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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Biomedizin.
Zielprotein für
Antitumor-Verbindungen. System zur Identifikation von vermutlichen Antitumor-Verbindungen.
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Tumorinvasions-
und -metastasenmarker, ihre Verwendung als diagnostische Marker
für die Krankheit
und als Leitfaden für
Mediziner bei der Auswahl oder Bewertung von Behandlungen.
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STAND DER
TECHNIK
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Für das Protein
E-Cadherin wurde nicht nur gezeigt, dass es interzelluläre Adhäsion von
Epithelzellen während
der embryonalen Entwicklung und im erwachsenen Gewebe vermittelt,
sondern auch, dass es an der phänotypischen
Transformation, die in Epitheltumoren während ihrer Weiterentwicklung
zu invasiven Tumoren beobachtet wurde, beteiligt ist. In diesem
Invasionsvorgang durch die Tumorzellen wird die Expression des Proteins
E-Cadherin reduziert oder vollständig
eliminiert, und dieser Verlust ist mit dem Erwerb an Migrationseigenschaften
verbunden. Funktionelle Veränderungen
von E-Cadherin und/oder damit assoziierten Proteinen, den Cateninen,
wurden mit Entdifferenzierung und höherer Aggressivität von Tumoren
in Verbindung gebracht [Takeichi, M., "Cadherins in cancer: implications for
invasion and metastasis";
Curr. Op. Cell Biol. 5, 806–811 (1993);
Birchmeier, W. & Behrens,
J., "Cadherin expression
in carcinomas: role in the formation of cell junctions and the prevention
of invasiveness";
Biochim. Biophys. Acta 1198, 11–26
(1994)], und es wurde sogar erachtet, dass sie in den Übergang
von Adenomen zu invasiven Karzinomen eingebunden seien [Perl, A.K.,
Wilgenbus, P., Dahl, U., Semb H. & Christofori,
G., "A causal role
for E-Cadherin in the transition form adenoma to carcinoma"; Nature 392, 190–193 (1998)].
Aus all diesen Gründen
wurde angenommen, dass das E-Cadherin-Gen ein Tumorinvasions-Suppressorgen
ist [Frixen, U.H. et al., "E-cadherin-mediated
cell-cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells"; J. Cell Biol. 113,
173–185
(1991); Vleminckx, K., Vakaet, L.J., Mareel, M. Fiers, W. & Van Roy, F., "Genetic manipulation
of E-cadherin expression by epithelial tumor cells re veals an invasion
suppressor role";
Cell 66, 107–119
(1991); Miyaki, M. et al., "Increased cell-substratum
adhesion, and decreased gelatinase secretion and cell growth, induced
by E-Cadherin transfection of human colon carcinoma cells"; Oncogene 11, 2547–2552 (1995);
Llorens, A. et al., "Downregulation
of E-cadherin in mouse skin carcinoma cells enhances a migratory
and invasive phenotype linked to matrix metalloproteinase-9 gelatinase
expression"; Lab.
Invest. 78, 1–12
(1998)], sodass die Molekülmechanismen,
die seine Expression oder Funktion kontrollieren, dem Ausbau des
Wissens über
Tumorinvasionsprozesse äußerst dienlich
sind.
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Expression
des E-Cadherin-Gens wird durch mehrere Elemente reguliert, die in
der 5'-proximalen Region
seines Promotors liegen [Behrens, J., Löwrick, O., Klein, N. L. & Birchmeier, W., "The E-cadherin promoter:
functional analysis of a GC-rich region and an epithelial cell-specific
palindromic regulatory element";
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11495–11499 (1991); Ringwald, M.,
Baribault, H., Schmidt, C. & Kemler,
R., "The structure
of the gene coding for the mouse cell adhesion molecule uvomorulin"; Nucleic Acids Res.
19, 6533–6539
(1991); Bussemakers, M.J., Giroldi, L.A., van Bokhoven, A. & Schalken, J.A., "Transcriptional regulation
of the human E-cadherin gene in human prostate cancer cell lines:
characterization of the human E-Cadherin gene promoter"; Biochem. Biophys.
Res. Commun. 203, 1284–1290
(1994); Giroldi, L.A. et al., "Role
of E-boxes in the repression of E-cadherin expression"; Biochem. Biophys.
Res. Commun. 241, 453–458 (1997)].
Von diesen Elementen wurde das E-pal-Element,
das zwei E-Boxen enthält,
im E-Cadherin-Promotor in Mäusen
identifiziert (zwischen Positionen –90 und –70), und es ist wichtig, da
es in normalen Zellen und transformierten Zellen, die eine E-Cadherin-Defizienz
aufweisen, als Repressor wirkt [Behrens, J., Löwrick, O., Klein, N.L. & Birchmeier, W., "The E-cadherin promoter:
functional analysis of a GC-rich region and an epithelial cell-specific
palindromic regulatory element";
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11495–11499 (1991); Hennig, G.,
Löwrick,
O., Birchmeier, W. & Behrens,
J., "Mechanisms
identified in the transcriptional control of epithelial gene expression"; J. Biol. Chem.
271, 595–602
(1996); Faraldo, M.L., Rodrigo, I., Behrens, J., Birchrneier, W. & Cano, A., "Analysis of the E-cadherin
and P-Cadherin promoters in murine keratinocyte cell lines from
different stages of mouse skin carcinogenesis"; Mol. Carcinog. 20, 33–47 (1997);
Rodrigo, 1., Cato, A.C.B. & Cano,
A., "Regulation
of E-cadherin gene expression during tumor progression: the role
of a new Ets-binding site and the E-pal element"; Exp. Cell Res. 248, 358–371 (1999)].
Die Transkriptionsfaktoren, die mit diesem Element oder in der entsprechenden
Region des Promotors des menschlichen Cadherin-Gens Wechselwirken,
sind unbekannt. [Bussemakers, M.J., Giroldi, L.A., van Bokhoven
A. & Schalken,
J.A., "Transcriptional
regulation of the human E-cadherin gene in human prostate cancer
cell lines: characterization of the human E-cadherin gene promoter"; Biochem. Biophys.
Res. Commun. 203, 1284–1290 (1994);
Giroldi, L.A. et al., "Role
of E-boxes in the repression of E-cadherin expression"; Biochem. Biophys.
Res. Commun. 241, 453–458
(1997)].
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Mögliche Transkriptionsfaktoren,
die Repressoren der Expression des E-Cadherin-Gens sind, könnten von großem Wert
für die
Identifikation neuer Antitumor-Kandidaten sein, die durch Hemmen
der Funktion dieser Faktoren und in weiterer Folge des Invasions-
und Metastase-Vorgangs wirken. Weiters könnte ihre Gegenwart als Marker
von Tumorausbreitung und Tumormalignität verwendet werden.
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BESCHREIBUNG
Kurze Beschreibung
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Der
Transkriptionsfaktor Snail wurde als Repressor der Expression von
E-Cadherin identifiziert, da er in direkter Wechselwirkung mit der
E2-Box des E-pal-Elements des Promotors steht. Die ektopische Expression
von Snail in Epithelzellen bewirkt Epithel-Mesenchym-Übergang
und den Erwerb von Migrationseigenschaften, gleichzeitig mit der
Hemmung von E-Cadherin-Expression und dem Verlust anderer Epithel-Differenzierungsmarker.
Diese Erfindung präsentiert
und umfasst Folgendes:
- – ein Zielprotein zur Identifikation
neuer Antitumor-Verbindungen, und
- – einen
neuen Marker für
Tumorinvasion und -metastase und seine Anwendung als diagnostischer Marker
für die
Krankheit und als Leitfaden für
Mediziner bei der Auswahl oder Bewertung von Behandlungen.
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Detaillierte
Beschreibung
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Snail ist ein Transkriptionsfaktor,
der als direkter Repressor von E-Cadherin-Expression wirkt.
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Die
Identifikation von Transkriptionsfaktoren, die mit dem E-pal-Element
wechselwirken, wurde mittels Einhybrid-Näherung unter Verwendung der oligomerisierten
Maus-E-pal-Sequenz (–90/–70) unternommen,
um die Expression des HIS3-Gens von S. cerevisiae als Köder und
einer cDNA-Genbibliothek von NIH3T3, fusioniert mit der GAL4-Aktivierungsdomäne, als
Beute zu steuern. Insgesamt 130 Klone wurden isoliert, die in der
Lage waren, mit der Konstruktion, die das native E-pal-Element enthielt, zu
wechselwirken (und die Transkription des Reportergens HIS3 zu steuern);
sie erkannten das mutierte oligomere Element nicht. Diese mutierte
Form des E-pal-Elements enthält
2 modifizierte Basen (TT anstelle von GC), was die E2-Box eliminiert. Diese
mutierte Form wurde als verantwortlich für die Unterbindung der Repressorwirkung
im E-Cadherin-Promotor in Mäusen
beschrieben [Henning, G., Löwrick,
O., Birchmeier, W. & Behrens,
J., "Mechanisms
identified in the transcriptional control of epithelial gene expression"; J. Biol. Chem.
271, 595–602
(1996); Faraldo, M.L., Rodrigo, I., Behrens, J. Birchmeier W. & Cano, A., "Analysis of the E-cadherin
and P-cadherin promoters in murine keratinocyte cell lines from
different stages of mouse skin carcinogenesis"; Mol. Carcinog. 20, 33–47 (1997)].
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Das
Sequenzieren der isolierten Klone zeigte, dass 49 % der Klone Inserts
enthielten, die für
die ganze Sequenz der Maus-Snail-cDNA oder für Teile davon kodierten [Nieto,
M.A., Bennet, M.F., Sargent, M.G. & Wilkinson, D.G., "Cloning and developmental expression
of Sna, a murine homologue of the Drosophila snail gene"; Development 116,
227–237
(1992); Smith, D.E., Del Amo, F.F. & Gridley, T., "Isolation of Sna, a mouse homologous
to the Drosophila gene snail and escargot: its expression pattern
suggests multiple roles during postimplantation development"; Development 116,
1033–1039
(1992)], während
ein einziger Klon für
eine Teilsequenz der Maus-Slug-cDNA
kodierte.
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Um
die Wirkung von Snail als Transkriptionsfaktor im Zusammenhang mit
der proximalen Region des E-Cadherin-Promotors (–178/+92) zu bestimmen, wurde
die vollständige
Sequenz von Snail-DNA in einen Expressionsvektor (pcDNA3) subkloniert, und
seine Aktivität
wurde durch Cotransfektion in zwei Maus-Epidermalkeratinozyten-Zelllinien, MCA3D
und PDV, analysiert. Beide Linien wurden bereits davor so charakterisiert,
dass sie ein hohes Niveau an E-Cadherin-Expression und Promotoraktivität aufwiesen
[Faraldo, M.L., Rodrigo, I., Behrens, J., Birchmeier, W. & Cano, A., "Analysis of the E-cadherin
and P-cadherin promoters in murine keratinocyte cell lines from
different stages of mouse skin carcinogenesis"; Mol. Carcinog. 20, 33–47 (1997);
Rodrigo, 1., Cato, A.C.B. & Cano,
A., "Regulation
of E-cadherin gene expression during tumor progression: the role
of a new Ets-binding site and the E-pal element"; Exp. Cell Res. 248, 358–371 (1999);
Navarro, P. etal., "A
role for the E-cadherin cell-cell adhesion molecule in tumor progression
of mouse epidermal carcinogenesis"; J. Cell Biol. 115, 517–533 (1991)].
Cotransfektion von Snail in MCA3D-Zellen (1A) und
PDV (1B) erzeugte starke Repression des nativen E-Cadherin-Promotors (95 % bzw.
75 %), jedoch nicht des Promotors, der die mutierte E2-Box enthielt (1).
Diese Ergebnisse bestätigen
jene, die durch das Einhybrid-Screeningverfahren erhalten wurden, und
zeigen, dass Snail ein direkter Repressor der Transkription des
E-Cadherin-Gens ist, der über
seine Bindung an die E2-Box des E-pal-Elements wirkt.
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Snail induziert die Fibroblastenkonversion
von Epithelzellen und den Erwerb von Migrationseigenschaften.
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Um
mehr Informationen über
die Rolle des Snail-Proteins bei der Regulierung des E-Cadherin-Gens und über seine
Beteiligung an Epithel-Mesenchym-Transition zu erhalten, wurde es
ektopisch in mehreren Zelllinien exprimiert. Vorübergehende Expression von Snail
wurde anfänglich
in den Keratinozytenlinien MCA3D und PDV analysiert, die den Vorteil
bieten, in der Lage zu sein, in isolierten Gruppen zu wachsen, starke
interzelluläre
Kontakte, die durch E-Cadherin auch bei geringer Dichte vermittelt
werden, aufzubauen und sehr geringe Zellbewegung aufweisen [Navarro, P.
et al., "A role
for the E-cadherin cell-cell adhesion molecule in tumor progression of
mouse epidermal carcinogenesis";
J. Cell Biol. 115, 517–533
(1991); Lozano, E. & Cano,
A., "Cadherin/catenin
complexes containing either b-catenin or plakoglobin contribute
to stable cell-cell contacts"; Cell
Adh. Commun. 6, 51–67
(1998); Gómez
M. Navarro P. & Cano
A., "Cell adhesion
and tumor progression in mouse skin carcinogenesis: increased synthesis
and organization of fibronectin is associated with the undifferentiated
spindle phenotype";
Invasion & Metastasis
14, 17–26
(1994); Frontelo, P. et al., "Transforming
growth factor b1 induces squamous carcinoma cell variants with increased
metastatic abilities and a disorganized cystoskeleton"; Exp. Cell Res.
244, 420–432
(1998)]. Die Überexpression von
Snail eliminierte interzelluläre
Kontakte innerhalb der von –48
Stunden nach Transfektion in beiden Zelltypen als Folge von Hemmung
der Expression von E-Cadherin (2b und 2f)
und anderer assoziierter Proteine, wie beispielsweise Plakoglobin. Gleichzeitig
mit diesen Veränderungen
wurde die Morphologie der mit Snail transfizierten Zellen stark verändert. Zahlreiche
Membranausdehnungen und lange Fäden,
die Filopodien ähnlich
waren, wurden in beiden Zelllinien beobachtet.
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Stabile
Expression von Snail wurde in der Zelllinie MDCK durchgeführt, die
einen "prototypischen" Epithelphänotyp aufweist
und in Kultur als Monoschicht aufscheint. Dieser Phänotyp scheint durch
Expression des Kontrollvektors in sechs unabhängigen isolierten Klonen nicht
beeinflusst zu werden (3a), die die Expression von
E-Cadherin (3b)
und Plakoglobin (3c) in interzellulären Kontakten
aufrechterhalten. Stabile Expression von Snail bewirkt jedoch eine
drastische Konversion zu einem völlig
undifferenzierten Fibroblastenphänotyp. MDCK-Zellen,
die mit Snail transfiziert sind, verlieren ihre Fähigkeit,
als eine Monoschicht zu wachsen und durch Kontakt zu hemmen. Anstelle
dessen bilden diese Zellen sich überlagernde
Netzwerke mit äußerst langen
Membranausdehnungen (3d). Eine Analyse von E-Cadherin-
und Plakoglobinexpression zeigten den Verlust beider Moleküle in MDCK-Zellen, die
mit Snail transfiziert sind (3e und f).
Darüber
hinaus bewirkte stabile Expression von Snail in MDCK-Zellen ein
starkes Migrationsverhalten, das durch Tests von Wundheilung in
Kulturen gezeigt wurde (4).
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Snail wird in undifferenzierten
Tumoren und in invasiven Regionen von Epidermiskarzinomen exprimiert.
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Eine
Analyse der endogenen Expression von Snail durch RT-PCR in einer
Gruppe von Zelllinien mit unterschiedlicher E-Cadherin-Expression
zeigte eine umgekehrte Korrelation zwischen der Expression von beiden
Molekülen
und einer Beziehung zwischen der Expression von Snail und ihrer
invasiven und metastatischen Fähigkeit
(5). E-Cadherin wurde in der epithelialen, nicht-tumoralen MCA3D-Zelllinie
und in der PDV-Tumorzelllinie beobachtet, wobei Letztere trotz ihres
tumoralen Ursprungs keine invasive oder metastatische Fähigkeit zeigte.
Die Gegenwart von Snail wurde dennoch in jeder der Zelllinien festgestellt.
Im Gegensatz dazu wird bei den Tumorzelllinien mit invasiver und
metastatischer Fähigkeit,
HaCa4 und CarB, die Abwesenheit von E-Cadherin mit der Gegenwart
von Snail verbunden.
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Expression
von Snail wurde mittels In-situ-Hybridisierung in Epidermistumoren,
induziert in immungehemmten Mäusen,
entweder durch verschiedene Zelllinien oder durch chemische Behandlung
der Haut der Mäuse
analysiert. In beiden Fällen wurde
starke Expression von Snail in undifferenzierten Tumoren (6f und h)
und in Invasionsbereichen in Epidermiskarzinomen (6l)
beobachtet, bei denen die Expression von E-Cadherin verloren gegangen
war (6k). Im Gegensatz dazu wurde
keine Expression von Snail in nicht-invasiven, gut differenzierten
Tumoren nachgewiesen (6b und 6d).
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Zusammengenommen
zeigen diese Resultate, dass Snail ein direkter Repressor von E-Cadherin-Expression
ist, der in die Epithel-Mesenchym-Transition eingebunden ist, die
während
der Tumorinvasion auftritt. Die Gegenwart von Snail ist daher ein
neuer Marker für
Tumorfortentwicklung, insbesondere verbunden mit dem Erwerb des
invasiven und metastatischen Phänotyps,
der Snail ermöglicht,
als ein diagnostischer Marker von Tumoren bei Menschen und als ein
Leitfaden für
Mediziner bei der Auswahl und Bewertung von Antitumor-Behandlungen
verwendet zu werden, und stellt daher einen Teil dieser Erfindung
dar.
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Weiters
weisen diese Daten eindeutig darauf hin, dass Snail eine direkte
induktive Rolle im Erwerb dieser Eigenschaften von Tumorinvasion
und -metastase spielt, so dass Snail als Zielprotein für neue Antitumor-Verbindungen
erachtet werden kann. Experimente zur Identifikation neuer Antitumor-Kandidaten können von
diesem Protein ausgehend entwickelt werden, basierend auf Zelllinien,
die durch das Snail-Protein transformiert wurden, worin eine Analyse
der Regulierung von Snail-Expression durch einen Antitumorkandidaten
neue Antitumor-Verbindungen identifizieren würde, was wiederum einen Teil
dieser Erfindung darstellt. Analyse der Regulierung von Snail-Expression
könnte
durch Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von Snail nach Kontakt
mit dem Antitumorkandidaten oder mittels einer anderen Signalart
durchgeführt
werden, die die Snail-Funktion in Zellen, die mit Reportergenen
wie z.B. HIS3 und LacZ transformiert wurden, hemmt, was Teil dieser Erfindung
ist.
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FIGURENBESCHREIBUNG
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1 – Snail
hemmt die Aktivität
des E-Cadherin-Promotors in Epithel-Zelllinien. MCA3D- (1A)
und PDV- (1B) Zellen wurden mit dem nativen
E-Cadherin-Promotor (wt-178) oder mit einer mutierten Version davon
(mE-pal) transfiziert, der/die mit dem Genmarker CAT in Gegenwart
von 1 μg
des Kontrollvektors pcDNA3 oder eines Vektors, der Snail enthielt,
fusioniert war. Das Diagramm zeigt die Niveaus der CAT-Aktivität des Promotors.
Promotoraktivität
ist als Messung relativ zu jener des nativen Promotors in Gegenwart
des Kontrollvektors ausgedrückt.
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2 – Vorübergehende
Expression von Snail in Epidermis-Keratinozyten bewirkt den Verlust von
E-Cadherin und Plakoglobin und den Verlust von Zell-Zell-Adhäsion. MCA3D-
(a–d)
und PDV- (e–h) Zellen
wurden mit Kontrollvektor (Mock, a, c, e, g)
oder jenem, der Snail-cDNA enthielt (b, d, g, h),
transfiziert, und die Gegenwart von E-Cadherin und Plakoglobin wurde
durch Immunzytochemie, sichtbar gemacht durch konfokale Mikroskopie
nach 48 Stunden, analysiert.
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3 – Stabile
Transfektion von Snail in MDCK-Epithelzellen bewirkt Epithel-Mesenchym-Konversion,
gleichzeitig mit dem Verlust von E-Cadherin und Plakoglobin. Phasenkontrastbilder von
Zellen, die mit dem Kontrollvektor (a) und mit
dem Vektor, der Snail enthielt (d), transfiziert wurden.
Konfokale Mikroskopiebilder zeigen Expression von E-Cadherin (b, e)
und Plakoglobin (c, f) in Kontroll-
bzw. transfizierten Snail-Zellen.
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4 – Snail
bewirkt einen Migrationsphänotyp
bei Epithelzellen. Das Migrationsverhalten wurde in einem In-vitro-Modell
analysiert. MDCK-Kontrollkulturen (Mock) oder Kulturen, die mit
Snail transfiziert waren, wurden mit der Spitze einer Pipette angeritzt,
und Photographien wurden sofort (t=0, a, d)
und 10 Stunden später
(b, e) angefertigt.
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5 – Analyse
der endogenen Expression von Snail durch RT-PCR in einer Gruppe
von Zelllinien. Die endogene Expression von Snail korreliert invers
mit jener von E-Cadherin in normalen und transformierten Maus-Keratinozyten-Zelllinien.
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6 – Snail-Expression
ist verbunden mit invasiven Karzinomen und invasiven Bereichen in Epidermiskarzinomen.
Tumoren wurden in Nacktmäusen
mittels PDV- (a–d) oder
CarB- (e–h)
Zellen oder durch chemische Behandlung (i–l)
induziert. Sie wurden durch In-situ-Hybridisierung mit E-Cadherin-
(a, c, e, g, i, k)
oder Snail-(b, d, f, h, j, l)
Sonden analysiert. E-Cadherin wird in differenzierten Bereichen
von Epidermiskarzinomen (a, c, i, k)
exprimiert, während
es zu keiner Expression von Snail in diesen Tumoren (b, d, j)
kommt. Invasive Karzinome exprimieren E-Cadherin nicht (e, g),
doch sie exprimieren Snail (f, h).
In chemisch induzierten Tumoren wird Snail-Expression in undifferenzierten
invasiven Bereichen (l) beobachtet, die E-Cadherin
nicht exprimieren (k).
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BEISPIELE
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Beispiel 1. Isolierung
von Snail-cDNA in Mäusen
unter Verwendung des Einhybrid-Verfahrens.
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Das
Oligonucleotid, das die Sequenz des E-pal-Elements des Maus-E-Cadherin-Promotors (CD-E)
(Nucleotide –90
bis –70)
enthält,
der Targets für
die Restriktionsenzyme Sall in 5' und
Xhol in 3' aufweist,
wurde in direkter Richtung mit insgesamt sechs vollständigen Wiederholungen
unter Anwendung herkömmlicher
Verfahren, Isolierung in Polyacrylamidgelen und Klonieren in pHISi-Vektor
(Clontech, Palo Alto, CA, USA), der das Reportergen HIS3 von S.
cerevisiae und Replikationselemente von Hefe, Bakterien und geeigneten
Selektionsgenen enthält,
ligiert. Auf diese Weise bleibt die Expression des HIS3-Gens unter
der Kontrolle des multimerisierten E-pal-Elements. Korrekte Insertion der Regulationssequenzen
wurde mittels PCR, Verdau mit geeigneten Restriktionsenzymen und
Sequenzierung überprüft. Der
so gebildete Ködervektor
wurde als pHIS-E6 bezeichnet. Dasselbe Verfahren wurde angewandt,
um Vektoren zu bilden, in die eine mutierte Version des E-pal-Elements
eingeführt
wurde, auch sechsmal in direkter Richtung ligiert wurde, worin die zwei
zentralen Oligonucleotide, GC, durch TT ersetzt wurden. Der gebildete,
mutierte Ködervektor
wurde als pHIS-mE6 bezeichnet. Die Ködervektoren pHIS-E6 und pHIS-mE6
wurden unabhängig
voneinander in den chromosomalen Locus URA3 des Hefestamms YM-4271 (Clontech, Palo
Alto, CA, USA) durch die herkömmlichen
Verfahren zur Transformation und Selektion stabiler Stämme, die
Wachstum in Gegenwart von 20 mM 3-Aminotriazol (3 AZT) aufrechterhalten,
integriert. Die ausgewählten
Stämme wurden
als E-pal HIS3 (natives E-pal-Konstrukt) und mE-pal HIS3 (mutiertes
E-pal-Konstrukt) bezeichnet. Der Hefestamm E-pal HIS 3 wurde Transformation mit
einer herkömmlichen
Genbibliothek von cDNA aus NIH3T3-Zellen unterzogen, die unterschiedliche Inserts
von cDNA, fusioniert mit der GAL4-Aktivierungsdomäne im pACT2-Vektor
(Clontech, Palo Alto, CA, USA), enthielt, der davor amplifiziert
worden war, um einen Titer von 3×106 unabhängigen Klonen
unter Verwendung herkömmlicher
Verfahren zu erhalten. Transformierte Hefen wurden aufgrund ihrer
Fähigkeit ausgewählt, in
Abwesenheit von Histidin und in Gegenwart von 20 mM 3ATZ zu wachsen,
und 300 unabhängige
Klone wurden isoliert. Die die unterschiedlichen Sequenzen von cDNA
enthaltenden Plasmide wurden aus den transformierten Hefen isoliert
und wurden später
verwendet, um E. coli (DHSa-Stamm) zu transformieren, wobei 221
unabhängige
E.-coli-Klone erhalten wurden, aus denen die entsprechenden Plasmide
isoliert wurden. Um falsche Positive zu eliminieren, wurden die
221 Plasmide unabhängig
voneinander parallel in die davor gebildeten Hefestämme, die
das HIS3-Gen enthielten, unter der Kontrolle des Wild-E-pal-Elements (E-pal-HIS3-Stamm) oder des mutierten
E-pal (mE-pal-HIS3-Stamm) eingeführt,
wobei jene Plasmide ausgewählt
wurden, die in Abwesenheit von Histidin und Leucin und in Gegenwart
von 20 mM 3ATZ ausschließlich
im Stamm E-pal His3 Wachstum initiierten; die ausgewählte Gesamtanzahl
betrug 130. Inserts dieser Plasmide wurden anfänglich unter Verwendung von
Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen analysiert und in einer
automatischen Sequenzierungsvorrichtung sequenziert. Die erhaltenen
Sequenzen wurden in cDNA-Datenbanken unter Verwendung des BLAST/FASTA-Programms analysiert.
49 % der identifizierten Klone kodierten für die gesamte Maus-Snail-cDNA-Sequenz
oder für
einen Teil davon.
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Beispiel 2. Vorübergehende
stabile Transfektion von mSnail in Epithelzellen.
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Die
vollständige
Maus-Snail-cDNA-Sequenz (mSnail), die in einem der Klone, der mittels
des Einhybrid-Screens identifiziert wurde, enthalten war, wurde
aus dem pACT2-Vektor durch Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI
und HindIII isoliert und in den EcoRI/HindIII-Stellen des pcDNA3-Vektors
(Invitrogene) subkloniert, der das Neogen enthält, das Resistenz gegenüber dem
Antibiotikum G418 verleiht, und wurde an beiden Enden sequenziert.
Der so gebildete Vektor wurde als pcDNA3-mSnail bezeichnet.
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Das
Maus-E-Cadherin-Promotorkonstrukt, –178, das die Gensequenzen –178 bis
+92 bp, fusioniert mit dem CAT-Reportergen (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase) enthält, und
das mE-pal-Konstrukt (in dem die zwei zentralen GC-Nucleotide des
E-pal-Elements durch
TT mutiert wurden) wurden bereits zuvor beschrieben [Behrens, J., Löwrick, O.
Klein, H.L. & Birchmeier,
W., "The E-cadherin
Promoter: functional analysis of a GC-rich region and an epithelial
cell-specific palindromic regulatory element"; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 11495–11499 (1991);
Hennig, G., Löwrick,
0. Birchmeier, W. & Behrens,
J., "Mechanisms
identified in the transcriptional control of epithelial gene expression"; J. Biol. Chem.
271, 595–602
(1996); Faraldo, M.L., Rodrigo, I., Behrens, J., Birchmeier, W. & Cano, A., "Analysis of the E-cadherin
and P-cadherin promoters
in murine keratinocyte cell lines from different stages of mouse
skin carcinogenesis";
Mol. Carcinog. 20, 33–47
(1997)] und wurden von Dr. J. Behrens zur Verfügung gestellt.
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a) Analyse der Aktivität des E-Cadherin-Promotors
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MCA3D
AND PDV- Zellen wurden bei Subkonfluenz (3 × 105 Zellen
/ 6-cm-Durchmesser-Platten, P-60) in HamF12-Nährmedium mit 10 % fötalem Rinderserum
(Gibco) beimpft und 24 Stunden lang bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 %
CO2 bei einer Feuchtigkeit von 95 % inkubiert.
Das Medium wurde anschließend
durch frisches DMEM-Medium, das 10 % fötales Rinderserum enthielt,
ersetzt und wurde weitere 6 Stunden lang im Inkubator belassen.
Die Kulturen wurden unter Verwendung von Lipofectamin Plus (Life
Technologies) Transfektion gemäß den Anweisungen
des Herstellers unterzogen, wobei 2,5 μg von Konstrukt –178, mE-pal
oder der Kontrollvektor pCATbasic (ohne Promotorsequenzen) (Promega) verwendet
wurden und 1 μg
pcDNA3-Snail oder das leere pcDNA3-Plasmid vorhanden war. Als zusätzliche
Kontrolle wurde die Aktivität
der E-Cadherin-Promotorkonstrukte mit jener der Vektor-pCAT-Kontrolle (Promega),
die das CAT-Reportergen unter der Kontrolle des SV-40-Promotors enthielt,
verglichen, und so wurden die Zellen parallel mit diesem Vektor
transfiziert. Die Wirksamkeit der Transfektion wurde durch Cotransfektion
in allen Kulturen mit 2,5 μg
des CMV-Luc-Plasmids analysiert, das das Luciferase-Reportergen
unter der Kontrolle des Zytomegalievirus-Promotors enthält. 24 Stunden
nach Transfektion wurde das Medium verworfen, und nach Waschen mit
PBS wurden die Zellen durch sanftes Abstreifen der Platten gesammelt
und zentrifugiert (2.000 U/min, 4 Minuten lang). Durch Resuspendieren
des Zellpellets in 100 μl
eines Puffers, der 10 mM Phosphat, pH 8,0, enthielt, wurden Extrakte
erhalten und 4 Zyklen abwechselnden Einfrierens in flüssigem N2 und Auftauens bei 37 °C unterzogen. Luciferase-Aktivität wurde
anfänglich
in Aliquoten von 5 μl
unter Verwendung eines im – Handel
erhältlichen
Sets und eines Luminometers bestimmt. Aliquoten verschiedener Extrakte,
die äquivalente
Luciferase-Aktivitäten aufwiesen,
wurden auf CAT-Aktivität
analysiert, wobei C14-Chloramphenicol (Amersham)
als Substrat und Acetyl-CoA (Sigma) als Cofaktor gemäß dem bereits
beschriebenen Verfahren verwendet wurden [Faraldo, M.L., Rodrigo,
I., Behrens, J., Birchmeier, W. & Cano,
A., "Analysis of
the E-cadherin and P-cadherin promoters in murine keratinocyte cell
lines from different stages of mouse skin carcinogenesis"; Mol. Carcinog.
20, 33–47
(1997); Rodrigo, I., Cato, A.C.B. & Cano, A., "Regulation of E-cadherin gene expression
during tumor progression: the rote of a new Ets-binding site and
the E-pal element";
Exp. Cell Res. 248, 358–371
(1999)]. Die CAT-Aktivität, die
in MCA3D- und PDV-Zellen für
das –178-Konstrukt
des nativen E-Cadherin-Promotors erhalten wurde, betrug 70 % bzw.
50 % jener des pCAT-SV40-Vektors. Die erhaltenen CAT-Aktivitäten wurden
bezüglich
jener normalisiert, die für
das –178-Konstrukt
in Gegenwart des leeren pcDNA3-Vektors
in den beiden Zelllinien erhalten worden war. Transfektionstests
wurden in je zwei äquivalenten
Kulturen in beiden Zelllinien für
alle analysierten Versuchsbedingungen durchgeführt.
-
b) Wirkung der Expression
von mSnail im Zellphänotyp
und der Expression von Epithelmarker
-
Vorübergehende
Transfektion wurde mit 2 μg mSnail
(pcDNA3-mSnail-Vektor) und "Mock"-Kontrollen (mit
leerem pcDNA3-Vektor) in Maus-Keratinozytenlinien MCA3D und PDV
nach dem zuvor beschriebenen Verfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, dass
die Zellen auf kreisförmigen
Deckgläsern
(mit 1,2 cm Durchmesser), die auf der Oberfläche der P-60-Platten platziert
waren, beimpft wurden. Nach 24 und 48 Stunden nach der Transfektion
wurden die Glasplatten, die den zwei Versuchsbedin gungen der beiden
Zelllinien entsprachen, mit Methanol (–20 °C) 30 Sekunden lang fixiert
und wurden durch Immunfluoreszenz auf E-Cadherin- und Plakoglobinexpression
analysiert (Navarro, P. et al., "A
rote for the E-cadherin cell-cell adhesion molecule in tumor progression
of mouse epidermal carcinogenesis"; J. Gell Biol. 115, 517–533 (1991)].
Die Bilder wurden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops (Leica)
analysiert.
-
Stabile
Transfektionen von mSnail und "Mock"-Kontrollen wurden
an der MDCK-Epithellinie, die in DMEM-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum in
parallelen Kulturen und gemäß der zuvor
beschriebenen Arbeitsvorschrift gezüchtet wurde, durchgeführt. Zwischen
48 und 72 Stunden nach Transfektion, wenn die Kulturen Konfluenz
erreicht hatten, wurde das Medium gegen frisches Medium gewechselt, und
400 μg/ml
von G418 wurden zugesetzt, wobei nach 2–3 Wochen Wachstum in Gegenwart
des Antibiotikums die Zellen selektiert wurden, die gegen G418 resistent
waren. Die gesamte gebildete Population (der "Pool")
beider Kulturtypen (mSnail und Mock) wurde gesammelt, und unabhängige Klone wurden
durch Verdünnung
erhalten. Um dies umzusetzen, wurden 100 Zellen von beiden Populationstypen
auf P-100-Platten (10 cm Durchmesser) beimpft und in DMEM-Medium
mit 10 % fötalem
Rinderserum und 400 μg/ml
an G418 gezüchtet.
Unabhängige
Kolonien, die gegenüber
G418 resistent waren, wurden nach weiteren 2–3 Wochen erhalten, und diese
wurden durch Trypsinierung unter Verwendung von Clonierzylinder
(Innendurchmesser: 5 mm) isoliert und durch aufeinanderfolgendes
Durchlaufen von Kulturplatten steigender Größe (T6→F12,5→F25→F75) amplifiziert, wobei Antibiotikadruck
in allen Phasen der Kultur aufrechterhalten wurde. Insgesamt 10
unabhängige
Klone wurden aus der mSnail-Transfektion und 6 unabhängige Klone
aus der Mock-Transfektion isoliert. Die unterschiedlichen Klone
wurden auf E-Cadherin- und Plakoglobinexpression durch Immunfluoreszenz
(Analyse mittels konfokalen Mikroskops) und Immunübertragung
analysiert, und sie wurden auf mSnail-Expression durch RT-PCR nach Extraktion
des RNA-polyA+ der verschiedenen Klone und die Verwendung geeigneter
Primer, um ein Fragment von 388 Basenpaaren gemäß der mSnail-cDNA-Sequenz zu
amplifizieren, analysiert.
-
Beispiel 3. Erhalt von
Tumoren
-
a) Tumoren, die in immungehemmten
Mäuse durch Zelllinien
induziert werden
-
Tumoren
wurden in 8-Wochen-alte athymische männliche nu/nu-Mäuse des
BaIC-Stamms durch
subkutane Injektion von PDV, HaCa4 oder CarB-Zellen, wie bereits
davor beschrieben wurde, induziert [Navarro, P. et al., "A rote for the E-cadherin cell-cell adhesion molecule
in tumor progression of mouse epidermal carcinogenesis"; J. Cell Biol. 115, 517–533 (1991)].
Die unterschiedlichen Zelllinien wurden bis zur Konfluenz in F75-Kolben
wachsen gelassen und wurden trypsiniert und in Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) bei einer Dichte von 1×107 Zellen/ml in PBS resuspendiert. Die Zellen wurden
subkutan in beide Flanken jeder Maus (1×106 Zellen/Injektionsstelle)
unter Verwendung von Insulinspritzen und 25er-Nadeln für subkutane
Injektion injiziert. Üblicherweise
wurden 3 Tiere für
jede Zelllinie inokuliert (6 Injektionsstellen/Linie). Die Tiere wurden
von der IFA-CREDO-Produktionseinheit (Frankreich) erhalten und unter
sterilen Bedingungen in der speziell für solche Tiere eingerichteten
Anlage im Tierhaus des Instituto de Investigaciones Biomedicas (IIB)
gemäß den Vorschriften
des Zentrums in Bezug auf den Umgang mit Tieren gehalten. Die mit Injektionen
versehenen Tiere wurden dreimal pro Woche untersucht; das Auftreten
von Tumoren wurde durch visuelle Beobachtung bestimmt, und die Messung
ihrer Größe erfolgte
mittels Messlehre. Die Tiere wurden durch Erstickungstod in Äther getötet, wenn
der Außendurchmesser
der Tumoren 1,5–2,0 cm
erreicht hatte. Die Tumoren wurden entfernt, ein Stück wurde
in Formaldehyd zur darauf folgenden histologischen Analyse fixiert,
und der verbleibende Teil wurde sofort in Isopentan eingefroren,
das direkt in einem Bad von flüssigem
Stickstoff gekühlt
oder in OCT (Tissue Tek) vergossen wurde. Die Proben wurden bei –70 °C zur späteren Verwendung
gelagert.
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b) Induktion von Tumoren
in Mäusehaut
durch chemische Kanzerogenese
-
Tumoren
wurden in die Rückenhaut
von 8– bis
10-Wochen-alten BaIC-Mäusen,
die von der Produktionseinheit des IIB-Tierhauses erhalten wurden, unter
Verwendung der Zweistufen-DMBA/TPA-Arbeitsvorschrift induziert,
wie [Cano, A. et al., "Expression
pattern of the cell adhesion molecules E-cadherin, P-cadherin and
integrin is altered in pre-malignant skin tumors of p53-deficient
mice"; Int. J. Cancer 65,
254–262
(1996)] beschrieben. Eine Woche vor Beginn des Experiments wurden
die Rücken
der Tiere (20 insgesamt) rasiert, woraufhin eine einzelne Dosis
des kanzerogenen Dimethylben(z)anthracen (DMBA) bei einer Konzentration
von 50 μg/ml,
gelöst in
Aceton, aufgetragen wurde. Eine Woche später wurde die Förderung
durch örtliche
Anwendung von Phorboltetradecanoylphorbolacetat in einer Konzentration
von 50 μg/ml,
gelöst
in Ethanol, begonnen. Das TPA wurde alle 3 Tage über insgesamt 30 Wochen aufgetragen.
Die Tiere wurden unter wöchentlicher Beobachtung über insgesamt
50 Wochen gehalten. Nach 10 Wochen Behandlung mit TPA wurde das Auftreten
der ersten Tumoren des Papilloma-Typs nachgewiesen, und diese traten
im Laufe der Behandlung weiterhin auf, was schließlich eine
Inzidenz von 5–6
Tumoren pro Maus im Mittel ergab. Ein geringer Anteil der Papillomen
(5 %) entwickelten sich nach dem Ende der TPA-Behandlung zu Karzinomen.
Die Tiere wurden in unterschiedlichen Zeitabständen getötet, und die Tumoren wurden
extrahiert und wie zuvor beschrieben eingefroren.