DE60032632T2

DE60032632T2 - Verfahren zur identifizierung von modulatoren von proteaseaktivierten rezeptoren (par)

Info

Publication number: DE60032632T2
Application number: DE60032632T
Authority: DE
Inventors: Ludger Altrogge; Denis Monard
Original assignee: Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research; Novartis Forschungsstiftung
Current assignee: Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research; Novartis Forschungsstiftung
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2020-12-14
Also published as: WO2001044496A3; ATE349699T1; GB9929674D0; CY1106384T1; EP1238283A2; DK1238283T3; AU3158501A; WO2001044496A2; US20030148921A1; ES2277866T3; EP1238283B1; US7148018B2; PT1238283E; DE60032632D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Tests für Modulatoren von Protease-aktivierten Rezeptoren, die in den Gebieten der Thrombogenese, Neurobiologie, Onkologie, Osteoporose und Darmmotilität brauchbar sind.
Einführung
Der Thrombinrezeptor (Protease-aktivierter Rezeptor 1, PAR1, Nystedt et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9208–9212) ist der prototypische Vertreter einer Familie an G-Protein-gekuppelten Rezeptoren mit 7 Transmembrandomänen, die Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs) genannt werden, die jetzt 4 identifizierte Vertreter sowohl in der Maus als auch beim Menschen umfasst, von denen einige auch in mehreren Vertebraten identifiziert wurden (Nystedt et al. (1994), Nystedt et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 5950–5955, Ishihara et al. (1997) Nature 386, 502–506, Kahn et al. (1998), Nature 394, 690–694, Vu et al. (1991) Cell 64, 1057–1068, Bohm et al. (1996) Biochem. J. 314 (Pt 3), 1009–1016, Xu et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6642–6646, Rasmussen et al. (1991) FEBS Lett 288, 123–128, Zhong et al. (1992), J. Biol. Chem. 267, 16975–16979, Saifeddine et al. (1996) Br. J. Pharmacol. 118, 521–530, Gerszten et al. (1994) Nature 368, 648–651).
Thrombin spaltet humanes PAR1 nach Arg⁴ ¹, was zu einem neuen N-Terminus führt, der intramolekular die Aktivierung des Rezeptors auslöst (Vu et al., 1991). Ähnlich werden andere Vertreter der PAR Familie durch die Proteasespaltung aktiviert. Die Aktivierung von PAR1 kann auch durch die Anwendung der Thrombinrezeptor-aktivierenden Peptide (TRAPs) erreicht werden, die den durch Thrombinspaltung erzeugten N-Terminus nachahmen (Vu et al. 1991). PARs können so als Peptidrezeptoren betrachtet werden, die ihren eigenen Liganden tragen, der nach der proteolytischen Spaltung unmaskiert ist.
PARs sind bei verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt. Thrombin oder TRAP Behandlung verursacht eine Neuritenrückbildung in kultivierten Neuroblastomzellen (Gurwitz und Cunnigham (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3440–3444, Suidan et al. (1992) Neuron 8, 363–375) und die Rückbildung der sternförmigen Verzweigungen wie auch die Proliferation von Astrocyten (Cavanaugh et al. (1990) J. Neurochem 54, 1735–1743, Grabham und Cunningham (1995), J. Neurochem 64, 583–591, Loret et al., (1989), J. Biol. Chem. 264, 8319–8327, Nelson und Siman (1990), Brain Res. Dev. Brain Res. 54, 93–104, Pindon et al. (1998) Eur. J. Biochem 255, 766–774, Suidan et al. (1997), Glia 21, 244–25, Perraud et al. (1987) Int. J. Dev. Neurosci 5, 181–188). Geringe Mengen an Thrombin erhöhen die Überlebensrate von provozierten Hippokampusneuronen und Astrocyten, aber hohe Dosen der Protease verursachen eine neuronale Apoptose, was eine modulatorische Rolle für PAR1 im programmierten Zelltod nahelegt (Vaughan et al. (1995), J. Neurosci. 15, 5389–5401, Smith-Swintosky et al. (1995), J. Neurosci. 15, 5840–5850). Die Blockierung der PAR1 Aktivierung mit einem Antikörper, der gegen den neu geschaffenen N-Terminus gerichtet ist, wirkt der durch Thrombin induzierten Blutplättchenaktivierung (Hung et al. (1992) J. Cell. Biol. 116, 827–832, Brass et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 13795–13798) wie auch der Neuritenrückbildungsreaktion der Neuroblastomzellen (Suidan et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8112–8116) entgegen. PAR1 wird in humanen Krebszelllinien und Biopsien stark exprimiert, was die Beteiligung im mitogenen und metastasierenden Verhalten von Tumorzellen andeutet (Even-Ram et al. (1998), Nat. Med. 4, 909–914, Kaufmann et al. (1997), Cancer 80, 2068–2074, Kaufmann et al. (1998a) Neuroreport 9, 709–712, Nierodzik et al. (1998) Blood 92, 3694–3700). Während die PAR1 Aktivierung die DNA Synthese in Hep-2g Krebszellen stimuliert (Kaufmann et al., 1997), führt die PAR2 Aktivierung zu einer Verringerung der DNA Synthese in den humanen Pankreastumorzellen MIA PaCa-2 (Kaufmann et al. (1998b) Int. J. Pancreatol. 24, 97–102). PAR1 vermittelt die Aktivierung von humanen Blutplättchen, während die von Mäusen stammenden Blutplättchen durch PAR3 aktiviert werden (Ishihara et al. 1997). Geringe Mengen an PAR4 wurden als zweiter Thrombin-sensitiver Rezeptor in Blutplättchen detektiert (Kahn et al. 1998, Xu et al. 1998).
PAR1 kann durch Thrombin, Trypsin, Plasmin, Granzym A und möglicherweise auch durch aktiviertes Protein C aktiviert werden (Ishihara et al. 1997, Vu et al. 1991, Suidan et al. 1994, Parry et al. (1996) Biochem J. 320, 335–341). Im Gegensatz dazu entfernt die Spaltung von PAR1 durch Cathepsin G, Chymotrypsin, Leukozytenelastase oder Myeloblastin (Proteinase 3) die Thrombinspaltstelle, was eine Rolle für diese Proteasen bei der Inaktivierung des Rezeptors andeutet (Vu et al. 1991, Parry et al. 1996, Molino et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 11168–11175, Renesto et al. (1997) Blood 89, 1944–1953), da die Spaltung an einer alternativen Stelle einen neuen N-Terminus bildet, der bei der Signaltransduktion inaktiv ist. PAR2 unterscheidet sich von anderen bekannten Vertretern der PAR Familie dahingehend, dass es eine Spaltstelle enthält, die gegenüber Serinproteasen empfindlich ist, wie Trypsin, Mastzelltryptase und Acrosin (Nystedt et al (1994), Molino et al. (1997a), J. Biol. Chem. 272, 4043–4049, Fox et al. (1997), FEBS Lett. 417, 267–269). Der physiologische Aktivator von PAR2 in Enterozyten ist höchstwahrscheinlich Trypsin (Kong et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8884–8889), während in anderen Geweben die Aktivatoren von PAR2 großteils unbekannt sind.
Zusammengefasst wurden detaillierte Studien ausgeführt, um Proteasen zu identifizieren, die zur Aktivierung oder Inaktivierung von PAR1 fähig sind (Vu et al. 1991, Pary et al. 1996, Molino et al. 1995, Renesto et al. 1997, Ishii et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 16435–16440), jedoch ist für PAR2 (Nystedt et al. (1994), Molino et al. (1997a), Fox et al. (1997), Molino et al. (1997b), J. Biol. Chem. 272, 11133–11141), PAR3 (Ishihara et al. 1997) oder PAR4 (Kahn et al. 1998, Xu et al. 1998) wenig bekannt.
Die Tests für die PAR Spaltung und Aktivierung basierten früher auf der Analyse von gereinigten Spaltprodukten, die aus der Wirkung von Proteasen auf lösliche Peptidsubstrate resultieren, die auf der PAR Spaltstelle basieren (K. Ishii (1995), J. Biol. Chem. 270: 16435–16440) oder auf der Messung der ⁴⁵Ca²⁺ Freisetzung, die durch eine Proteaseaktivierung der PARs aufgelöst wird, die in Xenopus Oocyten mikroinjiziert werden (Vu et al. 1991). Die WO 98 18 456 A und K. Ishii et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 9780–9786 beschreiben Verfahren zur Untersuchung der Thrombinspaltung von PAR1 oder PAR3 durch die Detektion der M1 Antikörperbindung an mit Epitop versehenes PAR, das auf der Zelloberfläche von COS-7 oder Ratten-1 Zellen exprimiert wird, vor und nach der Thrombinbehandlung. Diese Verfahren sind entweder aufwändig, unsensitiv und für Methoden mit hohem Durchsatz nicht besonders passend. Zusätzlich schließt der Ca²⁺ Signaltest nicht Proteasen aus, die die Ca²⁺ Signalbildung auf eine Weise beeinflussen, die unabhängig von der PAR Aktivierung ist. Tests, die die Identifizierung der PAR-spaltenden Proteasen und die Charakterisierung der Proteasespezifität erlauben sind erforderlich, um weiter die wichtige biologische Rolle der PARs zu ermitteln.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifikation oder Detektion eines PAR Spaltmoleküls bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellung eines immobilisierten PAR Spaltpeptids, das an ein Reportermolekül gebunden ist,
(b) Zusammenbringen des immobilisierten PAR Spaltpeptids mit einem PAR Spaltmolekül, und
(c) Detektion des freigesetzten Reportermoleküls. Das Reportermolekül liefert vorzugsweise ein amplifizierbares Signal, wie dies der Fall ist, wenn das Reportermolekül ein Reporterenzym ist. Das Verfahren ist bei der Identifizierung der Aktivatoren und Inaktivatoren von PAR wie auch von Modulatoren der PAR Aktivierung brauchbar. Die vorliegende Erfindung liefert auch Kits, die ein PAR Fusionsprotein umfassen, worin das PAR Fusionsprotein ein PAR Fusionsprotein mit einem enzymatischen Reporter ist und worin das PAR Fusionsprotein auf einem festen Träger immobilisiert ist zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A: Schematische Zeichnung eines Plasmids zur Produktion eines biotinylierten GPAR1 Fusionsproteins in E. coli. BAD: Biotinakzeptordomäne. BirA: Biotinholoenzymsynthetase. 1B: C-terminales Ende der GPAR Fusionsproteine. Kleine Buchstaben: Linker. Große Buchstaben: Extrazelluläre Fragmente der N-terminalen Domäne von PAR. Kursive Buchstaben: Affinitätsanhänge. Fette Buchstaben und Pfeil: Rest der Aktivierungsstelle.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ein sensitives Verfahren zur Detektion von Proteasen, die zur Spaltung der Protease-aktivierten Rezeptoren (PARs) fähig sind, wird bereitgestellt. Die Tests erlauben die Detektion von Proteasen, die die extrazellulären Domänen der PARs spalten, in kleinen Mengen an biologischen Proben, ein ziemlich relevanter Vorteil für klinische Tests. Die Tests können auch für Screeningzwecke verwendet werden und erlauben dem Anwender die Detektion und Charakterisierung von Proteasemengen, die in kleinen Mengen aber trotzdem biologisch relevanten Konzentrationen für die durch PARS vermittelten biologischen Effekte vorhanden sind. Zusätzlich kann ein natürlicheres Proteasesubstrat entworfen werden, als jene, die vorher für PAR Spalttests verwendet wurden. Daher ist das Verfahren zur Analyse der proteolytischen Regulation von PARs und zum Screening von PAR Modulatoren brauchbar.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifikation oder Detektion eines PAR Spaltmoleküls bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellung eines immobilisierten PAR Spaltpeptids, das an ein Reportermolekül gebunden ist,
(b) Zusammenbringen des immobilisierten PAR Spaltpeptids mit einem PAR Spaltmolekül, und
(c) Detektion des freigesetzten Reportermoleküls.

Wie hierin verwendet wird der Ausdruck "Protease-aktivierter Rezeptor" oder "PAR" verwendet, um ein Oberflächenprotein einer eukaryontischen Zelle zu bezeichnen, das spezifisch durch eine Protease aktiviert werden kann und die geeignete Kaskade biologischer Ereignisse einleiten kann (beispielsweise Phosphoinositidhydrolyse, Ca²⁺ Efflux oder Blutplättchenaggregation). Ein PAR Spaltmolekül kann jedes Molekül sein, das zur Spaltung von PAR fähig ist, wie eine ortsspezifische Protease, deren Funktion es ist, ein PAR in einem biologischen System zu aktivieren (oder inaktivieren).
Der Ausdruck "PAR Spaltpeptid" meint, wie er hierin verwendet wird, ein Peptid oder Polypeptid, das die aminoterminale PAR Exodomäne oder ein Fragment hiervon umfasst und die endogene Proteasespaltstelle umfasst, die PAR aktiviert (oder inaktiviert). Beispielsweise wird PAR1 der Maus und des Menschen durch Thrombin nach Arg⁴ ¹ gespalten. Es sind minimal 3 Aminosäuren stromaufwärts von Arg⁴ ¹ (N-terminal hierzu in der natürlichen Sequenz) gefolgt von einem Arg minimal erforderlich, um das Vorkommen eines Proteaseaktivators von PAR1 (VNPR) zu detektieren. Das PAR2 der Maus wird nach Arg³⁸ gespalten. Drei Aminosäuren direkt stromaufwärts von Arg³⁸ gefolgt von Arg sind minimal erforderlich, um das Vorkommen des Proteaseaktivators von PAR2 der Maus (SKGR) zu detektieren. Das PAR3 der Maus wird nach dem Lys³ ⁷ gespalten. Es sind drei Aminosäuren direkt stromaufwärts von Lys³⁷ gefolgt von Lys minimal erforderlich, um das Vorkommen eines Proteaseaktivators von PAR3 (LTIK) zu detektieren. Das humane PAR4 wird nach Arg⁴⁷ gespalten. Es sind minimal 3 Aminosäuren direkt stromaufwärts von Arg⁴⁷ gefolgt von Arg erforderlich, um das Vorkommen eines Proteaseaktivators von humanem PAR4 (PAPR) zu detektieren. Ähnlich für andere PARs und zur Detektion der Proteaseinaktivatoren sind die 4 Aminosäuren N-terminal zur Spaltstelle minimal im PAR Spaltpeptid zur Detektion einer Protease enthalten.
Typischerweise werden zusätzliche Aminosäuren im PAR Spaltpeptid enthalten, insbesondere Sequenzen der extrazellulären PAR Domäne stromabwärts der Spaltstelle. Beispielsweise ist zur Detektion von Thrombin mittels Thrombin-sensitiver PARs der Einbau der "Hirudin-ähnlichen Sequenz" GDEee bevorzugt, wobei die "Hirudin-ähnliche Sequenz" minimal GDE umfasst, aber typischerweise zusätzliche saure Aminosäurereste, insbesondere zusätzliche E Reste umfasst. Daher kann zur Detektion von Thrombin das minimale PAR Spaltpeptid direkt oder indirekt an die "Hirudin-ähnliche Sequenz" gebunden werden, bei der eine indirekte Bindung mittels PAR Sequenzen, die natürlich zwischen dem minimalen PAR Spaltpeptid und der "Hirudin-ähnlichen Sequenz" vorkommen oder mittels einer Linkersequenz ohne Bezug erreicht werden. Vorzugsweise werden die Sequenzen der extrazellulären Domäne der Spaltstelle in das PAR Spaltpeptid einbezogen, insbesondere wenn der Test zur Detektion von inaktivierenden Proteasen verwendet wird.
Bevorzugter werden Aminosäuresequenzen, die die Spaltstelle im natürlich vorkommenden PAR umgeben, in das PAR Spaltpeptid aufgenommen und so das natürliche Proteasesubstrat nachgeahmt. Beispielsweise erstrecken sich die in den folgenden Beispielen verwendeten Fragmente der aminoterminalen Exodomäne (extrazellulären Domäne) von den Aminosäuren 27 bis 78, 26 bis 78, 21 bis 92 und 17 bis 78 (die Aminosäurenummerierung entspricht der EMBL Datenbanknummerierung) jeweils von Maus PAR1 (EMBL Hinterlegungsnummer L03529), Maus PAR2 (EMBL Hinterlegungsnummer Z48043), Maus PAR3 (EMBL Hinterlegungsnummer U92972) und Mensch PAR4 (EMBL Hinterlegungsnummer AF055917) und erlaubt so die Detektion von PAR Aktivatoren und Inaktivatoren.
Obwohl die spezifischen Beispiele, die hierin bereitgestellt werden, auf bekannte PARs beschränkt sind, ist es für den Fachmann ersichtlich, dass bisher nicht identifizierte PARs oder Fragmente hiervon leicht in Anbetracht der Beschreibungen der vorliegenden Spezifikation hergestellt werden können. Beispielsweise können Oligonukieotidmatrizen für die PCR Amplifikation der kodierenden Sequenzen für die extrazellulären Domänen der unterschiedlichen PARs zur Verwendung gemäß dem Ausmaß der Homologie zwischen den bekannten und den neuen PARs und in Abhängigkeit der Hybridisierungsbedingungen modifiziert werden. Alternativ dazu kann, falls ausreichend Identität zwischen den zwei Se quenzen besteht, die selbe Matrize ohne weitere Modifikation verwendet werden. Alternativ dazu können geeignete Paare an Oligonukleotidmatrizen verwendet werden. Zusätzlich sind Varianten der natürlich vorkommenden Sequenzen vorgesehen, insbesondere konservative Substitutionen von Aminosäuren, die an der biologischen Spaltstelle nicht für eine Spaltung essentiell sind.
Es ist vorteilhaft, eine Transmembrandomäne in das PAR Spaltpeptid mitaufzunehmen. Eine Transmembrandomäne besteht aus hydrophoben Regionen, die identifiziert werden können, wie durch computergestützte Hydropathieplots. Beispielsweise werden die sieben Transmembrandomänen von PAR1 auf diese Weise durch Vu et al. (1991, siehe 5) identifiziert. Die Aufnahme einer Transmembrandomäne in das PAR Spaltpeptid ist besonders brauchbar zur Detektion von Proteasen nach einer Expression des PAR Spaltpeptids auf der Zelloberfläche, wobei die Transmembrandomäne die Verankerung des Peptids in die Membran der Zelle erlaubt. Die Transmembrandomäne kann jeden Ursprungs sein, obwohl die Einbeziehung einer PAR Transmembrandomäne bevorzugt ist. Zur leichteren Herstellung wird die PAR Exodomäne gefolgt von der ersten Transmembrandomäne typischerweise in der Ausführungsform verwendet (beispielsweise einschließlich der Aminosäuren 99 bis 127 von PAR1 (Vu et al. (1991)).
Das PAR Spaltpeptid ist an ein Reportermolekül gebunden. Das Reportermolekül (das heißt ein Signal-erzeugendes Molekül) kann jedes Molekül sein, das zur Bereitstellung einer detektierbaren Veränderung fähig ist. Solche Reportermoleküle umfassen Fluoreszenzreste (beispielsweise Fluoreszenzproteine oder chemische Fluoreszenzmarkierungen), radioaktive Reste, phophoreszierende Reste, Antigene, Reporterenzyme und dergleichen. Vorzugsweise ist das Reportermolekül ein Reporterenzym, dessen Aktivität eine detektierbare Veränderung herbeiführt. Solche Reporterenzyme umfassen unter anderem die folgenden: Beta-Galactosidase, Glucosidasen, Chloramphenicolacetyltransferasen (CAT), Glucuronidasen, Luciferase, Peroxidasen, Phosphatasen, Oxidoreduktasen, Dehydrogenasen, Transferasen, Isomerasen, Kinasen, Reduktasen, Desaminasen, Katalasen und Urease.
Bei der Auswahl eines im vorliegenden Verfahren verwendeten Reportermoleküls ist es zwingend, dass das Reportermolekül keiner Inaktivierung durch ein Mittel in der Probe unterzogen wird, einschließlich der Inaktivierung durch eine Proteaseaktivität, die in einer Probe vorhanden ist. Die Selektion eines geeigneten Reportermoleküls ist für den Fachmann leicht ersichtlich. Derzeit bevorzugte Reportermoleküle sind Reporterenzyme, wie beta-Galactosidase, wie dies im Beispiel 1 dargestellt ist.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das bereitgestellte PAR Spaltpeptid an ein Paar aus wechselwirkenden Reportermolekülen gebunden. Nach der Spaltung des PAR Spaltpeptids wird ein Reporter aus dem PAR Spaltpeptid freigesetzt, was zu einer detektierbaren Veränderung im zweiten Reportermolekül führt. Beispielsweise kann ein Fusionsprotein entworfen werden, das in N-terminaler zu C-terminaler Richtung umfasst: Ein erstes Fluoreszenzprotein (beispielsweise Cyanfluoreszenzprotein CFP, gelbes Fluoreszenzprotein YFP, blaues Fluoreszenzprotein BFP, grünes Fluoreszenzprotein GFP, wobei alle im Handel erhältlich sind, Clontech Living Colors User Manual), ein PAR Spaltpeptid und ein zweites Fluoreszenzprotein. Die Immobilisierung des PAR Spaltpeptids kann wie im folgenden beschrieben erreicht werden. Nach der Spaltung an der PAR Spaltstelle tritt eine messbare Veränderung in der Fluoreszenzwellenlänge des zweiten Reportermoleküls auf.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung umfassen in N-terminaler zu C-terminaler Reihenfolge Cyanfluoreszenzprotein, PAR Spaltpeptid, gelbes Fluoreszenzprotein und einen Immobilisierungsanhang (beispielsweise ein Biotinanhang oder eine Transmembrandomäne) oder ein gelbes Fluoreszenzprotein, PAR Spaltpeptid, rotes Fluoreszenzprotein und einen Immobilisierungsanhang (beispielsweise ein Biotinanhang oder eine Transmembrandomäne). Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass andere wechselwirkende Reportermoleküle verwendet werden können, beispielsweise Aequorin und GFP, Luciferase und YFP. Vorzugsweise sind die zwei wechselwirkenden Reportermoleküle durch mindestens 15 Aminosäuren, bevorzugter mindestens 20 Aminosäuren, vor allem mindestens 30 Aminosäuren getrennt, was die natürlich vorkommenden PAR Sequenzen nachahmt.
Die Bindung des Reportermoleküls an das PAR Spaltpeptid kann durch jedes in der Technik bekannte Mittel (oder noch aufzufindende Mittel) erreicht werden, mit der Maßgabe, dass (i) das PAR Spaltpeptid durch die Protease erkannt werden kann und (ii) nach der Proteasewirkung auf das PAR Spaltpeptid ein Reportermolekül auf eine detektierbare Weise freigesetzt wird. Daher kann die Bindung erreicht werden durch eine chemische Reaktion, durch Einbau eines Reportermoleküls während der Synthese des PAR Spaltpeptids oder durch zusammenhängende Synthese. Wenn beispielsweise das Reportermolekül ein Protein ist, kann ein Fusionsprotein, das das Reportermolekül, das PAR Spaltpeptid und andere optionale Sequenzen umfasst, leicht durch rekombinante oder chemische Verfahren hergestellt werden.
Kurz gesagt kann die DNA, die für das Fusionsprotein kodiert, in einer Nukleinsäureexpressionskassette enthalten sein, die einen Promotor umfasst, der operativ an die für das Fusionsprotein kodierende Aminosäure gebunden ist und wahlweise an Transkriptionsterminationssignale. Die fusionierten Polypeptide des Fusionsproteins können direkt oder über einen Spacer gebunden sein. Das PAR Spaltpeptid kann in Abhängigkeit vom bestimmten Design des Tests (siehe unten) N-terminal oder C-terminal zum Reportermolekül sein.
Der Promotor kann aus fast jedem Ursprung stammen. Es ist beispielsweise möglich einen eng regulierten Promotor oder den Promotor zu verwenden, der natürlich benachbart zu einem PAR gen liegt. Bevorzugt sind Promotoren, die in den ausgewählten Wirtszellen aktiv sind, wie die Promotoren SV40, tac, beta-Aktin, Metallothionin, T7, Polyhedrin und Cytomegalovirus. Ein besonders bevorzugter Promotor ist der IacZ Promotor, wie er im folgenden in Beispiel 1 beispielhaft dargestellt ist. Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit den Hefewirten können reguliert oder konstitutiv sein und leiten sich vorzugsweise von einem stark exprimierten Hefegen ab, speziell einem Saccharomyces cerevisae Gen. Daher kann der Promotor der TRP1 Gens des ADHI oder ADHII Gens oder des Gens der sauren Phosphatase (Pho5) verwendet werden.
Eine DNA Sequenz, die die Transkriptionsterminationssignale enthält, ist vorzugsweise die 3'-flankierende Sequenz eines Gens, das geeignete Signale zur Transkriptionstermination und Polyadenylierung für den gewünschten Wirt enthält. Geeignete Signale sind beispielsweise das Polyadenylierungssignal des humanen Wachstumshormons, des DHFR Gens und des Kaninchen ß-Globingens.
In einigen Ausführungsformen, in denen die Verankerung der Zellmembran nicht erwünscht ist, ist es auch möglich, eine Polypeptidexpressionskassette zu verwenden, die zusätzlich eine Signalsequenz enthält, die verursacht, dass das Protein in das Medium sekretiert wird. Geeignete Signalsequenzen sind in der Technik bekannt. Demnach ist in dieser Art von Expressionskassetten ein Promotor operativ an eine erste DNA Sequenz gebunden, die für ein Signalpeptid kodiert, das im richtigen Leserahmen an eine zweite DNA Sequenz gebunden ist, die für das Fusionsprotein kodiert und an eine DNA Sequenz, die die Transkriptionsterminationssignale enthält.
Der Promotor, die für das Fusionsprotein kodierende DNA Sequenz und die die Transkriptionsterminationssignale enthaltende DNA Sequenz werden operativ miteinander verbunden, das heißt sie werden so zusammengesetzt, dass ihre normalen Funktionen erhalten bleiben. Das Ziel ist, dass der Promotor eine korrekte Expression des Strukturgens und die Transkriptionsterminationssignale eine korrekte Termination der Transkription und Polyadenylierung bewirken.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten zur Synthese des Fusionsproteins können in den gewünschten Wirt in Form eines stabilen Plasmids oder direkt in das Chromosom eingebaut werden, wobei letzteres bevorzugt ist.
Es ist auch möglich, dass die erfindungsgemäßen Expressionsplasmide einen oder mehrere, speziell ein oder zwei genetische Selektionsmarker für den zur Konstruktion, Amplifikation und zum Testen des Plasmids verwendeten Wirt umfassen, wie einen Marker und einen Replikationsursprung für einen bakteriellen Wirt, speziell Escherichia coli.
Als genetischer Selektionsmarker kann jedes Markergen verwendet werden, das die Selektion auf Transformanden aufgrund der phänotypischen Expression des Markergens erleichtert. Geeignete Marker sind beispielsweise die, die Antibiotikumresistenz exprimieren, oder im Fall von auxotrophen Wirtsmutanten, Gene, die die Wirtsschäden komplementieren. Entsprechende Gene verleihen beispielsweise eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Tetracyclin, Ampicillin, G418, Hygromycin, Kanamycin, Chloramphenicol, Carbenicillin, Zeocin, Blasticydin oder Bleomycin oder sorgen für eine Prototrophie in einer auxotrophen Mutante, beispielsweise das URA3, LEU2, LYS2, HIS3 oder TRP1 Gen.
Da die Amplifizierung der Expressionsplasmide gewöhnlich in einem Prokaryonten durchgeführt wird, wie E.coli, wird vorteilhafterweise ein Replikationsursprung einbezogen. Diese können aus entsprechenden prokaryontischen Plasmiden erhalten werden, beispielsweise E. coli Plasmiden, wie pBluescript^®, pBR322, pTZ18R oder einem pUC Plasmid, beispielsweise pUC18 oder pUC19, die beide einen prokaryontischen, beispielsweise E. coli Replikationsursprung und einen Genmarker enthalten, der eine Resistenz gegenüber Antibiotika verleiht, wie Ampicillin und Tetracyclin.
Bevorzugte Nukleinsäuren, die für das Fusionsprotein kodieren, sind in den späteren Beispielen 1 bis 5 beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Expressionsplasmide werden durch in der Technik bekannte Verfahren hergestellt, beispielsweise durch Verbinden der Polypeptidexpressionskassette, der die selektiven Genmarker für den Wirt enthaltenden DNA Fragmente und des Replikationsursprungs in der vorbestimmten Reihenfolge mittels herkömmlicher chemischer oder biologischer in vitro Syntheseverfahren. Vorzugsweise werden die Plasmide mittels rekombinanter DNA Techniken konstruiert und hergestellt. Zur Herstellung durch rekombinante DNA Techniken werden geeignete DNA Fragmente in vitro auf herkömmliche Weise ligiert. Das Ligationsgemisch wird dann in einen geeigneten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt in Abhängigkeit der Art der verwendeten Regulationselemente transformiert und eine Transformante, die den gewünschten Vektor enthält, wie gemäß herkömmlicher Verfahren ausgewählt. Die Plasmide können durch die transformierten Wirte vermehrt und auf herkömmliche Weise isoliert werden. Die Wahl des Wirts hängt von den auf dem Vektor liegenden Regulationssequenzen ab. Zur Konstruktion und Vermehrung des Vektors ist ein prokaryontischer Wirt bevorzugt, beispielsweise E. coli.
Ein geeigneter Wirt zur Bildung des Fusionsproteins ist eine eukaryontische oder prokaryontische Zelle, beispielsweise eine Säuger-, Nematoden-, Insekten-, Hefe- oder Bakterienzelle. Der geeignete Wirt kann durch Standardverfahren der Gentechnik transfiziert werden, beispielsweise mit Hilfe von Viren, Lipidvesikeln, Partikelbeschuss oder Elektroporation. Um die Menge an gebildetem Protein zu erhöhen, ist es vorteilhaft, ein Plasmid mit einer hohen Kopienzahl zu verwenden oder dass die Plasmid DNA in das Genom in mehreren Kopien integriert ist. Das letztere kann beispielsweise durch Anwendung von Selektionsstress erreicht werden, beispielsweise unter Verwendung von Methotrexat. Die transfizierten Wirtszellen können durch Standardverfahren in Zellkultur kultiviert werden.
Proteine können auch durch synthetische Mittel anstelle der Gewinnung aus natürlichen Quellen mittels im Handel erhältlicher Proteinsynthesegeräte erhalten werden oder sogar von einem kommerziellen Peptidsyntheseservice bezogen werden. Synthetisierte Proteine können alle gewünschten Sequenzmodifikationen umfassen, einschließlich die Verwendung von veränderten Aminosäureresten oder der Zugabe von heterologen Gruppen oder Seitenketten an das Polypeptid und den Einbau von Markierungen oder Anhängen.
Zur Verwendung in den PAR Spaltsystemen der vorliegenden Erfindung wird das PAR Spaltpeptid-Reportermolekül auf einem festen Träger immobilisiert. Der feste Träger kann beispielsweise eine Mikrotiterplatte, ein Gel, eine Matrix, ein Kügelchen, einer Membran oder ein Röhrchen sein und kann aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, einschließlich ohne Beschränkung Cellulose, Agarose, Dextran, Polycarbonat, Nylon, Polyethylen, Polycarbonaten und Glas. In einigen Ausführungsformen kann der feste Träger eine Membran oder Oberfläche sein, wie sie durch ein Liposom oder eine Zelle bereitgestellt wird.
Das PAR Spaltpeptid-Reportermolekül ist auf einem festen Träger auf eine Weise immobilisiert, dass ein Reportermolekül nach der Wirkung der Protease freigesetzt wird, falls die enzymatisch aktive Protease in der Probe vorhanden ist. Die Immobilisierung kann auf eine beliebige Weise erreicht werden, vorausgesetzt die PAR Spaltstelle ist für die Protease zugänglich. Daher ist typischerweise ein orientierter Anhang an das PAR Spaltpeptid erforderlich. Eine solche orientierte Anfügung kann durch verschiedene in der Technik bekannte Verfahren erreicht werden, einschließlich spezifischer chemischer Reaktion des terminalen Endes des Proteins an reaktive Gruppen auf dem Träger, der Anfügung eines Anhangs an das terminale Ende des Proteins, das durch einen Rezeptor gefangen werden kann, der spezifisch an den Anhang bindet (beispielsweise können Biotin-Strepavidin, Biotin-Avidin, Antikörper-Epitop Wechselwirkungen als Rezeptor-Anhang-Paare verwendet werden) oder auf jede andere Weise, die dem Fachmann bekannt ist. Obwohl das PAR Spaltpeptid sich N-terminal oder C-terminal zum Rezeptormolekül befinden kann, trennt das PAR Spaltpeptid typischerweise den Anhang (oder ein anderes Immobilisierungsmittel) vom Reportermolekül, um die Freisetzung des Reportermoleküls nach der Wirkung der Protease zu erlauben.
Ein bevorzugtes Immobilisierungsmittel mittels Biotin-Streptavidinwechselwirkungen ist später in Beispiel 1 beschrieben. Obwohl dieses bestimmte Beispiele die Erfindung durch den Einbau von Biotin in das Fusionsprotein erläutert, kann jedes Einbauverfahren für solche Anhänge verwendet werden, mit der Maßgabe, dass die Spaltstelle nicht maskiert oder zerstört wird. Dies ist nicht nur zur Präsentation der Spaltstelle an eine Protease wichtig, sondern auch, um die Trennung des durch die Protease freigesetzten Reportermoleküls vom immobilisierten PAR Spaltpeptid-Reportermolekül zu erlauben. Daher ist die unspezifische chemische Quervernetzung des PAR Spaltpeptids-Reportermoleküls an eine feste Oberfläche nicht bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung angedacht.
In einem Aspekt der Erfindung wird das Fusionsprotein auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert und enthält eine Transmembrandomäne. Die Transmembrandomäne, die als Teil des Fusionsproteins exprimiert wird, kann als "Anhangsimmobilisierung" des Fusionsproteins an die Zeltoberfläche angesehen werden. Es wird ein Reportermolekül N-terminal zum PAR Spaltpeptid bereitgestellt, um die Freisetzung und anschließende Detektion des Reportermoleküls nach der Proteasewirkung zu erlauben.
Das immobilisierte PAR Spaltpeptid-Reportermolekül wird mit einem PAR Spaltungsmolekül (oder einer Protease) zusammengebracht. Die Protease kann eine bekannte Protease sein, die im Handel erhältlich oder beispielsweise in einer biologischen Probe vorhanden ist. Die Protease kann auch in Form einer Proteinbank bereitgestellt werden und der erfindungsgemäße Test wird dann verwendet, um die Protease zu detektieren und zu isolieren oder anderweitig zu identifizieren.
Es können Proteaseproben beispielsweise durch Extraktion einer natürlichen Quelle, durch Expression einer rekombinanten Nukleinsäure, die für eine Protease kodiert, oder durch chemische Synthese der Protease erhalten werden. Es ist von mehreren Tumorzelllinien (beispielsweise Melanom, Brustcarzinom und Neuroblastomzelllinien, erhältlich von der ATCC) bekannt, dass sie bekannte und uncharakterisierte Proteasen sekretieren, die als Quelle für eine Protease verwendet werden können. Zusätzlich können Gewebe, die bekanntermaßen aktivierte PARs (und daher eine biologisch relevante Protease) aufweisen, verwendet werden, wie Gehirnschnitte, Schnitte von Reproduktionsgewebe oder Schnitte von Darmgewebe. Alternativ dazu können Körperflüssigkeiten, wie Cerebrospinalflüssigkeit, Ascites, Serum oder Blut als Proteasequelle verwendet werden.
Die Protease kann aus natürlichen Quellen durch herkömmliche Mittel, aus Geweben oder aus kultivierten Zellen isoliert werden. Während der Isolierung können zusätzliche Additive, wie Proteinstabilisatoren, spezifische Proteinaseinhibitoren und dergleichen, zugegeben werden. Wenn beispielsweise das Polypeptid aus der Gewebekultur isoliert wird, besteht der erste Schritt gewöhnlich in der Lyse der Zellen oder, falls das Polypeptid in das Medium sekretiert wird, in der Abtrennung der Zellen aus der Kulturflüssigkeit, typischerweise durch Zentrifugation. In Gegenwart von zusätzlichen Proteinen und Verunreinigungen kann der entstehende Überstand auf die Protease durch die Entfernung des meisten nicht-proteinartigen Materials und der Fällung der Proteine durch Sättigen der Lösung mit Ammoniumsulfat oder dergleichen angereichert werden. Kontaminierende Proteine können auch durch Ansäuerung mit Essigsäure und anderen herkömmlichen Mitteln gefällt werden. Andere Reinigungsschritte können beispielsweise die Entfernung von Lektinen, Entsalzung, chromatographische Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Verteilungschromatographie, HPLC, Umkehrphasen HPLC und dergleichen umfassen. Die Abtrennung der Bestandteile des Gemisches kann auch durch Dialyse, gemäß Ladung durch Gelelektrophorese oder Träger-freie Elektrophorese, gemäß Molekülgröße durch eine geeignete Sephadexsäule, Gelpermeation oder Ultrafiltration, durch Affinitätschromatographie oder durch andere Verfahren bewirkt werden, speziell jenen, die aus der Literatur bekannt sind.
Die Reinheit der Protease kann durch jedes geeignete Verfahren gemessen werden, beispielsweise Säulenchromatographie, Polyacrylamidgelelektrophorese oder HPLC Analyse. Die Protease ist im wesentlichen rein, wenn sie in einer Bande in einem Gel isoliert werden kann.
Alternativ dazu können verschiedene Banken natürlicher Produkte auf eine Proteaseaktivität getestet werden oder tatsächlich Expressionsbanken auf eine freigesetzte Proteaseaktivität mittels der erfindungsgemäßen Tests gescreent werden. Beispielsweise können, obwohl einzelne Klone getestet werden können, zur einfacheren Handhabung Pools an Klonen aus einer Expressionsbank in einer geeigneten Zelllinie exprimiert werden, wie einer Zelllinie, die auch zür Expression, Sekretion und Aktivierung der Protease fähig ist. Durch die Anzucht der Zellen in einem geeigneten Medium (beispielsweise Serumfreien Medium, wie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) oder RPMI 1640 Medium, das wahlweise mit Spurenelementen und Wachstums-erhaltenden Supplementen versetzt ist) in einem Behälter (beispielsweise Platten mit 96 Vertiefungen), wird konditioniertes Medium gebildet (das heißt Medium, das aus den Zellen sekretierte Faktoren enthält), das dann mittels der hierin beschriebenen Verfahren auf eine Proteaseaktivität getestet werden kann. Wenn ein Pool identifiziert wird, dass er höhere Mengen an Proteaseaktivität bildet, können die Zellen mit Medium verdünnt, abgetrennt, angezogen und wie oben beschrieben getestet werden, bis der die Protease exprimierende Klon identifiziert ist.
Die Proteaseprobe wird, egal ob sie als Molekülgemisch, in isolierter Form, als Körperflüssigkeit, Zellextrakt, konditioniertes Medium, Zellen oder als Gewebeprobe bereitgestellt wird, mit dem immobilisierten PAR Spaltpeptid-Reportermolekül zusammengebracht, um die Spaltung des PAR Spaltpeptids zu erlauben, wobei das Reportermolekül freigesetzt wird. Die Freisetzung des Reportermoleküls wird dann detektiert und zeigt das Vorkommen eines PAR Spaltmoleküls in der Probe an.
Da das Reportermolekül, das an das PAR Spaltpeptid gebunden ist, mit der Detektion des freigesetzten Reportermoleküls wechselwirken kann, wird das freigesetzte Reportermolekül typischerweise vor der Detektion vom PAR Spaltpeptid-Reportermolekül abgetrennt. Dies wird leicht erreicht, wenn das PAR Spaltpeptid-Reportermolekül immobilisiert wird, um die Freisetzung des Reportermoleküls in das umgebende Medium nach der Inkubation mit der Proteaseprobe zu erlauben. Daher kann das Medium nach der Spaltung durch eine Protease abgezogen werden und das Vorkommen des freigesetzten Reporters im Medium bestimmt werden. Alternativ dazu wird das PAR Spaltpeptid-Reportermolekül auf einem entfernbaren Träger immobilisiert, das immobilisierte PAR Spaltpeptid-Reportermolekül wird entfernt, wobei das Medium in einem geeigneten Gefäß zur weiteren Analyse zurückbleibt.
Die Freisetzung des Reportermoleküls kann durch die Detektion jedes messbaren Signals bestimmt werden, wie der Veränderung in Farbe, Fluoreszenz, Lumineszenz oder Strahlungsereignissen in der Probe. Wenn das Reportermolekül ein Enzym ist, wird die Probe (oder das Medium, das die Probe enthalten hat) mit einem Indikator kombiniert. Der Indikator ist jede Spezies, die gegenüber einer detektierbaren Veränderung (beispielsweise einer pH Veränderung, Farbänderung, Fluoreszenz- oder Lumineszenzveränderung oder ein Substrat/Enzym, das durch einen zweiten Indikator detektiert werden kann) nach einer Einwirkung des Reporterenzyms zugänglich ist. Eine detektierbare Veränderung im Indikator ist eine Indikation, dass die enzymatisch aktive Protease in der Probe vorkommt. Im Gegensatz dazu ist das Fehlen einer detektierbaren Veränderung im Indikator eine Indikation, dass die enzymatisch aktive Protease nicht in der Probe vorhanden ist. Typscherweise ist die "detektierbare Veränderung" mindestens eine zweifache Erhöhung des Signals gegenüber dem Hintergrund (wenn die Kontrolltests in Abwesenheit der Probe ausgeführt werden), vorzugsweise mindestens eine fünffache Erhöhung, vor allem mindestens eine zehnfache Erhöhung des Signals gegenüber einem Kontrolltest.
Wie oben beschrieben sind die biologischen Spaltstellen für die PAR Aktivierungsmittel für PAR 1 des Menschen und der Maus (nach Arg⁴¹), Par 2 der Maus (nach Arg³⁸), PAR 3 der Maus (nach Lys³ ⁷) und PAR 4 vom Menschen (nach Arg⁴⁷) bekannt. Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "biologische Spaltstelle" auf die in vivo gespaltene Stelle, die zu einer biologischen Reaktion führt (beispielsweise Ca²⁺ Einstrom, Neuritenretraktion, Phosphoinositidhydrolyse oder Blutplättchenaggregation). Daher kann nach einer Indentifizierung eines PAR Spaltmoleküls das PAR Spaltmolekül als potentieller PAR Aktivator oder potentieller PAR Inaktivator auf der Basis identifiziert werden, wo das Proteasespaltpeptid durch die Protease gespalten wird. PAR Spaltmoleküle, die das PAR Spaltpeptid an einer anderen als die "biologische Spaltstelle" spalten, werden als potentielle PAR Inaktivatoren klassifiziert, während PAR Spaltmoleküle, die das PAR Spaltpeptid an der "biologischen Spaltstelle" spalten, als potentielle PAR Aktivatoren klassifiziert werden.
Die biologische Spaltstelle kann leicht bestimmt werden, wie es dem Fachmann bekannt ist, Die späteren Beispiele beschreiben die Verwendung von mutierten PAR Spaltpeptiden, bei denen die biologische Spaltstelle so verändert ist, dass die Spaltung an dieser Stelle zerstört ist. Jede Spaltung des mutierten PAR Spaltpeptids ist daher eine alternative Stelle zur "biologischen Spaltstelle", was das Vorkommen eines Inaktivators anzeigt. Alternativ dazu können der freigesetzte Reporter-abgespaltene Polypeptidrest oder vorzugsweise die immobilisierten gespaltenen PAR Sequenzen sequenziert werden oder es kann ein Antikörper, der für die Spaltstelle spezifisch ist, verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Spaltung an der biologischen Spaltstelle stattfindet oder nicht.
Wenn der potentielle Aktivator/Inaktivator klassifiziert ist, kann eine weitere Analyse ausgeführt werden, um die Klassifizierung zu bestätigen. Solche Tests sind in der Technik bekannt und umfassen Neuritenwachstumstests, Phosphoinositidhydrolysetests, Ca²⁺ Effluxtests und Blutplättchenaggregationstests.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren nach Anspruch 7 zum Screening potentieller PAR Modulatoren durch die Zusammenbringung des immobilisierten PAR Spaltpeptids mit einem PAR Aktivator/Inaktivator und einem potentiellen PAR Modulator und die Bestimmung der Veränderung in der Spaltmenge an der Spaltstelle im Vergleich dazu, wenn der PAR Modulator fehlt, bereitgestellt. PAR Modulatoren können die Wirkung des Inaktivators hemmen, wobei sie die PAR Aktivierung erlauben oder die Wirkung eines Inaktivators potenzieren, wobei eine PAR Inaktivierung gefördert wird. Im Gegensatz dazu können PAR Modulatoren die Wirkung eines Aktivators hemmen, wobei sie die PAR Aktivierung hemmen oder die Wirkung eines Aktivators potenzieren, wobei sie die PAR Aktivierung weiter verbessern.
Das Vorkommen eines PAR Modulators wird durch eine Veränderung in der Spaltmenge des PAR Spaltpeptids in Gegenwart des PAR Modulators im Vergleich zur Abwesenheit dessen detektiert. Vorzugsweise unterscheidet sich die Veränderung der Aktivität um 20 % zu der der Kontrollmenge, bevorzugter um 50 % zu der der Kontrollmenge, vor allem um 90 % oder mehr zu der der Kontrollmenge. Eine Erhöhung der Spaltung an der biologischen Spaltstelle reflektiert das Vorkommen eines Agonisten. Eine Zunahme der Spaltung an einer anderen Spaltstelle als der biologischen Spaltstelle (insbesondere C-terminal zur biologischen Spaltstelle) reflektiert auch das Vorkommen eines Antagonisten.
Daher ist ein Agonist ein Molekül, das die PAR Aktivierung fördert, wie dies durch die Spaltung an der biologischen Spaltstelle charakterisiert ist, relativ zu den Kontrolltests in Abwesenheit des Aktivators oder des Kandidatenagonisten. Ein Antagonist ist ein Molekül, das die PAR Aktivierung relativ zu den Kontrolltests in Abwesenheit eines Kandidatenantagonisten entweder durch (i) Förderung der Spaltung an einer anderen Stelle als der biologischen Spaltung oder (ii) Hemmung der Spaltung an der biologischen Spaltstelle (beispielsweise durch Bindung an PAR und die Blockierung der PAR Aktivierung hierdurch oder durch Bindung an den PAR Aktivator) verringert.
Geeignete Agonisten und Antagonisten können aus denselben Quellen wie die Proteasen erhalten werden, wie dies oben beschrieben ist. Alternativ dazu können Banken an chemischen Verbindungen, Peptiden, Antikörpern oder natürlichen Produkten oder kombinatorische Chemie als Quellen verwendet werden.
Nach einer Identifizierung kann die Wirkung der Agonisten oder Antagonisten durch funktionelle Tests bestätigt werden. Zusätzlich können die Agonisten oder Antagonisten potentiell verwendet werden, um einen gewünschten pharmakologischen und/oder physiologischen Effekt zu erhalten. Die Wirkung kann in Bezug auf die vollständige oder partielle Prävention einer Erkrankung/eines Zustands oder eines Symptoms hiervon prophylaktisch sein und/oder in Bezug auf eine partielle oder vollständige Heilung einer Erkrankung/eines Zustands und/oder des schädlichen Effekts, der dieser Erkrankung zugeordnet wird, therapeutisch sein. "Behandlung", deckt, wie es hierin verwendet wird, jede Behandlung einer Erkrankung bei einem Säuger, insbesondere einem Menschen, und umfasst

(a) Prävention der Erkrankung/des Zustands oder des Symptoms vor dem Auftreten bei einem Individuum, das für die Erkrankung/den Zustand oder das Symptom prädisponiert ist, das aber bisher nicht als positiv diagnostiziert wurde,
(b) Hemmung der Erkrankung/des Zustands oder Symptoms, das heißt Anhalten der Entwicklung oder
(c) Linderung der Erkrankung/des Zustands oder Symptoms, das heißt Veranlassung der Regression der Erkrankung/des Zustands.

Beispielsweise ist die PAR1 Aktivierung bei der Bereitstellung eines neuroprotektiven Effekts beteiligt (Vaughan et al. 1995), PAR1 wird in Krebszelllinien und Biopsien stark exprimiert, was die Beteiligung bei mitogenem und metastatischem Verhalten von Tumorzellen nahelegt, PAR1 ist vermutlich auch bei der Alzheimerschen Erkrankung beteiligt, die Expression von PN-1, eines potenten Antagonisten der PAR-1 Aktivierung, ist in reaktiven Astrozyten nach einer Ischämie und einem Schlaganfall oder bestimmten Typen von Neurotoxin-induzierten Läsionen dauerhaft hochreguliert (Hoffmann et al., 1992, Nitsch et al., 1993, Scotti et al., 1994), die PAR-3 Aktivierung ist vermutlich bei der Erhöhung der Darmmotilität beteiligt: Dies stellt alle möglichen Zielerkrankungen oder Zustände bereit.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann der PAR Spaltungstest beim Messen des Gehalts an Protease oder der Protease-hemmenden Aktivität in klinischen Proben verwendet werden. Das spätere Beispiel 7 zeigt, dass der Test ausreichend sensitiv ist, um zum ersten Mai das Vorkommen und die Menge an Thrombinaktivität in den CSF beim Menschen sowohl in gesunden Patienten und nach einer traumatischen Kopfverletzung zu messen, was in der Mehrzahl der Fälle zu einem erhöhten Thrombinspiegel führt. Ähnlich kann CSF von Patienten oder Versuchstieren nach einer Ischämie oder einem Schlaganfall auf die Mengen an Thrombin oder Thrombin-hemmender Aktivität analysiert werden. Die Menge an Protease oder Proteaseinhibitoraktivität in einer klinischen Probe kann daher als diagnostischer und/oder prognostischer Indikator wirken.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Kit bereitgestellt, der zumindest eines der hierin beschriebenen Materialien umfasst, beispielsweise ein PAR Spaltpeptid, ein PAR Fusionsprotein, wie hierin beschrieben, wie PAR beta-Glucosidasefusionsprotein oder die hierfür kodierende Aminosäure in Kombination mit Anleitungen zur Verwendung im erfindungsgemäßen Test.
Die folgenden Beispiele werden ausschließlich zu Erläuterungszwecken bereitgestellt und sollen die Patentansprüche nicht beschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Detektion von PAR 1 Spaltprotease
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Galactosidase-PAR1 (GPAR1) als rekombinantes Protein, das durch Fusion einer ß-Galactosidase, der extrazellulären Domäne von PAR 1, einen His₆-Tag und eine Biotinakzeptordomäne zur in vitro Biotinylierung erhalten wird. Die Spaltung des GPAR-1 Fusionsproteins, das an Streptavidin immobilisiert ist, führt zur Freisetzung einer aktiven löslichen ß-Galactosidase, die ein Mittel zur Verfolgung von Proteasen darstellt, die zur Spaltung der extrazellulären Domäne von PAR-1 fähig sind. Durch die Verwendung als immobilisiertes Substrat erlaubt das GPAR-1 Fusionsprotein zum ersten Mal die Detektion von Thrombin im subpicomolaren Bereich.
Stämme und Medien
Der E. coli Stamm SCS 110 (Stratagene, La Jolla, CA, USA) wird zur Vermehrung der rekombinanten Plasmide verwendet. Das rekombinante GPAR-1 wird entweder im E. coli Stamm M15 [pREP4] (Qiagen), SCS110 oder XL-1 Blue MR (Strategene) exprimiert. Die E. coli Zellen werden in 2 × YT Medium angezogen, das mit 100 μg/ml Ampicillin supplementiert ist (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Das Medium wird ferner mit 50 μM Biotin (Tsao et al. (1996) Gene 169, 59–64) zur Herstellung des biotinylierten rekombinanten GPAR-1 supplementiert.
Konstruktion des GPAR-1 Expressionsvektors
Das Plasmid pGPAR1 wird durch Ligation von vier Fragmenten konstruiert, die durch PCR generiert werden:

(i) ein Fragment, das für ß-Galactosidase kodiert
(ii) ein Fragment, das für die PAR1 Exodomäne kodiert
(iii) ein Fragment, das für Affinitätsanhänge kodiert, und
(iv) ein Fragment, das das BirA Enzym (Biotinholoenzymsynthetase) kodiert, die eine Biotinmodifizierung katalysiert (Barker and Campbell (1981), J. Mol. Biol. 146, 451–467), die alle durch Restriktionsstellen flankiert sind.

Das für ß-Galactosidase kodierende DNA Fragment wird aus pSV-ß-Galactosidase (im Handel erhältlich von Promega) mittels 5'-CACACAGCGGCCGCGTCGACGATGAGCGAAAAATACATCGTCACCT-3' (SEQ ID Nr. 1) und 5'-CACACTTAATTAATCTAGATTTGTACAGTTTTTGACACCAGACCAACTGGTAA-3' (SEQ ID Nr. 2) als Primer amplifiziert.
Das für die PAR1 Exodomäne kodierende Fragment wird aus pBSmThR, das die Maus PAR1 cDNA in Bluescript (Nicloulet al. (1994) Cell Mol. Biol. 40, 421–428) enthält, mittels 5'-CACACACCATGGGGTCGACGATGAGCGTGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGATCAAGCCAGCCAGAATCAGAGAGGA C-3' (SEQ ID Nr. 4) und 5'-GAGAGAACTAGTGGGGCTGGTCAGATATCCGGAG-3' (SEQ ID Nr. 4) als Primer amplifiziert.
Das für die Affinitätsanhänge kodierende DNA Fragment, das zusätzliche Restriktionsschnittstellen enthält, um die Subklonierung der anderen PCR Produkte zu erlauben, wird durch PCR mittels eines synthetischen DNA Oligonukleotids erzeugt (5'-CACACACCATGGGACTCGAGGAGGTACTAGTGGAGGTTCACACCATCATCACCACCATGCAGCGGCTCTGAACGATATTTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAGTAGTCTAGACGTCCAGGTACCAGAGAG3' (SEQ ID Nr. 5)).
Das BirA Fragment wird direkt aus suspendierten SCS 110 E. coli Zellen mittels 5'-CACACATCTAGATAAGGATCCATGAAGGATAACACCGTGCCACTG-3' (SEQ ID Nr. 6) und 5'-CACACAGGTACCAAGCTTATTTTTCTGCACTACGCAGGGAT-3' (SEQ ID Nr. 7) als Primer amplifiziert. Eine Kolonie an SCS 110 Zellen wird in 50 μl an LB Medium suspendiert. Zwei μl dieser Zellsuspension werden als Matrize in einer 100 μl PCR Reaktion unter Standardbedingungen verwendet.
Alle PCR Reaktionen werden mit Taq DNA Polymerase, die mit 1/50 Volumina Pwo DNA Polymerase supplementiert ist, in einer 100 μl Reaktion gemäß den Empfehlungen des Herstellers ausgeführt. Alle Manipulationen mit rekombinanter DNA werden gemäß Standardverfahren (Pepper et al. (1993) J. Cell. Biol. 122, 673–684) und gemäß den Anleitungen der Hersteller ausgeführt. Die DNA Sequenzen werden durch DNA Sequenzierung verifiziert.
Kurz gesagt wird ein Fragment der multiplen Klonierungsstelle von pBluescript SK^– (im Handel erhältlich von Stratagene) durch die Spaltung mit Clal und Sstll entfernt, wonach eine Behandlung mit T4 Polymerase zur Bildung von stumpfen Enden erfolgt und dann unter Bildung von pBS-CS ligiert. Die PCR Produkte (Fragmente (i) bis (iv) oben) werden in die Kpnl und Sall Schnittstellen von pBS-CS unter Bildung von pGPAR1 (1A) schrittweise ligiert. Das entstehende rekombinante Plasmid pGPAR1 hat daher einen ersten offenen Leserahmen, der für ß-Galactosidase kodiert, C-terminal an das Fragment der extrazellulären Domäne von PAR1 fusioniert ist, einen His₆-Anhang und eine Biotinakzeptordomäne (BAD). Ein zweiter offener Leserahmen, dem eine interne Ribosomenbindungstelle vorausgeht, wird in das Konstrukt unter Bildung der Biotinholoenzymsynthetase (BirA Enzym) aus derselben mRNA eingefügt (Tsao et al. (1996) Gene, 169, 59–64).
Expression und Reinigung von GPAR1 in E. coli
SCS 110 E. coli Zellen, die mit pGPAR1 transformiert sind, bilden blaue Kolonien, wenn sie auf Medien ausplattiert werden, die Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (X-Gal) enthalten. während Zellen, die mit pBS-CS transformiert sind, aufgrund des zerstörten Gens des α-Komplementationsfragments der ß-Galactosidase weiße Kolonien ergeben (Sambrook et al., 1989). 1 Liter des 2 × YT Mediums, das 100 μg/ml Ampicillin und 50 μM Biotin enthält (Tsao et al (1996)) wird mit rekombinanten E. coli Zellen beimpft, auf eine OD₆₀₀ von 0,7 angezogen und die Proteinexpression wird mit 0,4 g/l IPTG induziert. Nach einer Induktion für mindestens 16 Stunden werden die Zellen durch Zentrifugation bei 5500 Upm für 30 Minuten bei 4°C in einer Beckman J-6B/P Zentrifuge mit einem JS-5.2 Rotor geerntet und in 80 ml 1 × Lysepuffer [50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,2 mM MgCl₂, 10 mM Imidazol, 30 mM ß-Mercaptoethanol] resuspendiert, das mit 1 mg/ml Aprotinin und 1 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) als Proteaseinhibitoren versetzt ist. Nach der French-Press wird die Suspension durch eine Zentrifugation bei 35 000 × g für 30 Minuten bei 4°C in einem Sorvall SS-34 Rotor geklärt. GPAR1 wird mittels des His₆ Affinitätsanhangs mittels Ni²⁺-NTA Agarose (im Handel erhältlich von Qiagen) gereinigt. Das wie oben beschrieben hergestellte Zelllysat wird über Nacht mit 2,5 ml Ni²⁺-NTA Agarose bei 4°C mit sanftem Schütteln inkubiert. Nach dem Packen in eine geeignete Säule (beispielsweise BioRad Econocolumn, 1,5 × 15 cm, erhältlich von BioRad, Hercules, CA, USA) wird die Agarose mit 100 ml 1 × Lysepuffer, 100 ml EtOH Waschpuffer [10 mM Tis/HCl, pH 8,0, 60 mM NaCl, 0,2 mM MgCl₂, 10 mM Imidazol, 30 mM ß-Mercaptoethanol, 30 % Ethanol], gefolgt von weiteren 100 ml Lysepuffer ohne der Zugabe der Proteaseinhibitoren gewaschen. Die Säule wird für 30 Minuten bei 4°C mit 5 ml Elutionspuffer [50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 2,5 M NaCl, 0,5 M Imidazol] inkubiert, bevor eluiertes gereinigtes GPAR1 Fusionsprotein gewonnen wird. Das Eluat wird gegen Tris/Acetat Puffer [50 mM Tris/Acetat pH 7,3, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl₂] dialysiert. Für eine Langzeitlagerung wird ein gleiches Volumen an 100 % Glycerin zur gereinigten GPAR1 Präparation gegeben und die Aliquots werden bei –80°C gelagert.
Analyse von gereinigtem GPAR-1
Rekombinantes GPAR-1 wird durch SDS-PAGE auf 7,5 % Acrylamidgelen (Laemmli (1970) Nature 227, 680–685) analysiert. Das GPAR1 Protein wird für 1 Stunde bei 200 V zusammen mit geeigneten Molekulargewichtsmarkern einer Elektrophorese unterzogen (beispielsweise Benchmark Proteinleitermolekulargewichtsmarker, die von Life Technologies erhältlich sind oder Proteinmolekulargewichtsmarker, die von Amersham Pharmacia Biotech erhältlich sind).
Für die Immunblots und die Detektion der Biotinmodifikation von GPAR1 werden die Proteine nach der Elektrophorese auf eine Nitrocellulosemembran transfiziert (Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350–4354). Nach dem Waschen der Membran und der Blockierung der unspezifischen Proteinbindung mit Blockierungspuffer [Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1 % Triton X-100, 1 % Rinderserumalbumin (BSA)] wird eine Membran mit einem polyklonalen Kaninchen anti-ß-Galactosidaseantikörper sondiert (erhältlich von 5 Prime_3 Prime, Boulder CO, USA), gefolgt von 3 Waschschritten mit Waschpuffer [PBS, 1 % Triton X-100] und einer Inkubation mit einem durch eine alkalische Phosphatase markierten Schwein-anti-Kaninchen Antikörper, der 1/200 in Blockierungspuffer verdünnt ist. Die andere Membran wird mit einem Konjugat aus alkalischer Phosphatase-Streptavidin sondiert, das 1/200 in Blockierungspuffer verdünnt ist. Alle Inkubationen erfolgen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem dreimaligen Waschen mit Waschpuffer und einmal mit alkalischem Phosphatasepuffer [100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂), wird die Farbentwicklung mit Nitrobluetetrazolium (NBT) 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) in alkalischem Phosphatasepuffer [330 μg/ml NBT, 165 μg/ml BCIP] für 5 Minuten ausgeführt.
Eigenschaften des gereinigten GPAR1 Proteins
Gereinigtes GPAR1 erscheint als zwei Banden auf der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, was vom verwendeten E. coli Stamm unabhängig ist. Die obere Bande zeigt das erwartete Molekulargewicht von 136 kDa und die Reaktivität mit Streptavidin nach einem Blot auf eine Nitrocellulose membran, was anzeigt, dass sie biotinyliert ist. Die untere Bande zeigt ein scheinbares Molekulargewicht von 127 kDa und ist nicht biotinyliert. Beide Banden sind für ß-Galactosidase immunpositiv. Das Fehlen der Biotinylierung und das kleinere scheinbare Molekulargewicht der zweiten Bande legen nahe, dass sie eine verkürzte Form des Proteins ist, dem der C-terminale Teil fehlt. Diese Annahme wird weiter durch die Tatsache verstärkt, dass die Entfernung des C-terminalen Teils von GPAR1 durch Thrombinbehandlung nur das Vollängenprotein beeinflusst, was zum Auftreten von nur einer Bande bei 127 kDa auf der SDS-PAGE führt. Das Verhältnis des verkürzten zum Volllängenprotein wird gleichbleibend erhalten.
Test der ß-Galactosidaseaktivität
Es wird die Galactosidaseaktivität gemessen, um die Menge an GPAR-1 in einer gereinigten Probe zu messen. Eine gereinigte GPAR1 Probe (25–75 μl) wird zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Nach der Zugabe der Substratlösung [25 mM Tris/Acetat, pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,5 mM MgSO₄, 2,5 mg/ml ONPG, Endkonzentration] auf ein Endvolumen von 200 μl wird die Zunahme der OD₄₀₅ bei Raumtemperatur für 5 bis 30 Minuten aufgezeichnet und als Reaktionsgeschwindigkeit dargestellt wird. Die Menge an ß-Galactosidase, die eine Veränderung der optischen Dichte von 0,001 OD/min ergibt, wird als 1 Einheit definiert. Die OD Entwicklung wird mittels eines Thermomax Mikrotiterplattenlesegeräts unter Verwendung von SOFTmax verfolgt (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
Kalibriering der ß-Galactosidasefarbreaktion
Um den Test zu kalibrieren und eine Beziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Konzentration der ß-Galactosidase zu etablieren werden 75 μl einer Standardlösung, die 35 ng/ml bis 10 mg/ml ß-Galactosidase enthält (erhältlich von Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz) unter den oben erwähnten Bedingungen gemessen und die OD₄₀₅ Entwicklung wird für 30 Minuten aufgezeichnet.
Eine Dosis-Antwort-Kurve mit ß-Galactosidase zeigt, dass 1 pmol an ß-Galactosidase zu 819 Einheiten äquivalent ist, wie dies oben definiert ist. Eine Einheit ist somit zu einer Konzentration von 16,3 mM ß-Galactosidase in der Probe äquivalent. Die Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Konzentration von ß-Galactosidase ist bis zu 1,2 OD₄₀₅/min linear, was 20 nM ß-Galactosidase entspricht.
Immobilisierung von GPAR1
GPAR1 wird auf der Oberfläche von Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Partikeln (SA-PMP's, im Handel erhältlich von Promega, Madison, WI, USA) wie folgt immobilisiert. 25 μl SA-PMPs in Suspension werden dreimal mit 1 ml PBS gewaschen. 250 Einheiten an GPAR1 werden in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS zugegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit konstantem Schütteln inkubiert. Nach dem dreimaligen Waschen mit 1 ml PBS werden die GPAR1/SA-PMPs in 100 μl PBS resuspendiert und auf ß-Galactosidaseaktivität durch die Zugabe von 100 μl Substratlösung und einer Inkubation für 2 Minuten bei Raumtemperatur getestet. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 50 μl an 0,5 M EDTA, pH 8 gestoppt und der gefärbte Überstand wird von den Partikeln abgetrennt. Das Ausmaß der Farbreaktion wird photometrisch bei 405 nm gemessen. Etwa 95 % der gereinigten ß-Galactosidaseaktivität, wird auf SA-PMPs immobilisiert, während nur etwa 20 % der gesamten ß- Galactosidaseaktivität, die vom GPAR1 Konjugat exprimiert wird, auf den SA-PMPs immobilisiert werden können, vermutlich durch die Bildung einer C-terminalen Verkürzung von GPAR1.
Zur Immobilisierung von GPAR1 auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (erhältlich von Labsystems, Helsinki, Finnland), werden 125 Einheiten an GPAR1 pro Vertiefung in einem Gesamtvolumen von 100 μl PBS zugegeben und die Platten werden bei 4°C für 2 bis 4 Tage gelagert bis sie verwendet werden. Nach der Immobilisierung werden 75 μl der Lösung wie oben beschrieben auf ß-Galactosidaseaktivität gemessen, um die Immobilisierungseffizienz zu bestimmen. Die Immobilisierungseffizienzen sind im Bereich von 70 bis 75 % konsistent, wobei die Immobilisierungseffizienz nach 2 Tagen Inkubation bei 4°C am höchsten ist.
Humanthrombin wird vorher präpariert und durch Stone und Hofsteenge (1986, Biochemistry 25, 4622–4628) charakterisiert. Mikrotiterplatten mit immobilisiertem GPAR1 werden dann schnell dreimal mit PBS gewaschen, um das ungebundene GPAR1 Protein zu entfernen. Proteaseproben (dreifach) werden unmittelbar in 100 μl Enzympuffer [50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % PEG 6000, 0,02 Tween 20] zugegeben. Beispielsweise wird Thrombin zum immobilisierten GPAR1 in Konzentrationen zugegeben, die von 50 fM bis 10 pM in 100 μl Enzympuffer reichen. Um sicherzustellen, dass die Thrombinaktivität gemessen wird, werden identische Kontrollproben mitaufgenommen, die keine Zugabe von 5 pM Hirudin oder 5 pM PN-1 erhalten.
Die Mikrotiterplatten werden bei 37°C für 3 Stunden in einer feuchten Atmosphäre inkubiert, um die Proteasespaltung von GPAR1 zu erlauben, was zu einer Freisetzung der ß-Galactosidase in das Medium führt. Das Probenmedium (75 μl) wird dann in eine frische Platte überführt und auf ß-Galactosidaseaktivität getestet, wie dies oben beschrieben ist, indem man die optische Veränderung für 15 Minuten bei 405 nm misst. Die Daten werden als Picomol ß-Galactosidasefreisetzung gegen die Proteasekonzentration und Zeit in Minuten ausgedrückt. Die Empfindlichkeit der immobilisierten GPAR1 gegenüber der Spaltung durch verschiedene Proteasen wird durch die Berechnung der anfänglichen Steigungen evaluiert, die aus den Dosis-Antwortkurven erhalten werden, die für jede Protease ausgeführt werden.
Unter diesen Bedingungen sind 50 fM Thrombin mit einem linearen Bereich bis zu 250 fM detektierbar. Der Test ist über 0,5 bis 1 pM gesättigt. Die anfängliche Steigung, wie sie aus den Werten innerhalb der ersten linearen Phase berechnet wird, zeigt, dass unter diesen Testbedingungen 2,6 Mol ß-Galactosidase pro Minute pro Mol Thrombin freigesetzt werden. In Gegenwart von rekombinantem Hirudin oder Rattenproteasenexin-1 (Markwardt (1957) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 308, 147–156, Baker et al. (1980), Cell 21, 37–45, PN-1, Sommer et al. (1989) Gene 85, 453–459), die beide starke Thrombininhibitoren sind wird das Signal des GPAR1 Tests fast vollständig aufgehoben, was die starke Abhängigkeit von der proteolytischen Aktivität von Thrombin zeigt.
Um als Kontrolle sicherzustellen, dass die unterschiedlichen Proteaseproben nicht die ß-Galactosidaseaktivität beeinflussen (beispielsweise durch die Zerstörung der Enzymaktivität) werden 90 Einheiten GPAR1 pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen ohne Streptavidinbeschichtung mit 100 μl Enzympuffer inkubiert, die die Proteasen in verschiedenen Konzentrationen enthalten. Die Kontrollproben werden auf ß-Galactosidaseaktivität auf dieselbe Weise getestet, wie die Proben, die mittels der Streptavidin-beschichteten Mikkotiterplatten getestet werden.
Zusammengefasst ist der Test auf PAR Spaltmoleküle mittels des Fusionsproteins GPAR1 ausgesprochen sensitiv und erlaubt die Detektion von Thrombin bei Konzentrationen bis zu 50 fM, zumindest zehnfach sensitiver als die vorher verwendeten Verfahren, die auf dem spezifischen chromogenen Substrat S2238 beruhen (Chromogenix, Mölndal, Schweden).
Beispiel 2: Spezifität des GPAR1 Tests und die Identifizierung der PAR1 Aktivatoren und Inaktivatoren
Um zu zeigen, dass die Thrombinspaltung an der erwarteten Spaltstelle stattfindet, wird eine mutierte Form von GPAR1 erzeugt, worin eine R⁴⁵S Mutation die Spaltung durch Trypsin-ähnliche Serinproteasen verhindert. Die Expressionsvektoren für das mutierte GPAR1 werden durch das Ausschneiden des PAR1 Fragments aus pGPAR1 (siehe Beispiel 1) und den Ersatz mit einem mutierten für PAR1 kodierenden DNA Fragment erzeugt. Das mutierte PAR1 Konstrukt trägt eine Punktmutation am Codon für den ersten Aminosäurerest der Aktivierungsstelle, was zu einem Einbau eines Serins anstelle eines Arginins führt, was diese Stelle gegenüber einer Spaltung durch Trypsin-ähnliche Serinproteasen einschließlich Thrombin resistent macht. Das mutierte für PAR1 kodierende Fragment wird aus pBSmThR mittels 5'-CTCATGTACAGTGGAGGTTCAGGAGGCTCGAGCCAGCCAGAATCAGAGAGGACAGATGCTACGGTGAACCCCAGCTCATTCTTTCTAAGGAATC-3' (SEQ ID Nr. 8) und 5'-GAGAGAACTAGTGGGGCTGGTCAGATATCCGGAG-3' (SEQ ID Nr. 4) als Primer hergestellt. Der Austausch des Arg⁴⁵ Rests gegen Serin ergibt das an der Aktivierungsstelle mutierte Fusionsprotein GPAR1^R45S.
Die Proteasetests werden wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt, außer dass sowohl GPAR1 als auch das mutierte GPAR (GPAR1^R45S) zur vergleichenden Analyse verwendet werden. Die Inkubation von humanem Thrombin (Stone und Hofsteenge, 1986) mit immobilisierten GPAR1^R45S führt zu einer dramatischen Reduktion der detektierten Signalmutante, was zeigt, dass Thrombin tatsächlich GPAR1 vorwiegend nach Arg⁴⁵ spaltet. Es wird mehr als 30 000 fach mehr Thrombin benötigt, um eine Reaktion mit GPAR1^R45S auszulösen. Die anfängliche Geschwindigkeit für die Thrombinreaktion verringert sich von 2,6 mol_{ß-Galactosidase}/(mol_Thrombin × min) auf etwa 70 nmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Thrombin × min) (Tabelle 1). Dieses Signal kommt nicht durch eine kontaminierende Aktivität in der Thrombinpräparation zustande, da es in Gegenwart von Hirudin fehlt, einem spezifischen Thrombininhibitor. Die geringere Spaltgeschwindigkeit von GPAR1^R45S legt das Vorkommen einer zweiten Spaltstelle für Thrombin in Maus PAR1 nahe, das mit einer geringeren Effizienz gespalten wird. Humanes PAR1 enthält bekanntermaßen eine zweite Thrombinspaltstelle, die 5 Reste C-terminal der Aktivierungsstelle liegt (Vu et al. (1991), Parry et al (1996)).
Proteaseprofil von GPAR1 und GPAR1^R45S
Nach der Demonstration, dass der GPAR1 Test die Fähigkeit von Thrombin reflektiert, PAR1 zu spalten und zu aktivieren, wird der Effekt von anderen Proteasen auf GPAR1 und des GPAR1^R45S mit mutierter Aktivierungsstelle evaluiert. Die folgenden zusätzlichen Proteasen werden im wesentlichen wie oben beschrieben getestet: Rinderchymotrypsin vom Typ II (Sigma, St. Louis, MO, USA), aktiviertes Protein C vom Rind (ICN, Costa Mesa, CA, USA), Humanplasmin, humane Urokinase mit hohem Molekulargewicht und Rindertrypsin (alle erhältlich von Fluka, Buchs, Schweiz), Elastase von humanen Leukozyten (Merck Darmstadt, Deutschland) und humanes Einzelketten t-PA (Calbiochem La Jolla, CA, USA).
In den Fällen von Trypsin und Plasmin ist das maximale Signal sogar höher als das für Thrombin. Mit GPAR1^R45S als Substrat werden die Dosis-Antwortkurven für Trypsin und Plasmin im Vergleich zu GPAR1 leicht nach rechts verschoben und die anfänglichen Geschwindigkeiten nehmen ab (Tabelle 1), was zeigt, dass die Spaltung an der PAR1 Aktivierungsstelle durch diese Proteasen bevorzugt wird. Daher sind Trypsin und Plasmin klar detektierbar und ihre Effizienz ist gegenüber einer Mutation der Aktivierungsstelle empfindlich (Tabelle 1), was ihre Fähigkeit zur Aktivierung von PAR1 bestätigt (Ishihara et al. (1997), Vu et al. (1991), Parry et al. (1996)). Keine der getesteten Proteasen stellt sich als so stark wie Thrombin heraus.
Chymotrypsin und Elastase, Proteasen mit einem Vorzug für die Spaltung nach hydrophoben Resten, zeigen keine Bevorzugung für die Spaltung von GPAR1 gegenüber GPAR1^R45S und können daher als potentielle Inaktivatoren von PAR1 klassifiziert werden. Chymotrypsin und Elastase sind sogar effektiver, wenn sie mit immobilisiertem GPAR1^R45S inkubiert werden (Tabelle 1).
Die zwei getesteten Plasminogenaktivatoren sind jeweils unfähig zur Spaltung von GPAR1 mit beträchtlichen Geschwindigkeiten und scheinen so nicht bei der PAR1 Signalbildung oder Regulation beteiligt zu sein (Tabelle 1). Nur bei der höchsten gestesteten Urokinasekonzentration wird ein marginales Signal erhalten.
Sowohl Thrombin als auch aktiviertes Protein C sind Aktivatoren von PAR1 (Parry et al. (1996)). Von aktiviertem Protein C wurde im vorliegenden Test gezeigt, dass es nur GPAR1 spaltet und gegenüber immobilisiertem GPAR^R45S fast inaktiv ist. Die Aktivität von aktiviertem Protein C ist etwa 1000 fach geringer im Vergleich zu Thrombin. Um zu testen, ob die von aktiviertem Protein C resultierende Aktivität von einer Kontamination der Präparation mit Thrombin herrührt, wird aktiviertes Protein C mit immobilisiertem GPAR1 in Gegenwart von Hirudin getestet. In Gegenwart von Hirudin wird das Signal, das von aktiviertem Protein C resultiert, vollständig aufgehoben (Tabelle 1) und beruht so höchstwahrscheinlich auf einer Thrombinkontamination der Präparation (Tabelle 1) (Parry et al. (1996)).
Bei höheren Konzentrationen spalten Trypsin, Plasmin, Elastase und Chymotrypsin GPAR1 und GPAR1^R45S nicht nur in der PAR1 Domäne, sondern auch in der ß-Galactosidasedomäne, was eine Abnahme des Signals sogar unter das Hintergrundsignal verursacht. Jedoch können diese Proteasen erfolgreich in einem geringeren Konzentrationsbereich gemessen werden, was die breite Anwendung dieser Tests zeigt.
Um zu evaluieren, bei welchen Konzentrationen die unterschiedlichen Proteasen den Test durch die Zerstörung der ß-Galactosidaseaktivität beeinflussen können, wird GPAR1 mit diesen Proteasen ohne vorherige Immobilisierung inkubiert und die verbleibende ß-Galactosidaseaktivität wird wie oben in Beispiel 1 beschrieben gemessen. Keine der untersuchten Proteasen verursacht eine Verringerung in der ß-Galactosidaseaktivität in Konzentrationen unter 100 pM. Die anfänglichen Steigungen der Dosis-Antwortkurven, die unter dieser kritischen Konzentration erzeugt wurden, zeigen, dass die Zerstörung der ß-Galactosidase nicht zu den Daten beiträgt, die in diesem Testformat erhalten werden.
Daher ist in der Zusammenfassung der Test zur Detektion einer spezifischen Thrombinspaltstelle brauchbar. Der Test ist auch ausreichend empfindlich zur Detektion von anderen Proteasen als Thrombin und an anderen Spaltstellen als der Thrombinspaltstelle, wobei er die Detektion und Identifizieurng von potentiellen PAR1 Aktivatoren und Inaktivatoren erlaubt. Falls die Thrombinaktivität spezifisch in einem Gemisch aus Proteasen detektiert werden muss, kann Thrombin als die Aktivität gemessen werden, die spezifisch durch Hirudin gehemmt wird.
Beispiel 3: Identifizierung von PAR-2 Aktivatoren und Inaktivatoren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Galactosidase-PAR2 (GPAR2) Fusionsproteins und dessen Verwendung in den Tests, die zur Detektion von PAR2 Aktivatoren und Inaktivatoren angelegt sind.
Die Expressionsvektoren für GPAR-2 oder GPAR-2^R34S werden durch Ausschneiden des PAR1 Fragments aus pGPAR1 mit Xhol und Spüel (siehe Beispiel 1) und den Ersatz des ausgeschnittenen Fragments mit einem DNA Fragment hergestellt, das für die extrazelluläre Domäne des Maus PAR-2 oder dessen Aktivierungsstellenmutante kodiert. Die für die Exodomäne des Maus PAR2 kodierende Sequenz wird durch PCR mittels der synthetischen DNA Oligonukleotide 5'-CACACATGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGCTCGAGCGAGAACCTTGCACCGGGACGCAACAACAGTAAAGGAAGAAGTCTTATTGGCAGATTAGAAACCCAGCCTCCAATCACTG-3' (SEQ ID Nr. 9) und 5'-CACACAACTAGTGACCGTGGTCAGCTTCCCGGTGAGGATGGACGCAGAGAACTCATCGATGGAAAAGCCTGGTTCTACCGGAACCCCTTTCCCAGTGATTGGAGGCTGGGTT-3' (SEQ ID Nr. 10) als Matrizen hergestellt. Die PAR2 Mutante an der Aktivierungsstelle wird auf dieselbe Weise hergestellt, aber anstelle des Oligonukleotids der SEQ ID Nr. 9 wird ein ähnliches Oligonukleotid verwendet, worin das unterstrichene AGA durch AGC ersetzt ist. Die Annelierung der geeigneten zwei Oligonukleotide, die an ihren 3'-Enden komplementär sind, ergibt eine partiell doppelsträngige Matrize, die in einer PCR Reaktion verwendet wird. Alle anderen Techniken werden ausgeführt, wie dies oben in Beispiel 1 beschrieben ist. Die DNA Sequenz des entstehenden Klons wird durch DNA Sequenzierung verifiziert.
GPAR2 wird im E. coli Stamm SCS110 (Stratagene, La Jolla, CA, USA) oder M15 [pREP4] (Qiagen) exprimiert. Wie bei GPAR1 ist auch ein verkürztes GPAR2 in der gereinigten Fraktion von GPAR2 vorhanden. Das Verhältnis der verkürzten Proteine zu den Vollängenproteinen stimmt auch mit dem überein, das mit GPAR1 erhalten wurde, wie auch die Immobilisierungseffizienz zur Durchführung des Tests. Bei den in Beispiel 2 beschriebenen Spaltungstests aber unter Verwendung von immobilisierten GPAR2 und GPAR2^R34S Fusionsproteinen wird gezeigt, dass GPAR2 das bevorzugte Substrat für Trypsin bei einer Anfangsgeschwindigkeit von 370 mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Trypsin × min) (Tabelle 1) ist. Im Vergleich dazu wird eine anfängliche Geschwindigkeit von 97 mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Trypsin × min) für GPAR1 (Tabelle 1) detektiert. Man benötigt etwa neunfach mehr Trypsin, um das an der Aktivierungsstelle mutierte GPAR2^R34S zu spalten. Plasmin spaltet GPAR2 zweifach effizienter als GPAR2^R34S, aber nur mit einer 560 fach geringeren Geschwindigkeit als Trypsin (Tabelle 1). Chymortrypsin und Ealstase zeigen eine geringe Präferenz für Wildtyp GPAR2 gegenüber GPAR2^R34S. Chymotrypsin und Elastase spalten GPAR2 mit einer geringeren Geschwindigkeit als GPAR1. Man erhält kein Signal mit aktiviertem Protein C, den getesteten Plasminogenaktivatoren oder Thrombin (Tabelle 1).
Beispiel 4: Identifizierung von PAR-3 Aktivatoren und Inaktivatoren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Galactosidase-PAR3 (GPAR3) und dessen Verwendung in Tests, die zur Detektion von PAR3 Aktivatoren und Inaktivatoren entworfen werden.
Die Expressionsvektoren für GPAR-3 oder GPAR3^K3 ^7S werden durch Ausschneiden des PAR1 Fragments aus pGPAR1 mit Xhol und Spel (siehe Beispiel 3) und den Ersatz des ausgeschnittenen Fragments durch ein DNA Fragment hergestellt, das für die extrazelluläre Domäne von PAR-3 der Maus oder die Aktivierungsstellenmutante kodiert. Die für die PAR3 Exodomäne der Maus kodierende Sequenz wird durch PCR mittels folgender synthetischer DNA Oligonukleotide als Matrize hergestellt: 5'TGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGCTCGAGCGGCATAAATGTTTCAGACAACTCAGCAAAGCCAACCTTAACTATTAAGAGTTTTAATGGGGGTCCCCAAAATACCTTTGAAGAATTCCCACTTTCTGACATAGAGG-3' (SEQ ID Nr. 11) und 5'-ACTAGTACTTAAGGAACTTCTCAGGTATCCTATGGTAGCATTATTCACGTGGAGAGTTGAAATACTGTCCTCGGGACACTCCGCTTTTATAGTTGTGGTGGCTCCTGTCCAGCCC TCTATGTCAGAAAGTGGGA-3' (SEQ ID Nr. 12). Die PAR3 Aktivierungsstellenmutante wird auf dieselbe Weise hergestellt, aber anstelle des Oligonukleotids SEQ ID Nr. 11 wird ein ähnliches Oligonukleotid verwendet, worin das unterstrichene AAG durch TCG ersetzt ist. Alle anderen Techniken werden wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Wie bei GPAR1 und GPAR2 ist ebenfalls ein verkürztes GPAR3 in der gereinigten Fraktion von GPAR3 vorhanden. Das Verhältnis der verkürzten Proteine zu den Volllängenproteinen ist zu dem konsistent, das mit GPAR1 erhalten wird, wie auch die Immobilsierungseffizienz zur Durchführung des Tests.
Die Spaltungstests werden wie in Beispiel 3 aber unter Verwendung von immobilisierten GPAR3 und GPAR3^K3 ^7S Fusionsproteinen ausgeführt. PAR3 ist der Hauptthrombinrezeptor in Mausblutplättchen (Ishihara et al. (1997), Kahn et al. (1998) Nature 394, 690–694) und dementsprechend wird auch das immobilisierte GPAR3 Fusionsprotein effizient durch Thrombin (Tabelle 1) gespalten. Jedoch ist die anfängliche Geschwindigkeit von 41 mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Thrombin × min) etwa sechsfach geringer als die für GPAR1. Die Aktivierungsstellenmutante GPAR3^K37S zeigt eine Geschwindigkeit für die ß-Galactosidasefreisetzung durch Thrombin von 3,4 mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Thrombin × min) und zeigt so das Vorkommen einer zweiten möglichen Thrombinspaltstelle, die mit einer höheren Geschwindigkeit gespalten wird, als die zweite Thrombinspaltstelle in PAR1 (Tabelle 1). Wenn Trypsin mit GPAR3 oder GPAR3^K37S inkubiert wird, beobachtet man nur eine geringe Präferenz für die Spaltung von GPAR3 (Tabelle 1). Ein stärkerer Effekt der Mutation in der Aktivierungsstelle von GPAR3 wird mit Plasmin beobachtet, das etwa 120-fach weniger aktiv als Thrombin ist (Tabelle 1). Der Gewebeplasminogenaktivator zeigt nur ein sehr schwaches Signal mit GPAR3, das verringert wird, wenn GPAR3^K37S verwendet wird und somit eine bevorzugte Spaltung an der K37-S38 Bindung nahelegt (Tabelle 1). Die Werte für uPA sind zu gering, um einen ähnlichen Unterschied zu detektieren (Tabelle 1). Es gibt keine Präferenz für GPAR3 für Chymotrypsin oder Elastase (Tabelle 1). Aktiviertes Protein C spaltet weder GPAR3 noch GPAR3^K37S in einem nennenswerten Ausmaß in Gegenwart von Hirudin (Tabelle 1).
Beispiel 5: Identifizierung von PAR-4 Aktivatoren und Inaktivatoren
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Galactosidase-PAR4 (GPAR4) Fusionsproteins und dessen Verwendung in Tests, die zur Detektion von PAR4 Aktivatoren und Inaktivatoren ausgelegt sind.
Die Expressionsvektoren für GPAR-4 oder GPAR3^K37S werden durch das Ausschneiden des PAR1 Fragments aus pGPAR1 mit Xhol und Spel (siehe Beispiel 3) und den Ersatz des ausgeschnittenen Fragments durch ein DNA Fragment hergestellt, das das Fragment für die extrazelluläre humane PAR-4 Domäne oder die Aktivierungsstellenmutante kodiert. Die für das humane PAR4 Exodomänenfragment kodierende Sequenz wird durch PCR mittels der synthetischen DNA Oligonukleotide 5'CACACACTCGAGCGGCGGCACCCAGACGCCCAGCGTCTACGAGGAGAGCGGGAGCACCGGAGGTGGTGATGACAGCACGCCCTCAATCCTGCCTGCCCCCCGCGGCTACCCAGGC-3' (SEQ ID Nr. 13) und 5'-TGTGTGACTAGTCCTGGTGGGCACCCAGCCCAGAAGCAGTGCCCGTGAGCTGTCCGGAAGCTCCAGGGTGTCACTGTCATTGGCACAGACTTGGCCTGGGTAGCCGCGGGGGG-3' (SEQ ID Nr. 14) als Matrizen hergestellt. Die PAR4 Aktivierungsstellenmutante wird synthetisch hergestellt und ist zum PAR4 Exodomänenfragment ähnlich, aber das in SEQ ID Nr. 13 unterstrichene CGC wird durch AGC ersetzt. Alle anderen Techniken werden wie in Beispiel 3 beschrieben ausgeführt. Wie bei GPAR1, GPAR2 und GPAR3 ist auch ein verkürztes GPAR4 in der gereinigten Fraktion von GPAR4 vorhanden. Das Verhältnis von verkürzten Proteinen zu Vollängenproteinen stimmt mit dem überein, das mit GPAR1 erhalten wird.
Proteaseprofil für GPAR4 und GPSR4^R47S
GPAR4 und GPAR4^R47S werden auch mit demselben Satz an Proteasen unter denselben Bedingungen wie für die anderen GPARs getestet. GPAR4 wird effizient durch Trypsin mit einer Geschwindigkeit von 15 mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Trypsin × min) (Tabelle 1) gespalten. Im Vergleich zu den höchsten Spaltungsgeschwindigkeiten, die mit GPAR1, GPAR2 und GPAR3 beobachtet werden, ist die Spaltungsgeschwindigkeit von GPAR4 mindestens eine Größenordnung geringer (Tabelle 1). Thrombin, das ein bekannter Aktivator von PAR4 ist (Kahn et al. (1998), Xu et al. (1998)) spaltet GPAR4 mit einer Geschwindigkeit von 4,3 mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Thrombin × min), was immer noch drei Größenordnungen geringer ist als mit GPAR1 (Tabelle 1). Jedoch sind sowohl Trypsin als auch Thrombin deutlich weniger effektiv, wenn sie mit GPAR4^R47S inkubiert werden, wobei Thrombin ein höheres Maß an Spezifität zeigt (Tabelle 1). Plasmin spaltet sowohl GPAR4 und GPAR4^R47S mit geringer Effizienz, zeigt aber auch eine Präferenz für eine Spaltung an der Aktivierungsstelle von PAR4. Chymotrypsin und Elastase spalten beide Substrate ohne Präferenz für das Wildtypsubstrat. Beide Plasminogenaktivatoren wie auch aktiviertes Protein C spalten GPAR4 oder GPAR4^R47S nicht mit beträchtlichen Geschwindigkeiten (Tabelle 1). Im Vergleich zu GPAR1 spalten alle getesteten Proteasen GPAR4 und GPAR4^R47S mit viel geringeren Geschwindigkeiten (Tabelle 1).
Beispiel 6: Vergleichende Analyse von PAR Aktivatoren und Inaktivatoren
In diesem Beispiel erlaubt die Verwendung von extrazellulären PAR Domänen des Wildtyps und der Mutante die Analyse der proteolytischen Regulation von unterschiedlichen Vertretern der PAR Familie und liefert auch eine neues und hochempfindliches Werkzeug, um bisher unbekannte PAR Spaltungsproteasen zu identifizieren.
Eine vergleichende Analyse für eine proteolytische Spaltung von PAR1, PAR2 und PAR 3 der Maus und PAR4 vom Menschen wird unter Beteiligung der mutierten und nicht mutierten GPAR Fusionsproteine durchgeführt. Die Tests werden im wesentlichen ausgeführt, wie es oben beschrieben ist, aber mit der Zugabe von verschiedenen Proteasen.
Thrombin
Thrombin spaltet GPAR1 (2,6 mol_{ß-Galactosidase}/(mol_Thrombin min), GPAR3 (410 mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Thrombin min) und GPAR 4 (4,3 mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Thrombin × min), insbesondere an der proteolytischen Aktivierungsstelle, das heißt die Spaltung wird durch die Mutation der Aktivierungsstelle (Tabelle 1) gestört. Im Gegensatz dazu kann keine Spaltung von GPAR2 beobachtet werden (Tabelle 1).
Trypsin
Trypsin spaltet alle Rezeptorfusionsproteine mit einer geringen Spezifität an der Aktivierungsstelle mit Ausnahme einer deutlichen Präferenz von Trypsin für die Spaltung an der Aktivierungsstelle von GPAR2 (Tabelle 1). Die mutierten Formen werden weniger effizient gespalten, was das Protential von Trypsin anzeigt, alle PARs zu aktivieren. Während 6 potentielle Spaltstellen für Trypsin in der Exodomäne von PAR2 gefunden werden, führt die Mutation der Aktivierungsstelle zu einer neunfachen Reduktion in der Effizienz der Trypsinspaltung von GPAR2. Die Mutation der Aktivierungsstelle der anderen GPAR Fusionsproteine führt nicht zu einer so starken Verringerung der Spaltung durch Trypsin, was deutlich zeigt, dass PAR2 für die Spaltung durch Trypsin an dieser Stelle optimiert ist (Tabelle 1).
Aktiviertes Protein C und Plasminogenaktivatoren
Weder aktiviertes Protein C (in Gegenwart von Hirudin) noch die Plasminogenaktivatoren spalten eines der GPAR Fusionsproteine mit beträchtlichen Geschwindigkeiten.
Plasmin
Plasmin, die fibrinolytische Protease, die aus Plasminogen durch die Wirkung der Plasminogenaktivatoren erzeugt wird, spaltet alle nicht mutierten GPAR Proteine mi einer Geschwindigkeit, die immer noch durch die Mutation der Aktivierungsstelle beeinflusst wird, aber mindestens zehnfach geringer im Vergleich zu Trypsin (Tabelle 1). Die schwache Effizienz mit der Plasmin zur Spaltung der Thrombinsensitiven PARs fähig ist, erlaubt es möglicherweise, eine Rolle bei der Modulation von PAR1 vermittelten Reaktionen in Blutplättchen zu spielen, die keine aktivierten PARs durch die Synthese und den Membraneinbau von neuen Rezeptormolekülen ersetzen können (Molino et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 6011–6017). Die schwache Fähigkeit von Plasmin, GPAR2 an der Aktivierungsstelle zu spalten, steht im Gegensatz zu den Befunden von Fox et al., die mittels eines Peptidylchlormethaninhibitors auf der Grundlage der vier Reste stromaufwärts der Aktivierungsstelle von PAR2 festgestellt haben, dass sowohl Thrombin als auch Plasmin keine Aktivatoren von PAR2 sein dürften (Fox et al. (1997) FEBS Lett 417, 267–269). Jedoch kann dieser Test nur die durch die vier Reste stromaufwärts der Aktivierungsstelle vermittelten Wechselwirkungen detektieren, während die vorliegende Bestimmung zusätzliche N-terminale Sequenzen der extrazellulären PAR2 Domäne verwendet, ein biologisch relevanteres Substrat.
Chymotrypsin und Elastase
Es wurde auch die Spaltung der GPAR Fusionsproteine durch Elastase und Chymotrypsin untersucht, zwei Proteasen, die eine Präferenz für eine Spaltung nach hydrophoben Resten besitzen. GPAR1 wird gut durch beide Enzyme gespalten und die Mutante GPAR1^R45S wird mit einer noch größeren Effizienz gespalten, was deutlich zeigt, dass beide Proteasen andere Stellen als die Aktivierungsstelle erkennen und spalten (Tabelle 1). Die erhöhte Spaltung von GPAR1^R45S kann durch die Einführung einer zusätzlichen Spaltstelle bei der Erzeugung der R⁴⁵S Mutation erklärt werden. Im fall von GPAR2 und GPAR2^R34S gibt die Elastase ein etwa fünffach geringeres Signal als mit GPAR1 und noch geringer für die mutierte Form (Tabelle 1). Chymotrypsin spaltet auch GPAR2 besser als die Mutante: Das Signal ist etwa zehnfach geringer als mit GPAR1 und ähnlich zu dem mit GPAR3 und GPAR4 und ihrer Mutanten (Tabelle 1). Die Signale für Elastase und Chymotrypsin variieren unter oder um die 10mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Protease × min) und unter oder um die 100 mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Protease × min) (Tabelle 1). Die geringeren Spaltungsgeschwindigkeiten reflektieren möglicherweise die Spaltung außerhalb der PAR-Domänen. Während die Inaktivierung von PAR2 durch Elastase nicht ausgeschlossen werden kann, zeigen die vorliegenden Daten, dass PAR4 kein Substrat für dieses Enzym ist. Chymotrypsin spaltet GPAR1 mit einer Geschwindigkeit von 58 mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Thrombin × min), was eine chymotryptische Inaktivierung von PAR1 nahelegt.
Beispiel 7: Messung von aktivem Thrombin in der cerebrospinalen Flüssigkeit von Patienten nach schwerem Kopftrauma
Die cerebrospinale Flüssigkeit (CSF) ist eine Flüssigkeit, die Neuronen und Gliazellen im Nervensystem umgibt. Sie ist vom Blutsystem durch die Blut-Hirn-Schranke getrennt und die Solutzusammensetzung wird gut kontrolliert und aufrechterhalten, um eine normale neuronale Funktion zu erlauben. Kopfverletzungen können zu einer temporären Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke führen und so zum Einstrom von Blutkomponenten, einschließlich Thrombin, in das Gehirn.
Von Thrombin wurde beschrieben, dass es sowohl das Überleben der Zellen als auch den Zelltod von Neuronen und Astrocyten nach einem Glucosemangel oder einem oxidativem Stress beeinflusst (Smith-Swintosky et al, 1995, Vaughan et al. 1995, Pike et al. 1996). Die Thrombinzugabe zu kultivierten Neuroblastomzellen oder Neuronen ruft einen sehr schnellen Rückzug von Neuriten hervor (Gurwitz und Cunningham, 1988, Grand et al., 1989, Baird und Raper, 1995). Diese Thrombineffekte finden in picomolaren Konzentrationen statt (Gurwitz und Cunningham, 1988).
In einer vorherigen Studie mittels des pNA-Substrats S2238 findet sich kein aktives Thrombin in der CSF (Sminova et al, 1997). Jedoch ist es mittels des Tests der vorliegenden Erfindung möglich, Thrombin in subpicomolaren Mengen zu messen und es wurden erfolgreich Thrombinmengen in der CSF gemessen.
Proben von humanen cerebrospinalen Flüssigkeiten (CSFs) werden vom Kantonspital, Basel erhalten. Die Proben werden aus Patienten mit schwerem Kopftrauma, einem Patienten mit einer subarachnoiden Hämorrhagie und diagnostiziertem Hirntod und einem gesunden Patienten erhalten. Die Proben werden zwischen 3 Stunden und 17 Tagen nach der Verletzung erhalten und zum Vergleich wird auch eine Blutprobe von einem Patienten bereitgestellt.
Messung des Blutgehalts
Die Menge an kontaminierendem Blut wird durch Messen der OD₄₀₅ von verschiedenen Verdünnungen der Proben vor dem Start des GPAR Tests bestimmt. Die Steigungen der Kurven der OD₄₀₅ gegen die reziproke Verdünnung werden bestimmt und verglichen. Der Wert für die Blutprobe wird als 100 definiert, wobei der Wert für die Kontroll-CSF vom gesunden Patienten als 0 % definiert wird. Es wird eine lineare Beziehung zwischen Blutgehalt und OD₄₀₅ Werten angenommen.
Messung der Thrombinkonzentration
CSF Proben werden seriell in Enzympuffer 1 × EB
[50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 PEG 6000, 0,02 % Tween 20] verdünnt, wobei die Verdünnungen von 1:2 bis 1:30 000 reichen. Nach dem Messen des Blutgehalts werden die verdünnten Proben auf das Vorkommen der Thrombinähnlichen Aktivität dreifach unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen getestet.
Die Steigungen des linearen Teils der Dosis-Antwort-Kurven werden bestimmt und mit der Steigung für den Thrombinstandard verglichen, um die Daten als picomolare Konzentration von Thrombin in der Probe auszudrücken. Aufgrund einer starken intrinsischen Absorption bei 405 nm in Blut kann das ß-Galactosidasesubstrat ONPG nicht für die Blutprobe verwendet werden. Anstelle dessen wird das alternative Substrat Chlorphenolrot-ß-D-galactopyranosid (CPRG, erhältlich von Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz) verwendet, das die Messung der ß-Galactosidaseaktivität bei 590 nm ohne der Wechselwirkung mit der intrinsischen Absorption von Blut verwendet. CPRG wird in derselben Konzentration verwendet, wie ONPG. Der Thrombinstandard wird dementsprechend gemessen.
Die Thrombinkonzentration kann präzise in den CSF Proben bestimmt werden, wie dies durch die Referenzdosis-Reaktionskurve für Thrombin angezeigt wird, die währen der Messung jedes Satzes an 3 Proben mitaufgenommen wird. In der normalen CSF Probe und im Blut werden sehr ähnliche Mengen an Thrombin mit einer Konzentration von jeweils 25 und 29 pM detektiert. In den CSF Proben von Patienten nach einem schweren Kopftrauma wird häufig eine signifikant höhere Menge an Thrombin gefunden, die bei Patient 1 bereits 4 Stunden nach der Verletzung sogar 17 fach höher war als der Normalspiegel und nach 10 Stunden immer noch 5 fach höher. Bei den anderen Patienten wird sowohl eine Zunahme der Thrombinkonzentration über die Zeit beobachtet (Patienten 2, 4), wie auch eine Abnahme (Patient 3). Von den verbleibenden Patienten ist nur eine einzige Probe verfügbar, was keinen direkten Vergleich erlaubt. Von allen Patienten existiert mindestens 1 Probe, die einen erhöhten Thrombinspiegel zeigt, außer die CSF von einem Patienten, die zwei Tage nach der subarachnoiden Hämorrhagie entnommen wurde. In diesem Fall ist der Thrombinspiegel normal, aber die CSF Probe zeigt die höchste Menge an Blutkontamination (∼ 18 %) (Patient 6). Es gibt keine Korrelation zwischen der Menge an Blutkontamination in der CSF und der Thrombinkonzentration. Von einem zusätzlichen Patienten ist eine größere Serie an CSF Proben verfügbar, die zwischen 20 und 280 Stunden nach einer schweren Kopfverletzung entnommen wurden. Während in der ersten Phase nach dem Trauma die Thrombinkonzentration im Bereich von normalem CSF liegt, steigt sie nach 2 Tagen stark auf eine Maximalmenge von 370 pM Thrombin an, die 6 Tage nach dem Trauma erreicht wird. Sogar bis 12 Tage nach dem Trauma wird immer noch ein dreifach erhöhter Thrombinspigel gemessen. Fluktuationen in den Thrombinspiegeln sind leicht ersichtlich, sogar auf einer täglichen Basis, wobei eine starke Zunahme zwischen den Tagen 2 und 3 und eine Abnahme, erneut gefolgt von einer Zunahme zwischen den Tagen 5 und 8 beobachtet wird. Wenn der selbe Test in Gegenwart von Hirudin ausgeführt wird, ist keine ß-Galactosidasefreisetzung detektierbar, was die beobachtete Proteaseaktivität als Thrombin identifiziert.
Zusammengefasst wurde die Thrombinkonzentration in CSF mit Konzentrationen in normalem Blut oder CSF im Bereich von 25 bis 30 pM gemessen und in Fällen von CSF aus Patienten nach einem schweren Kopftrauma in Mengen bis zu 400 pM oder mehr. In allen Fällen, bei denen eine erhöhte Thrombinmenge gemessen wird, beträgt die Thrombinkonzentration mindestens 100 pM. Die hohe Empfindlichkeit des Tests erlaubt die Messung von geringen Mengen an Thrombin in biologischen oder klinischen Proben, einschließlich CSF. Daher erleichtert der Test Studien zur Bestimmung, ob Thrombin ein Risikofaktor bei einer traumatischen Kopfverletzung ist, um den Verlauf der Verletzung in Abhängigkeit der Thrombinspiegel vorherzusagen und um zu bestimmen, ob darauf geachtet werden soll, um die Thrombinaktivitäten in der CSF spezifisch zu blockieren.
Beispiel 8: Messung der Proteaseaktivität und der Protease-hemmenden Aktivität in Gehirnhomogenaten von PN-1 Knockout-Mäusen und heterozygoten oder Wildtypgeschwister eines Wurfes
Der Seinproteaseinibitor PN-1 zeigt ein distinktes temporäres und räumliches Expressionsmuster bei der Entwicklung von Knorpel, Lunge, Haut, Urogenitaltrakt und im zentralen und peripheren Nervensystem (Mansuy et al. 1993). Das Gen für PN-1 wurde bei den Mäusen zerstört, um die vorgeschlagenen Rollen für PN-1 während der Entwicklung und dem Erwachsenen besser zu definieren (Lüthi et al. 1997). Das vorliegende Beispiel zeigt die Messung der Mengen an Protease oder Protease-hemmender Aktivität in Gehirnhomogenaten, die von PN-1 defizienten Mäusen und von heterozygoten und Wildtypgeschwister eines Wurfes erhalten wurden, mittels des Substrats S2238 und des GPAR Tests. Es wurden 14 Tage alte PN-1 Knockout Mäuse und vorher beschriebene Geschwister eines Wurfes (Lüthi et al., 1997) analysiert, die in die C57/B16 Mauslinie (im Handel erhältlich) rückgekreuzt werden.
Präparation von Gehirnhomogenaten
Drei Mäuse von einem Wurf aus rückgekreuzten PN-1 Knockoutmäusen werden betäubt und mit Saccharose perfundiert [10 mM HEPES, pH 7,5, 320 mM Saccharose, 1 mM EDTA, 0,2 % Tween 20]. Die Gehirne werden dann ausgeschnitten und für 45 Sekunden in Saccharosepuffer in einem Verhältnis von 2 ml pro Gehirn mittels eines Polytronhomogenisiergeräts homogenisiert (Kinematica, Luzern, Schweiz). Der Zelldbris wird durch eine Zentrifugation bei 13 000 Upm in einer Heraeus Tischzentrifuge bei Raumtemperatur für 15 Minuten abgetrennt. Der Überstand wird anschließend durch Filtration zuerst durch ein 0,45 μm und dann durch ein 0,22 μm Millipore Filter sterilisiert. Die Homogenate werden bei –80°C bis zur Verwendung gefroren.
Messung der Protease und Thrombin-hemmenden Aktivität
Die Gehirnhomogenatüberstände werden seriell in Enzympuffer 1 × EB
[50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % PEG 6000, 0,02 % Tween 20] in Verdünnungen vedünnt, die von 1:100 bis 1:10 000 reichen. Die verdünnten Proben werden auf das Vorkommen der Thrombin-ähnlichen Aktivität dreifach unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen gemessen. Zur Messung der Thrombinhemmenden Aktivität werden die Homogenate in Enzympuffer verdünnt, der 1 pM Thrombin enthält. Die Konzentrationen an Thrombin-ähnlicher Aktivität oder Thrombin-hemmender Aktivität werden aus den Steigungen des linearen Teils der Dosis-Antwort-Kurve bestimmt.
Die Gehirnhomogenate aus 14 Tage alten Wildtyp oder PN-1 Knockout Mäusen setzen keine messbaren Mengen an löslicher ß-Galactosidaseaktivität nach einer Inkubation mit immobilisiertem GPAR1 frei. Ein Überschuss an Thrombin-hemmender Aktivität wird deutlich, wenn die Gehirnhomogenate in Gegenwart von 1 pM Thrombin getestet werden. Tatsächlich wird eine Verringerung der ß-Galactosidasefreisetzung in Gegenwart der Gehirnhomogenate detektiert. Die Menge an Thrombininhibitor, die in den Gehirnhomogenaten vorhanden ist, wird aus diesen Kurven berechnet. Die höchste Konzentration an Inhibitor beträgt 817 ± 122 pM und ist im Homogenat des Wildtypgehirns vorhanden, während die Thrombin-hemmende Aktivität in der PN-1 Knockout Maus auf 79 ± 8 pM verringert ist, was 9,7 der Wildtypmenge entspricht. Im Gehirn der heterozygoten PN-1 Knockout Maus wird eine mittlere Konzentration von 487 ± 65 pM Thrombin-hemmende Aktivität gefunden. Der detektierte Inhibitor ist aufgrund der reduzierten Menge, die in den Gehirnen der heterozygoten Maus gefunden wurden, höchstwahrscheinlich PN-1. Jedoch ist sogar im Homogenat aus der homozygoten PN-1 Knockout Maus eine Thrombin-hemmende Aktivität evident messbar, was die Anwesenheit eines Inhibitors zeigt, der nicht PN-1 ist.
Zusammengefasst wird eine präzise und empfindliche Messung der PAR-spezifischen Proteaseaktivität und Protease-hemmenden Aktivität in Gewebeproben durch das vorliegende Verfahren erreicht. Die gezielte Zerstörung des PN-1 Gens führt zu einer starken Reduktion aber keiner völligen Auslöschung der Thrombin-hemmenden Aktivität in Gehirnhomogenaten, was das Vorkommen eines zweiten Thrombininhibitors zeigt. Die Verringerung der hemmenden Aktivität ist mittels des Thrombinsubstrats S2238 messbar, wird aber in einem empfindlicheren Niveau mittels des vorliegenden Tests bestätigt. Es ist keine Thrombin-ähnliche Aktivität in diesen Knock-out Tieren detektierbar, was die Identifizierung einer putativen Zielprotease für PN-1 erlaubt.
Beispiel 9: Messung der Proteaseaktivität und Protease-hemmenden Aktivität in Flüssigkeiten aus dem männlichen Reproduktionssystem der Maus
Nach der Erzeugung der PN-1 Knockout Maus zeigt die anschließende Züchtung der mutierten Mauslinie, dass viele homozygote PN-1 Knockout Mäuse steril sind. Da PN-1 mit hohen Mengen in einer Androgen-abhängigen Weise im männlichen Reproduktionssystem der Wildtypmaus exprimiert wird (Mansuy et al., 1993, Vassalli et al. 1993) kann dessen Abwesenheit schwere Konsequenzen für die Fertilität des Tieres haben. Mögliche Ziele für PN-1 sind die Serinproteasen uPA und Plasmin, die aus uPA aus Plasminogen erzeugt werden können. Es wurden 14 Tage alte PN-1 Knockout Mäuse in die C57/B16 Mauslinie rückgekreuzt, wie dies in Beispiel 8 beschrieben ist.
Gewinnung der Flüssigkeiten aus dem männlichen Reproduktionssystem der Maus
Zwei Paare an erwachsenen, rückgekreuzten PN-1 Knockout Mäusen werden betäubt und durch Enthauptung getötet. Die Samenvesikel, die Koagulationsdrüse und die Vas deferens/Cauda epididymis werden herausgeschnitten und ihr Inhalt wird mit Pinzetten in Eppendorfröhrchen gedrückt und mit 100 μl Enzympuffer 1 × EB
[50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % PEG 6000, 0,02 % Tween 20] gemischt. Die Proben werden bis zur Verwendung bei –80°C gefroren gelagert.
Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung von seriellen Verdünnungen der Flüssigkeitsproben wird mittels eines Proteinbestimmungskits vom Bradfordtyp von BioRad gemäß den Anleitungen des Herstellers ausgeführt (Bradford, 1976).
Messung der Proteaseaktivität und der Protease-hemmenden Aktivität
Die Flüssigkeiten werden seriell in Enzympuffer mit Verdünnungen verdünnt, die von 1/200 bis 1/600 000 reichen. Die verdünnten Proben werden dreifach auf die Anwesenheit einer Thrombinähnlichen Aktivität unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wie auch auf eine Thrombinhemmende Aktivität getestet, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist. Alternativ dazu wird der Test in Gegenwart von 10 pM Trypsin ausgeführt. Die Konzentrationen der Thrombin-ähnlichen Aktivität oder der Thrombin-hemmenden Aktivität werden aus den Steigungen des linearen Teils der Dosis-Antwort-Kurven bestimmt.
Alle untersuchten Flüssigkeiten enthalten entweder eine messbare Menge der proteolytischen Aktivität oder der Thrombin-hemmenden Aktivität. Die Samenvesikel enthalten einen Überschuss an Thrombin-hemmender Aktivität von etwa 240 fmol pro mg Protein, die in der PN-1 Knockout Maus auf 19 verringert ist. In der Koagulationsdrüse der Wildtypmaus ist eine Thrombin-hemmende Aktivität mit einer Konzentration von etwa 10 fmol pro mg Protein vorhanden. In der Mutantenmaus, die unfähig zur Synthese von PN-1 ist, ist die Thrombin-hemmende Aktivität aufgehoben und deckt damit einen Überschuss an Proteasekativität auf. Die Flüssigkeit aus dem Vas Deferens zeigt eine Proteaseaktivität von etwa 400 fmol pro mg Protein, die in der PN-1 Knockout Maus um 150 % erhöht ist. Für eine Wildtypmaus wird die Messung in Gegenwart von 10 pM Trypsin ausgeführt, was zeigt, dass die hemmende Aktivität im Samenvesikel und der Koagulationsdrüse auch zur Hemmung von Trypsin fähig ist. Der hierin beschriebene empfindliche Test erlaubt die Detektion von Thrombin und Thrombin-ähnlichen Proteasen und ihren Inhibitoren in Flüssigkeiten aus dem Reproduktionssystem der PN-1 Knockout und Wildtypmaus.
Zusammengefasst wird ein Überschuss der Thrombin-hemmenden Aktivität in der Koagulationsdrüse der Wildtypmaus detektiert, die in der PN-1 Knockout Maus fehlt, was zu einem Überschuss einer nicht identifzierten Thrombin-ähnlichen Proteaseaktivität führt. Eine zweite Thrombin-hemmende Aktivität wird im Samenvesikel detektiert. In der Vas deferens und der Cauda epididymis führt die Zerstörung des PN-1 Gens zu einer Zunahme einer nicht identifizierten Proteaseaktivität, die auch in der Wildtypmaus in geringeren Mengen vorkommt. Daher können die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die bisher nicht identifizierten Proteasen und Protease-inhibitoren zu detektieren, die weitere biologische Ziele für die PAR Regulation bereitstellen.
Beispiel 10: Analyse von löslichen oder an Zelloberflächen assoziierten Proteasen
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines Fusionsproteins, das in einer membrangebundenen Weise auf der Oberfläche von Säugerzellen in Kultur exprimiert wird, wobei es die Analyse von löslichen oder an die Zelloberfläche assoziierten Proteasen erlaubt. Unter Verwendung dieses Formats war es möglich, die durch Thrombin vermittelte Freisetzung eines Reporterenzyms in das Medium von kultivierten Zellen zu zeigen. Die kultivierten Mausneuroblastomzellen (Nb2a oder Cho-E Zellen) werden mit der cDNA eines membranverankerten Fusionsproteins der humanen alkalischen Phosphatase der Plazenta und den extrazellulären und ersten Transmembrandomänen von PAR1 transfiziert.
Die Signalintensitäten können leicht für jedes PAR Fusionskonstrukt optimiert werden, beispielsweise durch die Selektion einer Zelllinie, die hohe Expressionsmengen erlaubt und durch die Erzeugung einer Zelllinie, die das Rezeptorfusionsprotein stabil exprimiert. Das zellbasierte Format des Tests kann für die sensitive Detektion von Proteasen verwendet werden, die zur Aktivierung von Proenzymen fähig sind, wie Prothrombin oder das Reporterenzym direkt spalten und freisetzen.
Wie es für den Fachmann ersichtlich ist, können die obigen Beispiele leicht modifiziert werden, um die verschiedenen Reportermoleküle oder PAR Sequenzen zu umfassen und die PAR Aktivatoren, Inaktivatoren, Agonisten und Antagonisten in Proben verschiedener Ursprünge zu detektieren. Zusätzlich sind die hierin beschriebenen PAR Fusionsproteine brauchbar, um jedes PAR Bindeprotein oder -molekül zu screenen, das dann durch die in der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden kann (beispielsweise Proteomics). Tabelle 1 GPAR Tests: ß-Galactosidasefreisetzungsgeschwindigkeiten durch potentielle Aktivatoren und Inaktivatoren der PARs

Anmerkung: Immobilisierte GPAR Fusionsproteine werden mit den oben angegebenen Proteasen inkubiert und die Freisetzung der ß-Galactosidase wird wie beschrieben detektiert und evaluiert. Die Daten stellen den Mittelwert aus mindestens 2 Experimenten mit Dreifachbestimmungen dar. Alle Werte sind in mmol_{ß-Galactosidase}/(mol_Protease × min) angegeben.
^a Bestimmt in Gegenwart von Hirudin

Claims

Verfahren zur Identifikation oder Detektion eines PAR Spaltmoleküls, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellung eines immobilisierten PAR Spaltpeptids, das an ein Reportermolekül gebunden ist, (b) Zusammenbringen des immobilisierten PAR Spaltpeptids mit einem PAR Spaltmolekül, und (c) Detektion des freigesetzten Reportermoleküls.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das PAR Spaltpeptid VNPR, SKGR, LTIK oder PAPR ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das PAR Spaltpeptid an einen Biotinrest gebunden ist und über eine Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, das ferner die Spaltstelle des PAR Spaltpeptids durch das PAR Spaltmolekül umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das PAR Spaltmolekül als PAR Aktivator identifiziert wird, falls die Spaltstelle eine biologische Spaltstelle ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das PAR Spaltmolekül als PAR Inaktivator identifiziert wird, falls die Spaltstelle keine biologische Spaltstelle ist.
Verfahren der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, das ferner das Zusammenbringen des immobilisierten PAR Spaltpeptids mit einem potentiellen PAR Modulator und die Bestimmung einer Veränderung in der Menge an freigesetztem Reportermolekül im Vergleich zu der Situation umfasst, bei der der PAR Modulator fehlt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Reportermolekül ein Reporterenzym ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Reporterenzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus beta-Galactosidase, Glucosidasen, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Glucuronidasen, Luciferase, Peroxidasen, Phosphatasen, Oxidoreduktasen, Dehydrogenasen, Transferasen, Isomerasen, Kinasen, Reduktasen, Desaminasen, Katalasen und Urease.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Reporterenzym beta-Galactosidase ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das PAR Spaltpeptid auf einer Mikrotiterplatte, einem Gel, einer Matrix, einem Kügelchen, einer Membran oder einem Röhrchen immobilisiert ist.
Kit, der ein PAR Fusionsprotein, worin das PAR Fusionsprotein ein PAR Fusionsprotein mit einem enzymatischen Reporter ist und worin das PAR Fusionsprotein auf einem festen Träger immobilisiert ist, zur Verwendung in den Verfahren nach den Ansprüchen 8 oder 9, umfasst.
Kit nach Anspruch 12, worin das PAR Fusionsprotein ein PAR beta-Galactosidasefusionsprotein ist.