DE60030744T2

DE60030744T2 - Verfahren zum identifizieren von inhibitoren der methioninaminopeptidasen

Info

Publication number: DE60030744T2
Application number: DE60030744T
Authority: DE
Inventors: Yie-Hwa St. Louis CHANG
Original assignee: St Louis University
Current assignee: St Louis University
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2020-10-13
Also published as: WO2001027242A2; ATE339210T1; EP1221954B1; EP1221954A4; WO2001027242A3; JP3727269B2; CA2387126A1; US6593454B2; DE60030744D1; EP1221954A2; AU2113001A; US20010047078A1; US6261794B1; JP2003511063A

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter dem National Science Foundation Grant Nr. MCB 9512655 gemacht. Die Regierung besitzt gewisse Rechte an der Erfindung.
(1) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Untersuchungen der Enzymaktivität sowie Enzym-Inhibitoren. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Untersuchungen zur Detektion von Methionin-Aminopeptidasen und Inhibitoren von Methionin-Aminopeptidasen.
(2) Beschreibung des Standes der Technik
In allen lebenden Zellen wird die Proteinsynthese mit einem AUG-Codon initiiert, wobei Methionin als N-terminale Aminosäure in naszierenden Proteinen spezifiziert wird. Sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten wird dieses N-terminale Methionin durch eine Methionin-Aminopeptidase (MAP) (EC 3.4.11.18) entfernt, falls der vorletzte Aminosäurerest klein und ungeladen ist, z.B. Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Pro und Val, obwohl die Methionin-Spaltungsaktivität durch MAP verringert ist, wenn die drei N-terminalen Aminosäuren Met-Thr-Pro oder Met-Val-Pro sind (Moerschell et al., J. Biol. Chem. 265, 19638–19643 (1990); Tsunasawa et al., J. Biol. Chem. 260, 5382–5391 (1985). Die Entfernung des N-terminalen Methionins ist essentiell für eine normale Funktionsweise gewisser Proteine in vivo. Beispielsweise ist Entfernung des Initiator-Methionins oftmals für darauf folgende N-terminale Modifikationen, wie z.B. N-Myristoylierung, erforderlich, die für die normale Funktion verschiedener Signalübertragungsproteine, Krebszellen, auf Proteine abzielender Gruppierungen sowie Enzyme essentiell ist (Gordon et al, J. Biol. Chem. 266, 8647–8650 (1991); Duronio et al., Science 243, 796–800 (1989).
Methionin-Aminopeptidasen wurden aus mehreren Organismen isoliert und kloniert, unter anderem E. coli und einigen anderen Eubakterien, Hefe, Ratten und verschiedenen Archaea. Neu entdeckte MAPs wurden basierend auf Struktur- und Sequenzähnlichkeiten in zwei Typen eingeteilt, Typ-1-MAP und Typ-2-MAP. Eubakterien weisen Typ 1 auf, Archaea weisen Typ 2 auf, und Eukaryoten besitzen beide Typen. In Eukaryoten sind Null-Mutanten in jedem der beiden Typen lebensfähig, sie vermehren sich jedoch langsam, Null-Mutanten beider MAP-Typen sind jedoch nicht lebensfähig (Li & Chang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 12357–12361 (1995); Li & Chang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 152–159 (1996); Bradshaw et al., Trends Biochem. Sci. 21, 285–286 (1998)). In ähnlicher Weise sind Zerstörungen des bakteriellen MAP-1-Gens letal (Ben-Bassat et al., H. Bacteriol. 169, 751–757 (1987). Die MAP-Aktivität ist daher essentiell für die normale Funktion prokaryotischer und eukaryotischer Zellen.
Abgesehen von ihrer Rolle bei der Spaltung des Initiator-Methionins von Proteinen haben MAPs Auswirkungen auf andere Zellfunktionen. Menschliche Typ-2-MAP etwa dient auch als eukaryotischer Initiationsfaktor 2, der die Proteinsynthese reguliert (US-Patent Nr. 5.885.820). Der Wirkmodus von Angiogenese-Inhibitoren vom Fumagillin-Typ ist ebenso die irreversible Inhibierung von Typ-2-MAP (Griffith et al., Chem. Biol. 4, 461–471 (1997); Liu et al., Science 282, 1324–1327 (1998); Lowther et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 12153–12157; Sin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6099–6103 (1997)), was auf eine essentielle Rolle von Typ-2-MAP bei der Angiogenese hindeutet.
Aufgrund der entscheidenden Rolle von MAPs bei prokaryotischen und eukaryotischen Funktionen gibt es ein Interesse an der Entdeckung zusätzlicher Inhibitoren dieser Enzyme, die als Antibiotika oder als Chemotherapeutika dienen könnten, die die Angiogenese in Tumoren inhibieren. Die zur Zeit verfügbaren Verfahren zur Beobachtung der MAP-Aktivität sind für diese Aufgabe jedoch ungeeignet. Diese Verfahren umfassen das kolorimetrische Ninhydrin-Verfahren (Doi et al., Anal. Biochem. 118, 173–184 (1981)); Behandlung mit Aminosäure-Oxidase, gefolgt von einer Peroxidase-Reaktion und o-Dianisidin-Farbentwicklung (Carter & Miller, J. Bacteriol. 159, 453–459 (1984)); Aminosäure-Analyse durch Ionenaustauschchromatographie, gefolgt von Derivatisierung mit Ninhydrin (Moore et al., Anal. Biochem. 30, 1185–1190 (1958)), Fluorescamin (Stein et al., Arch. Biochem. Biophys. 155, 202–212 (1973)) oder o-Phthalaldehyd/β-Mermercaptoethanol (Roth, Anal. Chem. 43, 880–882 (1971)) nach dem Säulen; Derivatisierung von Aminosäuren, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie vor dem Säulen (Cohen & Strydom, Anal. Biochem. 174, 1–16 (1988); Zuo et al., Anal. Biochem. 222, 514–516 (1994)); sowie Trennung von Substratpeptiden und -produkten mittels Umkehrphasen-HPLC mit Online-UV-Detektion eines jeden getrennten Bestandteils (Larrabee et al., Anal. Biochem. 269, 194–198 (1999); Walker et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 29, 157–163 (1999)). Chang et al., J. Biol. Chem. 265 (32), 19892–19897 (1990), XP 002215299, offenbaren die Isolierung einer MAP, die die Entfernung von NH₂-terminalem Methionin aus Proteinen von Saccharomyces cerevisiae katalysiert. Diese Hefe-MAP zeigte ähnliche Substratspezifitäten wie das entsprechende bakterielle Protein, war jedoch nicht in der Lage, Methioninin-p-nitroanilid zu spalten, um die Detektionsgruppierung freizusetzen.
Diese Verfahren sind für quantitative Untersuchungen entweder nicht empfindlich oder genau genug, oder sie sind für Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz nicht schnell genug. Es besteht daher die Notwendigkeit für neue Untersuchungen der MAP-Aktivität, die schnell genug sind und ebenso den quantitativen Anforderungen gerecht werden, um eine Verwendung in Verfahren zu ermöglichen, die eine MAP-Analyse mit hohem Durchsatz, wie z.B. ein Screening auf MAP-Inhibitoren, erfordern.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend ist dem Erfinder die Erfindung eines neuen MAP-Tests gelungen, der schnell ist, den quantitativen Anforderungen gerecht wird und für automatisierte Verfahren geeignet ist. Der Test verwendet eine zweite Peptidase und ein Peptid, das ein N-terminates Methionin umfasst, das von MAP abgespalten werden kann, zusammen mit einer C-terminalen Detektionsgruppierung, die von der zweiten Peptida se nur dann aus dem Peptid freigesetzt werden kann, wenn das N-terminate Methionin von dem Peptid abgespalten wurde.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft daher Verfahren zur Detektion der Methionin-Aminopeptidase-(MAP-)Aktivität in einer Zusammensetzung. Diese Verfahren umfassen (a) das Kombinieren der Zusammensetzung mit einem Peptid, das ein N-terminales Methionin umfasst, unter solchen Bedingungen, dass das N-terminate Methionin durch eine MAP vom Peptid abgespalten werden kann, um ein gespaltenes Peptid zu erzeugen, worin das Peptid eine C-terminale Detektionsgruppierung enthält, die von einer zweiten Peptidase nur freigesetzt wird, wenn das N-terminale Methionin vom Peptid abgespalten wurde; (b) das Umsetzen von jeglichem gespaltenem, unter (a) erzeugtem Peptid mit der zweiten Peptidase, um die Detektionsgruppierung freizusetzen; und (c) das Nachweisen jeglicher freigesetzter Detektionsgruppierung. Eine bevorzugte zweite Peptidase ist Dipeptidyl-Peptidase IV. Wird Dipeptidyl-Peptidase IV verwendet, so umfasst ein bevorzugtes Peptid Met-X_aa-Pro, worin X_aa Ala, Cys, Gly oder Ser ist; ein besonders bevorzugtes Peptid ist Met-Gly-Pro-p-nitroanilid.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Bestimmung, ob eine Substanz eine MAP inhibiert. Die Verfahren umfassen (a) das Kombinieren der Substanz, der MAP und eines Peptids, das ein N-terminates Methionin umfasst, unter solchen Bedingungen, dass das N-terminale Methionin durch die MAP vom Peptid abgespalten werden kann, um ein gespaltenes Peptid zu produzieren, worin das Peptid eine C-terminale Detektionsgruppierung enthält, die von einer zweiten Peptidase nur freigesetzt wird, wenn das N-terminale Methionin vom Peptid abgespalten wurde; (b) das Umsetzen von jeglichem gespaltenem, unter (a) erzeugtem Peptid mit der zweiten Peptidase, um die Detektionsgruppierung freizusetzen; und (c) das Nachweisen jeglicher freigesetzter Detektionsgruppierung. Wie bei dem zuvor beschriebenen Verfahren ist eine bevorzugte zweite Peptidase Dipeptidyl-Peptidase IV, und ein bevorzugtes Peptid ist Met-Gly-Pro-p-nitroanilid. Dieses Verfahren umfasst vorzugsweise auch das Quantifizieren der Menge der freigesetzten Detektionsgruppierung, um die MAP-Inhibitoren genauer nachzuweisen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Reaktionsgemische, die zur Verwendung in den oben beschriebenen Verfahren geeignet sind. Das Reaktionsgemisch umfasst (a) ein Peptid, umfassend ein N-terminales Methionin, das durch die Methionin-Aminopeptidase abgespalten werden kann, und eine C-terminale Detektionsgruppierung, die durch eine zweite Peptidase nur freigesetzt werden kann, wenn das N-terminale Methionin vom Peptid abgespalten wurde; und (b) die zweite Peptidase. Eine MAP kann ebenso in dem Gemisch enthalten sein.
In einer zusätzlichen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Set zur Durchführung der oben beschriebenen Verfahren, umfassend die zweite Peptidase und das in diesen Verfahren beschriebene Peptid, zusammen mit Anweisungen zur Durchführung der Verfahren. Vorzugsweise umfasst das Set auch eine MAP.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die in den oben erwähnten Ausführungsformen beschriebenen Peptide.
Unter den verschiedenen Vorteilen, die durch die vorliegende Erfindung erzielt werden, kann daher die Bereitstellung von Verfahren und Reagenzien zur schnellen Detektion und Quantifizierung der MAP-Aktivität und der MAP-Inhibitor-Aktivität genannt werden. Diese Verfahren sind zum schnellen Screening und Quantifizieren der MAP- und der MAP-Inhibitor-Aktivität besser geeignet als zuvor bekannte Verfahren, da sie Geschwindigkeit, quantitative Genauigkeit und die Möglichkeit der automatisierten Durchführung kombinieren, was bis jetzt noch nicht erreicht wurde.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt durch MAP (A) und Dipeptidyl-Peptidase IV (B) katalysierte Reaktionen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
2 ist eine grafische Darstellung der Resultate eines MAP-Tests gemäß der Erfindung unter Verwendung des Peptids Met-Gly-Pro-p-nitroanilid, wobei Dipeptidyl-Pep tidase IV in der Lage ist, p-Nitroanilid in Gegenwart von Typ-1-MAP (•-•) und Typ-2-MAP (o-o) freizusetzen, jedoch nicht mit Dipeptidyl-Peptidase IV alleine (∇-∇).
3 ist eine grafische Darstellung der Resultate eines Tests zur Inhibierung von MAP durch Fumagillin gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Dipeptidyl-Peptidase IV und des Peptids Met-Gly-Pro-p-nitroanilid, wobei Fumagillin die Freisetzung von p-Nitroanilid stark inhibierte, wenn Typ-2-MAP verwendet wurde (∇-∇), jedoch nicht, wenn Typ-1-MAP verwendet wurde (o-o) oder wenn Dipeptidyl-Peptidase IV mit Gly-Pro-p-nitroanilid (•-•) verwendet wurde.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft schnelle und quantitative MAP-Tests. Diese Tests verwenden eine zweite Peptidase und ein Peptid, worin das Peptid ein N-terminales Met umfasst, das in der Lage ist, durch MAP gespalten zu werden, und eine C-terminale Detektionsgruppierung, die durch die zweite Peptidase nur dann vom Peptid freigesetzt werden kann, wenn das N-terminale Met vom Peptid abgespalten wurde. Die Detektionsgruppierung ist nicht nachweisbar, wenn sie kovalent an das Peptid gebunden ist, sie wird jedoch nach ihrer Freisetzung aus dem Peptid nachweisbar.
Es ist bekannt, das Peptidanaloga, wie z.B. Leu-p-nitroanilid, als Substrat für Aminopeptidasen, wie z.B. Leucin-Aminopeptidase (EC 3.4.11.1) dienen. An Leu gebunden, absorbiert p-Nitroanilid bei 405 nm viel weniger Licht als nach Freisetzung aus der Aminosäure.
Die Spaltung von Leu-p-nitroanilid durch Leucin-Aminopeptidase, um Leucin + p-Nitroanilid zu bilden, wird daher von einer quantitativen Zunahme der A₄₀₅ begleitet. MAP kann jedoch Met-p-nitroanilid nicht spalten, um p-Nitroanilid freizusetzen.
Es ist ebenso bekannt, dass andere Enzyme in der Lage sind, ein kurzes Peptid, das an p-Nitroanilid konjugiert ist, oder andere solche Detektionsgruppierungen als Sub strat zu verwenden, wobei p-Nitroanilid freigesetzt wird. Ein nennenswertes Beispiel ist Dipeptidyl-Peptidase IV (EC 3.4.14.5) (auch als Leukozyten-Differenzierungsantigen CD26 bekannt), das X_aa-Pro-p-nitroanilid spaltet, wobei X_aa eine beliebige Aminosäure ist, um p-Nitroanilid (z.B. Reaktion B in 1) freizusetzen. Dipeptidyl-Peptidase IV kann auch Ala und Hydroxyprolin als vorletzte Aminosäure (anstelle von Pro) nutzen, wenn auch mit einer langsameren Freisetzung der Detektionsgruppierung (Ikehara et al, Meth. Enzymol 244, 215–227 (1994)). Es wurde ebenso vor kurzem entdeckt, dass Dipeptidyl-Peptidase IV ein N-terminates Tyr-Gly als Substrat nutzen kann (Proost et al., J. Biol. Chem 274, 3988–3993 (1999)).
Es wurde nun entdeckt, dass, wenn entweder Typ-1- oder Typ-2-MAP mit Met-Gly-Pro-p-nitroanilid und Dipeptidyl-Peptidase IV vermischt wird, p-Nitroanilid aus dem Peptid freigesetzt wird, wohingegen kein p-Nitroanilid freigesetzt wird, wenn MAP nicht enthalten ist (2). MAP ist daher in der Lage, ein Tripeptid als Substrat zu nutzen, wodurch z.B. Reaktion A in 1 vermittelt wird, um Gly-Pro-p-nitroanilid zu bilden, das Dipeptidyl-Peptidase IV als Substrat nutzen kann, um p-Nitroanilid freizusetzen.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "freisetzen", wenn er sich auf eine Detektionsgruppierung auf einem Peptid bezieht, dass die kovalente Bindung zwischen der Detektionsgruppierung und dem Peptid zerstört wurde, normalerweise durch Enzymeinwirkung.
In manchen Ausführungsformen der Erfindung werden daher Verfahren zum Nachweisen von MAP-Aktivität in einer Zusammensetzung bereitgestellt. Diese Verfahren umfassen das Kombinieren der Zusammensetzung mit einem Peptid, das ein N-terminales Methionin umfasst, unter solchen Bedingungen, dass das N-terminale Methionin abgespalten werden kann, worin das Peptid ebenso eine C-terminale Detektionsgruppierung umfasst, die durch eine zweite Peptidase nur freigesetzt werden kann, wenn das N-terminale Methionin abgespalten wurde. Jedes gespaltene Peptid, das nach der Reaktion mit der Zusammensetzung erzeugt wurde, wird mit der zwei ten Peptidase umgesetzt, um die Detektionsgruppierung freizusetzen, die danach detektiert wird.
Die zweite Peptidase muss in der Lage sein, die Detektionsgruppierung aus dem Peptid freizusetzen, wenn das N-terminale Methionin des Peptids entfernt wurde. Zusätzlich muss die zweite Peptidase nicht in der Lage sein, die Detektionsgruppierung aus dem Peptid freizusetzen, wenn ein N-terminales Met vorhanden ist. Da MAP das N-terminate Met von einem Peptid auch nur dann abspalten kann, wenn bestimmte Aminosäuren (z.B. Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Pro oder Val) an der vorletzten Stelle des Peptids vorhanden sind, muss die Peptid-Detektionsgruppierung, die von der zweiten Peptidase abgespalten werden kann, eine dieser Aminosäuren an der N-terminalen Position aufweisen. Die zweite Peptidase ist vorzugsweise Dipeptidyl-Peptidase IV, die z.B. Gly-Pro-p-nitroanilid als Substrat nutzen kann, um p-Nitroanilid freizusetzen. Es ist anzumerken, dass die N-terminate Aminosäure dieses Dipeptidyl-Peptidase-IV-Substrats Gly ist, eine zulässige vorletzte Aminosäure für MAP. Met-Gly-Pro-p-nitroanilid kann daher durch MAP gespalten werden, um Gly-Pro-p-nitroanilid freizusetzen, ein Dipeptidyl-Peptidase-IV-Substrat; Met-Gly-Pro-p-nitroanilid selbst ist jedoch kein Dipeptidyl-Peptidase-IV-Substrat. Dipeptidyl-Peptidase-IV ist daher eine geeignete zweite Peptidase für dieses Verfahren. Andere Peptidasen können als zweite Peptidase ebenso nützlich sein, z.B. Triaminopeptidase, die die Gly-Pro-Leu-Detektionsgruppierung als Substrat nutzen kann (Aoyagi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 435 (1978)), und Cathepsin C, das die Gly-Phe-Detektionsgruppierung als Substrat nutzen kann (Jadot et al., Biochem. J. 219, 965 (1984); Doughty & Gruenstein, Biochem. and Cell Biol. 64, 772 (1986)).
Vorzugsweise ist die zweite Peptidase unter denselben Bedingungen wie MAP aktiv (z.B. 10 mM Hepes, pH 7,35, 1,5 mM MgCl₂, 150 mM KCl, 10% Glycerin, 0,1–0,5 mM Co²⁺ [Puffer H], [Zuo et al., s.o.], 30–35°C), um das Auftreten beider Peptidase-Reaktionen zu ermöglichen, ohne die Bedingungen anzupassen. Solch eine zweite Peptidase würde es ermöglichen, den Versuch in einem Schritt durchzuführen, in dem die Zusammensetzung, das Peptid und die zweite Peptidase gleichzeitig inkubiert werden.
Wie zuvor angesprochen, muss das im Test verwendete Peptid ein N-terminates Methionin aufweisen, das von MAP abgespalten werden kann, d.h., es muss eine vorletzte Aminosäure aufweisen, die es MAP ermöglicht, das N-terminale Methionin abzuspalten (z.B. Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Pro oder Val). Das Peptid muss ebenso eine C-terminale Detektionsgruppierung aufweisen, die durch die zweite Peptidase vom Peptid nur dann abgespalten werden kann, wenn das N-terminate Methionin nicht vorhanden ist. Die Sequenz muss daher solch eine Spaltung erlauben. Ist die zweite Peptidase Dipeptidyl-Peptidase-IV, so umfassen zulässige Peptide die Met-X_aa1-X_aa2-Detektionsgruppierung, worin X_aa1 Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Pro oder Val, vorzugsweise Ala, Cys, Gly oder Ser, noch bevorzugter Gly ist; und X_aa2 Pro, Hyp oder Ala, insbesondere Pro ist. Das am meisten bevorzugte Peptid für Dipeptidyl-Peptidase IV ist daher die Met-Gly-Pro-Detektionsgruppierung. Jedes Peptid, das jedoch zu der Freisetzung der Detektionsgruppierung führt, wenn aktive MAP vorhanden ist, jedoch nicht, wenn MAP nicht vorhanden ist, kann in diesen Verfahren nützlich sein. Es können z.B. Wiederholungen des Peptids, das durch Dipeptidyl-Peptidase-IV spaltbar ist, verwendet werden, z.B. eine Met-Gly-Pro-Gly-Pro-Detektionsgruppierung oder Met-Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro-Detektionsgruppierung, da Dipeptidyl-Peptidase IV in der Lage ist, jedes darauf folgende Dipeptid zu spalten (nach N-terminaler Met-Abspaltung durch MAP), um die Detektionsgruppierung freizusetzen. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können durch jedes nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden.
Diese Verfahren können auch ein drittes Enzym verwenden, das in Kombination mit MAP und der zweiten Peptidase (jedoch nicht ohne MAP) eine Detektionsgruppierung freisetzt oder aktiviert. Diesem Schema zufolge ist das Peptid so beschaffen, dass das dritte Enzym eingesetzt werden kann. Die zweite Pepitdase und das dritte Enzym können z.B. Dipeptidyl-Peptidase IV und Cathepsin C sein, und das Peptid kann die Met-Gly-Pro-Gly-Phe-Detektionsgruppierung oder die Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Detektionsgruppierung sein, worin die zweite Peptidase und das dritte Enzym nacheinander einwirken. Alternativ dazu kann das dritte Enzym auf die Detektionsgruppierung wirken, um ein nachweisbares Signal zu produzieren. In diesem Fall ist die De tektionsgruppierung ein Substrat für das dritte Enzym, z.B. Luciferin für Luciferase als drittes Enzym.
Die Erfindung ist durch die Wahl der Detektionsgruppierung nicht eng eingeschränkt, vorausgesetzt, die Detektionsgruppierung kann aus dem Peptid freigesetzt werden, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Die Detektionsgruppierung kann eine Gruppierung sein, die durch einen Sekundärschritt bestimmt werden kann, z.B. durch eine Trennung mittels Chromatographie, Zentrifuge oder Elektrophorese, oder durch eine Enzymreaktion (wie zuvor beschrieben). Diesbezüglich kann die Detektionsgruppierung selbst ein Enzym sein, vorausgesetzt, dass (1) das Enzym erhöhte Aktivität aufweist, wenn es durch die zweite Peptidase vom Peptid freigesetzt wird, und (2) das Enzym Aktivität für ein Substrat besitzt, das detektiert werden kann, nachdem das Enzym darauf eingewirkt hat. Die Detektionsgruppierung ist vorzugsweise eine, die leicht detektiert werden kann, z.B. mittels visueller, photometrischer, spektrometrischer oder Fluoreszenzverfahren. Nicht einschränkende Beispiele für solche Gruppierungen sind Kresylviolett, das nach Freisetzung fluoresziert (Van Norden et al., Anal. Biochem. 252, 71–77 (1997)); 7-Amino-3-trifluormethylcumarin, das ebenso nach Freisetzung fluoresziert (Lojda, Acta Histochem 98, 215–218 (1996)); 4-Methoxy-2-naphthylamin (Scharpe et al., Clin. Chem. 34, 2299–2301 (1988)) oder 2-Naphthylamin (Ikehara et al., s.o.), die nach Freisetzung ebenso fluoreszieren; 1-Hydroxy-4-naphthylamid, das nach Freisetzung mit Tetrazoliumsalzen reagiert, um ein wasserunlösliches, intensiv gefärbtes Formazan zu bilden (was für gewisse Festphasenformate des Verfahrens nützlich ist); 3,5-Dibrom-4-hydroxyanilid, das nach Freisetzung 2,6-Dibromphenol-indo-p-xylenol bildet, eine Verbindung mit einem Absorptionsmaximum bei 600 nm (Shibuya-Saruta et al., J. Clin. Lab. Anal. 9, 113–118 (1995)); und p-Nitroanilid, das nach Freisetzung ein Absorptionsmaximum bei 415 nm aufweist (ebda.). Eine bevorzugte Detektionsgruppierung ist p-Nitroanilid, da es z.B. als Detektionsgruppierung in Dipeptidyl-Peptidase-Tests (beispielsweise unter Verwendung des Peptids Gly-Pro-p-nitroanilid) weit verbreitet Verwendung fand. Es wurden mehrere verschiedene Detektionsverfahren verwendet, um p-Nitroanilid zu detektieren (Ikehara, s.o.). Diese Verbindung kann z.B. sichtbar gemacht werden oder z.B. bei 385 nm direkt photometrisch oder spektrometrisch gemessen werden.
Ein empfindlicheres p-Nitroanilid-Detektionsverfahren umfasst die Diazotierung und Kuppeln mit N-(1-Naphthyl)ethylendiamin, um ein Produkt zu ergeben, das bei 548 nm gemessen werden kann (ebda.).
Die Erfindung umfasst verschiedene Testformate. Der Test kann z.B. in einem Zwei-Stufen-Verfahren durchgeführt werden, und zwar zuerst durch Vermischen der Zusammensetzung (in der MAP vorhanden sein könnte) mit dem Peptid, wodurch jeglicher vorhandener MAP ermöglicht wird, das N-terminale Methionin vom Peptid abzuspalten, und anschließendes Hinzufügen der zweiten Peptidase, wodurch die Freisetzung der Detektionsgruppierung ermöglicht wird. Dieses Format kann in Fällen nützlich sein, in denen die zweite Peptidase unterschiedliche Aktivitäts-Anforderungen aufweist (z.B. unterschiedliche pH- oder Temperatur-Optima), bei denen die Bedingungen vor dem Hinzufügen der zweiten Peptidase geändert werden können. Vorzugsweise wird der Versuch jedoch in einer Stufe durchgeführt, in dem die Zusammensetzung, das Peptid und die zweite Peptidase miteinander vermischt und inkubiert werden, um die Freisetzung der Detektionsgruppierung zu ermöglichen.
Auch können die Verfahren zur Gänze in einer wässrigen Lösung (z.B. in Eprouvetten oder Mikrotiter-Wells) oder teilweise oder zur Gänze auf einer Festphase durchgeführt werden. Eine Festphase kann beispielsweise verwendet werden, wenn eine Peptidase an eine Perle, ein Teströhrchen oder einen Well adsorbiert oder kovalent gebunden ist und sich die anderen Bestandteile in einer Lösung befinden, oder aber in Fällen, in denen der gesamte Test auf einer festen Phase, wie z.B. einer Nitrocellulosemembran, durchgeführt wird und die Detektionsgruppierung nach der Freisetzung vom Peptid ein unlösliches detektierbares Produkt ergibt. Solch ein Festphasenformat kann auch in histochemischen Anwendungen eingesetzt werden, um in Gewebe vorhandene MAPs zu lokalisieren. In diesen Anwendungen wird das Peptid zusammen mit der Dipeptidyl-Peptidase IV auf das Gewebe aufgetragen. Die Detektionsgruppierung ist vorzugsweise unlöslich, wenn sie aus dem Peptid freigesetzt wird, um eine Bewegung des MAP-"Signals" von der MAP-Stelle im Gewebe weg zu verhindern.
Diese Verfahren können qualitativ oder quantitativ angewandt werden. Die Verfahren können z.B. qualitativ durch einfaches Sichtbarmachen der freigesetzten Detektionsgruppierung angewandt werden, um die MAP-Produktion oder -Reinigung zu verfolgen. Das Verfahren kann ebenso verwendet werden, um diese Produktion oder Reinigung quantitativ zu verfolgen oder um die MAP-Aktivität zu messen, z.B in Gewebe- oder Flüssigkeitsproben; dies erfolgt durch Quantifizieren der Detektionsgruppierung und Vergleichen des Werts mit Vergleichswerten bekannter MAP-Aktivität.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung werden Verfahren bereitgestellt, um zu bestimmen, ob eine Substanz eine MAP inhibiert. Diese Verfahren werden wie das oben offenbarte Verfahren der MAP-Aktivität durchgeführt, mit der Ausnahme, dass eine konstante Menge MAP verwendet wird und die Substanz hinzugefügt wird, bevor die MAP mit dem Peptid kombiniert wird. Das Verfahren umfasst daher das Kombinieren der Substanz, der MAP und eines Peptids, das ein N-terminales Methionin umfasst, unter solchen Bedingungen, dass das N-terminale Methionin durch eine MAP vom Peptid abgespalten werden kann, um ein gespaltenes Peptid zu erzeugen, worin das Peptid eine C-terminale Detektionsgruppierung umfasst, die von einer zweiten Peptidase nur freigesetzt wird, wenn das N-terminale Methionin vom Peptid abgespalten wurde; das Umsetzen von jeglichem gespaltenem Peptid, das mit der zweiten Peptidase erzeugt wurde, um die Detektionsgruppierung freizusetzen; und das Nachweisen jeglicher freigesetzter Detektionsgruppierung. Falls die Substanz die MAP inhibiert, so werden weniger (oder keine) Detektionsgruppierungen aus dem Peptid freigesetzt, als wenn die Substanz die MAP nicht inhibiert. Es wird daher die Verwendung eines Vergleichs ohne Inhibitor bevorzugt, um bestimmen zu können, ob weniger Detektionsgruppierung freigesetzt wird als ohne den Inhibitor. Ebenso wird die Verwendung eines Vergleichs bevorzugt, um eine Inhibierung der zweiten Peptidase statt der MAP auszuschließen. Ist die zweite Peptidase z.B. Dipeptidyl-Peptidase IV, so würde ein solcher Vergleich die Verwendung des Peptids Gly-Pro-p-nitroanilid anstelle von Met-Gly-Pro-p-nitroanlilid umfassen.
In diesem Inhibitor-Detektionsverfahren kann eine MAP oder eine zweite Peptidase aus beliebiger Quelle verwendet werden. Da jedoch einige bekannte MAP-Inhibitoren nur einige Formen von MAP inhibieren (Fumagillin inhibiert z.B. Typ-2-, jedoch nicht Typ-1-MAP), sollte die für diesen Test ausgewählte MAP dieselbe MAP sein, deren Inhibierung gewünscht wird, oder sie sollte dieser ähneln.
Die MAP und die zweite Peptidase können in gereinigter Form oder in verunreinigter Form, wie z.B. als Zelllysat, vorliegen, vorausgesetzt, die anderen Bestandteile des verunreinigten Präparats stören die MAP/Peptid- oder die MAP/zweite-Peptidase-Reaktion nicht. In einer Variation können die MAP und die zweite Peptidase in transgenen Zellen (erhalten durch nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren) produziert werden, denen das Peptid und der Inhibitor zugesetzt werden.
Diese Verfahren können für ein qualitatives oder quantitatives Screening auf MAP-Inhibitoren verwendet werden. Die Verfahren können z.B. in Fällen, in denen die Differenz der freigesetzten Detektionsgruppierung zwischen Behandlungen mit einem gewünschten Inhibitor und Behandlungen oder Vergleichen ohne solch einen Inhibitor visuell leicht festzustellen ist, qualitativ angewandt werden, um zu evaluieren, ob eine Substanz ein starker MAP-Inhibitor ist. Die Verfahren können auch für eine quantitative Evaluierung der relativen Hemmaktivität einer Substanz eingesetzt werden oder aber zur Quantifizierung der Menge eines Inhibitors, z.B. in Gewebe- oder Flüssigkeitsproben, was durch Quantifizierung der freigesetzten Detektionsgruppierung und Vergleichen des Werts mit Vergleichswerten, die bekannte Mengen eines Inhibitors aufweisen, erfolgt. So kann z.B. die Menge an Fumagillin im Gewebe eines Krebspatienten, der mit diesem MAP-Inhibitor behandelt wurde, um die Angiogenese zu unterbinden, nach diesem Verfahren verfolgt werden.
Diese Inhibitordetektions Verfahren können ebenso zum gleichzeitigen Screening von Verbindungen auf Hemmaktivität bezüglich MAP und zweiter Peptidase und/oder, falls dieses verwendet wurde, des dritten Enzyms eingesetzt werden. In diesem Verfahren wird der Inhibitor zu MAP, der zweiten Peptidase und, falls gewünscht, dem dritten Enzym hinzugefügt. Jede Substanz, die die Freisetzung der Detektionsgruppierung inhibiert, wird anschließend auf Inhibierung der zweiten Peptidase und/oder des dritten Enzyms untersucht. So können z.B. MAP, Dipeptidyl-Peptidase IV, Cathepsin C und das Peptid Met-Gly-Pro-Gly-Phe-p-nitroanilid verwendet werden, um die Hemmaktivität einer Substanz zu testen. Falls die Substanz keines dieser Enzyme inhibiert, wird p-Nitroanilid freigesetzt. Wird jedoch eine verringerte Menge an p-Nitroanilid freigesetzt, so kann die Substanz anschließend unter Verwendung von Gly-Pro-p-nitroanilid (ein Dipeptidyl-Peptidase-IV-Substrat) oder Gly-Phe-p-nitroanilid (ein Cathepsin-C-Substrat) getestet werden. Falls der Inhibitor die Freisetzung von p-Nitroanilid in keinem dieser Tests inhibiert, so ist der Inhibitor für MAP spezifisch. Ermöglicht der Inhibitor die Freisetzung von p-Nitroanilid nicht, wenn Gly-Pro-p-nitroanilid verwendet wurde, jedoch schon bei Verwendung von Gly-Phe-p-nitroanilid, so ist der Inhibitor für Dipeptidyl-Peptidase IV spezifisch; beim gegenteiligen Ergebnis ist der Inhibitor für Cathepsin C spezifisch.
In zusätzlichen Ausführungsformen der Erfindung werden Reaktionsgemische bereitgestellt, die entweder für das Verfahren der Detektion der MAP oder für das Verfahren der Detektion eines Inhibitors, der MAP, der zweiten Peptidase oder des dritten Enzyms nützlich sind. Die Reaktionsgemische umfassen ein Gemisch aus (a) einem Peptid, das ein N-terminales Methionin, das von der MAP abgespalten werden kann, und eine C-terminale Detektionsgruppierung umfasst, die von einer zweiten Peptidase nur freigesetzt werden kann, wenn das N-terminale Methionin vom Peptid abgespalten wurde, und (b) der zweiten Peptidase. Zusätzlich müssen die Reaktionsgemische dieser Ausführungsform zur Verwendung als Reaktionsgemisch im oben beschriebenen Verfahren zur Detektion von MAP geeignet sein, wobei Faktoren wie z.B. pH und Ionenstärke für die Aktivität der MAP und der zweiten Peptidase geeignet sein müssen. Eine bevorzugte zweite Peptidase in diesem Reaktionsgemisch ist Dipeptidyl-Peptidase IV. Ist die zweite Peptidase Dipeptidyl-Peptidase IV, so umfasst ein bevorzugtes Peptid Met-X_aa-Pro, worin X_aa Ala, Cys, Gly oder Ser ist, und das am meisten bevorzugte Peptid ist Met-Gly-Pro-p-nitroanilid. Diese Reaktionsgemische können ebenso eine MAP umfassen, die für die Verfahren zur Detektion von MAP-Inhibitoren nützlich ist.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung werden Sets bereitgestellt, die für die Durchführung des MAP-Detektionsverfahrens oder des Verfahrens zur Detektion eines Inhibitors der MAP, der zweiten Peptidase oder des dritten Enzyms nützlich sind. Die Sets umfassen (a) ein Peptid, umfassend ein N-terminales Methionin, das von der MAP abgespalten werden kann, und eine C-terminale Detektionsgruppierung, die von einer zweiten Peptidase nur freigesetzt werden kann, wenn das N-terminale Methionin vom Peptid abgespalten wurde, (b) die zweite Peptidase und (c) Anweisungen zur Durchführung des Verfahrens. Eine bevorzugte zweite Peptidase in diesen Sets ist Dipeptidyl-Peptidase IV. Ist die zweite Peptidase Dipeptidyl-Peptidase IV, so umfasst ein bevorzugtes Peptid Met-X_aa-Pro, worin X_aa Ala, Cys, Gly oder Ser ist, und das am meisten bevorzugte Peptid ist Met-Gly-Pro-p-nitroanilid. Diese Sets umfassen vorzugsweise auch eine MAP, die für die Verfahren zur Detektion von MAP-Inhibitoren oder als Bestandteil eines Vergleichs für Verfahren zur Detektion von MAPs nützlich ist. Die Bestandteile dieser Sets können sich in einzelnen Behältern befinden, oder einige oder alle der Bestandteile können miteinander vermischt sein.
In zusätzlichen Ausführungsformen der Erfindung werden Peptide bereitgestellt, die ein N-terminales Methionin, das von einer Methionin-Aminopeptidase abgespalten werden kann, und eine C-terminale Detektionsgruppierung umfassen, die von einer zweiten Peptidase nur freigesetzt werden kann, wenn das N-terminate Methionin vom Peptid abgespalten wurde, worin die zweite Peptidase Dipeptidyl-Peptidase IV ist. Ein bevorzugtes Peptid für diese Ausführungsformen umfasst Met-X_aa-Pro, worin X_aa Ala, Cys, Gly oder Ser ist, und das am meisten bevorzugte Peptid ist Met-Gly-Pro-p-nitroanilid.
Gewerbliche Anwendbarkeit:
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind für die schnelle und quantitative Detektion von MAPs oder MAP-Inhibitoren, für die Isolierung, Reinigung oder Quantifizierung neuer MAPs oder MAP-Inhibitoren oder für die Bestimmung oder Quantifizierung der MAP-Aktivität in einer Probe nützlich.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden Beispiel beschrieben. Andere Ausführungsformen, die im Schutzumfang der Ansprüche liegen, ergeben sich für den Fachmann unter Berücksichtigung der Beschreibung oder der praktischen Umsetzung der hierin offenbarten Erfindung. Die Beschreibung und die Beispiele sollen lediglich der Veranschaulichung dienen, wobei der Schutzumfang und die Lehre der Erfindung durch die auf die Beispiele folgenden Ansprüche definiert werden.
Beispiel
Dieses Beispiel veranschaulicht Ausführungsformen des Verfahrens zur Quantifizierung von MAPs sowie des Verfahrens zur Detektion eines MAP-Inhibitors gemäß der Erfindung.
Um zu bestimmen, ob Met-Gly-Pro-p-nitroanilid ein Substrat für MAP ist und ob die Gegenwart von Dipeptidyl-Peptidase die MAP-Aktivität beeinflussen könnte, wurde ein AccQ-Tag-Test verwendet, beschrieben von Zuo et al., s.o. Tabelle 1 zeigt, dass dieses Peptid sowohl für Typ-1- als auch für Typ-2-MAP ein Substrat ist.
Tabelle 1: Kinetische Parameter für Typ-1-Hefe-MAP und menschliche Typ-2-MAP.

Die Daten sind als Mittelwerte ± SA angegeben.

Sowohl die Aktivität von Typ-1-MAP als auch von Typ-2-MAP wurde durch Zusatz von Dipeptidyl-Peptidase IV nicht beeinflusst.
Die MAP-Aktivität wurde als nächstes durch Beobachten der Freisetzung von p-Nitroanilid in einem Mikrotiter-Format bestimmt. Gereinigte Typ-1-MAP oder Typ-2-MAP (0,6 μg) und/oder 0,001 Einheiten Dipeptidyl-Peptidase IV wurden in 47 μl Puffer H (10 mM Hepes, pH 7,4, 10% Glycerin), enthaltend 0,1 M KCl und 0,1 mM Co²⁺, zu Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte hinzugefügt. Nach 5 Minuten Inkubationszeit bei 37°C wurden 2 mM Met-Gly-Pro-p-nitroanilid zu dem Gemisch hinzugefügt, um die Reaktion zu starten. Ein Mikrotiterplattenleser, eingestellt auf 405 nm, um freigesetztes p-Nitroanilid nachzuweisen, wurde verwendet, um den Reaktionsfortschritt zu verfolgen. Wie in 2 dargestellt kam es nur zu bedeutenden Zunahmen an freigesetztem p-Nitroanilids, wenn MAP (jeglichen Typs) zusammen mit Dipeptidyl-Peptidase IV vorhanden ist. Diese Kurven sind hochgradig reproduzierbar und linear mit Korrelationskoeffizienten (r²) > 0,98.
Um die Verwendung dieses Verfahrens zur Detektion eines Typ-2-MAP-Inhibitors zu demonstrieren, wurden zu jeder Reaktion verschiedene Mengen Fumagillin hinzugefügt. Nachdem der Inhibitor mit MAP-Lösungen 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert worden war, wurden 2 mM Met-Gly-Pro-p-nitroanilid hinzugefügt, um die Reaktion zu starten, und die Freisetzung von p-Nitroanilid wurde wie oben beschrieben mit einem Mikrotiterplattenleser bei 405 nm verfolgt. Die Auswirkung von Fumagillin auf die Dipeptidyl-Peptidase-IV-Aktivität wurde ebenso unter Verwendung von Gly-Pro-p-nitroanilid als Substrat getestet. Während, wie in 3 dargestellt, sowohl die Typ-1-MAP- als auch die Dipeptidyl-Peptidase-IV-Aktivität sogar in Gegenwart von 900 nM Fumagillin nicht beeinflusst wurden, wurde die Typ-2-MAP-Aktivität durch 500 nM Fumagillin vollständig inhibiert. Diese Resultate sind jenen, die mit dem AccQ-Tag-Verfahren (Griffith et al., s.o.) erzielt wurden, sehr ähnlich, was darauf hinweist, dass es sich um ein verlässliches Verfahren zur Identifikation neuer MAP-Inhibitoren handelt.
Die hierin enthaltene Beschreibung der Verweise dient lediglich dazu, die von den Autoren getätigten Erklärungen zusammenzufassen, und ist nicht als Eingeständnis zu werten, dass einer der Verweise einen Stand der Technik darstellt. Die Anmelder behalten sich das Recht vor, die Genauigkeit und Relevanz der zitierten Verweise in Frage zu stellen.
Angesichts der obigen Ausführungen ist klar ersichtlich, dass die vielen Vorteile der Erfindung sowie noch weitere Vorteile erzielt werden.
Da verschiedene Änderungen an den obigen Verfahren und Zusammensetzungen vorgenommen werden konnten, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu überschreiten, sind all die in der obigen Beschreibung enthaltenen und in den begleitenden Zeichnungen dargestellten Informationen als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung zu verstehen.

Claims

Verfahren zur Detektion von Methioninaminopeptidase-(MAP-)Aktivität in einer Zusammensetzung, umfassend: (a) das Kombinieren der Zusammensetzung mit einem Peptid, das ein N-terminales Methionin umfasst, unter Bedingungen, sodass das N-terminate Methionin vom Peptid durch eine MAP abgespalten werden kann, um ein gespaltenes Peptid zu produzieren, worin das Peptid eine C-terminate Detektionsgruppierung enthält, die von einer zweiten Peptidase nur freigesetzt wird, wenn das N-terminale Methionin vom Peptid abgespalten wurde; (b) das Umsetzen von jeglichem gespaltenen, in (a) produzierten Peptid mit der zweiten Peptidase, um die Detektionsgruppierung freizusetzen; und (c) das Nachweisen jeglicher freigesetzter Detektionsgruppierung.
Verfahren zur Bestimmung, ob eine Substanz eine Methioninaminopeptidase (MAP) inhibiert, umfassend: (a) das Kombinieren der Substanz, der MAP und eines Peptids, das ein N-terminales Methionin umfasst, unter Bedingungen, sodass das N-terminate Methionin vom Peptid durch die MAP abgespalten werden kann, um ein gespaltenes Peptid zu produzieren, worin das Peptid eine C-terminate Detektionsgruppierung enthält, die von einer zweiten Peptidase nur freigesetzt wird, wenn das N-terminate Methionin vom Peptid abgespalten wurde; (b) das Umsetzen von jeglichem gespaltenen, in (a) produzierten Peptid mit der zweiten Peptidase, um die Detektionsgruppierung freizusetzen; und (c) das Nachweisen jeglicher freigesetzter Gruppierung.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der Detektionsschritt das Quantifizieren der Menge an freigesetzter Detektionsgruppierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin (a) und (b) beide in einem wässrigen Reaktionsgemisch durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die C-terminale Detektionsgruppierung p-Nitroanilid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die MAP eine menschliche MAP ist.
Reaktionsgemisch, umfassend: (a) ein Peptid, das ein N-terminates Methionin, das durch die Methioninaminopeptidase abgespalten werden kann, und eine C-terminate Detektionsgruppierung, die durch eine zweite Peptidase nur freigesetzt werden kann, wenn das N-terminate Methionin vom Peptid abgespalten wurde, umfasst; und (b) die zweite Peptidase, worin das Reaktionsgemisch zur Verwendung als Reaktionsgemisch nach Anspruch 4 geeignet ist.
Reaktionsgemisch nach Anspruch 7 oder Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die zweite Peptidase Dipeptidylpeptidase IV ist und das Peptid Met-X_aa-Pro umfasst, worin X_aa Ala, Cys, Gly oder Ser ist.
Reaktionsgemisch nach Anspruch 8 oder Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Peptid Met-Gly-Pro-p-Nitroanilid ist.
Reaktionsgemisch nach Anspruch 7, ferner umfassend eine MAP.
Reaktionsgemisch nach Anspruch 10 oder Verfahren nach Anspruch 1, worin die MAP eine Typ-2-MAP ist.
Set zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 4, umfassend die zweite Peptidase, das Peptid und Anweisungen zur Durchführung des Verfahrens.
Set nach Anspruch 12, worin die zweite Peptidase Dipeptidylpeptidase IV und das Peptid Met-X_aa-Pro-p-Nitroanilid ist, worin X_aa für Ala, Cys, Gly oder Ser steht.
Set nach Anspruch 12, ferner umfassend eine MAP.
Set nach Anspruch 14, worin das Peptid Met-Gly-Pro-p-Nitroanilid und die MAP eine Typ-2-MAP ist.
Peptid, umfassend ein N-terminales Methionin, das durch eine Methioninaminopeptidase abgespalten werden kann, und eine C-terminale Detektionsgruppierung, die durch eine zweite Peptidase nur freigesetzt werden kann, wenn das N-terminate Methionin vom Peptid abgespalten wurde, worin die zweite Peptidase Dipeptidylpeptidase IV ist.
Peptid nach Anspruch 16, worin das Peptid Met-X_aa-Pro umfasst, worin X_aa für Ala, Cys, Gly oder Ser steht.
Peptid nach Anspruch 17, bestehend aus Met-Gly-Pro-p-Nitroanilid.