DE60029913T2

DE60029913T2 - Verbesserter DNA-Chip mit thermischem Gradienten (ATGC), dessen Herstellungsverfahren und Verfahren zur Durchführung biochemischer Reaktionen

Info

Publication number: DE60029913T2
Application number: DE60029913T
Authority: DE
Inventors: Tomoharu Kokubunji-shi Kajiyama; Yuji Kodaira-shi Miyahara; Katsuji Kodaira-shi Murakawa
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 2000-03-17
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2020-03-18
Also published as: EP1108472B1; US6428749B1; EP1108472A3; US20020164778A1; EP1108472A2; DE60029913D1; US6346383B1; US6977149B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen verbesserten DNA-Chip mit thermischem Gradienten (advanced thermal gradient DNA chip, ATGC), ein Substrat für ATGCs, ein Verfahren zur Herstellung von ATGCs, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung biochemischer Reaktionen sowie ein Speichermedium.
Als Verfahren zur Bestimmung der Basensequenz einer Nucleinsäure ist ein Verfahren zur Erfassung der Hybridisierung zwischen einem interessierenden einzelsträngigen Polynucleotid und einer zuvor konstruierten einzelsträngigen Oligonucleotidsonde unter Verwendung eines Chips zur Erfassung von Polynucleotiden bekannt, der die einzelsträngigen Oligonucleotidsonden in immobilisierter Form in Abhängigkeit von der Art der Sequenzen in seinen verschiedenen Bereichen enthält. Zu den Beispielen für Chips zur Erfassung von Polynucleotiden gehören Polynucleotiderfassungschips zur Diagnose, auf denen DNAs angeordnet sind, die zu spezifischen mutierten interessierenden Sequenzen komplementär sind (Science, Bd. 270, 467–470, 1995), sowie Polynucleotiderfassungschip für das SBH (Sequencing By Hybridization)-Verfahren, bei denen die Oligonucleotidsonden, die befähigt sind, mit sämtlichen möglichen, in einer Probe vorliegenden Basensequenzen zu hybridisieren, auf den Chips vorgesehen sind, um die Basensequenzen der Messobjekte zu bestimmen (J. DNA Sequencing and Mapping, Bd. 1, 375–388, 1991).
Die thermische Stabilität der Hybridisierung zwischen Oligonucleotidsonden und dem einzelsträngigen Polynucleotid variiert in Abhängigkeit von der Art der Basensequenzen. Der Grund hierfür wird im Folgenden beschrieben. Die Bindung zwischen Adenin (A) und Thymin (T) oder Adenin (A) und Uracil (U) beruht auf zwei Wasserstoffbrückenbindungen pro Basenpaar, während die Bindung zwischen Guanin (G) und Cytosin (C) auf einer Bindung über drei Wasserstoffbrücken pro Basenpaar beruht (vergleiche 11), was zu gewissen Unterschieden in der Bindungsstärke zwischen diesen beiden Bindungstypen führt. Da die G-C-Bindung stärker ist als die A-T-Bindung (vergleiche 12A), ist die thermische Stabilität der ersteren Bindung größer. Wenn daher die thermische Stabilität der Hybridisierung von Sequenzen mit gleicher Basenlänge verglichen wird, ist die thermische Stabilität der Hybridisierung, bei der lediglich A-T- oder A-U-Bindungen vorliegen, am geringsten, während die thermische Stabilität am höchsten ist, wenn G-C-Bindungen beteiligt sind. Allgemein wird die thermische Stabilität der Hybridisierung durch die Temperatur dargestellt, bei der sowohl eine Bindung als auch eine Dissoziation in einem Verhältnis von jeweils 50% vorliegen (Schmelztemperatur, im Folgenden als Tm bezeichnet) (12B).
Wenn als Beispiel die Oligonucleotid-DNA-Sonde eines Octamers herangezogen wird, beträgt der Wert Tm der doppelsträngigen DNA, die nur A-T-Bindungen aufweist, 15,2°C (Wert berechnet nach dem % GC-Verfahren (Breslauer, K. J., et al., "Predicting DNA Duplex stability from the base sequence", Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 3746–3750)), während der Wert Tm für die doppelsträngige DNA, die nur G-C-Bindungen aufweist, 56,2°C beträgt, was zu einer Differenz von 41,0°C führt (12C).
Wenn, wie oben angegeben, der Wert von Tm für die Hybridisierung für jede Sonde erheblich variiert, ist es erforderlich, das Hybridisierungsassay bei dem Wert für Tm für jede entsprechende Sonde durchzuführen. Wenn die Temperatur höher als Tm ist, kann ein einzelsträngiges Polynucleotid kaum wirksam an eine Sonde gebunden werden. Wenn die Temperatur andererseits unter Tm liegt, ist das Untergrundrauschen, das von Fehlpaarungsbindungen herrührt, erhöht, was zu einer Verringerung der Messauflösung führt. Wenn entsprechend verschiedene Arten von Sonden auf dem Chip zur Erfassung von Polynucleotiden immobilisiert sind und die Sonden mit der Probe des einzelsträngigen Polynucleotids unter Konstanthaltung der Temperatur auf dem Chip hybridisiert werden, führt dies zu Problemen, wie etwa Unterschieden im Ausmaß der Hybridisierung und Unterschieden in der Fehlpaarungswahrscheinlichkeit aufgrund von Unterschieden in der thermischen Stabilität der individuellen Sonden.
Zur Lösung der oben beschriebenen Probleme wurde herkömmlicherweise versucht, beispielsweise die Salzkonzentration im Lösungsmittel einzustellen oder die Dichte oder die Basenlänge der auf dem Erfassungschip zu immobilisierenden Sonden für jede Sonde zu variieren, wobei die Temperatur für die Hybridisierung sämtlicher Sonden auf dem Erfassungschip konstant gehalten wurde. Ein derartiger Ansatz ist allerdings für eine vollständige Eliminierung des Effekts unterschiedlicher Werte von Tm nicht ausreichend.
Als Beispiel für Mittel zur Lösung dieses Problems ist in dem offengelegten japanischen Patent Nr. H11-127900 ein Verfahren offenbart, bei dem eine leitende Heizspur um jede analytische Elektrode herum vorgesehen ist, oder ein Verfahren, bei dem jede analytische Elektrode mit einem Laser erwärmt wird. In dem offengelegten japanischen Patent Nr. H11-127900 ist allerdings ein Verfahren offenbart, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die analytische Elektrode lediglich erwärmt wird, wobei aber keine Mittel zur Regelung beispielsweise der Temperatur der analytischen Elektrode auf ein konstantes Niveau offenbart sind.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen und sein Substrat anzugeben, das befähigt ist, die Temperatur für die biochemische Reaktion einschließlich der Hybridisierung der Oligonucleotidsonde mit einem Polynucleotid zu regeln.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, die es erlauben, dass die biochemischen Reaktionen in einer Vielzahl von Reaktionssystemen gleichzeitig bei Temperaturen ablaufen, die für die individuellen Reaktionssysteme geregelt sind; ferner soll ein zugeordnetes Datenspeichermedium angegeben werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Substrat eines Chips zur Erfassung biochemischer Reaktionen anzugeben, das eine Vielzahl von Inseln aus einem wärmeleitenden Material aufweist, die auf einer Membran ausgebildet sind, wobei die Inseln voneinander beabstandet angeordnet sind und jede Insel mit einem Temperaturregler ausgerüstet ist.
Der Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen der vorliegenden Erfindung ist in Anspruch 1 definiert.
Es ist bevorzugt, wenn die Membran aus einem Material mit hoher Isolierfähigkeit, thermischer Isolierfähigkeit und physikalischer Festigkeit hergestellt ist. Eine elektrische Leitfähigkeit von 10⁸ Ω·m oder mehr ist für das Membranmaterial ausreichend; sie beträgt bevorzugt 10¹⁰ Ω·m oder mehr. Eine Wärmeleitfähigkeit von 10 W/m·K oder weniger ist für das Membranmaterial ausreichend; sie beträgt bevorzugt 1 W/m·K oder weniger.
Es ist leichter, die Temperatur jeder Insel zu regeln, wenn die Membran aus einem Material mit hohem (elektrischem) Isolationsvermögen und hohem thermischem Isolationsvermögen besteht. Die Membran kann beispielsweise aus zumindest einem Material aus der Gruppe von Materialien wie Siliciumnitrid, Siliciumoxid, Aluminiumoxid, Ta₂O₅ bestehen, oder sie kann eine Membran aus einem Kompositmaterial aus diesen Materialien darstellen. Hiervon ist eine Kompositmembran aus SiN und SiO₂ bevorzugt. Da SiN Alkalibeständigkeit aufweist, können Sonden mit Hilfe der Silankupplung in alkalischer Lösung auf der SiN-Membran immobilisiert werden. Die SiN-Membran ist ferner befähigt, die elektronische Schaltung zur Temperaturregelung, die darunter vorgesehen ist, vor Lösungen zu schützen, zum Beispiel einer Probenlösung.
Eine Schichtdicke von 1–500 μm ist ausreichend; sie beträgt bevorzugt 5–20 μm.
Es ist bevorzugt, für den Bereich zur Bindung der Sonde auf der Membran eine Vertiefung anzubringen. Eine solche Vertiefung ist zum Halten der Probenlösung auf einem Chip günstig, wenn die biochemische Reaktion ablaufen gelassen wird, indem die Probenlösung mit der Sonde in Kontakt gebracht wird.
Auf der den Inseln gegenüberliegenden Oberfläche kann ferner eine Resistmembran erzeugt werden. Die Resistmembran kann aus einem lichtempfindlichen Polyimidharz oder dergleichen bestehen.
Auf der Membran werden eine Vielzahl von Inseln aus einem Wärmeleiter erzeugt. "Eine Vielzahl von Inseln" bedeutet mindestens 2 Inseln und vorzugsweise 10–1000 Inseln, obgleich die Anzahl der Inseln nicht definiert ist. Eine Vielzahl von Inseln können entweder in einer Linie oder zweidimensional angeordnet sein, das heißt, in einer ersten Richtung (Zeile) und einer zweiten Richtung (Spalte).
Die Inseln werden aus einem Wärmeleiter erzeugt. Beispiele für Wärmeleiter sind Kristalle von Si, Metalle wie Ag, Au und Cu sowie Silicium, wie etwa Polysilicium und amorphes Silicium. Der Wärmeleiter, aus dem die Inseln aufgebaut sind, ist bevorzugt vom Temperaturregler elektrisch isolierbar. Silicium ist als Wärmeleiter zur Erzeugung der Inseln bevorzugt, da es ein guter Wärmeleiter ist und vom Temperaturregler elektrisch isoliert werden kann. Die Isolierung zwischen dem Wärmeleiter und dem Temperaturregler kann durch Ausbildung eines pn-Übergangs im Silicium sichergestellt werden.
Die Inseln sind voneinander beabstandet. Die Abstände zwischen den Inseln dienen als Ersatz für ein Wärmeisoliermaterial, wodurch die Temperatur jeder Insel leicht unabhängig geregelt werden kann.
Für eine Insel ist eine Größe von 10–1000 μm² ausreichend, bevorzugt 50–500 μm². Ein Abstand von 50–1000 μm zwischen den Inseln ist ausreichend; er beträgt bevorzugt 100–500 μm. Die Form der Inseln ist nicht speziell definiert. Wenn zum Beispiel die Inseln aus kristallinem Si aus einer flachen Platte aus kristallinem Si mit 100-Ebenen als Oberfläche durch Entfernen unnötiger Bereiche durch Ätzen mit KOH erzeugt werden, werden während des Herstellungsprozesses 111-Ebenen freigelegt, die eine regelmäßige pyramidenartige Form ergeben.
Jede der Vielzahl von Inseln ist mit dem Temperaturregler versehen. Es ist insbesondere bevorzugt, für jede Insel eine Heizschaltung und eine Temperaturerfassungsschaltung vorzusehen. Die Heizschaltungen und die Temperaturerfassungsschaltungen können so gesteuert werden, dass sie entweder unabhängig für jede Insel oder für jede Gruppe von Inseln betrieben werden.
Wenn ferner eine Vielzahl von Inseln zweidimensional angeordnet sind, können die Heizschaltungen und die Temperaturerfassungsschaltungen so gesteuert werden, dass sie für jede (erste oder zweite) Reihe unabhängig betrieben werden. Die Größe des Chips zur Erfassung biochemischer Reaktionen ist mit 25 mm² bis 100 cm² ausreichend und beträgt bevorzugt 100 mm² bis 14 cm².
Mit einem Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen, der durch Immobilisierung von Sonden auf einem Substrat des Chips zur Erfassung biochemischer Reaktionen gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt ist, kann der Einfluss der Temperatur auf benachbarte Sondenzellen (Reaktionssysteme) verringert werden, so dass die biochemische Reaktion in jeder der Sondenzellen (in jedem Reaktionssystem) bei einer geeigneten Temperatur vor sich gehen kann.
Das Substrat für den Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise mit einer Wärmeabführeinrichtung versehen, die es erlaubt, Wärme nach außen abzuleiten, und zwischen den Inseln angeordnet ist. Jede Wärmeabfuhreinrichtung besitzt vorzugsweise einen Aufbau (zum Beispiel eine Gitterstruktur), der einen direkten Kontakt mit den Inseln verhindert. Die Wärmeabfuhreinrichtungen können entweder lediglich für eine Richtung oder für beide Richtungen der ersten und der zweiten Richtung abgebracht sein. Wenn die Sonden je nach der Nähe der optimalen Temperaturen der biochemischen Reaktionen in Gruppen unterteilt und an der Membran gebunden sind, können die Wärmeabfuhreinrichtungen für jeden Bereich solcher Gruppen entsprechend vorgesehen sein.
Es ist bevorzugt, die Wärmeabfuhreinrichtungen aus Materialien mit guter Wärmeleitfähigkeit zu erzeugen, etwa aus Si, Au, Ag, Cu und dergleichen.
Die Erzeugung von Wärmeabfuhreinrichtungen zwischen den Inseln ermöglicht eine Abführung von Wärme nach außen, bevor sie von irgendwelchen benachbarten Inseln übertragen wird.
Der Abstand zwischen einer Insel und einer Wärmeabfuhreinrichtung ist mit 10–500 μm ausreichend und beträgt bevorzugt 10–250 μm.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung des Substrats für den Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen und insbesondere auf ein Verfahren, das folgende Schritte umfasst:

(a) Erzeugung einer Membran auf einer Seite einer flachen Scheibe eines Wärmeleiters und
(b) Erzeugung von Inseln auf dem Wärmeleiter durch Entfernen unnötiger Bereiche von der anderen Seite der flachen Scheibe des Wärmeleiters.

Bei dem oben erwähnten Verfahren kann der Temperaturregler auf einer Oberfläche der flachen Scheibe des Wärmeleiters vorgesehen sein, und die Membran kann darauf ausgebildet werden.
Als eine Ausführungsform des Herstellungsverfahrens für das Substrat des Chips zur Erfassung biochemischer Reaktionen kann eine Maske mit dem gewünschten Bildmuster auf der Oberfläche der flachen Platte des Wärmeleiters gegenüber der Oberfläche, auf der die Membran ausgebildet ist, vorgesehen werden, so dass die mit der Maske versehene Oberfläche geätzt werden kann, bis die auf der anderen Oberfläche ausgebildete Membran unter Bildung von Inseln des Wärmeleiters auf der Membran freigelegt wird, die dem Bildmuster der Maske entsprechen. Die Maske kann beispielsweise eine Membran aus Siliciumnitrid sein.
Die vorliegende Erfindung gibt ferner einen Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen an, der eine auf dem Substrat des oben beschriebenen Chips zur Erfassung biochemischer Reaktionen immobilisierte Sonde aufweist.
Die Oberfläche der Siliciumnitrid-Membran ist zur Immobilisierung der Sonden darauf bevorzugt. In diesem Fall kann die Sonde mit einer Aminogruppe auf der Oberfläche der silanisierten Siliciumnitrid-Membran durch Silankupplung immobilisiert werden.
Der Begriff "Sonde" bedeutet Substanzen, die eine bestimmte Substanz, eine bestimmte Stelle, einen bestimmten Zustand und dergleichen spezifisch erfassen können; hierzu gehören Oligonucleotid-DNA/RNA-Sonden, Proteinsonden, wie Antikörper, und dergleichen. Im Fall der Oligonucleotid-DNA/RNA-Sonde ist es ausreichend, wenn die Anzahl der Basen 4–500 nt (Nucleotide) und bevorzugt 8–200 nt (Nucleotide) beträgt. Die Oligonucleotidsonde kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und ist unter dem Gesichtspunkt der Effizienz der Bindung zwischen der Sonde und der zu bindenden Substanz bevorzugt einzelsträngig.
Auf der Membran auf dem Substrat des Chips zur Erfassung biochemischer Reaktionen können Sonden nach einem bekannten Verfahren immobilisiert werden. Wenn zum Beispiel die Sondenzellen auf der Membran silanisiert sind, kann eine Sonde mit einer Aminogruppe durch Silankupplung auf der Membran immobilisiert werden. Die Inseln sollten unter den Probenzellen auf der Membran vorgesehen sein.
Nach dem Immobilisieren der Sonde wird der Bereich der Membran, der nicht zur Sondenzelle gehört, ferner vorzugsweise mit Polylysin beschichtet, um die Bindungsstelle inaktiv zu machen, die auf der mit Silan beschichteten Oberfläche keine Bindung mit der Sonde eingeht. Die Polylysinbeschichtung kann verhindern, dass sich Proben aus DNA, RNA und dergleichen nichtspezifisch an der silanbeschichteten Oberfläche binden.
Die Art der Sonden unterliegt keiner Einschränkung, und es können eine oder mehrere Arten von Sonden verwendet werden. Wenn mehrere Arten von Sonden auf einem einzigen Chip immobilisiert sind, können mehrere Erfassungsobjekte in einer Probe gleichzeitig erfasst werden. Alternativ dazu kann, wenn mehrere Arten von Sonden auf einem einzigen Chip immobilisiert sind, eine Art von Erfassungsobjekt in einer Vielzahl von Proben gleichzeitig erfasst werden.
Der Erfassungschip gemäß der vorliegenden Erfindung kann zur Erfassung biochemischer Reaktionen Verwendung finden, zum Beispiel zur Erfassung von DNA, cDNA, RNA und Proteinen sowie von Antigen-Antikörper-Reaktionen.
Wenn der Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann die biochemische Reaktion in jeder Sondenzelle (Reaktionssystem) bei einer optimalen Temperatur durchgeführt werden, indem der Einfluss der Temperatur einer benachbarten Sondenzelle (Reaktionssystem) verringert wird.
Die vorliegende Erfindung gibt ferner eine Vorrichtung für biochemische Reaktionen an, die es ermöglicht, die biochemischen Reaktionen in einer Vielzahl von Reaktionssystemen auf einem Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen stattfinden zu lassen. Die Vorrichtung umfasst einen Heizer zur Erwärmung des gesamten Chips zur Erfassung biochemischer Reaktionen auf eine Temperatur, die höher ist als die optimale Temperatur für jede biochemische Reaktion, sowie einen Temperaturregler zur Regelung der Temperatur jedes Reaktionssystems auf eine für jede biochemische Reaktion geeignete Temperatur.
Der Temperaturregler regelt bevorzugt die Temperatur jedes Reaktionssystems aufgrund eines Protokolls.
Die vorliegende Erfindung gibt ferner ein computerlesbares Speichermedium an, das ein Programm zum Betrieb einer Vorrichtung zur Durchführung biochemischer Reaktionen speichert, die es erlaubt, die biochemischen Reaktionen in einer Vielzahl von Reaktionssystemen auf einem Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen stattfinden zu lassen, wobei die Vorrichtung einen Heizer zur Erwärmung des gesamten Chips zur Erfassung biochemischer Reaktionen auf eine Temperatur, die höher ist als die optimale Temperatur für jede biochemische Reaktion, sowie einen Temperaturregler zur Regelung der Temperatur jedes Reaktionssystems auf eine für jede biochemische Reaktion geeignete Temperatur aufweist.
Wenn die optimale Temperatur für eine biochemische Reaktion die Schmelztemperatur eines mit einer Oligonucleotidsonde und einem damit komplementären Strang gebildeten Doppelstrangs darstellt, ist die Temperatur, die höher ist als die optimale Temperatur für die biochemische Reaktion, bevorzugt eine Temperatur, bei der das doppelsträngige Nucleotid vollständig dissoziiert, zum Beispiel eine Temperatur im Bereich von 90–99°C. Die für die biochemische Reaktion geeignete Temperatur kann eine Temperatur im Bereich der Schmelztemperatur sein, zum Beispiel die Schmelztemperatur ±2°C.
Im Folgenden wird eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben. Eine Probe wird in Reaktionssysteme auf einem Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen gemäß Anspruch 1 aufgespritzt. Anschließend wird der Chip abgedeckt, in einen Inkubator gebracht und auf eine Maximaltemperatur erwärmt, zum Beispiel auf 90°C. Der Inkubator ist normalerweise mit einem Heizer und einer Kühleinrichtung versehen, so dass die Innentemperatur auf eine vorgegebene Temperatur eingestellt werden kann. Die Temperatur des Inkubators wird dann auf eine Minimumtemperatur eingestellt, zum Beispiel auf 15°C, um die Temperatur sämtlicher Reaktionssysteme zu verringern. Wenn die Temperatur jedes Reaktionssystems (zum Beispiel einer Sondenzelle) niedriger geworden ist als eine eingestellte Temperatur (zum Beispiel die Schmelztemperatur des mit jeder Sonde und ihrem komplementären Strang gebildeten Doppelstrangs), wird der Heizer eingeschaltet, um die biochemische Reaktion stattfinden zu lassen, wobei die eingestellte Temperatur für jedes Reaktionssystem für eine Zeitdauer (zum Beispiel 12 Stunden) aufrechterhalten wird. Nach der Reaktion wird das Reaktionssystem (zum Beispiel die Sondenzelle) gewaschen, und die biochemische Reaktion wird erfasst, worauf die als Ergebnis der Erfassung erhaltenen Daten verarbeitet werden.
Zur Erfassung wird allgemein ein Fluoreszenzmarker an eine Probe gebunden, so dass die Stärke der Fluoreszenz des an die Sonde gebundenen Markers mit einem konfokalen Mikroskop gemessen werden kann; die Menge der gebundenen Probe wird auf der Basis der Stärke der Fluoreszenz berechnet.
Normalerweise werden biochemische Reaktionen bei einer optimalen Temperatur für die biochemischen Reaktionen lediglich durch Erwärmen der Reaktionssysteme gestartet. Dieses Verfahren führt jedoch häufig zu einer Bindung der Sonde an eine andere Substanz als die zu erfassende Substanz, was Rauschen bei der Erfassung der zu bestimmenden Substanz hervorruft. Daher können eine Anhebung der Temperatur von Reaktionssystemen auf ein Niveau, das höher ist als die optimale Temperatur für die biochemischen Reaktionen, und eine anschließende Temperaturerniedrigung auf die optimale Temperatur die Wahrscheinlichkeit verringern, dass die Sonde an eine andere Substanz als die zu erfassende Substanz gebunden wird, wodurch das Rauschen bei der Erfassung der zu bestimmenden Substanz verringert wird.
Für die Hybridisierung der Oligonucleotidsonde mit dem Polynucleotid ist die optimale Temperatur die Schmelztemperatur des Doppelstrangs, der durch die Sonde und den dazu komplementären Strang gebildet wird. Wenn die Reaktion bei der Schmelztemperatur lediglich durch Erwärmen des Reaktionssystems ablaufen gelassen wird, kann die Oligonucleotidsonde an ein anderes Nucleotid binden als das Nucleotid mit dem zur Sonde komplementären Strang (zu erfassende Substanz), was zu einer sogenannten Fehlpaarung führt, die ein Rauschen bei der Erfassung der zu bestimmenden Substanz hervorruft. Wenn allerdings die Temperatur des Reaktionssystems einmal auf ein Niveau angehoben wurde, das höher ist als die Schmelztemperatur, und die Temperatur dann auf die Schmelztemperatur verringert wird, wird die Wahrscheinlichkeit dafür, dass die Sonde an ein anderes Nucleotid gebunden wird als das Nucleotid mit dem zur Sonde komplementären Strang, verringert, was zur Verringerung des Rauschens bei der zu bestimmenden Substanz beiträgt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Temperatur sämtlicher Reaktionssysteme zuerst auf Niveaus angehoben, die höher sind als die optimalen Temperaturen für die Reaktionen, und anschließend auf die optimalen Temperaturen verringert, wobei diese Temperaturen für eine bestimmte Zeitdauer aufrechterhalten werden, zum Beispiel dadurch, dass den Reaktionssystemen durch Heizer die erforderliche Wärmemenge zugeführt wird.
Dementsprechend wird im Vergleich zu dem Verfahren, bei dem die Temperatur jedes Reaktionssystems auf die optimale Temperatur angehoben wird und die Reaktion unter Aufrechterhaltung dieser Temperatur ablaufen gelassen wird, beim vorliegenden Verfahren nicht nur die dem Reaktionssystem zuzuführende gesamte Wärmemenge verringert, sondern auch eine leichtere Temperaturkontrolle für jedes Reaktionssystem ermöglicht. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist gegenüber dem herkömmlichen Verfahren zur Durchführung einer Reihe von biochemischen Reaktionen durch paralleles Ablaufenlassen vorteilhaft.
Alternativ kann die optimale Temperatur für eine spezielle Reaktion ermittelt werden, wenn das oben beschriebene Verfahren auf eine Vielzahl von Reaktionssystemen angewandt wird, wobei die gleiche Reaktion bei von System zu System variierenden Temperaturen durchgeführt wird.
Die Erfindung wird im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen lediglich beispielhaft erläutert:
Die 1A bis 1C sind schematische Darstellungen, die das Substrat eines Chips zur Erfassung biochemischer Reaktionen zur Immobilisierung von Oligonucleotid-DNA (im Folgenden als DNA- Chip-Substrat bezeichnet) zeigen. 1A ist eine Draufsicht auf ein DNA-Chip-Substrat 1 mit 100 Sondenzellen 2, das insgesamt 10 Zeilen in waagrechter Richtung und 10 Spalten in senkrechter Richtung aufweist. 1B ist eine vergrößerte Teilansicht des eingerahmten Bereichs von 1A, und 1C ist eine vergrößerte Teilansicht einer Sondenzelle 2, die in 1B dargestellt ist.
Die 2A und 2B sind schematische Darstellungen, welche die Formen der auf der Membran ausgebildeten Inseln veranschaulichen. 2A ist eine vergrößerte Teilansicht der Rückseite des DNA-Chip-Substrats. 2B ist eine senkrechte Schnittansicht längs der gestrichelten Linie A-A' von 1B.
3 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel für die Temperatureinstellung bei einem DNA-Chip zeigt.
Die 4A und 4B sind schematische Darstellungen, welche die Formen der auf dem DNA-Chip ausgebildeten Inseln und die Gitterstruktur veranschaulichen. 4A ist eine vergrößerte Rückansicht des DNA-Chip-Substrats, und 4B ist eine senkrechte Schnittansicht des DNA-Chip-Substrats 1 mit der darauf ausgebildeten Gitterstruktur längs der gestrichelten Linie A-A'.
5 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung des Effekts der Gitterstruktur.
6 ist eine schematische Darstellung, die eine Ausführungsform erläutert, bei der eine Kühleinrichtung längs des Umfangs der Gitterstruktur vorgesehen ist.
7 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung des ersten Prozesses zur Herstellung des DNA-Chip-Substrats.
8 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung des zweiten Prozesses zur Herstellung eines DNA-Chip-Substrats.
9 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung des dritten Prozesses zur Herstellung eines DNA-Chip-Substrats.
10 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau eines Beispiels für die Vorrichtung zur Erfassung biochemischer Reaktionen zeigt.
11 ist eine Darstellung zur Erläuterung der Art der Bindung zwischen Adenin (A) und Thymin (T) und der Art der Bindung zwischen Guanin (G) und Cytosin (C). Die Striche zwischen O in der Molekülstruktur und H in der Molekülstruktur stellen Wasserstoffbindungen dar.
Die 12A bis 12C sind Darstellungen zur Erläuterung des Wertes Tm der Hybridisierung, der je nach Art der Sonde variiert. 12A zeigt, dass die Bindungsstärke zwischen der auf dem DNA-Chip-Substrat immobilisierten Sonde und dem Polynucleotid in der Probenlösung in Abhängigkeit von der Sequenz der Sonde variiert. 12B zeigt die Kurve von Tm bei der Hybridisierung. Die y-Achse stellt den Grad der Dissoziierung des DNA-Doppelstrangs dar, während die x-Achse die Temperatur darstellt. 12C zeigt den Wert für Tm für Sonden mit 8 Basen, der nach dem % GC-Verfahren berechnet wurde.
13 ist eine Draufsicht auf einen DNA-Chip.
14 ist ein schematisches Diagramm, das die Änderung der Temperatur von Sondenzellen zeigt, die zu Spalte a, Spalte c, Spalte g und Spalte i des DNA-Chips von 13 gehören.
15 ist ein Diagramm, das die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung bei der Messung der Proben-DNA des Sequenzprotokolls SEQ ID NO: 1 zeigt.
16 ist ein Diagramm, das die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung bei der Messung der Proben-DNA des Sequenzprotokolls SEQ ID NO: 6 zeigt.
17 ist ein Diagramm, das die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung bei der Messung der Proben-DNA des Sequenzprotokolls SEQ ID NO: 7 zeigt.
18 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel für die Form der Heizerschaltung und des Temperaturerfassungselements in einer Sondenzelle zeigt.
19 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Temperatur (t) der Sondenzelle und dem Temperaturerfassungselement (v) in der Temperaturerfassungsschaltung von 18 zeigt.
20 ist ein Diagramm, das die an die Betriebselektrode anzulegende Spannung in Abhängigkeit von der Zeitsteuerung des Heizens durch den Heizer zeigt.
Die Bestandteile der vorliegenden Erfindung und die entsprechenden Bezugszeichen werden im Folgenden beschrieben.

1: Substrat für den DNA-Chip
2: Sondenzelle
4: Insel
5: Heizerschaltung
6: Temperaturerfassungselement mit pn-Übergang
1001: Heizeranschluss (+)
1002: Heizeranschluss (–)
1003: Temperaturerfassungsanschluss (+)
1004: Temperaturerfassungsanschluss (–)
21: Si-Insel
22: SiN/SiO₂-Membran
24: Temperaturaufbaubereich
25: Sonde
26: Probenlösung
27: Abdeckung
41: Gitterstruktur (Wärmeabfuhreinrichtung)
51: Probenpuffer
52: Acrylharzplatte
61: Metallrahmen
71: Substrat vom n-Typ
72: p-Wanne
73: p-Wanne
74: SiO₂-Membran
75: Diffusionsschicht vom n-Typ
76: Diffusionsschicht vom n-Typ
77: Diffusionsschicht vom n-Typ
78: Diffusionsschicht vom p-Typ
79: Diffusionsschicht vom p-Typ
81: Isolierung zwischen den ersten Schichten
82: Verdrahtung in der ersten Schicht
83: Isolierung zwischen den zweiten Schichten
84: Verdrahtung in der zweiten Schicht
91: Si₃N₄-Membran
101: DNA-Chip
102: gedruckte Leiterplatte
103: Halter
104: Kabel
105: Regler
106: Inkubator
107: Gebläse
108: Kühleinheit
109: Schalter
110: Voltmeter
111: Ausgangsregler
Vpo: Stromquelle des Heizers
Vc: Konstantspannungs-Stromquelle
801: Masseleitung des Sensors
802: positiver Anschluss des Temperatursensors mit pn-Übergang
803: Elektrode
804: Elektrode
805: Masseelektrode des Sensors
806: Masseelektrode des Heizers
901: Seitenfläche der Insel.

Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden unter Bezug auf die Zeichnungen beschrieben.
Beispiel 1: Aufbau des Substrats für einen DNA-Chip
1 ist eine Darstellung, die ein Substrat für einen Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen für die Immobilisierung von Oligonucleotid-DNA (im Folgenden als Substrat für den DNA-Chip bezeichnet) schematisch veranschaulicht. Das Substrat für den DNA-Chip mit immobilisierten Sonden wird als DNA-Chip bezeichnet.
1A ist eine Draufsicht auf ein Substrat für einen DNA-Chip mit insgesamt 100 Sondenzellen, der 10 Zeilen (in horizontaler Richtung) und 10 Spalten (in vertikaler Richtung) aufweist. Das Substrat für den DNA-Chip besitzt bevorzugt eine senkrechte Länge (hy) und eine waagrechte Länge (hx) von jeweils 10 bis 100 mm. Der Abstand Lx vom linken Ende der ersten Sondenzelle bis zum rechten Ende der zehnten Sondenzelle in waagrechter Richtung und der Abstand Ly vom oberen Ende der ersten Sondenzelle bis zum unteren Ende der zehnten Sondenzelle in senkrechter Richtung beträgt jeweils bevorzugt 5–100 mm.
1B ist eine vergrößerte Ansicht des eingerahmten Bereichs von 1A. Die Breite X und die Länge Y jeder Sondenzelle auf dem Substrat für den DNA-Chip zur Immobilisierung von Sonden betragen jeweils bevorzugt 10–1000 μm. Die Zwischenräume zwischen den Sondenzellen betragen bevorzugt jeweils 50–1000 μm.
Unter jeder Sondenzelle ist eine Insel ausgebildet. 1C stellt eine vergrößerte Teilansicht der Sondenzelle 2 von 1B dar. Jede Sondenzelle ist mit einer Heizerschaltung 5 versehen, die aus einer Diffusionsschicht vom n-Typ gebildet ist, und weist ein Temperaturerfassungselement 6 auf, das durch einen pn-Übergang zwischen einer Diffusionsschicht vom p-Typ und einer Diffusionsschicht vom n-Typ ausgebildet ist. Ein Heizeranschluss (+) 1001 und ein Heizeranschluss (–) 1002 sind an den beiden Enden der Heizerschaltung 5 ausgebildet. Wenn an die beiden Anschlüsse eine Spannung so angelegt wird, dass die Seite des Anschlusses 1001 die positive Elektrode ist, fließt Strom in der Diffusionsschicht 5 vom n-Typ und erzeugt Joulesche Wärme. Die Wärmemenge der Jouleschen Wärme kann durch Regelung entweder der Höhe oder der Dauer der angelegten Spannung geregelt werden. Das Temperaturerfassungselement 6 ist mit dem Temperaturerfassungsanschluss (+) 1003, der mit der Diffusionsschicht vom p-Typ verbunden ist, und dem Temperaturerfassungsanschluss (–) 1004 versehen, der mit der Diffusionsschicht vom n-Typ verbunden ist. Die Strom-Spannungs-Kennlinie des pn-Übergangs des Temperaturerfassungselements 6 hängt in erheblichem Maße von der Temperatur des pn-Übergangs ab. Daher kann die Temperatur des pn-Übergangs durch Erfassung der Strom-Spannungs-Kennlinie zwischen den Elementen bestimmt werden. Da ferner die Insel 4 aus einem Wärmeleiter besteht, sind die Temperaturen des pn-Übergangs und der Insel 4 nahezu gleich, so dass auf diese Weise die Temperatur der Sondenzelle 2 auf der Insel 4 durch Messung der Strom-Spannungs-Kennlinie zwischen den pn-Übergangselementen erfasst werden kann. Die Temperaturabhängigkeit der Strom-Spannungs-Kennlinien an den pn-Übergängen, zum Beispiel, wenn die Spannung in Vorwärtsrichtung fest ist und 1003 der positive Anschluss ist, ist so, dass der fließende Strom in Abhängigkeit von der Temperatur des pn-Übergangs exponentiell variiert. Wenn alternativ dazu der Strom in Durchlassrichtung fest ist, kann die Temperatur und die Potentialdifferenz auf der Basis der linearen Funktion angenähert werden.
18 zeigt eine weitere Ausführungsform der Heizerschaltung und des Temperaturerfassungselements einer Sondenzelle. Bei dieser Ausführungsform wird ein Substrat vom n-Typ (n-sub) verwendet, und die Heizerschaltung 5 und das Temperaturerfassungselement 6 auf einer Sondenzelle sind durch separate p-Wannen voneinander getrennt, um die Heizerschaltung und das pn-Übergangselement elektrisch voneinander unabhängig zu machen. Diese Anordnung dient zur Verhinderung einer elektrischen Störung zwischen der Diffusionsschicht vom n-Typ und dem Temperaturerfassungselement 6. Wie in 18 dargestellt ist, ist die Sondenzelle mit dem Regler 105 verbunden, der eine Heizstromquellenschaltung 181 und eine Temperaturerfassungsschaltung 182 aufweist. Der Regler 105 ist ein Beispiel für eine Schaltung zur Erfassung der Temperatur einer Sondenzelle und zur Regelung der Heizung durch den Heizer. Die Heizstromquellenschaltung 181 umfasst eine Heizerstromquelle Vp, einen Ausgangsregler 111 und einen Schalter 109 und ist mit den Anschlüssen 1001 und 1002 der Sondenzelle verbunden. Durch Regelung der Heizerstromquelle Vp und des Ausgangsreglers 111 können die Spannung und der Strom an den Anschlüssen 1001 und 1002 der Sondenzelle und damit die Joulesche Wärme geregelt werden, die in der Heizerschaltung 5 der Sondenzelle auftritt. Die Temperaturerfassungsschaltung 182 umfasst eine Stromquelle Vc, einen Widerstand R und ein Voltmeter 110. Der Anschluss 1003 ist auf Nullpotential gelegt, und der Anschluss 1004 ist mit dem negativen Potential verbunden. In diesem Fall wird eine Vorwärtsspannung angelegt. Wenn der Schaltungswiderstand R so festgelegt ist, dass er einen ausreichend größeren Wert hat als der Widerstand r zwischen den pn-Übergängen, hängt der durch die Temperaturerfassungsschaltung 182 fließende Strom im Wesentlichen von Vc der Stromquelle und dem Widerstand R ab und kann unter Konstantstrombedingungen durch die folgende Formel angenähert werden: Strom I = Vc/R.
Die Potentialdifferenz zwischen den Temperaturerfassungselementen kann durch das Voltmeter 110 gemessen werden.

Das Prinzip, aufgrund dessen die Temperatur erfasst werden kann, wird im Folgenden erläutert. 19 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Temperatur der Sondenzelle (t) und der Potentialdifferenz zwischen den Temperaturerfassungselementen 6 (v), wie in 18 dargestellt, zeigt. Die Temperatur des pn-Übergangs wird unter den Bedingungen R = 800 kΩ, Vc = 8 V und I = 10 μA von 20 bis 60°C variiert.

Temperatur des Temperaturerfassungselements (°C) (mV)	Potentialdifferenz zwischen den Temperaturerfassungselementen
20,0	537
25,0	524
30,0	512
35,0	500
40,0	489
45,0	477
50,0	465
55,0	453
60,0	442

Aufgrund der obigen experimentellen Ergebnisse kann die Beziehung zwischen der Potentialdifferenz Vx und der Temperatur Tx als lineare Funktion mit einer Steigung von etwa –2,37 mV/°C angenähert werden, wobei die folgende Formel erhalten werden kann: Tx = 20 + (537 – Vx)/2,37
Unter Verwendung der obigen Formel kann die Temperatur durch Messung der Potentialdifferenz mit dem Temperaturerfassungselement ermittelt werden.
Die an die Betriebselektrode anzulegende Spannung und die Zeitsteuerung der Heizung durch den Heizer wird unter Bezug au 20 beschrieben. Wenn die Temperatur für die Insel 4 einzustellen ist, das heißt, wenn die gewünschte Temperatur des pn-Übergangs als T₀ gegeben ist, ist die Potentialdifferenz v₀ unter dieser Bedingung die Soll-Potentialdifferenz des pn-Übergangs. Wenn eine ausreichend hohe Temperatur als Anfangsbedingung festgesetzt wird, wobei der Heizer zur Beheizung der Insel ausgeschaltet ist, fällt die Temperatur gemäß der in 19 dargestellten Kennlinie, und die Potentialdifferenz der pn-Übergänge steigt an. Zum Zeitpunkt t1, wenn die Differentialdifferenz der pn-Übergänge v₀ überschritten hat, wird der Heizer zur Beheizung der Insel eingeschaltet. Als Ergebnis steigt die Temperatur der Insel an, und die Potentialdifferenz der pn-Übergänge nimmt ab. Wenn zum Zeitpunkt t2 die Potentialdifferenz kleiner geworden ist als die Soll-Potentialdifferenz v₀, wird der Heizer zur Beheizung der Insel abgeschaltet, um die Beheizung der Insel zu stoppen. Da die Temperatur der Insel abfällt, steigt die Potentialdifferenz der pn-Übergänge wieder an. Durch Wiederholung einer solchen Steuerung kann die Potentialdifferenz v₀ des pn-Übergangs und damit die Soll-Temperatur T₀ aufrechterhalten werden.
Der oben beschriebene Aufbau kann zur Messung der Temperatur der Sondenzelle und zur Regelung der Temperatur durch Regelung der Menge an Joulescher Wärme herangezogen werden.
2 ist eine Darstellung zur Erläuterung der Formen der Inseln, die auf einer Membran ausgebildet sind.
2A ist ein vergrößertes Bild der Rückseite des Substrats für einen DNA-Chip. Eine Si-Insel 21 ist auf einer SiN/SiO₂-Membran 22 ausgebildet. Sowohl die Breite als auch die Länge der Si-Insel 21 betragen etwa 500 μm. Der Abstand zwischen jeder der Si-Inseln ist im Wesentlichen gleich dem Abstand zwischen jeder der Sondenzellen.
2B ist eine Schnittdarstellung gemäß A-A' in 1B. Die Höhe der Si-Insel 21 beträgt 250 μm. Die Länge der Grundfläche der Si-Insel 21 beträgt etwa 150 μm. Der Neigungswinkel der geneigten Seite der Insel 21 beträgt etwa 55°. Die Si-Insel 21 weist die Heizerschaltung 5 der Diffusionsschicht vom n-Typ auf. Der Abstand zwischen jeder der Si-Inseln beträgt 500–700 μm. Die Dicke der SiN/SiO₂-Membran 22 beträgt dort, wo die Insel ausgebildet ist (d. h., die Fläche der Sondenzelle), etwa 5 μm. Im Umfangsbereich (dem Bereich 3–5 mm vom Rand der Membran) beträgt die Dicke der Si-Schicht 250 μm.
Der Bereich auf der SiN/SiO₂-Membran 22, der mit der darunter liegenden Si-Insel 21 übereinstimmt, ist der Temperaturaufbaubereich 24. Die Sonde 25 ist in diesem Bereich immobilisiert.
Durch Silanisierung der Sondenzelle auf der Membran (Siliciumnitrid-Membranoberfläche) und Anbringen einer Aminogruppe an der Sonde kann die Sonde durch Silankupplung auf der Membran immobilisiert werden.
Die Probenlösung 26 wird bevorzugt in einer Menge aufgegeben, die ausreicht, um eine Lösungsschicht einer Dicke von 10–1000 μm zu erzeugen. Nach Zugabe der Probenlösung 26 wird eine Glasabdeckung 27 aufgelegt.
3 zeigt ein Beispiel für die Temperatureinstellung beim DNA-Chip. Die Temperatur jeder Insel wird auf 15–90°C eingestellt. Wie in 3, welche die Anordnung der Sondenzellen bezüglich der Temperatureinstellung zeigt, können die Sonden entsprechend ihrem Tm-Wert angeordnet werden. So können die Sonden zum Beispiel so angeordnet werden, dass sich die Sonden mit höheren Tm-Werten im Mittelbereich befinden, während die Sonden mit niedrigeren Tm-Werten zum Umfangsbereich hin angeordnet sind. Alternativ können die Sonden von einer Seite des Chips zur anderen Seite hin so angeordnet werden, dass ein Übergang von der Sonde mit dem höchsten Tm-Wert zur Sonde mit dem niedrigsten Tm-Wert vorliegt. Durch Anordnen der Sonden in dieser Weise kann ein gutes Gleichgewicht zwischen Wärmedissipation und Wärmezufuhr für eine leichtere Temperaturkontrolle aufrechterhalten werden.
4 ist eine schematische Darstellung, welche die Formen der Inseln und die auf der Membran ausgebildete Gitterstruktur veranschaulicht.
4A ist eine vergrößerte Rückansicht eines DNA-Chip-Substrats. Mit Ausnahme der Si-Insel 21 ist die Gitterstruktur 41 zwischen den Inseln auf der SiN/SiO₂-Membran 22 ausgebildet.
4B ist eine Querschnittsansicht längs der Linie B-B' in 4A. Die höchste Dicke des Si, aus dem die Gitterstruktur aufgebaut ist, beträgt etwa 250 μm, wobei die Breite etwa 350 μm beträgt. Bei dieser Ausführungsform beträgt der Neigungswinkel der geneigten Seite bei der höchsten Dicke des Si etwa 55°. Der Abstand zwischen dem dicksten Bereich des Si, aus dem die Gitterstruktur aufgebaut ist, und der Si-Insel 21 beträgt etwa 75 μm.
Mit der längs den Inseln 21 ausgebildeten thermisch leitfähigen Schicht (Gitterstruktur) 41 wird es möglich, die Wärme von beliebigen Inseln abzuführen, bevor sie auf eine benachbarte Insel übertragen werden kann. Dies bedeutet, dass die Gitterstruktur als Wärmeabfuhreinrichtung dient.
5 ist eine schematische Darstellung, welche die Wirkung der Gitterstruktur zeigt. Die Bedingungen zur Erzielung dieser Wirkung werden im Folgenden beschrieben. Die Breite und Länge der Si-Insel 21 beträgt jeweils 500 μm. Die Höhe der Si-Insel 21 beträgt 250 μm. Die beiden Basisseiten der Si-Insel 21 sind 150 μm lang. Auf der anderen Seite betragen die Höhe und die Breite des Si, aus dem die Gitterstruktur aufgebaut ist, etwa 250 μm bzw. etwa 300 μm. Der Abstand zwischen dem höchsten Si-Bereich, der die Gitterstruktur bildet, und der Si-Insel 21 beträgt etwa 75 μm. Die Dicke der SiN/SiO₂-Membran 22 beträgt 5 μm. Die Dicke der Wasserschicht 51 (z. B. Probenpuffer) beträgt 20 μm. Die Acrylharzplatte ist 5 μm dick.
Die Wärmeleitfähigkeit von Punkt A (Mittelpunkt der Grundfläche der Si-Insel) zu Punkt B (Mittelpunkt der Grundfläche einer benachbarten Si-Insel) und die Wärmeleitfähigkeit von Punkt A zu Punkt C (Punkt, der sich in einem Abstand von 2 mm vom Mittelpunkt M zwischen Punkt A und Punkt B befindet), werden verglichen. Die Wärmeleitfähigkeit von Punkt A zu Punkt M ist in beiden Fällen gleich und wird so zu dem Vergleich außer Betracht gelassen. Wenn die Wärme UMB, die von dem Punkt M zu dem Punkt B pro Zeiteinheit übertragen wurde, mit der von Punkt M zu Punkt C pro Zeiteinheit übertragenen Wärme UMC verglichen wird, wobei der Wärmeübertragungskoeffizient der Membran gleich 10 und der Wärmeübertragungskoeffizient der Si-Schicht 150 betragen, kann die Beziehung zwischen UMB und UMC wie folgt ausgedrückt werden: UMB : UMC = 10 × (Querschnittsfläche der Membran)/150 : 150 × (Querschnittsfläche der Gitterstruktur)/2000 = 10 × (5 × 500)/150 : 150 × (175 × 250/2000 = 1 : 20.
Dementsprechend ist festzustellen, dass die Wärmeleitung von dem Punkt M zu dem Punkt C etwa 20-fach höher ist als die Wärmeleitung von Punkt M zu Punkt B.
6 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer Ausführungsform, die mit der Kühlfunktion am Umfang des Gitters versehen ist. So wird zum Beispiel ein DNA-Chip-Substrat 1 in einen Metallrahmen 61 eingesetzt, der mit einer Kühleinheit verbunden ist. Durch das Vorsehen der Kühlfunktion am Umfang der Gitterstruktur kann die Wärmeableitungswirkung verstärkt werden.
Beispiel 2: Verfahren zur Chip-Herstellung
Das Verfahren zur Herstellung des DNA-Chip-Substrats, auf dem die Inseln in der Gitterstruktur auf einer Kompositmembran aus SiO₂ und SiN ausgebildet werden, wird unter Bezug auf die 7 bis 9 beschrieben.
7 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung des ersten Herstellungsprozesses des DNA-Chip-Substrats. Bei dieser Ausführungsform wird ein Si-Substrat vom n-Typ (N-sub) 71 als Substrat verwendet, das die Ebene (100) als Oberfläche besitzt und eine Dicke von 500 μm aufweist. Nach Erzeugung des Bildmusters der p-Wannen mit der SiO₂-Membran 74 auf der Oberfläche des Substrats werden p-Wannen (1018 Stück/cm³) 72 und 73 mit einer jeweiligen Tiefe von 3 μm durch B-Dotierung und Diffusion ausgebildet, um das Temperaturerfassungselement 6, das später durch n+ Diffusion erzeugt wird, und die Schaltung des Heizers 5 elektrisch zu isolieren. Eine SiO₂-Membran 74 wird als Maske zur Trennung der Elemente voneinander und für die Diffusion ausgebildet. Ein Dotierungsmittel wie Borsäure wird für die Diffusion der p-Wannen verwendet. Anschließend werden, nach Ausbildung eines Schaltungsmusters mit der SiO₂-Membran, Diffusionsschichten 75, 76 und 77 vom n-Typ mit hoher Konzentration (n+, 1020 Stück/cm³) und hochkonzentrierte Diffusionsschichten 78 und 79 vom p-Typ (p+ 1020 Stück/cm³), jeweils mit einer Tiefe von 100 nm, durch Eindiffundieren von Phosphor erzeugt (hohe Konzentration der Verunreinigung vom n-Typ). Die Diffusionsschicht n+ (Diffusionsschicht vom n-Typ) ergibt das Temperaturerfassungselement 6. Die Diffusionsschicht 77 vom n+-Typ (Diffusionsschicht vom n-Typ) ist der Bezugselektrodenanschluss 75 des Substrats vom n-Typ. Das Potential des Substrats 71 kann durch den Referenzelektrodenanschluss 75 eingestellt werden, und die Potentiale der p-Wanne 72 und der p-Wanne 73 können durch 78 bzw. 79 eingestellt werden. Die Schicht p+ 78 und die Schicht p+ 79 (Diffusionsschichten vom p-Typ) werden durch Eindiffundieren von Bor (Verunreinigung vom p-Typ mit hoher Konzentration) als Anschlüsse zur Lieferung des Referenzpotentials an die p-Wannen ausgebildet.
8 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung des zweiten Herstellungsprozesses des DNA-Chip-Substrats.
Im Anschluss an den ersten Prozess wird die isolierende Membran 81 zwischen den ersten Schichten (z. B. eine SiO₂-Membran) zum Schutz und zur Isolierung der Oberflächenschaltung erzeugt. Die Membran 81 wird durch Aufbeschichten einer BPSG-Membran mit einer Dicke von 500 nm auf einer durch CVD oxidierten Membran (SiO₂) von 400 nm Dicke erzeugt, die zuvor hergestellt wurde. Anschließend wird, nachdem Löcher für jeden Anschluss in der Isolierung zwischen den ersten Schichten 81 vorgesehen wurden, die Verdrahtung in der ersten Schicht 82 (801, 802, 803, 804) darauf erzeugt, wie im Folgenden beschrieben wird. 75 und 76 sind elektrisch miteinander verbunden und bilden eine gemeinsame Verdrahtung 801 für den Sensor. 78 ist mit der positiven Elektrode 802 des Temperatursensors mit pn-Übergang verbunden. Die Temperatur des Substrats kann durch Erfassen der Stärke des Stroms gemessen werden, der zwischen 802 und 801 über die p-Wanne fließt. Die Heizerschaltung 77 führt zu zwei Elektroden 803 und 804. 804 ist elektrisch mit 79 verbunden. 804 ist die gemeinsame Verdrahtung für die Heizerschaltung. Wenn eine Stromquelle an 803 und 804 angeschlossen wird, wobei 803 die positive Elektrode darstellt, erzeugt der Heizstrom, der durch 77 fließt, Joulesche Wärme.
Als Nächstes wird eine Isolierung zwischen den zweiten Schichten 83 (zum Beispiel einer SiN-Membran) als Schutzmembran für die Verdrahtung erzeugt. 83 ist eine aufbeschichtete Membran, welche die SiO₂-Membran von 600 nm Dicke, die durch Plasma-DVD erzeugt wurde, und die SiN-Membran von 1200 nm Dicke, die durch Plasma-CVD erzeugt wurde, umfasst. Anschließend wird die Verdrahtung in der zweiten Schicht (zum Beispiel aus Gold) 84 erzeugt, nachdem eine Isolierung zwischen den zweiten Schichten 83 mit Verbindungslöchern für die Verdrahtung in der ersten Schicht erzeugt wurde. 84 umfasst die gemeinsame Elektrode 805 für den mit 801 verbundenen Sensor, die positive Elektrode des mit 802 verbundenen Temperatursensors (nicht dargestellt), die positive Elektrode des mit 803 verbundenen Heizers (nicht dargestellt) und die gemeinsame Elektrode 806 des mit 804 verbundenen Heizers. Von diesen Komponenten können 805 und 806 zwischen der Vielzahl von Inseln miteinander verbunden sein.
Schließlich wird ein Beispiel der auf der Rückseite erzeugten Insel erläutert. 9 ist eine schematische Darstellung, die den dritten Herstellungsprozess des DNA-Chip-Substrats veranschaulicht. Zunächst wird die Rückseite eines Substrats 71 vom n-Typ mechanisch poliert, um die Dicke des Substrats von 500 μm auf 250 μm zu bringen. Dieser Prozess wird angewandt, da eine Dicke von 250 μm oder weniger für die Dicke der Insel ausreichend ist und eine Verringerung der Dicke zu einer Verringerung der für den Ätzprozess erforderlichen Zeit führt. Nach dem Glätten der polierten Oberfläche durch chemische Ätzung wird eine Siliciumnitrid-Membran (Si₃N₄-Membran) 91 durch Plasma-CVD in einer Dicke von 120 nm als Ätzmaske aufgebracht.
Das Bildmuster auf der Rückseite (Insel-Bildmuster), das den zuvor auf der entgegengesetzten Oberfläche ausgebildeten Vorrichtungen, wie der Heizerschaltung, der Temperatursensorschaltung und dergleichen entspricht, wird unter Verwendung einer Ausrichteinrichtung für die beiden Seiten damit in Übereinstimmung gebracht, und die Siliciumnitrid-Membran 91 wird durch ein Trockenätzverfahren teilweise geätzt.
Im Anschluss daran wird unter Verwendung der verbliebenen Si₃N₄-Membran 91 als Maske das Substrat 71 vom n-Typ geätzt, bis die SiO₂-Membran 81 freigelegt wird, das heißt, bis die Siliciumoxid-Membran 74 auf der Oberflächenseite durch partielles Auflösen mit wässeriger Kaliumhydroxidlösung erreicht wird. Da die Siliciumnitrid-Membran 91 extrem hohe Beständigkeit gegenüber wässeriger Kaliumhydroxidlösung besitzt, beträgt die Menge, die während einer solchen Ätzung des Si-Substrats 71 mit einer Dicke von 250 μm von der Siliciumnitrid-Membran entfernt wird, in der Dicke lediglich 10 nm oder weniger. Die Ätzrate für die Ebene (111) des Si-Substrats 71 ist ferner niedrig und beträgt 1/100 im Vergleich mit der Ätzrate für die Ebene (100). Dementsprechend wird der Chip längs der Ebene (111) von der Schutzoberfläche der Siliciumnitrid-Membran 91 geätzt, so dass die Ebene (111) als Seitenfläche 901 der Insel freigelegt wird. Die Ebene (111) ist unter einem Winkel von etwa 55° zur Ebene (100) geneigt. Dementsprechend kann im Fall der Ätzung eines Si-Substrats von 250 μm Dicke eine Schrägung einer Breite von etwa 175 μm erhalten werden.
Beispiel 3: Verfahren zur Sondenimmobilisierung
Das Verfahren zur Immobilisierung von Oligonucleotidsonden auf einem hergestellten Chip wird im Folgenden beschrieben. Zunächst werden auf der Siliciumnitrid-Membran auf der Oberfläche eines Chips OH-Gruppen eingeführt. Hierzu wird allgemein das Hydrolyseverfahren unter Verwendung eines Gemisches von H₂SO₄ und H₂O₂, eines Gemisches von NaOH und H₂O₂, und dergleichen, angewandt. Ferner ist auch das Verfahren anwendbar, bei dem der Chip lediglich für eine bestimmte Zeitdauer einfach in Wasser eingetaucht gelassen wird.
Anschließend wird ein Silan-Kupplungsmittel, wie etwa ein Epoxyharz und dergleichen, auf die Oberfläche eines Chips gespritzt, um die Siliciumnitrid-Membran zu silanisieren. Bei diesem Verfahren reagieren die zuvor erzeugten OH-Gruppen mit dem Silan-Kupplungsmittel. Bei dieser Ausführungsform wird 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan als Silan-Kupplungsmittel eingesetzt. Die Reaktion wird 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, wonach 1 Stunde auf 120°C erhitzt wird.
Danach werden Oligonucleotidsonden mit einer an ihrem Ende eingeführten Aminogruppe auf vorgegebene Sondenzellenoberflächen aufgetropft. Durch Durchführung der Reaktion unter hoher Luftfeuchtigkeit während 10 Minuten bei 50°C zur Verhinderung eines Trocknens der Substanzen können die Sonden auf der Oberfläche des Chips durch Silan-Kupplung immobilisiert werden. Danach wird eine überschüssige Menge Polylysin auf den Chip gespritzt und unter hoher Luftfeuchtigkeit 10 Minuten bei 50°C zur Umsetzung gebracht, um die funktionellen Gruppen, die nicht an Sonden gebunden sind, zu binden. Dieses Verfahren ist zur Verringerung des Untergrunds wirksam, der aus der nichtspezifischen Absorption während des Prozesses der Hybridisierung mit Proben resultiert.
Zuletzt wird die Oberfläche des DNA-Chips mit Tris-EDTA gewaschen, und der Chip wird zur Aufbewahrung getrocknet.
Beispiel 4: Temperaturregelung
Die Vorrichtung zur Temperaturregelung des DNA-Chips wird im Folgenden beschrieben.
10 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel für die Vorrichtung zur Erfassung biochemischer Reaktionen veranschaulicht. Der DNA-Chip 101 umfasst Sondenzellen, die jeweils mit einem Heizeranschluss (+) 1001, einem Heizeranschluss (–) 1002, einem Temperaturerfassungsanschluss (+) 1003 und einem Temperaturerfassungsanschluss (–) 1004 versehen sind, wobei die Verdrahtung für diese Anschlüsse und den Regler 105 ähnlich sind, wie in 18 dargestellt ist. Der Regler 105 umfasst eine Temperaturerfassungsschaltung 182 mit einem Voltmeter 110, einer Stromquelle Vc und einem Widerstand R sowie eine Heizer-Stromquellenschaltung 181 mit einer Heizer-Stromquelle Vpo, einem Ausgangsregler 111 und einem Schalter 109, wobei die Anzahl dieser beiden Schaltungen der Anzahl der Sondenzellen entspricht, die unabhängig voneinander in ihrer Temperatur zu regeln sind. 18 zeigt lediglich eine Gruppe solcher Komponenten. Die Verdrahtungen mit diesen Anschlüssen sind über eine Leiterplatte 102 mit einem Halter 103 verbunden, und der Halter 103 ist ferner über ein Kabel 104 mit einem Regler 105 verbunden. Die Verdrahtung für den mit dem Erdanschluss verbundenen Anschluss auf der Seite des Reglers 105 kann zur Vereinfachung als Verdrahtung für eine Vielzahl von Sondenzellen herangezogen werden.
Die Temperatur der individuellen Sondenzellen kann nach dem oben unter Bezug auf 18 beschriebenen Verfahren unabhängig geregelt werden. Die Temperatur jeder Sondenzelle kann durch Messung der Potentialdifferenz des integrierten Temperaturerfassungselements bestimmt werden. Das Niveau der an den Heizer anzulegenden Spannung wird durch EIN/AUS-Betrieb des Schalters 109 gemäß dem gemessenen Wert der Temperatur geregelt. Wenn die von der Temperaturerfassungsschaltung erfasste Temperatur niedriger ist als der vorgegebene Wert, regeln der Schalter 109 und der Ausgangsregler 111 den Ausgang der Stromquelle des Heizers V_po, um einen Strom in den Heizer fließen zu lassen. Die Regelung wird unabhängig für jede Sondenzelle durchgeführt.
Der DNA-Chip 101, die gedruckte Leiterplatte 102 und der Halter 103 werden in einem Inkubator 106 betrieben, und ein Gebläse 107 dient erforderlichenfalls zur Kühlung des DNA-Chips 101 durch Anblasen von unten. Die Kühleinheit 108 kann zum Kühlen des Umfangs des DNA-Chips verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform wird die Temperatur des Inkubators, wie später beschrieben wird, auf einen Mindestwert verschiedener für den Chip erforderlicher Einstellungstemperaturen eingestellt, und die Kühleinheit 108 und/oder das Gebläse 107 werden in Abhängigkeit vom Grad des Temperaturanstiegs des Chips oder der Temperaturverteilung über die nahe zueinander angeordneten Sondenzellen verwendet.
Die Temperatur des DNA-Chips kann ferner mit einem Computer gesteuert werden. In diesem Fall dient der Computer als Temperaturregler, wobei ein Temperaturregelprogramm vorliegt, das in einem computerlesbaren Speichermedium abgespeichert ist. Das Speichermedium kann ein beliebiger Typ eines Speichermediums sein, wie etwa ein RAM, ein ROM, eine Magnetplatte, ein CD-ROM, ein Magnetband oder eine IC-Karte.
Beispiel 5: Messung
In diesem Beispiel wird eine Messung eines DNA-Fragments einer Länge von 17 Basen mit 4 Arten von Sonden einer Länge von 8 Basen erläutert.
SEQ ID NO: 1 ist ein DNA-Fragment einer Länge von 17 Basen (im Folgenden als Proben-DNA bezeichnet).
Diese Proben-DNA wird mit 4 Arten von Sonden einer Länge von 8 Basen, wie unten angegeben, hybridisiert.
Die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 2 dargestellte Sonde (im Folgenden als Sonde 2 bezeichnet) stellt eine zur 6. bis 13. Base der Proben-DNA komplementäre Sequenz dar. In ähnlicher Weise sind SEQ ID NO: 3 (Sonde 3), SEQ ID NO: 4 (Sonde 4) und SEQ ID NO: 5 (Sonde 5) zur 5. bis 12. Base, zur 4. bis 11. Base bzw. zur 3. bis 10. Base der Proben-DNA komplementäre Sequenzen.
Die Temperatur Tm, bei der diese Sonden mit der Proben-DNA hybridisiert wurden, wurde unter Verwendung des DNA-Chips gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen.
Zunächst wird ein DNA-Chip gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt, der 36 Sondenzellen aufweist, die 4 Arten von Sonden (Sonde 2 bis Sonde 5) umfassen, die für jede Sonde auf 9 Sondenzellen immobilisiert sind. 13 ist eine Draufsicht auf einen Chip. Die zuvor markierte Probe wird zur Hybridisierung auf diesen Chip gespritzt. Die Temperatur zur Hybridisierung wird innerhalb des Bereichs von 10–50°C für jede Spalte in Intervallen von 5°C für die Sondenzellen eingestellt, die unter Bildung von Spalten a bis i angeordnet sind, wie in 13 dargestellt ist (10°C für Spalte a, 15°C für Spalte b, 20°C für Spalte c, ... 45°C für Spalte h, 50°C für Spalte i).
Die Reaktionsschritte sind wie folgt. 14 ist ein Diagramm, das schematisch die Temperaturänderung der zu Spalte a, Spalte c, Spalte g und Spalte i gehörenden Sondenzellen zeigt. Zunächst wird die Temperatur des Inkubators auf 90°C angehoben. Anschließend wird der Inkubator auf 10°C eingestellt, um zu ermöglichen, dass die Temperatur der individuellen Sondenzellen abfällt. Wenn die Temperatur jeder Sondenzelle auf etwa 50°C fällt, wird der Heizer für Spalte i eingeschaltet, um zu verhindern, dass die Temperatur weiter abfällt. In ähnlicher Weise beginnt, wenn die vorgegebene Temperatur zur Hybridisierung erfasst wird, der Heizer für jede Spalte durch EIN/AUS-Schalten zu regeln, um die Temperatur aufrechtzuerhalten. Dementsprechend können die Sondenzellen, die zu jeder Spalte gehören, die vorgegebene Temperatur aufrechterhalten, um die Hybridisierung zwischen der Probe und den Sonden zu ermöglichen. Nach einer bestimmten Zeitdauer wird der DNA-Chip mit einer Reinigungslösung gewaschen, um die nichthybridisierte Probe und andere Stoffe zu entfernen. Das Ergebnis der Hybridisierung wird durch Scannen der Oberfläche des Chips und Messung der Stärke der Fluoreszenzemission von jeder Sondenzelle unter Verwendung eines Laserfluoreszenz-Konfokalmikroskops ermittelt.
15 ist ein Diagramm, das die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung bei der Messung der Proben-DNA zeigt. Die dargestellten Ergebnisse sind die Ergebnisse der Messung in jeder Spalte. Die maximale Lichtemission bei der Hybridisierungstemperatur von 10°C ist als Wert 1 normiert. 15 zeigt, dass das Ausmaß der Hybridisierung mit steigender Temperatur abnimmt. Tm ist die Temperatur, die dem Wert 0,5 auf der y-Achse entspricht. Dementsprechend befinden sich die Werte für Tm der Hybridisierung bei den Sonden 2 bis 5 mit der Proben-DNA bei 25°C, 34°C, 42°C bzw. 31°C. Der Chip der vorliegenden Erfindung ist insofern vorteilhaft, als er eine Hybridisierung von 4 Arten von Sonden mit der gleichen Probe bei 9 unterschiedlichen Temperaturen sowie eine gleichzeitige Ergebnisauswertung auf Vergleichsbasis erlaubt. Die Ergebnisse enthalten keine Fehler von der Probenherstellung und können so mit erheblich höherer Genauigkeit erhalten werden.
Wenn daher 1 Art einer Proben-DNA unter Verwendung von Sonden mit 8 Basen untersucht wird, variiert die optimale Temperatur für die Hybridisierung in Abhängigkeit von jeder Sonde. Es ist erforderlich, die beste Sonde zur gleichzeitigen Ermittlung der Hybridisierungseigenschaften mehrerer Arten von Sonden auszuwählen. Aus diesem Grund eignet sich der DNA-Chip der vorliegenden Erfindung, mit dem es möglich ist, die Hybridisierungstemperatureigenschaften mehrerer Arten von Sonden gleichzeitig zu ermitteln, in besonderem Maße zur Sondenbeurteilung.
Mit dem Chip der vorliegenden Erfindung kann die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung auch dann ermittelt werden, wenn eine Fehlpaarung einer Base vorliegt. Es wurden 2 Arten von DNA-Fragmenten hergestellt, die unten angegeben sind.
Diese Fragmente sind Beispiele für zwei Arten von einzelnen Nucleotiden von polymorphen DNA-Fragmenten mit einer Länge von 17 Basen, die sich im Vergleich mit SEQ ID NO: 1 lediglich in der 8. Base vom 3'-Ende her unterscheiden. Für diese einzelnen polymorphen Nucleotid-DNA-Fragmente wird die Temperaturabhängigkeit unter Verwendung des obigen Chips nach dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben gemessen. Die 16 und 17 zeigen die Ergebnisse der Hybridisierung unter Verwendung der Fragmente SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 7. Im Idealfall tritt keine Hybridisierung bei einer solchen Fehlpaarung einer Base auf. Wie allerdings aus den 16 und 17 hervorgeht, tritt im vorliegenden Fall eine Hybridisierung in einem gewissen Ausmaß ein. Bei der Messung unter Verwendung des DNA-Chips ist es allgemein erforderlich, eine solche Ein-Basen-Fehlpaarung genau diskriminieren zu können. Dementsprechend wird die Auswertung in ähnlicher Weise, wie in den 16 und 17 gezeigt wird, vorgenommen, um die zu verwendende Sonde und auf der Basis ihrer Eigenschaften den Tm-Wert zu bestimmen. Die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung für jede Sonde kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung genau und leicht gemessen werden.
Die vorliegende Erfindung gibt einen Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen und sein Substrat an, mit dem eine Regelung der Temperatur für die biochemische Reaktion möglich ist.
Die vorliegende Erfindung gibt ferner eine Vorrichtung und ein Verfahren zur gleichzeitigen Durchführung einer Vielzahl biochemischer Reaktionen in einer Vielzahl von Reaktionssystemen, wobei die Temperatur für jedes Reaktionssystem geregelt wird, sowie ein Speichermedium an.

Claims

Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen, der aufweist: ein membranartiges Substrat (1) mit Isoliereigenschaft, mehrere Inseln (21), die auf einer Seite des Substrats (1) vorgesehen sind, und Sondenzellen (2) zur Immobilisierung von Sonden (25) und zur Erfassung der biochemischen Reaktion, wobei die Sondenzellen (2) auf der anderen Seite des Substrats (1) und an Stellen vorgesehen sind, die den Inseln (21) entsprechen, wobei jede der Inseln aufweist: einen Heizer (5) zum Heizen der Insel (21), einen Temperaturdetektor (6) zur Erfassung der Temperatur der Insel (21), einen Heizeranschluss (101, 1002) zur Regelung der Heizung durch den Heizer (6) und einen Temperaturerfassungsanschluss (1004, 1005) zur Ausgabe des Ergebnisses der Erfassung durch den Temperaturdetektor (6), und wobei die Heizung durch den Heizer (5) extern über den Heizeranschluss entsprechend dem Ausgang des Temperaturerfassungsanschlusses geregelt wird.
Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen nach Anspruch 1, bei dem das membranartige Substrat (1) aus einer Art von Material oder aus einem Kompositmaterial besteht, das ausgewählt ist aus einer Gruppe, die aus Siliciumnitrid, Siliciumoxid, Aluminiumoxid und Ta₂O₅ besteht.
Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Temperatur für jede der Inseln (21), die auf dem Substrat (1) vorgesehen sind, separat kontrolliert wird.
Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem der Heizer (5) aus einer eindiffundierten Schicht vom n-Typ besteht und der Temperaturdetektor (6) mit einem pn-Übergang ausgebildet ist, der aus einer eindiffundierten Schicht vom p-Typ und einer eindiffundierten Schicht vom n-Typ besteht.
Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Sondenzelle (2) zur Immobilisierung der Sonden (25) jeweils zu der Insel (21) hin eingekerbt ist.
Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die eindiffundierte Schicht vom p-Typ zwischen dem Heizer (5) und dem Temperaturdetektor (6) vorgesehen ist, wo das Substrat (1) ein Substrat vom n-Typ ist.
Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die mehreren Inseln (21) an den Schnittpunkten eines Gitters auf der einen Seite des Substrats (1) vorgesehen sind und die Sonden (25) nach ihren Tm-Werten in der Reihenfolge vom höchsten zum niedrigsten Wert angeordnet sind, und zwar entweder von der Mitte des Chips zum äußeren Rand oder von einer Seite des Chips zur anderen Seite.
Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Sonden (25) aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus Oligonucleotid-DNA-Sonden, Oligonucleotid-RNA-Sonden und Proteinsonden besteht.
Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein Wärmeleiter zwischen den Inseln (21) vorgesehen ist.
Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ein Metallrahmen (61) am Umfang des Substrats (1) vorgesehen ist.
Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das membranartige Substrat (1) eine Wärmeleitfähigkeit von 10 W/m·K (Watt/Meter Kelvin) oder weniger besitzt.
Verfahren zur Herstellung eines membranartigen Substrats (1) für einen Chip zur Erfassung biochemischer Reaktionen, das folgende Schritte umfasst: (a) Erzeugung einer Membran auf einer Seite einer flachen Scheibe eines Wärmeleiters und (b) Erzeugung von Inseln (21) auf dem Wärmeleiter auf der anderen Seite der flachen Scheibe des Wärmeleiters durch Entfernen der unnötigen Bereiche davon.
Verfahren nach Anspruch 12, das ferner folgenden Schritt umfasst: (c) nach Schritt (b) Erzeugung von Sondenzellen (2) zur Immobilisierung von Sonden (25) auf der Membran.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, bei dem ein Temperaturregler auf einer Seite der flachen Scheibe des Wärmeleiters ausgebildet und die Membran (1) darauf erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem eine Maske mit einem gewünschten Bildmuster auf der der Membran (1) gegenüberliegenden Seite erzeugt wird und die Inseln (21) des Wärmeleiters, die dem Maskenbildmuster entsprechen, durch Ätzen der Maskenseite erzeugt werden, bis die auf der gegenüberliegenden Seite vorgesehene Membran freigelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Maske eine Membran aus Siliciumnitrid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, bei dem das membranartige Substrat (1) eine Wärmeleitfähigkeit von 10 W/m·K (Watt/Meter·Kelvin) oder weniger besitzt.
Verfahren zur gleichzeitigen Durchführung biochemischer Reaktionen in mehreren Reaktionssystemen bei für jedes betreffende Reaktionssystem geregelten Temperaturen unter Verwendung des Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder eines gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17 hergestellten Chips, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Erwärmen aller Reaktionssysteme auf eine Temperatur, die höher ist als die optimale Temperatur für die biochemische Reaktion in jedem Reaktionssystem, und (b) Verringerung der Temperatur jedes Reaktionssystems auf eine optimale Temperatur für jede biochemische Reaktion in jedem Reaktionssystem und Aufrechterhaltung der Temperatur für eine bestimmte Zeitdauer.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem der Heizvorgang (a) in einem Inkubator (106) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, bei dem der Vorgang der Verringerung der Temperatur (b) durch Stoppen des Heizvorgangs (a) oder unter Verwendung eines Kühlers (108) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, 19 oder 20, bei dem die biochemische Reaktion die Hybridisierung zwischen einem Polynucleotid und einem Oligonucleotid ist und die optimale Temperatur für die biochemische Reaktion die Schmelztemperatur des Doppelstrangs ist, der mit dem Oligonucleotid und seinem komplementären Strang gebildet wurde.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das Polynucleotid eine DNA in einer Probe ist und das Oligonucleotid eine Oligonucleotidsonde des Chips zur Erfassung biochemischer Reaktionen ist.
Computerlesbares Speichermedium, in dem ein Programm zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 18 bis 22 gespeichert ist.