DE3650786T2 - Analyseverfahren und Vorrichtung für biologische Proben - Google Patents

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Cell Analysis Systems Inc
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Description

  • Die Erfindung betrifft generell die Messung von Zellobjekteigenschaften und -parametern durch Bildanalyse und ist insbesondere auf quantitative Messverfahren und -vorrichtungen zur DNA-Analyse in kleinen Zellpopulationen gerichtet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum quantitativen Testen, die in einem weiten Bereich von diagnostischen und prognostischen Bewertungen verschiedener Zellen, Antigene oder anderer aus dem menschlichen Körper entnommenen biologischen Materialien verwendbar sind. Zum Zwecke der Veranschaulichung und leichten Verständlichkeit wird die Erfindung jedoch anhand ihrer bevorzugten Anwendung beschrieben, bei der es sich um die quantitative Messung von zellularer DNA zum Zwecke der Krebsdiagnose und -prognose handelt. Speziell betrifft die Erfindung ein Verfahren zur interaktiven Bildanalyse zum Anglisieren und Quantifizieren der DNA in einer Person entnommenen Probezellen.
  • Der gegenwärtige Stand in pathologischen Laboratorien besteht in der Messung des DNA-Gehaltes einer Zelle mittels visueller Betrachtung durch den Pathologen, der primär die Form und das Gewebe mutmaßlicher Krebszellen beobachtet und die Zellen anschließend in eine normale Kategorie oder in eine von mehreren abnormalen Krebskategorien klassifiziert. Derartige Bewertungen sind jedoch sehr subjektiv und können geringe Mengen der DNA in einzelnen Zellen oder sehr kleinen Populationen von abnormalen Zellen nicht unterscheiden oder quantifizieren. Derartige kleine Änderungen können einen beginnenden Krebszustand oder eine Änderung der Zellstruktur aufgrund einer Behandlung des Krebses durch Chemotherapie oder Bestrahlung repräsentieren. Somit sind solche kleinen Änderungen bei der Diagnose und Prognose dieser Krankheiten wichtig.
  • Der Vorteil bei der Diagnose und/oder Prognose von abnormalen Verteilungen für einen eine Probe unter einem Mikroskop betrachtenden Pathologen besteht jedoch in der vom Fachmann vornehmbaren klar unterscheidenden Beurteilung bei der Klassifizierung von Zellen als normal oder abnormal. Es existiert eine natürliche menschliche Begabung zur Durchführung relativ schneller begrenzter Klassifikationsabstufungen, d.h. fast normal, geringfügig abnormal, usw. Andererseits ist die Klassifizierung und Messung von Zellmerkmalen und -parametern durch den Pathologen von Zelle zu Zelle extrem mühsam und zeitaufwendig. Eine breite statistische Analyse derartiger Zelldaten von Hand ist relativ schwierig, da jede Aufnahme eingegeben und anschließend verarbeitet werden muss. Für verschiedene zu unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnene Aufnahmen und für sich ändernde Bedingungen können breite statistische Einteilungen möglicherweise unzuverlässig sein.
  • Die Alternative ist eine automatische Zellanalyse, bei welcher der Pathologe zur Durchführung der Analyse spezialisierte Geräte verwendet. Bei der automatischen Zellanalyse, wie sie beispielsweise mittels eines Durchflusszytometers durchgeführt wird, werden bei einer Probezellpopulation grobe Massentests durchgeführt, ohne dass der Untersuchende bestimmte Daten der Population ausschließen oder einschließen kann. Die Probe wird "wie sie ist" gemessen, ohne dass tatsächlich bekannt ist, welche und wie viele Zellen gemessen werden. Wichtige Einzelzelldaten oder Daten von relativ kleinen Zellgruppen gehen bei der Gesamtausmittelung einer Probe verloren. Zudem müssen wegen des Mittelungsproblems zur Gewährleistung der Genauigkeit relativ große Mengen einer Probe verwendet werden. Dies ist im Stand der Technik als notwendig betrachtet worden, um große Mengen von Zelldaten relativ schnell so zu verarbeiten, dass die Ergebnisse einigermaßen präzise sind. Wiederum können auch hier kleine Änderungen von Einzelzellen oder kleinen Zellpopulationen nicht genau erkannt werden.
  • Zwar sind Durchflusszytometer für generelle Zwecke kommerziell erhältlich; sie sind jedoch sehr teuer und können lediglich flüssige Blutproben oder Gewebeauflösungen handhaben. Diese Zytometer können keine Standardgewebeschnitte verarbeiten oder konventionelle Mikroskopschnitte nutzen, welche die bevorzugten Probeformen in pathologischen Laboratorien sind. Darüber hinaus ermöglicht ein Durchflusszytometer keine Analyse von morphologischen Eigenschaften von Zellen, wie beispielsweise die Beschaffenheit, die Größe und die Form von Zellkernen und Abweichungen in Kern/Zytoplasma-Verhältnissen der Zellen.
  • Darüber hinaus sollte bei einer derartigen Zellanalyse, unabhängig davon, ob sie automatisch oder manuell ist, eine Verifizierung der Resultate möglich sein, damit sie zweckdienlich ist. Die normale wissenschaftliche Methode zur Realisierung der Verifizierung besteht darin, die Probe aufzubewahren, damit ein anderer Pathologe seine Analyse mit der des ersten Pathologen vergleichen kann. Für durch manuelle Mittel klassifizierte Einzelzellen sind dabei jedoch Photos, Zeichnungen oder andere ungenaue Medien erforderlich, da es extrem schwierig ist, eine Gewebeprobe für lange Zeit zu fixieren. Selbst bei Techniken, mit denen derartige Proben für eine nachfolgende Betrachtung ausreichend fixiert werden, verbleibt jedoch das Problem des Auffindens der gleichen Zelle oder kleiner Zellpopulationen, an denen die ursprüngliche Bestimmung durchgeführt wurde, sowie der Herstellung der gleichen Bedingungen für die Betrachtung. Mit automatischen Verfahren wird die Probe verbraucht, wobei eine Verifizierung nur durch Beobachtung gleichartigen Gewebes aus dem gleichen Bereich möglich ist.
  • Das Dokument US-3,908,078 zeigt eine zur digitalen Erkennung von Objekten vorgesehene Vorrichtung mit einem optischen Scanner, der mit einem digitalen Computer verbunden ist. Ein Objektträger mit normalem Gewebe wird gescannt, digitalisiert und als Referenzmaterial in dem Computer gespeichert. Das dem Test unterzogene Gewebe wird gescannt und digitalisiert. Anschließend werden die digitalisierten Werte verglichen, um festzustellen, ob die Gewebe einander ähnlich sind. Das System funktioniert wie eine Datenbank für biologische Proben. Das Problem der Kalibrierung wird nicht angesprochen.
  • In Patent Abstracts of Japan, Vol. 9. Nr. 323 (P-414) (2046), 18. Dezember 1985 und in JP-A-60 149 947 (YASUKAWA DENKI SEISAKUSHO K.K.) ist eine Dichte-Detektionsvorrichtung beschrieben, bei der Laserlicht verwendet wird, um die Dichte zweier Referenz-Reflexionskörper und gedruckter Bereiche, die untersucht werden sollen, zu messen. Bei dem ersten Reflexionskörper handelt es sich um einen Körper zum Messen eines Absolutwerts, während der zweite Körper zum Messen eines Relativwerts dient. Die Kalibrierung der Vorrichtung wird wie folgt durchgeführt: das als reflektierter Strahl vorgesehene Signal von dem ersten oder dem zweiten Reflexionskörper wird zum Korrigieren der Empfindlichkeit des Strahlempfängers für die Messung der gedruckten Bereiche verwendet. Somit ist eine komplizierte Vorrichtung mit einstellbarem Strahlempfänger erforderlich.
  • Ferner werden die Referenz-Reflexionskörper verwendet, um die Empfindlichkeit der Dichte-Messung zu kalibrieren; das Kalibrieren des Anfärbens ist nicht beschrieben.
  • Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Zellanalyseverfahren anzugeben, das eine quantitative Analyse von Probenzellenobjekten mit hoher Präzision ermöglicht.
  • Das Zellanalyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist durch Anspruch 1 definiert.
  • Ferner betrifft die Erfindung einen mikroskopischen Objektträger nach Anspruch 5.
  • Für eine quantitative DNA-Analyse erfolgt die Messung der optischen Dichte des Zellobjektes, wobei die Klassifizierung durch einen Pathologen dahingehend erfolgt, ob die Zelle als normal oder kanzerös erscheint. Die Entscheidungen können beinhalten, ob die spezielle Zelle für eine weitere Verarbeitung angenommen oder abgewiesen wird. Das ausgewählte Zellobjekt kann ferner in eine von mehreren Klassifikationen für eine spätere statistische Analyse klassifiziert werden. Die Vorrichtung weist ferner Einrichtungen auf, mit denen mehr als ein einziges Bild klassifiziert und gespeichert werden kann.
  • Wird das Verfahren zur DNA-Analyse verwendet, so werden Gewebe- und Zellproben auf einen Objektträger aufgebracht, der sodann mit einem speziellen Anfärbemittel eingefärbt wird, das sich proportional mit der DNA kombiniert und den Rest der Zelle im wesentlichen unsichtbar macht, so dass bei der Bildanalyse die optische Dichte der im Kern der Zelle konzentrierten DNA gemessen werden kann. Die Farbe ist der DNA zugeordnet, um eine detaillierte Kernstruktur und ein Raster zu erzeugen, das durch den das Gerät zur Klassifikation benutzenden Pathologen beobachtet und interpretiert werden kann. Die DNA-Menge in den malignen Zeilen ist im wesentlichen größer als die normaler Zellen, weil die malignen Zellen sich gewöhnlich schnell teilen und kopieren oder abnormale Chromosomenzahlen oder defekte Chromosomen besitzen.
  • Die bevorzugte und dargestellte Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung kann nicht nur kleine Änderungen im Kern durch reale und genaue Messung der DNA-Masse in Picogramm detektieren, sondern kann auch die DNA-Menge messen und quantifizieren und sie zwecks Unterstützung der Diagnose in Beziehung zu gespeicherten statistischen Analysen setzen. Insbesondere ermöglicht die Erfindung eine iterative Analyse von Probepopulationszellen und schafft ein Histogramm oder eine andere statische Anzeige der Populationsverteilung der Zellen in Bezug auf ihren DNA-Gehalt sowie in Bezug auf eine Standard-DNA für normale Zellen, so dass feine Verschiebungen in der Populationsvuerteilung leicht interpretierbar sind. Zu diesem Zweck werden nicht nur Zellkernbilder erfasst und gespeichert, sondern es können auch die Daten daraus mit anderen statistischen Daten integriert werden, um eine mehrdimensionale Analyse, eine Unterscheidung von Zellen, Histogramme sowie Streuungsdiagramme von Zellen oder Zellpopulationen zu realisieren.
  • Die Nutzung von Bildanalysetechniken und -anlagen für angefärbte Proben durch Pathologen in einem konventionellen Pathologielaboratorium ermöglicht die Lösung einer Anzahl von Problemen, welche durch die vorliegende Erfindung beseitigt werden. Beispielsweise existiert zwar eine Anzahl von verfügbaren verwendbaren Anfärbetechniken, wie beispielsweise eine nachfolgend beschriebene Azur A Feulgen-Anfärbetechnik, die Anfärbung der DNA ändert sich jedoch wesentlich nicht nur von Objektträger zu Objektträger und von Charge zu Charge durch den gleichen Pathologen, sondern auch wesentlich zwischen verschiedenen Pathologen und verschiedenen Laboratorien. Da die vorliegende Bildanalysevorrichtung den Graupegel oder die optische Dichte misst und da es erwünscht ist, eine wahre tatsächliche Messung von DNA in Picogramm zu leisten, ist es wichtig, das Problem un terschiedlicher Anfärbefaktoren für unterschiedliche Proben zu lösen. Ferner schaffen auch Bildanalysetechniken mit einstellbaren Mikroskopen und optischer Beleuchtung unterschiedliche Lichtintensitäten bei Verwendung durch den Pathologen. Man kann entsprechend ausgebildeten Wissenschaftlern in wissenschaftlichen Laboratorien Mittel zur Verfügung stellen, mit denen durch Bildrastertechniken die optische Intensität auf die gewünschten Bedingungen für eine Bildanalyse eingestellt werden kann; dies kann jedoch nicht mit der für das gebräuchliche pathologische Labor notwendigen Genauigkeit realisiert werden. Daher muss das Problem dieser variablen Lichtintensität und damit variablen optischen Dichte überwunden werden.
  • Ferner ist die vorliegende Erfindung auf die Überwindung des Problems des hohen Kostenaufwandes gerichtet, der bisher mit für die Bildanalyse verwendeten automatisierten Anlagen anfiel; zu diesem Zweck schafft die vorliegende Erfindung ein einfach bedienbares interaktives System, in dem der Pathologe eine Anzahl von Aufgaben löst und die Präparierung von Zellen und ihre Auswahl durch Bedienung der Anlage durchführt. Dem Pathologen stehen ferner Objektträger zur Verfügung, welche zur Unterstützung der Analyse der Probezellen in Bezug zu Referenzzellen speziell präpariert und kalibriert sind und die Überwindung des oben beschriebenen Anfärbeproblems unterstützen.
  • Die vorliegende Erfindung ist speziell zum Lokalisieren der Zellen für eine Untersuchung hinsichtlich ihrer Morphologie und zur Beibehaltung ihrer Lage für eine bedarfsweise spätere oder erhärtende Analyse durch einen zweiten Pathologen entwickelt worden. Wie hinsichtlich von Kernen noch ausgeführt wird, können Messungen hinsichtlich von deren Größe in Mikrometer, der optischen Gesamtdichte von Kernen oder der Kernmasse in Picogramm, der mittleren optischen Dichte von Kernen, der Kerntextur und der Abweichung der Kernform von runden Kernen durchgeführt werden.
  • Die Erfindung wird deutlicher ersichtlich bei Lektüre der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt eine bildliche Darstellung eines gemäß der Erfindung aufgebauten Bildanalysesystems;
  • 2 zeigt ein funktionales Blockschaltbild des Bildanalysesystems nach 1, das zur Durchführung eines Bildanalyseverfahrens gemäß der Erfindung dient;
  • 2A zeigt ein funktionales Systemdiagramm, aus dem die Hauptfunktionen der in 2 dargestellten Systemsteuerung ersichtlich sind;
  • 3 zeigt ein elektrisches Blockschaltbild einer Schnittstellenelektronik für die X-,Y-Positionsschaltungsanordnung nach 2;
  • 4 zeigt repräsentative Zeitsteuerungs-Wellenformen für die Eingabe in die Schnittstellenelektronik nach 2;
  • 5A, 5B und 5C zeigen eine perspektivische Ansicht, eine Draufsicht bzw. eine Schnittansicht eines Objektträgers, der speziell an die Verwendung im Bildanalysesystem nach 1 angepasst ist und getrennte Bereiche für Kalibrierungszellenobjekte und Probezellenobjekte aufweist;
  • 6 bis 9 zeigen bildliche Darstellungen von Histogrammen für verschiedene normale und abnormale Zellpopulationen;
  • 10 zeigt eine bildliche Darstellung der unterschiedlichen Schirmbilder, die auf einen Instruktionsmonitor gemäß 1 sichtbar sind;
  • 11 zeigt eine bildliche Darstellung des Hauptschirmbildes, das auf dem Instruktionsmonitor nach 1 erscheint;
  • 12 zeigt eine bildliche Darstellung des Kalibrierungsschirmbildes, das auf dem Instruktionsmonitor nach 1 erscheint;
  • 13 zeigt eine bildliche Darstellung des Analyseschirmbildes, das auf dem Instruktionsmonitor nach 1 erscheint;
  • 14 zeigt eine bildliche Darstellung des X-,Y-Feld-Koordinaten-Schirmbilds, das auf dem Instruktionsmonitor nach 1 erscheint;
  • 15 zeigt eine bildliche Darstellung der Optionsliste für den Hauptschirm nach 11;
  • 16 zeigt eine bildliche Darstellung der Optionsliste für den Kalibrierungsschirm nach 12;
  • 17 zeigt eine bildliche Darstellung der Optionsliste für den Analyseschirm nach 13;
  • 18 zeigt eine bildliche Darstellung der Messvorgänge für den Kalibrierungsschirm nach 12;
  • 19 zeigt eine bildliche Darstellung der Analysevorgänge für den Analyseschirm nach 13;
  • 20 zeigt eine bildliche Darstellung des Analysevorgangs in zeitlicher Folge für ein Feld von Zellenobjekten auf der Bildanzeige nach 1;
  • 21 zeigt ein Bilddiagramm eines zur Bildanalyse verwendeten Objektträgers, der durch das Bildanalysesystem nach 2 in mehrere auswählbare Bildfelder unterteilt ist;
  • 22 zeigt ein bildliches Diagramm eines zur Lichtquellenkalibrierung im Bildanalysesystem nach 1 verwendeten Histogramms;
  • 23 zeigt ein Flussdiagramm des Programms, das die X-,Y-Koordinatenposition der Plattform des Mikroskops nach 1 ausliest;
  • 24 zeigt ein Software-Flussdiagramm des Programms, das zur Verarbeitung der Analyse- und Messvorgänge für den Analyse- bzw. Mess-Schirm nach 12 bzw. 13 dient; und
  • 24A, 24B und 24C zeigen ein Feldmuster mehrerer Zellobjekttabellen, ein Zellobjektmuster bzw. eine Zellobjekttabelle, wie sie durch das Programm ausgenutzt werden.
  • Die Vorrichtung gemäß 1 und 2 kann zur Entwicklung von Histogrammen und anderer statistischer Daten von Zellpopulationen für die Diagnose und Prognose von Krebserkrankungen und anderen Erkrankungen verwendet werden. Die Brauchbarkeit einer derartigen statistischen Analyse wird anhand der 6 bis 9 erläutert.
  • Die nun zu beschreibende 6 zeigt ein normales auswertendes Histogramm der Zellenanzahl als Funktion der Massenverteilung für gesunde, sich nicht teilende Zellen. Die Anzahl von Zellen ist auf der Ordinate und deren Kernmasse auf der Abszisse aufgetragen. Wenn sich die in dieser Figur dargestellte Zellpopulation nicht teilt, so sollte der DNA-Gehalt eine Spitze um eine Normalspitze G0/G1 bilden, bei der es sich um die diploide Menge von 7,18 Picogramm/Zelle handelt. Diese relative Masse der DNA ist mit 1,0 bezeichnet, um die Abszisse des Histogramms zu normieren. 7 zeigt ebenfalls eine normale sich teilende Zellpopulation, bei der eine signifikante G0/G1-Spitze bei 1,0 und eine zweite Spitze G2 bei 2,0 liegt. Die Spitze bei 2,0 ist normal, weil einige der Zellen sich teilen und die doppelte diploide Menge an DNA besitzen. Der Sattel S zwischen den beiden Spitzen ist relativ klein und zeigt keine Krebserkrankung an.
  • Aus dem Vergleich des Histogramms gemäß 8 mit den ersten beiden Histogrammen ist ersichtlich, dass diese Zellpopulation vom Normalen abweicht, und eine höhere erste Spitze um 1,5 und eine zweite Spitze um 3,0 besitzt. Ferner ist der Sattel 5 ausgeprägter und kann in der Zellzählung grob sein. Dieses Histogramm kann wegen des abnormal hohen DNA-Gehaltes vieler der Zeilen eine Krebserkrankung anzeigen. Dieser hohe DNA-Gehalt ist eine wahrscheinliche Anzeige der erhöhten Chromosomensatzmenge von kanzerösen Zellen, welche sich schnell teilen. Entsprechend zeigt 9, dass die G0/G1-Spitze bei 1,0 mit einer normalen diploiden Menge an DNA auftritt, aber einen relativ großen hinteren Sattel von 1,0 bis 2,8 besitzt. Eine normale zweite G2-Spitze wird nicht beobachtet, was auf eine abnormale Zellpopulation hinweist. Die Form des Histogramms ergibt sich wahr scheinlich aufgrund von abnormalen DNA-Mengen in Zellen und Zellhaufen, welche eine Krebserkrankung anzeigen. Daher können aus den Formen und den Änderungen von Zellverteilungshistogrammen diagnostische und prognostische Informationen gewonnen werden.
  • In der dargestellten Implementierung ist das System ein computerisiertes Bildanalysesystem, das zur Messung einer Anzahl von Zellobjekteigenschaften und -parametern aus deren Bild auf einem typischen Glasobjektträger ausgelegt ist. Das Instrument enthält ein hochentwickeltes, durch Software gesteuertes digitales Bildverarbeitungssystem zur Durchführung einer quantitativen Analyse einzelner Zellen hinsichtlich des Kern-DNA-Gehaltes durch Feulgen-Anfärbung sowie zur Messung weiterer Kerneigenschaften. Das Abbildungssystem erlaubt eine Kombination der Fähigkeit eines Pathologen zur Identifizierung von zu studierenden Zellen mit den Möglichkeiten einer computergestützten digitalen Video-Bildverarbeitung hoher Auflösung zwecks genauer Quantifizierung der optischen Dichte und Anfärbedichte.
  • Generell präpariert ein Pathologe zunächst ein entnommenes Präparat bzw. eine Punktierung frischen Gewebes. Andererseits können auch eingebettete Proben hinsichtlich interessierender Bereiche visuell untersucht werden und anschließend durch Zerkleinern in Gegenwart von Pepsin entparaffiniert und getrennt werden, um eine einzige Zellsuspension zu erzeugen, welche dann auf einen Mikroskopobjektträger aufgebracht wird. Nach Fixieren und Anfärben mit Azur-A-Feulgen-Anfärbemittel ist das Präparat für die Analyse bereit.
  • Die Bedienungsperson hat dann die Wahl einer morphologischen Klassifizierung der Zellen in eine von sechs Kategorien oder des Verwerfens ungeeigneter Zellen oder Zellausschusses. Die Zelldaten werden durch eine Systemsteuerung verarbeitet, und ihre zellularen Elemente werden durch eine quantitative DNA-Analyse für jede Zellklasse charakterisiert. Bei Vergleich der Information entweder mit einer Standardzelleichung oder mit veröffentlichten Daten ist es einem Pathologen möglich, Abnormalitäten, wel che gewöhnlich lediglich verbal aus dem Bild einer angeschauten Person beschrieben werden können, genau zu quantifizieren und zu klassifizieren.
  • Das Hinzufügen von quantitativen Daten ermöglicht es den Pathologen, ihre Arbeit standardisierter und reproduzierbarer durchzuführen. Das System ist bei der Klassifizierung von möglicherweise malignen Veränderungen und bei der Gewinnung von prognostischer Information für bekannte Krebserkrankungen auf der Basis des DNA-Gehaltes zweckmäßig. Das Bildidentifizierungssystem ist vorteilhafter als gebräuchliche Durchflusszytometrieverfahren zur Ermittlung des DNA-Gehaltes. Eine Durchflusszytometrie ermöglicht es einer Bedienungsperson, neoplastische Zellen lediglich auf der Basis von Zellmarkierungen zu klassifizieren. Der Pathologe sieht jedoch niemals die Zellen, welche das Instrument untersucht hat. Ferner muss die Zellpräparierung in einem kurzen Zeitrahmen verwendet werden und wird im Laufe der Untersuchung verbraucht. Obwohl ein bleibender Schnitt eines untersuchten Tumors gleichzeitig untersucht werden kann, besteht keine Garantie, dass die gleichen Zellen in beiden Bereichen untersucht werden. Auch kann die verfügbare Tumormenge möglicherweise nicht groß genug sein, um eine Durchflusszytometrie-Untersuchung zu erlauben.
  • Gemäß der Erfindung wird die quantitative DNA-Analyse zur Messung der DNA und des Chromosomensatzverteilungsmusters in einer studierten Zellpopulation schnell durchgeführt. Der Pathologe wählt vorteilhafterweise die Zellen aus, welche bei den Populationsmessungen verwendet werden sollen. Die Messung des DNA-Gehaltes ist nützlich und bei der Diagnose und der bestimmenden Prognose für eine Vielzahl von Tumoren in Brust, Darm und Prostata als relevant anzusehen. Das System macht sich die Erfahrung des Pathologen zur visuellen Identifizierung abnormaler Zellen zunutze und verwendet dann eine computergestützte Bildanalyse zur quantitativen Analyse dieser Einzelzellen für die gewünschten Parameter. Ein derartiges Instrument erweitert und unterstützt die Erkennung und die diagnostische Erfahrung des Pathologen.
  • Wie in den Zeichnungen zur Veranschaulichung deutlicher gezeigt ist, ist die Erfindung in einem Verfahren und in einer Vorrichtung zur automatischen Analyse von "Zellobjekten" realisiert, wobei dieser Begriff hier generell für Zellen, wie beispielsweise Blutzellen oder aus Tumoren entnommene Zellen oder ähnliches verwendet wird, welche hinsichtlich des DNA-Gehaltes analysiert werden sollen. Der Begriff umfasst auch nicht-biologische Objekte, wie beispielsweise bei biologischen Studien verwendete konventionelle Kunststoff- oder Glaskugeln, gefärbte Zellbilder auf einem Objektträger oder Antigene oder monoklonale Antikörper auf Zellen. Das System findet ferner dort Verwendung, wo ein monoklonaler Antikörper mit einem Anfärbemittel gepaart ist, wobei das Anfärbemittel ein fluoreszentes Material sein kann, das bei einer Wellenlänge angeregt wird und dann bei einer anderen Wellenlänge analysiert werden kann, wo Fluoreszenz auftritt. Beispielsweise ist die vorliegende Erfindung zur Chromosomensatzanalyse, Analyse von Zellen roter Blutkörperchen, Schleimschmier-Zellanalyse, Monoklonalantikörperanalyse und zur Analyse anderer Infektionskrankheiten geeignet, welche durch DNA-Proben hinsichtlich Viren diagnostiziert werden können. Das Abbildungs- und Analysesystem wird daher vorteilhafterweise bei einer Anzahl von Untersuchungen verwendet, bei denen eine der optischen Charakteristiken, wie beispielsweise die optische Dichte, eines Zellobjektes ausgenutzt werden kann, um einen bestimmten Parameter oder eine bestimmte Eigenschaft desjenigen Objektes zu bestimmen, das sich für einen bestimmten Zustand zur Diagnose oder Prognose eignet.
  • Gemäß 1 und 2 der Zeichnung ist die Erfindung als Vorrichtung 11 ausgebildet, die funktionell als digitales Bildverarbeitungssystem 13 arbeitet (2). Die Vorrichtung 11 umfasst ein hochauflösendes Mikroskop 15, mit dem eine Bedienungsperson Proben auf einem Träger, in der bevorzugten Ausführungsform ein Glasobjektträger 14, beobachten kann. Das Mikroskop 15 besitzt eine Einrichtung 70 zur Fokussierung seiner Optik auf den Objektträger und eine durch Einrichtungen 110 und 17 zur Betrachtung verschiedener Bereiche in X- und Y-Richtung schrittweise bewegbare Plattform 51. Die Proben bzw. das Material auf dem Objektträger 14 können ferner durch das Abbildungssystem 13 betrachtet werden, das durch eine Systemsteuerung 22 in Form eines digitalen Prozessors, beispielsweise eines Personal Computers, gesteuert wird. Eine Bedienungsperson kann mit der Systemsteuerung 22 über eine Tastatur 36 kommunizieren und interagiert mit der Vorrichtung 11 durch Betrachtung zweier Anzeigen. Eine erste Anzeige in Form einer Bildanzeige 37 ist ein RGB-Monitor, welcher über die Systemsteuerung 22 das gleiche Bild anzeigt, wie es durch das Mikroskop 15 gesehen wird. Eine zweite Anzeige in Form eines Befehlmonitors 62 ist ein weiterer RGB-Monitor, welcher der Bedienungsperson interaktive Eingabeaufforderungen, Mitteilungen, Information und Befehle aus dem Programm liefert, welches die Systemsteuerung 22 steuert. Ein Drucker 38 dient zur Erzeugung eines zuverlässigen Hard-Copy-Ausdrucks der durch die Vorrichtung 11 erzeugten Daten.
  • Das Funktionsschema der Vorrichtung 11 ist in 2 als Bildverarbeitungssystem 13 dargestellt. Das Bildverarbeitungssystem 13 dient zur Analyse einer Vielzahl von Zellobjekten auf dem Träger bzw. dem Glasobjektträger 14 des Mikroskops 15. Eine geeignete Mikroskopoptik 16 hoher Auflösung nimmt Licht von einer variablen Intensitätsquelle 17a durch den Objektträger 14 auf. Die Optik 16 erzeugt ein optisches Bild jedes der Zellobjekte auf dem Objektträger 14 und überträgt diese auf einen Bildteiler 25, welcher in Form eines Prismas vorgesehen sein kann.
  • Auf einer Seite des Teilers 25 überführt eine Fernsehkamera 18 oder ein anderer Detektor die optischen Bilder punktweise in ein abgetastetes elektronisches Signal, das die optische Intensität jedes Punktes im Bild repräsentiert. Die Ausgangsgröße der Kamera 18, welche ein Standard-NTSC-Analogvideosignal ist, wird in einen Analog-Digital-Umsetzer einer Bildverarbeitungsschnittstelle 21 eingespeist. Die Bildverarbeitungsschnittstelle 21 setzt das Bildsignal von der Fernsehkamera 18 in ein digitalisiertes Signal um, das von der Systemsteuerung 22 empfangen und gespeichert wird. Wegen der kontinuierlichen Abtastung wird durch die Bildanzeige 37 ein Echtzeitbild des Bereiches geliefert, auf den die Optik 16 fokussiert ist. Ge nerell ist das Bild ein Raster mit 512 × 512 Bildpunkten, die jeweils eine gemessene Lichtintensität besitzen.
  • Auf der anderen Seite des Bildteilers 25 ist die Betrachtungsoptik 23 des Mikroskops 15 angeordnet. Diese parafokale Anordnung ermöglicht die Anzeige des Bildes in der Betrachtungsoptik 23 als gleiches Bild auf der Bildanzeige 37. Dieses Merkmal ermöglicht die Einstellung der Plattform 51 durch die manuelle X-,Y-Einstelleinrichtung 110 und 17, bis die Bedienungsperson ein interessierendes Feld auf dem Objektträger 14 sieht. Dabei wird ein durch Computer unterstütztes digitalisiertes Bild des ausgewählten Feldes auf der Bildanzeige 37 zur weiteren Analyse angezeigt.
  • Die beiden Anzeigevorrichtungen 37 und 62 werden durch die Systemsteuerung 22 über eine Standard-Videoschnittstellenschaltung 39 bzw. 610 gesteuert. Entsprechend kommunizieren die Tastatur 36 und der Drucker 38 mit der Systemsteuerung 22 über eine konventionelle Schnittstellenschaltung 35 bzw. 41. Ferner steuert die Systemsteuerung 22 einen Speicher 73 mit wahlfreiem Zugriff sowie einen Großspeicher in Form von Disketten- und Festplattenantrieben 75 über eine Speichersteuerung 71.
  • Sämtliche Schnittstellenschaltungen 21, 35, 39, 41, 610, 71 und 106 können selektiv in gedruckten Schaltungen realisiert werden, welche auf der Hinterseite oder einem Kartenstecker eines die Systemsteuerung 22 bildenden konventionellen Personal Computers montiert sind. Vorzugsweise ist der Personal Computer ein Modell, wie es durch die IBM Corporation unter der Modellbezeichnung AT hergestellt wird. Eine derartige Systemsteuerung kann mit einem Plattenbetriebssystem, beispielsweise die PC-DOS-Version 3.1 oder eine spätere Version betrieben werden. Die Systemsoftware für die Bildanalyse wird als Anwenderprogramm vom Plattenantrieb 75 abgerufen und kann beispielsweise auf einer Diskette 77 geliefert werden. Die Systemsoftware wird aus der Platte 77 gelesen und in das RAM 73 geladen. Nach dem Laden wird die Programmsteuerung auf die Analysesoftware überführt, um die verschiedenen obengenannten Hardwareelemente in bekannter Weise zu steuern.
  • Die Analysesoftware kann für eine nachfolgend zu beschreibende DNA-Analyse geeignet sein oder eine andere Software für verschiedene Zwecke enthalten. Beispielsweise kann die Analyse der Form und der Größe sowie des Hämoglobingehaltes der Zellen bei Untersuchung von Zellen roter Blutkörperchen gemäß der Rastererkennungstechnik und des Analyseverfahrens nach den U.S. Patenten Nr. 4,097,845 und 4,199,748 durchgeführt werden, die Bacus erteilt wurden, die hiermit durch Verweis derart einbezogen werden, als ob sie hier vollständig wiedergegeben worden wären.
  • 2A zeigt die funktionelle Wirkungsweise der Systemsoftware, wobei zur Durchführung der Hauptsystemfunktionen eine Steuerlogik für die Instrumentenhardware, die Bildanzeige und die Befehlsanzeige verwendet wird. Die Hauptsystemfunktionen sind Patientenbezeichnung, Lichtpegelkalibrierung, Kontrollzellenkalibrierung, Zellendatenerfassung, Zellenklassifikation, Zellenanalyse und Berichterzeugung.
  • Die Schnittstellenschaltung kann mit Ausnahme der Schnittstellenelektronik 106 durch Standardsteuerschaltungen für die verschiedenen dargestellten Funktionen gebildet werden. Die Schnittstellenelektronik 106 ist eine spezielle Schaltung, die genauer in den 3 und 4 dargestellt ist. Die X-,Y-Positionssensoren ermöglichen die Einstellung des analysierten Feldes.
  • Hier werden die X- und Y-Position jedes Feldes in einfacher Weise für jede gegebene Position durch ein neues Verfahren und eine neue Vorrichtung festgelegt, welche, wie 2 am besten zeigt, einen X-Richtungssensorstreifen 100 enthält, der an der Unterseite der Mikroskop-Plattform 51 befestigt werden kann und mit dieser Plattform an einem Sensorkissen 102 vorbei bewegbar ist, das am stationären Teil des Mikroskops befestigt ist. Der Sensor gibt ein analoges Ausgangssignal für die Schnittstellenelektronik 106 aus, welche die X-Koordinate in Digitalzahlen für die Systemsteuerung 22 zur Speicherung im Speicher und zur Anzeige auf dem Monitorschirm 62 liefert. Ferner ist ein entsprechender Streifen 114 an der Plattform 51 befestigt und mit dieser in Y-Richtung an einem Sensorkissen 112 vorbei bewegbar, das an einem stationären Teil des Mikroskops befestigt ist, so dass das Kissen ein Analogsignal für die Schnittstellenelektronik 106 ausgeben kann, welche Digitalsignale für die Systemsteuerung 22 zur Speicherung der Y-Koordinate und zur Anzeige der Y-Koordinate auf dem Videomonitor benachbart zur X-Koordinate liefert. In der Tat kann das System auch umgekehrt ausgebildet sein, wobei die Sensorköpfe an der Plattform zur Bewegung mit dieser befestigt sind und die Sensorstreifen 100 und 110 stationär montiert sind, um Analogsignale zu liefern, wenn sich die Köpfe über sie bewegen.
  • Die Schnittstellenschaltung für die Positionssensoren ist in 3 und 4 detaillierter dargestellt. Die Positionssensoren sind magnetische Sensoren mit dem Paar von Sensorstreifen 100 für die X-Koordinate und dem Paar von Sensorstreifen 114 für die Y-Koordinate. Die Sensorstreifen 100 und 114 sind senkrecht zueinander derart befestigt, dass diese Streifen Referenzachsen für das Koordinatensystem bilden. Die beweglichen Sensorkissen 102 und 112, welche an der beweglichen Basis des Mikroskops 15 befestigt sind, bewegen sich längs der Streifen 100 und 114, wobei die Relativbewegung zwischen den Elementen in Abhängigkeit von der Relativposition des beweglichen Kissens in bezug auf den festen Streifen erfasst wird. Die Sensoren sind mit einem Mess-Schaltkreis 180 verbunden, der eine Schaltung zur Messung der Relativposition zwischen den Streifen sowie zur Erzeugung von Digitalzahlen auf der Basis des erfassten Parameters enthält. Die X-Sensorstreifen 100 sind mit Sensor-XA- und Sensor-XB-Eingängen der Mess-Schaltung 180 verbunden, während die Y-Sensorstreifen 114 entsprechend mit den Sensor-YA- und Sensor-YB-Eingängen der Schaltung verbunden sind. Die Schaltung 180 ist ein intern getakteter Positions-/Digitalzahlgenerator, der in Abhängigkeit von der Relativposition des beweglichen Kissens in Bezug auf den festen Streifen eine serielle Digitalzahl mit 3 Byte an Ausgängen OXA und OYA liefert. Diese Zahl mit 3 Byte ist se riell und für Zeitsteuerzwecke von einem Taktsignal XCLK oder YCLK begleitet.
  • Sämtliche der Burst-Signale mit 24 Bit haben jeweils eine Frequenz von etwa 24 kHz und treten alle 100 ms auf. Die Mess-Schaltung 118 erzeugt daher alle 110 ms eine Zahl mit 3 Byte für die X-Position und eine Zahl mit 3 Byte für die Y-Position. Die Ausgänge OXA und OXB sind mit dem seriellen Eingang IN bzw. dem Takteingang CLK eines Schieberegisters 20 verbunden. Entsprechend ist der Ausgang OYA und OYB der Schaltung 180 mit dem seriellen Eingang IN und dem Takteingang CLK des Schieberegisters 220 verbunden. Das Signal XCLK taktet alle 100 ms die 24 Bit der Positionszahl in das Schieberegister 20. Diese Zahl wird dann im Schieberegister 20 gespeichert, bis sie durch das Hauptsteuerprogramm verwendet wird. Die Y Position mit 24 Bit wird seriell in den Eingang des Schieberegisters 220 eingegeben und alle 100 ms durch das Signal YCLK in diese Anordnung getaktet. Die Schieberegister 20 und 220 erhalten diese Positionszahlen zwischen Kommunikationsimpulssignalen von der Mess-Schaltung 180.
  • Die Schieberegister 20 und 220 sind mit der Systemsteuerung 22 durch die Adressleitungen A0–A15 ihres Adressbusses und durch die Datenleitungen D0–D7 des Datenbusses verbunden. Der Datenbus mit 8 Bit ist parallel mit den Byte-Ausgängen A, B und C des Schieberegisters 20 und den Byte-Ausgängen A, B und C des Schieberegisters 220 verbunden. Die Ausgänge repräsentieren jeweils eines der Bytes eines Positonswortes mit 24 Bit für die X- oder Y-Position. Die Ausgänge werden durch die mit den Ausgängen Q0–Q2 eines Decoders 24 verbundenen Eingangsleitungen A, B und C aktiviert. Die Adressbusleitungen A0–A15 sind mit den Eingangsleitungen des Decoders 24 verbunden.
  • Der Decoder 24 überträgt für jedes Byte der Positionswörter eine diesem speziell zugeordnete Adresse und aktiviert dieses Byte vom entsprechenden Schieberegister, so dass es auf dem Datenbus 28 eingelesen werden kann. Um beispielsweise die X-Position zu lesen, liefert die Systemsteuerung 22 die Adresse, welche von dem Decoder 24 genutzt wird, um den A-Ausgang des Schieberegisters 20 freizugeben, wonach dieses Byte über den Datenbus 28 eingelesen wird. Danach liefert die Systemsteuerung 22 die Adresse, welche den B-Ausgang des Schieberegisters 20 freigibt, wonach dieses Byte vom Datenbus 28 gelesen wird. Danach liefert die Systemsteuerung 22 die Adresse zur Freigabe des C-Ausgangs des Schieberegisters 20 sowie zum Lesen dieses Bytes. Die Wirkungsweise ist für das Lesen des Y-Positionswortes aus dem Schieberegister 220 identisch.
  • Das Lesen und Laden der Schieberegister 20 und 220 ist vollständig asynchron. Da die Positionen der X- und Y-Koordinate alle 100 ms aktualisiert werden, kann ein relativ einfaches Transferschema dieser Art realisiert werden. Falls die Schieberegister 20 und 220 in einen Schiebevorgang durchführen, wenn die Positionswörter durch den Computer gelesen werden, so nimmt die Software geeignete Vergleiche vor, um festzustellen, ob die gelesene Eingangszahl eine richtige Zahl ist oder das Schieberegister beim Lesen eine andere Zahl eingegeben hat.
  • Ein Flussdiagramm des Unterprogramms, das die Schieberegister 20 und 220 liest, ist in 23 detaillierter dargestellt. Das Unterprogramm kann periodisch zur Festlegung der tatsächlichen X-,Y-Position auf der Plattform 51 aufgerufen werden. Das Programm beginnt durch zweimaliges Lesen und Speichern der X-Position in Blöcken A225–A231. Es erfolgt ein Vergleich, ob die beiden gleich sind (A=B); ist dies nicht der Fall, so folgt eine Rückführung auf den Start. Ein drittes Lesen und Speichern in Blöcken A235 und A237 geht einem Vergleich von A und C im Block A239 voran. Ein negativer Zweig beginnt den Prozess noch einmal, während ein positiver Zweig das Lesen der Y-Position in der gleichen Weise startet. Die Technik erfordert drei Auslesungen zur Anpassung, bevor die Zahl als die richtige Position angenommen wird, wobei die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass der Tisch bewegt wurde oder die Schieberegister Zwischenauslesungen geschoben haben.
  • Da die Vorrichtung 11 in verschiedenen Praxen, wie z.B. pathologischen Praxen mit Personen unterschiedlicher Ausbildung und Kenntnis über Bildanalyse verwendet werden kann, kann die Mikroskoplichtquelle 17a durch unterschiedliche Personen unterschiedlich eingestellt werden, so dass der Hintergrund nicht nur von Gerät zu Gerät, sondern auch zu unterschiedlichen Zeiten in Abhängigkeit vom Alter und der Natur der beleuchtenden Lampe eine unterschiedliche Lichtintensität besitzen kann. Sind die Zellobjekte DNA-Kerne, so können die eingefärbten Kerne dunkler erscheinen und besitzen stärker dunkle Graupegel als Zellen, welche einen geringeren oder keinen DNA-Gehalt besitzen. Der spezielle Lichtintensitätspegel sollte in genauer und realer Weise bekannt sein; es ist daher wichtig, dass eine Kalibrierung der Lichtintensität erfolgt, um Fehler zu eliminieren, welche auftreten können, falls Unterschiede in den Lichtintensitätspegeln nicht berücksichtigt werden.
  • Ein weiteres Problem bei der breiten Verwendung einer Anlage der vorgenannten Art ist der Anfärbungsfaktor, womit gemeint ist, dass der Benutzer entweder eine große Menge oder eine geringe Menge des Azur-A-Anfärbemittels aufbringen kann. Dies führt zu einer Änderung des durch das Mikroskop 15 oder durch die Kamera 18 beobachten Graupegels, welcher dann als der spezielle DNA-Gehalt analysiert wird. Die Vorrichtung 11 muss daher kalibriert werden, um durch den Anfärbungsfaktor bedingte Unterschiede zu eliminieren, so dass eine realistische Anzeige der tatsächlichen Menge an Hämoglobin, DNA oder Antigenen oder monoklonalen Antikörpern auf Zellen, usw. bei der Analyse gewährleistet ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auf den Objektträger 14 ein Kalibriermaterial 40 (5A) aufgebracht, das es der beobachtenden Bedienungsperson im Kalibrierungsschritt der Systemsoftware ermöglicht, die Vorrichtung vor der Messung und Analyse von Probezellobjekten 12 auf dem Objektträger 14 einzustellen und zu kalibrieren.
  • In der dargestellten Ausführungsform der Erfindung sind zwei unterschiedliche Kalibriermaterialien auf dem Objektträger 14 vorgesehen, wobei es sich bei dem ersten Kalibriermaterial um die Kontrollzellenobjekte 40 handelt, welche gleichzeitig mit dem Anfärben der Probezellenobjekte 12 eingefärbt werden. Das gleichzeitige Anfärben ermöglicht die Analyse der Kontrollzellenobjekte zum Vergleich mit einer vorgegebenen gespeicherten Referenzlichtenergie, einem Graupegel, oder der optischen Dichte, welche die Kontrollzellenobjekte 40 nach dem Anfärben besitzen. Sind die Zellobjekte entweder zu schwach oder zu stark angefärbt, so kann der Betrag der Unterfärbung oder Überfärbung quantitativ analysiert und eingestellt werden, wie dies nachfolgend beschrieben wird.
  • Bei der Erfindung enthält das Kalibriermaterial ferner ein Referenzmaterial 45 für optische Dichte, bei dem es sich gewöhnlich um eine gedruckte Markierung auf dem Objektträger handelt, welcher eine vorgegebene bekannte optische Dichte besitzt und als Bezug zur Kalibrierung des Instrumentes verwendbar ist. Wie nachfolgend noch genauer beschrieben wird, erhält die Bedienungsperson von der Systemsoftware Befehle. Gemäß diesen Befehlen stellt die Bedienungsperson manuell die Hintergrundlichtintensität der Quelle 17a ein, bis die gewünschte Intensität für das Referenzmaterial 45 erreicht ist. Wie nachfolgend erläutert wird, wird durch diesen Schritt die Systemsteuerung 22 mit einer Kalibrierung zur Auslesung der richtigen optischen Dichte der Objekte auf dem Objektträger 14 versehen.
  • Zur Gewährleistung der Integrität des Systems kann es erwünscht sein, eine Vollständigkeitsprüfung bzw. einen Identifikationsschritt für den Objektträger 14 durch Analyse eines vorgegebenen und vorfestgelegten optischen Rasters auf dem Objektträger durchzuführen, wobei die Graupegel und die physikalischen Abmessungen ausgelesen und gemessen werden, bevor die Analyse begonnen werden kann. Dabei kann das optische Vollständigkeitsraster in der Form von Initialen CAS vorliegen, welche gemäß den 5A bis 5C oberhalb der Kontrollzellenobjekte angeordnet sind. Wie ersichtlich kann das Vollständigkeitsprüfmerkmal das Kreuz 52 oder ein anderes geformtes Material auf dem Objektträger 14 sein.
  • Das Lichtkalibrierungsmaterial 45 in Form eines Kreuzes 52 gemäß 5B kann eine große Anzahl unterschiedlicher Gestalten und Formen annehmen und kann tatsächlich lediglich die Grenze 54 für die Kontrollzellenobjekte, ein Logo CAS oder eine andere Identifizierungsmarkierung sein, die auf den Objektträger aufgebracht ist, um eine vorgegebene optische Dichte zu gewährleisten, wenn die Lichtquelle für das Mikroskop 15 auf die gewünschte Intensität eingestellt wird.
  • Die vorliegende Erfindung ist ferner für eine spätere Analyse der Probezellen 12 auf dem Objektträger 14 und zur Unterstützung des Abrufs von im Speicher gespeicherten Zellenbildern oder für eine Rückkehr auf eine gegebene Zelle für eine zweite Betrachtung durch die Bedienungsperson oder eine andere Person zu einem späteren Zeitpunkt verwendbar. Zu diesem Zweck wird nach der Befestigung des Objektträgers 12 auf dem Mikroskopstativ 51 (1) in einer bestimmten Position eine bestimmte Lage bzw. ein bestimmter Punkt auf dem Objektträger, beispielsweise die Mitte des Kreuzes 52 als Null/Null-X-Y-Referenzpunkt definiert. Dieser Referenzpunkt dient zur Aufstellung einer Translationstabelle für die Positionsauslesungen durch die X-,Y-Sensoren. Ein Paar von Lageregistern der Systemsteuerung 22 für den X- und den Y-Abstand werden in diesem Punkt auf Null eingestellt, so dass anschließend sämtliche Zellenlagen eine spezielle X- und Y-Koordinatenadresse vom Referenzpunkt besitzen. Ein weiterer einfacher Punkt, mit dem die Lageeinstellungsmittel des Mikroskopstativs 51 auffindbar sind, ist eine Ecke, wie beispielsweise die rechte untere Ecke 53 der Kastengrenze 54, innerhalb der die Referenzzellenobjekte 40 angeordnet sind, Die Kastengrenze 54 ist auf dem Objektträger aufgedruckt und kann an Stelle des speziellen Kreuzes 52 zur Kalibrierung der optischen Dichte verwendet werden. Durch eine geeignete Logik kann jeder Punkt auf dem Objektträger und dem Mikroskopstativ, in dem die Klassifizierungsoperation beginnt, als Null-X- und Y-Lage in den Lageregistern verwendet werden. Die X- und Y-Ko ordinaten werden in dieser Lage anfänglich auf Null eingestellt, wobei aus dieser Null-Lage für jede Bildfeldlage eine Auslesung durchgeführt wird.
  • Der Probeobjektträger 14 kann jede Größe oder Form besitzen; da jedoch Labortechniker und Pathologen mit bei Mikroskopen verwendeten Glasobjektträgern vertraut sind, ist der Träger 14 vorzugsweise ein gebräuchlicher Mikroskopobjektträger aus Glas mit typischen Abmessungen von 7,62 × 2,54 cm (3 inch × 1 inch). Der in 5A dargestellte Objektträger 14 besitzt eine vorgedruckte Grenze 54, innerhalb der Referenz- oder Kontrollzellenobjekte 40 angeordnet sind. Ferner besitzt der Objektträger einen Bereich 61 für die Probezellenobjekte.
  • Die Kontrollzellenobjekte sind in dieser dargestellten Ausführungsform der Erfindung lymphopiastoide Zellen bekannter Größe und Form und bekannten DNA-Inhaltes. Die lymphoplastoiden Zellen können zum größten Teil Zellen mit normalem DNA-Gehalt sein, obwohl bestimmte Zellen ein doppeltes oder anderes Verhältnis zum normalen DNA-Gehalt besitzen können, wie es für Krebszellen typisch ist. Die Kontrollzellenobjekte können andere Zelltypen mit dunklen Zentren oder Kernen sein, welche sich gut einfärben, wie beispielsweise Hühnerblutzellen oder Truthahnzellen. Andererseits können die Zellobjekte 40 auch auf den Objektträger aufgedruckte Artefakte mit Zellform sein. Darüber hinaus können die Zellobjekte 40 wie oben ausgeführt konventionelle Kunststoffkügelchen mit vorgegebener Größe sein, welche bei gleichzeitiger Behandlung mit Probezellenobjekten, wie beispielsweise monoklonalen Antikörpern im Probebereich 61 auf dem Objektträger mit einer speziellen fluoreszierenden Anfärbung oder einer Enzymanfärbung reagieren. Die Referenzzellenobjekte ändern sich von Test zu Test, wobei die vorliegende Erfindung nicht auf spezielle Tests oder Zellobjekte beschränkt ist.
  • Ein Pathologe bringt auf einem vorbereiteten Objektträger gemäß 5A mit vorher aufgebrachten Kontrollzellenobjekten 40 zusätzlich die Probezellobjekte 12 auf, welche in diesem Fall Zellen von einem Gewebeschnitt (wie etwa einem Tumorgewebe) einer Punktierung von Tumorgewebe oder eine Monoschicht von Blutzellen oder anderen Zellen im Bereich 61 auf dem Objektträger sind. Der Pathologe färbt dann die Kontrollzellenobjekte und die Probezellenobjekte zur Bildverbesserung gleichzeitig an oder behandelt sie in anderer Weise. Die bevorzugten Objektträger sind mit einem Gefäß versehen, in dem sich Flaschen mit einem Wirkstoff befinden, der für die Kontrollzellenobjekte spezifisch ist. Zur DNA-Analyse enthält das Gefäß Flaschen mit einer Feulgen-Azur-A-Wirkstofflösung sowie Flaschen mit einer Spülwirkstofflösung zur spezifischen und quantitativen Anfärbung nuklearer DNA.
  • Zur Vorbereitung eines Objektträgers wird das folgende Verfahren verwendet. Der Objektträger 14 besitzt normale Kontrollzellen in einem Bereich sowie einen Raum für Probezellen in einem anderen Bereich. Der Objektträger 14 wird 10 Minuten lang in 10%-igem Formalin befestigt und anschließend beiseitegelegt, während für den Bereich 61 in normales Paraffin eingebettete Abschnitte vorbereitet werden. Ist auf dem bleibenden Abschnitt ein malignes oder fragwürdiges Gewebe vorhanden, so wird der Objektträger 14 zur Analyse des Abschnittes verarbeitet.
  • Die Verarbeitung besteht zunächst aus der 65-minütigen Behandlung des Objektträgers in 5N Hydrochlorid für eine Hydrolyse der nuklearen DNA. Der Objektträger wird anschließend für eine Anfärbeperiode von zwei Stunden zu einen Behälter mit Azur A-Färbemittel gebracht. Danach wird der Objektträger in Spüllösung gewaschen, mit Ethanol getrocknet, mit Zylen gereinigt, abgedeckt und montiert. In diesem Punkt wird der Objektträger permanent fixiert und ist jederzeit für eine Analyse bereit.
  • Die Systemsoftware zur DNA-Analyse kann nunmehr die Dichte der zellularen DNA durch Ermittlung der optischen Dichte der Probezellen über das Instrument 11 bestimmen. Generell kann die Masse eines eingefärbten Zellobjektes aus dessen optischer Dichte gemäß den in der Mikrospektrophoto metrie bekannten Beer-Lambert-Gesetz gewonnen werden. Dabei gilt die Gleichung:
    Figure 00250001
    wobei
    M die Masse des Objektes in Picogramm
    α die Punktgröße in μm2
    Eλ den Auslöschungskoeffizienten des Anfärbemittels bei der Wellenlänge X in μm2/pg
    OD die optische Dichte jedes Punktes (dimensionslos) bedeuten.
  • Das Instrument nutzt dieses Gesetz zur Ermittlung der Massenverteilung einer Anzahl von Zellen oder Zellobjekten aus, welche dann auf statistischer Basis, in Form eines Histogramms oder in Form eines anderen analytischen Formates analysiert werden kann, wie dies nachfolgend noch diskutiert wird. Die Punktgröße α ist durch die Anzahl von Bildpunkten festgelegt, welche durch die Kamera 18 gemessen werden. Die optische Dichte für jeden Bildpunkt wird durch Einstellung des Lichtpegels, des Fokussierungspunktes und durch Auslesens einer optischen Referenzdichte aus dem Kalibrierbereich auf dem Objektträger geeicht. Diese Kalibrierung ermöglicht die Umsetzung der gemessenen Lichtpegel für jeden Bildpunkt in eine optische Dichte als dimensionslose Größe.
  • Die Kalibrierung für den Auslöschungskoeffzienten erfolgt durch Messung der optischen Dichte für eine Vielzahl von Kontrollzellen zur Bestimmung einer Spitze für die Verteilung in relativen Masseeinheiten. Da der Spitzen-DNA-Gehalt für die Kontrollzellenverteilung bekannt ist, können die Zellen im Messfeld unter Ausnutzung der relativen OD-Einheiten gemessen und sodann unter Nutzung der Kontrollzellenkalibrierung direkt in Picogramm überführt werden. Ist beispielsweise bekannt, dass die Kontrollzellen 5,96 pg an DNA (Truthahnzellen) enthalten und eine Gruppe von Kalibrierzellen eine Spitzenverteilung von 11.000 relativen OD-Einheiten zeigen, so besitzt eine normale Gruppe von menschlichen Zellen (mit einem bekannten DNA- Gehalt von 7,18 pg) eine Spitze in ihrer Verteilung bei etwa 13.250 relativen OD-Einheiten. Ferner kann jede andere relative OD-Einheitsmessung direkt in Picogramm überführt werden, in dem der aus der Gruppe von Kalibrierzellen gefundene Auslöschungskoeffizient bestimmt und ausgenutzt wird.
  • Die Systemsoftware zur DNA-Analyse ist ein durch ein Menü gesteuertes Programm, das interaktive Informationsschirmbilder auf dem Monitor 63 ausnutzt, um die Bedienungsperson bei der Durchführung der beschriebenen Messungen an mehreren Zellen oder Zellunterpopulationen zu unterstützen. In 10 ist die visuelle Schirmstruktur des auf dem Monitor 62 erscheinenden Programms dargestellt. Ein Hauptschirmbild 150 liefert Information hinsichtlich des Kalibrier- und Analysestatus der Vorrichtung und liefert eine optische Liste zum Aufrufen dreier weiterer Primär-Informationsschirmbilder. Ein visuelles Beispiel des Hauptschirmbildes ist in 11 dargestellt. Die drei Primär-Informationsschirmbilder entsprechen den drei Betriebsfunktionen des Programms, wobei das Kennzeichnungsschirmbild 156 der Kennzeichnungsfunktion, ein Kalibrierschirmbild 152 der Kalibrierfunktion (optische Dichte und Anfärbung) und ein Analyseschirmbild 154 der Analysefunktion entspricht. Die Schirmbilder 152, 154 und 156 stellen eine optische Liste bzw. ein Menü dar, in dem einer der Sondervorgänge in das Hauptschirmbild 150 übergeht.
  • Ferner kann der Benutzer das Kalibrierschirmbild 152 aus dem Analyseschirmbild 154 eingeben oder den Vorgang umgekehrt durchführen. Die beiden anderen Schirmbilder sind als Sondervorgänge aus dem Analyseschirmbild 154 verfügbar und dienen zur Einstellung der Grenze des Betrachtungsfeldes im Einstellgrenzschirmbild 158 sowie zur Anzeige der X-,Y-Koordinaten der Felder, die im X-,Y-Feldschirmbild 160 gemessen werden. Eine Darstellung des Kalibrierschirmbildes ist in 12 gezeigt, während Darstellungen des Analyseschirmbildes und des X-,Y-Feldkoordinatenschirmbildes in 13 bzw. 14 gezeigt sind.
  • Bei Betrieb der Einheit steht dem Pathologen eine Anzahl von Sondervorgängen oder Funktionen aus einem Menü auf jedem Schirmbild zur Verfügung, unter denen er wählen kann, um Daten zu erfassen und diese Daten zu verarbeiten. Generell liegt das Programm als ein Menü vor, das anhand des in 11 gezeigten Hauptschirmbilds gesteuert wird, welches ein Hauptmenü von Sondervorgängen gemäß 15 angibt. Das Hauptmenü A10 besteht aus fünf Hauptschirmbildfunktionen einschließlich einer Kennzeichnungsfunktion A12, einer Kalibrierfunktion A14, einer Analysefunktion A16, einer Hilfsfunktion A18 und einer Austrittsfunktion A20.
  • Die Kennzeichnungsfunktion ermöglicht es einem Benutzer, Information hinsichtlich Patientenidentifizierung, Vermehrungszahl und DNA-Umwandlungszahl einzugeben. Die DNA-Umwandlungszahl ist diejenige Zahl, durch welche die erste und zweite Spitzenmasse geteilt wird, um den ersten und zweiten Spitzenindex zu erhalten (11). Anfänglich wird die Zahl für normale menschliche Zellen auf einen Standard von 7,18 Picogramm/Zelle eingestellt. Die Vorrichtung kann jedoch auch zur Messung nicht menschlicher Zellen verwendet werden, wobei der Index auf den gewünschten Index geändert werden kann. Die DNA-Indexzahl muss größer oder gleich 1,0 und kleiner oder gleich 99,99 sein. Liegt die Umwandlungszahl nicht in diesem Bereich, so darf der Benutzer die Analyse-Option weder im Hauptschirmbild noch im Kalibrierschirmbild wählen.
  • Die drei während der Kennzeichnungsfunktion eingegebenen Informationslinien erscheinen auf jedem Schirmbild mit Ausnahme des X-,Y-Feldkoordinatenschirmbildes. Der Kennzeichnungsvorgang wird durch Drücken entweder der Eingabetaste oder der Austrittstaste eingeleitet. Durch Drücken der Eingabetaste werden Änderungen gesichert, welche in den drei Informationszeilen durchgeführt werden. Bei Drücken der Austrittstaste werden in den drei Zeilen durchgeführte Änderungen ignoriert. Die während der Kennzeichnungsfunktion gespeicherte Information wird bei Auslösung des Programms nicht aufbewahrt.
  • Die Auswahl der Kalibrierfunktion bewirkt eine Änderung der Anzeige auf dem Monitor 62 vom Hauptschirmbild in das Kalibrierschirmbild gemäß 12. Die Sondervorgänge des Kalibrierschirmbildes gemäß 16 sind diejenigen, welche zur Durchführung der Kalibrierung des Instrumentes hinsichtlich optischer Dichte und Anfärbungsfaktor der Kontrollzellen notwendig sind. Eine Kalibrierung der Vorrichtung 11 muss bei jeder Wahl eines neuen Objektträgers durchgeführt werden, um den Lichtpegel und den Anfärbefaktor zu normieren.
  • Die Wahl der Analysefunktion bewirkt eine Änderung der Anzeige vom Hauptschirmbild auf den Monitor 62 in das Analyseschirmbild nach 13. Das Analyseschirmbild enthält das Menü für die Funktionen, welche zur Durchführung der Datenerfassung und der DNA-Messungen an den Probe zellen notwendig sind. Diese Funktionen sind vollständiger in 17 dargestellt. Zur Auswahl der Analysefunktion müssen drei Kriterien erfüllt sein. Zunächst muss die Einstell-Lichtfunktion im Kalibrierschirmbild wenigstens einmal erfolgreich durchgeführt worden sein. Die Einstellungslichtfunktion ist erfolgreich, wenn das laufende Bild weiß ist und der Lichtpegel zwischen 129 und 131 liegt. Zweitens muss die Kalibrier-Kontrollzellenzählung zwischen 50 und 512 liegen. Schließlich muss die DNA Umwandlungszahl größer oder gleich 1,0 und kleiner oder gleich 99,99 sein.
  • Die Austrittsfunktion ermöglicht es dem Benutzer, den Programmbetrieb aus dem Hauptschirmbild zu beenden. Das Drücken der Austrittstaste entspricht der Wahl der Austrittsfunktion. Ist die Austrittsoperation entweder durch Wahl des Austritts oder Drücken der Austrittstaste spezifiziert, so muss der Benutzer seinen Austrittsbefehl bestätigen. Zur Annahme der Bestätigung wählt der Benutzer die Ja-Taste. Um die Bestätigung zurückzuweisen, wählt er die Nein-Taste oder drückt die Austrittstaste.
  • Die Optionen für das Kalibriermenü sind in 16 gezeigt. Zu den Kalibriermenü-Wahlmöglichkeiten zählen eine Einstell-Lichtfunktion A24, eine X-,Y-Einstell-Funktion A26, eine Fokussierungsfunktion A32, eine Messfunktion A36, eine X-,Y-Funktion A38, eine Analysefunktion A28, eine Löschfunktion A30, eine Hilfsfunktion A34, sowie eine Austritts- bzw. Rückkehrfunktion A40 in das Hauptschirmbild. Die Lichteinstellfunktion A24 berechnet den Hintergrundlichtpegel für das laufende Bild. Der Lichtpegel kann eingestellt werden, bis er in einem standardisierten Bereich liegt. Die Einstell-Lichtfunktion sollte wenigstens einmal erfolgreich durchgeführt worden sein, bevor die Analyse-, Fokussierungs- und Messfunktion gewählt wird. Für genaueste Ergebnisse sollte der Lichtpegel exakt gleich 130 sein. Der Lichtpegelwert wird auf dem Kalibrierschirmbild durch das Wort "Lichtpegel" angezeigt. Ist der Lichtpegel erfolgreich eingestellt, so wird im Messprogramm eine Bildrauschsubtraktion durchgeführt.
  • Die Lichtquelfenkalibrierung realisiert eine Anzahl von Ergebnissen einschließlich einer Hilfe bei der Fokussierung des Mikroskops durch Aktualisierung eines Grauskalenhistogramms, das in der generell in 22 dargestellten und "Verteilung der Lichtintensität" bezeichneten Form vorliegen kann. Das dargestellte Histogramm zeigt einen Vergleich des einfallenden Lichtes I0 und des übertragenen Lichtes It mit dem einen Graupegelwert besitzenden übertragenen Licht und dem einen Graupegelwert besitzenden auffallenden Licht. Die Bedienungsperson hat die Plattform zur Betrachtung des Lichtkalibriermaterials 45 auf dem Monitor 37 bewegt. Die Bedienungsperson betrachtet das Lichtkalibriermaterial 45 und das System berechnet ein Histogramm dieses Rasters durch Eingabe von Licht aus den Bildelementen aus den Bildelementen dieses Feldes. Die Bedienungsperson stellt dann den Intensitätspegel der Quelle 17a zur Änderung der Lichtpegelauslesung auf dem Schirm ein. Die Bedienungsperson führt dies durch abwechselndes Auswählen der Funktion und Einstellen der Quelle 17a aus, bis die richtige Auslesung auf dem Schirm erscheint. Ist die Lichtquelle eingestellt, um die linke und rechte Spitze It und I0 für das übertragene und auffallende Licht bei den gewünschten Graupegeln mit 130 als Hintergrundlichtintensität zu erzeugen, so ist das System geeicht. Die Systemsoftware der Vorrichtung 11 nutzt den I0- und It-Wert zum Aufstellen einer internen Kalibriertabelle für die optische Dichte derart aus, dass die für jedes Bildelement er fasste Lichtintensität auf diese Tabelle bezogen ist und in der analysierten Bildszene als eine spezielle optische Dichte aufweisend bekannt ist.
  • Bei digitalen Abbildungsgeräten wird zum Erkennen der tatsächlichen optischen Dichte für ein dunkles Objekt bekanntlich weiß (I0) als Referenz genutzt. Durch Kalibrieren des Gerätes hinsichtlich der optischen Dichte können die eintreffenden Bilddaten durch Nachschlagetabellen in der Bildverarbeitungsschnittstelle 21 derart umgesetzt werden, dass die optische Ausgangsdichte zur direkten proportionalen Darstellung linear addiert werden können, wobei sich in diesem Fall um die DNA-Mengen in den Probeobjekten handelt.
  • Die X-,Y-Einstell-Funktion A26 bildet die Einstellung des Ursprungs für das Objektträger-X-,Y-Koordinatensystem. Mit diese Funktion wird die laufende Bild- bzw. Feldlage durch Nullstellung eines Paars von Lageregistern in der Software als Ursprung eingestellt. Generell wird das Mikroskopstativ 51 bewegt, bis eine leicht erkennbare Markierung, beispielsweise als Kreuz 52, sichtbar ist. Diese Markierung wird dann zur erneuten Nullstellung des Koordinatensystems als Mittel zur Neueinstellung vorher gemessener Felder genutzt. Die X-,Y-Einstell-Funktion wird für jeden gewählten neuen Objektträger genutzt. Ist die X-,Y-Einstell-Funktion nicht ausgeführt worden, so arbeiten die X-,Y-Funktionen des Kalibrier- und Analyseschirmbildes sowie die Funktionen im X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild nicht korrekt. Die X-,Y-Einstell-Funktion kann lediglich genutzt werden, wenn die Kalibrier-Kontrollzellenzählung gleich Null ist. Wird das Mikroskopstativ 51 bewegt, wenn sich die Einstell-X-,Y-Operation in Ausführung befindet, so ist der Koordinatenursprung fehlerhaft. Das Programm liefert eine Information auf dem Schirmbild, um der Bedienungsperson kenntlich zu machen, wann die Einstell-X-,Y-Operation erfolgreich ist. In Reaktion auf eine nicht erfolgreiche Funktion wählt die Bedienungsperson lediglich die X-,Y-Einstell-Funktion aus dem Menü neu und versucht die Funktion erneut.
  • Die Messfunktion A36 dient zur Durchführung der Kontrollzellen- oder Kontrollobjektkalibrierung zur Normierung des Anfärbungsfaktors. Ist die Messfunktion gewählt, so wird die Kamerabilderfassung gestoppt, wobei sich der Zeiger 170 auf dem Kalibrierschirmbild auf das Wort "Messoperationen" gemäß 12 bewegt. Wenn der Zeiger 170 sich in dieser Lage befindet, kann der Benutzer Messoperationen durch Aktivierung der numerischen Sperre spezifizieren. Eine Identifizierung, wie beispielsweise ein in magenta eingefärbter Kasten wird um ein identifiziertes Zellenobjekt angeordnet. Durch Anwendung einer Anzahl von Tastenoperationen gemäß 18 kann die Bedienungsperson einen nachfolgend noch genauer beschriebenen interaktiven Auswahl- und Ausschlussprozess durchführen.
  • Während der Kontrollzeilenkalibrierung bewegt die Bedienungsperson das Mikroskopstativ durch Drehen der konventionellen X- und Y-Knöpfe 110 und 17 (1), um die Kontrollzellenobjekte 40 in das Sichtfeld auf dem Monitorschirm 37 zu schieben. Befindet sich ein einzelnes Zellobjekt 40 in einem Kasten oder einer Identifizierungsgrenze, so drückt die Bedienungsperson eine Taste auf der Tastatur 36 zur Eingabe der Messung der summierten optischen Dichte für dieses Kontrollzellenobjekt. Nach Analyse einer geeigneten Anzahl von Kontrollzellenobjekten erhält die Bedienungsperson ein Histogramm gemäß 12 auf dem Videomonitor 62, das ihr die Kontrollzellenobjekt-Chromosomensatzverteilung mit einer relativen Menge an DNA zeigt. Die tatsächlich für die Kontrollzellenobjekte gemessenen summierten relativen optischen Dichtewerte werden in der Systemsteuerung 22 intern mit einer vorgegebenen Standard- oder Referenzmenge an DNA verglichen, welche die Kontrollzellen bekanntermaßen besitzen. Enthalten im vorliegenden Beispiel die Steuerzellen 5,96 Picogramm an DNA pro Zelle, so entspricht eine optische Dichtemessung von etwa 8700 relativen OD-Einheiten dieser Masse. Die tatsächliche durch die Bedienungsperson gefundene summierte optische Dichte wird in den gespeicherten Referenz-DNA-Wert geteilt, um einen Faktor zu erzeugen, durch den der Auslöschungskoeffizient für Abweichungen im Anfärbmittel von einer perfekten Anfärbung einzustellen.
  • Die X-,Y-Funktion A38 bewirkt bei Auswahl auf dem Kalibrierschirmbild eine Anzeige der X-,Y-Koordinaten des laufenden Bildes oder Feldes auf dem Monitor 37. Die Koordinaten werden kontinuierlich angezeigt, bis der Benutzer eine Taste drückt (mit Ausnahme CTRL, ALT oder SHIFT). Wurde der gleiche Ursprung für den Objektträger 14 eingestellt, so kann daher die Bedienungsperson durch Einstellen der Plattform 51 und Betrachten der Koordinatenänderung das gleiche vorher aufgezeichnete Bild finden. Die X-,Y-Einstell-Funktion A26 muss vorher erfolgreich durchgeführt worden sein, um die X-,Y-Funktion wählen zu können.
  • Die Löschfunktion A30 bewirkt ein Löschen aller gespeicherten Datenbilder. Nach Auswahl einer Löschfunktion wird der Benutzer aufgefordert, die Operation zu bestätigen. Um die Bestätigung anzunehmen, wählt der Benutzer die Ja-Taste zur Bestätigung, während er zum Ausschluss der Bestätigung die Nein-Taste wählt oder die ESC-Taste drückt.
  • Die Fokussierungsfunktion A32 gewährleistet eine Farbverstärkung für das Bild, so dass der Benutzer eine genauere Fokussierung des Bildes durchführen kann. Die Systemsteuerung 22 liefert automatisch unterschiedliche Farben für Abstufungen des Graupegels im Bild. Die Bedienungsperson stellt dann die Fokussierungsmittel des Mikroskops 15 ein, bis das z.B. auf eine Kante des Kastens fokussierte Objekt eine klare Farbabgrenzung zeigt. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die beiden getrennten Pegel oder die Grauskala der Kante fokussiert sind. Ohne Farbe ist dies weitaus schwieriger, weil die beiden Graupegel nahe beieinanderliegen und ohne Farbverstärkung nicht unterschieden werden können. Die Einstell-Lichtfunktion A24 muss mindestens einmal erfolgreich durchgeführt worden sein, um die Fokussierungsfunktion zu wählen. Um das Bild in seiner ursprünglichen Farbe neu zu bilden, wird die Fokussierungsfunktion ein zweites Mal gewählt. Ist das in der Farbe verstärkte Bild vorhanden, wenn der Benutzer die Messfunktion wählt, so wird das Bild automatisch auf seine ursprüngliche Farbe zurückgeführt.
  • Durch das Auswählen der Analysefunktion A28 wird die Anzeige vom Kalibrierschirmbild in das Analyseschirmbild geändert. Das Analyseschirmbild liefert ein Menü der Funktionen gemäß 17, welche zur Durchführung der DNA-Messungen bei zellularem Material erforderlich sind. Zur Auswahl der Analysefunktion müssen drei Kriterien erfüllt sein. Erstens muss die Einstell-Lichtfunktion im Kalibrierschirmbild wenigstens einmal erfolgreich ausgeführt worden sein. Zweitens muss die Kalibrier-Kontrollzeilenzählung zwischen 50 und 512 liegen und schließlich muss die DNA Umwandlungszahl größer oder gleich 1,0 und kleiner oder gleich 99,99 sein. Die Analysefunktion im Kalibriermenü wirkt in der gleichen Weise wie die Analysefunktion im Hauptschirmbild.
  • Die Analysefunktions-Optionen im Analysemenü sind in 17 ausführlicher dargestellt. Das Analysemenü ermöglicht die Auswahl einer Klassifizierungsfunktion A44, einer Fokussierungsfunktion A46, einer Prüflichtfunktion A48, einer Zweitauswahlfunktion A50, einer Bereichs 1–2 Funktion A52, einer Skalenfunktion A54, einer Anzeige-X-,Y-Funktion A56, einer Grenzfunktion A58, einer Lösch-X-,Y-Funktion A60, einer Hilfsfunktion A62, einer Berichtsfunktion A64 und einer Rückkehrfunktion auf das Hauptmenü A66.
  • Die Lichtprüffunktion A48 berechnet den Lichtpegel des laufenden Bildes. Der Lichtpegelwert wird auf dem Analyseschirmbild durch das Wort "Lichtpegel" gemäß 13 angezeigt.
  • Die Zweitauswahlfunktion A50 ermöglicht es dem Benutzer, die zweite Spitze in dem auf dem Analyseschirmbild angezeigten Histogramm auszuwählen. Die Masse, der DNA-Index und der Bereich der zweiten Spitze werden auf dem Schirmbild unter den Wörtern "zweite Spitze" angezeigt. Die Zeitauswahlfunktion kann nicht ausgewählt werden, wenn die gezeigte Zellzählung gleich Null ist. Die gezeigte Zellzählung wird durch das Wort "gezeigt" angezeigt. Nach Wahl der Zweitauswahlfunktion bewegt sich der Zeiger auf einen Satz von Pfeilen, wobei die Lage der laufenden zweiten Spitze im Histogramm gelb hervorgerufen wird. Zunächst wird die am weitesten rechts liegende Histogrammdatenstelle als zweite Spitze gewählt. Durch Wahl des linken Pfeils wird die Lage der zweiten Spitze nach links bewegt, während bei Wahl des rechten Pfeils durch den Benutzer die Lage der zweiten Spitze nach rechts bewegt wird. Jedes Mal, wenn ein Pfeil gewählt wird, werden die laufenden Spitzendaten auf dem Bildschirmbild aktualisiert.
  • Unter der Horizontalachse des Histogramms erscheint eines von drei Symbolen unterhalb der Lage der zweiten Spitze. Ein "kleiner als"-Symbol erscheint, wenn die zweite Spitze im Bereich Eins liegt. Ein "größer als"-Symbol erscheint, wenn die zweite Spitze in einem Bereich Zwei liegt. Ein Aufwärtspfeilsymbol erscheint, wenn die zweite Spitze weder im Bereich Eins noch im Bereich Zwei liegt. Der Zweck für die drei Symbole besteht darin, dass die Lage der zweiten Spitze nach Auslösung der Zweitwahloperation identifiziert werden kann. Die vertikale gelbe Linie verschwindet, wenn die Zweitauswahlfunktion einmal ausgelöst ist. Der Benutzer drückt die ESC-Taste um die Zeitauswahloperation auszulösen. Die Daten für die zweite Spitze werden ferner automatisch gelöscht, wenn eine der folgenden Analyseschirmbildfunktionen gewählt ist: Löschen, Berichten, Skalieren oder Hauptfunktion.
  • Die Klassifizierungsfunktion A44 ermöglicht dem Benutzer, die Zellen oder Objekte im laufenden Bild zu klassifizieren. Ist die Klassifizierungsfunktion gewählt, so wird der Benutzer aufgefordert, die Operation zu bestätigen. Zur Annahme der Bestätigung wählt der Benutzer die Ja-Taste, während er zum Ausschluss der Bestätigung die Nein-Taste wählt oder die ESC-Taste drückt. Ist die Klassifizierung bestätigt, so stoppt die Kameraerfassung und der Zeiger bewegt sich auf das Wort "Klassifizierungsoperation". Befindet sich der Zeiger in dieser Stellung, so kann der Benutzer die Klassifizierungsoperationen spezifizieren. Die numerische Sperre wird zur Freigabe dieser Funktionen aktiviert. Ebenso wie bei der Messfunktion wird ein in Magenta gefärbter Kasten um eine laufende Zelle angeordnet, wobei die Operationen es dem Benutzer ermöglichen, diese Zellenidentifizierung zur Identifizierung und Klassifizierung der darin befindlichen Zellen durch das Bild zu bewegen.
  • Die X-,Y-Anzeige-Funktion A56 dient zum Ändern die Anzeige vom Analyseschirmbild in das X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild (14). Das X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild zeigt die X-,Y-Koordinaten der ersten 512 Bilder an, welche klassifiziert und gespeichert werden. Ferner enthält das Schirmbild die Funktionen, die das Sortieren der Bildfelder durch Koordinaten ermöglichen. Die X-,Y-Einstell-Funktion im Kalibrierschirmbild muss erfolgreich durchgeführt worden sein, bevor die Anzeige-X-,Y-Funktion gewählt wird.
  • Das X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild besitzt mehrere Funktionen. Eine der Funktionen, die "Nächstlage"-Funktion, sortiert die X-,Y-Koordinaten in Abhängigkeit vom Abstand von der laufenden X-,Y-Feldlage. Die X-Funktion sortiert die X-,Y-Koordinaten in Abhängigkeit vom X-Koordinatenwert. Ist eine Schleife vorhanden, so legt die Y-Koordinate die Sortierungsfolge fest. Entsprechend sortiert die Y-Funktion die X-,Y-Koordinaten in Abhängigkeit vom Y-Koordinatenwert. Ist eine Schleife vorhanden, so legt die X-Koordinate die Sortierungsfolge fest. Die "Feldnummer"-Funktion sortiert die X-,Y-Koordinaten in Abhängigkeit von der Koordinatenfeldnummer. Die Feldnummer ist die Reihenfolge, in der die Bilder klassifiziert werden.
  • Die Seitenaufwärtsfunktion, falls vorhanden, ermöglicht dem Benutzer, die vorhergehende Seite von X-,Y-Koordinaten anzuzeigen, und die Seitenabwärtsfunktion, falls vorhanden, ermöglicht das Anzeigen der nächsten Seite von X-,Y-Koordinaten anzuzeigen. Die Austrittsfunktion ändert die Anzeige vom X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild auf das Analyseschirmbild. Das Drücken der Austrittstaste entspricht der Wahl der Austrittsfunktion.
  • Durch Wahl der X-,Y-Funktion werden die X-,Y-Koordinaten des laufenden Feldes angezeigt. Die Koordinaten werden kontinuierlich angezeigt, bis der Benutzer eine Taste drückt (mit Ausnahme CTRL, ALT und SHIFT). Die X-,Y-Einstell-Funktion im Kalibrierschirmbild muss erfolgreich durchgeführt wor den sein, bevor die X-,Y-Funktion gewählt wird. Die X-,Y-Funktion im X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild wirkt ebenso wie die X-,Y-Funktion im Kalibrier- und Analyseschirmbild.
  • Die Löschfunktion A60 löscht alle auf Datenbereiche bezogenen Analysen. Nach Wahl der Löschfunktion wird der Benutzer aufgefordert, die Löschoperation zu bestätigen. Zur Annahme der Bestätigung wählt der Benutzer die Ja-Taste, während er zum Ausschluss der Bestätigung die Nein-Taste wählt oder die ESC-Taste drückt.
  • Die Fokussierungsfunktion A46 realisiert eine Farbverstärkung für das Bild, so dass der Benutzer eine genauere Fokussierung des Bildes durchführen kann. Die Fokussierungsfunktion im Analyseschirmbild arbeitet ebenso wie die Fokussierungsfunktion im oben beschriebenen Kalibrierschirmbild.
  • Die Bereich 1–2-Funktion A52 ermöglicht es dem Benutzer, zwei Bereiche in dem im Analyseschirmbild angezeigten Histogramm zu spezifizieren. Der Zweck dieser Funktion besteht darin, die Zellzählung in bestimmten Bereichen im Histogramm zu identifizieren. Die Bereich 1–2-Funktion kann nicht gewählt werden, wenn die gezeigte Zellzählung gleich Null ist. Die Zellzählungen werden im unteren rechten Teil des Schirmbildes angezeigt. Nach Wahl der Bereich 1–2-Funktion bewegt sich der Zeiger auf eine Zahlenzeile unterhalb der Histogramm-Horizontalachse. Die Zahlenzeile ermöglicht dem Benutzer, die Lagen des Bereiches 1 und des Bereiches 2 zu spezifizieren. Der Benutzer gibt eine "1" zur Spezifizierung ein, dass die laufende Histogrammlage zum Bereich 1 gehört. Der Benutzer gibt eine "2" zur Spezifizierung ein, dass die Lage zum Bereich 2 gehört. Der Benutzer gibt eine "0" zur Spezifizierung ein, dass die laufende Histogrammlage weder zum Bereich 1 noch zum Bereich 2 gehört. Der Benutzer kann einen Bereich 1 ohne einen Bereich 2 jedoch nicht einen Bereich 2 ohne einen Bereich 1 spezifizieren. Werden beide Bereiche spezifiziert, so muss der Bereich 1 links vom Bereich 2 spezifiziert werden. Der Bereich muss als kontinuierlich spezifiziert werden. Zum Austritt aus der Bereich 1–2-Funktion drückt der Benutzer die Eingabe- oder ESC-Taste. Drückt der Benutzer die Eingabetaste, so wird der Bereich 1 des Histogramms in grün und der Bereich 2 in Magenta hervorgehoben. Die Bereichszellzählungen werden ebenfalls angezeigt. Das Drücken der ESC-Taste bewirkt, dass das Programm durchgeführte Änderungen nicht berücksichtigt. Bereich 1- und Bereich 2-Daten werden automatisch gelöscht, wenn eine der folgenden Funktionen gewählt wird: Klassifizieren, Löschen, Berichten, Skalieren oder Hauptfunktion.
  • Die Analysefunktion A42 wird nun anhand der 20 und 21 genauer beschrieben. Die Bedienungsperson wählt eine Zahl von Feldlagen 360, 361 und 362 im Objektträgerprüfbereich 61 zur Analyse. Die Bedienungsperson bewegt die X- und Y-Knöpfe 110 und 17 für das Mikroskopstativ 51 zur Bewegung eines ersten hinsichtlich des DNA-Gehaltes sowie gegebenenfalls hinsichtlich der Zellmorphologie zu analysierenden Feldes von Probezellenobjekten in das Betrachtungsfeld auf dem Monitorschirm 37 (20). Das Programm ordnet dann einen Kasten beispielsweise 300 auf einem auf dem Monitor 37 angezeigten speziellen Probezellenobjekt 12 an, wobei der Benutzer dann eine Taste benutzt, um die Abtastung der Bildpunkte (Bildelemente) des Probeobjektes auszulösen, wobei die Zellen entsprechend klassifiziert werden, wie dies im US-Patent 4,453,266 beschrieben ist, woraus die summierte optische Dichte für das Zellprobenobjekt, d.h. einen eingefärbten Zellkern, sowie dessen Fläche, Rundung und andere Klassifizierungsinformation erzeugt wird. Ferner stehen der Bedienungsperson auf der Tastatur 36 mehrere manuell betätigbare Zellklassifizierungstasten zur Verfügung, von denen er eine Taste bekannter Kategorie, etwa Typ 0-Normalzelle; Typ 1-Krebszelle; Typ 2-Krebszelle; Typ 3-Krebszelle; usw. drückt. Auf dem Monitorschirm 62 erscheint ein Analysehistogramm, das den DNA-Gehalt der Zellen im Feld anzeigt. Die Bedienungsperson wählt eine Zellenzahl in jedem Feld bzw. Bereich und bewegt dann das Mikroskopstativ, um eine Anzahl anderer Felder von Probezellen in das Betrachtungsfeld zu bringen und erfasst und analysiert eine Anzahl dieser Probezellen, bis er den Eindruck hat, genug Zellen für eine repräsentative Probe zu haben.
  • Zu diesem Zeitpunkt wird auf dem Monitorschirm 62 ein Histogramm der dargestellten Art angezeigt, das die Anzahl von Zellen eines speziellen DNA-Gehaltes sowie die DNA-Gehaltmittelwerte für jede der Referenzspitzen zeigt, wie dies beispielsweise in 13 dargestellt ist. Durch Drücken einer Drucktaste auf der Tastatur 36 kann die Bedienungsperson das Histogramm gemäß 13 auf den Drucker 38 ausdrucken. Die Daten für Probezellen werden ebenfalls intern in der Systemsteuerung 22 für einen späteren Abruf und einem Vergleich mit Daten jeder neuen Probe für den gleichen Patienten zur Analyse in bezug auf den Fortschritt oder Rückschritt eines Patienten gespeichert.
  • Die Arbeitsweise der Analysefunktion nun wird anhand von 19 und 20 eingehender beschrieben, in denen ein visuelles Feld dargestellt ist, das vorher im Instrument gespeichert wurde. Das Feld enthält eine Anzahl von Zellenobjekten, welche hinsichtlich des DNA-Gehaltes klassifiziert und gemessen werden sollen. Gelangt das Programm anfänglich in diese Betriebsart, so wird das erste Objekt im Feld durch rasterförmiges Abtasten der Bildpunkte des Feldes identifiziert, bis ein Zellobjekt erkannt ist. Ist ein Zellobjekt einmal erkannt, so kann ein Identifizierungsmittel wie beispielsweise der Kasten 300 um das Objekt gezeichnet werden. Dies gewährleistet eine visuelle Identifizierung für die Bedienungsperson zur Bestimmung, welches Zellobjekt gegenwärtig gemessen wird. Zusätzlich zur Messung stehen die Bedienungsperson mehrere Zusatzfunktionen im Analysemenü zur Verfügung. Die primäre Zusatzfunktion für die Bedienungsperson besteht in der Klassifizierung eines laufenden Objektes im Block A202. Die Bedienungsperson führt dies durch Drücken einer der numerischen Tasten 0–5 aus, wodurch das Zellobjekt des identifizierenden Kastens automatisch in die gewählte Klassifikation 0–5 gebracht wird. Wird das Objekt als Abfall, nicht jedoch als abnormale Zelle oder als nicht identifizierendes Zellobjekt identifiziert, so kann die Bedienungsperson das laufende Objekt durch Wahl einer 9 auf der Tastatur ausschließen, wie dies im Block A204 angegeben ist.
  • Nach Klassifizierung oder Ausschluss des Objekts im Kasten 300 kann die Bedienungsperson den Identifizierungskasten zum nächsten ungemessenen im Block A208 festgelegten Objekt bewegen. Eine Bedienungsperson führt dies durch Drücken der Tasten CTRL/F2 aus, wodurch das Programm den Kasten 300 löscht und das nächste identifizierbare Zellobjekt sucht. Dieses Zellobjekt wird aufgefunden, wonach ein weiterer Identifizierungskasten 302 um dieses Objekt gezogen wird, um der Bedienungsperson die von ihr ausgeführte Funktion anzuzeigen. Auf diese Weise kann die gesamte Gruppe von Zellobjekten klassifiziert und gemessen oder durch Wiederholen dieses Prozesses ausgeschlossen werden. 20 zeigt den Vorgang der Abtastung eines Zellobjektes, das Umgeben dieses Objektes mit einem Identifizierungskasten und die Klassifizierung bzw. den Ausschluss des Objektes. Auf diese Weise durchläuft das Programm den Analysevorgang vom Objekt 300 zu 302, 304, 306, 308, 310, 312 usw.
  • Wenn eines der zu klassifizierenden Zellobjekte nicht so aussieht, wie es nach Meinung der Bedienungsperson erforderlich wäre, dann sollte und kann es darüber hinaus nicht in eine der obengenannten Klassifizierungen eingebracht werden; sollte die Bedienungsperson aus irgendeinem Grunde glauben, er habe das vorhergehende Objekt fehlerhaft klassifiziert, so kann er in Block A206 durch Drücken von CTRL/F1 den Identifizierungskasten auf das vorher gemessene Objekt zurückbewegen. Nach Identifizierung aller im speziellen Feld angezeigten Zellobjekte hat die Bedienungsperson die Wahl, durch Betätigen des X-,Y-Einstellmechanismus auf ein anderes Feld überzugehen, um mehr Zellen für die spezielle Analyse bereitzustellen.
  • Hat die Bedienungsperson festgestellt, dass genug Zellen analysiert sind, so kann sie die Analysefunktion durch Drücken entweder der Eingabetaste oder der Austrittstaste die Analysefunktion beenden. Beendet sie die Analysefunktion durch Drücken der Eingabetaste, wie dies im Block A212 dargestellt ist, so werden die für jede der Messungen gesammelten Daten bewahrt. Wird die Analysefunktion jedoch durch Drücken der ESC-Taste beendet, so werden im Block A216 die Daten nicht bewahrt.
  • Die Berichtsfunktion A64 ermöglicht es dem Benutzer, zu spezifizieren, welche Zellklassifikationen in dem auf dem Schirm des Monitors 62 angezeigten Histogramm enthalten sein sollen. Nach Wahl der Berichtsfunktion kann der Zeiger auf eine Optionsliste bewegt werden, welche der Bedienungsperson die Spezifizierung der Zelltypen ermöglicht. Die folgende Tabelle spezifiziert, welche Taste die Bedienungsperson drückt, um einen speziellen Zelltyp auszuwählen.
    Zelltyp Taste
    Normal 0 oder n
    1 1
    2 2
    3 3
    4 4
    Lymphkörper 5 oder L
  • Jede Kombination der Typen für die Berichtsdaten ist zulässig. Das Programm ignoriert von den in der Tabelle aufgelisteten Zeichen verschiedene Zeichen. Die Bedienungsperson steigt durch Drücken der Eingabe- oder Austrittstaste aus der Berichtsoperation aus. Drückt die Bedienungsperson die Eingabetaste, so ändert er die Typen im Histogramm auf diejenigen, welche spezifiziert wurden. Wird jedoch die Austrittstaste gewählt, so ignoriert das Programm alle durchgeführten Änderungen und kehrt normal zurück. Der Funktionsbereich 1 oder 2 sowie die Daten der zweiten Spitze werden automatisch gelöscht, wenn die Berichtsfunktion durchgeführt wird.
  • Die Skalierungsfunktion A54 ermöglicht es der Bedienungsperson, die Skala der Horizontalachse des auf dem Analyseschirmbild dargestellten Histogramms zu ändern. Es sind drei wählbare Skalen von 0–16, 0–32 und 0–64 vorhanden. Wird die Skalierungsfunktion gewählt, wenn die laufende Skala gleich 0–16 ist, so ist die neue Skala gleich 0–32. Wird die Skalierungsfunktion gewählt, wenn die laufende Skala gleich 0–32 ist, so ist die neue Skala gleich 0–64. Wird die Skalierungsfunktion gewählt, wenn die laufende Skala gleich 0–64 ist, so ist die neue Skala entsprechend gleich 0–16. Bei dieser Funktion werden der Bereich 1, der Bereich 2 und die Daten für die zweite Spitze automatisch gelöscht, wenn die Skalierungsoperation durchgeführt wird.
  • Die Grenzfunktion A58 ändert die Anzeige auf dem Monitor 37 vom Analyseschirmbild in das Einstellgrenzschirmbild. Das Einstellgrenzschirmbild enthält Funktionen, welche zur Änderung der Zellgrenze, d.h. des Schwellwertes erforderlich sind. Beim Adressieren des Grenzschirmbildes wird die Kamerabilderfassung angehalten.
  • Die Schrittfunktion ermöglicht der Bedienungsperson, den Betrag zu verändern, um den sich die Grenze ändert, wenn eine der Pfeiltasten gewählt wird. Der Wert muss im Bereich von 0–128 liegen. Ist die Schrittgröße gewählt, so bewegt sich der Zeiger auf die Stelle auf dem Schirm, an welcher der Benutzer einen neuen Schrittgrößenwert tippen kann. Zum Austritt aus der Schrittgrößenfunktion wird die Eingabe- oder Austrittstaste verwendet. Beim Drücken der Eingabetaste wird die Schrittgrößenänderung bewahrt, während beim Drücken der Austrittstaste jede bereits durchgeführte Änderung ignoriert wird. Anfänglich ist der Schrittgrößenwert gleich Eins.
  • Die Aufwärtspfeilfunktion vergrößert die Zellgröße um den Wert der Schrittgröße, während die Abwärtsbereichsfunktion die Zellgrenze um den Wert der Schrittgröße verringert. Die Austrittsfunktion ändert die Anzeige vom Adressgrenzschirmbild in das Analyseschirmbild. Das Drücken der Austrittstaste entspricht der Wahl der Austrittsfunktion.
  • Generell wird durch die Vorrichtung ein interaktives Schema zum Sammeln und Analysieren von Daten zwecks Sammelns spezieller Parameter sowohl für die Kalibrierzellobjekte als auch die Probezellobjekte verwendet. Jedes gewählte Feld wird auf dem Monitor 37 angezeigt, wobei entweder die Messoperation des Kalibrierschirmbildes oder die Klassifizierungsoperation des Analyseschirmbildes gewählt wird.
  • Ein Software-Flussdiagramm eines die interaktiven Operationen für die Kalibriertastenoperationen und die Analysetatenoperationen gemäß den 18 und 19 realisierenden Unterprogramms ist in 24 dargestellt. Wählt die Bedienungsperson entweder die Messoperationen oder die Klassifizierungsoperationen, so wird dieses Programm aufgerufen, um den Auswahlprozess sowohl für die Kalibrierzellenobjekte als auch die Probezellenobjekte durchzuführen. Das Programm beginnt im Block A300 durch bildpunktweises Ausführen einer Rasterabtastung des gespeicherten Bildes, bis ein Bildpunkt aufgefunden wird, welcher größer als der Schwellwert ist. Der Test für diese Operation wird im Block A302 durchgeführt. Wird kein Bildpunkt aufgefunden, welcher größer als der Schwellwert ist, so legt der Block A304 fest, ob die Abtastung vollständig ist. Ist dies nicht der Fall, so kehrt das Programm zum Block A300 zurück, wobei die Abtastung fortgesetzt wird, bis alle Bildpunkte im Bildfeld getestet sind. Sind alle Bildpunkte getestet, so werden die Abtastparameter im Block A308 rückgesetzt und das Zellobjektraster im Block A310 aktualisiert.
  • Wenn festgestellt wird, dass ein Bildpunkt größer als der Schwellwert ist, so kennzeichnet das Programm das Objekt im Block A306. Die Kennzeichnungsoperation wird nachfolgend im einzelnen beschrieben. Die individualisierten Zellobjekte im digitalisiertem Bild werden durch eine Szenenanalysetechnik lokalisiert, bei der die Rasterabtastung des digitalisierten Bildes erfolgt, um jeden Bildpunkt oberhalb des kritischen Schwellwertes zu lokalisieren. Die Technik führt sodann eine Vierernachbarschaftsanalyse benachbarter Bildelemente durch und fährt fort, in sich wiederholender Form oberhalb des Schwellwertes liegende "Nachbarn der Nachbarn" zu lokalisieren, bis der gesamte Bereich eines Zellobjektes definiert ist. Diese Technik wird gegenüber anderen Szenenanalysetechniken, wie beispielsweise einer Auffindung einer lokalen Grenze aus einem Gradientenbild, bevorzugt, weil sie bei der Unterscheidung des wahren Bereiches einer Zelle, insbesondere bei Zellen mit irregulären oder nadelförmigen Ansätzen irrtumssicher ist.
  • Die vier Bildpunkte (oben, unten, rechts und links), welche den anfänglich lokalisierten Bildpunkt umgeben und an diesen angrenzen, werden sequentiell untersucht, um den nächsten Bildpunkt mit einer optischen Dichte bzw. einen Graupegelwert oberhalb des Schwellwertes zu identifizieren. Liegt beispielsweise der oberhalb des ersten Bildpunktes liegende Bildpunkt nicht über dem Schwellwert, so wird er aus dem Kennzeichnungsprogramm herausgenommen. Der nächste Bildpunkt (rechts) im Uhrzeigersinn wird sodann untersucht und kann oberhalb des Schwellwertes liegen. Ist dies der Fall, so wird dann dieser Bildpunkt identifiziert und im Speicher gespeichert, wobei der Bildpunkt ein Teil des Bereichs einer Zelle ist. Anschließend werden die Adresse und die Dichte des gefundenen Bildpunktes in einer Pushdown-Liste gespeichert, und die vier Nachbarbildpunkte dieses Bildpunktes werden im gleichen Uhrzeigersinn untersucht. Dies wird rekursiv fortgeführt, bis oberhalb eines Schwellwertes für einen speziellen Bildpunkt keine Nachbarn gefunden werden. An diesem Punkt werden die früheren Bildpunkte in der Pushdown-Liste erneut untersucht, um den Nachbarsuchprozess fortzusetzen, bis die vollständige Anzahl von einen Bereich definierenden Bildpunkten, d.h. das Zellobjekt, identifiziert ist. Es werden also die Bildpunkte oberhalb des Schwellwertes des Bereiches identifiziert, wobei ein vollständiger geschlossener Bereich für eine Zelle definiert ist.
  • Nachdem ein Zellobjekt bezeichnet worden ist, wird wie gezeigt eine Zellobjekttabelle (24C) für das Objekt aufgestellt. Die Tabelle listet die Adresse ihres Eintrittspunkt-Bildpunktes, die Anzahl von Bildpunkten im Objekt, die X-,Y-Punkte für den Minimum- und Maximumpunkt des Objektes, ein Zählwert der Bildpunkte im Umfang des Objektes, die Summe der optischen Dichte der Objektbildpunkte, für das Objekt realisierte Klassifizierungen sowie die X-,Y-Koordinaten des Feldes auf, zu dem das Objekt gehört. Eine Vielzahl der Zellobjekttabellen umfassen ein als Feldraster bezeichnetes und in 24A dargestelltes Zwischenraster, das zur Speicherung der für das relevante gegenwärtige Feldbild entwickelten interaktiven Daten benutzt wird.
  • Im Block A312 stellt das Programm fest, ob ein automatisches Kennzeichensignal vorher gesetzt worden ist. Ist dies der Fall, so verzweigt sich das Programm unmittelbar zum Block A316, oder falls nicht, negativ zum Block A313. Sodann wird im Block A313 unter Verwendung der X-,Y-Grenzen ein Kasten bzw. eine Identifizierungsgrenze um das Objekt angeordnet. Diese Betriebsart identifiziert für die Bedienungsperson ein spezielles Objekt im Feld. Im Block A314 wird eine Tastenhandhabung eingegeben, um die Bedienungsperson zum Drücken einer Taste zu veranlassen, wodurch festgelegt wird, welche der Tastenfunktionen nach 18 oder 19 durchzuführen ist. Der Tasten-Bediener legt ferner fest, welche Operation entweder zur Kalibrierung oder Analyse durchzuführen ist, wobei lediglich die der vorhandenen Betriebsart zugeordneten Tasten freigegeben werden, während sämtliche anderen Tasten gesperrt werden. Ist eine Taste gegeben, so legen Blöcke A326 bis A342 die gewählte Funktion und den Fortgang der Routine fest.
  • Im Block A326 detektierte Tasten 0–5 gewährleisten die Akzeptanz eines Kalibrierungsobjektes oder die Klassifizierung eines Probeobjektes. Wird eine derartige Taste detektiert, so setzt ein bestätigender Zweig das Programm im Block A316 fort. Im Block A318 wird das Objekt erneut gekennzeichnet, während das Objekt im Block A320 (rot) gefärbt wird, um der Bedienungsperson anzuzeigen, dass es angenommen oder klassifiziert worden ist. Die Bedienungsperson klassifiziert die Zellobjekte in unterschiedliche Kategorien auf der Basis von sichtbaren Anhaltspunkten, beispielsweise morphologisch. Die Zellen für die Analyse können in eine normale Klasse 0 oder in eine von mehreren abnormalen Klassen 1–5 klassifiziert werden. Die Datenklasse des Objektes wird an ihrer Stelle in der zugehörigen Objektdatentabelle im Block A316 gespeichert. Kalibrierobjekte werden als Typ 0 bzw. normal klassifiziert. Das Programm kehrt dann zum Block A300 zu rück, in dem die Bildabtastregister zur Abtastung des Feldes für das nächste Objekt inkrementiert werden.
  • Wurde hingegen durch Tastendrücken eine 9 betätigt, was im Block A328 getestet wird, so bedeutet dies, dass entweder ein Kalibrierzellobjekt oder ein laufendes Probezellenobjekt ausgeschlossen wurde. Damit wird im Block A322 das ausgeschlossene Zellobjekt gegenüber einem angenommenen bzw. klassifizierten Zellobjekt in unterschiedlicher Farbe (weiß) eingefärbt, wobei das Programm zur Auffindung eines weiteren Objektes im Block A300 zur Abtastprogrammeingabe zurückkehrt. Die Anfärbung des Zellobjektes zeigt der Bedienungsperson an, dass das Objekt in diesem Feld analysiert worden ist, während das Anfärben des Objektes in einer anderen Farbe das Objekt von angenommenen bzw. klassifizierten Zellobjekten unterscheidet.
  • Wird jedoch die Taste CTRL/F1 gedrückt, was im Block A336 getestet wird, dann möchte die Bedienungsperson den identifizierenden Kasten zum letzten vorher gemessenen Objekt zu bewegen. Das Programm fragt dann das Feldraster ab, um den letzten Objektzeiger im Block A346 aufzufinden. Dieser Zeiger dient zur Erzeugung des Kastens um das vorhergehende Zellobjekt durch Transformation der Steuerung auf den Block A313 vor dem neuen Drücken einer Taste im Block A314. Durch Verwendung einer Serie von CTRL/F1-Tasten kann die Bedienungsperson den identifizierenden Kasten selektiv in Rückwärtsrichtung vom vorher gemessenen Zellobjekt zum vorher gemessenen Zellobjekt bewegen. Wünscht die Bedienungsperson nach dem Anordnen des Kastens um ein spezielles Zellobjekt dieses Zellobjekt erneut zu klassifizieren, hat er die Möglichkeit, es mit den Tasten 0–5 im Block A326 zu klassifizieren.
  • Der identifizierende Kasten kann durch Wahl der Taste CTRL/F2 zum nächsten ungemessenen Zellobjekt bewegt werden. Diese Taste wird im Block A338 getestet, wobei bei ihrer Auffindung eine unmittelbare Rückkehr der Programmsteuerung auf die Bildabtasteingabe im Block A300 erfolgt. Der Effekt dieser Operation besteht darin, der Bedienungsperson das Übersprin gen des vorhandenen Zellobjektes und die Bewegung des identifizierenden Kastens auf das nächste Zellobjekt zu ermöglichen, ohne dass die vorhandene Zelle abgewiesen oder angenommen wird. Aufeinanderfolgendes Drücken von CTRL/F2 bewegt den Kasten durch die Zellen nach vorne, ohne sie zu messen.
  • Erscheinen sämtliche Zellobjekte in einem speziellen Feld normal als Probezellen, oder wie es generell mit Kontrollzellen der Fall ist, so sind sie annehmbar, wobei die Bedienungsperson möglicherweise wünscht, sie automatisch zu klassifizieren. Zu diesem Zweck drückt die Bedienungsperson die Taste CTRL/F3. Dies wird im Block A339 detektiert, wobei die Steuerung zum Block A341 fortschreitet, in dem ein Automatikbetriebsart-Kennzeichensignal gesetzt wird. Das Programm kehrt sodann zur Eingabe der Bildabtastung im Block A300 zurück. An Stelle des Durchlaufens der normalen Folge der Anordnung eines Kastens um das nächste Objekt und des Wartens auf einen Tastendruck, schreitet das Programm jedoch automatisch fort, um den Rest der Zellen eines Feldes automatisch zu klassifizieren. Das gesetzte Automatikbetriebsart-Kennzeichensignal wird im Block A313 abgetastet, wobei das Programm die Steuerung automatisch auf den Block A316 weiterführt. Automatisch klassifizierte Zellen werden als normal oder als Typ 0 eingeteilt. Über die Blöcke A300, A302, A306, A313, A316, A318 und A320 wird also eine Abtast- und Kennzeichnungsschleife abgearbeitet, bis die Abtastung des gesamten Feldes abgeschlossen ist, was im Block A304 erfasst wird.
  • Eine weitere durch die Bedienungsperson wählbare Option ist die Zellschneidfunktion, welche durch Drücken der Taste CTRL/F4 eingegeben wird. Diese Taste wird im Block A342 detektiert und überträgt die Steuerung auf den Zellschneid-Funktionsbetrieb im Block A352. Werden die Tasten CTRL und F4 gedrückt, so gibt der Benutzer den Zellschneidbetrieb ein. In diesem Betrieb kann der Benutzer Schnittlinien innerhalb des identifizierenden Kastens durchführen. Die Bedienungsperson kann keine Schnittlinie über einen Bildpunkt führen, welcher zu einer gemessenen oder ausgeschlossenen Zel le gehört. Eine gemessene Zelle ist eine Zelle, die als Typ 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 klassifiziert worden ist. Um eine Zellschneidoperation durchzuführen, muss eine numerische Sperre aktiviert werden. An der Stelle, an welcher der Schnitt stattfinden soll, wird ein Fadenkreuz angeordnet. Die folgende Tabelle listet die durchführbaren Zellschneidoperationen sowie die Taste auf, welche gedrückt werden muss, um die gewünschte Operation zu wählen. Die Funktion ermöglicht die Trennung von sich überlappenden Zellen durch künstliches Herstellen eines Umrisses, nämlich eines Schnittes zwischen den beiden Bereichen. Das Kennzeichnungsprogramm kennzeichnet daher lediglich einen Bereich als ein Zellobjekt.
    (TASTE) (AKTION)
    0 Aufspalten ein- und ausschalten
    1 Um einen Schritt abwärts und nach links gehen
    2 Um einen Schritt abwärts gehen
    3 Um einen Schritt abwärts und nach rechts gehen
    4 Um einen Schritt nach links gehen
    5 Zur Kastenmitte gehen
    6 Um einen Schritt nach rechts gehen
    7 Um einen Schritt aufwärts und nach links gehen
    8 Um einen Schritt aufwärts gehen
    9 Um einen Schritt aufwärts gehen und nach rechts gehen
    ENTER Letzten Schritt erneut ausführen (bis zu 100 Pixel)
    ESC Austritt aus dem Zellaufspaltungsmodus
  • Ein Schritt umfasst drei Bildpunkte. Bei Beginn eines neuen Schnittes wird der erste Bildpunkt nicht geschnitten. Für die Operation 5 bewegt sich das Fadenkreuz nicht, wenn der Mittenbildpunkt zu einer gemessenen oder ausgeschlossenen Zeile gehört.
  • Nach Durchführung des Zellschneidens im Block A352 werden die Abtastregister auf den Eingabepunkt des speziellen Objektschnittes gesetzt. Das Programm kehrt sodann zur Abtasteingabe im Block A300 zurück. Da das Zellobjekt den gleichen Eingabepunkt jedoch einen unterschiedlichen Umriß hat, kennzeichnet das Kennzeichnungsprogramm (Block A306) das Zellobjekt als neuen Schnitt.
  • Eine weitere von der Bedienungsperson wählbare Option ist die Auswahl eines Objektes in einem Feld. Die Wahl dieser Betriebsart erfolgt durch Drücken der CTRL/F5-Taste, welche im Block A340 erfasst wird. Eine bestätigende Verzweigung vom Block A340 überträgt die Steuerung auf den Block A348, in dem der Wählobjektbetrieb eingegeben wird.
  • Werden die CTRL- und FS-Taste gedrückt, so gibt der Benutzer den Wählbetrieb ein. Zur Durchführung einer Wähloperation muss eine numerische Sperre aktiviert werden. Im laufenden Auswahlpunkt erscheint ein Fadenkreuz. Die folgende Tabelle listet die durchführbaren Auswahloperationen sowie die Taste auf, die gedrückt werden muss, um die gewünschte Operation zu wählen.
    (TASTE) (AKTION)
    0 Fadenkreuz-Bewegungsschrittgröße wählen [5 oder 15]
    1 Um einen Schritt abwärts und nach links gehen
    2 Um einen Schritt abwärts gehen
    3 Um einen Schritt abwärts und nach rechts gehen
    4 Um einen Schritt nach links gehen
    5 Zur Bildmitte gehen
    6 Um einen Schritt nach rechts gehen
    7 Um einen Schritt aufwärts und nach links gehen
    8 Um einen Schritt aufwärts gehen
    9 Um einen Schritt aufwärts und nach rechts gehen
    ESC Austritt auf Wählbetrieb
  • Erfolgt der Austritt aus dem Auswahlmodus, so bewegt sich der Kasten zunächst auf die erste ungemessene Zeile nach dem Auswahlpunkt. Sind nach dem Fadenkreuz keine Zellen vorhanden, so geht der Kasten zur nächsten unklassifizierten Zelle.
  • Nachdem das Objekt durch die oben beschriebene Technik gewählt ist, werden die Abtasterregister im Block A348 auf den Eingabepunkt dieses speziellen Objektes gesetzt und das Programm kehrt auf die Abtasteingabe im Block A300 zurück. Dadurch wird unter Verwendung der X-,Y-Grenzen der Identifizierungskasten um das Objekt erzeugt und der Bedienungsperson die Möglichkeit gegeben, sodann eine weitere Taste zu drücken und weitere Messungen und Klassifizierungen für das ausgewählte Objekt durchzuführen.
  • Eine weitere Funktion wird durch die Taste CTRL/F6 realisiert, welche im Block A330 getestet wird. Diese Maßnahme gibt einer Bedienungsperson die Möglichkeit, den Identifizierungskasten durch Lesen des im Block A324 angezeigten nächsten Zellobjektes vorwärtszubewegen und im Block A313 einen Kasten um das gewählte Objekt zu zeichnen. Die Taste CTRL/F1, CTRL/F2 ermöglicht es daher einer Bedienungsperson, eine vorhergehende Zellklassifizierung durch Vorwärts- bzw. Rückwärtsschalten durch die Pointer der vorher gemessenen Zellen schnell zu überprüfen.
  • Wird im Block A332 die Eingabetaste erkannt, so wird die Steuerung des Programms auf den Block A310 übertragen. In diesem Block wird das Zellobjektraster (24B) mit dem vorhandenen Feldraster aktualisiert, um alle für die speziellen Objekte im Feld gesammelten Daten zu speichern. Andererseits führt die Erfassung der Austrittstaste das Programm unmittelbar an die Stelle in der Software zurück, wo es abgerufen wurde.
  • Es ist ersichtlich, dass die dargestellte Steuerung 22 zur Durchführung der Zellklassifikation und der Analyse der optischen Dichte programmiert ist.
  • Eine derartige Klassifikation und Analyse entspricht den im US-Patent 4,453,266 angegebenen Maßnahmen für die Klassifizierung von roten Blutkörperchen, wobei die vorliegende Erfindung insbesondere bei der Analyse von roten Blutkörperchen anwendbar ist, wobei an Stelle des DNA-Gehaltes im oben beschriebenen Sinne die optische Dichte des Hämoglobingehaltes gemessen wird. Wie bei der Analyse von roten Blutkörperchen üblich, müssen diese für die Bildverstärkung nicht angefärbt werden, so dass der Anfärbungseichschritt für rote Blutkörperchen entfallen kann, wenn die in den oben genannten Bacus-Patenten angegebene spezielle Lichtwellenlänge zur Anwendung kommt.
  • Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht in einer genauen Messung von Hämoglobin in tatsächlichen Picogramm zur Kalibrierung anderer Instrumente, beispielsweise eines Coulter-Zählers. In einem derartigen Prozess besitzen die Kontrollblutzellen 40 einen bekannten vorgegebenen Hämoglobinwert, wobei die Probeblutzellen 12 mit unbekanntem Hämoglobinwert auf den Probebereich 61 gebracht werden. Anschließend wird die Vorrichtung geeicht, um das Histogramm für den Hämoglobingehalt der Probezellen 12 anzuzeigen.
  • Es ist ferner darauf hinzuweisen, dass die verschiedenen Kalibrierschritte entfallen oder kombiniert und gleichzeitig durchgeführt werden können, statt in der Anordnung und Reihenfolge durchgeführt zu werden, die für die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung bei der Durchführung einer DNA-Analyse beschrieben wurden. Die Anwendung der vorliegenden Erfindung zur Antigenanalyse kann die Schritte des Anbindens von monoklonalen Antikörpern an die Probe- und Kontrollzellenobjekte enthalten. Später können die monoklonalen Antikörper mit einem Enzym-Färbemittel gepaart werden. Ferner können die monoklonalen Antikörper mit einem fluoreszierenden Material gepaart werden. Danach kann das fluoreszierende Anfärbemittel mit einer Wellenlänge erregt werden, welche die Fluoreszenz anregt, wobei die Probeobjekte in bezug auf die Wellenlänge, bei der die Fluoreszenzemission auftritt, mit einer anderen Wellenlänge beobachtet werden.
  • Wird das Antigen für einen bestimmten Virus gebildet, so können die Kontrollzellen-Probeobjekte mit einer für das Genom des Virus spezifischen Nukleinsäureprobe behandelt werden.
  • Obwohl eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung gezeigt wurde, wird Fachleuten ersichtlich sein, dass an der Erfindung zahlreiche Modifikationen und Veränderungen vorgenommen werden können. Die Erfindung ist in den angefügten Ansprüchen definiert.

Claims (5)

  1. Zellanalyseverfahren zum Bestimmen der optischen Dichte von Proben-Zellobjekten, mit den folgenden Schritten: Bereitstellen eines Supports (14) mit einem Referenzbereich und einem Probenbereich (61), Anordnen von Kontroll-Zellobjekten (40) in dem Referenzbereich, Anordnen von Referenzmaterial (45) für optische Dichte, das eine vorbestimmte optische Dichte aufweist, in dem Referenzbereich, Anordnen von Proben-Zellobjekten (12) unbekannter optischer Dichte in dem Probenbereich (61), Messen der optischen Dichte (oD) der Kontroll-Zellobjekte (40), Bestimmen eines Dichte-Faktors aus der gemessenen optischen Dichte der Kontroll-Zellobjekte (40) und der vorbestimmten optischen Dichte des Referenzmaterials (45) für optische Dichte, Messen der optischen Dichte der Proben-Zellobjekten (12), und Bestimmen der tatsächlichen optischen Dichte der Proben-Zellobjekte (12) aus der gemessenen optischen Dichte der Proben-Zellobjekte (12) und dem Dichte-Faktor.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 zum Messen von Hämoglobin in Proben-Blutzellen mittels einer Messvorrichtung (11) für optische Dichte, mit den folgenden Schritten: Versehen eines Objektträgers (14) mit Kontroll-Blutzellen (40), die einen vorbestimmten Hämoglobinwert aufweisen, Platzieren der Proben-Blutzellen (12) auf dem Objektträger (14), Kalibrieren der Messvorrichtung (11) für optische Dichte auf den bekannten Hämoglobinwert der Kontrollzellen (40), Messen der optischen Dichte der Probenzellen (61), Erzeugen eines Ausgangssignals, das den Hämoglobinwert der Proben-Blutzellen angibt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, mit den folgenden Schritten: Betrachten vergrößerter Bilder der Proben-Zellobjekte (61) in jedem Feld mehrerer aufeinanderfolgender Felder, Wählen bestimmter Bilder von Proben-Zellobjekten (12) in den entsprechenden Feldern zur Bildanalyse und Ausschließen anderer Bilder in den Feldern von der Bildanalyse, und Analysieren der gewählten Zellobjekte auf quantitative Daten zur optischen Dichte.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, mit den folgenden Schritten: Kalibrieren einer Bildanalysevorrichtung durch Prüfen der Kalibrierungs-Zellobjekte und Messen eines Zellobjekt-Parameters und In-Beziehung-Setzen dieses Messwerts zu einer tatsächlichen Massenzahl, Analysieren der Proben-Zellobjekte durch Bildanalyse und Messen des Parameters in Relation zu einer während des Kalibrierungsvorgangs errechneten Massenzahl, Erzeugung einer Parameterverteilung des gemessenen Parameters für eine Population von Proben-Zellobjekten, und Melden der Parameterverteilung auf einer Masseneinheiten entsprechenden Koordinatenskala.
  5. Mikroskopischer Objektträger zur Verwendung in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, wobei der Objektträger einen Support (14) mit einem Probenbereich (61) und zwei an einer Seite des Probenbereichs angeordneten Referenzbereichen aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Referenzbereich Referenzmittel (45) mit einer vorbestimmten optischen Dichte aufweist, die durch eine automatische Zellanalysevorrichtung zum Kalibrieren der Vorrichtung detektiert werden kann, und dass der zweite Referenzbereich Kontroll-Zellobjekte (40) enthält, die zum Kalibrieren der verschiedenen Anfärbefaktoren verwendet werden.
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