DE60123583T2

DE60123583T2 - Dehydratisierungs-/rehydratisierungsverfahren zur herstellung von liposome

Info

Publication number: DE60123583T2
Application number: DE60123583T
Authority: DE
Inventors: Brahim Lipoxen Technologies Limited 2 Royal College Street ZADI
Original assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Current assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Priority date: 2000-02-04
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2021-02-01
Also published as: AU2869901A; JP4786105B2; ATE341310T1; ES2272496T3; US7025988B2; JP2003521508A; US20030138481A1; DE60123583D1; WO2001056548A2; EP1259225B1; WO2001056548A3; EP1259225A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bildung von Liposomen. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Bildung Liposomen, die aktive Bestandteile enthalten, welche lipophil und von besonderer Nützlichkeit für die Formulierung von Paclitaxel und dessen Analoga und Derivaten sind.
Paclitaxel ist ein Antimikrotubulus-Mittel, das eine vielversprechende klinische Wirkung gegen eine große Vielfalt von Tumoren gezeigt hat, einschließlich Eierstock-, Brust- und Lungentumoren sowie Melanoma und Lymphoma. Es wurden auch Derivate von Paclitaxel mit analogen Eigenschaften beschrieben. Paclitaxel kann aus seiner natürlichen Quelle (Eiben) isoliert oder synthetisch hergestellt werden.
Paclitaxel weist in herkömmlichen wässrigen Vehikeln eine sehr geringe Löslichkeit auf. Das einzige für die klinische Verwendung zugelassene Präparat besteht aus einer Lösung in dem Vehikel Cremophor EL, bei dem es sich um eine 50:50-Mischung von Ethanol und ethoxyliertem Rizinusöl handelt. Die Paclitaxel/Cremophor-Mischung wird verdünnt, bevor sie infundiert wird. Ein Problem ist, dass die verdünnte Mischung instabil ist und das Paclitaxel dazu neigt auszufallen, was die Verwendung eines Filters in der Zufuhrleitung erfordert und einen Verlust an Wirkstoff zur Folge hat. Weiter erzeugt das organische Vehikel toxische Nebenwirkungen, einschließlich einer anaphylaktischen Überempfindlichkeit und Schmerzen an der Injektionsstelle. Tests bei Mäusen zeigen eine niedrige maximale tolerierbare Dosis an.
Es sind verschiedene Wege zur Verbesserung der Dispergierbarkeit von Paclitaxel in wässrigen Vehikeln eingeschlagen worden. Phosphat-Derivate mit verbesserter Löslichkeit sind von Ueda, Y. et al. in Bioorg. Med. Chem. Lett. 3 (1993), 1761-66, und Vyas, D.M. et al. in Biorg. Med. Chem. Lett. 3 (1993), 1357-60, hergestellt worden. Paclitaxel ist von Takahashi, T. et al. in Bioorg. Med. Chem. Lett. 8 (1998), 113-116, sialysiert worden. Es wurde von Sharma, U.S. et al. in J. Pharm. Sci. 84(10) (1995), 1123-30, mit Cyclodextrinen komplexiert.
Andere Prodrugs von Taxol sind von Mathew, A.E. et al. in J. Med. Chem 35(1992) 145-151 und von Deutsch, H. et al. in J. Med. Chem. 32 (1989), 788-792, beschrieben worden.
Paclitaxel ist auch in Liposomen eingekapselt worden. Rahman, A. et al. beschreiben in der US 5,424,073 , US 5,648,090 und (als Cabanes, A. et al.) in Int. J. Onc. 12 (1998), 1035-40, ein Verfahren, in dem Paclitaxel und Liposomenbildende Materialien zusammen in organischem Lösungsmittel gelöst werden, das Lösungsmittel verdampft wird, was einen dünnen trockenen Film von Lipid in Arzneistoff und Liposomen zurückläßt, die durch Zugabe von wässrigem Medium mit Vortexen und anschließender Beschallung unter Bildung von kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs) gebildet werden. Rahman et al. beschreiben weiter die Einverleibung von Trehalose in die Kochsalzlösung, die verwendet wird, um den dünnen Film aus dem Lipid und Arzneistoff zu hydratisieren. Die Liposomensuspensionen wurden dann durch Einfrieren bei –80°C (offensichtlich ohne getrocknet zu werden) aufbewahrt. Die zuckerhaltige eingefrorenen Liposomenmischung wird aufgetaut und wieder eingefroren und erweist sich über mehrere Monate als lagerstabil. Das Massenverhältnis von Zucker:Lipid scheint bei etwa 10-15:1 zu liegen.
Sharma, A. et al. beschreiben in Pharm. Res. 11(6) (1994), 889-896, die Einkapselung von Paclitaxel (Taxol) in Liposomen, die aus Mischungen von Phospholipiden mit einer anionischen Gesamtladung gebildet werden. Die Lipide bestehen aus Mischungen von Phosphatidylcholin und Phosphatidylglycerol in verschiedenen molaren Verhältnissen. Die Liposomen werden durch gleichzeitiges Lösen von Paclitaxel und Lipid in organischem Lösungsmittel unter Bildung eines dünnen Films der Mischung, Wiederauflösen in Butanol gebildet, gefriergetrocknet, dann in wässrigen Rehydratisierungsmedium rehydratisiert. Es wurde angegeben, dass die Einverleibung von negativ geladenem Phospholipid die Aggregation verringert und dass die Liposomen im hydratisierten Zustand für mehr als zweieinhalb Monate stabil waren, vorausgesetzt, dass der Paclitaxel-Gehalt nicht mehr als 2 Mol-% (bezogen auf Gesamt-Lipidgehalt) betrug. Die Autoren geben an, dass das Ausfallen des Arzneistoffs im Schritt des Lösens im organischen Lösungsmittel eine Instabilität verursachte und vermieden werden sollte.
Bernsdorff C. beschreibt in J. Biomed. Mater. Res. 46, 141-149 (1999) verschiedene Untersuchungen der Auswirkung von Paclitaxel auf Liposomen-Doppelschichten. Der Arzneistoff scheint die Fluidität der Doppelschicht zu beeinflussen.
In der US-A-5 683 715 umfassen Liposomen, die ein Taxan umfassen, im Wesentlichen nur Phosphatidylcholin als Lipid. Beispiele für Phosphatidylcholine sind Dioleoyl-, Palmitoyloleoyl- oder Eiphosphatidylcholin. Die Liposomen können in dehydratisierter Form mit schützenden Zuckern auf der Innen- und Außenoberfläche der Doppelschicht bereitgestellt werden. Die allgemeinen Verfahren, die zur Bildung von Liposomen beschrieben werden, geben nicht an, wie das Taxan den Liposomen einzuverleiben ist. In den Arbeitsbeispielen wird Paclitaxel zusammen mit Lipid in Chloroform oder Methylenchlorid gelöst. Zu der Lösungsmischung wird wässriger Puffer gegeben, gefolgt von einer Lösungsmittelentfernung zur Bildung von multilamellaren Vesikeln (MLV). Eine Beschallung, um kleinere Vesikel zu bilden, hatte das Ausfallen von Paclitaxel zur Folge. Keines der Beispiele gefriertrocknet die Liposomen-Zusammensetzungen, und es gibt keine Offenbarung, wie das Kryoschutzmittel einzuverleiben ist.
In der US-A-5 653 998 werden Paclitaxel und andere in Wasser unlösliche Verbindungen zu Liposomen-Zusammensetzungen gebildet, die kurzkettige Fettsäuren als Stabilisatoren gegen ein Ausflocken enthalten. Zucker können als Kryoschutzmittel zugesetzt werden. Die Formulierungen werden durch direktes Dispergieren von Lipid und Taxol in Wasser unter Verwendung von Hochenergie-Mischverfahren, gefolgt von Filtration und Hochdruck-Homogenisierung, gebildet. Nachdem der aktive Wirkstoff ersichtlich eingekapselt worden ist, kann vor dem Gefriertrocknen als Kryoschutz ein Zucker zugesetzt werden. Das Gefriertrocknen ändert die Größe der Liposomen nicht.
In der WO-A-87/01933 wird Amphotericin B, bei dem es sich um einen lipophilen Wirkstoff handelt, zu Liposomen-Zusammensetzungen gebildet. In einem Verfahren werden der aktive Wirkstoff, der Zucker und Lipid alle zusammen in einer Alkohollösung gelöst, die getrocknet, dann in Puffer hydratisiert, dann gefriergetrocknet und rehydratisiert wurde.
In der WO-A-99/65465 sind Verfahren zur Herstellung von Liposomen mittels einer Dehydratisierungs/Rehydratisierungs-Technik beschrieben. Eine Lösung von Lipid in einem organischen Lösungsmittel wird verwendet, um die Innenoberfläche eines geeigneten Gefäßes zu beschichten, und getrocknet, um einen dünnen Film zu bilden. Die Zugabe einer wässrigen Liposomen-bildenden Flüssigkeit hat die Bildung von multilamellaren Liposomen zur Folge, die einem Größensteuerungsschritt unterzogen werden, um kleine unilamellare Vesikel (SUVs) zu bilden. Der aktive Bestandteil kann zusammen mit dem Lipid in organischem Lösungsmittel gelöst werden, kann in der Liposomen-bildenden Flüssigkeit vorliegen oder kann mit vorgeformten SUVs gemischt werden. Die den aktiven Bestandteil enthaltende Liposomensuspension wird anschließend durch Sprühtrocknen oder gewöhnlicher durch Gefriertrocknen (Lyophilisierung) dehydratisiert. Die getrocknete Mischung wird anschließend in einem wässrigen Rehydratisierungsmedium rehydratisiert, um die Deydratisierungs/Rehydratisierungs-Vesikel (DRVs) zu bilden. Die Erfindung in der WO-A-99/65465 besteht darin, vor dem Dehydratisierungsschritt Zucker in die Liposomensuspension einzuführen, um dem Grad des Einfangens von hydrophilen aktiven Bestandteilen zu erhöhen.
Merisko-Liversidge, E. et al. beschreiben in Pharm. Res 13(2) (1996), 272-278, alternative Mittel zum Suspendieren von lipophilen Arzneistoffen in wässrigen Suspensionsmedien. Beispiele für lipophile Arzneistoffe sind Paclitaxel, Camptothecin, Etoposid und Piposulfan. Die aktiven Bestandteile werden nass in wässriger Suspension gemahlen, welche einen Stabilisator enthält, bei dem es sich um ein nichtionisches Tensid handelt. Die End-Teilchengröße betrug weniger als 400 nm.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Liposomen-bildendes Verfahren bereitgestellt, welches die Schritte umfaßt:
Mischen einer wässrigen Suspension von vorgebildeten leeren Liposomen, die aus Liposomen-bildenden Verbindungen gebildet sind, mit lipophilem aktivem Bestandteil in teilchenförmiger Form;
Dehydratisieren einer wässrigen Suspension, die leere Liposomen, teilchenförmigen Wirkstoff und gelösten Zucker enthält; und
Rehydratisieren des dehydratisierten Produkts in einem wässrigen Rehydratisierungsmedium, um Dehydratisierungs/Rehydratisierungs-Vesikel (DRVs) zu bilden.
Das dehydratisierte Produkt wird vor der Verwendung entweder als Teil eines Herstellungsschrittes oder als Teil einer Formulierung durch medizinisches Personal rehydratisiert.
Das dehydratisierte Produkt wird in einem wässrigen Rehydratisierungsmedium unter Bildung von Dehydratisierungs/Rehydratisierungs-Vesikeln (DRVs) rehydratisiert. Das Rehydratisierungsmedium umfaßt im Allgemeinen ein pharmazeutisch annehmbares wässriges Medium, zum Beispiel Wasser.
Nach dem Rehydratisierungsschritt können die DRVs einem oder mehreren Schritten zur Größensteuerung unterzogen werden. Die DRVs im Rehydratisieungsmedium können einem physikalischen Mischen, einer Beschallung oder Homogenisierung unterzogen werden. Jedoch besteht ein Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, dass die Einverleibung von Zucker im Dehydratisierungsschritt die Bildung von DRVs zum Ergebnis hat, welche Größen aufweisen, die sie für die Verabreichung als Pharmazeutikum ohne weitere Größensteuerungsschritte geeignet machen. Bevorzugt weist das Endprodukt entweder des Rehydratisierungsschrittes oder der anschließenden Schritte zur Größensteuerung einen mittleren Durchmesser von weniger als 1000 nm auf, am bevorzugtesten weisen im Wesentlichen alle Vesikel Größen von weniger als 1500 nm auf. Bevorzugter beträgt der mittlere Durchmesser weniger als 500 nm.
In der vorliegenden Erfindung beträgt das Gewichtsverhältnis von Zucker zu Liposomen-bildenden Verbindungen in dem Dehydratisierungssschritt bevorzugt (mindestens 2):1. Bevorzugt beträgt das Verhältnis (mindestens 5):1. Das Verhältnis kann (20 oder mehr):1 betragen, beträgt aber bevorzugt (weniger als 20):1. Diese Verhältnisse von Zucker zu den gesamten Liposomen-bildenden Verbindungen sind bezüglich Gewicht.
In der vorliegenden Erfindung sollte das Verhältnis von Liposomen-bildenden Verbindungen:Wirkstoff so niedrig wie möglich sein. Die Erfindung ermöglicht, dass Verhältnisse von (weniger als 10):1 erzielt werden. Bevorzugt beträgt das Verhältnis 7,5:(mindestens 1).
In der vorliegenden Erfindung sind die Liposomen in der wässrigen Suspension (vor der Dehydratisierung) im Wesentlichen leer, ohne aktive Verbindungen. Sie können Puffer oder andere flüssige Hilfsstoffe enthalten. Die Liposomen werden so aus Liposomen-bildenden Verbindungen und wässrigem Medium in Abwesenheit von aktivem Bestandteil in einem vorangehenden Schritt gebildet oder werden als solche aus einer kommerziellen Quelle erhalten. Die Liposomen sollten bevorzugt kleine unilamellare Vesikel (SUVs) beispielsweise mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 500 nm, bevorzugt weniger als 200 nm, zum Beispiel im Bereich von 50-100 nm sein. Geeignete Liposomen sind im Handel erhältlich oder können in einem vorangehenden Liposomen-bildenden Schritt unter Verwendung herkömmlicher Techniken hergestellt werden.
Wenn leere Liposomen in dem Verfahren verwendet werden, können sie mit aktivem Bestandteil in geeigneter Form gemischt werden und gegebenenfalls durch Vortexen oder Homogenisieren gemischt werden. Da der aktive Bestandteil lipophil ist, ist es unwahrscheinlich, dass er bei den Konzentrationsniveaus, welche für ausreichende Konzentrationen erforderlich sind, die im getrockneten Produkt benötigt werden, in der wässrigen Suspension löslich ist. Geeignete Weisen zum Dispergieren des aktiven Bestandteils in der wässrigen Suspension können sein, wie es von Merisko-Liversidge et al., (a.a.O.) beschrieben ist.
Als Alternative zum nassen Mahlverfahren, das von Merisko-Liversidge beschrieben wird, können die aktiven Bestandteile einer vorangehenden Fällung oder einem kolloidbildenden Schritt unterzogen werden, indem sie in einem organischen Lösungsmittel gelöst und durch Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels für die Verbindung, gewöhnlich Wasser, wieder ausgefällt oder zu einem Kolloid gebildet werden. Der Niederschlag kann dann gesammelt und in der wässrigen Liposomensuspension oder einer wässrigen Vorstufen-Flüssigkeit resuspendiert werden, welche zu den verbleibenden Komponenten zur Bildung der wässrigen Liposomensuspension gegeben wird. Es kann erforderlich sein, dass die Dispersion mit dem aktiven Bestandteil und/oder die wässrige Liposomensuspension während des ganzen Verfahrens gerührt werden müssen, um die Teilchen des aktiven Bestandteil ausreichend dispergiert zu halten. Eine kolloidale Suspension kann direkt mit der Suspension von leeren Liposomen gemischt werden.
Ein vorangehender Schritt zur Bildung eines geeigneten Niederschlags oder Kolloids aus aktivem Bestandteil beinhaltet das Lösen des Bestandteil in einem Alkohol oder einem Ether. Bevorzugt sollte der Alkohol oder Ether ausreichend flüchtig sein, damit er durch Verdampfen von dem Niederschlag entfernt werden kann, bevor dieser der wässrigen Liposomensuspension einverleibt wird. Alternativ können der Festkörper und die Flüssigkeit durch Zentrifugation mit Entfernung des Überstands aufgetrennt werden, gefolgt von einem Resuspendieren in Wasser. In einigen Fällen kann jedoch das ganze Lösungsmittel oder ein Teil davon mit dem Niederschlag an aktivem Bestandteil verbleiben, wodurch es in der Liposom-Suspension und gegebenenfalls auch in dem dehydratisierten Produkt verbleibt. Der Niederschlag sollte einen Volumenmittel des Durchmessers, gemessen mit Hilfe eines Malvern Mastersizers, von etwa 1 μm bis 100 μm, bevorzugt etwa 20-50 μm, aufweisen.
Wenn das organische Lösungsmittel, das verwendet wird, um den aktiven Bestandteil vor Bildung des Niederschlags oder Kolloids zu lösen, mit Wasser mischbar ist, kann es unnötig sein, den Niederschlag als trockenes Material zu gewinnen, bevor er mit der Liposomensuspension gemischt wird. In diesem Fall kann das organische Lösungsmittel in der Liposomensuspension und/oder in dem dehydratisierten Produkt verbleiben, wenn das organische Lösungsmittel nichtflüchtig ist. Die Anwesenheit von rückständigem organischem Lösungsmittel kann die Einverleibung des lipophilen Bestandteils in die Produkt-Vesikel unterstützen. Bevorzugt wird das organische Lösungsmittel während der Verarbeitung vollständig entfernt, da es die Eigenschaften der End-Vesikel stören kann. Demgemäß ist die wässrige Suspension, die dehydratisiert wird, vorzugsweise im Wesentlichen frei von organischem Lösungsmittel.
Es wird bevorzugt, einen vorangehenden Schritt der Fällung des aktiven Bestandteils durchzuführen, indem der aktive Bestandteil in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst und dann aus diesem durch Zugabe eines Fällungsmittels ausgefällt wird. Der Niederschlag wird bevorzugt durch Zentrifugation oder Filtration von der Flüssigkeit abgetrennt. Der Überstand oder das Filtrat wird vorzugsweise verworfen, und der Festkörper wird in einem Nicht-Lösungsmittel resuspendiert.
Geeignete organische Lösungsmittel zum Lösen des lipophilen aktiven Bestandteils sind Alkohole, wie Ethanol, oder Ether oder Glycolether, wie Polyethylenglycole mit niedrigem Molekulargewicht. Der Fällungsmittel und das Resuspensionsmedium sind gewöhnlich wässrig, bevorzugt bestehen sie nur aus Wasser.
Der im Dehydratisierungsschritt verwendete Zucker kann ein Mono- oder Disaccharid sein. Bevorzugt ist er ein Disaccharid, zum Beispiel Trehalose oder am meisten bevorzugt Saccharose. Der Zucker sollte in der wässrigen Suspension vollständig gelöst sein. Dies wird im Allgemeinen erzielt, indem man eine Vorstufenlösung des Zuckers in Wasser bildet, obwohl wir gefunden haben, dass einige Zucker in Wasser ausreichend löslich sind, so dass sie als teilchenförmiger Festkörper direkt in die Liposomensuspension gegeben werden können.
In der vorliegenden Erfindung können die Liposomen-bildenden Verbindungen eine Gesamtladung tragen, die positiv oder bevorzugt negativ sein kann. Die Verwendung derartiger Verbindung kann für eine verbesserte Stabilität von Dehydratisierungs/Rehydratisierungs-Vesikeln in wässriger Suspension sorgen. Anionische Lipide sind bekannt und umfassen Phosphatidylserin und Phosphatidylglycerol. Es wird bevorzugt, dass die Liposomen-bildenden Verbindungen keine Gesamtladung tragen und dass jede Verbindung keine Gesamtladung trägt. Bevorzugt umfassen die Liposomen-bildenden Verbindungen zwitterionische Lipide, gewöhnlich zwitterionische Phospholipide, wie Phosphatidylethanolamin oder am meisten bevorzugt Phosphatidylcholin. Die Lipide umfassen im Allgemeinen Difettsäureacyl-Derivate (d.h. Ester), können aber alternativ Ether-Analoga einschließen. Die Fettacylgruppen werden gemäß der gewünschten Fluidität ausgewählt, indem man geeignete Kettenlängen und eine geeignete Anwesenheit, Position und Konformation der ethylenisch ungesättigten Bindungen in der Kette auswählt. Die Liposomen-bildenden Verbindungen können weiter Cholesterol umfassen, was die Stabilität der Liposomen in Anwesenheit von Plasma verbessern kann.
Die vorliegende Erfindung ist für die Einkapselung eines Bereichs von lipophilen Arzneistoffen geeignet, wie jenen, die von Meristo-Liversidge et al., a.a.O., untersucht worden sind. Sie ist von besonderem Wert für die Einkapselung von Paclitaxel und dessen Derivaten oder Analoga (Taxanen), die, wie oben erwähnt, spezielle Probleme aufweisen, von denen sich erwiesen hat, dass sie schwer zu überwinden sind. Andere lipophile Arzneistoffe, von denen man annimmt, dass sie in der Erfindung nützlich eingekapselt werden können, umfassen Steroide, Arzneistoffe auf Platin-Basis und nicht-steroidale entzündungshemmende Arzneistoffe.
Die vorliegende Erfindung wird in den begleitenden Beispielen erläutert:
Materialien

PC – hydriertes Soja-Phosphatidylcholin ist von Lipoid erhalten.
CHOL – Cholesterol ist von Sigma erhalten.
DMPG – Dimyristyoylphosphatidylglycerol ist von Lipoid erhalten.
DSPG – Distearoylphosphatidylglycerol ist von Lipoid erhalten.
DSPC – Distearoylphosphatidylcholin ist von Lipoid erhalten.
DSPE-PEG – PEGyliertes Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG MG = 2000) war ein Geschenk von Sequus.
EiPC – Ei-Phosphatidylcholin ist von Lipid Products erhalten.
Paclitaxel ist der Arzneistoff, der in allen Experimenten verwendet wird. Das ³H-markierte Paclitaxel ist von Moravek Biochemicals erhalten.
¹⁴C-markiertes DOPE (Dioleoylphosphatidylcholin) ist von Amersham International erhalten.

Verfahren
SUV-Bildung
Die Liposomen-bildenden Verbindungen werden in den gewünschten Verhältnissen (wie in den nachstehenden Tabellen angegeben) zusammen in Chloroform gelöst, zur Bildung eines dünnen Films auf der Innenfläche eines Kolbens verwendet und getrocknet, dann wird Wasser (als Liposomen-bildendes wässriges Medium) unter Vortexen dazugegeben, um multilamellar Vesikel (MLVs) zu bilden. Die MLV-Suspension wird beschallt und Metallteilchen werden durch Zentrifugation entfernt. Die SUVs weisen einen mittleren Durchmesser im Bereich von 60-80 nm auf.
Dehydratisierungs- und Rehydratisierungs-Schritte
Das Verfahren beruht auf der Methode, die von Kirby, C. und Gregoriadis, G. in Biotechnology 2 (1984), 979-984, beschrieben wird. 2 ml SUV werden mit Zucker in fester Form gemischt, und dann wird aktiver Bestandteil (in den in den nachstehenden speziellen Beispielen offenbarten Verhältnissen) unter Vortexen dazugegeben, wie erforderlich, um zu vermeiden, dass irgendwelche Komponenten aus der Suspension ausfallen. Die Suspension wird anschließend 2-3 Stunden lang auf eine Temperatur von etwa –35°C abgekühlt. Anschließend wird das gefrorene Produkt über Nacht bei Hochvakuum dehydratisiert.
Der lyophilisierte Kuchen wird in 100-300 μl Wasser (als Rehydratisierungsflüssigkeit) rehydratisiert, um DRVs zu bilden. Proben wurden entnommen, und die Größe der Vesikel wurde durch Photonen-Korrelationsspektroskopie unter Verwendung eines Zeta-Größenmeßgerätes bestimmt, weiter wurden visuelle Beobachtungen der DRV-Suspension bezüglich Anzeichen von Instabilität durch Ausflocken oder andere Probleme vorgenommen. Weiter wird der Einschlusswert des Paclitaxels durch Messen von ³H im Pellet und Überstand nach Zentrifugation bestimmt.
Beispiel 1 – Optimieren der Zuckerkonzentration für ein hohes Lipid: Paclitaxel-Verhältnis
In diesem Beispiel wird eine Lösung von Paclitaxel in Ethanol mit einer Konzentration von 20 mg/ml hergestellt. Eine Menge der ethanolischen Paclitaxel-Lösung wird zu SUVs gegeben, die aus der in Tabelle 1 angegebenen Liposomen-bildenden Verbindung gebildet sind, so dass 1-4 ml Suspension (abhängig von der Menge an Lipid) gebildet werden, welche 2 mg Paclitaxel und 78 mg Gesamtlipid enthält, um 4-5 ml Suspension zu bilden. Die Lipidverhältnisse sind molar. Eine Aliquote von fester Saccharose wird unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens (d.h. vor dem Arzneistoff) ebenfalls dazugegeben, um eine Liposomensuspension mit dem in Tabelle 1 angegebenen Saccharose: Lipid-Verhältnis zu bilden.
Die Lipidsuspension wurde die durch oben beschriebene allgemeine Technik einer Lyophilisierung und Rehydratisierung unterzogen. Die DRVs wurden analysiert, um ihre mittlere Größe und Einschlusswerte zu bestimmen.
Man fand, dass die Einschlusswerte 98 bis 99% betrugen. Die Tests wurden als Duplikat durchgeführt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Beispiel 2 – Variieren der Lipidmenge
In diesem Beispiel blieben die Gesamtmenge an Paclitaxel und an Saccharose die gleichen. Die Menge an Lipid wird variiert, aber ansonsten ist das Experiment so, wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Es wurde wieder gefunden, dass die Einschlussmengen im Bereich von 98 bis 99% lagen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Die Ergebnisse der Beispiele 1 und 2 zeigen an, dass das Verhältnis von Saccharose zu Lipid optimiert werden sollte, ebenso wie das Verhältnis von Lipid zu Paclitaxel. Die Anwesenheit von Ethanol und/oder von Paclitaxel in der Dehydratisierungsstufe scheint die letztendliche Größe der DRVs zu erhöhen, wenn das Verhältnis Lipid:Arzneistoff zu gering ist. Die Anwesenheit von Saccharose scheint die Größe nicht in großem Ausmaß zu verbessern, obwohl die Stabilität der DRVs verbessert wird, wenn das Lipid:Arzneistoff-Verhältnis (mehr als 5):1 beträgt.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wird das Gewichtsverhältnis Zucker:Lipid auf 10 erhöht, während die Lipid-Komponenten variiert werden. In jedem Fall beträgt der Gesamtlipid-Gehalt zwischen 38 und 40 mg, während die Paclitaxel-Menge wie in den Beispielen 1 und 2 bleibt, nämlich 2 mg. Die Einschlusswerte bei allen Beispielen liegen im Bereich von 98 bis 99%. Andere Einzelheiten sind wie in Beispiel 1. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen an, dass Cholesterol die Stabilität der DRVs verbessert.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wird die Bedeutung der Einverleibung von anionischem Lipid untersucht, indem die Menge an PG weggelassen oder verringert wird oder das PEGylierte Lipid ersetzt wird. In allen Beispielen liegt die Lipidmenge zwischen 38 und 40 mg, während Paclitaxel bei 2 mg verbleibt. Man folgt dem gleichen allgemeinen Verfahren, wie es in Beispiel 1 verwendet wird. Die Einschlusswerte lagen alle im Bereich von 98 bis 99%. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
Tabelle 4 zeigt an, dass bei Liposomen, die durch das in Beispiel 1 offenbarte allgemeine Verfahren hergestellt sind, die Einverleibung von anionischem Lipid etwas Stabilität gegen ein Ausflocken im Produkt zu verleihen scheint. Die Verringerung der Menge an anionischem Lipid hinunter auf 0,01 Molteile, bezogen auf einen Teil von jeweils PC und Cholesterol, hat immer noch Liposomen mit einer ausreichenden Stabilität gegen ein Ausflocken zum Ergebnis. Die Entfernung des anionischen Lipids führt zu einer instabilen Suspension, aus der die Liposomen ausflocken. Der Ersatz des anionischen Lipids durch PEGyliertes Lipid in relativ hohen Mengen (Beispiel 4.6), von dem man erwarten könnte, dass er eine Beständigkeit gegen ein Ausflocken verleiht, verleiht etwas Stabilität. Jedoch ist bei der geringeren Menge von Beispiel 4.3 die Suspension instabil.
Beispiel 5 – Verwendung von PEG300 als Vehikel für Arzneistoff
In diesem Beispiel wird Paclitaxel anstelle von Lösen in Alkohol vielmehr in einer wässrigen Lösung gelöst, die 75% PEG mit einem Molekulargewicht von 300 in 25% Wasser umfasst. Zwei Reihen von Experimenten wurden durchgeführt, eine unter Verwendung von 100 μl der 75%-igen PEG-Lösung und die andere unter Verwendung von 100 μl der Paclitaxel-Lösung in der 75%-igen PEG-Lösung, wobei sie in jedem Fall auf die gleiche Weise zu den SUVs gegeben wurden, wie die ethanolische Paclitaxel-Lösung in Beispiel 1 zu den SUVs gegeben wird. So enthält die End-Suspension 2 mg Paclitaxel und 75 bis 80 mg Gesamtlipid. Die verbleibenden Einzelheiten sind wie in der allgemeinen Technik.
In jedem Fall betrugen die Einschlusswerte von Paclitaxel etwa 98%. Die verwendeten Lipid-Mischungen, die Menge an Saccharose und die Größen der produzierten DRVs sind in der nachstehenden Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
Die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen klar die Wirkung des Einschlusses von Saccharose bei neutralen und bei anionischen Lipiden mit und ohne in PEG vorgelöstem Arzneistoff auf Liposomen. Dies ist die gleiche allgemeine Wirkung, wie sie oben für Verfahren erläutert wurde, in denen der Arzneistoff in Ethanol gelöst wird.
Die Ergebnisse zeigen auch, dass die Erhöhung der Saccharose-Menge eine Verringerung der DRV-Größe zum Ergebnis hat, wiederum mit und ohne Arzneistoff. Die Anwesenheit von Arzneistoff scheint größere DRVs zur Folge zu haben.
Beispiel 6
In diesem Beispiel wird ein Verfahren verwendet, das dem in Beispiel 5 verwendeten ähnlich ist. Das heißt, der Arzneistoff wird in einer 75 gewichtsprozentigen wässrigen PEG-Lösung vorgelöst. In diesem Experiment wurde kein Vergleich mit PEG, aber ohne Arzneistoff, durchgeführt. In jedem Experiment betrug die verwendete Gesamtmenge an Arzneistoff 2 mg pro Experiment, während die Menge an Lipid im Bereich von 38 bis 40 mg lag (im Vergleich zu 75 bis 80, die in Beispiel 5 verwendet wurde). Die Lipid-Mischung ist die gleiche, wie sie in den Beispielen 5.1 bis 5.4 verwendet wurde. In jedem Fall betrug der Einschlussgrad von Paclitaxel etwa 98 bis 99%.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
Die Ergebnisse zeigen, dass bei diesem System die Erhöhung der Saccharose-Menge für eine weitere Verringerung der DRV-Größe sorgt.
Beispiel 7 – In-vivo-Versuche
Liposomen, die gemäß der allgemeinen Technik und Beispiel 1 hergestellt wurden und Saccharose in einer Menge vom 7-fachen Gewicht des Gewichts des Lipids einschlossen, wurden unter Verwendung der Lipidmischungen und -verhältnisse und der Lipidgewicht:Arzneistoffgewicht-Verhältnisse hergestellt, die in der nachstehenden Tabelle 7 angegeben sind (gleiche Zusammensetzungen wie in Tabelle 1). Um einen radioaktiven Tracer im Paclitaxel und Lipid bereitzustellen, wurden eine Spur von ³H-markiertem Paclitaxel bzw. ¹⁴C-markiertem Dioleoylphosphatidylethanolamin verwendet. 1 ml DRVs wurden i.v. Ratten injiziert (2 mg Paclitaxel und 20, 40 bzw. 78 mg Lipid). Blutproben wurden den Tieren nach 2 Minuten, 10 Minuten, 60 bis 80 Minuten und 120 Minuten entnommen, und die Menge der ³H- und ¹⁴C-Markierung wurde nachgewiesen. Der Gesamtprozentsatz der Lipidmarkierung und der Paclitaxel-Markierung im Plasma bei den jeweiligen Zeitintervallen wurde berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Als Vergleich wird ein im Handel erhältliches Paclitaxel in Cremophor-Zusammensetzung bei der gleichen Dosishöhe verwendet. (Das im Handel erhältliche Paclitaxel weist eine Spur von zugesetzter ³H-Markierung auf).
Die Tiere wurden nach 2½ Stunden geopfert, und die Menge jeder Markierung in den Nieren (N), in der Leber (L) und in der Milz (M) wurde bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8
Die Ergebnisse in Tabelle 7 scheinen zu zeigen, dass es über die Zeitspanne des Experiments eine Dissoziation zwischen dem Lipid und dem Paclitaxel im Plasma gibt. Dies ist wahrscheinlich vorteilhaft, da es anzeigt, dass Paclitaxel nach der Verabreichung freigesetzt werden kann. Die Werte in Tabelle 8 zeigen, dass die Gewebeverteilung des liposomalen Paclitaxels die Leber und die Milz begünstigt, verglichen mit der Formulierung des Standes der Technik.
Beispiel 8
Liposomen, die wie in Beispiel 7 hergestellt waren, waren wie in Tabelle 9 gezeigt zusammengesetzt. Die Lipid-Arzneistoff-Massenverhältnisse betrugen 20:1. Um einen radioaktiven Tracer in Paclitaxel und Lipid bereitzustellen, wurden Spuren von ³H-markiertem Paclitaxel und ¹⁴C-markiertem Dioleoylphosphatidylcholin verwendet. Die Liposomen wurden Mäusen intravenös injiziert (0,33 mg Paclitaxel und 8 mg Lipid bei jeder Formulierung). Blutproben wurden nach 5, 30, 60 und 180 Minuten entnommen, wonach die Tiere getötet wurden. Die Radioaktivitäten von Paclitaxel (³H) und Lipid (¹⁴C) wurden in Blutplasmaproben, Leber, Milz und Nieren gemessen, und der Prozentsatz der Paclitaxel- und Lipid-Radiomarkierung im Gesamtplasma und in den Geweben wurde bei den jeweiligen Zeitintervallen berechnet. Als Vergleich wurde eine Zusammensetzung aus im Handel erhältlicher Paclitaxel- (gemischt mit Spuren von ³H-markiertem Arzneistoff) und Cremophor-Zusammensetzung in der gleichen Dosismenge verwendet.
Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 und in Tabelle 9 gezeigt. Die 1 und 2 demonstrieren, dass die Clearance von liposomalem Paclitaxel (1) aus dem Plasma schneller ist als jene von Liposomen (2), wobei dies impliziert, dass es über die Zeitspanne des Experiments eine Dissoziation zwischen den Paclitaxel und den Liposomen im Plasma gibt. 1 zeigt auch, dass die anfängliche Clearance (nach 5 min) von Paclitaxel in Cremophor rascher ist als jene von Paclitaxel in irgendeiner der gezeigten Liposomen-Formulierungen. Viel des Paclitaxels, das mit Liposomen verabreicht wird, wird schließlich in der Leber (L) und der Milz (M) gefunden, wohingegen geringere Mengen von Paclitaxel in Cremophor diese Gewebe erreichen (Tabelle 9). Die Ergebnisse zeigen, dass Liposomen die Pharmakokinetik des Arzneistoffs ändern können. Tabelle 9
Beispiel 9
In diesem Experiment wird anstelle des Lösens von Paclitaxel in Alkohol und der direkten Verwendung der Lösung zur Zugabe zu SUVs ein vorangehender Paclitaxel-Fällungsschritt durchgeführt. Paclitaxel wurde in absolutem Ethanol mit einer Konzentration von 20 mg/ml gelöst. 600 μl dieser Vorratslösung (12 mg Paclitaxel) wurden zu 8 ml destilliertem Wasser gegeben. Dies hatte eine Fällung von Paclitaxel zum Ergebnis, die dadurch durch Trübung der Lösung festgestellt wurde. Der Paclitaxel-Niederschlag wurde durch Zentrifugation aus der Suspension gewonnen. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde in 3 ml destilliertem Wasser resuspendiert.
500 μl des redispergierten Paclitaxels (die 2 mg Paclitaxel enthielten) wurden zu einer Suspension von SUVs gegeben, gefolgt von der Zugabe von Saccharose, Dehydratisieren und Rehydratisieren gemäß dem Rest der oben beschriebenen allgemeinen Technik. In diesem Experiment betrug die Lipid-Gesamtmenge in jedem Fall 37 bis 40 mg, während das Verhältnis von Saccharose zu Lipid zusammen mit den Lipidverhältnissen in der nachstehenden Tabelle 10 gezeigt ist. Tabelle 10
Die Ergebnisse zeigen, dass bei gefälltem Paclitaxel die DRV-Größe bei neutralen Lipid-Zusammensetzungen (9.1 und 9.2) geringer ist. Beispiel 9.3 unter Verwendung von anionischem Lipid erzeugt ebenfalls DRVs mit wünschenswerter geringer Größe. Ein direkter Vergleich mit den neutralen Lipid-Mischungen, die frei von PEG sind, ist jedoch im Hinblick auf den Unterschied der Saccharose-Menge nicht möglich. Die Ergebnisse von Beispiel 9.4 zeigen, dass bei Lipidmischungen mit einem bedeutenden Gehalt an ungesättigten Acylgruppen die Produkt-DRVs eine brauchbare Größe aufweisen.
Beispiel 10
Man folgt der in Beispiel 9 angegebenen allgemeinen Technik für die Fällung von Taxol vor dem Mischen mit SUVs, außer dass anstelle der Verwendung von Ethanol eine 75 volumenprozentige PEG/Wasser-Mischung verwendet wurde, um das Taxol zu lösen (unter Verwendung der gleichen Konzentration von 20 mg/ml). Weiter wurden 4 ml Wasser verwendet, um 100 μl Lösung zu fällen. Nachdem die Suspension eine Stunde stehengelassen worden war, wurde eine Zentrifugation durchgeführt, um das ausgefallene Paclitaxel abzutrennen. Der Überstand wird entfernt. Das Pellet wird bezüglich seines Taxol-Gehalts überprüft, und man fand, dass er etwa 99% des ursprünglich zugesetzten Taxols betrug. Das Pellet wird in Wasser redispergiert und die Suspension wird wie in der allgemeinen Technik mit SUVs und fester Saccharose gemischt, gefriergetrocknet und rehydratisiert. In jedem Experiment ist die Lipidmenge, die für eine 2 mg-Probe von Paclitaxel verwendet wird, etwa 38 mg. Die Lipidmischungen und das Saccharose:Lipid-Verhältnis sind in der nachstehenden Tabelle 11 gezeigt.
In diesem Beispiel wurde die Größenverteilung von zwei Wiederholungen bestimmt, wobei die Standardabweichung der Größe bei jeder Probe bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle gezeigt. Tabelle 11
Die in Tabelle 11 veranschaulichten Ergebnisse zeigen, dass die PEG-Fällung mit der Gewinnung des Paclitaxels aus dem Fällungsmittel wiederum wünschenswerte Ergebnisse mit Bezug auf die DRV-Größe liefert. Gute Ergebnisse werden sowohl bei neutralen Lipidmischungen als auch bei Lipidmischungen mit anionischer Gesamtladung erzielt.
Beispiel 11
SUVs, die aus äquimolarem Sojabohnen-Phosphatidylcholin und Cholesterol gebildet waren, wurden unter Verwendung der oben beschriebenen allgemeinen Technik hergestellt. Um zu bestätigen, dass Liposomen gebildet wurden, wurde zwei Sätze von Experimenten durchgeführt. Im ersten wurden SUVs mit Carboxyfluorescein gemischt, dehydratisiert und rehydratisiert, wobei man die oben beschriebene allgemeine Technik einschließlich Zucker in der SUV-Zusammensetzung verwendete. Parallel dazu wurden SUVs mit Zucker in der SUV-Zusammensetzung mit Carboxyfluorescein (CF) und Paclitaxel gemischt und dehydratisiert und rehydratisiert, wie es oben beschrieben wurde. Das Paclitaxel lag in der im Beispiel 9 verwendeten Form vor. Der Prozentsatz an eingekapseltem CF und das Z-Mittel des Durchmessers wurden bestimmt.
Wenn CF allein eingekapselt wurde, betrug das Einkapselungsverhältnis etwa 12%. Das Z-Mittel des Durchmessers betrug etwa 100 nm. Bei gleichzeitiger Einkapselung von CF und Paclitaxel betrug das Einkapselungsverhältnis von CF etwa 17%, während das Z-Mittel des Durchmessers etwa 171 nm betrug. Das Verhalten des Carboxyfluoresceins in dem beide einschließenden Produkt war ähnlich jenem, in dem CF allein eingeschlossen war. Da es wohlbekannt ist, dass CF unter Verwendung dieser Technik in SUVs eingeschlossen wird, ist es vernünftig anzunehmen, dass das Produkt des Verfahrens der Erfindung kleine Vesikel erzeugt, die Paclitaxel enthalten.
In einem getrennten Test wurden die SUVs, die aus äquimolarem Sojabohnen-PC und Cholesterol gebildet waren, unter Verwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens mit einem gefällten Paclitaxel gemischt, dehydratisiert und rehydratisiert. Die Liposomen wurden gewonnen und unter einem Transmissionselektronenmikroskop betrachtet. Die Anwesenheit von Lipid-Doppelschichten in den DRVs konnte klar beobachtet werden.

Claims

Liposomen-bildendes Verfahren, umfassend die Schritte: Mischen einer wässrigen Suspension von vorgeformten leeren Liposomen, die aus Liposomen-bildenden Verbindungen gebildet sind, mit einem lipophilen aktiven Bestandteil in teilchenförmiger Form; Dehydratisieren einer wässrigen Suspension, die leere Liposomen, teilchenförmiges aktives Material und gelösten Zucker enthält und Rehydratisieren des dehydratisierten Produkts in einem wässrigen Rehydratisierungsmedium, um Dehydratisierungs/Rehydratisierungsvesikel (DRVs) zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Rehydratisierungsmedium aus Wasser besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem der aktive Bestandteil in einem vorläufigen Suspensions-bildenden Schritt zu einer kolloidalen Suspension gebildet wird, bevor er mit den leeren Liposomen gemischt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die vorläufigen Suspensions-bildenden Schritte des Lösens des aktiven Bestandteils in einem Lösungsmittel zur Bildung einer Lösung, des Zugebens eines Fällungsmittels zu dieser Lösung, welches den aktiven Bestandteil ausfällt, des Gewinnens des Niederschlags aus dem Überstand, des Resuspendierens des Niederschlags in einem Nicht-Lösungsmittel und des Mischens der Suspension des resuspendierten Niederschlags mit den leeren Liposomen.
Verfahren nach Anspruch 4, in dem das Lösungsmittel ein Alkohol, ein Ether oder ein Glycolether ist und das Fällungsmittel und das Resuspendierungsvehikel beide Wasser sind.
Verfahren nach Anspruch 5, indem das Lösungsmittel aus Ethanol und Polyethylenglycol mit niedrigem Molekulargewicht ausgewählt ist.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die Dehydratisierung durch Sprühtrocknung oder bevorzugt Gefriertrocknung durchgeführt wird.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem der Zucker ein Mono- oder Disaccharid, bevorzugt Saccharose, ist.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die Liposomen-bildenden Materialien mindestens eine nichtionische oder zwitterionische (keine Gesamtladung) Verbindung umfassen, wobei sie vorzugsweise Cholesterol mit einem Phosphatidylcholin umfassen.
Verfahren nach Anspruch 9, in dem die Liposomen-bildenden Materialien weiter eine anionische Verbindung umfassen.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das Verhältnis Zucker:Lipid im Bereich von (mehr als 5):1 (Gewicht/Gewicht) liegt.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem das Verhältnis Lipid:aktiver Bestandteil (weniger als 10):1, bevorzugt 7,5 (mindestens 1) beträgt.
Verfahren nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die Liposomen in der wässrigen Suspension einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 100 nm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 13, in dem die DRVs eine höhere durchschnittliche Teilchengröße als die durchschnittliche Teilchengröße der Liposomen in der wässrigen Suspension aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 14, in dem die DRVs einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 1000 nm, bevorzugter weniger als 500 nm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem der aktive Bestandteil ein Taxan, bevorzugt Paclitaxel ist.