DE60028544T2

DE60028544T2 - Prostata-spezifische gene zur diagnose, prognose und behandlung von prostata-krebs

Info

Publication number: DE60028544T2
Application number: DE60028544T
Authority: DE
Inventors: Gang An; Robert Oklahoma City VELTRI
Original assignee: Laboratory Corp of America Holdings
Current assignee: Laboratory Corp of America Holdings
Priority date: 1999-02-09
Filing date: 2000-01-24
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2020-01-25
Also published as: ES2394093T3; EP1734134B1; US6156515A; EP1151140B9; CA2362527A1; ATE329057T1; EP1734134A3; EP1151140A1; CA2362527C; US20020068281A1; WO2000047773A1; US20110286917A1; US20030017472A1; DE60028544D1; US6369195B1; EP1151140B1; US7993830B2; AU2740100A; EP1151140A4; US20080044416A1

Description

1.0 HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1.1 Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen neue Nukleinsäuresequenzen, Polypeptide, die durch die neuen Nukleinsäuresequenzen kodiert werden und Antikörper, die für solche Polypeptide spezifisch sind, die als Sonden oder Primer für die Diagnose, Prognose und das Management von Prostatakrebs und damit zusammenhängende Verfahren brauchbar sind. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Sonden, Primer und Verfahren, die bei der Diagnose, der Identifizierung und der Überwachung des Fortschreitens von Prostatakrebs durch Messungen von Genprodukten brauchbar sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein neues Prostata-spezifisches Gen und Verfahren zur Behandlung von Prostatakrebs, basierend auf den beschriebenen Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen.
1.2 Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Der genetische Nachweis von menschlichen Erkrankungszuständen ist ein sich schnell entwickelndes Feld (Taparowsky et al., 1982; Slamon et al., 1989; Sidransky et al., 1992; Miki et al., 1994; Dong et al., 1995; Morahan et al., 1996; Lifton, 1996; Barinaga, 1996). Jedoch existieren einige Probleme mit diesem Ansatz. Ein Zahl von bekannten genetischen Läsionen prädisponieren lediglich die Entwicklung von spezifischen Erkrankungszuständen. Individuen, die die genetische Läsion tragen, können diesen Erkrankungszustand gar nicht entwickeln, während andere Individuen diesen Erkrankungszustand entwickeln können, ohne eine bestimmte genetische Läsion zu besitzen. In menschlichen Krebserkrankungen können genetische Defekte in einer großen Zahl von bekannten Tumorsuppressor-Genen und Proto-Onkogenen auftreten.
Der genetische Nachweis von Krebs hat eine lange Geschichte. Eine der frühesten genetischen Läsionen, von der gezeigt wurde, dass sie Krebs prädisponiert, waren transformierende Punktmutationen in den ras-Onkogenen (Taparowsky et al., 1982). Transformierende ras- Punktmutationen können im Stuhl von Individuen mit benignen und malignen kolorektalen Tumoren nachgewiesen werden (Sidransky et al., 1992). Jedoch enthielten nur 50% solcher Tumore eine ras-Mutation (Sidransky et al., 1992). Ähnliche Ergebnisse wurden mit der Amplifikation von HER-2/neu in Brust- und Eierstockkrebs (Slamon et al., 1989), Deletion und Mutation von p53 in Blasenkrebs (Sidransky et al., 1991), Deletion von DCC in kolorektalem Krebs (Fearon et al., 1990) und Mutation von BRCA1 in Brust- und Eierstockkrebs (Miki et al., 1994) erhalten.
Keine dieser genetischen Läsionen ist in der Lage, eine Vielzahl von Individuen mit Krebs vorherzusagen, und die meisten erfordern eine direkte Probe eines vermuteten Tumors, was das Screening schwierig macht.
Weiterhin ist keiner der oben beschriebenen Marker in der Lage, zwischen metastatischen und nicht-metastatischen Formen von Krebs zu unterscheiden. Bei dem effektiven Management von Krebspatienten ist die Identifizierung von denjenigen Individuen, deren Tumore bereits metastasiert haben oder wahrscheinlich metastasieren werden, entscheidend. Weil metastatischer Krebs in den USA jedes Jahr 560.000 Menschen tötet (ACS-Homepage), wäre die Identifizierung von Markern für metastatischen Prostatakrebs ein wichtiger Fortschritt.
Ein besonderes Problem im Krebsnachweis und der Diagnose tritt bei Prostatakrebs auf. Ein Karzinom der Prostata (PCA) ist der am häufigsten diagnostizierte Krebs unter Männern in den Vereinigten Staaten (Veltri et al., 1996). Prostatakrebs wurde 1998 in ungefähr 189.500 Männern diagnostiziert, und ungefähr 40.000 Männer erlagen der Malignität (Landis et al., 1998). Obwohl relativ wenige Prostatatumore zu klinischer Signifikanz während der Lebenszeit des Patienten fortschreiten, haben diejenigen, die in ihrer Art progressiv sind, zum Zeitpunkt des Nachweises wahrscheinlicherweise metastasiert. Die Überlebensraten für Individuen mit metastatischem Prostatakrebs sind relativ gering. Zwischen diesen Extremen liegen Patienten mit Prostatatumoren, die metastasieren werden, jedoch dies noch nicht getan haben, für die eine chirurgische Prostataentfernung die Heilung ist. Die Bestimmung, in welche Gruppe ein Patient fällt, ist bei der Bestimmung von optimaler Behandlung und Patientenüberleben kritisch.
Die FDA-Zulassung des Serum-Prostata-spezifischen Antigen(PSA)-Tests 1984 veränderte die Art, auf die Prostataerkrankung gehandhabt wird (Allhoff et al., 1989; Cooner et al., 1990; Jacobson et al., 1995; Orozco et al., 1998). PSA wird weit als ein Serum-Biomarker verwendet, um die therapeutische Antwort in Prostatakrebspatienten nachzuweisen und zu überwachen (Badalament et al., 1996; O'Dowd et al., 1997). Verschiedene Modifikationen in den PSA-Tests (Partin and Oesterling, 1994; Babian et al., 1996; Zlotta et al., 1997) haben zu einer früheren Diagnose und verbesserter Behandlung geführt.
Obwohl PSA seit 1988 als ein klinischer Marker für Prostatakrebs weit verbreitet wurde (Partin and Oesterling, 1994), waren Screening-Programme unter der Verwendung von PSA alleine oder in Kombination mit digitaler rektaler Untersuchung (DRE) bei der Verbesserung der Überlebensrate für Männer mit Prostatakrebs nicht erfolgreich (Partin and Oesterling, 1994). Obwohl PSA für Prostatagewebe spezifisch ist, wird es durch normales und benignes, sowie malignes Prostataepithel produziert, was zu einer hohen falsch-positiven Rate für Prostatakrebsnachweis führt (Partin and Oesterling, 1994).
Während sie ein effektiver Indikator von Prostatakrebs sind, wenn die Serumspiegel relativ hoch sind, sind PSA-Serumspiegel ein zweifelhafterer Indikator von Prostatakrebs, wenn nur mittelmäßig erhöht, zum Beispiel wenn die Spiegel zwischen 2–10 ng/ml liegen. Bei diesen mittleren Erhöhungen kann Serum-PSA von Nicht-Krebserkrankungszuständen, wie zum Beispiel BPH (benigner Prostata-Hyperplasie), Prostatitis oder physikalischem Trauma (McCormack et al., 1995) herrühren. Obwohl die Anwendung von der geringeren 2,0 ng/ml Krebsnachweis-Ausschlusskonzentration von Serum-PSA die Diagnose von Prostatakrebs erhöht hat, insbesondere in jüngeren Männern mit nicht-fühlbaren Frühen-Phasen-Tumoren (Phase Tlc) (Soh et al., 1997; Carter and Coffey, 1997; Harris et al., 1997; Orozco et al, 1998), bleibt die Spezifität des PSA-Tests für Prostatakrebsnachweis bei niedrigen Serum-PSA-Spiegeln ein Problem.
Verschiedene Forscher haben versucht, die Spezifität von serologischem Nachweis von Prostatakrebs durch die Untersuchung einer Vielzahl von anderen Biomarkern neben Serum-PSA-Konzentration zu verbessern (Ralph and Veltri, 1997). Einer der am meisten untersuchten dieser anderen Biomarker ist das Verhältnis von freiem gegenüber gesamtem PSA (f/t-PSA) im Blut eines Patienten. Das meiste PSA in Serum liegt in einer molekularen Form vor, die an andere Proteine, wie zum Beispiel α1-Antichymotypsin (ACT) oder α2-Makroglobulin (Christensson et al., 1993; Stenman et al., 1991; Lilja et al., 1991) gebunden ist. Freies PSA ist nicht an andere Proteine gebunden. Das Verhältnis von freiem zu gesamtem PSA (f/t-PSA) ist gewöhnlicherweise in Patienten mit BPH signifikant höher, verglichen zu denjenigen mit Organ-begrenztem Prostatakrebs (Marley et al., 1996; Oesterling et al., 1995; Pettersson et al., 1995). Wenn ein geeigneter Ausschlusswert für den f/t-PSA-Test bestimmt wird, kann der f/t-PSA-Test dabei helfen, Patienten mit BPH von denjenigen mit Prostatakrebs in Fällen zu unterscheiden, in denen die Serum-PSA-Spiegel nur mittelmäßig erhöht sind (Marley et al., 1996; Partin and Oesterling, 1996). Unglücklicherweise, während f/t-PSA den Nachweis von Prostatakrebs verbessern kann, ist die Information im f/t-PSA-Verhältnis unzureichend, um die Sensitivität und Spezifität von serologischem Nachweis von Prostatakrebs auf wünschenswerte Spiegel zu verbessern.
Andere Marker, die für den Prostatakrebsnachweis verwendet wurden, schließen Prostata-Saure-Phosphatase (PAP) und Prostata-sekretiertes Protein (PSP) ein. PAP wird durch Prostatazellen unter hormoneller Kontrolle sekretiert (Brawn et al., 1996). Es weist weniger Spezifität und Sensitivität auf, als dies PSA tut. Im Ergebnis wird es zur Zeit viel weniger verwendet, obwohl PAP immer noch einige Anwendungen für die Überwachung von metastatischen Patienten aufweisen kann, bei denen eine primäre Behandlung versagt hat. Im Allgemeinen ist PSP ein sensitiverer Biomarker als PAP, ist jedoch nicht so sensitiv wie PSA (Huang et al., 1993). Wie PSA sind die PSP-Spiegel häufig in Patienten mit BPH sowie in denjenigen mit Prostatakrebs erhöht.
Ein anderer Serum-Marker, der mit Prostataerkrankung assoziiert ist, ist das Prostataspezifische Membran-Antigen (PSMA) (Horoszewicz et al., 1987; Carter and Coffey, 1996; Murphy et al., 1996). PSMA ist ein Typ II Zellmembranprotein und wurde als Folinsäure-Hydrolase (FAH) identifiziert (Carter and Coffey, 1996). Antikörper gegen PSMA reagieren sowohl mit normalem Prostatagewebe als auch mit Prostatakrebsgewebe (Horoszewicz et al., 1987). Murphy et al. (1995) verwendeten ELISA, um Serum-PSMA in fortgeschrittenem Prostatakrebs nachzuweisen. Als ein Serum-Test sind PSMA-Spiegel ein relativ schlechter Indikator von Prostatakrebs. Jedoch kann PSMA unter bestimmten Umständen eine Brauchbarkeit aufweisen. PSMA wird in metastatischen Prostatatumor-Kapillarbetten exprimiert (Silver et al., 1997) und wird als häufiger in Blut von metastatischen Krebspatienten berichtet (Murphy et al., 1996). PSMA-messenger-RNA (mRNA) ist in der LNCaP-Prostatakrebszelllinie nach Aussetzen gegenüber von 5-α-Dihydroxytestosteron (DHT) 8–10fach herunter-reguliert (Israeli et al., 1994).
Zwei relativ neue potentielle Biomarker für Prostatakrebs sind menschliches Kallikrein 2 (HK2) (Piironen et al., 1996) und Prostata-spezifische Transglutaminase (pTGase) (Dubbink et al., 1996). HK2 ist ein Mitglied der Kallikrein-Familie, die durch die Prostatadrüse sekretiert wird (Piironen et al., 1996). Die Prostata-spezifische Transglutaminase ist ein Calciumabhängiges Enzym, das in Prostatazellen exprimiert wird, das post-translationales Kreuzvernetzen von Proteinen katalysiert (Dubbink et al., 1996). Theoretisch können Serum-Konzentrationen von HK2 oder pTGase beim Prostatakrebsnachweis oder der Diagnose brauchbar sein, jedoch wird die Brauchbarkeit dieser Marker immer noch untersucht.
Interleukin 8 (IL-8) wurde auch als ein Marker für Prostatakrebs berichtet. (Veltri et al., 1999). Serum-IL-8-Konzentrationen wurden als mit zunehmender Phase von Prostatakrebs korreliert berichtet und als in der Lage, BPH von malignen Prostatatumoren zu unterscheiden (Id.). Die breite Anwendbarkeit dieses Markers für Prostatakrebsnachweis und die Diagnose wird immer noch untersucht.
Zusätzlich zu diesen Proteinmarkern für Prostatakrebs wurden mehrere genetische Veränderungen als mit Prostatakrebs assoziiert berichtet, einschließlich: allelischer Verlust (Bova, et al., 1993; Macoska et al., 1994; Carter et al., 1990); DNA-Hypermethylierung (Isaacs et al., 1994); Punktmutationen oder Deletionen des Retinoblastoms (Rb), p53 und KAI1-Genen (Bookstein et al., 1990a; Bookstein et al., 1990b; Isaacs et al., 1991; Dong et al., 1995); und Aneuplodie und Aneusomie von Chromosomen, die durch Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) nachgewiesen werden (Macoska et al., 1994; Visakorpi et al., 1994; Takahashi et al., 1994; Alcaraz et al., 1994). Keine dieser wurde als eine ausreichende Sensitivität und Spezifität aufweisend berichtet, um als allgemeine Screeningwerkzeuge für asymptomatischen Prostatakrebs brauchbar zu sein.
Eine kürzliche Entdeckung war, dass die differentielle Expression von sowohl Vollängen-, als auch verkürzten Formen von HER2/neu-Onkogen-Rezeptor mit Prostatakrebs korreliert war. (An et al., 1998). Die Analyse durch RT-PCR^TM zeigte, dass die Überexpression des HER2/neu-Gens mit Prostatakrebsfortschreiten assoziiert ist. (Id.)
In der laufenden klinische Praxis wird der Serum-PSA-Test und die digitale rektale Untersuchung (DRE) verwendet, um anzuzeigen, welche Patienten eine Prostatabiopsie haben sollten (Lithrup et al., 1994; Orozco et al., 1998). Die histologische Untersuchung des Biopsie- Gewebes wird durchgeführt, um die Diagnose von Prostatakrebs zu machen. Basierend auf den 189.500 Fällen von diagnostiziertem Prostatakrebs 1998 (Landis, 1998) und einer bekannten Krebsnachweisrate von ungefähr 35% (Parker et al., 1996), wird geschätzt, dass 1998 über eine halbe Million Prostatabiopsien in den Vereinigten Staaten durchgeführt wurden (Orozco et al., 1998; Veltri et al., 1998). Klar gäbe es einen großen Vorteil, der von einem biologischen Test abgeleitet wäre, der sensitiv genug wäre, um kleine und frühe-Phasen-Prostatatumore nachzuweisen, der auch eine ausreichende Spezifität aufweisen würde, um einen größeren Teil von Patienten mit keinem Krebs oder klinisch insignifikanten Zuständen auszuschließen.
Es verbleiben Nachteile im Stand der Technik im Hinblick auf die Identifizierung der Gene, die mit dem Fortschreiten von Prostatakrebs zusammenhängen und die Entwicklung von diagnostischen Verfahren, um das Fortschreiten der Erkrankung zu überwachen. Ebenso wäre die Identifizierung von Genen, die in Prostatakrebs differenziell exprimiert sind, für die Entwicklung eines schnellen, billigen Verfahrens, um Krebs zu diagnostizieren, von beträchtlicher Wichtigkeit. Obwohl ein paar Prostata-spezifische Gene kloniert wurden (PSA, PSMA, HK2, pTGase, usw.), sind diese typischerweise nicht in Prostatakrebs hoch-reguliert. Die Identifizierung eines neuen, Prostata-spezifischen Gens, das in Prostatakrebs differenziell exprimiert ist, verglichen zu nicht-malignem Prostatagewebe, würde einen großen, unerwarteten Fortschritt für die Diagnose, Prognose und die Behandlung von Prostatakrebs darstellen.
Dokument WO98/04689 beschreibt diagnostische Techniken für den Nachweis von menschlichem Prostatakrebs, Sonden und Verfahren, die bei der Überwachung des Fortschreitens und der Diagnose von Prostatakrebs brauchbar sind. Es beschreibt, dass UC41 ein differentiell reguliertes Gen ist und erwähnt, dass es ein potentieller Tumormarker ist.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isolierter Nukleinsäureabschnitt zur Verfügung gestellt, umfassend eine Vollängensequenz oder das Vollängenkomplement einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
Es wird auch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer Größe zwischen 14 und 100 Basen Länge zur Verfügung gestellt, identisch in seiner Sequenz mit einem durchgehenden Teil von mindestens 14 Basen einer Nukleinsäure oder seinem Komplement ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4.
Weiterhin wird auch eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, die für eine Vollängen-Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5, kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung gestellt, umfassend eine Vollängen-Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5.
Weiterhin wird auch ein Verfahren zum Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, umfassend den Schritt von Nachweisen eines Prostatakrebsmarkers in der Probe, wobei der Prostatakrebsmarker eine Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 angegeben aufweist.
In einem weiteren Aspekt wird ein Antikörper zur Verfügung gestellt, der immunologisch mit einem Polypeptid reagiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, wie in SEQ ID NO: 2 angegeben, zur Verwendung bei der Behandlung von Individuen mit Prostatakrebs, und ein Antisense-DNA-Molekül, das für ein RNA-Molekül kodiert, das an ein Polynukleotid bindet, das eine Nukleinsäuresequenz wie angegeben in SEQ ID NO: 1 aufweist, zur Verwendung bei der Behandlung von Individuen mit Prostatakrebs.
In einem weiteren Aspekt wird auch eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, die für eine Vollängen-Aminosäuresequenz kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5. Ein Kit zur Verwendung bei dem Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe, umfassend:

(a) eine Oligonukleotidsonde, die von 16 bis 100 Nukleotide in ihrer Länge ist, die unter hoch-stringenten Bedingungen an eine isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4, bindet; und
(b) einen Behälter für die Sonde.

Ein Kit zur Verwendung beim Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe, umfassend:

(a) einen Antikörper, der immunologisch an ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 5, bindet; und
(b) einen Behälter für den Antikörper.

In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Zur-Verfügung-Stellen eines Antikörpers, der immunologisch an ein Peptid, umfassend SEQ ID NO: 5 bindet;
(b) In-Kontakt-Bringen einer menschlichen Gewebeprobe mit dem Antikörper;
(c) Abtrennen von Antikörper, der an die Gewebeprobe gebunden ist, von nicht-gebundenem Antikörper; und
(d) Nachweisen des gebundenen Antikörpers.

In einem anderen Aspekt wird ein Kit zur Verwendung beim Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, umfassend:

In einem weiteren Aspekt wird ein Antikörper zur Verfügung gestellt, der spezifisch an ein Polypeptid, umfassend die Sequenz wie angegeben in SEQ ID NO: 5, bindet, zur Verwendung bei der Behandlung von Individuen mit Prostatakrebs.
Die vorliegende Erfindung richtet sich gegen Nachteile im Stand der Technik durch Identifizieren eines neuen, Prostata-spezifischen Gens, das in menschlichem Prostatakrebs, verglichen zu normaler menschlicher Prostata oder benigner Prostata-Hyperplasie (BPH), unterschiedlich exprimiert ist. Die kodierte mRNA-Spezies und die entsprechend kodierten Protein-Spezies weisen zum Beispiel eine Brauchbarkeit als Marker von Prostatakrebs auf. Antikörper gegen die kodierten Protein-Spezies, sowie Antisense-Konstrukte, die spezifisch für die mRNA-Spezies sind, weisen eine Brauchbarkeit für Verfahren von therapeutischer Behandlung von Prostatakrebs auf. Zusätzlich kann die cDNA-Sequenz verwendet werden, um Sonden und Primer zur Identifizierung einer Vollängen-genomischen Sequenz sowie der Promotor-Sequenz für das Gen zu entwickeln, zur Verwendung in dem Aufbau von Prostata-spezifischen Expressionsvektoren, von Brauchbarkeit in der Gentherapie von Prostatakrebs.
Die Nukleinsäuresequenz dieses neuen Prostata-spezifischen Gens kann verwendet werden, um spezifische Oligonukleotidsonden und -primer aufzubauen. Wenn in Kombination mit Nukleinsäurehybridisierung und Amplifikationsverfahren verwendet, erlauben diese Sonden und Primer die schnelle Analyse von Prostatabiopsie-Kernproben, Serumproben, usw. Dies wird Ärzten bei der Diagnose von Prostatakrebs und bei der Bestimmung von optimalen Behandlungsverläufen für Individuen mit Prostatatumoren von variierender Malignität helfen. Dieselben Sonden und Primer können auch zur in situ-Hybridisierung oder zum in situ-PCR^TM-Nachweis und zur Diagnose von Prostatakrebs verwendet werden.
Die neue Gensequenz kann auch dazu verwendet werden, eine Vollängen-genomische DNA-Sequenz und ihre damit zusammenhängenden regulatorischen Elemente, einschließlich dem Promotor, aus genomischen menschlichen DNA-Bibliotheken zu identifizieren und zu isolieren. Die in der vorliegenden Erfindung identifizierte cDNA-Sequenz wird zuerst dazu verwendet, Hybridisierungssonden herzustellen, um genomische menschliche DNA-Bibliotheken durch Standardtechniken zu screenen. Sobald partielle genomische Klone identifiziert wurden, werden Vollängen-Klone durch „chromosomales Wandern" (auch „überlappende Hybridisierung" genannt) isoliert. Siehe Chinault and Carbon, 1979. Nicht-repetitive Sequenzen an oder nahe den Enden der partiellen genomischen Klone werden dann als Hybridisierungssonden in weiterem genomischem Bibliotheksscreening verwendet, was letztendlich die Isolierung der gesamten genomischen Sequenz für das hier berichtete neue Prostata-spezifische Gen ermöglicht. Diejenigen, die im Stand der Technik erfahren sind, werden realisieren, dass Vollängen-Gene unter der Verwendung der hier beschriebenen cDNA-Sequenz unter der Verwendung von augenblicklich erhältlicher Technologie erhalten werden können (Sambrook et al., 1989; Chinault and Carbon, 1979).
Bei der Durchführung dieses Verfahrens wird die in der vorliegenden Beschreibung identifizierte cDNA-Sequenz als eine Hybridisierungssonde verwendet, um menschliche genomische DNA-Bibliotheken durch Standardtechniken zu screenen. In einer bevorzugten Durchführung wird eine Hoch-Qualitäts-menschliche genomische DNA-Bibliothek von kommerziellen oder anderen Quellen erhalten. Die Bibliothek wird auf zum Beispiel Agaroseplatten plattiert, die Nährstoffe, Antibiotika und andere Standard-Inhaltsstoffe enthalten. Einzelne Kolonien werden auf Nylon- oder Nitrozellulose-Membranen transferiert, und die cDNA-Sonden werden an komplementäre Sequenzen auf den Membranen hybridisiert. Die Hybridisierung wird durch radioaktive oder Enzym-gekoppelte Marker nachgewiesen, die mit den hybridisierten Sonden assoziiert sind. Positive Kolonien werden angezogen und durch zum Beispiel Didesoxynukleotid-Sequenzierung oder ähnliche Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, sequenziert. Der Vergleich von klonierten Sequenzen mit bekannten menschlichen oder Tier-cDNA- oder genomischen Sequenzen wird unter der Verwendung von Computerprogrammen und Datenbanken, die dem Fachmann gut bekannt sind, durchgeführt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die isolierten Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung in Expressionsvektoren eingefügt und als die kodierten Proteine oder Peptide exprimiert. Solche Proteine oder Peptide können in bestimmten Ausführungsformen als Antigene zur Induktion von monoklonaler oder polyklonaler Antikörper-Produktion verwendet werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung sind daher Oligonukleotid-Hybridisierungssonden und Primer, die selektiv an Proben von Prostatakrebs hybridisieren. Diese Sonden und Primer sind ausgewählt aus denjenigen Sequenzen, die hier als SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 bezeichnet werden. Die Erhältlichkeit von Sonden und Primern, die für solche Prostata-spezifischen Nukleinsäuresequenzen spezifisch sind, die in Prostatakrebs unterschiedlich exprimiert werden, stellt die Basis für diagnostische Kits zur Verfügung, die zum Unterscheiden zwischen BPH, Prostataorgan-beschränktem Krebs und metastatischen Prostatatumoren brauchbar sind. Alternativ stellt die Erhältlichkeit von Sonden und Primern, die an eine oder mehrere Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 hybridisieren, die Basis für diagnostische Kits zur Verfügung, die beim Nachweis von Prostatakrebs brauchbar sind.
In einem breiten Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung Kits zur Verwendung im Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe. Solch ein Kit kann eines oder mehre Paare von Primern zur Amplifikation von Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 umfassen. Das Kit kann weiterhin Proben von Gesamt-mRNA umfassen, abgeleitet aus Gewebe von verschiedenen physiologischen Zuständen, so wie normal, BPH, beschränkter Tumor und metastatisch progressiver Tumor, zum Beispiel, um als Kontrollen verwendet zu werden. Das Kit kann auch Puffer, Nukleotidbasen und andere Zusammensetzungen umfassen, die in Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsreaktionen verwendet werden sollen. Jede Lösung oder Zusammensetzung kann in einem Gefäß oder einer Flasche enthalten sein und alle Gefäße können nahe beieinander in einer Schachtel zum kommerziellen Verkauf gehalten werden. Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Kit zur Verwendung beim Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe, umfassend Oligonukleotid-Sonden, die effektiv sind, um mit hoher Affinität an Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 in einem Northern-Blot-Test zu binden und Behälter für jede dieser Sonden. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein Kit zur Verwendung beim Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologische Probe, umfassend Antikörper spezifisch für Proteine, die durch Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 kodiert werden, die in der vorliegenden Erfindung angegeben sind.
In einem breiten Aspekt beschreibt die vorliegende Anmeldung Verfahren zur Behandlung von Prostatakrebspatienten durch die Verabreichung von effektiven Mengen von Antikörpern, die spezifisch für die Peptidprodukte von Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 sind, oder durch die Verabreichung von effektiven Mengen von Vektoren, die Antisense-Messenger-RNAs produzieren, die an Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 binden, wodurch sie die Expression der Proteinprodukte eines Prostata-spezifischen Gens inhibieren, das in Prostatakrebs überexprimiert wird. Antisense-Nukleinsäuremoleküle können auch als RNAs zur Verfügung gestellt werden, da einige stabile Formen von RNA mit einer langen Halbwertszeit jetzt im Stand der Technik bekannt sind, die direkt ohne die Verwendung eines Vektors verabreicht werden können. Zusätzlich können DNA-Konstrukte an Zellen durch Liposomen, rezeptorvermittelte Transfektion oder andere im Stand der Technik bekannte Verfahren zugeführt werden. Die Zuführung der vorliegenden Mittel durch jedes im Stand der Technik bekannte Mittel würde durch die vorliegenden Ansprüche umfaßt sein.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung sind neue, isolierte Nukleinsäuresegmente, die, wie hier beschrieben, als Hybridisierungssonden und Primer brauchbar sind, die spezifisch an Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 hybridisieren. Diese Nukleinsäuren sind hier als Spezies beschrieben, von denen gezeigt wird, dass sie in Prostatakrebs unterschiedlich exprimiert werden, verglichen zu BPH und normalem Prostatagewebe. Die Erfindung umfaßt weiterhin eine isolierte Nukleinsäure von zwischen ungefähr 14 und ungefähr 100 Basen in ihrer Länge, entweder identisch oder komplementär zu einem Teil derselben Länge, die innerhalb der beschriebenen Sequenzen auftritt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Proteine und Peptide mit Aminosäuresequenzen, die durch die voranstehenden, isolierten Nukleinsäuresegmente kodiert werden.
Die Erfindung umfaßt weiterhin Verfahren zum Nachweis von Prostatakrebszellen in biologischen Proben unter der Verwendung von Hybridisierungsprimern und -sonden, die so aufgebaut sind, um spezifisch an Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 zu hybridisieren. Dieses Verfahren umfaßt weiterhin das Messen der Mengen von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten, die gebildet werden, wenn Primer, ausgewählt aus den angegebenen Sequenzen, verwendet werden.
Die Anmeldung beschreibt weiterhin die Prognose und/oder Diagnose von Prostatakrebs durch Messen der Mengen von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten, die wie oben gebildet werden. Die Erfindung umfaßt Verfahren zur Behandlung von Individuen mit Prostatakrebs durch Zur-Verfügung-Stellen von effektiven Mengen von Antikörpern und/oder Antisense-DNA-Molekülen, die an die Produkte der oben angegebenen, isolierten Nukleinsäuren binden. Die Erfindung umfaßt weiterhin Kits zur Durchführung der oben angegebenen Verfahren, die Antikörper, Amplifikationsprimer und/oder Hybridisierungssonden enthalten.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin die Herstellung von Antikörpern, die für Proteine oder Peptide spezifisch sind, die durch Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 kodiert werden, und die Verwendung von diesen Antikörpern für diagnostische Anwendungen beim Nachweis von Prostatakrebs. Die Erfindung umfaßt weiterhin die therapeutische Behandlung von Prostatakrebs durch Verabreichung von effektiven Dosen von Inhibitoren, die für die oben genannten kodierten Proteine spezifisch sind.
3.0 Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Identifizierung des UC41-cDNA-Klons und Bestätigung der differentiellen Expression. Panel A. Ergebnisse einer Agarosegel-basierten Differentieal Display-Studie, wobei RNA von normalem Prostatageweben (N) mit RNA aus Prostatakrebsgeweben (C) verglichen wird. Die Position der UC41-Bande befindet sich am unteren Ende des Panels, gerade oberhalb des Markers „UC41". Panel B. Bestätigung der differentiellen Expression von UC41 durch RT-PCR^TM von normalen Prostatageweben (N) und Prostatakrebsgeweben (C). Die Position der UC41-Bande in diesem Panel ist angrenzend an den Marker „UC41".
2. UC41-Expression in paarweise übereinstimmenden normalen Geweben und Krebsgeweben. Die paarweise übereinstimmenden Gewebe wurden aus OCT-eingebetteten radikalen Prostataektomien wie unten beschrieben im Teil MATERIALIEN UND METHODEN mikro-präpariert. β₂-Mikroglobin RT-PCR^TM wurde als eine Kontrolle verwendet. Die gepaarten Proben waren von normalen Prostata- (N) und angrenzenden Prostatakrebsgeweben (C). Der Einschub auf der ganz rechten Seite der Figur zeigt die Ergebnisse von RT-PCR^TM für UC41 und β₂-Mikroglobin in den LNCaP-, PC-3- und DU145-Prostatakrebszellinien und den Lu23- und Lu35-Prostatkrebs-Xenografts.
3. In situ-Hybridisierung, durch geführt mit sowohl Sense-, als auch Antisensesonden, markiert mit Digoxigenin-dUTP, wie unten beschrieben im Teil MATERIALIEN UND METHODEN. UC41 wurde hauptsächlich in den Basalzellen von normaler Prostata exprimiert (ganz links). Seine Expression war in Prostatakrebs hochreguliert (Mitte und ganz rechts).
4. In situ-Hybridisierung, durchgeführt mit sowohl Sense-, als auch Antisensesonden, markiert mit Digoxigenin-dUTP, wie unten im Teil MATERIALIEN UND METHODEN beschrieben. UC41 war hauptsächlich in den Basalzellen von normaler Prostata exprimiert (ganz links). Seine Expression war in Prostatakrebs, metastatisch zu Lymphknoten, hochreguliert (Mitte und ganz rechts).
5. In situ-Hybridisierung, durchgeführt mit sowohl Sense-, als auch Antisensesonden, markiert mit Digoxigenin-dUTP, wie unten beschrieben im Teil MATERIALIEN UND METHODEN. UC41 war hauptsächlich in den Basalzellen von normaler Prostata exprimiert (ganz links). Seine Expression war in Prostatakrebs, metastatisch zu Knochen, hochreguliert (Mitte und ganz rechts).
6. Expression von UC41 in verschiedenen normalen Geweben, analysiert durch Northern-Blot-Hybridisierung. Der menschliche, multiple Gewebe-Northern-Blot (Clontech, 2 μg an Poly-A⁺-RNA pro Spur) wurde wie unten in dem Teil MATERIALIEN UND METHODEN beschrieben geblottet. Die relative Expression von UC41 wird in menschlicher Milz (Spur 1), Thymus (Spur 2), Prostata (Spur 3), Testis (Spur 4), Eierstock (Spur 5), Dünndarm (Spur 6), Colon (mukosale Auskleidung, Spur 7) und peripheren Blutleukozytengeweben (Spur 8) gezeigt. Die UC41-Bande von ungefähr 2,4 kb wird nur in normalem Prostatagewebe exprimiert.
7. Bestätigung der Prostata-spezifischen Expression in UC41 durch Slot-Blot-Analyse. Ein menschlicher RNA-Masterfilter (Clontech, 89–514 ng an Poly-A⁺-RNA pro Spur) wurde mit einer UC41-spezifischen Sonde wie unten im Teil MATERIALIEN UND METHODEN beschrieben sondiert. Die Expression von UC41 wurde in RNA-Proben aus (obere Reihe) Gesamthirn, Amygdala, Cauda-Kern, Cerebellum, zerebraler Cortex, vorderem Lappen, Hippocampus, Medulla oblongata, (zweite Reihe) occipitalem Lappen, Putamen, Substantia nigra, temporalem Lappen, Thalamus, Nucleus acumens, Wirbelsäule, (dritte Reihe) Herz, Aorta, Skelettmuskel, Colon, Blase, Uterus, Prostata, Magen, (vierte Reihe) Testis, Eierstock, Pankreas, Hypophyse, Nebenniere, Schilddrüse, Speicheldrüse, Brustdrüse, (fünfte Reihe) Niere, Leber, Dünndarm, Milz, Thymus, peripheren Leukozyten, Lymphknoten, Knochenmark, (sechste Reihe) Blinddarm, Lunge, Trachea, Plazenta, (siebte Reihe) fötalem Hirn, fötalem Herz, fötaler Niere, fötaler Leber, fötaler Milz, fötalem Thymus, fötaler Lunge, (untere Reihe) Hefe-Gesamt-RNA, Hefe-tRNA, E. coli-rRNA, E. coli-DNA, Poly-r(A), menschlicher Cot1-DNA, menschlicher DNA (100 ng) und menschlicher DNA (500 ng) untersucht.
8. Ergebnisse der UC41-FISH-Kartierung. Panel A zeigt die FISH-Signale auf einem Metaphase-Chromosom. Panel B zeigt dieselbe mitotische Figur, gefärbt mit DAPI, um Chromosom 3 zu identifizieren. Panel C zeigt ein Diagramm der FISH-Kartierungs- Ergebnisse, wobei jeder Punkt die doppelten FISH-Signale darstellt, die auf dem menschlichen Chromosom 3 nachgewiesen wurden.
9. Sequenzanalyse von UC41-cDNA. Die UC41-cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind gezeigt. Die vorhergesagte Leader-Sequenz ist durch den unterstrichenen Kasten gezeigt. Die vorhergesagte Transmembranregion ist fett unterstrichen. Die Vorhersage der Transmembranregion basiert auf statistischer Analyse von Tmbase, einer Datenbank von natürlich auftretenden Transmembranproteinen.
4.0 Genaue Beschreibung der Erfindung
Vorangegangene Arbeit durch die vorliegenden Erfinder und andere führten zu der Identifizierung eines Expressed-Sequence-Tag (EST), bezeichnet als UC41, dessen Expression in Prostatakrebszellen, verglichen zu normalen oder benignen Prostatageweben, erhöht war.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die gesamte cDNA-Sequenz des UC41-Gens (SEQ ID NO: 1), und identifiziert UC41 als ein neues, Prostata-spezifisches Gen, dessen Expression in Prostatakrebs hochreguliert ist. Als solches ist das UC41-Gen ein Indikator der malignen Transformation von Prostatageweben. Der Fachmann wird erkennen, dass solch ein differentiell exprimiertes Prostata-spezifisches Gen Brauchbarkeit beim frühen Nachweis, bei der Diagnose, Prognose und der Behandlung von Prostatakrebs aufweist, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
Der Fachmann im Stand der Technik wird erkennen, dass die hier beschriebenen Nukleinsäuresequenzen eine Anwendbarkeit in einer Vielzahl von Anwendungen in Prostatakrebsnachweis, der Diagnose, Prognose und Behandlung finden werden. Beispiele von solchen Anwendungen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung umfassen die Amplifikation von einer oder mehreren Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 unter der Verwendung von spezifischen Primern; der Nachweis von Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 durch Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden; die Inkorporation von isolierten Nukleinsäuren in Vektoren; die Expression von RNA, Peptiden oder Polypeptiden aus den Vektoren; die Entwicklung von immunologischen Reagenzien, entsprechend zu Proteinen, die durch isolierte Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 kodiert werden; und thera peutische Behandlungen von Prostatakrebs unter der Verwendung von Antikörpern, Antisense-Nukleinsäuren oder anderen Inhibitoren, die für die identifizierten Prostata-spezifischen Genprodukte spezifisch sind.
4.1 Nukleinsäuren
Wie hier beschrieben ist ein Aspekt der vorliegenden Beschreibung Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4. Im Umkehrschluss entsprechen diese Sequenzen: der gesamten cDNA-Sequenz von UC41 (SEQ ID NO: 1, 9); der cDNA-Sequenz von UC41, die 5' zu der UC41-EST-Sequenz, beschrieben in U.S.-Patentanmeldung Aktenzeichen Nr. 08/692,787 ist (SEQ ID NO: 3, 9, Basen 1-1322 der cDNA-Sequenz); und der cDNA-Sequenz von UC41, die 3' zu der UC41-EST-Sequenz ist (SEQ ID NO: 4, 9, Basen 1501-1934 der cDNA-Sequenz).
In einer Ausführungsform werden die hier beschriebenen Nukleinsäuresequenzen eine Brauchbarkeit als Hybridisierungssonden oder Amplifikationsprimer finden. Diese Nukleinsäuren können zum Beispiel bei der diagnostischen Abschätzung von Gewebeproben verwendet werden, oder dazu verwendet werden, um Vollängen-genomische Klone einschließlich Promotor und anderen regulatorischen Sequenzen, die denen entsprechen, zu klonieren. In bestimmten Ausführungsformen bestehen diese Sonden und Primer aus Oligonukleotidfragmenten. Solche Fragmente sollten von ausreichender Länge sein, um eine spezifische Hybridisierung an eine RNA- oder DNA-Gewebeprobe zur Verfügung zu stellen. Die Sequenzen werden typischerweise 10–20 Nukleotide sein, können jedoch länger sein. Längere Sequenzen, z.B. 40, 50, 100, 500, und sogar bis zur vollen Länge, sind für bestimmte Ausführungsformen bevorzugt.
Nukleinsäuremoleküle, die kontinuierliche Abschnitte von ungefähr 10, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800 oder 1900 Nukleotide, bis zu der vollen Länge der offenbarten Sequenzen, von einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 sind vorgesehen. Moleküle, die zu den oben genannten Sequenzen komplementär sind und an diese Sequenzen unter hochstringenten Bedingungen binden, sind ebenfalls vorgesehen. Diese Sonden werden bei einer Auswahl von Hybridisierungs-Ausführungsformen, wie z.B. Southern und Northern Blotting, brauchbar sein. In einigen Fällen ist es vorgesehen, dass Sonden verwendet werden können, die an multiple Zielsequenzen hybridisieren können, ohne ihre Fähigkeit zu beeinträchtigen, effektiv Krebs zu diagnostizieren.
Verschiedene Sonden und Primer können um die offenbarten Nukleotidsequenzen herum aufgebaut werden. Primer können von jeder Länge sein, sind jedoch typischerweise 10–20 Basen lang. Durch die Zuordnung von numerischen Werten zu einer Sequenz ist zum Beispiel der erste Rest 1, der zweite Rest ist 2 usw., kann zum Beispiel einen Algorithmus definieren, der alle Primer definiert, vorgeschlagen werden:
n bis n + y
worin n eine ganze Zahl von 1 bis zur letzten Zahl der Sequenz ist, und y ist die Länge des Primers minus Eins (9 bis 19), wobei n + y nicht die letzte Zahl der Sequenz übersteigt. Daher entsprechen für einen 10-mer die Sonden den Basen 1 bis 10, 2 bis 11, 3 bis 12 und so weiter. Für ein 15-mer entsprechen die Sonden den Basen 1 bis 15, 2 bis 16, 3 bis 17 und so weiter. Für ein 20-mer entsprechen die Sonden den Basen 1 bis 20, 2 bis 21, 3 bis 22 und so weiter.
Die Werte von n in dem Algorithmus oben für jede der Nukleinsäuresequenzen ist: SEQ ID NR: 3, n = 1322; SEQ ID NR: 4, n = 434.
Die Verwendung einer Hybridisierungssonde von zwischen 14 und 100 Nukleotiden Länge ermöglicht die Bildung eines Duplexmoleküls, das sowohl stabil und selektiv ist. Moleküle, die komplementäre Sequenzen über Bereiche von mehr als 20 Basen in Länge aufweisen, sind im allgemeinen bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und dadurch die Qualität und das Ausmaß von besonderen erhaltenen Hybridmolekülen durch verbessern. Man wird im allgemeinen bevorzugen, Nukleinsäuremoleküle aufzubauen, die Abschnitte von 20 bis 30 Nukleotiden oder sogar länger sind, wo gewünscht. Solche Fragmente können leicht durch zum Beispiel direkte Synthese des Fragments durch chemische Mittel oder durch Einführung von ausgewählten Sequenzen in rekombinante Vektoren für die rekombinante Produktion hergestellt werden.
Demzufolge können die Nukleotidsequenzen der Erfindung auf ihre Fähigkeit hin verwendet werden, selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten von Genen oder RNAs zu bilden, oder Primer für die Amplifikation von DNA oder RNA ausgegeben zur Verfügung zu stellen. In Abhängigkeit von der vorgesehenen Anwendung, wird man wünschen, variierende Hybridisierungsbedingungen zu verwenden, um verschiedene Ausmaße an Selektivität von Sonde gegen Zielsequenz zu erhalten.
Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, wird man typischerweise wünschen, relativ stringente Bedingungen anzuwenden, um die Hybride zu bilden, z.B. man wird relativ niedrige Salz- und/oder hohe Temperaturbedingungen auswählen, wie z.B. durch ungefähr 0,02 M bis ungefähr 0,10 M NaCl bei Temperaturen von ungefähr 50°C bis ungefähr 70°C zur Verfügung gestellt. Solche hoch-stringenten Bedingungen tolerieren wenig, wenn überhaupt, Fehlpaarung zwischen der Sonde und dem Templat oder Zielstrang und wären für die Isolierung von typischen Genen oder dem Nachweis von spezifischen mRNA-Transkripten besonders geeignet. Es ist im allgemeinen verstanden, dass Bedingungen durch die Hinzufügung von ansteigenden Mengen von Formamid stringenter gemacht werden können.
Für bestimmte Anwendungen, zum Beispiel die Substitution von Aminosäuren durch stellenspezifische Mutagenese, ist es ersichtlich, dass Bedingungen mit niedriger Stringenz erforderlich sind. Unter diesen Bedingungen kann die Hybridisierung auch auftreten, obwohl die Sequenzen von Sonde und Zielstrang nicht perfekt komplementär sind, sondern an einer oder mehreren Positionen fehlgepaart sind. Die Bedingungen könnten weniger stringent durch Erhöhen der Salzkonzentration und Verringerung der Temperatur gemacht werden. Zum Beispiel könnte eine mittlere stringente Bedingung zur Verfügung gestellt werden, durch ungefähr 0,1 bis 0,25 M NaCl bei Temperaturen von ungefähr 37°C bis ungefähr 55°C, während eine Bedingung mit niedriger Stringenz durch ungefähr 0,15 M bis ungefähr 0,9 M Salz bei Temperaturen im Bereich von ungefähr 20°C bis ungefähr 55°C zur Verfügung gestellt werden könnte. Daher können Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden und werden daher im allgemeinen ein Verfahren der Wahl in Abhängigkeit von den gewünschten Ergebnissen sein.
Die folgende Codontabelle kann verwendet werden, in einem stellenspezifischen Mutageneseschema, um Nukleinsäuren herzustellen, die für dieselbe oder eine leicht verschiedene Aminosäuresequenz einer angegebenen Nukleinsäure kodieren:
TABELLE 1
In anderen Ausführungsformen kann die Hybridisierung unter Bedingungen, von zum Beispiel, 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, bei Temperaturen zwischen ungefähr 20°C bis ungefähr 37°C erreicht werden. Andere verwendete Hybridisierungsbedingungen könnten ungefähr 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 μM MgCl₂ bei Temperaturen im Bereich von ungefähr 40°C bis ungefähr 72°C einschließen.
In bestimmten Ausführungsformen würde es vorteilhaft sein, Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem geeigneten Mittel, wie zum Beispiel einem Marker, zu verwenden, um Hybridisierung zu bestimmen. Eine große Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich fluoreszenten, radioaktiven, enzymatischen oder anderen Liganden, wie zum Beispiel Avidin/Biotin, die in der Lage sind, nachgewiesen zu werden. In bevorzugten Ausführungsformen kann man wünschen, einen fluoreszenten Marker oder einen Enzymtag, wie zum Beispiel Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase zu verwenden, anstelle von radioaktiven oder anderen, in der Umwelt nicht wünschenswerten Reagenzien. Im Fall von Enzymtags sind kolorimetrische Indikatorsubstanzen bekannt, die verwendet werden können, um ein Nachweismittel zur Verfügung zu stellen, das für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um eine spezifische Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure-enthaltenden Proben zu identifizieren.
Im allgemeinen ist es vorgesehen, dass die hier beschriebenen Hybridisierungssonden sowohl als Reagenzien in Lösungshybridisierung, wie in PCR^TM, zum Nachweis der Expression von entsprechenden Genen, sowie in Ausführungsformen brauchbar sind, die eine feste Phase verwenden. In Ausführungsformen, die eine feste Phase einschließen, wird die Test-DNA (oder -RNA) auf eine ausgewählte Matrix oder Oberfläche absorbiert oder auf andere Weise angebracht. Diese fixierte einsträngige Nukleinsäure wird dann einer Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter ausgewählten Bedingungen unterzogen. Die ausgewählten Bedingungen werden von den bestimmten Umständen abhängen, basierend auf den erforderlichen besonderen Kriterien (abhängig, zum Beispiel, vom G + C-Gehalt, Typ der Zielnukleinsäure, Quelle der Nukleinsäure, Größe der Hybridisierungssonde, usw.). Im Anschluss an das Waschen der hybridisierten Oberfläche, um nicht-spezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die Hybridisierung nachgewiesen oder sogar mittels des Markers quantifiziert.
Es wird verstanden werden, dass diese Erfindung nicht auf die hier offenbarten bestimmten Sonden beschränkt ist und insbesondere es vorgesehen ist, mindestens Nukleinsäuresequenzen einzuschließen, die an die offenbarten Sequenzen hybridisierbar sind oder funktionelle Sequenzanaloga dieser Sequenzen sind. Zum Beispiel kann eine teilweise Sequenz verwendet werden, um ein strukturell-verwandtes Gen oder den Vollängen-genomischen oder cDNA-Klon zu identifizieren, von der sie abgeleitet ist. Der Durchschnittsfachmann ist sich der Verfahren zur Erzeugung von cDNA und genomischen Bibliotheken, die als ein Ziel für die oben beschriebenen Sonden verwendet werden können, gut bewusst (Sambrook et al., 1989).
Für Anwendungen, in denen die Nukleinsäuresegmente der vorliegenden Erfindung in Vektoren eingeschlossen sind, wie zum Beispiel Plasmide, Cosmide oder Viren, können diese Segmente mit anderen DNA-Sequenzen kombiniert werden, wie zum Beispiel Promotoren, Polyadenylierungssignalen, Restriktionsenzymstellen, multiple Klonierungsstellen, anderen kodierenden Segmenten und ähnlichen, so dass ihre Gesamtlänge beträchtlich variieren kann. Es ist vorgesehen, dass ein Nukleinsäurefragment von fast jeder Länge verwendet werden kann, wobei die Gesamtlänge bevorzugterweise durch die Einfachheit der Präparation und Verwendung in dem vorgesehenen rekombinanten DNA-Protokoll begrenzt wird.
DNA-Segmente, die für ein spezifisches Gen kodieren, können in rekombinante Wirtszellen eingeführt werden und zur Expression eines spezifischen strukturellen oder regulatorischen Proteins verwendet werden. Alternativ können durch die Anwendung von gentechnischen Techniken Sub-Teile oder Derivate von ausgewählten Genen verwendet werden. Stromaufwärts liegende Regionen, die regulatorische Regionen, wie zum Beispiel Promotorregionen, enthalten, können isoliert werden und anschließend für die Expression des ausgewählten Gens verwendet werden.
Wo ein Expressionsprodukt erzeugt werden soll, ist es möglich, dass die Nukleinsäuresequenz variiert wird, während die Fähigkeit beibehalten wird, für dasselbe Produkt zu kodieren. Der Bezug auf die Codontabelle, wie oben zur Verfügung gestellt, wird es dem Fachmann ermöglichen, jede Nukleinsäure aufzubauen, die für ein Produkt einer gegebenen Nukleinsäure kodiert.
4.2 Kodierte Proteine
Sobald die gesamte kodierende Sequenz des differentiell exprimierten, Prostata-spezifischen Gens bestimmt wurde, kann das Gen in ein geeignetes Expressionssystem eingeführt werden. Das Gen kann in jeder Zahl von verschiedenen rekombinanten DNA-Expressionssystemen exprimiert werden, um große Menge des Polypeptidprodukts zu erzeugen, das dann gereinigt werden kann und dazu verwendet werden kann, um Tiere zu impfen, und so Antiseren zu erzeugen, mit denen weitere Untersuchungen durchgeführt werden könnten.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Expressionssystemen schließen Bakterien, wie zum Beispiel E. coli ein, Hefe, wie zum Beispiel Pichia pastoris, Baculovirus und Säugeexpressi onssysteme, wie zum Beispiel in COS- oder CHO-Zellen. Ein komplettes Gen kann exprimiert werden oder alternativ können Fragmente des Gens, die für Teile des Polypeptids kodieren, hergestellt werden.
In bestimmten breiten Anwendungen der Erfindung wird die Gensequenz, die für das Polypeptid kodiert, analysiert, um putative Transmembransequenzen nachzuweisen. Solche Sequenzen sind typischerweise hydrophob und werden leicht durch die Verwendung von Standardsequenzanalysesoftware, wie zum Beispiel MacVector (IBI, New Haven, CT), nachgewiesen. Die Anwesenheit von Transmembransequenzen ist oft schädlich, wenn ein rekombinantes Protein in vielen Expressionssystemen synthetisiert wird, insbesondere E. coli, da es zur Produktion von unlöslichen Aggregaten führt, die schwierig in die native Konformation des Proteins zu renaturieren sind. Die Deletion von Transmembransequenzen verändert typischerweise nicht signifikant die Konformation der verbleibenden Proteinstruktur.
Darüber hinaus sind Transmembransequenzen, die per Definition innerhalb einer Membran eingebettet sind, nicht zugänglich. Antikörper gegen diese Sequenzen können daher sich als nicht brauchbar in in vivo- oder in in situ-Untersuchungen erweisen. Die Deletion von Transmembran-kodierenden Sequenzen aus den für die Expression verwendeten Genen kann durch Standardtechniken erreicht werden. Zum Beispiel können zufällig-plazierte Restriktionsenzymstellen verwendet werden, um das gewünschte Genfragment auszuschneiden oder die PCR^TM-Amplifikation kann verwendet werden, um nur den gewünschten Teil des Gens zu amplifizieren.
Computersequenzanalyse kann dazu verwendet werden, um die Stelle der vorhergesagten hauptsächlichen antigenischen Determinantenepitope des Polypeptids zu bestimmen. Software, die in der Lage ist, diese Analyse durchzuführen, ist leicht käuflich erhältlich, zum Beispiel MacVector (IBI, New Haven, CT). Die Software verwendet typischerweise Standardalgorithmen, wie zum Beispiel das Kyte/Doolittle- oder Hopp/Woods-Verfahren zur Lokalisierung von hydrophilen Sequenzen, die auf der Oberfläche von Proteinen gefunden werden können und daher wahrscheinlich als antigenische Determinanten wirken.
Sobald diese Analyse durchgeführt wurde, können Polypeptide hergestellt werden, die mindestens die essentiellen Merkmale der antigenischen Determinante enthalten und die in der Erzeugung von Antiseren gegen das Polypeptid verwendet werden können. Minigene oder Gen fusionen, die für diese Determinanten kodieren, können konstruiert werden und in Expressionsvektoren durch Standardverfahren eingeführt werden, zum Beispiel, unter der Verwendung von PCR^TM-Klonierungsmethodologie.
Das Gen oder Genfragment, das für ein Polypeptid kodiert, kann in einen Expressionsvektor durch Standardsubklonierungstechniken eingeführt werden. Ein E. coli-Expressionsvektor kann verwendet werden, der das rekombinante Polypeptid als ein Fusionsprotein herstellt, was eine schnelle Affinitätsreinigung des Proteins ermöglicht. Beispiele von solchen Fusionsproteinexpressionssystemen sind das Glutathion S-Transferase-System (Pharmacia, Piscataway, NJ), das Maltosebindeproteinsystem (NEB, Beverley, MA), das FLAG-System (IBI, New Haven, CT) und das 6 × His-System (Qiagen, Chatsworth, CA).
Einige der Systeme stellen rekombinante Polypeptide her, die nur eine kleine Zahl von weiteren Aminosäuren tragen, von denen es unwahrscheinlich ist, dass sie die antigenische Fähigkeit des rekombinanten Polypeptids beeinträchtigen. Zum Beispiel fügen sowohl das FLAG-System und das 6 × His-System nur kurze Sequenzen hinzu, die beide dafür bekannt sind, dass sie schlecht antigen sind und die nicht die Faltungspolypeptids in seine native Konformation nachteilig beeinträchtigen. Andere Fusionssysteme sind so aufgebaut, um Fusionen herzustellen, wobei der Fusionspartner leicht von dem gewünschten Polypeptid ausgeschnitten wird. In einer Ausführungsform ist der Fusionspartner an das rekombinante Polypeptid durch eine Polypeptidsequenz verbunden, die eine bestimmte Erkennungssequenz für eine Protease enthält. Beispiele von geeigneten Sequenzen sind diejenigen, die durch die Tabak-"Etch"-Virusprotease (Life Technologies, Gaithersburg, MD) oder Faktor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA) erkannt werden.
Das verwendete Expressionssystem kann auch eines sein, das durch den Baculoviruspolyhedron-Promotor angetrieben wird. Das Gen, das für das Polypeptid kodiert, kann durch Standardtechniken manipuliert werden, um die Klonierung in den Baculovirusvektor zu erleichtern. Ein Baculovirusvektor ist der pBluBac-Vektor (Invitrogen, Sorrento, CA). Der Vektor, der das Gen für das Polypeptid trägt, wird in Spodoptera frugiperda-(Sf9)-Zellen durch Standardprotokolle transfiziert, und die Zellen werden kultiviert und verarbeitet, um das rekombinante Antigen herzustellen. Siehe Summers et al., U.S. Patent Nr. 4,215,051.
Als eine Alternative zu rekombinanten Polypeptiden können synthetische Peptide, entsprechend zu den antigenen Determinanten präpariert werden. Solche Peptide sind mindestens sechs Aminosäurereste lang und können bis zu ungefähr 35 Reste enthalten, was die ungefähre obere Längengrenze von automatischen Peptidsynthesemaschinen ist, wie zum Beispiel denjenigen, erhältlich von Applied Biosystems (Foster City, CA). Die Verwendung von solch kleinen Peptiden zur Impfung erfordert typischerweise die Konjugation des Peptids an ein immunogenes Trägerprotein, wie zum Beispiel das Hepatitis B Oberflächenantigen, "Keyhole Limpet"-Hämocyanin oder Rinderserumalbumin. Verfahren zur Durchführung dieser Konjugation sind alle gut im Stand der Technik bekannt.
Aminosäuresequenzvarianten des Polypeptids können auch präpariert werden. Diese können zum Beispiel kleinere Sequenzvarianten des Polypeptids sein, die aufgrund der natürlichen Variation innerhalb der Population entstehen oder sie können Homologe sein, die in anderen Spezies gefunden werden. Sie können auch Sequenzen sein, die nicht natürlich auftreten, die jedoch ausreichend ähnlich sind, so dass sie ähnlich funktionieren und/oder eine Immunantwort hervorrufen, die mit den natürlichen Formen des Polypeptids kreuzreagieren. Sequenzvarianten können durch Standardverfahren der Stellen-spezifischen Mutagenese präpariert werden, so wie den hier beschriebenen, um die Transmembransequenz zu entfernen.
Aminosäuresequenzvarianten des Polypeptids können Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten sein. Deletionsvarianten fehlt eine oder mehrere Reste des nativen Proteins, die nicht für die Funktion oder immunogenische Aktivität essentiell sind und werden durch die Varianten beispielhaft dargestellt, denen eine Transmembransequenz fehlt. Ein weiterer verbreiteter Typ an Deletionsvariante ist einer, dem sekretorische Signalsequenzen oder Signalsequenzen fehlen, die ein Protein steuern, an einen bestimmten Teil einer Zelle zu binden. Ein Beispiel der letztgenannten Sequenz ist die SH2-Domäne, die eine Proteinbindung an Phosphotyrosinreste induziert.
Substitutions-Varianten enthalten typischerweise eine alternative Aminosäure an einer oder mehreren Stellen innerhalb des Proteins und können so aufgebaut werden, um eine oder mehrere Eigenschaften des Polypeptids zu modulieren, wie zum Beispiel die Stabilität gegen proteolytische Spaltung. Substitutionen sind bevorzugterweise konservativ, das heißt, eine Aminosäure wird mit einer ähnlicher Größe und Ladung ersetzt. Konservative Substitutionen sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen zum Beispiel die Veränderungen von: Alanin zu Serin; Arginin zu Lysin; Asparagin zu Glutamin oder Histidin; Aspartat zu Glutamat; Cystein zu Serin; Glutamin zu Asparagin; Glutamat zu Aspartat; Glycin zu Prolin; Histidin zu Asparagin oder Glutamin; Isoleucin zu Leucin oder Valin; Leucin zu Valin oder Isoleucin; Lysin zu Arginin, Glutamin oder Glutamat; Methionin zu Leucin oder Isoleucin; Phenylalanin zu Tyrosin, Leucin oder Methionin; Serin zu Threonin; Threonin zu Serin; Tryptophan zu Tyrosin; Tyrosin zu Tryptophan oder Phenylalanin und Valin zu Isoleucin oder Leucin ein.
Insertions-Varianten schließen Fusionsproteine ein, wie diejenigen, die dazu verwendet werden, um eine schnelle Reinigung des Polypeptids zu ermöglichen und können auch Hybridproteine einschließen, die Sequenzen aus anderen Proteinen und Polypeptiden, die für das Polypeptid homolog sind, enthalten. Zum Beispiel kann eine Insertions-Variante Teile der Aminosäuresequenz des Polypeptids von einer Spezies zusammen mit Teilen des homologen Polypeptids auch einer anderen Spezies einschließen. Andere Insertions-Varianten können diejenigen einschließen, in die zusätzliche Aminosäuren in die kodierende Sequenz des Polypeptids eingeführt wurden. Dies sind typischerweise kleinere Insertionen als die oben beschriebenen Fusionsproteine und werden zum Beispiel eingeführt, um eine Protease-Spaltstelle zu unterbrechen.
Hauptsächliche antigenische Determinanten des Polypeptids können durch einen empirischen Ansatz identifiziert werden, in dem Teil des Gens, das für das Polypeptid kodiert, in einen rekombinanten Wirt exprimiert werden und die erhaltenen Proteine auf ihre Fähigkeit hin getestet werden, eine Immunantwort hervorzurufen. Zum Beispiel kann PCR^TM verwendet werden, um einen Bereich von Peptiden herzustellen, denen sukzessiv längere Fragmente des C-Terminus des Proteins fehlen. Die immunprotektive Aktivität jedes dieser Peptide identifiziert dann diejenigen Fragmente oder Domänen des Polypeptids, die für diese Aktivität essentiell sind. Weitere Untersuchungen, in denen nur eine kleine Zahl von Aminosäuren bei jeder Iteration entfernt wird, ermöglichen dann die Lokalisierung der antigenen Determinanten des Polypeptids.
Ein anderes Verfahren zur Präparation der Polypeptide gemäß der Erfindung ist die Verwendung von Peptidmimetika. Mimetika sind Peptid-enthaltende Moleküle, die Elemente der Proteinsekundärstruktur nachahmen. Siehe zum Beispiel Johnson et al. (1993). Der dahinter liegende Ansatz hinter der Verwendung von Peptidmimetika ist, dass das Peptidrückgrat von Proteinen hauptsächlich existiert, um Aminosäure-Seitenketten auf solch eine Weise zu orien tieren, dass sie molekulare Interaktionen erleichtern, wie zum Beispiel diejenige von Antikörper und Antigen. Von einem Peptidmimetikum wird erwartet, dass es molekulare Interaktionen ähnlich zu dem natürlichen Molekül erlaubt.
Erfolgreiche Anwendungen des Peptidmimetikakonzepts haben sich bisher auf Mimetika von β-Turns innerhalb von Proteinen fokussiert, die als hochantigen bekannt sind. Wahrscheinlich kann die β-Turn-Struktur innerhalb eines Polypeptids durch Computer-basierte Algorithmen wie hier diskutiert vorhergesagt werden. Sobald die Komponenten-Aminosäuren des Turns bestimmt sind, können Peptidmimetika konstruiert werden, um eine ähnliche spatiale Orientierung der essentiellen Elemente der Aminosäure-Seitenketten zu erreichen.
4.3 Präparation von für kodierte Proteine spezifische Antikörper
4.3.1 Expression von Proteinen aus klonierten cDNAs
Die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 angegebenen cDNA-Spezies können als kodierte Peptide oder Proteine exprimiert werden. Die gentechnische Bearbeitung von DNA-Segmenten zur Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen System kann durch Techniken durchgeführt werden, die dem Fachmann in der rekombinanten Expression allgemein bekannt sind. Es wird geglaubt, dass im Wesentlichen jedes Expressionssystem in der Expression der beanspruchten Nukleinsäuresequenzen angewendet werden kann.
Sowohl cDNA und genomische Sequenzen sind für die eukaryontische Expression geeignet, da die Wirtszelle im Allgemeinen die genomischen Transkripte prozessieren wird, um eine funktionelle mRNA für die Translation in Proteine zu ergeben. Zusätzlich ist es möglich, teilweise Sequenzen zur Erzeugung von Antikörpern gegen diskrete Teile eines Genprodukts zu verwenden, auch wenn die Gesamtsequenz des Genprodukts unbekannt bleibt. Computerprogramme sind erhältlich, um bei der Selektion von Regionen zu helfen, die potentielle immunologische Signifikanz aufweisen. Zum Beispiel ist Software, die in der Lage ist, diese Analyse durchzuführen, leicht käuflich von MacVector (IBI, New Haven, CT) erhältlich. Die Software verwendet typischerweise Standardalgorithmen, wie zum Beispiel die Kyte/Doolittle- oder Hopp/Woods-Verfahren für die Lokalisierung von hydrophilen Sequenzen, die charakteristischerweise auf der Oberfläche von Proteinen gefunden werden und daher möglicherweise als antigene Determinanten wirken können.
Wie hier verwendet sind die Ausdrücke „gentechnisch veränderte" und "rekombinante" Zellen dazu vorgesehen, sich auf eine Zelle zu beziehen, in die ein exogenes DNA-Segment oder Gen, wie zum Beispiel eine cDNA oder Gen durch die menschliche Hand eingeführt wurde. Daher sind gentechnisch veränderte Zellen von natürlich auftretenden Zellen unterscheidbar, die nicht ein rekombinant eingeführtes exogenes DNA-Segment oder Gen enthalten. rekombinante Zellen schließen diejenigen ein, die eingeführte cDNA oder ein genomisches Gen aufweisen und schließen auch Gene ein, die angrenzend an einen heterologen Promoter positioniert sind, der nicht natürlicherweise mit dem bestimmten eingeführten Gen assoziiert ist.
Um ein rekombinantes kodiertes Protein oder Peptid zu exprimieren, ob Mutanten oder Wildtyp, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, würde einer einen Expressionsvektor vorbereiten, der eine der beanspruchten isolierten Nukleinsäuren unter Kontrolle von oder operativ verbunden mit einem oder mehreren Promotoren umfaßt. Um eine kodierende Sequenz „ unter die Kontrolle von" einem Promotor zu bringen positioniert man das 5'-Ende der Transkriptionsstartstelle des transkriptionellen Leserahmens im allgemeinen zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 Nukleotide „stromabwärts" (d.h. 3') des ausgewählten Promotors. Der „stromaufwärts" gelegene Promotor stimuliert die Transkription der DNA und fördert die Expression des kodierten rekombinanten Proteins. Dies ist die Bedeutung von „rekombinanter Expression" in diesem Zusammenhang.
Viele Standardtechniken sind erhältlich, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die geeigneten Nukleinsäuren enthalten und transkriptionelle/translationale Kontrollsequenzen, um eine Protein- oder Peptidexpression in einer Vielzahl von Wirts-Expressionssystemen zu erreichen. Zelltypen, die für die Expression erhältlich sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf, Bakterien, wie zum Beispiel E. coli und B. subtilis, transformiert mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren.
Bestimmte Beispiele von prokaryontischen Wirten sind E. coli-Strämme RR1, E.coli LE392, E.coli B. E.coli X 1776 (ATCC Nr. 31537) sowie E. coli W3110 (F-, lambda-, prototroph, ATCC Nr. 273325); Bazilli, wie zum Beispiel Bacillus subtilis; und andere Enterobakteria ceen, wie zum Beispiel Salmonella typhimurium, Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Spezies.
Im Allgemeinen werden Plasmid-Vektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die von Spezies abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Zusammenhang mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt gewöhnlicherweise eine Replikationsstelle sowie markierende Sequenzen, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen zur Verfügung zu stellen. Zum Beispiel wird E. coli oft transformiert unter der Verwendung von pBR322, einem Plasmid, das von einer E. coli-Spezies abgeleitet ist. pBR322 enthält Gene für die Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt daher ein einfaches Mittel zur Identifizierung von transformierten Zellen zur Verfügung. Das pBR-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide oder Phagen müssen auch enthalten, oder modifiziert werden um zu enthalten, Promotoren, die durch den mikrobiellen Organismus zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können.
Zusätzlich können Phagen-Vektoren, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die mit dem Wirtsmikroorganismus kompatibel sind, als transformierende Vektoren in Zusammenhang mit diesen Wirten verwendet werden. Zum Beispiel kann der Phage Lambda GEM^TM-11 verwendet werden bei der Herstellung eines rekombinanten Phagenvektors, der dazu verwendet werden kann Wirtszellen zu transformieren, wie zum Beispiel E. coli LE392.
Weitere brauchbare Vektoren schließen pIN-Vektoren (Inouye et al., 1985); und pGEX-Vektoren zur Verwendung bei der Erzeugung von Glutathion S-Transferase(GST)-löslichen Fusionsproteinen zur späteren Reinigung und Abtrennung oder Spaltung ein. Andere geeignete Fusionsproteine sind diejenigen mit β-Galactosidase, Ubiquitin oder Ähnlichem.
Promotoren, die am häufigsten in rekombinanter DNA-Konstruktion verwendet werden schließen die β-Lactamase (Penicillinase), Laktose und Tryptophan(trp)-Promotorsysteme ein. Während diese am häufigsten verwendet werden, wurden andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet und Details, die ihre Nukleinsäuren betreffen wurden publiziert, was es dem Fachmann ermöglicht, diese funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren.
Zur Expression in Saccharomyces wird zum Beispiel das Plasmid YRp7 herkömmlich verwendet (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm einer Hefe zur Verfügung stellt, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, zum Beispiel ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977). Die Anwesenheit der trp1-Läsion als ein Charakteristikum des Hefewirtszellgenoms stellt dann eine effektive Umgebung zum Nachweis von Transformation durch Wachstum in der Abwesenheit von Tryptophan zur Verfügung.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren schließen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), wie zum Beispiel Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-Phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratnmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase und Glukokinase ein. Bei der Herstellung von geeigneten Expressionsplasmiden werden die Terminationssequenzen, die mit diesen Genen assoziiert sind, auch in dem Expressionsvektor 3' der Sequenz, von der gewünscht ist, dass sie exprimiert wird, ligiert, um eine Polyadenylierung der mRNA und Termination zur Verfügung zu stellen.
Andere geeignete Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil von Transkription aufweisen, die durch Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, schließen die Promotorregion für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit dem Stickstoff-Stoffwechsel assoziiert sind und die vorgenannte Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase ein und Enzyme, die für die Maltose- und Galaktose-Verwendung verantwortlich sind.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können Kulturen von Zellen, die von multizellulären Organismen abgeleitet sind, auch als Wirtszellen verwendet werden. Im Prinzip kann jede solche Zellkultur benützt werden, ob von vertebrater oder invertebrater Kultur. Zusätzlich zu Säugerzellen schließen diese Insektenzellsysteme ein, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Baculovirus) infiziert sind und Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert sind oder transformiert mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid), die eine oder mehrere kodierende Sequenzen enthalten.
Als ein brauchbares Insektensystem wird Autographa californica Kernpolyhidrosisvirus (AcNPV) als ein Vektor verwendet, um fremde Gene zu exprimieren. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die isolierten Nukleinsäure-kodierenden Sequenzen werden in nicht essentielle Regionen (zum Beispiel das Polyhedringen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (zum Beispiel dem Polyhedrinpromotor) platziert. Die erfolgreiche Einführung der kodierenden Sequenzen führt zu der Inaktivierung des Polyhedringens und der Herstellung von nicht-verschlossenen rekombinanten Virus (d.h. Virus, dem die proteinöse Hülle fehlt, die durch das Polyhedringen kodiert wird). Diese rekombinanten Viren werden dann dazu verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in denen das eingeführte Gen exprimiert wird (z. B. U.S.-Patent Nr. 4,215,051 (Smith)).
Beispiele von brauchbaren Säuger-Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Chinese hamster ovary (CHO)-Zelllinien, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 373, RIN und MDCK-Zellinien. Zusätzlich kann ein Wirtszellstrang ausgewählt werden, der die Expression der inserierten Sequenzen moduliert oder modifiziert und das Genprodukt in der spezifischen gewünschten Weise prozessiert. Solche Modifikationen (z.B. Glykosylierung) und Prozessieren (z.B. Spaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des kodierten Proteins wichtig sein.
Verschiedene Wirtszellen weisen Charakteristika und spezifische Mechanismen für das posttranslationale Prozessieren und die Modifikation von Proteinen auf. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können so ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und das Prozessieren des exprimierten fremden Proteins sicherzustellen. Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugerzellen schließen gewöhnlicherweise einen Ursprung der Replikation (wie erforderlich), einen vor dem Gen, das exprimiert werden soll, lokalisierten Promotor zusammen mit jeglichen erforderlichen Ribosom-Bindungsstellen, RNA-Splicestellen, eine Polyadenylierungsstelle und transkriptionelle Terminatorsequenzen ein. Der Ursprung der Replikation kann entweder durch Konstruktion des Vektors, einen exogenen Ursprung zu enthalten, wie zum Beispiel abgeleitet von SV40 oder einer anderen viralen Quelle (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) zur Verfügung gestellt werden oder kann durch den Wirtszell-chromosomalen Replikationsmechanismus zur Verfügung gestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert ist, ist das Letztgenannte oftmals ausreichend.
Die Promotoren können von dem Genom von Säugerzellen (z.B. Metallothioneinpromotoren) oder aus Säugerviren (z.B. dem Adenovirus-späten Promotor; dem Vakzinia-Virus 7,5K-Promotor) abgeleitet sein. Weiter ist es auch möglich und kann wünschenswert sein, Promotor oder Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz assoziiert sind, unter der Voraussetzung, dass solche Kontrollsequenzen mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Eine Zahl von viral-basierten Expressionssystemen kann verwendet werden, zum Beispiel sind herkömmlich verwendete Promotoren abgeleitet von Polyoma, Adenovirus 2 und am häufigsten Simian Virus 40 (SV40). Die frühen und späten Promotoren von SV40-Virus sind besonders brauchbar, da sie beide leicht aus dem Virus als ein Fragment erhalten werden können, das auch den SV40-viralen Ursprung der Replikation enthält. Kleinere oder größere SV40-Fragmente können auch verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass die ungefähr 250 bp-Sequenz eingeschlossen ist, die sich von der HindIII-Stelle in Richtung der Bgl I-Stelle erstreckt, die in dem viralen Ursprung der Replikation lokalisiert ist.
In Fällen, wo ein Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet wird können die kodierenden Sequenzen an einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z.B. der späte Promotor und die Tripartit Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirusgenom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination eingeführt werden. Die Einführung in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, das lebensfähig ist und in der Lage ist, Proteine in infizierten Wirten zu exprimieren.
Spezifische Startsignale können auch für die effiziente Translation der beanspruchten isolierten Nukleinsäure-kodierenden Sequenzen erforderlich sein. Diese Signale schließen das ATG-Startkodon und angrenzende Sequenzen ein. Exogene Translations-Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Startkodons, können zusätzlich zur Verfügung gestellt werden müssen. Der Fachmann wäre leicht in der Lage, dies zu bestimmen und die erforderlichen Signale zur Verfügung zu stellen. Es ist gut bekannt, dass das Startkodon in-frame (oder in-Phase) mit dem Leserahmen der gewünschten kodierenden Sequenz vorliegen muss, um die Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und Startkodons können aus einer Vielzahl von Ursprüngen stammen, sowohl natürlich und synthetisch. Die Effizienz der Expression kann durch den Einschluss von geeigneten Transkription senhancer-Elementen oder Transkriptionsterminatoren verbessert werden (Bittner et al., 1987).
In der eukaryontischen Expression wird es typischerweise auch wünschenswert sein, in die Transkriptionseinheit eine geeignete Polyadenylierungsstelle (z.B. 5'-AATAAA-3') einzufügen, falls eine solche nicht innerhalb des original klonierten Segments vorhanden war. Typischerweise wird die Poly-A-Hinzufügungsstelle ungefähr 30 bis 2000 Nukleotide „stromabwärts" der Terminationsstelle des Proteins bei einer Position vor der Transkriptionstermination platziert.
Für die Langzeit-Produktion von rekombinanten Proteinen in hoher Ausbeute ist die stabile Expression bevorzugt. Zum Beispiel können Zelllinien, die stabil Konstrukte exprimieren, die für Proteine kodieren, gentechnisch hergestellt werden. Anders als die Verwendung von Vektoren, die virale Ursprünge der Replikation enthalten, können Wirtszellen mit Vektoren transformiert werden, die durch geeignete Expressionskontrollelemente kontrolliert werden (z.B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen, usw.) und einen selektierbaren Marker. Im Anschluss an die Einführung von fremder DNA kann es gentechnisch veränderten Zellen ermöglicht werden, für 1–2 Tage in einem angereicherten Medium zu wachsen und dann werden sie auf ein selektives Medium übertragen. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid überträgt die Resistenz für die Selektion und ermöglicht es den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um Foci zu bilden, die umgekehrt kloniert und in Zelllinien expandiert werden können.
Eine Zahl von Selektionssystemen können verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, die Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase (Wigler et al., 1977), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska et al., 1962) und Adenin-Phosphoribosyltransferase-Gene (Lowy et al., 1980), in jeweils tk-, hgprt- oder aprt-Zellen. Auch kann die antimetabolite Resistenz als die Basis der Selektion für dhfr verwendet werden, das Resistenz gegen Methotrexat überträgt (Wigler et al., 1980; O'Hare et al., 1981); gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure überträgt (Mulligan et al., 1981); neo, das Resistenz gegenüber dem Aminoglycosid G-418 überträgt (Colberre-Garapin et al., 1981) und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin überträgt (Santerre et al., 1984).
Es ist vorgesehen, dass die isolierten Nukleinsäuren der Erfindung „überexprimiert" werden können, d.h. in erhöhten Spiegeln relativ zu ihrer natürlichen Expression in menschlichen Prostatazellen exprimiert werden oder sogar relativ zur Expression von anderen Proteinen in der rekombinanten Wirtszelle. Solche Überexpression kann durch eine Vielzahl von Verfahren ermittelt werden, einschließlich Radio-Markierung und/oder Proteinreinigung. Jedoch sind einfache und direkte Verfahren bevorzugt, zum Beispiel diejenigen, die SDS/PAGE und Proteinfärbung oder Western Blot einschließen, gefolgt durch quantitative Analysen, wie zum Beispiel densitometrisches Scannen des sich ergebenden Gels oder Blots. Eine spezifische Zunahme im Spiegel des rekombinanten Proteins oder Peptids im Vergleich zum Spiegel in natürlichen Prostatazellen ist für die Überexpression anzeigend, genau wie eine relative Häufigkeit des spezifischen Proteins in Bezug zu den anderen Proteinen, die durch die Wirtszelle produziert werden und, z.B., auf einem Gel sichtbar.
4.3.2 Reinigung von exprimierten Proteinen
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen die Reinigung und in bestimmten Ausführungsformen die wesentliche Reinigung eines kodierten Proteins oder Peptids. Der Ausdruck „gereinigtes Protein oder Peptid" wie hier verwendet ist als eine Zusammensetzung betreffend vorgesehen, die isolierbar ist von anderen Komponenten, wobei das Protein oder Peptid in einem jeglichen Ausmaß relativ zu seinem natürlich-erhältlichen Zustand gereinigt ist, d.h. in diesem Fall relativ zu seiner Reinheit innerhalb eines Prostatazellextrakts. Ein gereinigtes Protein oder Peptid betrifft daher auch ein Protein oder Peptid, das frei von der Umgebung ist, in dem es natürlich auftreten kann.
Im Allgemeinen wird „gereinigt" eine Protein- oder Peptidzusammensetzung bezeichnen, die einer Fraktionierung unterzogen wurde, um verschiedene andere Komponenten zu entfernen und wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen ihre exprimierte biologische Aktivität beibehält. Wenn der Ausdruck „im Wesentlichen gereinigt" verwendet wird, wird dies eine Zusammensetzung betreffen, in der das Protein oder Peptid die hauptsächliche Komponente der Zusammensetzung bildet, wie zum Beispiel ungefähr 50% oder mehr der Proteine in der Zusammensetzung darstellend.
Verschiedene Verfahren zur Quantifizierung des Ausmaßes von Reinigung des Proteins oder Peptids werden dem Fachmann im Stand der Technik bekannt sein, im Hinblick auf die vor liegende Beschreibung. Diese schließen zum Beispiel das Bestimmen der spezifischen Aktivität einer aktiven Fraktion oder das Ermitteln der Zahl von Polypeptiden innerhalb einer Fraktion durch SDS/PAGE-Analyse ein. Ein bevorzugtes Verfahren zur Ermittlung der Reinheit einer Fraktion ist es, die spezifische Aktivität der Fraktion zu berechnen, sie mit der spezifischen Aktivität des Ausgangsextrakts zu vergleichen und so das Ausmaß an Reinheit zu berechnen, hier durch eine „-fach Reinigungszahl" ermittelt. Die aktuellen Einheiten, die dazu verwendet werden, die Menge von Aktivität darzustellen, werden natürlich abhängig sein von der bestimmten ausgewählten Testtechnik, um der Reinigung zu folgen, und ob oder ob nicht das exprimierte Protein oder Peptid eine nachweisbare Aktivität zeigt.
Verschiedene Techniken, die zur Verwendung in Proteinreinigung geeignet sind, werden dem Fachmann im Stand der Technik gut bekannt sein. Diese schließen zum Beispiel das Fällen mit Ammoniumsulfat, PEG, Antikörper und Ähnliches oder durch Hitzedenaturierung ein, gefolgt von Zentrifugation; Chromatographieschritte, wie zum Beispiel Ionenaustausch, Gelfiltration, Umkehrphase, Hydroxylapatit und Affinitätschromatographie; isoelektrisches Fokusieren; Gel-Elektrophorese und Kombinationen von solchen und anderen Techniken. Wie allgemein im Stand der Technik bekannt ist, wird geglaubt, dass die Reihenfolge der Durchführung der verschiedenen Reinigungsschritte verändert werden kann oder das bestimmte Schritte ausgelassen werden können und immer noch zu geeigneten Verfahren zur Präparation eines im Wesentlichen gereinigten Proteins oder Peptids führen werden.
Es besteht kein allgemeines Erfordernis, dass das Protein oder Peptid immer im am meisten gereinigten Zustand zur Verfügung gestellt wird. In der Tat ist es vorgesehen, dass weniger substantiell gereinigte Produkte eine Brauchbarkeit in bestimmten Ausführungsformen haben werden. Die teilweise Reinigung kann durch die Verwendung von weniger Reinigungsschritten in Kombination erreicht werden oder durch Verwenden von verschiedenen Formen desselben allgemeinen Reinigungsschemas. Zum Beispiel ist es ersichtlich, dass einen Kationen-Austausch-Säulenchromatographie, die unter der Verwendung einer HPLC-Vorrichtung durchgeführt wird, im Allgemeinen zu einer größer-fachen Reinigung führen wird, als dieselbe Technologie unter der Verwendung eines Niedrigdruck-Chromatographiesystems. Verfahren, die ein geringeres Ausmaß an relativer Reinigung zeigen, können Vorteile in der Gesamtausbeute an Proteinprodukt aufweisen oder bei der Beibehaltung der Aktivität eines exprimierten Proteins.
Es ist bekannt, dass die Wanderung eines Polypeptids variieren kann, manchmal signifikant, mit verschiedenen Bedingung an SDS/PAGE (Capaldi et al., 1977). Es wird daher ersichtlich sein, dass unter sich unterscheidenden Elektrophoresebedingungen die ersichtlichen Molekulargewichte von gereinigten oder teilweise gereinigten Expressionsprodukten variieren können.
4.3.3 Antikörpererzeugung
Für einige Ausführungsformen wird es wünschenswert sein, Antikörper herzustellen, die mit hoher Spezifität an das/die Polypeptidprodukt(e) einer isolierten Nukleinsäure ausgewählt aus SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 binden werden. Mittel zur Präparation und Charakterisierung sind gut im Stand der Technik bekannt (See, z.B. Antikörper: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Verfahren zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern sind im Stand der Technik gut bekannt. Kurz wird ein polyklonaler Antikörper durch Immunisierung eines Tieres mit einer immunogenen Zusammensetzung und Sammeln von Antiseren aus diesem immunisierten Tier präpariert. Eine große Zahl von Tierspezies können für die Produktion von Antiseren verwendet werden. Typischerweise ist das für die Produktion eines anti-Antiserums verwendete Tier ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Aufgrund der relativ großen Blutvolumen von Kaninchen, ist ein Kaninchen eine bevorzugte Auswahl zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern.
Wie im Stand der Technik gut bekannt ist, kann eine bestimmte Zusammensetzung in ihrer Immunigenizität variieren. Es ist daher oft erforderlich, das Wirtsimmunsystem zu boosten, wie durch Koppeln eines Peptids oder Polypeptidimmunogens an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind „Keyhole Limpet Hemocyanin" (KLH) und Rinderserum-Albumin (BSA). Andere Albumine, wie z.B. Ovalbumin, Mausserium-Albumin oder Kaninchenserum-Albumin können auch als Träger verwendet werden. Mittel zur Konjugation eines Polypeptids an ein Trägerprotein sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen Glutaraldehyd, M-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid Ester, Carbodiimid und Bis-Biazotisiertes Benzidin ein.
Es ist auch gut im Stand der Technik bekannt, dass die Immunogenizität einer bestimmten Immunogen-Zusammensetzung durch die Verwendung von nicht-spezifischen Stimulatoren der Immunantwort verstärkt werden kann, die als Adjuvantien bekannt sind. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvantien schließen vollständiges Freund's Adjuvans (ein nicht-spezifischer Stimulator der Immunantwort der abgetötete Mycobacterium tuberculosis enthält), unvollständiges Freund's Adjuvans und Aluminumhydroxid-Adjuvans ein.
Die Menge von in der Produktion von polyklonalen Antikörpern verwendeter immunogener Zusammensetzung variiert in Abhängigkeit von der Natur des Immunogens sowie für die Immunisierung verwendeten Tier. Eine Vielzahl von Routen können verwendet werden, um das Immunogen zu verabreichen (subkutan, intramuskulär, intradernal, intravenös, intraperitoneal). Die Herstellung von polyklonalen Antikörpern kann durch Sammeln von Blut des immunisierten Tiers an bestimmen Punkten im Anschluss an die Immunisierung verfolgt werden. Eine zweite Boosterinjektion kann auch gegeben werden. Dieses Verfahren von Boosten und Titrieren wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht wird. Wenn ein gewünschter Spiegel an Immunogenizität erhalten wurde, kann das immunisierte Tier ausgeblutet werden und das Serum isoliert und gelagert werden, und/oder das Tier kann verwendet werden, um MAbs zu erzeugen. Zur Herstellung von Kaninchen-polyklonalen Antikörpern kann das Kaninchen durch eine Ohrvene oder alternativ durch kardiale Punktur ausgeblutet werden. Dem entfernten Blut wird es ermöglicht zu koagulieren und dann wird es zentrifugiert, um die Serumkomponenten von ganzen Zellen und Blutklumpen abzutrennen. Das Serum kann für verschiedene Anwendungen verwendet werden wie es ist, oder andererseits kann die gewünschte Antikörperfraktion durch gut bekannte Verfahren gereinigt werden, wie z.B. Affinitätschromatrographie unter der Verwendung eines anderen Antikörpers oder eines Peptids, das an eine feste Matrix gebunden ist.
Monoklonale Antikörper (MAbs) können leicht durch die Verwendung von gut bekannten Techniken präpariert werden, wie zum Beispiel denen, die in US-Patent Nr. 4,196,265 beispielhaft dargestellt sind. Typischerweise schließt diese Technik das Immunisieren eines geeigneten Tiers mit einer ausgewählten immunogenen Zusammensetzung, z.B. einem gereinigten oder teilweise gereinigten exprimierten Protein, Polypeptid oder Peptid ein. Die immunisierende Zusammensetzung wird auf eine Weise verabreicht, die effektiv ist, um die Antikörperproduzierenden Zellen zu stimulieren.
Die Verfahren zu Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (MAbs) beginnen im allgemeinen entlang mit derselben Grundsätze wie diejenigen zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern. Nagetiere, wie z.B. Mäuse und Ratten sind bevorzugte Tiere, jedoch ist die Verwendung von Kaninchen, Schafen oder Froschzellen auch möglich. Die Verwendung von Ratten kann bestimmte Vorteile zur Verfügung stellen (Goding, 1986, pp. 60–61), jedoch sind Mäuse bevorzugt, wobei BALB/c-Maus am meisten bevorzugt ist, da diese am meisten routinemäßig verwendet wird und im allgemeinen einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen ergibt.
Die Tiere werden mit Antigen wie oben seziert. Das Antigen kann an Trägermoleküle, wie z.B. „Keyhole Limpet Hemocyanin" gekoppelt werden, falls erfordert. Das Antigen wurde typischerweise mit Adjuvants gemischt, wie z.B. Freund's vollständigem oder unvollständigem Adjuvants. Boosterinjektionen mit denselben Antigenen würden in ungefähr 2-Wochenintervallen auftreten.
Im Anschluss an die Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential zur Herstellung von Antikörpern, spezifisch B-Lymphozyten (B-Zellen), ausgewählt zur Verwendung in dem MAb-erzeugenden Protokoll. Diese Zellen können aus biopsierten Milzen, Mandeln oder Lymphknoten, oder aus einer peripheren Blutprobe erhalten werden. Milzzellen und periphere Blutzellen sind bevorzugt, die zuerst genannten, da sie eine reiche Quelle von Antikörpernproduzierenden Zellen sind, die sich in der teilenden Plasmablasten-Phase befinden, und die letztgenannten, da peripheres Blut leicht zugänglich ist. Oft wird ein Panel von Tieren immunisiert werden müssen und die Milz des Tieres mit dem höchsten Antikörpertiter wird entfernt werden und die Milzlymphozyten durch Homogenisieren der Milz mit einer Spritze erhalten werden. Typischerweise enthält eine Milz auch von einer immunisierten Maus ungefähr 5 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ Lymphozyten.
Die Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten aus dem immunisierten Tier werden dann mit Zellen einer immortalisierten Myelomzelle fusioniert, im allgemeinen eine derselben Spezies, wie das Tier, das immunisiert wurde. Myelomzelllinien, die zur Verwendung von Hybridom-produzierenden Fusionsverfahren geeignet sind, sind bevorzugterweise nicht-Antikörper herstellend, weisen eine hohe Fusionseffizienz auf und Enzymdefizienzen, die sie unfähig dazu machen, in bestimmten selektiven Medien zu wachsen, was das Wachstum von nur den gewünschten fusionierten Zellen (Hybridome) fördert.
Jede einer Zahl von Myelomzellen kann verwendet werden, wie dem Fachmann bekannt ist (Goding, pp. 65–66, 1986; Campbell, pp. 75–83, 19684). Zum Beispiel, wo das immunisierte Tier eine Maus ist, kann man P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 Bul verwenden; für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 verwenden, und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 sind alle brauchbar in Verbindung mit menschlichen Zellfusionen.
Eine bevorzugte murine Myelomzelle ist die NS-1 Myelonzellinie (auch als P3-NS-1-Ag4-1) bezeichnet, die leicht erhältlich ist aus dem NIGMS Menschliche Genetische Mutantenzellen Hinterlegungsstelle, durch Bestellen der Zellinien, Hinterlegungsstelle GM3573. Eine andere Mausmyelomzellinie, die verwendet werden kann, ist die 8-azaguanini-resistente Maus-Murines Myelom SP2/0 nicht-Producer Zellinie.
Verfahren zur Erzeugung von Hybriden von Antikörper-produzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen gewöhnlicherweise das Mischen von somatischen Zellen mit Myelomzellen in einem 2:1 Verhältnis, obwohl das Verhältnis von etwa 20:1 bis ungefähr 1:1 jeweils variieren kann, in der Anwesenheit eines Mittels oder Mittel (chemisch oder elektrisch), die die Fusion von Zellmembranen unterstützen. Fusionsverfahren unter der Verwendung von Sendai-Virus wurden durch Köhler und Milstein (1975; 1976) beschrieben und diejenigen von Polyethylenglycol (PEG) wie z.B. 37% v/v) PEG, durch Gefter et al. (1977). Die Verwendung von elektrisch induzierten Fusionsverfahren ist auch geeignet (Goding S. 71–74, 1986).
Fusionsverfahren produzieren gewöhnlicherweise lebensfähige Hybride bei geringen Frequenzen, ungefähr 1 × 10^–6 bis 1 × 10^–8. Jedoch verursacht dies kein Problem, da die lebensfähigen fusionierten Hybride von den parenteralen, nicht fusionierten Zellen (insbesondere die nicht fusionierten Myelomzellen, die normalerweise damit fortfahren würden, sich unendlich zu teilen) durch Kultivieren in einem selektiven Medium. Das selektive Medium ist im allgemeinen eines, das ein Mittel enthält, das die de novo Synthese von Nukleotiden in den Gewebekulturmedien blockiert. Beispielhafte und bevorzugte Mittel sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de novo Synthese von sowohl Purinen und Pyrimidinen, wohingegen Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Wo Aminopterin oder Methotrexat verwendet werden, wird das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin als eine Quelle von Nukleotiden ergänzt (HAT Medium). Wo Azaserin verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin ergänzt.
Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. Nur Zellen, die in der Lage sind, Rettungs-Nucleotidsynthesewege zu betreiben, sind in der Lage, in HAT-Medium zu überleben. Den Myelomzellen fehlen Schlüsselenzyme des Rettungs-Synthesewegs, z.B. Hypoxanthinphosphoribosyl-Transferase (HPRT), und sie können nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Syntheseweg betreiben, jedoch weisen sie eine begrenzte Lebensdauer in Kultur auf und sterben im allgemeinen innerhalb zwei Wochen ab. Daher sind die einzigen Zellen, die in dem Selektionsmedium überleben können, diejenigen Hybride, die aus Myelom und B-Zellen gebildet wurden.
Dieses Kultivieren stellt eine Population von Hybridomen zur Verfügung, aus denen spezifische Hybridome ausgewählt werden. Typischerweise wird die Selektion von Hybridomen durch Kultivieren der Zellen durch Einzel-Klonverdünnung in Miktrotiterplatten durchgeführt von Testen der individuellen klonalen Überstände (über ungefähr zwei bis drei Wochen) auf die gewünschte Reaktivität. Der Test sollte sensitiv einfach und schnell sein, wie z.B. Radionimmunassays, Enzymimmunassays, cytotoxische Assays, Plaqueassays, Dotimmunbindungsassays und ähnliche.
Die ausgewählten Hybridome würden dann seriell verdünnt und in individuelle Antikörperproduzierende Zellinien kloniert, die Klone können dann unbegrenzt vermehrt werden, um MAbs zur Verfügung zu stellen. Die Zellinien können auf zwei grundsätzliche Wege für die MAb-Produktion ausgenutzt werden. Eine Probe des Hybridoms kann in ein histokompatibles Tier des Typs, das verwendet wurde, um die somatischen und Myelomzellen für die Ausgangsfusion zur Verfügung zu stellen injiziert werden (oft in die peritoneale Höhlung). Die injizierten Tiere entwickeln Tumore, die den spezifischen monoklonalen Antikörper, der durch das fusionierte Zellhybrid produziert wird, sekretieren. Die Körperflüssigkeiten des Tiers, wie z.B. Serum oder Bauchflüssigkeit können dann angezapft werden, um MAbs in hoher Konzentration zur Verfügung zu stellen. Die einzelnen Zellinien können auch in vitro kultiviert werden, wo die MAbs natürlich im Kulturmedium sekretiert werden, aus dem sie leicht in hohen Konzentrationen erhalten werden können. MAbs, die durch beide Mittel hergestellt wurden, können weiter gereinigt werden, falls gewünscht, unter der Verwendung von Filtration, Zentrifugation und verschiedenen chromatographischen Verfahren, wie z.B. HPLC oder Affinitätschromatographie.
Große Mengen der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch erhalten werden durch Multiplizieren von Hybridomzellen in vitro. Zellklone werden in Säugetiere injiziert, die mit den Ausgangszellen histokompatibel sind, z.B. syngeneische Mäuse, um das Wachstum von Antikörper-produzierenden Tumoren zu verursachen. Gegebenenfalls werden die Tiere mit einem Kohlenwasserstoff, insbesondere Ölen, wie z.B. Pristan (Tetramethylpentadekan), vor der Injektion geprimed.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können Fragmente des monoklonalen Antikörpers der Erfindung von dem wie oben beschrieben hergestellten monoklonalen Antikörper erhalten werden, durch Verfahren, die eine Verdauung mit Enzymen, wie z.B. Pepsin oder Papain und/oder die Spaltung von Disulfid durch chemische Reduktion einschließen. Alternativ können monoklonale Antikörper Fragmente, die durch die vorliegenden Erfindung umfaßt sind, unter der Verwendung eines automatischen Peptidsynthesizers synthetisiert werden.
Die monoklonalen Konjugate der vorliegenden Erfindung werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren präpariert, z.B. durch Reagieren eines wie oben präparierten monoklonalen Antikörpers mit, z.B., einem Enzym in der Anwesenheit eines Kopplungsmittels, z.B. Glutaraldehyd oder Periodat. Konjugate mit Fluoriszeinmarkern werden in Anwesenheit dieser Kopplungsmittel oder durch Reaktion mit einem Isothiocyanat präpariert. Konjugate mit Metallchelatoren werden ähnlich hergestellt. Andere Gruppen an die Antikörper konjugiert werden können, schließen Radionuklide wie z.B: ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶Cl, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu und ^99mTc ein. Radioaktiv markierte monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung werden gemäß gut bekannten Verfahren im Stand der Technik produziert. Z.B. können monoklonale Antikörper durch Kontakt mit Natrium oder Kaliumjodit und einem chemischen oxidierenden Mittel, wie z.B. Natriumhypochlorit oder einem enzymatischen oxidierenden Mittel, wie z.B. Laktoperoxidase jodiniert werden. Monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung können mit Technetium-⁹⁹ durch Liganden-Austauschprozess markiert werden, z.B. durch Reduzieren von Pertechnat mit zinnhaltiger Lösung, Chelatieren des reduzierten Technetium auf eine Sephadexsäule und Aufbringen des Antikörpers auf diese Säule oder durch direkte Markierungstechniken, z.B. durch Inkubieren von Pertechnat, einem Reduktionsmittel, wie z.B. SNCl₂, einer Pufferlösung, wie z.B. Natrium-Calium-Phthalat-Lösung und dem Antikörper.
Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass monoklonale oder polyklonale Antikörper, die spezifische Proteine sind, die bevorzugterweise in metastatischen oder nicht-metastatischen menschlichen Prostatakrebs exprimiert werden, Brauchbarkeiten in mehreren Typen von Anwendungen aufweisen werden. Diese können die Produktion von diagnostischen Kits zur Verwendung im Nachweis oder der Diagnose von menschlichem Prostatakrebs einschließen. Eine alternative Verwendung wäre es, solche Antikörper an therapeutische Mittel zu koppeln, wie z.B. chemotherapeutische Mittel, gefolgt durch Verabreichung an Individuen mit Prostatakrebs, wodurch auf den Prostatakrebs selektiv zur Zerstörung abgezielt wird. Der Fachmann wird realisieren, dass solche Verwendungen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung sind.
4.4 Immunnachweistests
4.4.1 Immunnachweisverfahren
In noch weiteren Verfahren betrifft die vorliegende Erfindung Immunnachweisverfahren zur Bindung, Reinigung, Entfernung, Quantifizierung oder dem andererseits allgemeinen Nachweis von biologischen Komponenten. Die codierten Proteine oder Peptide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden um Antikörper nachzuweisen, die mit Ihnen eine Reaktivität zeigen oder, alternativ, können Antikörper die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung präpariert wurden verwendet werden, um die codierten Proteine oder Peptide nachzuweisen. Die Schritte von verschiedenen brauchbaren Immunnachweisverfahren wurden in der wissenschaftlichen Literatur, wie z.B. Nakamura et al (1987), beschrieben.
Im allgemeinen schließen die immunbindenden Verfahren das Erhalten einer Probe, von der vermutet wird, dass sie ein Proteinpeptid oder in Antikörper enthält ein, und Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper oder Protein oder Peptid in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wie der Fall auch sein mag, unter Bedingungen, die effektiv sind, um die Bildung von Immunkomplexen zu ermöglichen.
Die immunbindenden Verfahren schließen Verfahren zum Nachweis oder der Quantifizierung der Mängel einer reaktiven Komponente in einer Probe ein, wobei die Verfahren den Nachweis über die Quantifizierung von jeglichen Immunkomplexen erfordern, die während des Bindeprozesses gebildet wurden. Hier würde man eine Probe erhalten, von der vermutet wird, dass sie eine prostataspezifisches Proteinpeptid oder einen entsprechenden Antikörper enthält und die Probe mit einem Antikörper oder codierten Protein oder Peptid, wie der Fall auch sein mag, kontaktieren und dann die Mängel von unter den spezifischen Bedingungen gebildeten Immunkomplexen nachweisen oder quantifizieren.
Im Hinblick auf den Antigen-Nachweis kann die biologische Probe, die analysiert wird, jede Probe sein, von der vermutet wird, daß sie ein Prostatakrebs-spezifisches Antigen enthält, wie z.B. ein Prostata- oder Lymphknotengewebeschnitt oder -probe, ein homogenisierter Gewebeextrakt, eine isolierte Zelle, eine Zellmembranpräparation, abgetrennte oder gereinigte Formen von jedem der oben genannten Protein-enthaltenen Zusammensetzungen oder sogar jede biologische Flüssigkeit, die in Kontakt mit Prostatageweben kommt, einschließlich Blut oder lymphatischer Flüssigkeit.
In-Kontakt-Bringen der ausgewählten biologischen Probe mit dem Protein, Peptid oder Antikörper unter Bedingungen, die effektiv sind und für eine Zeitdauer, die ausreichende ist, um die Bildung von Immunkomplexen (primären Immunkomplexen) zu ermöglichen, ist im allgemeinen eine Sache des einfachen Hinzufügen der Zusammensetzung zu der Probe, und Inkubieren des Gemisches für eine Zeitdauer, die lang genug ist, damit die Antikörper Immunkomplexe bilden, d.h. an jegliche vorhandene Antigene binden. Nach dieser Zeit wird die Proben-Antikörperzusammensetzung, wie z.B. ein Gewebeschnitt, ELISA-Platte, Dot Blot oder Western Blot im allgemeinen gewaschen werden, um jegliche nicht-spezifisch gebundene Antikörperspezies zu entfernen, was es nur den Antikörpern ermöglicht nachgewiesen zu werden, die spezifisch innerhalb der primären Immunkomplexe gebunden sind.
Im allgemeinen ist der Nachweis von Immunkomplexbildung im Stand der Technik gut bekannt und kann durch die Anwendung von verschiedenen Ansätzen erreicht werden. Diese Verfahren basieren allgemein auf dem Nachweis eines Markers oder Markierung, wie z.B. jeglichem radioaktiven, fluoreszenten, biologischen oder enzymatischen Marker oder Markierung, der im Stand der Technik standardmäßig verwendet wird. US-Patente, die die Verwendung von solchen Markern betreffen, schließen 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,149 ein. Natürlich kann man weitere Vorteile durch die Verwendung eines sekundären bindenden Liganden, wie z.B. eines zweiten Antikörpers oder einer Biotin/Avidin-Ligandenbindungsanordnung finden, wie es im Stand der Technik bekannt ist.
Das codierte Protein, Peptid oder der entsprechende Antikörper, der in dem Nachweis verwendet wird, kann selber an einen nachweisbaren Marker gekoppelt sein, wobei man dann einfach diesen Marker nachweisen würde, wodurch ermöglicht wird, die Menge der primären Immunkomplexe in der Zusammensetzung zu bestimmen.
Alternativ kann die erste hinzugefügte Komponente, die innerhalb der primären Immunkomplexe gebunden wird, mittels eines zweiten Bindungsliganden nachgewiesen werden, der eine Bindungsaffinität für das kodierte Proteinpeptid oder den entsprechenden Antikörper aufweist. In diesen Fällen kann der zweite Bindungsligand an einen nachweisbaren Marker gekoppelt sein. Der zweite Bindungsligand ist selber oft ein Antikörper, der daher als ein „sekundärer" Antikörper bezeichnet wird. Die primären Immunkomplexe werden mit dem markierten sekundären Bindungsliganden oder Antikörper unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die effektiv sind, und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um die Bildung von sekundären Immunkomplexen zu ermöglichen. Die sekundären Immunkomplexe werden dann im allgemeinen gewaschen, um jegliche nicht-spezifisch gebundenen sekundären Antikörper oder Liganden zu entfernen, und der verbleibende Marker in den sekundären Immunkomplexen wird dann nachgewiesen.
Weitere Verfahren schließend den Nachweis von primären Immunkomplexen durch einen Zweischritt-Ansatz ein. Ein zweiter Bindungsligand, wie z. B.: ein Antikörper, der eine Bindungsaffinität für das kodierte Protein, Peptid oder den entsprechenden Antikörper aufweist, wird dazu verwendet, um sekundäre Immunkomplexe, wie oben beschrieben, zu bilden. Nach Waschen werden die sekundären Immunkomplexe mit einem dritten Bindungsliganden oder Antikörper in Kontakt gebracht, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper aufweist, nochmals unter Bedingungen die effektiv sind und für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um die Bildung von Immunkomplexen zu ermöglichen (tertiäre Immunkomplexe). Der dritte Ligand oder Antikörper ist an einen nachweisbaren Marker gekoppelt, was den Nachweis der tertiären Immunkomplexe ermöglicht, die so gebildet wurden. Das System kann eine Signalverstärkung zur Verfügung stellen, falls dies gewünscht wird.
Die Immunnachweisverfahren der vorliegenden Erfindung weisen eine ersichtliche Brauchbarkeit in der Diagnose von Zuständen, wie z.B. Prostatakrebs, auf. Hier wird eine biologische oder klinische Probe verwendet, von der vermutet wird, dass sie entweder das codierte Protein oder Peptid oder entsprechende Antikörper enthält. Jedoch können diese Ausführungsformen auch Anwendungen in nicht-klinischen Proben aufweisen, wie z.B. im Titern von Antigen- oder Antikörperproben, bei der Selektion von Hybridomen, und ähnlichem.
In der klinischen Diagnose oder der Überwachung von Patienten mit Prostatakrebs ist der Nachweis eines Antigens, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 entspricht oder eine Erhöhung in dem Spiegel eines solchen Antigens, im Vergleich zu den Spiegeln in einer entsprechenden biologischen Probe aus einem normalen Subjekt indikativ für einen Patienten mit Prostatakrebs. Die Basis für solche diagnostische Verfahren liegt teilweise in dem Ergebnis begründet, dass das neue Prostataspezifische Gen, das in der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, in Prostatakrebs-Gewebeproben überexprimiert ist (siehe Beispiele unten). Durch weiteren Schluss kann angenommen werden, dass das Gen erhöhte Spiegel von kodierte/n Protein(en) produziert, die als Prostatakrebsmarker verwendet werden können.
Der Fachmann ist mit der Unterscheidung zwischen signifikanter Expression eines Prostataspezifischen Gens, was eine positive Identifizierung darstellt, und einer Expression des selben Gens in einem niedrigen Ausmaß oder Hintergrund-Expression sehr gut vertraut. In der Tat werden Hintergrundexpressionsspiegel oft verwendet, um einen „cut-off" zu bilden, oberhalb dessen eine erhöhte Färbung als signifikant oder positiv bewertet werden wird. Signifikante Expression kann durch hohe Spiegel an Antigenen in Geweben oder innerhalb von Körperflüssigkeiten dargestellt sein, oder, alternativ, durch einen hohen Anteil an Zellen aus einem Gewebe, die jede ein positives Signal geben.
4.4.2 Immunhistochemie
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in Verbindung mit frisch-gefrorenen und Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebeblöcken verwendet werden, die durch Immunhistochemie (IHC) präpariert wurden. Jedes im Stand der Technik gut bekannte IHC-Verfahren kann verwendet werden, wie zum Beispiel diejenigen beschrieben in Diagnostic Immunopathology, 2nd edition. edited by, Robert B. Colvin, Atul K. Bhan and Robert T. Mc-Cluskey. Raven Press, New York., 1995, und insbesondere Kapitel 31 dieser Referenz mit dem Titel Gynecological and Genitourinary Tumors (Seiten 579–597), von Debra A. Bell, Robert H. Young und Robert E. Scully und die darin zitierten Referenzen.
4.4.3 ELISA
Wie angegeben ist es vorgesehen, dass die kodierten Proteine oder Peptide der Erfindung eine Brauchbarkeit als Immunogene finden werden, z.B. in Verbindung mit der Impfstoffentwicklung, in der Immunhistochemie und in ELISA-Assays. Eine ersichtliche Brauchbarkeit der kodierten Antigene und entsprechenden Antikörper ist in Immunassays zum Nachweis von Prostatakrebs-spezifischen Proteinen, wie in der Diagnose und der prognostischen Überwachung erforderlich.
Immunassays, in ihrer einfachsten und direkten Bedeutung, sind Bindungsassays. Bestimmte bevorzugte Immunassays sind die verschiedenen Typen von Enzym-gekoppelten Immunsorbent-Assays (ELISAs) und Radioimmunassays (RIA), die im Stand der Technik bekannt sind. Der immunhistochemische Nachweis unter der Verwendung von Gewebeschnitten ist auch besonders brauchbar. Jedoch wird es leicht ersichtlich sein, dass der Nachweis nicht auf solche Techniken begrenzt ist und Western Blot, Dot Blot, FACS-Analysen und Ähnliche auch verwendet werden können.
In einem beispielhaften ELISA werden Antikörper, die an die kodierten Proteine der Erfindung binden, auf eine ausgewählte Oberfläche immobilisiert, die Proteinaffinität aufweist, wie zum Beispiel ein Well in einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Dann wird eine Testzusammensetzung, von der vermutet wird, dass sie das Prostatakrebsmarker-Antigen enthält, wie zum Beispiel eine klinische Probe, zu den Wells hinzugefügt. Nach Binden und Waschen, um nicht-spezifisch gebundene Immunkomplexe zu entfernen, kann das gebundene Antigen nachgewiesen werden. Der Nachweis wird im Allgemeinen durch die Hinzufügung eines zweiten Antikörpers erreicht, der für das Zielprotein spezifisch ist, der an einen nachweisbaren Marker gekoppelt ist. Dieser Typ von ELISA ist ein einfacher „Sandwich-ELISA". Der Nachweis kann auch durch die Hinzufügung eines zweiten Antikörpers erreicht werden, gefolgt durch die Hinzufügung eines dritten Antikörpers, der Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper aufweist, wobei der dritte Antikörper an einen nachweisbaren Marker gekoppelt ist.
In einem weiteren beispielhaften ELISA werden die Proben, von denen vermutet wird, dass sie das Prostatakrebsmarker-Antigen enthalten, auf die Well-Oberfläche immobilisiert und dann mit den Antikörpern der Erfindung in Kontakt gebracht. Nach Binden und Waschen, um nicht-spezifisch gebundene Immunkomplexe zu entfernen, wird das gebundene Antigen nachgewiesen. Wo die anfänglichen Antikörper an einen nachweisbaren Marker gekoppelt sind, können die Immunkomplexe direkt nachgewiesen werden. Wiederum können die Immunkomplexe unter der Verwendung eines zweiten Antikörpers nachgewiesen werden, der eine Bindungsaffinität für den ersten Antikörper aufweist, wobei der zweite Antikörper an einen nachweisbaren Marker gebunden ist.
Ein weiterer ELISA, in dem die Proteine oder Peptide immobilisiert werden, schließt die Verwendung von Antikörper-Kompetition im Nachweis ein. In diesem ELISA werden markierte Antikörper zu den Wells hinzugefügt, es ihnen ermöglicht, an das Prostatakrebs-Markerprotein zu binden, und mittels ihres Markers nachgewiesen. Die Menge von Markerantigen in einer unbekannten Probe wird dann durch Mischen der Probe mit den markierten Antikörpern vor oder während der Inkubation mit beschichteten Wells bestimmt. Die Anwesenheit von Markerantigen in der Probe wirkt, um die Menge von Antikörper zu reduzieren, die zur Bindung an den Well erhältlich ist und verringert daher das letztendliche Signal. Dies ist zum Nachweis von Antikörpern in einer unbekannten Probe geeignet, wo die nicht markierten Antikörper an die Antigen-beschichteten Wells binden und verringert auch die Menge von Antigen, das erhältlich ist, um die markierten Antikörper zu binden.
Unabhängig von dem verwendeten Format haben ELISAs bestimmte Merkmale gemein, wie zum Beispiel Beschichten, Inkubieren oder Binden, Waschen, um nicht-spezifisch gebundene Spezies zu entfernen und Nachweisen der gebundenen Immunkomplexe. Diese werden wie folgt beschrieben:
Beim Beschichten einer Platte mit entweder Antigen oder Antikörper wird man im Allgemeinen die Wells der Platte mit einer Lösung des Antigens oder Antikörpers inkubieren, entweder über Nacht oder für eine angegebene Dauer von Stunden. Die Wells der Platte werden dann gewaschen werden, um unvollständig adsorbiertes Material zu entfernen. Jegliche verbleibenden erhältlichen Oberflächen der Wells werden dann mit einem nicht-spezifischen Protein „beschichtet", das im Hinblick auf die Test-Antiseren antigenisch neutral ist. Dies schließt Rinderserumalbumin (BSA), Kasein und Lösungen von Milchpulver ein. Die Beschichtung ermöglicht ein Blockieren von nicht-spezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und verringert daher den durch nicht-spezifische Bindung von Antiseren auf die Oberfläche verursachten Hintergrund.
In ELISAs ist es wahrscheinlich verbreiteter, ein sekundäres oder tertiäres Nachweismittel, anders als ein direktes Verfahren, anzuwenden. Daher wird nach Bindung eines Proteins oder Antikörpers an den Well, Beschichten mit nicht-reaktivem Material, um Hintergrund zu verringern, und Waschen, um nicht-gebundenes Material zu entfernen, die immobilisierende Oberfläche mit der Kontroll-menschlichen Prostatakrebs- und/oder klinischen oder biologischen Probe, die getestet werden soll, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die dabei effektiv sind, um eine Immunkomplex-(Antigen/Antikörper)-Bildung zu ermöglichen. Der Nachweis des Immunkomplexes erfordert dann einen markierten sekundären Bindungsliganden oder Antikörper oder einen sekundären Bindungsliganden oder Antikörper in Konjunktion mit einem markierten tertiären Antikörper oder dritten Bindungsliganden.
„Unter Bedingungen, die effektiv sind, um die Immunkomplex-(Antigen/Antikörper)-Bildung zu ermöglichen" bedeutet, dass die Bedingungen bevorzugterweise ein Verdünnen der Antigene oder Antikörper mit Lösungen, wie zum Beispiel BSA, Rindergammaglobulin (BGG) und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)/Tween einschließen. Diese hinzugefügten Mittel neigen auch dazu, bei der Verringerung von nicht-spezifischem Hintergrund zu helfen.
Die „geeigneten" Bedingungen bedeuten auch, dass die Inkubation bei Raumtemperatur und für eine Zeitdauer stattfindet, die ausreichend ist, um eine effektive Bindung zu ermöglichen. Inkubationsschritte sind typischerweise von ungefähr 1 bis 2 bis 4 Stunden, bei Temperaturen bevorzugterweise im Bereich von 25° bis 27°C oder können über Nacht bei ungefähr 4°C oder so sein.
Im Anschluss an alle Inkubationsschritte in einem ELISA wird die kontaktierte Oberfläche gewaschen, um nicht-komplexiertes Material zu entfernen. Ein bevorzugtes Waschverfahren schließt das Waschen mit einer Lösung, zum Beispiel PBS/Tween oder Boratpuffer ein. Im Anschluss an die Bildung von spezifischen Immunkomplexen zwischen der Testprobe und dem ursprünglich gebundenen Material und anschließendem Waschen kann das Auftreten von sogar kleinen Mengen von Immunkomplexen bestimmt werden.
Um eine Nachweismittel zur Verfügung zu stellen, wird der zweite oder dritte Antikörper einen damit assoziierten Marker aufweisen, um den Nachweis zu ermöglichen. Bevorzugterweise wird dies ein Enzym sein, das eine Farbentwicklung nach Inkubieren mit einem geeigneten chromogenen Substrat erzeugen wird. Daher wird man zum Beispiel wünschen, den ersten oder zweiten Immunkomplex mit einer Urease, Glukoseoxidase, alkalischen Phosphatase oder Wasserstoffperoxid-konjugiertem Antikörper für eine Zeitdauer und unter Bedingungen in Kontakt zu bringen und zu inkubieren, die die Entwicklung von weiterer Immunkomplexbildung bevorzugen (z.B. Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer PBS-enthaltenden Lösung, wie zum Beispiel PBS-Tween).
Nach Inkubation mit markiertem Antikörper und im Anschluss an das Waschen, um nichtgebundenes Material zu entfernen, wird die Menge an Label quantifiziert, z.B. durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat, wie zum Beispiel Harnstoff und Bromcresol-Violett oder 2,2'-Azido-Di-(3-Ethyl-Benzthiazolin-6-Sulfonsäure [ABTS] und H₂O₂, im Fall von Peroxidase als dem Enzymmarker. Die Quantifizierung wird dann durch Messen des Ausmaßes an Farberzeugung, z.B. unter der Verwendung eines sichtbaren Spektrum-Spektrophotometers erreicht.
4.4.4 Verwendung von Antikörpern für Radio-Bildgebung
Die Antikörper dieser Erfindung werden dazu verwendet werden, die Expression der kodierten Markerproteine zu quantifizieren und zu lokalisieren. Die Antikörper werden zum Beispiel durch eines einer Vielzahl von Verfahren markiert werden und dazu verwendet, die lokalisierte Konzentration von Zellen, die das kodierte Protein herstellen, sichtbar zu machen.
Die Erfindung betrifft auch ein in vivo-Verfahren zur Darstellung eines pathologischen Prostatakrebszustands unter der Verwendung der oben beschriebenen monoklonalen Antikörper. Spezifisch schließt dieses Verfahren ein Verabreichen an ein Subjekt einer Bildgebungseffektiven Menge eines nachweisbar markierten Prostatakrebs-spezifischen monoklonalen Antikörpers oder Fragments davon und einem pharmazeutisch effektiven Träger ein, und Nachweisen der Bindung des markierten monoklonalen Antikörpers an das erkrankte Gewe be. Der Ausdruck „in vivo-Bildgebung" betrifft jedes Verfahren, das den Nachweis eines markierten monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung oder Fragments davon erlaubt, das spezifisch an ein erkranktes Gewebe bindet, das im Körper des Subjekts lokalisiert ist. Ein „Subjekt" ist ein Säuger, bevorzugterweise ein Mensch. Eine „Bildgebungseffektive Menge" bedeutet, dass die Menge von nachweisbar markiertem monoklonalen Antikörper oder Fragment davon, die verabreicht wird, ausreichend ist, um den Nachweis der Bindung des monoklonalen Antikörpers oder Fragments davon an das erkrankte Gewebe zu ermöglichen.
Ein Faktor, der bei der Auswahl eines Radionuklids für die in vivo-Diagnose zu berücksichtigen ist, ist, dass die Halbwertszeit eines Nuklids lang genug ist, so dass es immer noch zum Zeitpunkt der maximalen Aufnahme durch das Ziel nachzuweisen ist, jedoch kurz genug, so dass die schädliche Bestrahlung des Wirts sowie der Hintergrund minimiert wird. Idealerweise wird einem Radionuklid, das für die in vivo-Bildgebung verwendet wird, eine Partikelemission fehlen, jedoch eine große Zahl an Photonen in einem 140–2000 keV-Bereich produzieren, die leicht durch herkömmliche Gamma-Kameras nachgewiesen werden können.
Ein Radionuklid kann an einen Antikörper entweder direkt oder indirekt unter der Verwendung einer dazwischen liegenden funktionellen Gruppe gebunden werden. Dazwischen liegende funktionelle Gruppen, die oft verwendet werden, um Radioisotope zu binden, die als Metallionen vorliegen, an Antikörper, sind Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Beispiele von Metallionen, die zur Verwendung in dieser Erfindung brauchbar sind, sind ^99mTc, ¹²³I, ¹³¹I, ¹¹¹In, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ¹²⁵I, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr und ²⁰¹Tl.
In Übereinstimmung mit dieser Erfindung kann der monoklonale Antikörper oder Fragment davon durch jede verschiedener Techniken markiert werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch paramagnetische Isotope für Zwecke des in vivo-Nachweises verwenden. Besonders brauchbare Elemente in der Magnetischen Resonanz-Bildgebung („MRI") schließen ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr und ⁵⁶Fe ein.
Die Verabreichung des markierten Antikörpers kann lokal oder systemisch sein und intravenös, intra-arteriell, über die spinale Flüssigkeit oder Ähnliches erreicht werden. Die Verabreichung kann auch intradermal oder intrakavitär sein, in Abhängigkeit von der zu untersuchen den Körperstelle. Nachdem eine ausreichende Zeit verstrichen ist, damit der monoklonale Antikörper oder Fragment davon mit dem erkrankten Gewebe binden kann, zum Beispiel 30 Minuten bis 48 Stunden, kann der Bereich des Subjekts, der untersucht wird, durch Routinebildgebende Verfahren, wie zum Beispiel MRI, SPECT; planare Szintillations-Bildgebung und aufkommende Bildgebungstechniken auch untersucht werden. Das genaue Protokoll wird erforderlicher weise variieren, in Abhängigkeit von wie oben angegeben Faktoren, die für den Patienten spezifisch sind, und abhängig von der zu untersuchenden Körperstelle, dem Verfahren der Verabreichung und dem Typ von verwendetem Marker; die Bestimmung von bestimmten Verfahren wäre Routine für den Fachmann. Die Verteilung des gebundenen radioaktiven Isotops und seine Zunahme oder Abnahme mit der Zeit wird dann überwacht und aufgezeichnet. Durch Vergleichen der Ergebnisse mit Daten, die aus Studien mit klinisch normalen Individuen erhalten wurden, kann die Anwesenheit und das Ausmaß des erkrankten Gewebes bestimmt werden.
Es wird dem Fachmann ersichtlich sein, dass ein ähnlicher Ansatz verwendet werden kann, um die Herstellung des kodierten Prostatakrebsmarkerproteins in menschlichen Patienten Radio-Bildgebungs-aufzuzeichnen. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die in vivo-Diagnose von Prostatakrebs in einem Patienten zur Verfügung. Solche Verfahren umfassen im Allgemeinen die Verabreichung einer effektiven Menge eines Prostatakrebs-spezifischen Antikörpers an einen Patienten, wobei der Antikörper an einen Marker konjugiert ist, wie zum Beispiel ein radioaktives Isotop oder ein Spin-markiertes Molekül, das durch nicht-invasive Verfahren nachweisbar ist. Dem Antikörper-Marker-Konjugat wird es für eine ausreichende Zeit ermöglicht, in Kontakt mit reaktiven Antigenen zu kommen, die innerhalb der Gewebe des Patienten vorhanden sind, und der Patient wird dann einer Nachweis-Vorrichtung gegenüber ausgesetzt, um den nachweisbaren Marker zu identifizieren.
4.4.5 Kits
In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Immun-Nachweiskits zur Verwendung mit den oben beschriebenen Immunnachweisverfahren. Da die kodierten Proteine und Peptide verwendet werden können, um Antikörper nachzuweisen, und die entsprechenden Antikörper verwendet werden können, um kodierte Proteine oder Peptide nachzuweisen, können jedes oder beide dieser Komponenten in einem Kit zur Verfügung gestellt werden. Die Immun-Nachweiskits werden daher in geeigneten Behältermitteln ein kodiertes Protein oder Peptid oder einen ersten Antikörper umfassen, der an ein kodiertes Protein oder Peptid bindet und ein Immunnachweisreagenz.
In bestimmten Ausführungsformen kann das kodierte Protein oder Peptid oder der erste Antikörper, der an das kodierte Protein oder Peptid bindet, an einen festen Träger gebunden sein, wie zum Beispiel eine Säulenmatrix oder Well einer Mikrotiterplatte.
Die Immunnachweisreagenzien des Kits können jegliche einer Auswahl von Formen annehmen, einschließlich denjenigen nachweisbaren Markern, die mit dem gegebenen Antikörper oder Antigen assoziiert sind oder gekoppelt sind, und nachweisbare Marker, die mit einem sekundären Bindungsliganden assoziiert sind oder daran angebracht sind. Beispielhafte sekundäre Liganden sind diejenigen sekundären Antikörper, die eine Bindungsaffinität für den ersten Antikörper oder das Antigen aufweisen und sekundäre Antikörper, die eine Bindungsaffinität für einen menschlichen Antikörper aufweisen.
Weitere geeignete Immunnachweisreagenzien zur Verwendung in den vorliegenden Kits schließen das Zwei-Komponenten-Reagens ein, das einen sekundären Antikörper umfaßt, der eine Bindungsaffinität für den ersten Antikörper oder Antigen aufweist, zusammen mit einem dritten Antikörper, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper aufweist, wobei der dritte Antikörper mit einem nachweisbaren Marker verbunden ist.
Die Kits können weiterhin eine geeignet aliquotierte Zusammensetzung des kodierten Proteins oder Polypeptidantigens umfassen, ob markiert oder nicht markiert, die dazu verwendet werden können, um eine Standardkurve für einen Nachweistest herzustellen.
Die Kits können Antikörper-Markerkonjugate entweder in voll konjugierter Form, in der Form von Intermediaten oder als getrennte Gruppen, die durch den Verwender des Kits konjugiert werden müssen, enthalten. Die Komponenten des Kits können entweder in wässrigen Medien oder in lyophilisierter Form verpackt vorliegen.
Die Behältermittel der Kits werden im Allgemeinen mindestens ein Gefäß, Teströhrchen, Fläschchen, Flasche, Spritze oder andere Behältermittel einschließen, in die der Antikörper oder das Antigen platziert werden können und, bevorzugterweise, geeignet aliquotiert sein. Wo ein zweiter oder dritter Bindungsligand oder zusätzliche Komponenten zur Verfügung gestellt werden wird das Kit auch allgemein einen zweiten, dritten oder anderen zusätzlichen Behälter enthalten, in den dieser Ligand oder Komponente platziert werden können. Die Kits der vorliegenden Erfindung werden typischerweise auch ein Mittel zum Enthalten des Antikörpers, des Antigens und jegliche andere Reagenzienbehälter in enger Verpackung für den kommerziellen Verkauf einschließen. Solche Behälter können injektions- oder Blas-geformte Plastikbehälter einschließen, in die die gewünschten Gefäße verpackt werden.
4.5 Nachweis und Quantifizierung von RNA-Spezies
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Identifizierung von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe durch Amplifizieren und Nachweisen von Nukleinsäuren, die dem hier berichteten neuen Prostata-spezifischen Gen (UC41) entsprechen. Die biologische Probe kann jegliches Gewebe oder Flüssigkeit sein, in dem Prostatakrebszellen vorhanden sein können. Verschiedene Ausführungsformen schließen radikale Prostataektomie-Proben, pathologische Proben, Knochenmarksaspirat, Knochenmarksbiopsie, Lymphknotenaspirat, Lymphknotenbiopsie, Milzgewebe, feines Nadelaspirat, Hautbiopsie oder Organgewebebiopsie ein. Andere Ausführungsformen schließen Proben ein, wobei die Körperflüssigkeit peripheres Blut, Serum, Plasma, Lymphflüssigkeit, Ascites, seröse Flüssigkeit, pleurale Effusion, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Stuhl, Prostataflüssigkeit oder Urin ist.
Die als ein Templat für die Amplifikation verwendete Nukleinsäure wird aus Zellen, die in der biologischen Probe enthalten sind, gemäß Standardverfahren isoliert (Sambrook et al., 1989). Die Nukleinsäure kann genomische DNA oder fraktionierte oder gesamte Zell-RNA sein. Wenn RNA verwendet wird, kann es wünschenswert sein, die RNA in eine komplementäre cDNA umzuwandeln. In einer Ausführungsform ist die RNA Gesamtzell-RNA und wird direkt als das Templat für die Amplifikation verwendet.
Paare von Primern, die selektiv an Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 hybridisieren, werden mit der isolierten Nukleinsäure unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine selektive Hybridisierung ermöglichen. Sobald hybridisiert, wird der Nukleinsäure:Primerkomplex mit einem oder mehreren Enzymen in Kontakt gebracht, die die Templat-abhängige Nukleinsäuresynthese erleichtern. Multiple Runden an Amplifikation, auch als „Zyklen" bezeichnet, werden durchgeführt, bis eine ausreichende Menge von Amplifikationsprodukt hergestellt wurde.
Als nächstes wird das Amplifikationsprodukt nachgewiesen. In bestimmten Anwendungen kann der Nachweis durch visuelle Mittel durchgeführt werden. Alternativ kann der Nachweis eine indirekte Identifizierung des Produkts über Chemilumineszenz, radioaktive Scintigraphie von inkorporiertem Radiomarker oder fluoreszentem Marker oder sogar über ein System einschließen, unter der Verwendung von elektrischen oder thermischen Impulssignalen (Affymax Technologie; Bellus, 1994).
Im Anschluss an den Nachweis kann man die in einem bestimmten Patienten gesehenen Ergebnisse mit einer statistisch signifikanten Referenzgruppe von normalen Patienten und Prostatakrebspatienten vergleichen. Auf diese Weise ist es möglich, die Menge von in verschiedenen klinischen Zuständen nachgewiesener Nukleinsäure zu korrelieren.
4.5.1 Primer
Der Ausdruck Primer, wie hier definiert, ist als jegliche Nukleinsäure umfassend gedacht, die in der Lage ist, die Synthese einer anschließenden Nukleinsäure in einem Templatabhängigen Prozess zu primen. Typischerweise sind Primer Oligonukleotide mit 10 bis 20 Basenpaaren Länge, jedoch können längere Sequenzen verwendet werden. Primer können in doppelsträngiger oder einzelsträngiger Form zur Verfügung gestellt werden, obwohl die einzelsträngige Form bevorzugt ist.
4.5.2 Templat-abhängige Amplifikationsverfahren
Eine Zahl von Templat-abhängigen Prozessen sind erhältlich, um die in einer bestimmten Templatprobe vorhandenen Nukleinsäuresequenzen zu amplifizieren. Eines der am besten bekannten Amplifikationsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (bezeichnet als PCR^TM), die genau in U.S.-Patenten Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 und in Innis et al., 1990, beschrieben ist.
Kurz werden in der PCR^TM zwei Primersequenzen präpariert, die komplementär für Regionen auf gegenüberliegenden komplementären Strängen der Zielnukleinsäuresequenz sind. Ein Überschuss an Desoxynukleosid-Triphosphaten wird zu einem Reaktionsgemisch zusammen mit einer DNA-Polymerase, z.B. Taq-Polymerase, hinzugefügt. Wenn die Zielnukleinsäuresequenz in einer Probe vorhanden ist, werden die Primer an die Zielnukleinsäure binden und die Polymerase wird bewirken, dass die Primer entlang der Zielnukleinsäuresequenz durch die Hinzufügung von Nukleotiden verlängert wird. Durch Anheben und Verringern der Temperatur des Reaktionsgemisches werden die verlängerten Primer von der Zielnukleinsäure dissoziieren, um Reaktionsprodukte zu bilden, überschüssige Primer werden an die Zielnukleinsäure und die Reaktionsprodukte binden, und der Prozess wird wiederholt.
Ein reverse Transkriptase-PCR^TM-Amplifikationsverfahren kann durchgeführt werden, um die Menge von amplifizierter mRNA zu quantifizieren. Verfahren zur reversen Transkription von RNA in cDNA sind bekannt und in Sambrook et al., 1989 beschrieben. Alternative Verfahren für die reverse Transkription verwenden thermostabile DNA-Polymerasen. Diese Verfahren sind beschrieben in WO 90/07641, angemeldet am 21. Dezember 1990. Polymerase-Kettenreaktionsmethodologien sind im Stand der Technik gut bekannt.
Ein anderes Verfahren zur Amplifikation ist die Ligase-Kettenreaktion („LCR"), wie beschrieben in der Europäischen Anmeldung Nr. 320 308. Bei der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare präpariert und in der Anwesenheit einer Zielsequenz wird jedes Paar an gegenüberliegende komplementäre Stränge des Ziels binden, so dass sie aneinander angrenzen. In der Anwesenheit einer Ligase werden die beiden Sondenpaare verbunden, um eine einzige Einheit zu bilden. Durch Temperaturzyklisieren, wie bei der PCR^TM, dissoziieren gebundene ligierte Einheiten von dem Ziel und dienen dann als „Zielsequenzen" zur Ligation von überschüssigen Sondenpaaren. U.S.-Patent 4,883,750 beschreibt ein Verfahren ähnlich zu LCR zur Bildung von Sondenpaaren an eine Zielsequenz.
Qbeta-Replikase kann auch als noch ein anderes Amplifikationsverfahren in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In diesem Verfahren wird eine replikative Sequenz an RNA, die eine Region komplementär zu derjenigen eines Ziels aufweist, zu einer Probe in Anwesenheit einer RNA-Polymerase hinzugefügt. Die Polymerase wird die replikative Sequenz kopieren, die dann nachgewiesen werden kann.
Ein isothermales Amplifikationsverfahren, in dem Restriktionsendonukleasen und Ligasen verwendet werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen zu erreichen, die Nukleotid 5'- [α-thio]-Triphosphate in einem Strang einer Restriktionsstelle enthalten, kann auch bei der Amplifikation von Nukleinsäuren in der vorliegenden Erfindung brauchbar sein. Walker et al. (1992).
Strang-Verdrängungs-Amplifikation (SDA) ist ein anderes Verfahren zur Durchführung von isothermaler Amplifikation von Nukleinsäuren, die multiple Runden an Strangverdrängung und Synthese, d.h. Nick-Translation, einschließt. Ein ähnliches Verfahren, Reparatur-Kettenreaktion (RCR) genannt, schließt ein Annealing von mehreren Sonden über eine abgezielte Region hinweg zur Amplifikation ein, gefolgt von einer Reparaturreaktion, in der nur zwei der vier Basen vorhanden sind. Die anderen zwei Basen können als biotinylierte Derivate zum leichten Nachweis hinzugefügt werden. Ein ähnlicher Ansatz wird bei SDA verwendet. Ziel-spezifische Sequenzen können auch unter der Verwendung einer zyklischen Sondenreaktion (CPR) nachgewiesen werden. Bei der CPR wird eine Sonde, die 3'- und 5'-Sequenzen an nicht-spezifischer DNA und eine mittlere Sequenz von spezifischer RNA aufweist, an eine DNA hybridisiert, die in einer Probe vorhanden ist. Nach der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNase H behandelt und die Produkte der Sonde als unterscheidbare Produkte identifiziert, die nach der Verdauung freigesetzt wurden. Das Ausgangs-Templat wird an eine andere Zyklussonde annealed und die Reaktion wird wiederholt.
Noch andere Amplifikationsverfahren, beschrieben in GB-Anmeldung Nr. 2 202 328 können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In der zuerst genannten Anmeldung werden „modifizierte" Primer in einer PCR^TM-ähnlichen Templat- und Enzym-abhängigen Synthese verwendet. Die Primer können durch Markieren mit einer Fanggruppe (z.B. Biotin) und/oder einer Nachweisgruppe (z.B. Enzym) modifiziert werden. In der später genannten Anmeldung wird ein Überschuss von markierten Sonden zu einer Probe hinzugegeben. In der Anwesenheit einer Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach der Spaltung wird die Zielsequenz intakt freigesetzt, um durch überschüssige Sonde gebunden zu werden. Die Spaltung der markierten Sonde zeigt die Anwesenheit der Zielsequenz.
Andere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren schließen Transkriptions-basierte Amplifikationssysteme (TAS) ein, einschließlich der Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikation (NASBA) und 3SR. Kwoh et al. (1989); Gingeras et al., PCT-Anmeldung WO 88/10315. Bei NASBA können die Nukleinsäuren durch Standard-Phenol/Chloroform-Extraktion, Hitzede naturierung einer klinischen Probe, Behandlung mit Lysepuffer und Minispin-Säulen für die Isolierung von DNA und RNA oder Guanidiniumchlorid-Extraktion von RNA für die Amplifikation präpariert werden. Diese Amplifikationsverfahren schließen ein Anhybridisieren eines Primers ein, der Ziel-spezifische Sequenzen aufweist. Im Anschluss an die Polymerisierung werden DNA/RNA-Hybride mit RNase H verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle nochmals hitzedenaturiert werden. In jedem Fall wird die einzelsträngige DNA durch die Hinzufügung eines zweiten Ziel-spezifischen Primers, gefolgt von Polymerisation, vollständig doppelsträngig gemacht. Die doppelsträngigen DNA-Moleküle werden dann vervielfacht-transkribiert durch eine Polymerase, wie zum Beispiel T7 oder SP6. In einer isothermen zyklischen Reaktion werden die RNAs revers in doppelsträngige DNA transkribiert und nochmals mit einer Polymerase, wie zum Beispiel T7 oder SP6 transkribiert. Die sich ergebenden Produkte, ob verkürzt oder vollständig, zeigen Ziel-spezifische Sequenzen an.
Davey et al., Europäische Anmeldung Nr. 329 822 beschreiben ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, das ein zyklisches Synthetisieren von einzelsträngiger RNA („ssRNA"), ssDNA und doppelsträngiger DNA (dsDNA) einschließt, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die ssRNA ist ein erstes Templat für ein erstes Primer-Oligonukleotid, das durch reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird dann aus der sich ergebenden DNA:RNA-Duplex durch die Wirkung von Ribonuklease H (RNase H, eine RNase, die für RNA in Duplex mit entweder DNA oder RNA spezifisch ist) entfernt. Die sich ergebende ssDNA ist ein zweites Templat für einen zweiten Primer, der ebenfalls die Sequenzen eines RNA-Polymerase-Promotors (beispielsweise einer T7-RNA-Polymerase) 5' zu seiner Homologie zu dem Templat einschließt. Dieser Primer wird dann durch DNA-Polymerase (zum Beispiel durch das große „Klenow"-Fragment von E.coli-DNA-Polymerase I) verlängert, was zu einem doppelsträngigen DNA („dsDNA")-Molekül führt, das eine identische Sequenz zu der der Ausgangs-RNA zwischen den Primern aufweist und zusätzlich an einem Ende eine Promotorsequenz aufweist. Diese Promotorsequenz kann durch die geeignete RNA-Polymerase verwendet werden, um viele RNA-Kopien der DNA herzustellen. Diese Kopien können dann in den Zyklus wieder eintreten, was zu einer sehr raschen Amplifikation führt. Bei geeigneter Auswahl von Enzymen kann diese Amplifikation isothermal ohne die Hinzufügung von Enzymen zu jedem Zyklus durchgeführt werden. Aufgrund der zyklischen Natur dieses Verfahrens kann die Ausgangssequenz in der Form von entweder DNA oder RNA ausgewählt werden.
Miller et al., PCT-Anmeldung WO 89/06700, beschreiben ein Nukleinsäuresequenz-Amplifikationsschema, basierend auf der Hybridisierung einer Promotor/Primer-Sequenz an eine Ziel-einzelsträngige DNA („ssDNA"), gefolgt von Transkription von vielen RNA-Kopien der Sequenz. Dieses Schema ist nicht zyklisch, d.h. neue Template werden nicht aus den sich ergebenden RNA-Transkripten hergestellt. Andere Amplifikationsverfahren schließen „race" und „einseitige PCR^TM" ein. Frohman (1990) und Ohara et al. (1989).
Verfahren basierend auf Ligation von zwei (oder mehr) Oligonukleotiden in der Anwesenheit von Nukleinsäure, die die Sequenz des sich ergebenden „Di-Oligonucleotids" aufweist, wodurch das Di-Oligonukleotid amplifiziert wird, können auch im Amplifikationsschritt der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wu et al. (1989).
4.5.3 Trennverfahren
Im Anschluss an die Amplifikation kann es wünschenswert sein, das Amplifikationsprodukt von dem Templat und dem überschüssigen Primer für die Zwecke zur Bestimmung, ob spezifische Amplifikation aufgetreten ist, abzutrennen. In einer Ausführungsform werden die Amplifikationsprodukte durch Agarose-, Agarose-Acrylamid- oder Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter der Verwendung von Standardverfahren aufgetrennt. Siehe Sambrook et al., 1989.
Alternativ können chromatographische Techniken verwendet werden, um die Auftrennung zu bewirken. Es gibt viele Arten an Chromatographie, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Adsorption, Partition, Ionen-Austausch und Molekularsieb und viele spezialisierte Techniken zur Verwendung von diesen, einschließlich Säulen-, Papier-, Dünnschicht- und Gas-Chromatographie (Freifelder, 1982).
4.5.4 Identifikationsverfahren
Amplifikationsprodukte müssen sichtbar gemacht werden, um die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenzen zu bestätigen. Ein typisches Visualisierungsverfahren schließt die Färbung eines Gels mit Ethidiumbromid und die Sichtbarmachung unter UV-Licht ein. Alternativ, wenn die Amplifikationsprodukte integral mit Radio- oder fluorimetrisch-markierten Nu kleotiden markiert sind, können die Amplifikationsprodukte dann gegenüber Röntgenfilm ausgesetzt werden oder unter den geeigneten stimulierenden Spektren visualisiert werden, im Anschluss an die Auftrennung.
In einer Ausführungsform wird die Visualisierung indirekt erreicht. Im Anschluss an die Auftrennung der Amplifikationsprodukte wird eine markierte Nukleinsäuresonde in Kontakt mit der amplifizierten Zielnukleinsäuresequenz gebracht. Die Sonde ist bevorzugterweise an ein Chromophor konjugiert, kann jedoch auch ein Radiomarker sein. In einer anderen Ausführungsform ist die Probe an einen Bindepartner konjugiert, wie zum Beispiel einen Antikörper oder Biotin, wobei das andere Mitglied des Bindepaars eine nachweisbare Gruppe trägt.
In einer Ausführungsform findet der Nachweis durch Southern Blotting und Hybridisierung mit einer markierten Sonde statt. Die Techniken, die im Southern Blotting eingeschlossen sind, sind dem Fachmann gut bekannt und können in vielen Standardbüchern von molekularen Protokollen gefunden werden. Siehe Sambrook et al., 1989. Kurz, werden die Amplifikationsprodukte durch Gel-Elektrophorese getrennt. Das Gel wird dann mit einer Membran, wie zum Beispiel Nitrozellulose, in Kontakt gebracht, was den Transfer der Nukleinsäure und die nicht-kovalente Bindung ermöglicht. Anschließend wird die Membran mit einer Chromophorkonjugierten Sonde inkubiert, die in der Lage ist, mit einem Zielamplifikationsprodukt zu hybridisieren. Der Nachweis erfolgt durch Aussetzen der Membran gegenüber Röntgenfilm oder Ionen-emittierenden Nachweisvorrichtungen.
Ein Beispiel des Vorgenannten ist in U.S.-Patent Nr. 5,279,721 beschrieben, das eine Vorrichtung und Verfahren für automatisierte Elektrophorese und den Transfer von Nukleinsäuren beschreibt. Die Vorrichtung ermöglicht Elektrophorese und ein Blotten ohne externe Manipulation des Gels und ist ideal zur Durchführung von Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet.
4.5.5 Kit-Komponenten
Alle wesentlichen Materialien und Reagenzien, die zum Nachweis von UC41-Nukleinsäuren in einer biologischen Probe erforderlich sind, können in einem Kit zusammengefügt sein. Das Kit wird im Allgemeinen vorgewählte Primerpaare für Nukleinsäuren entsprechend zu SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, oder SEQ ID NO: 4 umfassen. Auch können Enzyme enthalten sein, die zum Nachweis von Nukleinsäuren geeignet sind, einschließlich verschiedenen Polymerasen (RT, Taq, usw.), Desoxynukleotide und Puffer, um das erforderliche Reaktionsgemisch für die Amplifikation zur Verfügung zu stellen. Bevorzugte Kits können auch zum Beispiel Primer für den Nachweis einer Kontroll-, nicht differentiell exprimierten RNA, wie zum Beispiel β-Aktin, umfassen.
Die Kits werden im Allgemeinen in geeigneten Mitteln getrennte Behälter für jedes einzelne Reagens Enzyme sowie für jedes Primerpaar umfassen. Bevorzugte Paare von Primern zur Amplifikation von Nukleinsäuren werden ausgewählt, um die Sequenzen, bezeichnet hier als SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 zu amplifizieren.
In bestimmten Ausführungsformen werden Kits Hybridisierungssonden umfassen, die so aufgebaut sind, um an eine Sequenz oder ein Komplement einer Sequenz, die hier als SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 bezeichnet wird, zu hybridisieren. Solche Kits werden im Allgemeinen, in geeigneten Mitteln zum engen Umschließen, getrennte Behälter für jedes individuelle Reagenz oder Enzym, sowie für jede Hybridisierungssonde umfassen.
4.6 Verwendung von RNA-Fingerprinting
RNA-Fingerprinting ist ein Mittel, durch das RNAs, die aus vielen verschiedenen Geweben, Zelltypen oder Behandlungsgruppen isoliert wurden, gemeinsam untersucht werden können, um RNAs zu identifizieren, deren relative Häufigkeiten variieren. Zwei Formen dieser Technologie wurden gleichzeitig 1992 als RNA-Fingerprinting durch differentielles Display (Liang and Pardee, 1992; Welsh et al., 1992) (siehe auch Liang and Pardee, U.S. Patent 5,262,311) beschrieben. Beide Techniken wurden in den unten beschriebenen Studien verwendet. Einige der hier beschriebenen Untersuchungen wurden ähnlich zu Donahue et al. 1994 durchgeführt.
Die Basistechnik von differentiellen Display wurde genau beschrieben (Liang and Pardee, 1992). Gesamtzell-RNA wird für die Erststrang-reverse Transkription mit einem Verankerungsprimer geprimed, der aus Oligo dT zusammengesetzt ist. Der Oligo dT Primer wird unter Verwendung einer reversen Transkriptase, z.B. Moloney Murine Leukemia Virua (MMLV) reverse Transkriptase, verlängert. Die Synthese des zweiten Stranges wir mit einem zufällig gewählten Oligonukleotid geprimed, bei verringerter Stringenzbedingungen verwen det werden. Sobald eine doppelsträngige cDNA synthetisiert wurde, fährt die Amplifikation durch Standard-PCR^TM-Techniken fort, wobei dieselben Primer verwendet werden. Der sich gegebene DNA-Fingerprint wird durch Elektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung oder Autoradiographie analysiert. Ein weiterer Vergleich von Fingerprints, die aus verschiedenen Zell-abgeleiteten RNAs unter Verwendung derselben Oligonukleotidprimer erhalten wurden, identifizieren mRNAs, die unterschiedlich exprimiert werden.
Die RNA-Fingerprinting-Technologie wurde als effektiv bei der Identifizierung von Genen gezeigt, die in Krebs unterschiedlich exprimiert werden können (Liang et al., 1992; Wong et al., 1993; Sager et al., 1993; Mok et al., 1994; Watson et al., 1994; Chen et al., 1995a; Chen et al., 1995b; An et al., 1995). Die vorliegende Erfindung verwendet die RNA-Finterprinting-Technik, um Gene zu identifizieren, die in Prostatakrebs unterschiedlich exprimiert werden. Diese Untersuchungen verwenden RNAs, die aus Tumorgeweben und Tumor-abgeleiteten Zellinien isoliert wurden, die sich wie Tumorzellen mit verschiedenen metastatischem Potential verhalten.
Das zugrunde liegende Konzept dieser Untersuchungen war, dass Gene, die in Zellen mit verschiedenen metastatischen Potentialen exprimiert werden, als Indikatoren für metastatisches Potential verwendet werden können. Da die Metastasierung eine Voraussetzung für das Fortschreiten von Prostatakrebs zu lebensbedrohlichen Pathologien ist, ist es wahrscheinlich, dass Indikatoren von metastatischem Potential Indikatoren von pathologischem Potential sind.
Die reverse Transkription (RT) von RNA zu cDNA, gefolgt durch relative quantitative PCR^TM (RT-PCR^TM) kann dazu verwendet werden, um die relativen Konzentrationen von spezifischen mRNA-Spezies in einer Reihe von Gesamtzell-RNAs isoliert aus normalem, benignem und kanzerösem Prostatageweben zu bestimmten. Durch Bestimmung, dass die Konzentration einer spezifischen mRNA-Spezies variiert, wird gezeigt, dass das Gen, das für die spezifische mRNA-Spezies codiert, differentiell exprimiert wird. Diese Technik kann dazu verwendet werden, um zu bestätigen, dass mRNA-Transkripte, von denen durch RNA-Fingerprinting gezeigt wird, dass sie differentiell reguliert werden, bei Prostatakrebsfortschreiten differentiell exprimiert werden.
Die klinischen Proben inhärenten Probleme sind, dass diese von variabler Quantität (was eine Normalisierung problematisch macht) sind, und dass sie von variabler Qualität sind (was die Ko-Amplifikation einer verlässlichen internen Kontrolle, bevorzugterweise von größerer Größe als das Ziel erforderlich macht. Beide dieser Probleme werden überwunden, wenn die RT-PCT^TM als eine relative quantitative RT-PCT^TM mit einem internen Standard durchgeführt wird, wobei der interne Standard ein amplifizierbares cDNA-Fragment ist, das größer ist als das Ziel cDNA-Fragment und in dem die Häufigkeit der mRNA, die für den internen Standard codiert, 5–100fach höher ist, als die mRNA, die für das Ziel codiert. Dieser Test misst die relative Häufigkeit und nicht die absolute Häufigkeit der jeweiligen mRNA-Spezies.
Andere unten beschriebene Untersuchungen wurden unter der Verwendung einer herkömmlicheren relativen quantitativen RT-PCR^TM mit einem externe Standardprotokoll durchgeführt. Diese Tests sammeln die PCR^TM-Produkte im linearen Teil ihrer Amplifikationskurven an. Die Zahl von PCR^TM-Zyklen, die für die Ansammlung optimal ist, muss für jedes Ziel-DNA-Fragment empirisch bestimmt werden. Zusätzlich müssen die reverse Transkriptase-Produkte jeder aus den verschiedenen Gewebeproben isolierten RNA-Population auf gleiche Konzentrationen von amplifizierbaren cDNAs sorgfältig normalisiert werden. Dies ist sehr wichtig, da dieser Test die absolute mRNA-Häufigkeit misst. Die absolute RNA-Häufigkeit kann als ein Maß der differentiellen Genexpression nur in normalisierten Proben verwendet werden. Während die empirische Bestimmung des linearen Bereichs der Amplifikationskurve und der Normalisierung von cDNA-Präparationen aufwendige und zeitaufwendinge Prozesse sind, können die sich ergebenen RT-PCR^TM-Tests gegenüber denjenigen überlegen sein, die von der relativen quantitativen RT-PCR^TM mit einem internen Standard abgeleitet sind.
Ein Grund für dies ist, dass ohne den internen Standard/Kompetitor alle Reagenzien in ein einziges PCR^TM-Produkt im linearen bereicht der Amplifikationskurve überführt werden kann, was die Sensitivität des Tests erhöht. Ein anderer Grund ist, dass mit nur einem PCR^TM-Produkt die Darstellung des Produkts auf einem elektrophoretischen Gel oder einem anderen Darstellungsverfahren weniger kompliziert wird, weniger Hintergrund aufweist und einfacher auszuwerten ist.
4.7 Diagnose und Prognose von menschlichem Krebs
In bestimmten Ausführungsformen ermöglicht die vorliegende Erfindung die Diagnose und Prognose von menschlichem Prostatakrebs durch Screening auf prostataspezifische Nukleinsäuren, insbesondere denjenigen, die in Prostatakrebs überexprimiert sind. Das Feld der Krebsdiagnose und -prognose ist immer noch unsicher. Verschiedene Marker wurden als mit Metastase und Maliginität korreliert vorgeschlagen. Sie können allgemein als zytologische, Protein- oder Nukleinsäuremarker spezifiziert werden.
Zytologische Marker schließen solche Dinge wie „Kernabrundung" (Diamond et al., 1982) und Zellploidität ein. Proteinmarker schließen prostataspezifisches Antigen (PSA) und CA125 ein. Nukleinsäuremarker haben die Amplifikation von Her2/neu Punktmutationen in p53 oder ras-Genen und Veränderungen in den Größen von Triplet Wiederholungssegmenten von bestimmten Chromosomen eingeschlossen.
Alle dieser Marker zeigen bestimmte Nachteile, die mit Falschpositiven und Falschnegativen assoziiert sind. Ein falschpositives Ergebnis tritt auf, wenn ein Individuum ohne malignen Krebs die Anwesenheit eines „Krebsmarkers" zeigt. Z.B. wurde erhöhte Serum-PSA^TM mit Prostatakarzinom assoziiert. Jedoch tritt dies auch in einigen Individuen mit nicht-maligner, benigner Hyperplasie der Prostata auf. Ein falschnegatives Ergebnis tritt auf, wenn ein Individuum Krebs hat, jedoch der Test dabei versagt, die Anwesenheit eines spezifischen Markers zu zeigen. Das Auftreten von Falschnegativen variiert für jeden Marker, und häufig auch mit dem Gewebetyp. Z.B. wurden RAS-Punktmutationen berichtet, als von so hoch wie 95% in pankreatischem Krebs, bis herunter zu 0% in gynäkologischen Krebsarten zu reichen.
Weiter Probleme treten auf, wenn ein Marker nur innerhalb der transformierten Zelle selber vorhanden ist. RAS-Punktmutationen können nur innerhalb der Mutantenzelle nachgewiesen werden und sind offensichtlich nicht in, z.B. dem Blutserum oder Urin von Individuen von RAS-aktivierten Karzinomen vorhanden. Dies bedeutet, dass um einen malignen Tumor nachzuweisen, man eine Probe des Tumors selber oder seiner metastatischer Zellen entnehmen muss. Da es die Aufgabe von Krebsnachweis ist, Tumore zu identifizieren und zu behandeln bevor sie metastasieren, muss man im wesentlichen zuerst den Tumor identifizieren und eine Probe nehmen, bevor die Anwesenheit des Krebsmarkers nachgewiesen werden kann.
Zuletzt treten spezifische Probleme mit Markern auf, die in normalen Zellen vorhanden sind, jedoch in Krebszellen fehlen. Die meisten Tumorproben werden gemischte Populationen von sowohl normalen und transformierten Zellen enthalten. Wenn man nach einem Marker sucht, der in normalen Zellen vorhanden ist, jedoch in reduzierten Spiegeln in transformierten Zellen auftritt, kann das „Hintergrund"-Signal aus normalen Zellen der Probe die Anwesenheit von transformierten Zellen maskieren.
Der ideale Krebsmarker wäre einer, der in malignen Krebsarten vorhanden ist und entweder fehlt oder bei signifikant niedrigeren Spiegeln in benignen Tumoren mit normalen Zellen anders exprimiert ist. Die vorliegende Erfindung adressiert diesen Bedarf für Prostatakrebsmarker durch Identifizieren eines neuen prostataspezifischen Gens (UC Bande #41), das in viel höheren Spiegeln in malignen Prostatakarzinom exprimiert wird, als in benigner oder normaler Prostata. Insbesondere sind die für UC Bande #41 (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4) in Beispielen 1–5 unten diskutierten Ergebnisse recht viel versprechend, dahingehend, in das dieser Marker offensichtlich nur in malignen Tumoren überexprimiert wird und in sehr geringen Spiegeln in BPH oder normaler Prostata vorhanden ist. Weiterhin ist dieses Gen in einem hohen Prozentsatz in menschlichen Prostatakrebsarten, die bis heute untersucht wurden signifikant erhöht.
Es wird erwartet, dass in klinischen Anwendungen menschliche Gewebeproben auf die Anwesenheit der Expressionsprodukte von UC41 gescreent werden. Solche Proben könnten aus Nadelbiopsiekernen, chirurgischen Resektionsproben, Lymphknotengewebe oder Serum bestehen. In bestimmten Ausführungsformen würden Nukleinsäuren aus diesen Proben extrahiert und wie oben amplifiziert. Einige Ausführungsformen würden Kits verwenden, die vorausgewählte Primerpaare oder Hybridisierungssonden enthalten. Die amplifizierten Nukleinsäuren würden auf UC41 Expressionsprodukte durch, z.B., Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung getestet werden, oder Southern Blotting oder einem Fest-Phase Nachweismittel wie oben beschrieben. Diese Verfahren sind gut im Stand der Technik bekannt. Die Spiegel an nachgewiesenen Expressionsprodukt(en) würde mit einer statistisch validen Gruppe von metastatischen, nicht-metastatischen malignen, benignen oder normalen Prostataproben verglichen werden. Die Diagnose und Prognose des individuellen Patienten wird durch Vergleich mit solchen Gruppen bestimmt werden.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Anwendung von RT-PCT^TM-Techniken, um zirkulierende Prostatakrebszellen nachzuweisen (d.h. solche, die bereits metastasiert haben), unter der Verwendung von Sonden und Primern ausgewählt aus Sequenzen oder deren Komplementen, die hier als SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 bezeichnet werden. Ähnliche Techniken wurden in der PCT-Patent Anmeldung Nr. WO 94/10343 beschrieben.
In dieser Ausführungsform werden metastatische Prostatakrebszellen in hämatopoietischen Proben durch Amplifikation von Prostatakrebs-spezifischen Nukleinsäuresequenzen nachgewiesen. Proben, die aus Blut oder Lymphknoten genommen werden, werden wie unten beschreiben behandelt, um Gesamtzell-RNA zu reinigen. Die isolierte RNA wird revers transkribiert unter der Verwendung einer reversen Transkriptase und Primern, die so ausgewählt sind, unter hoch stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 zu binden. Im Anschluss an die reverse Transkription werden die sich ergebenden cDNAs amplifiziert unter der Verwendung von Standard-PCR^TM-Techniken (unten beschrieben) und einer thermostabilen DNA-Polymerase.
Die Anwesenheit von Amplifikationsprodukten, die UC41-Nukleinsäurenen entsprechen, kann durch verschiedene alternative Mittel nachgewiesen werden. In einer Ausführungsform kann das Amplifikationsprodukt durch Elektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen werden. Alternativ kann im Anschluss an den Elektrophoreseschritt das Ampflifikationsprodukt durch Standard Southern Blotting Techniken unter der Verwendung einer Hybridisierungssonde ausgewählt, um spezifisch an eine Nukleinsäure entsprechend zu SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 zu binden, nachgewiesen werden. Die Sondenhybridisierung kann umgekehrt durch ein Standardmarkierungsmittel, z.B., durch Inkorporation von [³²P]-Nukleotiden gefolgt durch Autoradiographie, nachgewiesen werden. Die Amplifikationsprodukte können alternativ unter Verwendung eines Fest-Phase-Nachweissystems wie oben beschrieben nachgewiesen werden, unter der Verwendung einer Hybridisierungssonde die spezifisch für SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ist und einem geeigneten Markierungsmittel. Die Anwesenheit von UC41-Nukleinsäuren in Blut oder Lymphknotenproben kann als für einen Patienten mit metastatischem Prostatakrebs indikativ angenommen werden.
4.8 Gezielte Inhibierung eines Prostata-spezifischen Gens
Im Prinzip kann das neue Prostata-spezifische Gen (UC41), das in der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, als ein Ziel für die therapeutische Intervention in Prostatakrebs dienen.
Inhibitoren könnten potentiell für UC41 aufgebaut werden. Dies wird durch die Tatsache verkompliziert, dass keine spezifische Funktion für diese Genprodukte identifiziert wurde und keine Daten erhältlich sind über seine dreidimensionalen Strukturen.
Die Identifizierung der Proteinfunktion kann in einigen Fällen aus den primären Sequenzdaten extrapoliert werden, unter der Voraussetzung, dass eine Sequenzhomologie zwischen dem unbekannten Protein und einem Protein von ähnlicher Sequenz und bekannter Funktion existiert. Proteine neigen dazu, in großen Familien von relativ ähnlicher Sequenz und Funktion aufzutreten. Zum Beispiel weisen eine Zahl der Serinproteasen, wie Trypsin und Chymotrypsin extensive Sequenzhomologien auf und relativ ähnliche dreidimensionale Strukturen. Andere allgemeine Kategorien von homologen Proteinen schließen verschiedene Klassen von Transkriptionsfaktoren, Membranrezeptorproteinen, Tyrosinkinasen, GTP-bindenden Proteinen, usw. ein. Die putativen Aminosäuresequenzen, die durch das Prostata-spezifische Gen der vorliegenden Erfindung kodiert werden, können auf Sequenzhomologien gegen die Proteinsequenz-Datenbank des National Biomedical Research Fund gegen-untersucht werden. Homologie-Untersuchungen sind Standardtechniken für den Fachmann.
Sogar die dreidimensionale Struktur kann aus den primären Sequenzdaten des kodierten Protein(en) abgeleitet werden. Wiederum, wenn Homologien zwischen den kodierten Aminosäuresequenzen und anderen Proteinen von bekannter Struktur existieren, dann kann ein Modell für die Struktur des kodierten Proteins aufgestellt werden, basierend auf der Struktur des bekannten Proteins. Ein Beispiel dieses Typ von Ansatzes wurde durch Ribas de Pouplana und Fothergill-Gilmore (1994) berichtet. Diese Autoren entwickelten ein genaues dreidimensionales Modell für die Struktur von Drosophila-Alkoholdehydrogenase, basierend teilweise auf Sequenzhomologie mit der bekannten Struktur einer 3-α,20-β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase. Sobald ein dreidimensionales Modell erhältlich ist, können Inhibitoren durch Standard-Computermodell-Techniken aufgebaut werden. Dieser Bereich wurde durch Sun and Cohen (1993) zusammenfassend beschrieben.
4.8.1 Antisense-Konstrukte
Der Ausdruck „Antisense" ist gedacht, Polynukleotidmoleküle zu betreffen, die komplementär zu einem Teil eines RNA-Expressionsprodukts von UC41, wie hier definiert, sind. „Kom plementäre" Polynukleotide sind diejenigen, die in der Lage sind, gemäß den Standard-Watson-Crick-Komplementaritätsregeln Basen zu paaren. Gemeint ist, die größeren Purine werden mit den kleineren Pyrimidinen Basen-paaren, um Kombinationen von Guanin, gepaart mit Cytosin (G:C) und Adenin, gepaart mit entweder Thymin (A:T) im Fall von DNA, oder Adenin, gepaart mit Uracil (A:U) im Fall von RNA zu bilden. Der Einschluss von weniger häufigen Basen, wie zum Beispiel Inosin, 5-Methylcytosin, 6-Methyladenin, Hypoxanthin und andere in hybridisierende Sequenzen interferiert nicht mit der Paarung.
Antisense-Polynukleotide, wenn in eine Zielzelle eingeführt, binden spezifisch an ihre Zielpolynukleotide und interferieren mit der Transkription, mit dem RNA-Prozessieren, dem Transport, der Translation und/oder der Stabilität. Antisense-RNA-Konstrukte oder DNA, die für solche Antisense-RNAs kodiert, kann verwendet werden, um die Gentranskription oder Translation oder beides innerhalb einer Wirtszelle, entweder in vitro oder in vivo, wie zum Beispiel innerhalb eines Wirtstieres, einschließlich eines menschlichen Subjekts, zu inhibieren.
Die intrazelluläre Konzentration von monovalenten Kationen ist ungefähr 160 mM (10 mM Na⁺; 150 mM K⁺). Die intrazelluläre Konzentration von divalenten Kationen ist ungefähr 20 mM (18 mM Mg⁺; 2 mM Ca⁺⁺). Die intrazelluläre Proteinkonzentration, die dazu dienen würde, das Volumen der Hybridisierung zu verringern und dadurch die effektive Konzentration der Nukleinsäurespezies zu erhöhen, ist 150 mg/ml. Konstrukte können in vitro getestet werden unter Bedingungen, die diese in vivo-Bedingungen nachahmen.
Antisense-Konstrukte können so aufgebaut werden, um an den Promotor und andere Kontrollregionen, Exons, Introns oder sogar Exon-Intron-Grenzen eines Gens zu binden. Es ist vorgesehen, dass die am meisten effektiven Antisense-Konstrukte für die vorliegende Erfindung Regionen einschließen werden, die komplementär zu der mRNA-Startstelle sind, oder zu denjenigen Sequenzen, die hier als SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 angegeben sind. Man kann leicht solche Konstrukte testen, einfach durch Testen der Konstrukte in vitro, um zu bestimmen, ob Spiegel des Zielproteins beeinträchtigt sind. Ähnlich kann auch die schädliche nicht-spezifische Inhibierung von Proteinsynthese durch Bestimmen der Zielzell-Lebensfähigkeit in vitro gemessen werden.
Wie hier verwendet, bedeuten die Ausdrücke „komplementär" oder „Antisense" Polynukleotide, die im wesentlichen komplementär über ihre gesamte Länge sind und sehr wenige Basenfehlpaarungen aufweisen. Z.B. können Sequenzen von fünfzehn Basen in Länge als komplementär benannt werden, wenn sie ein komplementäres Nukleotid bei dreizehn oder vierzehn Nukleotiden von fünfzehn aufweisen. Natürlich werden Sequenzen, die „vollständig komplementär" sind, Sequenzen sein, die über ihre gesamte Länge hinweg vollständig komplementär ist und keine Basenfehlpaarungen aufweist.
Andere Sequenzen mit geringeren Ausmaßen an Homologie sind ebenfalls vorgesehen. Z.B. könnte an Antisense-Konstrukt, das begrenzte Regionen von Homologie, jedoch auch eine nicht-homologe Region (z.B. ein Ribozym) enthält, aufgebaut werden. Diese Moleküle, obwohl sie weniger als 50% Homologie aufweisen, würden unter geeigneten Bedingungen an Zielsequenzen binden.
Wie oben angegeben, obwohl die Antisense-Sequenzen Vollängen-cDNA-Kopien sind oder große Fragmente davon, können sie auch kürzere Fragmente oder „Oligonukleotide" sein, die hier als „Oligonukleotide" von 50 oder weniger Basen definiert sind. Obwohl kürzere Oligomere (8–20) einfacher herzustellen sind und die in vivo Verfügbarkeit erhöhen, sind zahlreiche andere Faktoren beider Bestimmung der Spezifität der Basenpaarung beteiligt. Z.B. steigen sowohl die Bindungsaffinität und die Sequenzspezifität eines Oligonukleotids an sein komplentäres Ziel mit ansteigender Länge an. Es ist vorgesehen, das Oligonukleotide von 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 oder 100 Basenpaare verwendet werden. Während alles oder ein 'Teil der Gensequenz im Kontext der Antisense-Konstruktion verwendet werden kann, sollte statistisch jede Sequenz von 14 Basenlänge nur einmal im menschlichen Genom auftreten und daher ausreichend sein, eine einmalige Zielsequenz zu spezifizieren.
In bestimmten Ausführungsformen kann man wünschen, Antisense-Konstrukte zu verwenden, die andere Elemente einschließen, z.B. diejenigen, die C-5-Propinpyrimidine enthalten. Oligonukleotide, die C-S-Propinanaloga von Uridin und Cytidin enthalten, wurden als RNA mit hoher Affinität bindend und als potente Antisense-Inhibitoren der Genexpression gezeigt (Wagner et al., 1993).
Als eine Alternative zu abgezielter Antisense-Zuführung können abgezielte Ribozyme verwendet werden. Der Ausdruck „Ribozym" betrifft ein RNA-basiertes Enzym, das in der Lage ist, gezielt bestimmte Basensequenzen in sowohl DNA und RNA zu spalten. Ribozyme weisen spezifische katalytische Domänen auf, die Endonukleaseaktivität besitzen (Kim and Cech, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster und Symons, 1987). Z.B. beschleunigen eine große Zahl von Ribozymen Phosphoester-Transferreaktionen mit einem hohen Ausmaß an Spezifität, wobei oft nur einer der verschiedenen Phosophorester in einem Oligonukleotidsubstrat gespalten wird (Cech et al., 1981; Michel und Westhof, 1990; Reinhold-Hurek and Shub, 1992). Diese Spezifität wurde dem Erfordernis zugeordnet, das das Substrat über spezifische Basenpaarungsinteraktionen an die interne Leitsequenz („IGS") des Ribozyms vor der chemischen Reaktion bindet.
Die Ribozymkatalyse wurde hauptsächlich als ein Teil von Sequenz-spezifischen Spaltungs-/Ligationsreaktionen beobachtet, die Nukleinsäuren einschließen (Joyce, 1989; Cech et al., 1981). Z.B. berichtet U.S.-Patent Nr. 5,354,855, das bestimmte Ribozyme als Endonukleasen mit einer Sequenzspezifität von mehr als der von bekannten Ribonukleasen wirken können und sich derjenigen der DNA-Restriktionensenzyme annähert. Daher kann die Sequenzspezifische Ribozym-vermittelte Inhibierung der Genexpression besonders für therapeutische Anwendungen geeignet sein (Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990). Kürzlich wurde berichtet, dass Ribozyme genetische Veränderungen in einigen Zellinien hervorrufen, auf die sie aufgetragen wurden; die veränderten Gene schlossen die Onkogene H-ras, c-fos und Gene von HIV ein. Der größte Teil dieser Arbeit schloss die Modifikation einer Ziel-mRNA, basierend auf einen spezifischen Mutantencodon ein, das durch ein spezifisches Ribozym gespalten wird.
Ribozyme können entweder direkt auf Zellen abgerichtet werden, in der Form von Oligonukleotiden, die Ribozymsequenzen enthalten, oder in die Zelle als ein Expressionsvektor eingeführt werden, der für die gewünschte Ribozym-RNA codiert. Ribozyme können auf im wesentlichen dieselbe Weise verwendet, wie für Antisense-Polynukleotide beschrieben. Ribozymsequenzen können auch auf die im wesentlichen selbe Weise wie beschrieben für Antisense-Polynukleotide modifiziert werden. Z.B. könnte man nicht-Watson-Crick Basen einschließen oder gemischte RNA/DNA-Oligonukleotide herstellen oder das Phosphodiester-Rückgrad modifizieren oder das 2'-Hydroxy in der Ribose-Zuckergruppe der RNA modifizieren.
Alternativ können die Antisense-Oligo- und Polynukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung als RNA über Transkription aus Expressionskonstrukten zur Verfügung gestellt werden, die Nukleinsäuren tragen, die für die Oligo- oder Polynukleotide codieren. Innerhalb dieser Anmeldung soll der Ausdruck „Expressionskonstrukt" bedeuten, jeden Typ von genetischen Konstrukt einschließen, das eine Nukleinsäure trägt, die für ein Antisense-Produkt codiert, indem ein Teil oder alles der Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, transkribiert zu werden. Typische Expressionsvektoren schließen bakterielle Plasmide oder Phagen ein, wie z.B. jedes der pUC oder Bluescript^TM-Plasmidreihen oder, wie weiter unten diskutiert, virale Vektoren, die für die Verwendung in eukaryontischen Zellen angepasst sind.
In bevorzugten Ausführungsformen codiert die Nukleinsäure für ein Antisense- oder Polynukleotid unter transkriptioneller Kontrolle eines Promotors. Ein „Promotor" betrifft eine DNA-Sequenz, die durch dies synthetische Maschinerie der Zelle erkannt wird oder in einer eingeführten synthetischen Maschinerie, die erforderlich ist, um die spezifische Transkription eines Gens zu initiieren. Der Ausdruck „unter transkriptioneller Kontrolle" bedeutet, dass der Promotor am richtigen Platz und in der richtigen Orientierung in Bezug zur Nukleinsäure vorliegt, um die RNA-Polymerase-Initiierung zu kontrollieren.
Der Ausdruck Promotor wird hier verwendet, um eine Gruppe von transkriptionellen Kontrollmodulen zu betreffen, die um die Startstelle für RNA-Polymerase II herum versammelt sind. Vieles der Gedanken, wie Promotoren organisiert sind, ist aus Analysen von mehreren viralen Promotoren abgeleitet, einschließlich denjenigen für die HSV-Thymidinkinase (tk) und den SV40 frühen Transkriptionseinheiten. Diese Untersuchungen, unterstützt durch kürzlichere Arbeiten, haben gezeigt, dass Promotoren aus diskreten funktionellen Modulen zusammengesetzt sind, die jeweils aus ungefähr 7–20 bp an DNA bestehen und eine oder mehrere Erkennungsstellen für transkriptionelle Aktivator- oder Repressorproteine enthalten.
Mindestens ein Modul in jedem Promotor funktioniert, um die Startstelle für RNA-Synthese zu positionieren. Das dafür am besten bekannte Beispiel ist die TATA Box, jedoch hilft in einigen Promotoren, denen eine TATA Box fehlt, wie z.B. dem Promotor für das Säugerterminale Desoxynukleotidyltransferasegens und dem Promotor für die SV40 späten Gene, ein diskretes Element, das die Startstelle selber überlagert, dabei, um den Platz des Starts festzulegen.
Weitere Promotorelemente regulierten die Frequenz der Transkriptionsinitiierung. Typischerweise sind diese in der Region 30–110 bp stromaufwärts der Startstelle lokalisiert, obwohl von einer Zahl von Promotoren kürzlich gezeigt wurde, dass sie auch funktionelle Elemente stromabwärts von der Startstelle enthalten. Der Abstand von den Promotorelementen ist häufig flexibel, so dass die Promotorfunktion beibehalten wird, wenn Elemente invertiert oder relativ zueinander bewegt wurden. Im tk-Promotor kann der Abstand zwischen den Promotorelementen auf 50 bp voneinander erhöht werden, bevor die Aktivität anfängt, abzunehmen. In Abhängigkeit von dem Promotor scheint es so zu sein, dass individuelle Elemente entweder kooperativ oder unabhängig funktionieren können, um die Transkription zu aktivieren.
Der bestimmte Promotor, der dazu verwendet wird, um die Expression einer Nukleinsäure zu kontrollieren, die für das inhibitorische Peptid codiert, wird als nicht wichtig vermutet, solange wie er in der Lage ist, das Peptid in der Zielzelle zu exprimieren. Daher, wenn auf eine menschliche Zelle abgezielt werden soll, ist es bevorzugt, die Nukleinsäure, die für das inhibitorische Peptid codiert, angrenzend zu und unter die Kontrolle eines Promotors zu positionieren, der in der menschlichen Zelle aktiv ist. Allgemein gesprochen kann solch ein Promotor möglicherweise entweder einen menschlichen oder viralen Promotor einschließen.
In verschiedenen Ausführungsformen können der menschliche Zytomegalovirus (CMV) unmittelbare frühe Gen-Promotor, der SV40 frühe Promotor und der Rous Sacroma Virus lange terminale Repeat verwendet werden, um hohe Spiegel an Expressionen von verschiedenen Proteinen zu erhalten. Die Verwendung von anderen viralen oder säugerzellulären oder bakteriellen Phagen-Promotoren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, um eine Expression der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung zu erreichen, ist ebenfalls vorgesehen, unter der Voraussetzung, dass die Expressionsspiegel für einen bestimmten Zweck ausreichend sind.
Durch Verwendung eines Promotors mit gut bekannten Eigenschaften können der Spiegel und das Muster der Expression eines Antisense-Oligo- oder Polynukleotids optimiert werden. Weiterhin kann die Auswahl eines Promotors, der in Antwort auf spezifische physiologische Signale reguliert wird, die induzierbare Expression eines inhibitorischen Proteins erlauben. Z.B. führt eine Nukleinsäure unter Kontrolle des menschlichen PAI-1-Promotors zur Expres sion, die durch Tumornekrosefaktor induzierbar ist. Zusätzlich könnte auch jede Promotor-/Enhancerkombination (wie mittels der eukaryontischen Promotordatenbank EPDB) verwendet werden, um die Expression einer Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung anzutreiben. Die Verwendung eines T3, T7 oder SP6-zytoplasmatischen Expressionssystems ist eine andere mögliche Ausführungsform. Eukaryontische Zellen können die zytoplasmatische Transkription von bestimmten bakteriellen Promotoren unterstützen, wenn die geeignete Polymerase zur Verfügung gestellt wird, entweder als Teil des Zuführungskomplexes oder als ein zusätzliches genetisches Expressionskonstrukt.
Tabellen 2 und 3 listen mehrere Elemente/Promotoren auf, die verwendet werden können im Kontext der vorliegenden Erfindung, um die Expression des Gens von Interesse zu regulieren. Diese Liste ist nicht als erschöpfend für alle möglichen Elemente gedacht, die an der Unterstützung der Gen-Expression beteiligt sind, sondern lediglich als dafür beispielhaft.
Enhancer sind genetische Elemente, die die Transkription von einem Promotor ansteigen lassen, der in einer beabstandeten Position auf demselben Molekül an DNA lokalisiert ist. Enhancer sind sehr ähnlich wie Promotoren organisiert. D.h., sie sind aus vielen Einzelelementen zusammengesetzt, die alle an eines oder mehrere transkriptionelle Proteine binden.
Die grundsätzliche Unterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren ist funktionell. Eine gesamte Enhancerregion muss in der Lage sein, eine Transkription in einem Abstand zu stimulieren; dies muss nicht für eine Promotorregion oder ihrer Komponentenelemente richtig sein. Auf der anderen Seite muss ein Promotor eines oder mehrere Elemente aufweisen, die die Initiation der RNA-Synthese an einer bestimmten Stelle und einer bestimmten Orientierung steuern, wohingegen Enhancern diese Eigenschaften fehlen. Promotoren und Enhancer überlappen oft und gehen in einander über, wobei sie oft eine sehr ähnliche modulare Organisation zu haben scheinen.
Unten ist eine Liste von viralen Promotoren, zellulären Promotoren/Enhancern und induzierbaren Promotoren/Enhancern, die in Kombination mit der Nukleinsäure verwendet werden könnten, die für ein Gen von Interesse codiert, in einem Expressionskonstrukt (Tabelle 2 und Tabelle 3). Zusätzlich, könnte auch jede Promotor/Enhancer-Kombination (wie mittels der eukaryontischen Promotordatenbank EPDB) verwendet werden, um die Expression des Gens anzutreiben. Eukaryontische Zellen können die zytoplasmatische Transkription von bestimm ten bakteriellen Promotoren unterstützen, wenn die geeignete bakterielle Polymerase zur Verfügung gestellt wird, entweder als Teil des Zuführkomplexes, oder als ein zusätzliches genetisches Expressionskonstrukt.
Tabelle 2
ENHANCER/PROMOTO

Immunglobulin schwere Kette
Immunglobulin leichte Kette
T-Zell Rezeptor
HLA DQ α und DQβ
B-Interferon
Interleukin-2
Interleukin-2 Rezeptor
MHC Klasse II
β-Aktin
Präalbumin (Transthyretin)
Muskelkeratinkinase
Elastase I
Metallothionein
Kollagenase
Albumin-Gen
α-Fetoprotein
τ-Globin
β-Globin
e-fos
c-HA-ras
Insulin
Neurales Zelladhäsionsmolekül (NCAM)
α1-Antitrypsin
H2B (TH2B) Histon
Maus oder Typ I Collagen
Glucose-regulierte Proteine (GRO94 und GRP78)
Rattenwachstumshormon
Human Serum Amyloid A (SAA)
Troponin I (TN I)
Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor
Duchenne-muskuläre Dystrophie
SV40
Polyma
Retroviren
Papilloma Virus
Hepatitis B Virus
Menschlicher Immundefizienzvirus
Cytomegalovirus

TABELLE 3 Element Induzierer
Wenn ein cDNA-Insert verwendet wird, wird man typischerweise ein Polyadenylierungssignal mit einschließen, um eine geeignete Polyadenylierung des Gentranskripts zu bewirken. Die Art des Polyadenylierungssignals wird als nicht entscheidend für die erfolgreiche Durchführung der Erfindung betrachtet, und jede solcher Sequenzen kann verwendet werden, wie z.B. menschliches Wachstumshormon und SV40 Polyadenylierungssignale. Auch als ein Element des Expressionskonstrukt vorgesehen ist ein Terminator. Diese Elemente können dazu dienen, um Message-Spiegel zu verstärken und das Durchlesen aus dem Konstrukt in andere Sequenzen zu minimieren. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann die Zuführung einer Nukleinsäure in eine Zelle in vitro oder in vivo durch Einschließen eines Markers in das Expressionskonstrukt identifiziert werden. Der Marker wird zu einer identifizierbaren Veränderung für die transfizierte Zelle führen, was die Identifizierung der Expression ermöglicht. Enzyme, wie z.B. Herpes Simplex Virus-Thymidinkinase (tk) (eukaryontisch) oder Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) (prokaryontisch) können verwendet werden.
Man kann auch ein Polyadenylierungssignal einschließen, um eine geeignete Polyadenylierung des Transkripts zu bewirken. Von der Art des Polyadenylierungssignals wird geglaubt, dass sie nicht für die erfolgreiche Durchführung der Erfindung entscheidend ist und jede solcher Sequenzen kann verwendet werden. Z.B. kann das SV40, β-Globin oder Adenovirus-Polyadenylierungssignal verwendet werden. Auch als ein Element der Expressionskassette ist ein Terminator. Diese Elemente können dazu dienen, um die Message-Spiegel zu verstärken und ein Durchlesen aus der Kassette in andere Sequenzen zu minimieren.
4.8.2 Einzelketten-Antikörper
In noch einer anderen Ausführungsform kann eingehen einen Einzelketten-Antikörper umfassen. Verfahren zu Herstellung von Einzelketten-Antikörpern sind dem Fachmann im Stand der Technik gut bekannt. Der Fachmann wird für solche Verfahren auf U.S.-Patent 9,359,046 hingewiesen. Ein Einzelketten-Antikörper wird durch Fusionieren der variablen Domänen der schweren und leichten Ketten unter der Verwendung eines kurzen Peptidlinkers erzeugt, wodurch eine Antigenbindungsstelle auf einem einzelnen Molekül rekonstituiert wird.
Einzelketten-Antikörper variable Fragmente (scFvs), in denen der C-Terminus einer variablen Domäne an den N-Terminus der anderen über ein 15 bis 25 Aminosäurepeptid oder Linker angebracht ist, wurden entwickelt, ohne die Antigenbindung oder Spezifität der Bindung si gnifikant zu stören (Bedzyk et al., 1990; Chaudhary et al., 1990). Diesen Fvs fehlen die konstanten Regionen (Fc), die in den schweren und leichten Ketten des nativen Antikörpers vorhanden sind. Einzelketten-Antikörper gegen die Proteinprodukte des UC41-Gens sind innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
Einzelketten-Antikörper können durch eine Zelle synthetisiert werden, auf bestimmte zelluläre Kompartimente abgerichtet werden und dazu verwendet werden, auf eine hochspezifische Weise mit dem Zellwachstum und Stoffwechsel zu interferieren. Kürzlich wurden Einzelketten-Antikörper für das phänotypische Knockout von Wachstumsfaktorrezeptoren, der funktionellen Aktivierung von p21ras und der Inhibierung der HIV-1-Replikation verwendet. Intrazelluläre Antikörper bieten eine einfache und effektive Alternative, gegenüber anderen Formen der Gen-Inaktivierung, und zeigen ein klares Potential als Reagenzien für die Krebstherapie und für die Kontrolle von infektiösen Erkrankungen. Einzelgen-Antigen-bindende Proteine stellen auch potentiell einmalige Moleküle für die gezielte Zuführung von Wirkstoffen, Toxinen oder Radionuklide an eine Tumorstelle zur Verfügung und zeigen eine erhöhte Zugänglichkeit gegenüber Tumorzellen in vivo (Yokoda et al. 1992).
Es ist durch die vorliegende Erfindung auch vorgesehen, dass Einzelketten-Antikörpertherapie mit chemotherapeutischer oder radiotherapeutischer Intervention kombiniert werden kann.
4.8.3 Liposomale Formulierungen
In bestimmten breiten Ausführungsformen der Erfindung können die Antisense-Oligo- oder Polynukleotide und/oder Expressionsvektoren in einem Liposom eingeschlossen vorliegen. Liposomen sind vesikuläre Strukturen, die durch eine Phospholipid-Bilagenmembran charakterisiert sind und einem inneren wässrigen Medium. Multilamellare Liposomen weisen multiple Lipidlagen auf, die durch ein wässriges Medium getrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Überschuss an wässrigem Medium suspendiert werden. Die Fettkomponenten werden einer Selbst-Rearrangierung vor der Bildung von geschlossenen Strukturen unterzogen und schließen Wasser und gelöste Solute zwischen den Lipidbilagen ein (Ghosh and Bachhawat, 1991). Auch vorgesehen sind kationische Lipidnukleinsäurekomplexe, wie z.B. Lipofektamin-Nukleinsäurekomplexe.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann das Liposom mit einem Hämagglutininvirus (HVJ) komplexiert werden. Von diesem wurde gezeigt, dass es die Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Zelleintritt von Liposomen-eingeschlossener DNA unterstützt (Kaneda et al., 1989). In anderen Ausführungsformen kann das Liposom komplexiert werden oder in Verbindung mit Kern nicht-Histon chromosomalen Proteinen (HMG-1) angewendet werden (Kato et al., 1991). In noch anderen Ausführungsformen kann das Liposom komplexiert werden oder in Konjunktion mit sowohl HVJ und HMG-1 verwendet werden. Insoweit solche Expressionsvektoren erfolgreich beim Transfer und der Expression eines Polynukleotids in vitro und in vivo verwendet wurden, sind sie für die vorliegende Erfindung anwendbar. Wo ein bakterieller Promotor in dem DNA-Konstrukt verwendet wird, wird es auch wünschenswert sein, innerhalb des Liposoms eine geeignete bakterielle Polymerase einzuschließen.
„Liposom" ist ein allgemeiner Ausdruck, der einen Vielzahl von einzelne und multilamellaren Lipidvehikeln umfaßt, die durch die Erzeugung von geschlossenen Lipid-Bilagen gebildet werden. Phospholipide werden zur Herstellung der Liposomen gemäß der Herstellung der vorliegenden Erfindung verwendet und können eine nettopositive Ladung, eine nettonegative Ladung tragen, oder sind neutral. Diacetylphosphat kann dazu verwendet werden, um eine negative Ladung an die Liposomen zu verleihen und Stearylamin kann verwendet werden um eine positive Ladung auf die Liposomen zu übertragen.
Zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbare Lipide können aus kommerziellen erhalten werden. Z.B. wird Dimyristylphosphatidylcholin („DMPC") von Sigma Chemical Co. Erhalten, Dicetylphosphat („DCP") wird von K&K Laboratories (Plainview, NY) erhalten; Cholesterin („Chol") wird von Calbiochem (La Jolla, CA) erhalten, Dimyristylphosphotidylglycerin („DMPG") und andere Lipide können von Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.) erhalten werden. Vorratslösungen von Lipiden in Chloroform, Chloroform/Methanol oder t-Butanol können bei ungefähr –20°C gelagert werden. Bevorzugterweise wird Chloroform als das einzige Lösungsmittel verwendet, da es leichter verdampft werden kann, als Methanol.
Phospholipide aus natürlichen Quellen, wie z.B. Ei oder Sojabohnen-Phosphatidylcholin, Hirnphosphatidin, Hirn- oder Pflanzenphosphatidylinositol, Herzkardiolipin und Pflanzen- oder bakterielles Phosphatidylethanolamin werden bevorzugterweise nicht als das primäre Phosphatid verwendet, d.h. stellen 50% oder mehr der Gesamt-Phosphatidzusammensetzung dar, aufgrund der Instabilität und Durchlässigkeit der sich ergebenen Liposomen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Liposomen können durch verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Die Größe der Liposomen variiert in Abhängigkeit vom Syntheseverfahren. Ein Liposom, das in einer wässrigen Lösung suspendiert wird, liegt gewöhnlicherweise in Form eines sphärischen Vehikels vor, das eine oder mehrere konzentrische Lagen von Lipidbilagenmolekülen aufweist. Jede Lage besteht aus einer parallelen Anordnung von Molekülen, die durch die Formel XY dargestellt werden, wobei X eine hydrophile Gruppe und Y eine hydrophobe Gruppe ist. In wässriger Lösung werden die konzentrischen Lagen so angeordnet, dass die hydrophilen Gruppen dazu neigen, in Kontakt mit einer wässrigen Phase zu bleiben und die hydrophoben Regionen dazu neigen selbst zu assoziieren, wenn wässrige Phasen sowohl innerhalb und außerhalb des Liposoms vorhanden sind, werden die Lipidmoleküle eine Bi-Lage bilden, bekannt als Lamella, der Anordnung XY-YX.
Liposomen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung können in Übereinstimmung mit bekannten Labortechniken präpariert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Liposomen durch Mischen von liposomalen Lipiden in einem Lösungsmittel in einem Behälter, z.B. einer Glas, rund-geformten Flasche, präpariert. Der Behälter sollte ein Volumen von zehnmal größer als das Volumen der erwarteten Suspension von Liposomen aufweisen. Unter der Verwendung eines Rotationsverdampfers wird das Lösungsmittel bei ungefähr 40°C unter negativem Druck entfernt. Das Lösungsmittel wird normalerweise innerhalb von 5 Minuten bis 2 Stunden in Abhängigkeit von dem gewünschten Volumen der Liposomen entfernt. Die Zusammensetzung kann weiter in einem Desiccator Vakuum-getrocknet werden. Die getrockneten Lipide werden im allgemeinen nach ungefähr einer Woche verworfen, aufgrund einer Tendenz, sich über die Zeit hinweg zu zersetzen.
Getrocknete Lipide können bei ungefähr 25–50 mM Phospholipid in sterilem Pyrogen-freiem Wasser durch Schütteln hydriert werden, bis alles des Lipidfilms resuspendiert ist. Die wässrigen Liposomen können dann in Aliquots aufgeteilt werden, jedes in einem Gefäß platziert werden, lyophilisiert werden und unter Vakuum versiegelt werden.
In der Alternative können Liposomen in Übereinstimmung mit anderen bekannten Laborverfahren präpariert werden: dem Verfahren von Bangham et al. (1956), dem Verfahren von Gregoriadis, wie beschrieben in DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis (1979), dem Verfahren von Deamer und Uster (1983) und dem Reverse-Phase Verdampfungsverfahren wie beschrieben von Szoka und Papahadjopoulus (1978). Die vorgenannten Verfahren unterscheiden sich in ihren jeweiligen Fähigkeiten, wässriges Material einzuschließen und ihren jeweiligen wässrigen Raum-zu-Lipidverhältnissen.
Die getrockneten Lipide oder lyophilisierten Liposomen wie oben präpariert, können in einer Lösung von Nukleinsäure rekonstituiert werden und auf eine geeignete Konzentration mit einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. DPBS, verdünnt werden. Das Gemisch wird dann kräftig in einen Vortexmischer geschüttelt. Nicht-verkapselte Nukleinsäure wird durch Zentrifugation bei 39.000 × g entfernt und die liposomalen Pellets gewaschen. Die gewaschenen Liposomen werden bei einer geeigneten Gesamt-Phospholipidkonzentration, z.B. ungefähr 50–200 nM, resuspendiert. Die Menge von Nukleinsäure, die eingekapselt ist, kann in Übereinstimmung mit Standardverfahren bestimmt werden. Nach Bestimmung der Menge von eingeschlossenen Nukleinsäure in der Liposomenpräparation können die Liposomen auf geeignete Konzentration verdünnt werden und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Lipid Dioleoylphosphatidylcholin verwendet. Nuklease-resistente Oligonukleotide werden mit Lipiden in der Anwesenheit von Überschuss t-Butanol gemischt. Das Gemisch wird gevortext, bevor es in einem Aceton/Trockeneisbad gefroren wird. Das gefrorene Gemisch wurde lyophilisiert und mit Hepesgepufferter Kochsalzlösung (1 mM Hepes, 10 mM NaCl, pH 7,5) über Nacht hydriert, und dann wurden Liposomen in einem Badtypbeschallungsgerät für 10 bis 15 Minuten beschallt. Die Größe der Liposomen-Oligonukleotide reicht typischerweise von zwischen 200–300 nM im Durchmesser, wie durch den Submicron Particle Sizer Autoverdünner Model 370 (Nicomp, Santa Barbara, CA) bestimmt.
4.8.4 Virale Zuführungssysteme
Es gibt eine Zahl von Wegen, in denen Expressionsvektoren in Zellen eingeführt werden können. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung umfaßt das Expressionskonstrukt ein Virus oder gentechnisch verändertes Konstrukt, abgeleitet von einem viralen Genom. Die Fähigkeit von bestimmten Viren, in Zellen über Rezeptor-vermittelte Endozytose einzudringen, sich in eine Wirtszellgenom zu integrieren und virale Gene stabil und effizient zu expri mieren, haben sie zu attraktiven Kandidaten für den Transfer von Fremdgenen in Säugerzellen gemacht (Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986). Bevorzugte Gentherapievektoren sind im allgemeinen virale Vektoren.
Obwohl einige Viren, die fremdes genetisches Material aufnehmen können in der Zahl an Nukleotiden begrenzt sind, dass sie aufnehmen können und im Bereich der Zellen, die sie infizieren, wurde von diesen Viren gezeigt, dass sie erfolgreich Genexpression bewirken können. Jedoch integrieren Adenoviren ihr genetisches Material nicht in das Wirtsgenom und benötigen daher keine Wirtsreplikation für die Genexpression, was sie ideal geeignet für die schnelle, effiziente, heterologe Genexpression macht. Techniken zur Präparation von Replikations-infektiven Viren sind im Stand der Technik gut bekannt.
Natürlich wird man bei der Verwendung von viralen Zuführungssystemen wünschen, das Virion ausrechend zu reinigen, um es im wesentlichen frei von unerwünschten Kontaminanten zu machen, wie z.B. defektiven interferierenden viralen Partikeln oder Endotoxinen und anderen Pyrogenen, so dass es keine nachteiligen Reaktionen der Zelle, dem Tier oder dem Individuum verursachen wird, das Vektorkonstrukt erhält. Ein bevorzugtes Mittel zur Reinigung des Vektors schließt die Verwendung von schwimmen Dichtegradienten ein, wie z.B. Cäsiumchloridgradienten Zentrifugation.
Viren, die als Genvektoren verwendet werden, wie z.B. DNA-Viren können die Papovaviren (z.B. Simian Virus 40, Rinderpapillomavirus und Polyoma) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986) und Adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986) einschließen.
Eines der bevorzugten Verfahren für die in vivo Zuführung schließt die Verwendung eines Adenovirus-Expressionsvektors ein. Obwohl Adenovirusvektoren als eine geringe Kapazität für die Integration in genomische DNA aufweisend bekannt sind, wird diese Eigenschaft durch die hohe Effizienz des Gentransfers, der durch diese Vektoren bewirkt wird, ausbalanciert. „Adenovirus-Expressionsvektoren" soll diejenigen einschließen, dessen Konstrukte Adenovirus-Sequenzen enthalten, die ausreichend sind für (a) eine Unterstützung von Verpackung des Konstrukts (b) um eine Antisense-Polynukleotid zu exprimieren, das darin kloniert wurde.
Der Expressionsvektor umfaßt eine gentechnisch veränderte Form von Adenovirus. Die Kenntnis der genetischen Organisation von Adenovirus, einem 36 kb, linearen, doppelsträngigen DNA-Virus, ermöglicht die Substitution von großen Stücken von adenoviraler DNA durch fremde Sequenzen bis zum 7 kb (Grunhaus and Horwitz, 1992). Im Unterschied zu retroviraler Infektion führt die adenovirale Infektion von Wirtszellen nicht zur chromosomalen Integration, da adenovirale DNA auf eine espisomale Weise ohne potentielle Genotoxizität replizieren kann. Auch sind Adenoviren strukturell stabil und nach extensiver Amplifikation wurde kein genomisches Rearrangement gefunden. Adenovirus kann im wesentlichen alle Epithelzellen unabhängig von ihrer Zellzyklusphase infizieren. Bis jetzt scheint die adenovirale Infektion nur mit milden Erkrankungen, wie z.B. akuter respiratorischer Erkrankung in Menschen gekoppelt zu sein.
Adenovirus ist für die Verwendung als ein Gentransfervektor besonders geeignet, aufgrund seines mittel-großen Genoms, Einfachheit der Handhabung, hohen Titers, großen Zielzellbereichs und hoher Infektivität. Beide Enden des viralen Genoms enthalten 100–200 Basenpaare Inverted Repeats (ITRs), die cis-Elemente sind, die für die virale DNA-Replikation und Verpackung erforderlich sind. Die frühen (E) und späten (L) Regionen des Genoms enthalten verschiedenen Transkriptionseinheiten, die durch den Beginn der viralen Replikation getrennt sind. Die E1-Region (E1A und E1B) codiert für Proteine, die für die Regulation von Transkription des viralen Genoms und ein paar zellulären Genen verantwortlich sind. Die Expression der E2-Region (E2A und E2B) führt zur Synthese der Proteine für die virale DNA-Replikation. Diese Proteine sind an der DNA-Replikation, der späten Genexpression und den Wirtszell-Shut-off (Renan, 1990) beteiligt. Die Produkte der späten Gene, einschließlich der Hauptzahl der viralen Capsidproteine werden nur nach signifikantem Prozessieren eines einzelnen primären Transkripts, das durch den hauptsächlichen späten Promotor (MLP) herausgegeben wird, exprimiert. Der MLP (lokalisiert bei 16,8 m.u.) ist besonders während der späten Phase der Infektion effizient und alle die mRNAs, die von diesem Promotor ausgehen, besitzen eine 5'-Tripartitvorläufer (TPL) Sequenz, was sie zu bevorzugen mRNAs für die Translation macht.
In augenblicklich verwendeten System wird rekombinantes Adenovirus aus der homologen Rekombination zwischen Shuttlevektor und Provirusvektor erzeugt. Aufgrund der möglichen Rekombination zwischen zwei proviralen Vektoren kann Wild-Typ Adenovirus aus diesem Prozess erzeugt werden. Daher ist es kritisch, einen einzelnen Klon von Virus aus einem einzelnen Plaque zu isolieren und seine genomische Struktur zu untersuchen.
Die Erzeugung und Vervielfältigung von Adenovirusvektoren, die Replikations-defizient sind, hängt von einer einzigartigen Helferzellinie ab, als 293 bezeichnet, die aus menschlichen embryonalen Nierenzellen durch Ad5 DNA-Fragmente transformiert ist und konstitutiv E1-Proteine exprimiert (Graham et al., 1977). Da die E3-Region aus dem Adenovirusgenom entfernt werden kann (Jones and Shenk, 1978), tragen die augenblicklichen adenoviralen Vektoren, mit der Hilfe der 293-Zellen, fremde DNA der E1, der E3 oder der beiden Regionen (Graham and Prevec, 1991). In der Natur kann das Adenovirus ungefähr 105% des Wildtypgenoms verpacken (Ghosh-Choudhury et al., 1987), was eine Kapazität für ungefähr 2 kb extra DNA zur Verfügung stellt. Kombiniert mit den ungefähr 5,5 kb an DNA, die in den E1 und E3-Regionen ersetzbar ist, liegt die maximale Kapazität der augenblicklichen Adenovirusvektoren unter 7,5 kb oder ungefähr 15% der Gesamtlänge des Vektors. Mehr als 80% des adenoviralen Genoms verbleibt in dem Vektorrückgrad und ist die Quelle an Vektorvermittelter Zytotoxizität. Auch ist die Replikationsdefizienz des E1-delitierten Virus unvollständig. Z. B. wurde die Durchlässigkeit der viralen Genexpression mit den augenblicklich erhältlichen Vektoren bei hoher Vervielfältigung an Infektion (MOI) beobachtet (Mulligan, 1993).
Helferzellinien können von menschlichen Zellen wie z.B. menschlichen embryonalen Nierenzellen, Muskelzellen, hämatopoietischen Zellen oder anderen menschlichen embryonalen mesechymalen oder Epithelzellen abgeleitet sein. Alternativ können die Helferzellen von den Zellen von anderen Säugerspezies abgeleitet sein, die menschliches Adenovirus zulassen. Solche Zellen schließen z.B. Vero-Zellen oder andere Maus-embryonale, mesenchymale oder Epithelzellen ein. Wie diskutiert ist die bevorzugte Helferzellinie 293.
Kürzlich beschrieben Racher et al. (1992) verbesserte Verfahren zur Kultivierung von 293-Zellen und der Anzucht von Andenovirus. In einem Format werden natürliche Zellenaggregate durch Beimpfen von individuellen Zellen in ein Liter siliconisierten Spinnerflaschen (Techne, Cambridge, UK), enthaltend 100–200 ml Medium. Im Anschluss an Rühren bei 40 U/min, wird die Zellebensfähigkeit mit Trypanblau abgeschätzt. In einem andere Format werden Fibra-Zellmikroträger (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) wie folgt verwendet. Ein Zell-Innoculum, resuspendiert in 5 ml Medium, wird zu dem Träger (50 ml) in einer 250 ml Er lenmeyerflasche hinzugefügt und für 1 bis 4 Stunden stationär mit gelegentlichem Rühren stehengelassen. Das Medium wird dann durch 50 ml frisches Medium ersetzt und das Schütteln wird begonnen. Für die Virusproduktion wird es den Zellen erlaubt, bis auf ungefähr 80% Konfluenz zu wachsen, wobei zu dieser Zeit das Medium ersetzt wird (auf 25% des finalen Volumens) und Adenovirus bei einer MOI von 0,05 hinzugefügt wird. Die Kulturen werden über Nacht stationär belassen, woraufhin das Volumen auf 100% erhöht wird und das Schütteln für weitere 72 Stunden fortgeführt wird.
Außer dem Erfordernis, dass der Adenovirusvektor Replikations-defektiv oder zumindest konditionell defektiv ist, wird von der Art des Adenovirusvektors geglaubt, dass sie nicht für die erfolgreiche Durchführung der Erfindung wesentlich ist. Das Adenovirus kann von jeder der 42 verschiedenen bekannten Serotypen oder Subgruppen A–F sein. Adenovirus 5 unter Gruppe C ist das bevorzugte Ausgangsmaterial, um den konditionell Replikations-defektiven Adenovirusvektor zur Verwendung der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Dies liegt daran, dass Adenovirus Typ 5 ein menschliches Adenovirus ist, über das eine große Menge von biochemischer und genetischer Information bekannt ist und historisch für die meisten Konstruktionen verwendet wurde, die Adenovirus als einen Vektor verwenden.
Ein typischer Vektor, der zur Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar ist, ist Replikations-defektiv und wird keine Adenovirus E1-Region aufweisen. Daher wird es am bequemsten sein, das Polynukleotid, das für das UC41-Gen kodiert, an der Position einzufügen, aus der die E1-kodierenden Sequenzen entfernt wurden. Jedoch ist die Position der Insertion des Konstrukts innerhalb der Adenovirus-Sequenzen nicht kritisch. Das Polynukleotid, das für das UC41-Gen kodiert, kann auch im Hinblick auf die deletierte E3-Region in E3-Ersatzvektoren wie beschrieben von Karlsson et al., (1986) oder in die E4-Region eingeführt sein, wobei eine Helferzellinie oder ein Helfervirus den E4-Defekt komplementiert.
Adenovirus kann leicht angezogen werden und manipuliert werden und zeigt einen breiten Wirtsbereich in vitro und in vivo. Diese Gruppe von Viren kann in hohen Titern, z.B. 10⁹–10¹¹ Plaque-bildenden Einheiten pro ml, erhalten werden, und sie sind hoch-infektiv. Der Lebenszyklus von Adenovirus erfordert keine Integration in das Wirtszellgenom. Die durch adenovirale Vektoren zugeführten Fremdgene sind episomal und daher weisen sie eine geringe Genotoxizität gegenüber Wirtszellen auf. Keine Nebenwirkungen wurden in Untersuchungen der Beimpfung mit Wiltyp-Adenovirus berichtet (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), was deren Sicherheit und therapeutisches Potential als in vivo-Gentransfervektoren zeigt.
Adenovirusvektoren wurden in eukaryontischer Genexpression verwendet (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) und der Impfstoffentwicklung (Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1991). Kürzlich ließen Tierstudien vermuten, dass ein rekombinantes Adenovirus für die Gentherapie verwendet werden könnte (Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Untersuchungen zur Verabreichung von rekombinantem Adenovirus an verschiedene Gewebe schließen Atemwegs-Instillation (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), Muskelinjektion (Ragot et al., 1993), periphere intravenöse Injektionen (Herz and Gerard, 1993) und stereotaktische Beimpfung in das Gehirn (Le Gal La Salle et al., 1993) ein.
Andere Gentransfer-Vektoren können aus Retroviren konstruiert werden. Die Retroviren sind eine Gruppe von einzelsträngigen RNA-Viren, die durch eine Fähigkeit gekennzeichnet sind, ihre RNA in doppelsträngige DNA in infizierten Zellen durch einen Prozess der reversen Transkription zu überführen (Coffin, 1990). Die sich ergebende DNA integriert dann stabil in zelluläre Chromosomen als ein Provirus und steuert die Synthese von viralen Proteinen. Die Integration führt zur Aufrechterhaltung der viralen Gensequenzen in der Rezipientenzelle und ihren Nachkommen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene, gag, pol und env., die für jeweils Capsidproteine, Polymerase-Enzyme und Envelope-Komponenten kodieren. Eine Sequenz, die stromaufwärts von dem gag-Gen gefunden wurde, enthält ein Signal zur Verpackung des Genoms in Virionen. Zwei lange terminale Repeat(LTR)-Sequenzen sind an den 5'- und 3'-Enden des viralen Genoms vorhanden. Diese enthalten starke Promotor- und Enhancer-Sequenzen und sind auch für die Integration in das Wirtszellgenom erforderlich (Coffin, 1990).
Um einen retroviralen Vektor zu konstruieren wird eine Nukleinsäure, die für ein UC41-Gen kodiert, an der Stelle von bestimmten viralen Sequenzen in das virale Genom eingeführt, um ein Virus herzustellen, das Replikations-defektiv ist. Um Virionen herzustellen, wird eine Verpackungszelllinie, die die gag-, pol- und env-Gene enthält, jedoch ohne die LTR und Verpackungskomponenten, konstruiert (Mann et al., 1983). Wenn ein rekombinantes Plasmid, das eine cDNA enthält, zusammen mit der retroviralen LTR und den Verpackungssequenzen in diese Zelllinie eingeführt wird (durch zum Beispiel Calciumphosphat-Fällung), ermöglicht es die Verpackungssequenz dem RNA-Transkript des rekombinanten Plasmids, in virale Partikel verpackt zu werden, die dann in das Kulturmedium sekretiert werden (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Das Medium, das die rekombinanten Retroviren enthält, wird dann gesammelt, gegebenenfalls konzentriert und für den Gentransfer verwendet. Retrovirale Vektoren sind in der Lage, eine große Vielzahl von Zelltypen zu infizieren. Jedoch erfordert die Integration und stabile Expression die Teilung von Wirtszellen (Paskind et al., 1975).
Ein neuer Ansatz, der so aufgebaut wurde, um das spezifische Abzielen von Retrovirus-Vektoren zu ermöglichen, wurde kürzlich basierend auf der chemischen Modifikation eines Retrovirus durch die chemische Hinzufügung von Laktoseresten zum viralen Envelope entwickelt. Diese Modifikation könnte die spezifische Infektion von Hepatozyten über Sialoglykoprotein-Rezeptoren ermöglichen.
Ein unterschiedlicher Ansatz, um rekombinante Retroviren abzuzielen, wurde entwickelt, indem biotinylierte Antikörper gegen ein retrovirales Envelope-Protein und gegen einen spezifischen Zellrezeptor verwendet wurden. Die Antikörper wurden über die Biotin-Komponenten unter der Verwendung von Streptavidin gekoppelt (Roux et al., 1989). Unter der Verwendung von Antikörpern gegen Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Klasse I-und-Klasse II-Antigene wurde die Infektion einer Vielzahl von menschlichen Zellen, die diese Oberflächen-Antigene tragen, mit einem ecotrophischen Virus in vitro gezeigt (Roux et al., 1989).
Es gibt bestimmte Begrenzungen für die Verwendung von Retrovirus-Vektoren. Zum Beispiel integrieren Retrovirusvektoren gewöhnlicherweise an zufällige Stellen in das Zellgenom. Dies kann zu insertioneller Mutagenese durch die Unterbrechung von Wirtsgenen oder durch die Insertion von viralen regulatorischen Sequenzen führen, was mit der Funktion der flankierenden Gene interferieren kann (Varmus et al., 1981). Eine andere Sorge mit der Verwendung von defektiven Retrovirusvektoren ist das potentielle Auftreten von Wildtyp-Replikationskompetentem Virus in den Verpackungszellen. Dies kann aus Rekombinationsereignissen resultieren, in denen die intakte Sequenz aus dem rekombinanten Virus-Insert stromaufwärts der gag-, pol-, env-Sequenz in das Wirtszellgenom integriert. Jedoch sind jetzt neue Verpackungszellinien erhältlich, die die Wahrscheinlichkeit an Rekombination stark verringern sollten (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).
Andere virale Vektoren können als Expressionskonstrukte verwendet werden. Vektoren, abgeleitet von Viren wie zum Beispiel Vakziniavirus (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), Adeno-assoziiertem Virus (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984) und Herpesvirus können verwendet werden. Diese bieten mehrere attraktive Merkmale für bestimmte Säugetierzellen (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988, Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
Mit der kürzlichen Erkennung von defektiven Hepatitis-B-Viren wurden neue Einsichten gewonnen, in den Struktur-Funktions-Zusammenhang von verschiedenen viralen Sequenzen. In vitro-Untersuchungen zeigten, dass das Virus die Fähigkeit für Helfer-abhängige Verpackung und reverse Transkription beibehalten konnte, trotz der Deletion von bis zu 80% seines Genoms (Horwich et al., 1990). Dies lässt vermuten, dass große Teile des Genoms durch fremdes genetisches Material ersetzt werden können. Die Hepatotropie und Persistenz (Integration) sind besonders attraktive Eigenschaften für Leber-gerichteten Gentransfer. Chang et al. (1991) führten kürzlich das Chloramphenicol-Acetyltransferase(CAT)-Gen in Enten-Hepatitis-B-Virusgenom anstelle der Polymerase-, Oberfläche- und Prä-Oberflächekodierenden Sequenzen ein. Es wurde mit Wildtypvirus in eine Vogel-Hepatomzellinie cotransfiziert. Kulturmedien, die hohe Titer des rekombinanten Virus enthielten, wurden dazu verwendet, um primäre Entenküken-Hepatozyten zu infizieren. Stabile CAT-Genexpression wurde für mindestens 24 Tage nach Transfektion nachgewiesen (Chang et al., 1991).
Um die Expression von Sense- oder Antisense-Genkonstrukten zu bewirken, muss das Expressionskonstrukt in eine Zelle zugeführt werden. Diese Zuführung kann in vitro erreicht werden, wie zum Beispiel in Laborverfahren zur Transformation von Zelllinien, oder in vivo oder ex vivo wie bei der Behandlung von bestimmten Erkrankungszuständen. Ein Mechanismus zur Zuführung ist über virale Infektion, wobei das Expressionskonstrukt in einem infektiösen viralen Partikel eingekapselt wird.
4.8.5 Nicht-virale Verfahren
Verschiedene nicht-virale Verfahren für den Transfer von Expressionskonstrukten in kultivierte Säugerzellen werden auch durch die vorliegende Erfindung vorgesehen. Diese schließen Calciumphosphat-Fällung (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-Dextran (Gopal, 1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), direkte Mikroinjektion (Harland and Weintraub, 1985), DNA-beladene Liposomen (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979) und Lipofektamin-DNA-Komplexe, Zellbeschallung (Fechheimer et al., 1987), Genbombardierung unter der Verwendung von Mikroprojektilen mit hoher Geschwindigkeit (Yang et al., 1990) und Rezeptor-vermittelte Transfektion (Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988) ein. Einige dieser Techniken können erfolgreich für die in vivo- oder ex vivo-Verwendung angepasst werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Expressionskonstrukt einfach aus nacktem rekombinantem Vektor bestehen. Der Transfer des Konstrukts kann durch jedes der oben erwähnten Verfahren durchgeführt werden, das physikalisch oder chemisch die Zellmembran permeabilisiert. Zum Beispiel injizierten Dubensky et al. (1984) erfolgreich Polyomavirus-DNA in der Form von CaPO₄-Prezipitaten in Leber und Milz von adulten und neugeborenen Mäusen, wobei aktive virale Replikation und akute Infektion gezeigt wurde. Benvenistry und Neshif (1986) zeigten auch, dass die direkte intraperitoneale Injektion von CaPO4-gefällten Plasmiden zu einer Expression der transfizierten Gene führt. Es wird vorhergesehen, dass die DNA, die für ein Antisense-UC41-Konstrukt kodiert, auch auf eine ähnliche Weise in vivo transferiert werden kann.
Sobald das Expressionskonstrukt in die Zelle zugeführt wurde, kann die Nukleinsäure, die für das UC41-Gen kodiert, an verschiedenen Stellen positioniert und exprimiert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann die Nukleinsäure, die für das Gen kodiert, stabil in das Genom der Zelle integriert werden. Diese Integration kann an der kognaten Stelle und Orientierung über homologe Rekombination (Genersatz) vorliegen oder es kann an einer zufälligen, nicht-spezifischen Stelle (Genergänzung) integriert werden. In noch weiteren Ausführungsformen kann die Nukleinsäure stabil in der Zelle als ein getrenntes episomales Segment an DNA beibehalten werden. Solche Nukleinsäuresegmente oder „Episomen" kodieren für Sequenzen, die ausreichend sind, um die Aufrechterhaltung und Replikation unabhängig von oder in Synchronisation mit dem Wirtszellzyklus zu ermöglichen. Wie das Expressionskonstrukt an eine Zelle zugeführt wird und wo in der Zelle die Nukleinsäure verbleibt, ist von dem Typ von verwendetem Expressionskonstrukt abhängig.
4.8.6 Pharmazeutische Zusammensetzungen und Routen der Verabreichung
Wo eine klinische Anwendung von Liposomen, die Antisense-Oligo- oder Polynukleotide oder Expressionsvektoren enthalten, unternommen wird, wird es erforderlich sein, den Liposomenkomplex als eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen, die für die vorgesehene Anwendung geeignet ist. Im Allgemeinen wird dies die Präparation einer pharmazeutischen Zusammensetzung einschließen, die im Wesentlichen frei von Pyrogenen ist, sowie von anderen Verunreinigungen, die für Menschen oder Tiere schädlich sein könnten. Man wird auch im Allgemeinen wünschen, geeignete Puffer zu verwenden, um den Komplex stabil zu machen und die Aufnahme durch Zielzellen zu ermöglichen.
Wässrige Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine effektive Menge des Antisense-Expressionsvektors, der in ein Liposom wie oben diskutiert eingekapselt ist, das weiter in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder wässrigem Medium dispergiert ist. Solche Zusammensetzungen werden auch als inokular bezeichnet. Die Ausdrücke „pharmazeutisch oder pharmakologisch akzeptabel" betreffen Zusammensetzungen, die nicht eine adverse, allergische oder andere nachteilige Reaktion produzieren, wenn an ein Tier oder einen Menschen verabreicht, wie geeignet.
Wie hier verwendet schließt „pharmazeutisch akzeptabler Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und antifungizide Mittel, isotonische und Absorptions-verzögernde Mittel und Ähnliches ein. Die Verwendung von solchen Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik gut bekannt. Mit der Ausnahme, in soweit, dass jedes herkömmliche Medium oder Mittel mit dem aktiven Inhaltsstoff inkompatibel ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen vorgesehen. Ergänzende aktive Inhaltsstoffe können auch in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden.
Lösungen von therapeutischen Zusammensetzungen können in Wasser, geeignet gemischt mit einem Oberflächen-aktiven Mittel, wie zum Beispiel Hydroxypropylzellulose, präpariert werden. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen, Mischungen davon und in Ölen präpariert werden. Unter gewöhnlichen Bedingungen von Lagerung und Verwendung enthalten diese Präparationen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden vorteilhafterweise in Form von injizierbaren Zusammensetzungen verabreicht, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, die zur Lösung in oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind können auch präpariert werden. Diese Präparationen können auch emulgiert werden. Eine typische Zusammensetzung für solch einen Zweck umfaßt einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung 10 mg, 25 mg, 50 mg oder bis zu ungefähr 100 mg von menschlichem Serum-Albumin pro Milliliter von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung enthalten. Andere pharmazeutisch akzeptable Träger schließen wässrige Lösungen, nicht-toxische Hilfsstoffe, einschließlich Salze, Konservierungsmittel, Puffer und Ähnliches ein.
Beispiele von nicht-wässrigen Lösungsmitteln sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöl und injizierbare organische Ester, wie zum Beispiel Ethyloleat. Wässrige Träger schließen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Kochsalzlösungen, parenterale Vehikel, wie zum Beispiel Natriumchlorid, Ringers Dextrose, usw. ein. Intravenöse Vehikel schließen flüssige und Nährstoff-ergänzende Mittel ein. Konservierungsmittel schließen antimikrobielle Mittel, Antioxidantien, Chelatbildner und inerte Gase ein. Der pH und die genaue Konzentration der verschiedenen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung werden gemäß gut bekannten Parametern eingestellt.
Eine effektive Menge der therapeutischen Zusammensetzung wird basierend auf dem beabsichtigten Ziel bestimmt. Der Ausdruck „Einheitsdosis" oder „Dosierung" betrifft physikalisch getrennte Einheiten, die zur Verwendung in einem Subjekt geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der therapeutischen Zusammensetzung enthält, so berechnet, um die oben diskutierten erwünschten Antworten in Zusammenhang mit seiner Verabreichung, d.h. der geeigneten Route und dem Behandlungsschema, zu produzieren. Die zu verabreichende Menge, sowohl hinsichtlich der Zahl von Behandlungen und der Einheitsdosis, hängt von dem gewünschten Schutz ab.
Die genauen Mengen der therapeutischen Zusammensetzung hängen auch von der Abschätzung des behandelnden Arztes ab und sind für jedes Individuum besonders. Faktoren, die die Dosis beeinflussen, schließen physikalischen und chemischen Zustand des Patienten, die Verabreichungsroute und das Potential, die Stabilität und Toxizität der bestimmten therapeutischen Substanz ein. Für die vorliegende Anwendung wird es vorhergesehen, dass die Menge von therapeutischer Zusammensetzung, die eine Einheitsdosis umfaßt, von ungefähr 5–30 mg an Polynukleotid reichen wird.
4.9 Verfahren zur Behandlung von UC41-zusammenhängenden Malignitäten
Die vorliegende Erfindung sieht in einer anderen Ausführungsform auch die Behandlung von Prostatakrebs vor. Die Typen von Krebs, die verhandelt werden können, gemäß der vorliegenden Erfindung, sind nur durch die Beteiligung von UC41 begrenzt. Mit Beteiligung ist gemeint, dass es nicht einmal ein Erfordernis ist, dass UC41 mutiert oder abnormal ist – die Überexpression oder Unterexpression der durch dieses Gen kodierten Protein(e) kann ein primärer Faktor in der Entwicklung von Prostatakrebs sein. Daher ist es vorgesehen, dass Tumore behandelt werden können unter der Verwendung von Antisense- oder Expressionstherapie, die auf das UC41-Genprodukt(e) ausgerichtet ist.
In vielen Zusammenhängen ist es nicht erforderlich, dass die Tumorzelle getötet wird oder so induziert wird, um normalen Zelltod oder „Apoptose" zu durchlaufen. Eher ist alles, was für eine wirksame Therapie zu erreichen ist, dass das Tumorwachstum in einigem Ausmaß verlangsamt wird. Es kann jedoch so sein, dass das Tumorwachstum vollständig blockiert wird, oder dass einige Tumorregression erreicht wird. Die klinische Terminologie, wie zum Beispiel „Remission" und „Verringerung von Tumor"-Last sind auch vorgesehen, ihre normale Verwendung gegeben.
4.9.1 Genetisch basierte Therapien
Eine der therapeutischen Ausführungsformen, die durch die vorliegenden Erfinder vorgesehen ist, ist die Intervention auf der molekularen Ebene in den Ereignissen, die an der Tumorgenese einiger Krebsarten beteiligt sind. Genauer beabsichtigen die vorliegenden Erfinder, ein Antisense-Konstrukt für eine Krebszelle zur Verfügung zu stellen, das in der Lage ist, die Expression von UC41 in dieser Zelle zu inhibieren. Besonders bevorzugte Expressionsvektoren sind virale Vektoren, wie zum Beispiel Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus, Vakziniavirus und Retrovirus. Auch bevorzugt ist ein Liposomal-verkapselter Expressionsvektor.
Die Fachleute im Stand der Technik wissen gut, wie eine Genzuführung in in vivo- und ex vivo-Situationen anzuwenden ist. Für virale Vektoren wird man im Allgemeinen einen viralen Vektorvorrat präparieren. In Anhängigkeit von der Art des Virus und dem erreichbaren Titer wird man zwischen ungefähr 1 × 10⁴ und 1 × 10¹² infektiöse Partikel an den Patienten zuführen. Ähnliche Werte können für liposomale oder andere nicht-virale Formulierungen durch den Vergleich von relativen Aufnahmeeffizienzen extrapoliert werden. Die Formulierung als eine pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung ist im Folgenden beschrieben.
Verschiedene Routen sind für verschiedene Tumortypen vorgesehen. Der folgende Teil betreffend Routen enthält eine ausführliche Liste von möglichen Routen. Für praktisch jeden Tumor wird die systemische Zuführung vorgesehen. Dies wird sich als insbesondere wichtig zum Angreifen von mikroskopischem oder metastatischem Krebs erweisen. Wo eine diskrete Tumormasse identifiziert werden kann, kann eine Auswahl von direkten, lokalen und regionalen Ansätzen unternommen werden. Zum Beispiel kann der Tumor direkt mit dem Expressionsvektor injiziert werden. Eine Tumorstelle kann vor, während oder nach der Resektion behandelt werden. Im Anschluss an die Resektion wird man im Allgemeinen den Vektor durch einen Katheter zuführen, der im Anschluss an die Chirurgie an der Stelle belassen wurde. Man kann die Tumor-Vaskulatur verwenden, um den Vektor in den Tumor durch Injektion einer versorgenden Vene oder Arterie verwenden. Eine weiter entfernte Blutzuführungsroute kann auch verwendet werden.
In einer unterschiedlichen Ausführungsform wird die ex vivo-Gentherapie vorgesehen. Dieser Ansatz ist besonders geeignet für, obwohl nicht beschränkt auf, die Behandlung von Knochenmarks-assoziierten Krebsarten. In einer ex vivo-Ausführungsform werden Zellen aus dem Patienten entfernt und außerhalb des Körpers für mindestens einige Zeitdauer behalten. Während dieser Zeitdauer wird eine Therapie zugeführt, nach der die Zellen in den Patienten wiedereingeführt werden. Bevorzugterweise wurden jegliche Tumorzellen in der Probe abgetötet.
4.9.2 Immuntherapien
Immuntherapeutika beruhen im Allgemeinen auf der Verwendung von Immun-Effektorzellen und Molekülen, um auf Krebszellen abzuzielen und diese zu zerstören. Der Immun-Effektor kann zum Beispiel ein Antikörper sein, der für einige Marker auf der Oberfläche einer Tumorzelle spezifisch ist. Der Antikörper allein kann als ein Effektor der Therapie dienen oder er kann andere Zellen rekrutieren, um die eigentliche Zellabtötung zu bewirken. Der Antikörper kann auch an einen Wirkstoff oder Toxin konjugiert sein (chemotherapeutisch, Radionuklid, Ricin-A-Kette, Choleratoxin, Pertussistoxin, usw.) und lediglich als ein abzielendes Mittel dienen. Alternativ kann der Effektor ein Lymphozyt sein, der ein Oberflächenmolekül trägt, das entweder direkt oder indirekt mit einem Tumorzellziel interagiert. Verschiedene Effektorzellen schließen cytotoxische T-Zellen und NK-Zellen ein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann natives oder Wildtyp-UC41 ein Ziel für einen Immun-Effektor sein. Es ist möglich, auf UC41 durch Immuntherapie abzuzielen, entweder unter der Verwendung von Antikörpern, Antikörper-Konjugaten oder Immun-Effektorzellen.
Alternativ könnte die Immuntherapie als ein Teil einer kombinierten Therapie in Konjunktion mit UC41-abgezielter Gentherapie verwendet werden. Der allgemeine Ansatz für die kombinierte Therapie wird unten diskutiert. Im Allgemeinen muss die Tumorzelle einen Marker tragen, der für das Abzielen geeignet ist, d.h. nicht auf der Hauptzahl von anderen Zellen vorhanden ist. Es existieren viele Tumormarker und jeder dieser kann zum Abzielen im Kontext der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Herkömmliche Tumormarker schließen karzinoembryonales Antigen, Prostata-spezifisches Antigen, urinäres Tumor-assoziiertes Antigen, fötales Antigen, Tyrosinase (p97), gp68, Tag-72, HMFG, Sialyl-Lewis-Antigen, MucA, MucB, PLAP, Estrogenrezeptor, Lamininrezeptor, erb B und p155 ein.
4.9.3 Kombinierte Therapie mit Immuntherapie, Chemotherapie oder Radiotherapie
Die Tumorzellresistenz gegenüber DNA-beschädigenden Mitteln stellt ein hauptsächliches Problem in der klinischen Onkologie dar. Ein Ziel der augenblicklichen Krebsforschung ist es, Wege zu finden, die Effizienz von Chemo- und Radiotherapie zu verbessern. Ein Weg ist durch Kombinieren solcher traditioneller Therapien mit Gentherapie. Zum Beispiel induzierte das Herpes-Simplex-Thymidinkinase-(HS-tk)-Gen, wenn zu Hirntumoren durch ein retrovirales Vektorsystem zugeführt, erfolgreich die Empfindlichkeit gegenüber dem antiviralen Mittel Ganciclovir (Culver et al., 1992). Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, dass die UC41-Gentherapie auf ähnliche Weise in Konjunktion mit chemo- oder radiotherapeutischer Intervention verwendet werden könnte.
Um Zellen abzutöten, das Zellwachstum zu inhibieren, Metastasierung zu inhibieren, die Angiogenese zu inhibieren oder auf andere Weise den malignen Phänotyp von Tumorzellen zu regatieren oder zu verringern, unter der Verwendung der Verfahren und Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, würde man im allgemeinen „Ziel"-Zelle mit einem Antisense-Konstrukt von UC41 und mindestens einem weiteren Mittel in Kontakt bringen. Diese Zusammensetzungen würden in einer kombinierten Menge zur Verfügung gestellt werden, die effektiv ist, um die Zelle abzutöten, oder die Zellteilung zu inhibieren. Dieses Verfahren kann ein In-Kontakt-Bringen der Zellen mit dem Antisense-Konstrukt und dem Mittel(n) oder Faktor(en) zur selben Zeit einschließen. Dies kann durch In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer einzigen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung die beide Mittel enthält, erreicht werden, oder durch In-Kontakt-Bringen der Zellen gleichzeitig mit zwei Zusammensetzungen oder Formulierungen, wobei eine Zusammensetzung das Antisense- oder Expressionskonstrukt und das andere das Mittel enthält.
Alternativ kann die Gentherapiebehandlung vor oder im Anschluss an die Behandlung mit dem anderen Mittel mit Intervallen, die von Minuten bis Wochen reichen, sein. In Ausführungsformen, wo das andere Mittel und Expressionskonstrukt getrennt zu der Zelle zugeführt werden, würde man im allgemeinen sicherstellen, dass keine signifikante Zeitdauer zwischen der Zeit jeder Zuführung abgelaufen ist, so dass das Mittel und Expressionskonstrukt immer noch in der Lage wären, einen vorteilhaften kombinierten (z.B. synergistischen) Effekt auf die Zelle auszuüben. In solchen Fällen ist es vorgesehen, dass man die Zelle mit beiden Modalitäten innerhalb ungefähr 12–24 Stunden voneinander in Kontakt bringt und, weiter bevorzugt, innerhalb von 6–12 Stunden voneinander, wobei eine Verzögerungszeit von nur ungefähr 12 Stunden am meisten bevorzugt ist. In einigen Situationen kann es wünschenswert sein, die Dauer der Behandlung mit nur dem therapeutischen Mittel signifikant zu verlängern, z.B. wo mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis mehrere Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) zwischen den jeweiligen Verabreichungen verstreichen.
Es ist auch denkbar, dass mehr als eine Verabreichung von entweder UC41-Antisenskonstrukt oder dem anderen Mittel gewünscht werden. Verschiedene Kombinationen können angewendet werden, wobei UC41 „A" ist und das andere Mittel „B" ist, wie unten beispielhaft dargestellt.
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
Um Zellabtötung zu erreichen, werden beide Mittel in einer kombinierten Menge zu einer Zelle zugeführt, die effektiv ist, um die Zelle abzutöten.
Mittel oder Faktoren, die zur Verwendung mit einer kombinierten Therapie brauchbar sind, sind jede chemische Verbindung oder Behandlungsverfahren, das DNA-Beschädigung induziert, wenn auf eine Zelle angewendet. Solche Mittel und Faktoren schließen Bestrahlung und Wellen ein, die DNA-Beschädigung induzieren, wie z.B. γ-Bestrahlung, Röntgenstrahlen, UV-Bestrahlung, Mikrowellen, elektrische Ladungen und ähnliches. Eine Vielzahl von chemischen Verbindungen, auch als „chemotherapeutische Mittel" beschrieben, funktionieren, DNA-Beschädigung zu induzieren, die alle als zur Verwendung in den hier beschriebenen kombinierten Behandlungsverfahren brauchbar vorgesehen sind. Chemotherapeutische Mittel, die als brauchbar angesehen werden schließen z.B. Adriamycin, 5-Fluorouracil (5FU), Etopsid (VP-16), Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C, Cisplatin (CDDP) und sogar Wasserstoffperoxyd ein. Die Erfindung umfaßt auch die Kombination von einem oder mehreren DNA-beschädigenden Mitteln, ob Strahlungs-basiert oder echte Verbindungen, wie z.B. die Verwendung von Röntgenstrahlen mit Cisplatin oder die Verwendung von Cisplatin mit Etoposid.
Bei der Behandlung von Krebs gemäß der Erfindung würde man die Tumorzellen mit einem Mittel in Kontakt bringen, zusätzlich zu dem Antisense-Konstrukt. Dies kann durch Bestrahlen der lokalen Tumorstelle mit Bestrahlung, wie z.B. Röntgenstrahlen, UV-Licht, γ-Strahlen oder sogar Mikrowellen erreicht werden. Alternativ können die Tumorzellen mit dem Mittel durch Verabreichen an das Subjekt einer therapeutisch effektiven Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend eine Verbindung wie z.B. Adriamycin, 5-Fluorouracil, Etoposid, Camptothecin, Actinomycin-D oder Mitomycin C in Kontakt gebracht werden. Das Mittel kann präpariert werden und verwendet werden als eine kombinierte therapeutische Zusammensetzung oder Kit durch Kombinieren dessen mit einem UC41-Antisenskonstrukt, wie oben beschrieben.
Mittel, die direkt Nukleinsäuren kreuzvernetzen, spezifisch DNA, sind als die DNA-Beschädigung beschleunigend vorgesehen, was zu einer synergistischen, antineoplastischen Kombination mit UC41 führt. Mittel, wie z.B. Cisplatin, und andere DNA-alkylierende Mittel können verwendet werden.
Mittel, die DNA beschädigen schließen auch Verbindung ein, die mit der DNA-Replikation, Mitose und chromosomaler Segregation interferieren. Solche chemotherapeutische Verbindungen schließen Adriamycin, auch als Doxorubicin, Etoposid, Verapamil, Podophyllotoxin und ähnliches ein. In einem klinischen Ansatz zur Behandlung von Neoplasmen weit verwendet, werden diese Verbindungen intravenös durch Bolusinjektion bei Dosen, die von 25–75 mg/m² bei 21 Tage-Intervallen für Adriamycin, bis 35–50 mg/m² für Etoposid intravenös oder das zweifache der intravenösen Dosis oral verabreicht.
Mittel, die Synthese und Genauigkeit von Nukleinsäurevorläufern und Untereinheiten unterbrechen, führen auch zu DNA-Beschädigung. Eine Zahl von Nukleinsäurevorläufern wurde zu diesem Zweck entwickeln. Insbesondere brauchbar sind Mittel, die intensiven Tests unterzogen wurden und leicht erhältlich sind, wie z.B. 5-Fluoruracil (5-FU). Obwohl relativ giftig ist 5-FU in einem großen Bereich von Trägern anwendbar, einschließlich topikal. Jedoch wird herkömmlich die intravenöse Verabreichung verwendet, wobei Dosen von 3 bis 15 mg/kg/Tag reichen.
Andere Faktoren, die eine DNA-Beschädigung verursachen und extensiv verwendet wurden, schließen γ-Strahlen, Röntgenstrahlen und/oder die direkte Zufuhr von Radioisotopen an Tumorzellen ein. Andere Formen von DNA beschädigenden Faktoren sind auch vorgesehen, wie z.B. Mikrowellen und UV-Bestrahlung. Es ist sehr wahrscheinlich, dass alle diese Faktoren einen weiten Bereich von Beschädigung von DNA bewirken, auf den Vorläufern von DNA, die Replikation und Reparatur von DNA und dem Zusammenbau und der Aufrechterhaltung von Chromosomen. Dosierungsbereiche für Röntgenstrahlen reichen von täglichen Dosen von 50–200 Röntgen für verlängerte Zeitdauer (3 bis 4 Wochen) zu Einzeldosen von 2000 bis 6000 Röntgen. Die Dosierungsbereiche für Radioisotope variieren breit und hängen von der Halbwertszeit der Isotope, der Stärke und der Art der imitierten Strahlung und der Aufnahme durch die neoplastischen Zellen ab.
Der Fachmann wird auf „Remington's Pharmazeutical Sciences" 15. Auflage, Kapitel 33, und insbesondere auf Seiten 624–652 hingewiesen. Einige Variationen in der Dosierung wird erforderlicherweise auftreten, in Abhängigkeit des Zustands des Subjekts, das behandelt wird.
Die für die Verabreichung verantwortliche Person wird in jedem Fall die geeignete Dosis für das einzelne Subjekt bestimmten. Darüber hinaus sollten für die menschliche Verabreichung die Präparationen die Sterilitäts-, Pyrogenizitäts- und allgemeinen Sicherheits- und Einheitsstandards, wie durch das FDA Office of Biologics standards erforderlich, erfüllen.
Die Erfinder schlagen vor, dass die regionale Zufuhr von UC41-Antisenskonstrukten an Patienten mit Prostatakrebs ein sehr effizientes Verfahren zur Zufuhr eines therapeutisch effektiven Gens sein wird, um der klinischen Erkrankung entgegenzuwirken. Ähnlich kann die Chemo- und Radiotherapie gegen eine bestimmte beeinträchtige Region des Körpers des Subjekts gerichtet werden. Alternativ kann die systemische Zufuhr von Expressionskonstrukt und/oder dem Mittel in bestimmten Umständen geeignet sein, z.B., wo extensive Metastasierung aufgetreten ist.
Zusätzlich zu Kombinieren von UC41-abgezielten Therapien mit Chemo- und Radiotherapien ist es auch vorgesehen, dass die Kombination mit anderen Gentherapien vorteilhaft sein wird. Z.B. kann das gleichzeitige Abzielen von Therapien, die gegen UC41 und p53 gerichtet sind, eine verbesserte Anti-Krebsbehandlung produzieren. Jedes andere denkbare Tumorzusammenhängende Gen kann auf diese Weise abgezielt werden, z.B. p21, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, p16, FHIT, WT-1, MEN-I, MEN-II, VHL, FCC, MCC, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, fun, trk, ret, gsp, hst, bcl und abl.
4.9.4 Screenen auf Modulatoren von UC41
Zellen, die eine erhöhte UC41-Expression zeigen, können gescreent werden, um Effektoren der UC41-Expression zu identifizieren. Daher werden innerhalb bestimmter Ausführungsformen der Erfindung Verfahren zur Verfügung gestellt zum Screenen auf Modulatoren von UC41-Expression. Umgekehrt kann die UC41-Expression durch Northern-Blot oder Slot-Blot-Analyse des RNA-Produkts des Gens, Western-Blot-Analyse des Proteinprodukts es Gens oder durch andere wie hier beschriebene Standardverfahren untersucht werden. Verbindungen, die die UC41-Expression modulieren, können durch ihren Effekt auf die Mengen dieser RNA oder Proteinprodukte, die in einer bestimmten Zellinie oder Gewebeprobe vorhanden sind, nachgewiesen werden.
Screeningverfahren können die Zielzellen als adhärente Zellen auf einer Kulturschale, als Teil einer Alginat-Biomatrix, in Suspensionskultur oder in jeder anderen Form verwenden, die es ermöglicht, die Expression des Polypeptids oder der Nukleinsäure zu verfolgen. Diese Zellen können dann als Reagenzien verwendet werden, um Bibliotheken von kleinen Molekülen und Peptiden zu screenen, um Modulatoren der UC41-Funktion zu identifizieren. Die Regulation der Expression kann zu jeder Phase in der Synthese und der Freisetzung eines Nukleotids oder Polypeptids auftreten, einschließlich der Gentranskription; der Stabilität der mRNAs; Translation; post-translationale Modifikationen, wie z.B. proteolytisches Prozessieren, die Bildung von Disulfidbrücken, Amidierung und Glykolisierung; und die sub-zelluläre Lokalisierung. Screeningverfahren werden die Expression dieser Genprodukte in der Abwesenheit der Kandidatensubstanz überwachen und solche Ergebnisse mit den in der Anwesenheit von Kandidatensubstanzen durchgeführten Tests vergleichen.
Es ist vorgesehen, dass diejenige Screeningtechnik sich bei der allgemeinen Identifizierung einer Verbindung brauchbar erweisen wird, die dem Zweck der Verringerung, Inhibierung oder auf andere Weise Einstellung der Expression von UC41 dienen wird. Solche Verbindungen werden bei der Behandlung von Prostatakrebs brauchbar sein. In diesen Ausführungsformen ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit einer Kandidatensubstanz gerichtet, die UC41-Expression zu inhibieren. Dieses Verfahren schließt im allgemeinen die Schritte ein von:

(a) Zur-Verfügung-Stellen mindestens einer UC41-exprimierenden Zelle;
(b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit der Kandidaten-Substanz;
(c) Messen des Spiegels an UC41-Expression in der Zelle; und
(d) Vergleichen der UC41-Expression der Zelle in Schritt (c) mit der UC41-Expression der Zelle von Schritt (a).

Um eine Kandidaten-Substanz als in der Lage befindlich zu identifizieren, die UC41-Expression in dem oben genannten Test zu inhibieren, würde man die Spiegel von UC41-Expression in einer geeigneten Zellinie messen oder bestimmten, in der Abwesenheit der hinzugefügten Kandidaten-Substanz. Man würde dann die Kandidaten-Substanz zu der Zelle hinzufügen und den Spiegel der UC41-Expression in der Anwesenheit der Kandidaten-Substanz bestimmten. Eine Kandidaten-Substanz, die die UC41-Expression relativ zu dem Expressionsspiegel in seiner Abwesenheit verringert, zeigt eine Kandidaten regulatorische Substanz für die UC41-Expression an.
Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck „Kandidatensubstanz" jedes Molekül, das in der Lage ist, die UC41-Expression zu modulieren. Die Kandidatensubstanz kann ein Protein oder Fragment davon, ein kleiner Molekülinhibitor oder sogar ein Nukleinsäuremolekül sein. Es kann sich als der Fall erweisen, dass die am meisten pharmakologischen Verbindung zur Identifizierung durch die Anwendung des Screeningverfahrens Verbindungen sein werden, die strukturell mit anderen bekannten Modulatoren der Expression verwandt sind. Die aktiven Verbindungen können Fragmente oder Teile von natürlich-auftretenden Verbindungen einschließen oder können nur als aktive Kombinationen von bekannten Verbindungen gefunden werden, die sonst inaktiv sind. Jedoch wird es vor dem Testen von solchen Verbindungen an Menschen oder Tiermodellen erforderlich sein, eine Auswahl von Kandidaten zu testen, um diejenigen zu bestimmen, die Potential aufweisen.
Demzufolge können die aktiven Verbindungen Fragmente oder Teile von natürlichauftretenden Verbindungen einschließen oder können nur als aktive Kombinationen von bekannten Verbindungen gefunden werden, die sonst inaktiv sind. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung Screeningtests zur Verfügung, um Mittel zum Identifizieren, die die zelluläre UC41-Expression stimulieren oder inhibieren, es ist vorgeschlagen, dass Verbindungen, die aus natürlichen Quellen isoliert wurden, wie z.B. Tieren, Bakterien, Pilzen, Pflanzenquellen, einschließlich Blättern und Rinde und Marinenproben als Kandidaten auf die Anwesenheit von offiziell brauchbaren pharmazeutischen Mitteln getestet werden. Es wird verstanden werden, dass die zu screenenden pharmazeutischen Mitteln von chemischen Zusammensetzungen oder menschlich-hergestellten Verbindungen abgeleitet oder synthetisiert werden können. Daher wird verstanden, dass die durch die vorliegende Erfindung identifizierte Kandidatensubstanz ein Polypeptid, Polynukleotid, kleine Molekülinhibitoren oder jede andere Verbindung sein kann, die durch rationales Drug Design aufgebaut werden kann, dass von bekannten Regulatoren der Gen-Expression ausgeht, sowie von bekannten Mitteln für die therapeutische Behandlung von Prostatakrebs.
Die Kandidaten-Screening-Assays sind einfach aufzubauen und durchzuführen. Daher wird man beim Testen auf eine Kandidaten-UC41-regulatorische Verbindung, nach Erhalt einer UC41-exprimierenden Zellinie, eine Kandidatensubstanz mit der Zelle mischen, unter Bedingungen, die das Auftreten einer messbaren Expression ermöglichen würden.
„Effektive Mengen" sind in bestimmten Ausführungsformen diejenigen Mengen, die effektiv sind, um reproduzierbar die Expression von der Zelle im Vergleich zu ihren normalen Spiegeln zu stimulieren. Verbindungen, die signifikante geeignete Veränderungen in der UC41-Expression erreichen, werden verwendet werden.
Signifikante Veränderungen in der UC41-Expression sind durch eine Abnahme in der Expression von mindestens ungefähr 30%–40% dargestellt und am meisten bevorzugt durch Abnahmen von ungefähr 50%, wobei höhere Werte natürlich möglich sind.
Es wird natürlich verstanden werden, dass alle Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung unabhängig von der Tatsache selber brauchbar sind, dass effektive Kandidaten vielleicht nicht gefunden werden. Die Erfindung stellte Verfahren zum Screening auf solche Kandidaten zur Verfügung, nicht einfach Verfahren zur Auffindung dieser.
5.0 Beispiele
Die folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen. Es sollte durch den Fachmann erkannt werden, dass die Techniken wie in den Beispielen beschrieben, die folgen, Techniken darstellen, die durch die Erfinder als gut funktionierend in der Durchführung der Erfindung entdeckt wurden und daher als bevorzugte Ausführungen für seine Durchführung betrachtet werden können.
5.1 Material und Methoden
5.1.1 Gewebeerhalt
Normale Prostata, benigne Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (CaP) und metastatisches Prostatakrebsgewebe waren aus radikalen Prostataektomien. Xenografts waren aus zwei Zellinien, Lu23 und Lu35, passagiert in Nacktmäusen. Alle Gewebe wurden entweder unmittelbar für die RNA-Isolierung prozessiert oder frisch in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei –80°C für die weiter Verwendung gelagert. Die Prostatakrebszellinien LNCaP, PC-3 und DU1145 wurden in RPMI 1640-Medium gehalten.
5.1.2 Differential Display
Ein modifiziertes Differential Display Verfahren (Liang and Pardee, 1992; An et al., 1995) wurde verwendet, um UC41 als ein hoch-reguliertes Gen zu identifizieren. Gesamt-RNA wurde aus gefrorenem normalem Prostata und Prostatakrebsgeweben gemäß Chomczynski und Sacchi (1987) isoliert. RNA (10 μg) aus jedem Gewebe wurde mit 5 Einheiten von RNase-freier DNase I (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) in der Anwesenheit von 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂ und 20 Einheiten RNase Inhibitor (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) behandelt. Nach Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ethanolfällung wurde die RNA in DEPC-behandeltem H₂O gelöst.
Ein μg von jeder RNA-Probe wurde revers in cDNA unter Verwendung von zufälligen Hexameren und M-MLV-reverser Transkriptase (GIBCO/BRL, Gaitherburg, MD) transkribiert, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden. Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 500 μM dNTP, 2 μm zufällige Hexamere und 400 U M-MLV-reverse Transkription. PCR^TM wurde mit zwei beliebigen 10mer-Primern durchgeführt.
Beliebige Primer, die für die Identifizierung von UC41 verwendet wurden.
PCR^TM wurde in 1 × PCR^TM-Puffer (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), 50 μM dNTPs, 0,2 μM willkürlicher Primer, 1/20 Volumen (1 μl) der cDNA und ein U der Taq DNA-Polymerase (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) in einem finalen Volumen von 20 μm durchgeführt. Die Amplifikations-Parameter schlossen 40 Zyklen an Reaktion mit 30 s Denaturierung bei 94°C, 1 min 30 s Annealing bei 38°C und 1 min Verlängerung bei 72°C ein. Eine finale Verlängerung bei 72°C wurde für 15 Minuten durchgeführt. Die PCT^TM-Produkte wurden dann auf einem 3% Methaphor-Agarosegel (FMC BioProducts, Rockland, ME) mit 0,5 μg Ethidiumbromid aufgetrennt, und positive Banden wurden unter UV-Licht identifiziert.
Die positiven Banden wurden mit einer Rasierklinge ausgeschnitten, auf Qiaex-Harz (Qiagen, Valencia, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt und direkt in ein Plasmid unter der Verwendung des TA-Klonierungssystems (pGEM-T-System, Promega, Madison, WI) kloniert. Die differentielle Expression von positiven Banden wurde durch relative quantitative RT-PCT^TM bestätigt.
5.1.3 Prostata-cDNA Bibliothek-Screening und Sequenzanalyse
Eine [α-³²P]-dATP markierte Sonde wurde durch zufälliges Markieren (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) aus einem 183 bp EST-Fragment von UC41 durchgeführt. Dieses Fragment entspricht den Basen 1323–1500 von SEQ ID NO: 1. Eine normale cDNA Prostata-Bibliothek in γgt11 (Clontech) wurde in zweifachen Ansätzen plattiert und gemäß den Produktanweisungen gescreent. Die Hybridisierung der plattierten Bibliothek wurde bei 68°C über Nacht in ExpressHyb-Lösung (Clontech, Palo Alto, CA) durchgeführt. Die Filter wurden zweimal in 2 × SSC, 0,05% SDS bei 37°C gewaschen, dann einmal in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C. Der markierte Filter wurde gegenüber XAR-5-Film ausgesetzt (Kodak, Rochester, NY) bei –70°C.
Aus ungefähr 3 × 10⁵ Plaque wurden zwei unabhängige positive Klone nach drei Runden an Screenen isoliert. Die Inserts aus diesen zwei Klonen wurden re-amplifiziert und in den Sequenzierungsvektor pCR-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Die Sequenz wurde durch Cycle-Sequencing mit sowohl M13 vorwärts und reverse Primern durchgeführt und mit Sequencher Software (Gene Codes) analysiert. Die vollständige für UC41 identifizierte cDNA ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Das Vollängen-cDNA-Fragment (SEQ ID NO: 1), das in Vektor pCR2-TOPO eingefügt ist, ist hier als pCR-TOPO-UC41 identifiziert. Die erzeugte Sequenz wurde auf die Vorhersage von offenen Leserahmen, Translations-Startstelle, Signalpeptid, Transmembranregion und potentielle Modifizierungsdomäne analysiert.
5.1.4 Northern-Blot und Dot-Blot Analysen
Die Sonde, die verwendet wurde um Northern-Blots und Dot-Blots zu screenen, bestand aus einem 697 bp DNA-Fragment, das durch Sph I und Pst I verdaut aus pCR TOPO-UC41 ausgeschnitten war und mit [α³²P]-dATP unter der Verwendung eines Random Primer DNA-Markierungskits (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) markiert wurde. Das Sph I-Pst I-Fragment entsprach den Basen 157 bis 854 von SEQ ID NO: 1. Die multiplen Gewebe-Northern (einschließlich acht normalen erwachsenen Geweben) und menschlichem RNA-Master (einschließlich 43 erwachsenen Geweben und 7 fetalen Geweben) Filter (Clontech, Palo Alto, CA), enthaltend jeweils 2 μg oder 89–514 ng normalisierter Poly A⁺ RNA pro Spur oder Punkt, wurden mit [α-³²P]-dATP-markierter Sonde wie oben beschrieben hybridisiert und gegenüber XAR-5-Film (Kodak, Rochester, NY) bei –70°C für 3 Tage exponiert.
5.1.5 In situ Hybridisierung
Um die Sonde für die Hybridisierungsuntersuchungen zu erzeugen, wurde die UC41 cDNA (SEQ ID NO: 1) durch PCR^TM unter Verwendung der folgenden Primer für 30 Zyklen bei jeweils 94°C 30 s, 58°C 1 min und einer finalen Verlängerung von 5 min bei 72°C amplifiziert.
Vorwärtsprimer (an Position 1319 von SEQ ID NO: 1)
Reverse Primer (an Position 1694 von SEQ ID NO: 1)
Das PCR^TM-amplifizierte Produkt wurde dann in den pGEM-T-Vektor kloniert, um das Plasmid pGEMT-UC41 zu erzeugen. Beide Sense- und Antisense -Digoxigenin-dUTP-markierten RNA-Sonden wurden aus 1 μg linearisiertem Plasmid-pGEMT-UC41 (verdaut mit NcoI oder Eco RV) in einer Standard-in vitro-Transkriptions-Reaktion unter der Verwendung der T7- und SP6-Promotoren und einem DIG-RNA-Markierungskit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) synthetisiert.
Die in situ-Hybridisierung wurde mit einem GenII-automatischen in situ-System (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) durchgeführt. Schnitte (5 μm) aus Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem Gewebe wurden auf Proma plus-Träger montiert. Die Träger wurden dann für 2 Stunden bei 65°C entwachst und rehydriert. Vor der Hybridisierung wurden die Schnitte mit Proteinase I-Cocktail für 12 Minuten bei 37°C verdaut. Dann wurden 10 ng von entweder Antisense- oder Sense-Sonde in dem Hybridisierungspuffer in einem Volumen von 70 μl auf die Schnitte aufgetragen, bei 65°C denaturiert und dann bei 42°C für 360 Minuten inkubiert. Nach dem sequenziellen Waschen mit 2 ×, 1 × und 0,1 × SSC-Puffer wurde das spezifische Signal unter der Verwendung von Maus-Anti-Digoxigenin-Antikörper nachgewiesen, gefolgt von Biotin-konjugiertem Anti-Mausantikörper und Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase und mit DAB H₂O₂ entwickelt.
5.1.6 RT-PCR^TM
Mikropräparationen von normalen Prostata- und Prostatakrebsgeweben, wie durch Hämatoxylin- und Eosin(H&E)-Färbung begleitet, wurden auf OCT (Optimal Cutting Temperature-Verbindung, Miles, Inc., Elkhart IN)-eingebetteten Geweben durchgeführt, die im Anschluss an radikale Prostataektomien genommen wurden. Gesamt-RNA wurde aus dem entsprechenden normalen Prostata- und Prostatakrebsgewebe, Prostatakrebszelllinien und Xenografts mit einem STAT-60-Kit (Tel-Test, Friendswood, TX) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. 1 μg von Gesamt-RNA aus jeder Probe wurde in cDNA mit Hexamer-zufälligen Primern und einem SuperTranskriptase-II-Kit (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) revers transkribiert. Jeweils 1 Mikroliter der sich ergebenden cDNA wurde durch PCR^TM für 28 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 58°C für 1 Minute, 72°C für 1 Minute jeweils unter der Verwendung entweder der unten angegebenen UC41-spezifischen oder β₂-Mikroglobin-Primer amplifiziert.
UC41-Vorwärts-Primer (Position 169 von SEQ ID NO: 1)
UC41-reverser Primer (Position 503 von SEQ ID NO: 1)
β₂-Mikroglobin-Vorwärts-Primer
β₂-Mikroglobin-reverser Primer
5.1.7 Chromosomale Lokalisierung des UC41-Gens durch FISH
Die chromosomale Lokalisierung von UC41 wurde durch FISH unter der Verwendung des Verfahrens von Heng et al. (1992) identifiziert. Aus dem menschlichen Blut isolierte Lymphozyten wurde in minimal-essentiellem Medium (MEM), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und Phytohämagglutinin (PHA) bei 37°C für 68–72 Stunden kultiviert. Die Lymphozytenkulturen wurden dann mit Bromdesoxyuridin (BrdU, 0,18 mg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) behandelt, um die Zellpopulation zu synchronisieren. Die Zellen wurden mit Serum-freiem Medium gewaschen, um die Blockade im Zellzyklus zu beseitigen und bei 37°C für 6 Stunden in MEM mit Thymidin (2,5 μg/ml, Sigma) rekultiviert.
Die Zellen wurden geerntet und die Träger wurden durch Standardverfahren hergestellt, einschließlich hypotonischer Behandlung und Fixierung, gefolgt von Lufttrocknen. Die Träger wurden bei 55°C für 1 Stunde gebacken. Nach Behandlung mit RNase wurden die Träger in 70% Formamid in 2 × SSC für 2 Minuten bei 70°C denaturiert, gefolgt von Ethanol-Entwässerung. Eine 0,9 kb UC41-cDNA-Sonde wurde mit dATP für 1 Stunde bei 15°C unter der Verwendung eines BioNick-Markierungskits (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) biotinyliert. Die Sonde wurde durch Hpa I- und Nco I-Verdauung präpariert und entspricht Basen 870 bis 1840 von SEQ ID NO: 1.
Die markierte Sonde wurde bei 75°C für 5 Minuten in einer Hybridisierungslösung denaturiert, die 50% Formamid, 10% Dextransulfat und menschliche Cot-I-DNA enthielt. Die denaturierte Sonde wurde zu den Trägern hinzugefügt und es ihr erlaubt, mit chromosomaler DNA über Nacht zu hybridisieren. Die Träger wurden dann gewaschen, nachgewiesen und amplifiziert durch Standardverfahren. FISH-Signale und DAPI-Bandenmuster wurden getrennt durch sequenzielle Photographie auf demselben mikroskopischen Feld aufgezeichnet. Die Zuordnung der FISH-Markierungsdaten mit chromosomalen Banden wurde durch Übereinanderlegen der FISH-Signale auf die DAPI-Banden-Chromosomen erreicht.
Ein Stanford-G3-Panel (Research Genetics, Huntsville, AL) wurde verwendet, um die Kopplung von UC41 mit bekannten Mikrosatellitenmarkern zu bestimmen. Das G3-Panel enthielt 83 Hamster-Mensch Bestrahlungs-reduzierte Zellhybride mit einer geschätzten Auflösung von ungefähr 500 kb. PCR^TM wurde mit den folgenden UC41-spezifischen Primern durchgeführt.
Vorwärts-Primer (an Position 1191 von SEQ ID NO: 1)
Reverser Primer (an Position 1707 von SEQ ID NO: 1)
Thermisches Zyklisieren wurde für 35 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 56°C für 1 Minute, 72°C für 1 Minute, gefolgt von Verlängerung bei 72°C für 10 Minuten durchgeführt. Das PCR^TM-Produkt wurde in 1% Agarose-Gel aufgelöst und das G3-Panel von UC41 wurde unter der Verwendung des RII-MAP-Programms auf dem RH-Server (University of Washington) geordnet.
5.2 Beispiel 1: Identifizierung von UC41 als ein überexprimiertes Gen in Prostatakrebs durch Differential Display
Ein modifiziertes Agarose-Gel-basiertes mRNA-Differential-Display-Verfahren wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die in Prostatakrebsgewebe unterschiedlich exprimiert waren. UC41 wurde als ein Gen identifiziert, das in Prostatakrebs sehr signifikant hochreguliert war. Wie in 1 (Panel A) gezeigt, wurde eine starke Bande (UC41) in allen drei Prostatageweben gesehen, die für die Differential-Display-Untersuchung verwendet wurden, während die UC41-Banden-Intensität in allen vier normalen getesteten Geweben sehr niedrig war.
Die UC41-Bande wurde ausgeschnitten, gereinigt und direkt in das pGEM-T-Plasmid durch TA-Klonierung kloniert. Der UC41-cDNA-Klon wurde sequenziert durch Standardverfahren wie oben beschrieben. Das sich ergebende 183 bp EST-Fragment von UC41 entspricht Basen 1323–1500 von SEQ ID NO: 1.
Unter der Verwendung dieser Sequenzdaten wurden Vorwärts- und reverse Primer für UC41 (SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11) aufgebaut und in einer relativen quantitativen RT-PCR^TM-Untersuchung wie oben beschrieben verwendet, um die Hochregulierung dieses Gens in Prostatakrebs zu bestätigen. Wie in 1 gezeigt, Panel B, wurde die Expression von UC41 als signifikant hochreguliert in allen sechs getesteten Prostatakrebsgeweben bestätigt, während die Expression in normalen Prostatageweben sehr gering war. Getrennte Untersuchungen bestätigten, dass die Expression von UC41 signifikant in Prostatakrebs erhöht ist, verglichen mit BPH. Daher scheint die Überexpression von UC41 diagnostisch für maligne Prostatatumore zu sein.
Die Expression von UC41 wurde in gepaarten übereinstimmenden Proben von normalen und Prostatakrebsgeweben verglichen, die von denselben Subjekten genommen wurden, wie bestimmt durch semi-quantitative RT-PCR^TM. Alle acht Proben zeigen erhöhte Expression von UC41 in Prostatakrebsgeweben, mit verschiedenen Ausmaßen von Überexpression, die in individuellen Subjekten beobachtet wurden (2). Die UC41-Expression wurde in drei Prostatakrebs-Zellinien, LNCaP, PC-3, DU 145 und zwei CaP-Xenografts, Lu 23 und Lu 35 untersucht. Lu 23 exprimierte einen hohen Spiegel von UC41, während Lu 35 eine relativ niedrige Expression zeigte und die drei Prostatakrebs-Zelllinien fast negativ für die Expression von UC41 waren (2).
5.3 Beispiel 2: Isolierung eines Vollängen-cDNA-Klons von UC41
Das 183 bp UC41-Fragment, wie identifiziert in Beispiel 1, wurde als eine Sonde verwendet, um eine Normal-Prostatagewebe-cDNA-Bibliothek zu screenen. Dieser Screen ergab sechs unabhängige positive Klone auf duplizierten Filtern (die über 3 × 10⁶ rekombinante Klone enthielten). Diese sechs isolierten Klone wurden einem weiteren Screening unterzogen. Zwei dieser Klone ergaben stark positive Signale bei repetitiver Hybridisierung. Die Inserts dieser zwei Klone wurden durch flankierende M 13-Primer amplifiziert und in dem Top-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) subkloniert. Die DNA-Sequenzen wurden von beiden Enden des Inserts bestimmt und als miteinander und mit dem durch Differential Display identifizierten UC41-Fragment überlappend gefunden.
Die Vollängen-cDNA für das UC41-Gen wurde durch eine Kombination von cDNA-Bibliotheks-Screening und RACE(Rapid Cloning of cDNA Ends)-Verfahren (Frohman, 1990) kloniert. Die vollständige identifizierte 1934 bp cDNA-Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 (9) gezeigt.
Die bioinformatisch erzeugte Translationsanalyse der cDNA zeigte einen ORF (offenen Leserahmen) von 125 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2), mit einem ATG-Startkodon bei bp 1320 von SEQ ID NO: 1 und einem Stoppkodon bei bp 1695 von SEQ ID NO: 1. Der in Beispiel 1 identifizierte 183 bp-EST beginnt unmittelbar nach dem Startkodon und endet ungefähr nach der Hälfte des ORF.
Das translatierte Protein weist eine berechnete molekulare Masse von 13,7 kDa auf und einen isoelektrischen pH von 10,48. Zwei potentielle Myristylierungsstellen sind an Resten 59–64 (GQVSTR) und 80–85 (GISNSG) von SEQ ID NO: 2 lokalisiert. Drei putative Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstellen sind an Resten 27–29 (TLR), 62–64 (STR) und 84–86 (SGR) von SEQ ID NO: 2 lokalisiert. Ein Hydropathie-Plot von SEQ ID NO: 2 ergab eine leicht hydrophile N-terminale Region, die als ein Signalpeptid dienen kann (Reste 2–24 von SEQ ID NO: 2) und einen stark hydrophoben C-terminalen Bereich, der die Eigenschaften einer Transmembrandomäne aufweist (Reste 99–121 von SEQ ID NO: 2). Ausführliche Computer-Homologieuntersuchungen, die in der GenBank, ECM und SWISS-Sequenzbanken durchgeführt wurden fanden keine bekannte Nukleotid/Aminosäuresequenz, die Homologie mit der UC41-cDNA oder abgeleiteten Aminosäuresequenzen aufweist.
5.4 Beispiel 3: In situ-Hybridisierung
Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Expression von UC41 zu untersuchen und die mRNA von UC41 in Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem Prostatakrebs und Prostatakrebs, metastatisch zu Lymphknoten und Knochen, verglichen mit normalen Prostatagewebe zu untersuchen. 3 zeigt einen Vergleich von UC41-Färbung in Prostatakrebsgewebe, verglichen zu normaler Prostata. Ein signifikanter Spiegel von UC41 wurde in Prostata-Adenokarzinom-Gewebe lokalisiert, während nur minimale Spiegel von UC41-mRNA in angrenzenden Proben von normalen und benignen Prostata-Epithelzellen nachgewiesen wurden (3). UC41-Expresssion in normalen Prostatageweben scheint auf luminale Epithel-Zellen lokalisiert zu sein, bevorzugterweise in luminalen Basalzellen (3). Prostatakrebszellen metastatisch zu den Lymphknoten zeigten sehr starke Färbung mit einer UC41-mRNA-Sonde (4), während normale Lymphknoten keine nachweisbare Färbung zeigten (4). Ähnliche Ergebnisse wurden mit metastatischen Prostatakrebszellen in Knochenmark, verglichen zu normalem Knochenmark, beobachtet (5).
5.5 Beispiel 4: spezifische Expression von UC41 in Prostatagewebe
Gewebe-spezifische Expression von UC41 wurde durch Northern Blot-Analyse mit mRNA aus Milz, Thymus, Prostata, Testis, Eierstöcken, Dünndarm, Colon und peripheren Blutleukozyten untersucht (6). Ein starkes Hybridisierungssignal wurde spezifisch in Prostatagewebe beobachtet (6). Die Ergebnisse in der Prostata sind in Übereinstimmung mit der Existenz von zwei verschiedenen Splice-Varianten des UC41-Gens, wobei eine Hauptbande bei ungefähr 1,5 kb wandert und eine kleinere Bande bei ungefähr 2,1 kb (6). Diese Ergebnisse zeigten an, dass die Expression des UC41-Gens für Prostatagewebe spezifisch ist.
Die Prostata-spezifische Expression von UC41 wurde durch Dot-Blot-Hybridisierung unter der Verwendung eines vergrößerten Panels von RNA-Proben von fünfzig verschiedenen Erwachsenen-menschlichen oder fötalen menschlichen Geweben bestätigt (7). Ein starkes Hybridisierungssignal wurde wiederum nur in Prostata-RNA beobachtet (7), mit einer sehr kleinen Menge an Hybridisierung, die in Blasen-RNA nachgewiesen wurde (7).
5.6 Beispiel 5: Chromosomale Lokalisierung von UC41
Der chromosomale Lokus von UC41 wurde durch Vergleich von UC41-FISH-Hybridisierung (8, Panel A) und DAPI-Färbung (8, Panel B) identifiziert. Basierend auf diesem Vergleich wurde UC41 dem langen Arm von Chromosom 3 zugeordnet. Die genauere Position von UC41 wurde weiter basierend auf einer Zusammenfassung von Daten aus 10 verschiedenen FISH/DAPI-Vergleichen (8, Einschub auf der ganz rechten Seite) bestimmt, was das Gen zu 3q22–23 kartierte. Sowohl FISH-Kartierung (8) und menschliche genomische DNA-Southern-Hybridisierung zeigen an, dass das UC41-Gen als eine einzelne Kopie existiert.
UC41 wurde auf dem G3-Bestrahlungshybridpanel typisiert, das bei Stanford entwickelt wurde und mit dem RH-MAP-Programm (University of Washington) wie oben beschrieben analysiert. Die Zwei-Punkt-Analysen stuften UC41 mit dem Mikrosatellitenmarker D3S1541 ein, mit einem Abstand von 11 cR (ungefähr 250 kb).
Diejenigen mit Erfahrung im Stand der Technik werden erkennen, dass das Gen und die Genprodukte (RNAs und Proteine) für UC41 innerhalb des Bereichs der hier beschriebenen Erfindung enthalten sind. Diejenigen mit Erfahrung im Stand der Technik werden auch erkennen, dass die Diagnose und Prognose von Prostatakrebs durch Nachweis der Nukleinsäure oder Proteinprodukte dieses Gens innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung enthalten sind.
Alle der hier beschriebenen und beanspruchten Zusammensetzungen und Verfahren können im Hinblick auf die vorliegende Beschreibung ohne unangemessene Experimente hergestellt und ausgeführt werden.
Genauer gesagt wird es ersichtlich sein, dass bestimmte Mittel, die sowohl chemisch und physiologisch verwandt sind, für die hier beschriebenen Mittel substituiert werden können, während dieselben oder ähnliche Ergebnisse erreicht werden würden.
6.0 Referenzen
Die folgenden Literaturzitate sowie diejenigen wie oben zitiert sind mit ihrem betreffenden Teil durch Bezugnahme hier aus den im obigen Text zitierten Gründen aufgenommen.

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Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes Nukleinsäuresegment, umfassend eine Vollängensequenz oder das Vollängenkomplement einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül einer Größe von zwischen 14 und 100 Basen in Länge, identisch in seiner Sequenz zu einem durchgehenden Teil von mindestens 14 Basen einer Nukleinsäure oder ihrem Komplement ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, von einer Größe von zwischen 17 und 100 Basen in Länge.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, von einer Größe von zwischen 20 und 100 Basen in Länge.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, von einer Größe von zwischen 25 und 100 Basen in Länge.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, von einer Größe von zwischen 30 und 100 Basen in Länge.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Sequenz SEQ ID NO: 1 ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Sequenz SEQ ID NO: 3 ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Sequenz SEQ ID NO: 4 ist.
Isolierte Nukleinsäure die für eine Vollängen-Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5 kodiert.
Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Vollängen-Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5.
Isoliertes Peptid, einer Größe von zwischen 10 und 65 Aminosäuren in Länge, identisch in seiner Sequenz zu einem durchgehenden Teil von mindestens 10 Aminosäureresten von SEQ ID NO: 5.
Isoliertes Peptid nach Anspruch 12, wobei das isolierte Peptid eine Größe von zwischen 10 und 25 Aminosäuren in Länge aufweist.
Verfahren zum Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe umfassend den Schritt von Nachweisen eines Prostatakrebsmarkers in der Probe, wobei der Prostatakrebsmarker eine Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 angegeben aufweist.
Verfahren nach Anspruch 14, weiter umfassend die Schritte von a) Amplifizieren von Nukleinsäuren aus der Probe, um Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte zu bilden; b) in Kontakt bringen der Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte mit einer Oligonukleotidsonde, die unter stringenten Bedingungen mit dem Prostatakrebsmarker hybridisieren wird; c) Nachweisen der Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte, die mit der Sonde hybridisieren; und d) Messen der Menge der Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte, die mit der Sonde hybridisieren, wobei eine erhöhte Menge des Prostatakrebsmarkers in der Probe, relativ zu der Menge des Markers in normalen Gewebeproben, für die Prostatakrebszellen indikativ ist.
Verfahren nach Anspruch 14, weiter umfassend die Schritte von a) zur Verfügung stellen von Primern die 10–20 Basen in Länge sind, die die Prostatakrebsmarker selektiv amplifizieren werden; b) Amplifizieren der Nukleinsäuren mit den Primern um Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte zu bilden; c) Nachweisen der Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte; und d) Quantifizieren der Nukleinsäure-Amplifikationsprodukte, wobei eine erhöhte Menge des Prostatakrebsmarkers in der Probe, relativ zu der Menge des Markers in normalen Gewebeproben, für die Prostatakrebszellen indikativ ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 16, weiter umfassend bestimmen der Diagnose von menschlichem Prostatakrebs durch Quantifizieren des Nukleinsäure-Amplifikationsprodukts, das an eine Sonde bindet, die für den Prostatakrebsmarker spezifisch ist, und Vergleichen der quantifizierten Menge zu einer Kontrolle, wobei erhöhte Spiegel für menschlichem Prostatakrebs indikativ sind.
Kit zur Verwendung beim Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe, umfassend: (a) ein Primerpaar, wobei jeder Primer zwischen 10 bis 20 Basen lang ist und identisch oder komplementär zu einer Region in SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ist, zum Amplifizieren einer Nukleinsäure umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4; und (b) einen Behälter für jeden der Primer.
Kit zur Verwendung beim Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe, umfassend: (a) eine Oligonukleotidsonde, die 16 bis 100 Nukleotide lang ist, die unter hoch stringenten Bedingungen an eine isolierte Nukleinsäure umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 bindet; und (b) einen Behälter für den Primer.
Kit zur Verwendung beim Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe, umfassend: (a) einen Antikörper der immunologisch an ein Polypeptid umfassend SEQ ID NO: 5 bindet; und (b) einen Behälter für den Antikörper.
Verfahren zum Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe umfassend die folgenden Schritte: (a) zur Verfügung stellen eines Antikörpers, der immunologisch an ein Peptid umfassend SEQ ID NO: 5 bindet; (b) in Kontakt bringen einer menschlichen Gewebeprobe mit dem Antikörper; (c) Abtrennen von an die Gewebeprobe gebundenem Antikörper von nicht gebundenem Antikörper; und (d) Nachweisen des gebundenen Antikörpers.
Kit zur Verwendung beim Nachweis von Prostatakrebszellen in einer biologischen Probe umfassend: (a) einen Antikörper der immunologisch an ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 5 bindet; und (b) einen Behälter für den Antikörper.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure in einen menschlichen Expressionsvektor inkorporiert ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 10, wobei die Nukleinsäure in einen menschlichen Expressionsvektor inkorporiert ist.