DE4442253A1 - Elektrochemischer Enzymbiosensor - Google Patents
Elektrochemischer EnzymbiosensorInfo
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
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Description
Die Erfindung geht aus von einem elektrochemischen Enzymbiosensor mit
Edelmetallelektroden, bei dem eine elektrochemische Oxidation von Pyridin
nukleotiden, insbesondere von NADH erfolgt.
Eine Vielzahl von enzymanalytischen Verfahren der klinischen Diagnostik sowie
der Umwelt-, Prozeß- und Lebensmittelanalytik basieren auf Reaktionen, die von
Enzymen der Klasse der Dehydrogenasen katalysiert werden. Dabei nutzt man die
direkte Proportionalität zwischen der Konzentration des zu analysierenden Sub
strates einerseits und der Konzentration des gebildeten bzw. verbrauchten
Co-Enzyms NADH andererseits. In der Mehrzahl machen sich diese Verfahren
optische Eigenschaften des Moleküls NADH zunutze, das sich z. B. durch eine
charakteristische Absorption von Licht der Wellenlänge 360 nm von seiner
korrespondierenden oxidierten Form NAD⁺ unterscheidet. Im Falle gefärbter oder
trüber Analyten versagen diese spektrophotometrischen Methoden weitgehend oder
machen zumindest eine arbeits- und zeitaufwendige Probenvorbehandlung not
wendig. Diese kann durch elektrochemische Detektion von NADH umgangen
werden. Außerdem ist eine direkte, stabile Kopplung von Elektrode und Enzym
zur Bildung von elektrochemischen Biosensoren möglich. Der Nachteil der
elektrochemischen Methode liegt bisher in der hohen benötigten Überspannung zur
Oxidation von NADH. Durch sie werden eine Reihe weiterer Substanzen, die
ebenfalls im Analyten vorhanden sind, miterfaßt, so daß normalerweise zu hohe
Analysenwerte erhalten werden, die nachträglich korrigiert werden müssen.
Außerdem führt die elektrochemische Oxidation von NADH bei hohen Über
spannungen über radikalische Zwischenstufen zu Di- und Oligomeren von NADH,
die die Elektrodenoberfläche stabil belegen und nachhaltig schädigen (sog.
Elektrodenfouling, siehe dazu W.J. Blaedel & R.A. Jenkins, Study of the
electrochemical oxidation of reduced nicotinamide adenine dinucleotide, Anal.
Chem. 47 (1975)1337-1343). Um dieses Phänomen zu umgehen, setzt man dem
Analyten oftmals katalytische Mengen redoxfähiger Moleküle kleiner Molmasse
zu, die den Transport der Elektronen von NADH zur Elektrode bewerkstelligen
(siehe dazu u.v.a. L. Gorton, Chemically modified electrodes for the
electrocatalytic oxidation of nicotinamide coenzymes, J. Chem. Soc. Faraday
Trans. 82 (1986) 1245-1258). Diese sogenannten Mediatoren werden z. T. an die
Elektrode immobilisiert, wobei wegen der Einschränkung, daß der Mediator
beweglich bleiben muß, um wirksam zu sein, oftmals eine stabile Anbindung des
Mediators an die Elektrode nicht möglich ist. Dieser diffundiert in den Analyten,
worunter die Stabilität der Sensoren erheblich leidet.
Eine in US-PS 5 240 571 beschriebene Methode verwendet ein redoxfähiges
Kopplungsreagenz, das dem Analyten zugesetzt wird und mit NADH eine elektro
aktive Verbindung bildet, die bei niedrigen Überspannungen oxidiert wird. Aus
US-PS 5 122 456 ist bekannt, daß NADH quantitativ an mit Platin oder Palladium
belegten, porösen Kohlenstoff- und Graphitelektroden oxidiert werden kann, wobei
das verwendete Potential nicht angegeben wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen elektrochemischen Enzymbio
sensor mit Edelmetallelektroden, ohne Zusatz eines Mediators zum Analyten und
ohne chemische Modifikation der Elektrode derart zu verbessern, daß etwaige im
Analyten enthaltene Interferenzsubstanzen, die ebenfalls elektrochemisch oxidier
bar sind, weitgehend keine Elektrodenreaktion eingehen können. Neben der da
durch gewonnenen höheren Selektivität soll die Stabilität der Transduktor
elektroden und damit die Betriebsstabilität der daraus hergestellten Sensoren er
höht werden.
Diese Aufgabe wird, ausgehend von einem elektrochemischen Enzymbiosensor mit
Edelmetallelektroden, bei dem eine elektrochemische Oxidation von Pyridin
nucleotiden erfolgt, erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Edelmetallelektroden
eine oberflächenporenreiche Mikrostruktur mit katalytischen Eigenschaften auf
weisen, wodurch die für die elektrochemische Oxidation der Pyridinnucleotide not
wendige Überspannung herabgesetzt wird. Die oberflächenporenreiche Mikro
struktur ist durch zahlreiche mikroskopisch kleine Spitzen und Krater bedingt, so
daß die Oberfläche der Elektroden erheblich vergrößert wird. Die Spitzen bestehen
aus Edelmetallpartikel oder aus Partikelclustern, die aus der Elektrodenoberfläche
herausragen und einen mittleren Krümmungsradius von 0,05 µm bis 4 µm,
vorzugsweise von 0,5 µm bis 2 µm aufweisen. Durch diese Mikrorauhigkeit wird
die Oberfläche einer Elektrode etwa um den Faktor 3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 7
vergrößert (verglichen mit der geometrischen Oberfläche), was durch elektronen
mikroskopische und impedanzspektroskopische Messungen nachgewiesen werden
kann.
Diese besondere oberflächenreiche Mikrostruktur der Edelmetallelektroden führt
dazu, daß die Elektroden katalytische Eigenschaften aufweisen, die sich in einer
drastischen Reduktion der Überspannung für die Oxidation von Pyridinnukleotiden
insbesondere von NADH, bemerkbar machen. Es wurde gefunden, daß die zur
anodischen Oxidation von NADH zu NAD⁺ erforderliche Überspannung auf 0 bis
200 mV, vorzugsweise auf 100 bis 150 mV gegen SCE herabgesetzt wird und
damit um mindestens 50% unter den sonst üblichen Werten liegt.
Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn die mikroporösen Edelmetall
elektroden aus Gold bestehen.
Die Immobilisierung der selektivitätsbestimmenden Enzyme kann bevorzugt
dadurch erfolgen, daß eine das Enzym enthaltende Membran auf die Arbeits
elektrode aufgebracht wird. Die Haftung der Membran auf der planaren Elektrode
wird durch die oben beschriebene Mikrorauhigkeit der Elektrode begünstigt.
Insbesondere mit Membranen auf wäßriger Polyvinylacetatdispersion, wie sie z. B.
in DE 40 27 728 beschrieben werden, können stabile, selektive hochempfindliche
Biosensoren realisiert werden.
Gemäß einer Weiterentwicklung werden die mikroporösen Edelmetallelektroden
durch eine Beschichtung mit elektropolymerisierbaren leitfähigen Polymeren, ins
besondere mit Polypyrrol und Polymethylenblau modifiziert. Diese Modifizierung
kann zur Immobilisierung von Enzymen u. a. selektivitätsgebenden Biokompo
nenten herangezogen werden. Die disperse Oberfläche der Edelmetallelektroden
ermöglicht dabei ein homogenes Wachstum des Polymers während der Elektro
polymerisation, da viele reaktive, gleichmäßig über die gesamte makroskopische
Elektrodenoberfläche verteilte Zentren erzeugt werden.
Wird die elektrochemische Polymerisation in Gegenwart eines Enzyms
durchgeführt, so wird dieses durch physikalischen Einschluß in das Polymer
während dessen Wachstum vor der Elektrode immobilisiert. Das Polymergerüst
dient einerseits der Immobilisierung des Enzyms, hat aber auch die Funktion eines
Siebes, welches verhindert, daß große Moleküle, z. B. Proteine, an die Elektroden
oberfläche gelangen, diese belegen und damit zumindest reversibel schädigen.
Desweiteren kann das Polymer, sofern es Redoxzentren besitzt, als katalytischer
Mediator für die Elektronenübertragung von Enzym oder Coenzym auf die
Metallelektrode wirksam werden. Im Falle des Polymethylenblaus läßt sich somit
die Höhe des amperometrischen Signals deutlich steigern (Faktor 10), was sich
günstig auf das Signal-Rausch-Verhältnis auswirkt und damit zu einer niedrigeren
Nachweisgrenze und einer erhöhten Sensitivität für die zu bestimmenden
Substanzen führt.
Alternativ können Enzyme oder andere Biokomponenten direkt über reaktive
Seitengruppen an den Elektroden immobilisiert werden. Dadurch wird die
Konstruktion von Biosensoren mit extrem kurzen Ansprechzeiten im Vergleich zu
Membran-Biosensoren ermöglicht, da die Meßkomponente nicht durch eine
Membran diffundieren muß. Einige Enzyme, wie z. B. Glucoseoxidase, sind
Glykoproteine, deren Polysaccharidhülle sich zur chemischen Verknüpfung mit
bifunktionellen Spacermolekülen eignet. Diese Spacer werden über eine ihrer
beiden funktionellen Gruppen, z. B. über eine Aminofunktion, an die Zuckerreste
des Glykoproteins gebunden, während die andere funktionelle Endgruppe, z. B.
eine Thiolgruppe, mit der Oberfläche der Goldelektroden eine stabile Verbindung
eingeht. Im Falle der Glucoseoxidase wird das Enzymlyophilisat in Carbonatpuffer
(pH 8,1) gelöst und nach Zugabe von einprozentiger ethanolischer 2,4-
Dinitrofluorbenzollösung mit Natriumperiodatlösung (60 mM) versetzt, worauf
eine sogenannte Periodatspaltung des Zuckeranteils des Enzyms erfolgt. Dabei
erzeugte reaktive Carbonylgruppen werden im Anschluß an einen dialytischen
Reinigungsschritt mit einem bifunktionellen Thiol, z. B. mit Cystamin, über dessen
Aminogruppen verkuppelt. Das erhaltene, modifizierte Enzym wird über die Thiol
gruppen des Cystaminrestes stabil an die Goldoberfläche gebunden.
Die oben beschriebenen oberflächenporenreichen Mikrostrukturen werden bei der
Herstellung von Goldelektroden dadurch erzielt, daß ein chemisch inerter Träger
mittels Siebdruck mit einer aus einem Goldpulver und einem polymeren
Bindemittel bestehenden Paste beschichtet wird und der beschichtete Träger
anschließend durch einen Ofen mit ansteigend abgestuften Brenntemperaturzonen
geführt wird, wobei die Temperatur der ersten Brennzone 300°C bis 400°C und
die der letzten Brennzone 800°C bis 950°C beträgt. Die Verweilzeit des
beschichteten Trägers beträgt dabei vorzugsweise ca. 3 min bis 8 min.
Mit der Erfindung werden folgende Vorteile erzielt:
Es wurde gefunden, daß die Überspannung für die anodische Oxidation von
NADH zu NAD⁺ an den in Dickschichttechnologie mittels Siebdruck hergestellten
Edelmetallelektroden derart herabgesetzt wird, daß - im Gegensatz zu herkömm
lichen Edelmetallelektroden, die eine Überspannung von +600 mV erforderlich
machen - zur amperometrischen Messung von NADH-Konzentrationen Überspan
nungen von weniger als +200 mV gegenüber einer KCl-gesättigten wäßrigen
Kalomelreferenzelektrode (SCE) ausreichend ist. Die Reduktion der Überspannung
führt dazu, daß etwaige im flüssigen Analyten vorhandene, bei hohen Überspan
nungen cooxidierbare Störsubstanzen elektrochemisch nicht mehr umgesetzt wer
den und das Analysenergebnis nicht mehr verfälschen. Die beschriebenen Edel
metallelektroden finden Verwendung vor allem als Transduktoren für elektro
chemische Enzymbiosensoren auf der Basis von Dehydrogenasen. Hauptanwen
dungsgebiete dieser Sensoren sind die klinische Diagnostik sowie die Umwelt-,
Prozeß- und Lebensmittelanalytik.
Im folgenden wird die Erfindung anhand eines Herstellungsbeispiels und anhand
von Meßbeispielen näher erläutert.
Ein Goldpulver mit einer mittleren Teilchengröße von 1,5 µm und einer Größen
verteilung von 1 µm bis 3,5 µm wird mit einem Nitrocellulose-haltigen, polymeren
Bindemittel innig vermischt. Die so erzeugte Goldpaste wird dann mittels
Siebdruck auf eine keramische Trägerplatte der Größe 41 × 41 × 0,5 mm³
aufgetragen. Anschließend wird die beschichtete Trägerplatte mit einer Ge
schwindigkeit von 8 cm/min durch einen Ofen mit sechs jeweils 60 cm langen
Brennzonen mit folgendem Temperaturprofil gefahren:
- 1. Zone 336°C
- 2. Zone 685°C
- 3. Zone 872°C
- 4. Zone 905°C
- 5. Zone 857°C.
Die Teilchengrößenverteilung der Goldpartikel in der verwendeten Siebdruckpaste,
sowie deren Radien bestimmen die späteren Oberflächeneigenschaften und die
Porosität der Goldelektroden. Zusätzlich führen beim Pyrolysieren des Polymer
anteils auftretende Kleinstexplosionen dazu, daß sich scharfkantige Krater auf der
Goldoberfläche bilden, die ebenfalls die Oberflächeneigenschaften beeinflussen.
Die Kleinstexplosionen entstehen dadurch, daß tieferliegende Polymerschichten so
schnell pyrolisieren, daß die Gasdiffusion der darüberliegenden Schichten nicht
ausreicht, den entstehenden Druck abzubauen. Mittels vergleichender impedanz
spektroskopischer Messungen der tatsächlichen Oberflächengröße herkömmlicher,
polierter Goldelektroden und in Dickschichttechnik hergestellter Goldelektroden
wurde gezeigt, daß letztere bei gleicher geometrischer Oberfläche eine sechsmal
größere tatsächliche Oberfläche besitzen.
Es zeigen
Fig. 1 die zyklischen Voltamogramme von (a) einer mikroporösen Dickschicht
goldelektrode und (b) einer kommerziell erhältlichen, hochglanzpolierten,
planaren Goldelektrode (EG & G) in gepufferten Lösungen mit (-) und
ohne (-) Zusatz von NADH,
Fig. 2 die Langzeitstabilität einer mikroporösen Goldelektrode bei der Messung
von NADH,
Fig. 3 den Einfluß von Interferenzsubstanzen bei herkömmlichen und durch die
Erfindung ermöglichten Potentialen zur Oxidation von NADH,
Fig. 4 die Konzentrations-Strom-Kennlinie eines Glucose-Biosensors, der mit der
erfindungsgemäßen Elektrode als Transduktor bei niedrigen Polarisations
spannungen arbeitet.
Fig. 1 verdeutlicht die katalytische Aktivität der erfindungsgemäßen Elektroden
bezüglich der anodischen Oxidation von NADH. Im Verlaufe des zyklischen
Voltamogramms zeigt sich im Falle der Dickschichtgoldelektrode (a) in Gegenwart
von NADH (1) bei ca. +100 mV (gegen SCE) beginnend ein deutlicher anodischer
Strom, der durch die Oxidation von NADH hervorgerufen wird. Für den NADH-
freien Puffer (2) fehlt dieser Strom. Für herkömmliche Elektroden (b) ist ein
solches Verhalten unter identischen Versuchsbedingungen nicht feststellbar (3, 4).
Die zyklischen Voltamogramme wurden in 0,1 M Natriumphosphatpuffer von
pH 7,0, der als Leitsalz 0,1 M Natriumperchlorat enthielt, aufgenommen. Die
Voltgeschwindigkeit betrug 10 mV/sec. Die NADH-Konzentration betrug 0 mM
(2, 4) bzw. 5 mM (1, 3).
Die erfindungsgemäßen Dickschichtgoldelektroden wurden in ein Fließinjektions
system zur Detektion von 0,5 mM NADH eingebaut und bei +145 mV (gegen
SCE) betrieben. Fig. 2 zeigt den zeitlichen Verlauf des anodischen Stromes für die
Oxidation von NADH. Die Pfeile weisen darauf hin, daß jeweils frisch bereitete
NADH-Lösungen eingesetzt wurden. Die Abnahme des Stromes nach Einsatz einer
frischen Lösung ist somit hauptsächlich eine Folge der thermischen Zersetzung
von NADH in Lösung (0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 mit 0,1 M
Natriumperchlorat, Raumtemperatur) und nicht oder nur in geringem Umfang auf
Elektrodenfouling zurückzuführen.
Zur Verdeutlichung der Vorteile eines Sensorbetriebes bei niedrigen Polarisations
spannungen wurden mögliche Interferenzsubstanzen (1 und 2 mM Wasserstoff
peroxid, 1 und 2 mM Acetaminophen (= Paracetamol), 1 : 1 verdünntes und unver
dünntes Serum) zusammen mit NADH (1 und 2 mM) in einem Fließinjektions-
System untersucht (Fig. 3). Dabei wurde einmal die bisher gebräuchlichste Span
nung von (a) +555 mV an die Elektroden angelegt und (b) einmal bei dem niedri
geren Potential von +145 mV (beide gegen SCE), welches bei den erfindungs
gemäßen Elektroden zur Oxidation von NADH ausreicht, gearbeitet. Neben NADH
wurden bei diesem niedrigen Potential nur noch Serumkomponenten in geringem
Maße angezeigt.
Der Glucose-Biosensor, dessen Eichkurve in Fig. 4 wiedergegeben ist, stellt einen
möglichen Anwendungsfall für die erfindungsgemäßen Elektroden dar. Das Enzym
Glucose-Dehydrogenase wurde durch Matrixeinschluß in eine Polyvinylacetat-
Membran an die Goldoberfläche immobilisiert. Die Eichkurve wurde in einem mit
0,1 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,0 betriebenen Fließinjektionssystem
aufgenommen, dessen Injektionsvolumen 100 µl bei einer Flußrate von 0,6 ml/min
betrug.
Claims (10)
1. Elektrochemischer Enzymbiosensor mit Edelmetallelektroden, bei dem eine
elektrochemische Oxidation von Pyridinnukleotiden, insbesondere von
NADH erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Edelmetallelektroden eine
oberflächenporenreiche Mikrostruktur mit katalytischen Eigenschaften auf
weisen, wodurch die für die elektrochemische Oxidation der Pyridin
nukleotide notwendige Überspannung herabgesetzt wird.
2. Elektrochemischer Enzymbiosensor nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Oberfläche einer Elektrode aufgrund der Mikrostrukturen
3 bis 10 mal, vorzugsweise 4 bis 7 mal größer ist, als ihre geometrische
Oberfläche.
3. Elektrochemischer Enzymbiosensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich
net, daß die Elektrodenoberfläche Edelmetallpartikel mit einem mittleren
Krümmungsradius von 0,5 µm bis 2 µm, vorzugsweise 0,05 bis 4 µm,
aufweist.
4. Elektrochemischer Enzymbiosensor nach Anspruch 1-3, dadurch gekenn
zeichnet, daß die zur anodischen Oxidation von NADH zu NAD⁺ erforder
liche Überspannung auf 0-200 mV, vorzugsweise auf 100 bis 150 mV
gegen SCE herabgesetzt wird.
5. Elektrochemischer Enzymbiosensor nach Anspruch 1-4, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Elektroden aus Gold bestehen.
6. Elektrochemischer Enzymbiosensor nach Anspruch 1-5, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Elektroden mit einer Membran beschichtet sind, in der
selektivitätsbestimmende Biokomponenten, inbesondere Enzyme immobili
siert sind.
7. Elektrochemischer Enzymbiosensor nach Anspruch 1-6, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Elektroden durch Elektropolymerisation, insbesondere von
Pyrrol und Methylenblau modifiziert sind.
8. Elektrochemischer Enzymbiosensor nach Anspruch 1-7, dadurch gekenn
zeichnet, daß Enzyme oder andere Biokomponenten direkt über reaktive
Seitengruppen an den Elektroden immobilisiert sind.
9. Verfahren zur Herstellung von Edelmetallelektroden für einen elektro
chemischen Biosensor gemäß den Ansprüchen 1-6, dadurch gekenn
zeichnet, daß ein chemisch inerter Träger mittels Siebdruck mit einer aus
einem Goldpulver und einem polymeren Bindemittel bestehenden Paste
beschichtet wird und der beschichtete Träger durch einen Ofen mit
ansteigend abgestuften Brenntemperaturzonen geführt wird, wobei die
Temperatur der ersten Brennzone 300°C bis 400°C und die der letzten
Brennzone 800°C bis 1100°C beträgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der beschichtete
Träger jeweils mit einer Verweilzeit von 3 min bis 8 min durch eine
Brennzone des Ofens geführt wird.
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