DE4234728A1 - Verfahren für die Gewinnung und die Umpufferung und/oder Einengung von gelösten Makromolekülen eines Makromolekülegemisches - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Gewinnung und die Umpufferung und/oder Einengung von gelösten Makromolekülen eines Makromolekülgemisches unter Ver­ wendung einer Flüssigchromatographieanlage, bei welchem dem zu trennenden Makromolekülgemisch vor der Eingabe in die Flüssigchromatographieanlage oder während des Trennvorganges in der Flüssigchromatographieanlage den Trennvorgang fördernde Pufferlösungen zugesetzt werden, die die nach der Trennung zum Zwecke der Konzentration oder der Schonung der gewonnenen Molekülspezies ganz oder teilweise entzogen und/oder ausgetauscht werden.

Verfahren der genannten Art kommen vorwiegend in bio­ chemischen Labors zur Anwendung, wo es beispielsweise um die Gewinnung von makromolekularen Präparaten z. B. aus Körperflüssigkeiten geht. Dabei müssen zur geziel­ ten Beeinflussung der Interaktion zwischen den Bestand­ teilen des Gemisches und den Adsorbtionsmaterialien der Flüssigchromatographieanlage dem zu trennenden Gemisch spezielle Pufferlösungen zugegeben werden, die speziel­ le niedermolekulare Substanzen, z. B. Salze etc. ent­ halten, welche den Trennvorgang günstig beeinflussen. Diese speziellen Pufferlösungen sind jedoch in dem herzustellenden Präparat meistens unerwünscht oder schädlich und müssen aus diesem Grunde ganz oder teil­ weise aus dem Präparat entfernt werden oder gegen ande­ re Pufferlösungen ausgetauscht werden.

Nach dem Stande der Technik ist es üblich, den Entzug und/oder Austausch von Pufferlösung nach der Fraktio­ nierung des Eluates der Flüssigchromatographieanlage vorzunehmen. Hierzu wird zunächst das Eluat der Flüs­ sigchromatographieanlage, welches die unterschiedlichen Molekülspezies in sequentieller Folge enthält, auf ein­ zelne Sammelgefäße aufgeteilt und anschließend in ge­ sonderten Verfahrensschritten die Einengung (Entzug von Pufferlösung) oder die Umpufferung (Austausch von Puf­ ferlösung) vorgenommen. Dieses Vorgehen ist umständlich und erfordert einen erheblichen zeitlichen und appara­ tiven Aufwand. Die bei dieser Verfahrensweise unver­ meidbar auftretenden Zeitverzögerungen sind besonders dann nachteilig, wenn die empfindlichen Makromoleküle zu lange in einer für sie schädlichen Pufferlösung ver­ bleiben. Oft ist auch die Lebensdauer der Makromoleküle an sich so kurz, daß für die umständlichen Verfahrens­ schritte der Umpufferung und/oder Einengung nicht genü­ gend Zeit verbleibt.

Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, das Verfahren der eingangs genannten Art dahingehend weiterzubilden, daß die Umpufferung und/oder Einengung wesentlich schnel­ ler, kontinuierlich und mit möglichst geringem appara­ tivem Aufwand bewerkstelligt werden können.

Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung ausge­ hend vom Verfahren der eingangs genannten Art vor, daß der Entzug und/oder der Austausch der Pufferlösung durch eine Gegenstrom-Dialyse erfolgt, die kontinuier­ lich mit dem Eluat der Flüssigchromatographieanlage vorgenommen wird.

Das Verfahren gemäß der Erfindung hat den Vorteil, daß die Einengung und/oder die Umpufferung sehr frühzeitig unmittelbar im Anschluß an die sequentielle Trennung in der Flüssigchromatographieanlage und kontinuierlich erfolgt, und zwar für das gesamte Eluat in ein und dem­ selben Verfahrensschritt der Gegenstrom-Dialyse. Hier­ durch wird das Verfahren zur Einengung und/oder Umpuf­ ferung erheblich beschleunigt und kann in einem einzi­ gen Aggregat erfolgen, nämlich einem für die Gegen­ strom-Dialyse geeigneten Behandlungsmodul. Infolgedes­ sen reduziert sich bei Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung auch der erforderliche apparative Aufwand erheblich.

Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß für die Gegenstrom-Dialyse Hohlfasermembranmo­ dule verwendet werden, deren semipermeable Membranen für Makromoleküle undurchlässig sind und deren Hohlfa­ sern vom Eluat der Flüssigchromatographieanlage durch­ strömt werden und im Gegenstrom von in Lösungsmitteln gelösten niedermolekularen Substanzen umspült werden.

Solche Hohlfasermembranmodule sind im Prinzip aus der Medizintechnik z. B. für die Zwecke der Blutwäsche (Nierendialyse) bekannt. Darüber hinaus ist es aus der EP-B1-0 058 168 bekannt, das Eluat einer Flüssigchroma­ tographieanlage in einem Hohlfasermembranreaktor mit Reagentien zu behandeln, die zum Zwecke einer besseren und schnelleren Analyse mit Bestandteilsgruppen der Proben und/oder des Fließmittels reagieren sollen. Die­ se Vorgehensweise ist indessen zur Gewinnung von bio­ chemischen Präparaten, die die zu untersuchende Makro­ molekülspezies möglichst unbeschädigt enthalten sollen, grundsätzlich ungeeignet.

Eine besonders vorteilhafte Weiterbildung des Verfah­ rens gemäß der Erfindung sieht vor, daß das im Gegen­ strom zum Eluat geführte Lösungsmittel spezifische nie­ dermolekulare Substrate für die enzymatische Detektion enthält. Hierdurch ist es möglich, in ein und demselben Verfahrensschritt eine Information über die in der Se­ quenz des Eluats enthaltene Makromolekularspezies zu erhalten. Bei dieser enzymatischen Detektion kommt es ebenfalls nicht zu einer Reaktion mit den zu untersu­ chenden makromolekularen Substanzen, die unbeschadet in das zu gewinnende Präparat gelangen sollen.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung des oben erläuterten Verfahrens, be­ stehend aus einer Flüssigchromatographieanlage und min­ destens einem in der Abströmleitung der Flüssigchroma­ trographieanlage angeordneten Hohlfasermembranmodul, wobei sich diese Vorrichtung dadurch kennzeichnet, daß die Hohlfasermembranmodule mittels lösbarer Schnellver­ bindungen in die Abströmleitung der Flüssigchromato­ graphieanlage eingeschaltet sind.

Auf diese Weise ist es möglich, für die möglicherweise von Probe zu Probe unterschiedlichen Vorgänge der Ein­ engung oder Umpufferung gesonderte Hohlfasermembranmo­ dule bereitzuhalten, die im Bedarfsfall schnell ausge­ tauscht oder beliebig miteinander kombiniert werden können.

Für eine einwandfreie Funktion der Hohlfasermembranmo­ dule bei der Gegenstromdialyse ist es notwendig, für eine ausreichende Austauschzeit sowie eine ausreichen­ de Länge des Konzentrationsgradienten zu sorgen. Aus diesem Grunde schlägt die Erfindung vor, daß bei dem Hohlfasermembranmodul der Quotient aus der Anzahl der Hohlfasern und der effektiven Hohlfaserlänge den Wert 0,25 mm^-1 und der Innendurchmesser einer Hohlfaser den Wert 0,2 mm nicht überschreiten. Bei diesen Abmessungs­ verhältnissen ergeben sich Durchflußzeiten und damit Kontaktzeiten sowie Längen des Konzentrationsgradienten an den semipermeablen Membranen, die für den Dialyse­ vorgang optimal sind.

Drei Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im fol­ genden anhand der Zeichnung näher erläutert, die sche­ matisch den Aufbau einer Flüssigchromatographieanlage mit nachgeschaltetem Hohlfasermembranmodul zeigt.

In der Zeichnung ist die Flüssigchromatographieanlage in ihrer Gesamtheit mit dem Bezugszeichen 1 bezeichnet. Die Flüssigchromatographieanlage 1 weist oben einen Einlauf 2 und unten einen Auslauf 3 auf. In den Einlauf 2 wird das mit einer geeigneten Pufferlösung versetzte zu trennende Gemisch von makromolekularen Substanzen, z. B. eine Körperflüssigkeit, eingegeben. Im Inneren der Flüssigchromatographieanlage 1 werden die in dem durchfließenden Gemisch vorhandenen Makromolekülspezies in bekannter Weise sequentiell versetzt und dabei even­ tuell verdünnt und/oder mit niedermolekularen Sub­ stanzen vermischt. Am Auslauf 3 treten die verschiede­ nen Makromolekülspezies in zeitlich versetzter Form, d. h. sequentiell aus. Das am Ausflug 3 austretende Eluat enthält allerdings noch die zuvor oder während der Trennung zugesetzten Pufferlösungen, die für die zu gewinnenden Präparate unerwünscht oder sogar schädlich sind.

Um dem Eluat die unerwünschten oder sogar schädlichen Substanzen der Pufferlösung zu entziehen oder zu erset­ zen, ist an den Ausfluß 3 der Flüssigchromatographiean­ lage 1 ein Hohlfasermembranmodul 4 angeschlossen, in welchem der Entzug und/oder der Austausch von Pufferlö­ sung durch eine Gegenstrom-Dialyse vorgenommen wird.

Dieses Hohlfasermembranmodul ist in seinem Inneren mit einer Vielzahl von Hohlfasern 5 versehen, die semiper­ meabel, d. h. nur für niedermolekulare Substanzen durchlässig, für makromolekulare Substanzen indessen undurchlässig sind. Die Hohlräume dieser Hohlfasern 5 werden von dem Eluat der Flüssigchromatographieanlage 1 in Richtung der Pfeile 6 durchströmt. Gleichzeitig werden die Hohlfasern 5 über ihre gesamte Länge in Gegenrichtung zu den Pfeilen 6 von einer Dialyse-Flüs­ sigkeit umspült, deren Zusammensetzung es gestattet, die durch im Eluat befindlichen Pufferlösungen gezielt zu beeinflussen, d. h. entweder zu entziehen oder zu ersetzen. Gegebenenfalls kann die Dialyse-Flüssigkeit auch spezifische niedermolekulare Substrate für die enzymatische Detektion enthalten.

Um einen ausreichenden Kontakt zwischen dem die Hohlfa­ sern 5 durchströmenden Eluat und der im Gegenstrom geführten Dialyse-Flüssigkeit herzustellen, ist beim Hohlfasermembranmodul gemäß der Erfindung vorgesehen, daß einerseits der Quotient aus der Anzahl der Hohlfa­ sern 5 und der wirksamen Länge der Hohlfasern kleiner als 0,25 mm^-1 und andererseits der Innendurchmesser jeder Hohlfaser kleiner als 0,2 mm ist.

Die Dialyse-Flüssigkeit wird durch die Gehäusean­ schlüsse 7 und 8 in das Hohlfasermembranmodul eingege­ ben. Die Strömungsrichtung ist durch die Pfeile 9 ge­ kennzeichnet.

Wie weiterhin aus der Zeichnung ersichtlich ist, sind sämtliche Anschlüsse des Hohlfasermembranmodules 4 als schnell lösbare Steck- oder Schraubanschlüsse ausgebil­ det. Hierdurch ist es möglich, das Modul 4 schnell auszuwechseln und durch ein anderes zu ersetzen oder gegebenenfalls mehrere Module 4 in geeigneter Weise miteinander zu verschalten.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird im folgenden anhand von drei konkreten Ausführungsbeispielen erläu­ tert, von denen das erste sich auf eine Einengung der Makromoleküle in der Pufferlösung, das zweite auf eine Umpufferung und das dritte auf eine zusätzliche enzyma­ tische Detektion bezieht:

Beispiel 1

Ein Gemisch aus biologischen Makromolekülen, z. B. Zellrohextrakt wird durch Gelfiltration z. B. mittels Sephracryl S-2000 HR chromatographisch aufgetrennt. Die dabei durch das Trennprinzip unvermeidliche Verdünnung der Probelösung wird durch Konzentrierung mittels eines nachgeschalteten Hohlfasermembranmoduls wieder rückgän­ gig gemacht. Es wird eine 20%ige wäßrige, hygroskopi­ sche Polyethylenglykollösung (MG=20 000) zur Gegenspü­ lung verwendet. Dadurch wird dem Eluat über die semi­ permeable Membran Pufferlösung entzogen und somit die Aufkonzentrierung der Makromoleküle bewirkt.

Beispiel 2

Ein Gemisch aus biologischen Makromolekülen z. B. Blut­ plasma wird durch kovalente Chromatographie z. B. mittels Thiol-Sepharose chromatographisch aufgetrennt. Ein nachgeschaltetes Hohlfasermembranmodul kann dann die für die Trennung notwendigerweise dem Eluat zuge­ fügten Substanzen wie z. B. β-Mercaptoethanol und 2- Thiopyridyl-Gruppen, die eine nachfolgende optische Proteindetektion unmöglich machen, wieder entfernen. Zur Gegenspülung wird dabei z. B. physiologische Koch­ salzpufferlösung verwendet.

Beispiel 3

Das im Beispiel 1 oder 2 aufgeführte Experiment wird derart ergänzt, daß dem Hohlfasermembranmodul ein zwei­ tes in Serie nachgeschaltet wird. Hier wird im Gegen­ strom z. B. NADH und Pyruvat in die Pufferlösung ein­ dialysiert. Nach der Passage des Moduls kann dann im Eluat das Enzym Laktatdehydrogenase photometrisch z. B. bei 340 nm über den Verlust von NADH, der bei der enzy­ matischen Umsetzung von Pyruvat zu Laktat durch Laktat­ dehydrogenase auftritt, nachgewiesen werden.

Claims (5)

1. Verfahren für die Gewinnung und die Umpufferung und/oder Einengung von gelösten Makromolekülen eines Makromolekülgemisches unter Verwendung einer Flüssig­ chromatographieanlage, bei welchem dem zu trennenden Ma­ kromolekülgemisch vor der Eingabe in die Flüssigchroma­ tographieanlage oder während des Trennvorganges in der Flüssigchromatographieanlage den Trennvorgang fördernde Pufferlösungen zugesetzt werden, die nach der Trennung zum Zwecke der Konzentration oder der Schonung der gewonnenen Molekülspezies ganz oder teilweise entzogen und/oder ausgetauscht werden, dadurch gekennzeichnet, daß der Entzug und/oder der Austausch der Pufferlösung durch eine Gegenstrom-Dialyse erfolgt, die kontinuier­ lich mit dem Eluat der Flüssigchromatographieanlage vorgenommen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß für die Gegenstrom-Dialyse Hohlfasermembranmo­ dule verwendet werden, deren semipermeable Membranen für Makromoleküle undurchlässig sind und deren Hohlfa­ sern vom Eluat der Flüssigchromatographieanlage durch­ strömt und im Gegenstrom von in Lösungsmitteln gelösten niedermolekularen Substanzen umspült werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das im Gegenstrom zum Eluat geführ­ te Lösungsmittel spezifische niedermolekulare Substrate für die enzymatische Detektion enthält.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bestehend aus einer Flüssigchromatographieanlage und mindestens einem in der Abströmleitung der Flüssigchromatographieanlage angeordneten Hohlfasermembranmodul, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Hohlfasermembranmodule mittels lösba­ rer Schnellverbindungen in die Abströmleitung der Flüs­ sigchromatographieanlage eingeschaltet sind.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß bei dem Hohlfasermembranmodul der Quo­ tient aus der Anzahl der Hohlfasern und der effektiven Hohlfaserlänge den Wert 0,25 mm^-1 und der Innendurch­ messer einer Hohlfaser den Wert 0,25 mm nicht über­ schreiten.