zu unterscheiden: Eine erste Zone 33, die sich von einer Diagonale 34 in die rechte obere Ecke des Arrays 31 erstreckt und eine zweite Zone 35, die sich von der Diagonale 34 in die linke untere Ecke des Arrays 31 erstreckt. Verursacht entweder durch eine inhomogene Fluorophordichte auf dem gescannten Objekt oder eine inhomogene Empfindlichkeit des konfokalen Laserscanmikroskops über das Scan-Bildfeld zeigt das in 4 dargestellte Bild, dass fluoreszierende Punkte 32, die in der Zone 33 des Array 31 lokalisiert sind, Fluoreszenzlicht von geringerer Intensität als die fluoreszierenden Punkte 32 in der Zone 35 zeigen. Zweck einer Referenzvorrichtung, eines Verfahrens und eines Systems gemäß der Erfindung ist es, quantitativ zu evaluieren, inwieweit derartige Variationen der Intensität des detektierten Fluoreszenzlichtes spezifisch auf eine inhomogene Empfindlichkeit des konfokalen Laserscanmikroskops über das Abtast-Bildfeld zurückzuführen sind.
  • 5a zeigt eine Aufsicht und 5b einen Querschnitt von einer ersten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Referenzvorrichtung 41, die dazu ausgebildet ist, quantitativ die Homogenität und Empfindlichkeit eines konfokalen Laserscanmikroskops zu charkterisieren, welches zur zweidimensionalen quantitativen Fluoreszenzmessung dient. In den 5a und 5b sind Abmessungen in Millimetern angegeben.
  • Die in den 5a und 5b dargestellte Referenzvorrichtung 41 besteht aus einer oberen Glasplatte 42, die mit einem Glassubstrat 43 verbunden ist. Das 16 × 16 Quadratmillimeter große Glassubstrat (Dicke = 1 Millimeter) hat eine geätzte planare Vertiefung 44 (schraffierter Bereich). Die Glas-Deckplatte 42 (Dicke 0,7 Millimeter) hat zwei Bohrlöcher 45 beziehungsweise 46, die als Ein- beziehungsweise Auslass dienen. In einer anderen möglichen Ausführungsform kann eine Glas-Deckplatte 42 ohne Bohrlöcher 45 und 46 verwendet werden, die nicht mit dem Glassubstrat 43 verbunden ist.
  • Das Glassubstrat 43 kann beispielsweise identische Abmessungen und vorzugsweise die gleichen optischen Eigenschaften haben, wie das Substrat eines DNA-Bindungsarrays 31, wie es vorstehend unter Bezugnahme auf 4 beschrieben wurde.
  • Die Vertiefung 44 der Referenzvorrichtung ist mit Fluorophoren gefüllt, die in einer vorherbestimmten Konzentration gelöst sind, so dass sich eine vorherbestimmte räumliche Verteilung von Fluorophoren auf der abgetasteten Fläche ergibt. Da die Fluorophore homogen gelöst sind, wird deren räumliche Verteilung durch die Struktur der Vertiefung 44, nicht durch die gelösten Fluorophore selbst, bestimmt. In dem unter Bezugnahme auf die 5a und 5b beschriebenen Beispiel ist die Vertiefung 44 planar und deshalb ist die räumliche Verteilung der Fluorophore gleichmäßig über die gesamte Fläche der Vertiefung 44.
  • Das Deckglas 42 der in in den 5a und 5b dargestellten Referenzvorrichtung 41 hat identische Dimensionen und optische Eigenschaften wie das Glassubstrat eines entsprechenden DNA-Bindungsarrays des Typs, der oben unter Bezugnahme auf 4 beschrieben wurde. Deshalb kann die Referenzvorrichtung 41 unter den gleichen optischen Bedingungen durch das konfokale Laserscanmikroskop gescannt werden. Wegen der definierten Abmessungen der Vertiefung und der kontrollierten Konzentration des Fluorophors, der in einer vorbestimmten räumlichen Verteilung über die abgetastete Fläche vorliegt, ist es möglich, das Messsignal hinsichtlich, der Empfindlichkeit (Detektionsgrenze) und hinsichtlich der Homogenität über das Scan-Bildfeld zu untersuchen. Wie weiter oben erwähnt, wird die räumliche Verteilung des gelösten Fluorophors durch die Struktur der Vertiefung 44 bestimmt, nicht durch die homogen gelösten Fluorophore selbst.
  • Ein Vorteil der Verwendung von gelösten Fluorophoren besteht darin, dass die Lösung unmittelbar vor Durchführung der Fluoreszenzmessung hergestellt werden kann. Deshalb unterliegt die mit einer flüssigen Lösung von Fluorophoren gefüllte Referenzvorrichtung nicht den Ein schränkungen eines möglichen Ausbleicheffektes, der anderweitig auftreten könnte, wenn die Referenzvorrichtung für längere Zeit gelagert wird. Ein solcher Ausbleicheffekt könnte zu einer nicht-quantitativen Fluoreszenzfähigkeit der Referenzvorrichtung über das Scan-Bildfeld führen. Außerdem können leicht verschiedene Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an gelöstem Fluorophor hergestellt werden. Dies ermöglicht Fluoreszenzmessungen mit unterschiedlichen Intensitätswerten. Insbesondere kann so der Intensitätswert der Detektionsgrenze bestimmt werden.
  • Die Höhe der Vertiefung 44 ist wesentlich kleiner als die Tiefe des konfokalen Volumens Vc, die durch den Rayleigh Bereich zc bestimmt wird. Deshalb ermöglicht die dünne ebene Schicht von Fluorophoren in der Vertiefung 44 eine verlässliche Evaluierung von z. B. möglichen Verschiebungen des konfokalen Volumens Vc in der Z-Richtung (im rechten Winkel zu dem Scan-Bildfeld), wenn die Referenzvorrichtung 41 über das gesamte Scan-Bildfeld abgetastet wird.
  • Ein Beispiel zeigt 6, wobei das Signalprofil der Reihe 588 aus 1024 des abgetasteten Bildes dargestellt ist, bezogen auf die in den 5a und 5b dargestellte Referenzvorrichtung: Die Vertiefung 44 der Vorrichtung hat eine konstante Dicke über ihre gesamte Ausdehnung und ist mit einer Lösung von 200 mg/ml Fluorescein-TRIS-Lösung (Fluorescein in einer wässrigen Lösung von 0,1 molarem TRIS-Puffer pH 8,3). Das Bild kann hinsichtlich der Empfindlichkeit und der Gleichmäßigkeit des konfokalen Laserscanmikroskops analysiert werden, wie dies in 6 für das Linienprofil der Reihe 588 aus 1024 dargestellt ist (Bildfeld = 10 × 10 Quadratmillimeter, Pixelgröße = 10 Mikrometer, Auflösung des Scans 1024×1024 Pixel, Abtastzeit 126 Sekunden, Detektionsempfindlichkeit des benutzten Transimpedanz-Verstärkers 10 μamp/Volt, Grenzfrequenz oder 6 dB-Frequenz des mit dem Transimpedanz-Verstärker verwendeten Tiefpassfilters 30 kHz, Integrationsintervall [tdwell]-Dauer 40 Mikrosekunden). Aus 6 kann man entnehmen, dass das resultierende Linienprofil von etwas Rauschsignal überlagert ist. Die Signalintensität ist in 6 in willkürlichen Einheiten dargestellt.
  • Die Abweichung der Signalintensität jedes Pixels von einem vorherbestimmten Wert, die beispielsweise als durchschnittliche Signalintensität über das gesamte abgetastete Bild angegeben werden kann, bildet einen quantitativen Parameter der Funktionsqualität eines konfokalen Laserscanmikroskops.
  • Eine weitere Anwendungsmöglichkeit wird dadurch gebildet, dass der Pegel der Signalintensität kalibriert werden kann. Die Anzahl der Fluorophore pro Flächeneinheit kann aus der Konzentration der gelösten Fluorophore bestimmt werden. Deswegen ist die gemessene Signalintensität und die gemessene Empfindlichkeit auf quantitative Weise bezogen auf die Zahl der Fluorophore pro Flächeneinheit.
  • Eine zweite Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Referenzvorrichtung zur quantitativen Evaluierung der Gleichmäßigkeit und räumlichen Auflösung eines konfokalen Laserscanmikroskops ist in 7a in Aufsicht und in 7b im Querschnitt dargestellt.
  • In 7a sind einige Abmessungen in Mikrometern angegeben. In 7b sind einige Abmessungen in Millimetern angegeben.
  • Die in den 7a und 7b dargestellte Referenzvorrichtung 51 besteht aus einer Glas-Deckplatte 52 auf einem Glassubstrat 51 und hat eine Fläche von 16 × 16 Quadratmillimeter. Die obere Oberfläche des Glassubstrats 53 (Dicke = 1 Millimeter) hat eine geätzte mikrostrukturierte Vertiefung von 5 μm, die einen Hohlraum 54 mit einer unteren inneren Oberfläche bildet. Der Hohlraum 54 ist gleichmäßig mit einem Fluorophor gefüllt, welcher eine vorherbestimmte Konzentration hat, sodass eine vorherbestimmte räumliche Verteilung fluoreszierender Zonen über die Fläche des Hohlraumes 54 resultiert. Diese räumliche Verteilung ist nicht von den gelösten Fluorophoren selbst bestimmt, sondern von der Struktur des Hohlraumes 54. Der Hohlraum 54 ist von der Glas-Deckplatte 52 abgedeckt, die eine untere äußere Oberfläche hat. Der Raum, der von der unteren äußeren Oberfläche der Platte 52 und der unteren inneren Oberfläche der Vertiefung 54 gebildet wird, hat eine Dicke D, welche gemäß einer vorherbestimmten Funktion der Form D = f (x, y) über die gesamte Fläche der Depression 54 variiert. Der vorstehend genannte Raum ist mindestens teilweise mit gelösten Fluorophoren gefüllt.
  • Das Glassubstrat 53 hat beispielsweise identische Dimensionen und vorzugsweise die gleichen optischen Eigenschaften wie das Substrat des oben unter Bezugnahme auf 4 beschriebenen DNA-Bindungsarrays 31.
  • Das Deckglas 52 der Referenzvorrichtung 51 hat identische optische Eigenschaften wie ein Glassubstrat eines gegebenen DNA-Bindungsarrays 31 derart, wie sie oben unter Bezugnahme auf 4 beschrieben wurde. Deshalb kann die Referenzvorrichtung 51 mittels eines konfokalen Laserabtastmikroskops unter den gleichen optischen Bedingungen abgetastet werden.
  • Der mikrostrukturierte Hohlraum 54 weist unterschiedliche Muster von fluoreszierenden Zonen auf. In 7 ist jede nicht-fluoreszierende Zone als abschattierte Oberfläche dargestellt.
  • Ein erstes Muster fluoreszierender Zonen weist nur zwei nicht-fluoreszierende Zonen auf, die jeweils in 7 als abgeschattete Quadrate dargestellt sind. In 7a sind fluoreszierende Zonen mit diesem ersten Muster in jeder der vier Eckzonen 55, 56, 57, 58 der Referenzvorrichtung 51 lokalisiert. Die Messsignale, die der Intensität des Fluoreszenzlichts entsprechen, welches aus diesen Eckzonen emitiert wird, werden ausgewertet, um den Grad der Gleichmäßigkeit über das Scan-Bildfeld des mit einem konfokalen Laserscanmikroskops durchgeführten Scans zu ermitteln. Die Zonen 61 und 62, die an mehreren Reihen der Referenzvorrichtung 51 lokalisiert sind, haben ein zweites Muster räumlicher Verteilung fluoreszierender Features. Die Messsignale, welche Fluoreszenzlicht entsprechen, das aus den Zonen 61 und 62 emitiert wurde, werden ausgewertet, um die Auflösung des mit dem Laserscanmikroskop durchgeführten Scans zu ermitteln. Darüberhinaus kann, da die Abmessungen der Zonen 61 und 62 bekannt sind, die Präzision der Scanschritte, die mit der Scanmaschine durchgeführt werden, ermittelt werden. Wie in 7a dargestellt ist, sind die Zonen 61 und 62 derartig unterteilt, dass der Hohlraum ein einziges verbundenes Reservoir bildet, das mit den gelösten Fluorophoren gefüllt ist.
  • Die Zonen 63, 64, welche als Gruppen von Balken mit verschiedenen Neigungswinkeln erscheinen, bilden ein drittes Muster fluoreszierender Features, das auf der Referenzvorrichtung 51 zur Verfügung steht. Die Messsignale, die dem fluoreszierenden Licht entsprechen, das aus einer Zone, wie der Zone 63, emitiert wird, wird ausgewertet, um das dynamische Signalverhalten zu ermitteln, das während eines mit dem konfokalen Laserscanmikroskop durchgeführten Scans zu beobachten ist.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Referenzvorrichtungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden und in den 5a und 5b bzw. 7a und 7b dargestellt sind. Diese Referenzvorrichtungen werden zur quantitativen Evaluierung eines konfokalen Laserscanmikroskops verwendet, das für die quantitative Fluoreszenzmessung bestimmt ist. Typische Charakteristika, die mit einer Referenzvorrichtung gemäß der Erfindung beziehungsweise einem entsprechenden Verfahren bestimmt werden, sind:
    • a) die quantitative Signaldetektionsempfindlichkeit,
    • b) die quantitative Signaldetektionsgrenze,
    • c) die Gleichmäßigkeit des konfokalen Volumens über das Scan-Bildfeld,
    • d) die räumliche Auflösung des Scanprozesses, und
    • e) das dynamische Verhalten des gemessenen Signals über das Scan-Bildfeld, wobei das gemessene Signal dem empfangenen Fluoreszenzlicht entspricht.
  • Die beschriebene Verwendung der Erfindung zur Evaluierung der Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops umfasst im Wesentlichen
    das Abtasten einer Referenzvorrichtung gemäß der Erfindung mit einem Mikroskop, das evaluiert werden soll, um dadurch einen ersten Satz von Messwerten zu erhalten,
    die Verarbeitung des ersten Satzes von Messwerten, um Korrekturfaktoren zu erhalten,
    das Speichern der Korrekturfaktoren
    das Abtasten einer Probe, beispielsweise eines DNA-Bindungsarrays mit dem evaluierten Mikroskop, um einen zweiten Satz von Messwerten zu erhalten, und
    die Korrektur des zweiten Satzes von Messwerten bezüglich der Korrekturfaktoren, um einen dritten Satz von Werten zu erhalten, die frei sind von auf die Funktion des Scanners zurückzuführenden Abweichungen und die deshalb genauer den Charakteristika der jeweils untersuchten Probe entsprechen.
  • Obwohl vorausgehend bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung unter Verwendung spezifischer Begriffe beschrieben wurden, dient diese Beschreibung nur zur Erläuterung und ist dahingehend zu verstehen, dass Änderungen und Variationen vorgenommen werden können, ohne den Schutzbereich der Ansprüche des Patentes zu verlassen.
  • 11
    Anregungslaserstrahl
    12
    Dichroischer Strahlteiler
    13
    Zweiachsige Scanmaschine
    14
    Linse
    15
    Objektebene
    16
    Fokusierter Laserpunkt
    17
    Fluoreszenzlicht
    18
    Linse
    19
    Detektor-Blendenloch
    21
    Konjugatebene
    22
    Photodetektor
    23
    Nominales konfokales Volumen (Querschnitt in der Ebene z-y)
    24
    Gescanntes konfokales Volumen (Querschnitt in der Ebene z-y)
    25
    Gescanntes konfokales Volumen (Querschnitt in der Ebene z-y)
    26
    Gescanntes konfokales Volumen (Querschnitt in der Ebene z-y)
    31
    DNA-Bindungsarray (in der Objektebene lokalisiert)
    32
    Fluoreszenzpunkt oder Fluoreszenz-Feature
    33
    Zone
    34
    Diagonale
    35
    Zone
    41
    erste Ausführungsform einer Referenzvorrichtung
    42
    Deckplatte
    43
    untere Platte
    44
    Hohlraum
    45
    Loch
    46
    Loch
    51
    zweite Ausführungsform einer Referenzvorrichtung
    52
    Deckplatte
    53
    untere Platte
    54
    Hohlraum
    55
    Zone mit einem ersten Muster fluoreszierender Features
    56
    Zone mit einem ersten Muster fluoreszierender Features
    57
    Zone mit einem ersten Muster fluoreszierender Features
    58
    Zone mit einem ersten Muster fluoreszierender Features
    61
    Zone mit einem zweiten Muster fluoreszierender Features
    62
    Zone mit einem zweiten Muster fluoreszierender Features
    63
    Zone mit einem dritten Muster fluoreszierender Features
    64
    Zone mit einem dritten Muster fluoreszierender Features

Claims (10)

  1. Referenzvorrichtung zur Evaluierung der Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops, gekennzeichnet durch die folgenden Bestandteile: a) ein Substrat (43, 53), und b) ein Referenz-Fluoreszenzmaterial, das über die Fläche des Substrats (43, 53) verteilt ist, wobei das Referenz-Fluoreszenzmaterial in vorbestimmter Weise über die Oberfläche verteilt ist und das Referenz-Fluoreszenzmaterial in einer Flüssigkeit in einer vorbestimmten Konzentration gelöst ist.
  2. Referenzvorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher das Referenz-Fluoreszenzmaterial über die Oberfäche des Substrats eine konstante Dicke hat.
  3. Referenzvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei welcher das Referenz-Fluoreszenzmaterial eine Dicke hat, die geringer ist als die Tiefe (zc) des konfokalen Volumens (Vc) des konfokalen Laserscanmikroskops.
  4. Referenzvorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher das Referenzfluoreszenzmaterial über die Oberfläche des Substrats gleichmäßig verteilt ist und das Referenz-Fluoreszenzmaterial eine vorbestimmte Konzentration hat.
  5. Referenzvorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher eine obere Oberfläche (43, 53) des Substrats eine Vertiefung (54) aufweist, wobei die Vertiefung (54) eine konstante Tiefe hat und sich über einen erheblichen Teil der oberen Oberfläche erstreckt und wobei die Vertiefung (54) außerdem eine innere Oberfläche an einem Boden der Vertiefung (54) hat, wobei die Referenzvorrichtung außerdem aufweist eine Deckplatte (42, 52), welche optisch transparent ist und die Vertiefung des Substrats abdeckt, wobei die Deckplatte außerdem eine untere äußere Oberfläche aufweist und so angeordnet ist, dass zwischen der unteren äußeren Oberfläche der Deckplatte und der inneren Oberfläche der Vertiefung ein Raum vorhanden ist, der auf der gesamten Fläche der Vertiefung (54) eine konstante Tiefe hat; eine oder mehrere Zonen in dem Raum, die vollständig mit dem Referenz-Fluoreszenzmaterial gefüllt sind, wobei sich dieses über die gesamte Tiefe jeder Zone erstreckt.
  6. Verfahren zur Evaluierung der Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops des Typs, welcher zur Durchführung von zweidimensionalen quantitativen Fluoreszenzmessungen eines Untersuchungsmaterials verwendet wird, das auf einer flachen Oberfläche eines ersten Substrats (31) verteilt ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgendes umfasst: Durchführung einer zweidimensionalen quantitativen Fluoreszenzmessung einer Referenzvorrichtung mittels des Mikroskops, um Messwerte für einen oder mehrere quantitative Parameter zu erhalten, wobei die Referenzvorrichtung folgendes aufweist: a) ein Substrat (43, 53), und b) ein Referenz-Fluoreszenzmaterial, das über die Fläche des Substrats (43, 53) verteilt ist, wobei das Referenz-Fluoreszenzmaterial in vorbestimmter Weise über die Oberfläche verteilt ist und das Referenz-Fluoreszenzmaterial in einer Flüssigkeit in einer vorbestimmten Konzentration gelöst ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, welches weiterhin eine Verarbeitung der Messwerte und vorbestimmter Werte erfasst, um einen quantitativen Parameter über die Funktion des Mikroskops zu bestimmen.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem Referenzvorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher eine obere Oberfläche (43, 53) des Substrats eine Vertiefung (54) aufweist, wobei die Vertiefung (54) eine konstante Tiefe hat und sich über einen erheblichen Teil der oberen Oberfläche erstreckt und wobei die Vertiefung (54) außerdem eine innere Oberfläche an einem Boden der Vertiefung (54) hat, wobei die Referenzvorrichtung außerdem aufweist eine Deckplatte (42, 52), welche optisch transparent ist und die Vertiefung des Substrats abdeckt, wobei die Deckplatte außerdem eine untere äußere Oberfläche aufweist und so angeordnet ist, dass zwischen der unteren äußeren Oberfläche der Deckplatte und der inneren Oberfläche der Vertiefung ein Raum vorhanden ist, der auf der gesamten Fläche der Vertiefung (54) eine konstante Tiefe hat; eine oder mehrere Zonen in dem Raum, die vollständig mit dem Referenz-Fluoreszenzmaterial gefüllt sind, wobei sich dieses über die gesamte Tiefe jeder Zone erstreckt.
  9. Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem die zweidimensionale quantitative Fluoreszenzmessung dazu geeignet ist, in Verbindung mit einem DNA-Bindungsarray verwendet zu werden.
  10. System zur Evaluierung der Funktion eines konfokalen Laserscanmikroskops, gekennzeichnet durch folgende Komponenten: ein konfokales Laserscanmikroskop und eine Referenzvorrichtung nach Anspruch 1
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