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Die
Erfindung betrifft generell die Messung von Zellobjekteigenschaften
und -parametern durch Bildanalyse und ist insbesondere auf quantitative
Messverfahren und -vorrichtungen zur DNA-Analyse in kleinen Zellpopulationen
gerichtet.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren
zum quantitativen Testen, die in einem weiten Bereich von diagnostischen
und prognostischen Bewertungen verschiedener Zellen, Antigene oder
anderer aus dem menschlichen Körper
entnommenen biologischen Materialien verwendbar sind. Zum Zwecke
der Veranschaulichung und leichten Verständlichkeit wird die Erfindung
jedoch anhand ihrer bevorzugten Anwendung beschrieben, bei der es
sich um die quantitative Messung von zellularer DNA zum Zwecke der Krebsdiagnose
und -prognose handelt. Speziell betrifft die Erfindung ein Verfahren
zur interaktiven Bildanalyse zum Anglisieren und Quantifizieren
der DNA in einer Person entnommenen Probezellen.
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Der
gegenwärtige
Stand in pathologischen Laboratorien besteht in der Messung des
DNA-Gehaltes einer Zelle mittels visueller Betrachtung durch den
Pathologen, der primär
die Form und das Gewebe mutmaßlicher
Krebszellen beobachtet und die Zellen anschließend in eine normale Kategorie
oder in eine von mehreren abnormalen Krebskategorien klassifiziert.
Derartige Bewertungen sind jedoch sehr subjektiv und können geringe
Mengen der DNA in einzelnen Zellen oder sehr kleinen Populationen
von abnormalen Zellen nicht unterscheiden oder quantifizieren. Derartige
kleine Änderungen
können
einen beginnenden Krebszustand oder eine Änderung der Zellstruktur aufgrund
einer Behandlung des Krebses durch Chemotherapie oder Bestrahlung
repräsentieren.
Somit sind solche kleinen Änderungen
bei der Diagnose und Prognose dieser Krankheiten wichtig.
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Der
Vorteil bei der Diagnose und/oder Prognose von abnormalen Verteilungen
für einen
eine Probe unter einem Mikroskop betrachtenden Pathologen besteht
jedoch in der vom Fachmann vornehmbaren klar unterscheidenden Beurteilung
bei der Klassifizierung von Zellen als normal oder abnormal. Es
existiert eine natürliche
menschliche Begabung zur Durchführung
relativ schneller begrenzter Klassifikationsabstufungen, d.h. fast
normal, geringfügig
abnormal, usw. Andererseits ist die Klassifizierung und Messung
von Zellmerkmalen und -parametern durch den Pathologen von Zelle
zu Zelle extrem mühsam
und zeitaufwendig. Eine breite statistische Analyse derartiger Zelldaten
von Hand ist relativ schwierig, da jede Aufnahme eingegeben und
anschließend
verarbeitet werden muss. Für
verschiedene zu unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnene Aufnahmen
und für
sich ändernde
Bedingungen können
breite statistische Einteilungen möglicherweise unzuverlässig sein.
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Die
Alternative ist eine automatische Zellanalyse, bei welcher der Pathologe
zur Durchführung
der Analyse spezialisierte Geräte
verwendet. Bei der automatischen Zellanalyse, wie sie beispielsweise
mittels eines Durchflusszytometers durchgeführt wird, werden bei einer
Probezellpopulation grobe Massentests durchgeführt, ohne dass der Untersuchende
bestimmte Daten der Population ausschließen oder einschließen kann. Die
Probe wird "wie
sie ist" gemessen,
ohne dass tatsächlich
bekannt ist, welche und wie viele Zellen gemessen werden. Wichtige
Einzelzelldaten oder Daten von relativ kleinen Zellgruppen gehen
bei der Gesamtausmittelung einer Probe verloren. Zudem müssen wegen
des Mittelungsproblems zur Gewährleistung
der Genauigkeit relativ große
Mengen einer Probe verwendet werden. Dies ist im Stand der Technik
als notwendig betrachtet worden, um große Mengen von Zelldaten relativ
schnell so zu verarbeiten, dass die Ergebnisse einigermaßen präzise sind.
Wiederum können
auch hier kleine Änderungen
von Einzelzellen oder kleinen Zellpopulationen nicht genau erkannt
werden.
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Zwar
sind Durchflusszytometer für
generelle Zwecke kommerziell erhältlich;
sie sind jedoch sehr teuer und können
lediglich flüssige
Blutproben oder Gewebeauflösungen
handhaben. Diese Zytometer können
keine Standardgewebeschnitte verarbeiten oder konventionelle Mikroskopschnitte
nutzen, welche die bevorzugten Probeformen in pathologischen Laboratorien
sind. Darüber
hinaus ermöglicht
ein Durchflusszytometer keine Analyse von morphologischen Eigenschaften
von Zellen, wie beispielsweise die Beschaffenheit, die Größe und die
Form von Zellkernen und Abweichungen in Kern/Zytoplasma-Verhältnissen
der Zellen.
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Darüber hinaus
sollte bei einer derartigen Zellanalyse, unabhängig davon, ob sie automatisch
oder manuell ist, eine Verifizierung der Resultate möglich sein,
damit sie zweckdienlich ist. Die normale wissenschaftliche Methode
zur Realisierung der Verifizierung besteht darin, die Probe aufzubewahren,
damit ein anderer Pathologe seine Analyse mit der des ersten Pathologen
vergleichen kann. Für
durch manuelle Mittel klassifizierte Einzelzellen sind dabei jedoch
Photos, Zeichnungen oder andere ungenaue Medien erforderlich, da
es extrem schwierig ist, eine Gewebeprobe für lange Zeit zu fixieren. Selbst
bei Techniken, mit denen derartige Proben für eine nachfolgende Betrachtung
ausreichend fixiert werden, verbleibt jedoch das Problem des Auffindens
der gleichen Zelle oder kleiner Zellpopulationen, an denen die ursprüngliche
Bestimmung durchgeführt
wurde, sowie der Herstellung der gleichen Bedingungen für die Betrachtung.
Mit automatischen Verfahren wird die Probe verbraucht, wobei eine
Verifizierung nur durch Beobachtung gleichartigen Gewebes aus dem gleichen
Bereich möglich
ist.
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Das
Dokument
US-3,908,078 zeigt
eine zur digitalen Erkennung von Objekten vorgesehene Vorrichtung
mit einem optischen Scanner, der mit einem digitalen Computer verbunden
ist. Ein Objektträger
mit normalem Gewebe wird gescannt, digitalisiert und als Referenzmaterial
in dem Computer gespeichert. Das dem Test unterzogene Gewebe wird
gescannt und digitalisiert. Anschließend werden die digitalisierten
Werte verglichen, um festzustellen, ob die Gewebe einander ähnlich sind.
Das System funktioniert wie eine Datenbank für biologische Proben. Das Problem
der Kalibrierung wird nicht angesprochen.
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In
Patent Abstracts of Japan, Vol. 9. Nr. 323 (P-414) (2046), 18. Dezember
1985 und in
JP-A-60
149 947 (YASUKAWA DENKI SEISAKUSHO K.K.) ist eine Dichte-Detektionsvorrichtung
beschrieben, bei der Laserlicht verwendet wird, um die Dichte zweier
Referenz-Reflexionskörper
und gedruckter Bereiche, die untersucht werden sollen, zu messen.
Bei dem ersten Reflexionskörper
handelt es sich um einen Körper
zum Messen eines Absolutwerts, während
der zweite Körper
zum Messen eines Relativwerts dient. Die Kalibrierung der Vorrichtung
wird wie folgt durchgeführt:
das als reflektierter Strahl vorgesehene Signal von dem ersten oder dem
zweiten Reflexionskörper
wird zum Korrigieren der Empfindlichkeit des Strahlempfängers für die Messung der
gedruckten Bereiche verwendet. Somit ist eine komplizierte Vorrichtung
mit einstellbarem Strahlempfänger erforderlich.
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Ferner
werden die Referenz-Reflexionskörper
verwendet, um die Empfindlichkeit der Dichte-Messung zu kalibrieren;
das Kalibrieren des Anfärbens
ist nicht beschrieben.
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Es
ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Zellanalyseverfahren
anzugeben, das eine quantitative Analyse von Probenzellenobjekten
mit hoher Präzision
ermöglicht.
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Das
Zellanalyseverfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung ist durch Anspruch 1 definiert.
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Ferner
betrifft die Erfindung einen mikroskopischen Objektträger nach
Anspruch 5.
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Für eine quantitative
DNA-Analyse erfolgt die Messung der optischen Dichte des Zellobjektes,
wobei die Klassifizierung durch einen Pathologen dahingehend erfolgt,
ob die Zelle als normal oder kanzerös erscheint. Die Entscheidungen
können
beinhalten, ob die spezielle Zelle für eine weitere Verarbeitung
angenommen oder abgewiesen wird. Das ausgewählte Zellobjekt kann ferner
in eine von mehreren Klassifikationen für eine spätere statistische Analyse klassifiziert
werden. Die Vorrichtung weist ferner Einrichtungen auf, mit denen
mehr als ein einziges Bild klassifiziert und gespeichert werden
kann.
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Wird
das Verfahren zur DNA-Analyse verwendet, so werden Gewebe- und Zellproben
auf einen Objektträger
aufgebracht, der sodann mit einem speziellen Anfärbemittel eingefärbt wird,
das sich proportional mit der DNA kombiniert und den Rest der Zelle
im wesentlichen unsichtbar macht, so dass bei der Bildanalyse die optische
Dichte der im Kern der Zelle konzentrierten DNA gemessen werden
kann. Die Farbe ist der DNA zugeordnet, um eine detaillierte Kernstruktur
und ein Raster zu erzeugen, das durch den das Gerät zur Klassifikation
benutzenden Pathologen beobachtet und interpretiert werden kann.
Die DNA-Menge in den malignen Zeilen ist im wesentlichen größer als
die normaler Zellen, weil die malignen Zellen sich gewöhnlich schnell
teilen und kopieren oder abnormale Chromosomenzahlen oder defekte
Chromosomen besitzen.
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Die
bevorzugte und dargestellte Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung
kann nicht nur kleine Änderungen
im Kern durch reale und genaue Messung der DNA-Masse in Picogramm
detektieren, sondern kann auch die DNA-Menge messen und quantifizieren
und sie zwecks Unterstützung
der Diagnose in Beziehung zu gespeicherten statistischen Analysen
setzen. Insbesondere ermöglicht
die Erfindung eine iterative Analyse von Probepopulationszellen
und schafft ein Histogramm oder eine andere statische Anzeige der
Populationsverteilung der Zellen in Bezug auf ihren DNA-Gehalt sowie
in Bezug auf eine Standard-DNA für
normale Zellen, so dass feine Verschiebungen in der Populationsvuerteilung
leicht interpretierbar sind. Zu diesem Zweck werden nicht nur Zellkernbilder
erfasst und gespeichert, sondern es können auch die Daten daraus
mit anderen statistischen Daten integriert werden, um eine mehrdimensionale
Analyse, eine Unterscheidung von Zellen, Histogramme sowie Streuungsdiagramme
von Zellen oder Zellpopulationen zu realisieren.
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Die
Nutzung von Bildanalysetechniken und -anlagen für angefärbte Proben durch Pathologen
in einem konventionellen Pathologielaboratorium ermöglicht die
Lösung
einer Anzahl von Problemen, welche durch die vorliegende Erfindung
beseitigt werden. Beispielsweise existiert zwar eine Anzahl von
verfügbaren
verwendbaren Anfärbetechniken,
wie beispielsweise eine nachfolgend beschriebene Azur A Feulgen-Anfärbetechnik, die
Anfärbung
der DNA ändert
sich jedoch wesentlich nicht nur von Objektträger zu Objektträger und
von Charge zu Charge durch den gleichen Pathologen, sondern auch
wesentlich zwischen verschiedenen Pathologen und verschiedenen Laboratorien.
Da die vorliegende Bildanalysevorrichtung den Graupegel oder die
optische Dichte misst und da es erwünscht ist, eine wahre tatsächliche
Messung von DNA in Picogramm zu leisten, ist es wichtig, das Problem
un terschiedlicher Anfärbefaktoren
für unterschiedliche
Proben zu lösen.
Ferner schaffen auch Bildanalysetechniken mit einstellbaren Mikroskopen
und optischer Beleuchtung unterschiedliche Lichtintensitäten bei
Verwendung durch den Pathologen. Man kann entsprechend ausgebildeten
Wissenschaftlern in wissenschaftlichen Laboratorien Mittel zur Verfügung stellen,
mit denen durch Bildrastertechniken die optische Intensität auf die
gewünschten
Bedingungen für
eine Bildanalyse eingestellt werden kann; dies kann jedoch nicht
mit der für
das gebräuchliche
pathologische Labor notwendigen Genauigkeit realisiert werden. Daher
muss das Problem dieser variablen Lichtintensität und damit variablen optischen
Dichte überwunden
werden.
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Ferner
ist die vorliegende Erfindung auf die Überwindung des Problems des
hohen Kostenaufwandes gerichtet, der bisher mit für die Bildanalyse
verwendeten automatisierten Anlagen anfiel; zu diesem Zweck schafft
die vorliegende Erfindung ein einfach bedienbares interaktives System,
in dem der Pathologe eine Anzahl von Aufgaben löst und die Präparierung
von Zellen und ihre Auswahl durch Bedienung der Anlage durchführt. Dem
Pathologen stehen ferner Objektträger zur Verfügung, welche
zur Unterstützung
der Analyse der Probezellen in Bezug zu Referenzzellen speziell
präpariert
und kalibriert sind und die Überwindung
des oben beschriebenen Anfärbeproblems
unterstützen.
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Die
vorliegende Erfindung ist speziell zum Lokalisieren der Zellen für eine Untersuchung
hinsichtlich ihrer Morphologie und zur Beibehaltung ihrer Lage für eine bedarfsweise
spätere
oder erhärtende
Analyse durch einen zweiten Pathologen entwickelt worden. Wie hinsichtlich
von Kernen noch ausgeführt
wird, können Messungen
hinsichtlich von deren Größe in Mikrometer,
der optischen Gesamtdichte von Kernen oder der Kernmasse in Picogramm,
der mittleren optischen Dichte von Kernen, der Kerntextur und der
Abweichung der Kernform von runden Kernen durchgeführt werden.
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Die
Erfindung wird deutlicher ersichtlich bei Lektüre der folgenden detaillierten
Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
eine bildliche Darstellung eines gemäß der Erfindung aufgebauten
Bildanalysesystems;
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2 zeigt
ein funktionales Blockschaltbild des Bildanalysesystems nach 1,
das zur Durchführung
eines Bildanalyseverfahrens gemäß der Erfindung
dient;
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2A zeigt
ein funktionales Systemdiagramm, aus dem die Hauptfunktionen der
in 2 dargestellten Systemsteuerung ersichtlich sind;
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3 zeigt
ein elektrisches Blockschaltbild einer Schnittstellenelektronik
für die
X-,Y-Positionsschaltungsanordnung nach 2;
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4 zeigt
repräsentative
Zeitsteuerungs-Wellenformen für
die Eingabe in die Schnittstellenelektronik nach 2;
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5A, 5B und 5C zeigen
eine perspektivische Ansicht, eine Draufsicht bzw. eine Schnittansicht
eines Objektträgers,
der speziell an die Verwendung im Bildanalysesystem nach 1 angepasst
ist und getrennte Bereiche für
Kalibrierungszellenobjekte und Probezellenobjekte aufweist;
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6 bis 9 zeigen
bildliche Darstellungen von Histogrammen für verschiedene normale und
abnormale Zellpopulationen;
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10 zeigt
eine bildliche Darstellung der unterschiedlichen Schirmbilder, die
auf einen Instruktionsmonitor gemäß 1 sichtbar
sind;
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11 zeigt
eine bildliche Darstellung des Hauptschirmbildes, das auf dem Instruktionsmonitor
nach 1 erscheint;
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12 zeigt
eine bildliche Darstellung des Kalibrierungsschirmbildes, das auf
dem Instruktionsmonitor nach 1 erscheint;
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13 zeigt
eine bildliche Darstellung des Analyseschirmbildes, das auf dem
Instruktionsmonitor nach 1 erscheint;
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14 zeigt
eine bildliche Darstellung des X-,Y-Feld-Koordinaten-Schirmbilds,
das auf dem Instruktionsmonitor nach 1 erscheint;
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15 zeigt
eine bildliche Darstellung der Optionsliste für den Hauptschirm nach 11;
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16 zeigt
eine bildliche Darstellung der Optionsliste für den Kalibrierungsschirm nach 12;
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17 zeigt
eine bildliche Darstellung der Optionsliste für den Analyseschirm nach 13;
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18 zeigt
eine bildliche Darstellung der Messvorgänge für den Kalibrierungsschirm nach 12;
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19 zeigt
eine bildliche Darstellung der Analysevorgänge für den Analyseschirm nach 13;
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20 zeigt
eine bildliche Darstellung des Analysevorgangs in zeitlicher Folge
für ein
Feld von Zellenobjekten auf der Bildanzeige nach 1;
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21 zeigt
ein Bilddiagramm eines zur Bildanalyse verwendeten Objektträgers, der
durch das Bildanalysesystem nach 2 in mehrere
auswählbare
Bildfelder unterteilt ist;
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22 zeigt
ein bildliches Diagramm eines zur Lichtquellenkalibrierung im Bildanalysesystem
nach 1 verwendeten Histogramms;
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23 zeigt
ein Flussdiagramm des Programms, das die X-,Y-Koordinatenposition
der Plattform des Mikroskops nach 1 ausliest;
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24 zeigt
ein Software-Flussdiagramm des Programms, das zur Verarbeitung der
Analyse- und Messvorgänge
für den
Analyse- bzw. Mess-Schirm nach 12 bzw. 13 dient;
und
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24A, 24B und 24C zeigen ein Feldmuster mehrerer Zellobjekttabellen,
ein Zellobjektmuster bzw. eine Zellobjekttabelle, wie sie durch
das Programm ausgenutzt werden.
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Die
Vorrichtung gemäß 1 und 2 kann
zur Entwicklung von Histogrammen und anderer statistischer Daten
von Zellpopulationen für
die Diagnose und Prognose von Krebserkrankungen und anderen Erkrankungen
verwendet werden. Die Brauchbarkeit einer derartigen statistischen
Analyse wird anhand der 6 bis 9 erläutert.
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Die
nun zu beschreibende 6 zeigt ein normales auswertendes
Histogramm der Zellenanzahl als Funktion der Massenverteilung für gesunde,
sich nicht teilende Zellen. Die Anzahl von Zellen ist auf der Ordinate
und deren Kernmasse auf der Abszisse aufgetragen. Wenn sich die
in dieser Figur dargestellte Zellpopulation nicht teilt, so sollte
der DNA-Gehalt eine Spitze um eine Normalspitze G0/G1 bilden, bei
der es sich um die diploide Menge von 7,18 Picogramm/Zelle handelt.
Diese relative Masse der DNA ist mit 1,0 bezeichnet, um die Abszisse
des Histogramms zu normieren. 7 zeigt
ebenfalls eine normale sich teilende Zellpopulation, bei der eine
signifikante G0/G1-Spitze bei 1,0 und eine zweite Spitze G2 bei
2,0 liegt. Die Spitze bei 2,0 ist normal, weil einige der Zellen
sich teilen und die doppelte diploide Menge an DNA besitzen. Der
Sattel S zwischen den beiden Spitzen ist relativ klein und zeigt
keine Krebserkrankung an.
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Aus
dem Vergleich des Histogramms gemäß 8 mit den
ersten beiden Histogrammen ist ersichtlich, dass diese Zellpopulation
vom Normalen abweicht, und eine höhere erste Spitze um 1,5 und
eine zweite Spitze um 3,0 besitzt. Ferner ist der Sattel 5 ausgeprägter und
kann in der Zellzählung
grob sein. Dieses Histogramm kann wegen des abnormal hohen DNA-Gehaltes
vieler der Zeilen eine Krebserkrankung anzeigen. Dieser hohe DNA-Gehalt
ist eine wahrscheinliche Anzeige der erhöhten Chromosomensatzmenge von
kanzerösen
Zellen, welche sich schnell teilen. Entsprechend zeigt 9,
dass die G0/G1-Spitze bei 1,0 mit einer normalen diploiden Menge
an DNA auftritt, aber einen relativ großen hinteren Sattel von 1,0
bis 2,8 besitzt. Eine normale zweite G2-Spitze wird nicht beobachtet,
was auf eine abnormale Zellpopulation hinweist. Die Form des Histogramms
ergibt sich wahr scheinlich aufgrund von abnormalen DNA-Mengen in
Zellen und Zellhaufen, welche eine Krebserkrankung anzeigen. Daher
können
aus den Formen und den Änderungen
von Zellverteilungshistogrammen diagnostische und prognostische
Informationen gewonnen werden.
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In
der dargestellten Implementierung ist das System ein computerisiertes
Bildanalysesystem, das zur Messung einer Anzahl von Zellobjekteigenschaften
und -parametern aus deren Bild auf einem typischen Glasobjektträger ausgelegt
ist. Das Instrument enthält
ein hochentwickeltes, durch Software gesteuertes digitales Bildverarbeitungssystem
zur Durchführung
einer quantitativen Analyse einzelner Zellen hinsichtlich des Kern-DNA-Gehaltes
durch Feulgen-Anfärbung
sowie zur Messung weiterer Kerneigenschaften. Das Abbildungssystem
erlaubt eine Kombination der Fähigkeit
eines Pathologen zur Identifizierung von zu studierenden Zellen
mit den Möglichkeiten
einer computergestützten
digitalen Video-Bildverarbeitung hoher Auflösung zwecks genauer Quantifizierung
der optischen Dichte und Anfärbedichte.
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Generell
präpariert
ein Pathologe zunächst
ein entnommenes Präparat
bzw. eine Punktierung frischen Gewebes. Andererseits können auch
eingebettete Proben hinsichtlich interessierender Bereiche visuell
untersucht werden und anschließend
durch Zerkleinern in Gegenwart von Pepsin entparaffiniert und getrennt
werden, um eine einzige Zellsuspension zu erzeugen, welche dann
auf einen Mikroskopobjektträger
aufgebracht wird. Nach Fixieren und Anfärben mit Azur-A-Feulgen-Anfärbemittel
ist das Präparat
für die
Analyse bereit.
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Die
Bedienungsperson hat dann die Wahl einer morphologischen Klassifizierung
der Zellen in eine von sechs Kategorien oder des Verwerfens ungeeigneter
Zellen oder Zellausschusses. Die Zelldaten werden durch eine Systemsteuerung
verarbeitet, und ihre zellularen Elemente werden durch eine quantitative
DNA-Analyse für
jede Zellklasse charakterisiert. Bei Vergleich der Information entweder
mit einer Standardzelleichung oder mit veröffentlichten Daten ist es einem
Pathologen möglich,
Abnormalitäten,
wel che gewöhnlich
lediglich verbal aus dem Bild einer angeschauten Person beschrieben
werden können,
genau zu quantifizieren und zu klassifizieren.
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Das
Hinzufügen
von quantitativen Daten ermöglicht
es den Pathologen, ihre Arbeit standardisierter und reproduzierbarer
durchzuführen.
Das System ist bei der Klassifizierung von möglicherweise malignen Veränderungen
und bei der Gewinnung von prognostischer Information für bekannte
Krebserkrankungen auf der Basis des DNA-Gehaltes zweckmäßig. Das
Bildidentifizierungssystem ist vorteilhafter als gebräuchliche Durchflusszytometrieverfahren
zur Ermittlung des DNA-Gehaltes. Eine Durchflusszytometrie ermöglicht es
einer Bedienungsperson, neoplastische Zellen lediglich auf der Basis
von Zellmarkierungen zu klassifizieren. Der Pathologe sieht jedoch
niemals die Zellen, welche das Instrument untersucht hat. Ferner
muss die Zellpräparierung
in einem kurzen Zeitrahmen verwendet werden und wird im Laufe der
Untersuchung verbraucht. Obwohl ein bleibender Schnitt eines untersuchten
Tumors gleichzeitig untersucht werden kann, besteht keine Garantie,
dass die gleichen Zellen in beiden Bereichen untersucht werden.
Auch kann die verfügbare
Tumormenge möglicherweise
nicht groß genug
sein, um eine Durchflusszytometrie-Untersuchung zu erlauben.
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Gemäß der Erfindung
wird die quantitative DNA-Analyse zur Messung der DNA und des Chromosomensatzverteilungsmusters
in einer studierten Zellpopulation schnell durchgeführt. Der
Pathologe wählt
vorteilhafterweise die Zellen aus, welche bei den Populationsmessungen
verwendet werden sollen. Die Messung des DNA-Gehaltes ist nützlich und
bei der Diagnose und der bestimmenden Prognose für eine Vielzahl von Tumoren
in Brust, Darm und Prostata als relevant anzusehen. Das System macht
sich die Erfahrung des Pathologen zur visuellen Identifizierung
abnormaler Zellen zunutze und verwendet dann eine computergestützte Bildanalyse
zur quantitativen Analyse dieser Einzelzellen für die gewünschten Parameter. Ein derartiges
Instrument erweitert und unterstützt
die Erkennung und die diagnostische Erfahrung des Pathologen.
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Wie
in den Zeichnungen zur Veranschaulichung deutlicher gezeigt ist,
ist die Erfindung in einem Verfahren und in einer Vorrichtung zur
automatischen Analyse von "Zellobjekten" realisiert, wobei
dieser Begriff hier generell für
Zellen, wie beispielsweise Blutzellen oder aus Tumoren entnommene
Zellen oder ähnliches verwendet
wird, welche hinsichtlich des DNA-Gehaltes analysiert werden sollen.
Der Begriff umfasst auch nicht-biologische Objekte, wie beispielsweise
bei biologischen Studien verwendete konventionelle Kunststoff- oder
Glaskugeln, gefärbte
Zellbilder auf einem Objektträger
oder Antigene oder monoklonale Antikörper auf Zellen. Das System
findet ferner dort Verwendung, wo ein monoklonaler Antikörper mit
einem Anfärbemittel gepaart
ist, wobei das Anfärbemittel
ein fluoreszentes Material sein kann, das bei einer Wellenlänge angeregt wird
und dann bei einer anderen Wellenlänge analysiert werden kann,
wo Fluoreszenz auftritt. Beispielsweise ist die vorliegende Erfindung
zur Chromosomensatzanalyse, Analyse von Zellen roter Blutkörperchen, Schleimschmier-Zellanalyse,
Monoklonalantikörperanalyse
und zur Analyse anderer Infektionskrankheiten geeignet, welche durch
DNA-Proben hinsichtlich Viren diagnostiziert werden können. Das
Abbildungs- und Analysesystem wird daher vorteilhafterweise bei
einer Anzahl von Untersuchungen verwendet, bei denen eine der optischen
Charakteristiken, wie beispielsweise die optische Dichte, eines
Zellobjektes ausgenutzt werden kann, um einen bestimmten Parameter
oder eine bestimmte Eigenschaft desjenigen Objektes zu bestimmen, das
sich für
einen bestimmten Zustand zur Diagnose oder Prognose eignet.
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Gemäß 1 und 2 der
Zeichnung ist die Erfindung als Vorrichtung 11 ausgebildet,
die funktionell als digitales Bildverarbeitungssystem 13 arbeitet
(2). Die Vorrichtung 11 umfasst ein hochauflösendes Mikroskop 15,
mit dem eine Bedienungsperson Proben auf einem Träger, in
der bevorzugten Ausführungsform ein
Glasobjektträger 14,
beobachten kann. Das Mikroskop 15 besitzt eine Einrichtung 70 zur
Fokussierung seiner Optik auf den Objektträger und eine durch Einrichtungen 110 und 17 zur
Betrachtung verschiedener Bereiche in X- und Y-Richtung schrittweise
bewegbare Plattform 51. Die Proben bzw. das Material auf
dem Objektträger 14 können ferner durch
das Abbildungssystem 13 betrachtet werden, das durch eine
Systemsteuerung 22 in Form eines digitalen Prozessors,
beispielsweise eines Personal Computers, gesteuert wird. Eine Bedienungsperson
kann mit der Systemsteuerung 22 über eine Tastatur 36 kommunizieren
und interagiert mit der Vorrichtung 11 durch Betrachtung
zweier Anzeigen. Eine erste Anzeige in Form einer Bildanzeige 37 ist ein
RGB-Monitor, welcher über
die Systemsteuerung 22 das gleiche Bild anzeigt, wie es
durch das Mikroskop 15 gesehen wird. Eine zweite Anzeige
in Form eines Befehlmonitors 62 ist ein weiterer RGB-Monitor,
welcher der Bedienungsperson interaktive Eingabeaufforderungen,
Mitteilungen, Information und Befehle aus dem Programm liefert,
welches die Systemsteuerung 22 steuert. Ein Drucker 38 dient
zur Erzeugung eines zuverlässigen
Hard-Copy-Ausdrucks der durch die Vorrichtung 11 erzeugten
Daten.
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Das
Funktionsschema der Vorrichtung 11 ist in 2 als
Bildverarbeitungssystem 13 dargestellt. Das Bildverarbeitungssystem 13 dient
zur Analyse einer Vielzahl von Zellobjekten auf dem Träger bzw.
dem Glasobjektträger 14 des
Mikroskops 15. Eine geeignete Mikroskopoptik 16 hoher
Auflösung
nimmt Licht von einer variablen Intensitätsquelle 17a durch
den Objektträger 14 auf.
Die Optik 16 erzeugt ein optisches Bild jedes der Zellobjekte
auf dem Objektträger 14 und überträgt diese
auf einen Bildteiler 25, welcher in Form eines Prismas
vorgesehen sein kann.
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Auf
einer Seite des Teilers 25 überführt eine Fernsehkamera 18 oder
ein anderer Detektor die optischen Bilder punktweise in ein abgetastetes
elektronisches Signal, das die optische Intensität jedes Punktes im Bild repräsentiert.
Die Ausgangsgröße der Kamera 18,
welche ein Standard-NTSC-Analogvideosignal
ist, wird in einen Analog-Digital-Umsetzer einer Bildverarbeitungsschnittstelle 21 eingespeist.
Die Bildverarbeitungsschnittstelle 21 setzt das Bildsignal
von der Fernsehkamera 18 in ein digitalisiertes Signal
um, das von der Systemsteuerung 22 empfangen und gespeichert
wird. Wegen der kontinuierlichen Abtastung wird durch die Bildanzeige 37 ein
Echtzeitbild des Bereiches geliefert, auf den die Optik 16 fokussiert
ist. Ge nerell ist das Bild ein Raster mit 512 × 512 Bildpunkten, die jeweils
eine gemessene Lichtintensität
besitzen.
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Auf
der anderen Seite des Bildteilers 25 ist die Betrachtungsoptik 23 des
Mikroskops 15 angeordnet. Diese parafokale Anordnung ermöglicht die
Anzeige des Bildes in der Betrachtungsoptik 23 als gleiches
Bild auf der Bildanzeige 37. Dieses Merkmal ermöglicht die
Einstellung der Plattform 51 durch die manuelle X-,Y-Einstelleinrichtung 110 und 17,
bis die Bedienungsperson ein interessierendes Feld auf dem Objektträger 14 sieht.
Dabei wird ein durch Computer unterstütztes digitalisiertes Bild
des ausgewählten
Feldes auf der Bildanzeige 37 zur weiteren Analyse angezeigt.
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Die
beiden Anzeigevorrichtungen 37 und 62 werden durch
die Systemsteuerung 22 über
eine Standard-Videoschnittstellenschaltung 39 bzw. 610 gesteuert.
Entsprechend kommunizieren die Tastatur 36 und der Drucker 38 mit
der Systemsteuerung 22 über
eine konventionelle Schnittstellenschaltung 35 bzw. 41.
Ferner steuert die Systemsteuerung 22 einen Speicher 73 mit
wahlfreiem Zugriff sowie einen Großspeicher in Form von Disketten-
und Festplattenantrieben 75 über eine Speichersteuerung 71.
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Sämtliche
Schnittstellenschaltungen 21, 35, 39, 41, 610, 71 und 106 können selektiv
in gedruckten Schaltungen realisiert werden, welche auf der Hinterseite
oder einem Kartenstecker eines die Systemsteuerung 22 bildenden
konventionellen Personal Computers montiert sind. Vorzugsweise ist
der Personal Computer ein Modell, wie es durch die IBM Corporation
unter der Modellbezeichnung AT hergestellt wird. Eine derartige
Systemsteuerung kann mit einem Plattenbetriebssystem, beispielsweise
die PC-DOS-Version 3.1 oder eine spätere Version betrieben werden.
Die Systemsoftware für
die Bildanalyse wird als Anwenderprogramm vom Plattenantrieb 75 abgerufen
und kann beispielsweise auf einer Diskette 77 geliefert
werden. Die Systemsoftware wird aus der Platte 77 gelesen
und in das RAM 73 geladen. Nach dem Laden wird die Programmsteuerung
auf die Analysesoftware überführt, um
die verschiedenen obengenannten Hardwareelemente in bekannter Weise
zu steuern.
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Die
Analysesoftware kann für
eine nachfolgend zu beschreibende DNA-Analyse geeignet sein oder eine
andere Software für
verschiedene Zwecke enthalten. Beispielsweise kann die Analyse der
Form und der Größe sowie
des Hämoglobingehaltes
der Zellen bei Untersuchung von Zellen roter Blutkörperchen
gemäß der Rastererkennungstechnik
und des Analyseverfahrens nach den U.S. Patenten Nr.
4,097,845 und
4,199,748 durchgeführt werden, die Bacus erteilt
wurden, die hiermit durch Verweis derart einbezogen werden, als
ob sie hier vollständig
wiedergegeben worden wären.
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2A zeigt
die funktionelle Wirkungsweise der Systemsoftware, wobei zur Durchführung der
Hauptsystemfunktionen eine Steuerlogik für die Instrumentenhardware,
die Bildanzeige und die Befehlsanzeige verwendet wird. Die Hauptsystemfunktionen
sind Patientenbezeichnung, Lichtpegelkalibrierung, Kontrollzellenkalibrierung,
Zellendatenerfassung, Zellenklassifikation, Zellenanalyse und Berichterzeugung.
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Die
Schnittstellenschaltung kann mit Ausnahme der Schnittstellenelektronik 106 durch
Standardsteuerschaltungen für
die verschiedenen dargestellten Funktionen gebildet werden. Die
Schnittstellenelektronik 106 ist eine spezielle Schaltung,
die genauer in den 3 und 4 dargestellt
ist. Die X-,Y-Positionssensoren
ermöglichen
die Einstellung des analysierten Feldes.
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Hier
werden die X- und Y-Position jedes Feldes in einfacher Weise für jede gegebene
Position durch ein neues Verfahren und eine neue Vorrichtung festgelegt,
welche, wie 2 am besten zeigt, einen X-Richtungssensorstreifen 100 enthält, der
an der Unterseite der Mikroskop-Plattform 51 befestigt
werden kann und mit dieser Plattform an einem Sensorkissen 102 vorbei
bewegbar ist, das am stationären
Teil des Mikroskops befestigt ist. Der Sensor gibt ein analoges
Ausgangssignal für
die Schnittstellenelektronik 106 aus, welche die X-Koordinate
in Digitalzahlen für
die Systemsteuerung 22 zur Speicherung im Speicher und
zur Anzeige auf dem Monitorschirm 62 liefert. Ferner ist
ein entsprechender Streifen 114 an der Plattform 51 befestigt
und mit dieser in Y-Richtung an einem Sensorkissen 112 vorbei
bewegbar, das an einem stationären
Teil des Mikroskops befestigt ist, so dass das Kissen ein Analogsignal
für die
Schnittstellenelektronik 106 ausgeben kann, welche Digitalsignale
für die
Systemsteuerung 22 zur Speicherung der Y-Koordinate und
zur Anzeige der Y-Koordinate auf dem Videomonitor benachbart zur
X-Koordinate liefert. In der Tat kann das System auch umgekehrt ausgebildet
sein, wobei die Sensorköpfe
an der Plattform zur Bewegung mit dieser befestigt sind und die
Sensorstreifen 100 und 110 stationär montiert
sind, um Analogsignale zu liefern, wenn sich die Köpfe über sie
bewegen.
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Die
Schnittstellenschaltung für
die Positionssensoren ist in 3 und 4 detaillierter
dargestellt. Die Positionssensoren sind magnetische Sensoren mit
dem Paar von Sensorstreifen 100 für die X-Koordinate und dem
Paar von Sensorstreifen 114 für die Y-Koordinate. Die Sensorstreifen 100 und 114 sind
senkrecht zueinander derart befestigt, dass diese Streifen Referenzachsen
für das
Koordinatensystem bilden. Die beweglichen Sensorkissen 102 und 112,
welche an der beweglichen Basis des Mikroskops 15 befestigt
sind, bewegen sich längs
der Streifen 100 und 114, wobei die Relativbewegung
zwischen den Elementen in Abhängigkeit von
der Relativposition des beweglichen Kissens in bezug auf den festen
Streifen erfasst wird. Die Sensoren sind mit einem Mess-Schaltkreis 180 verbunden,
der eine Schaltung zur Messung der Relativposition zwischen den
Streifen sowie zur Erzeugung von Digitalzahlen auf der Basis des
erfassten Parameters enthält.
Die X-Sensorstreifen 100 sind mit Sensor-XA- und Sensor-XB-Eingängen der
Mess-Schaltung 180 verbunden, während die Y-Sensorstreifen 114 entsprechend
mit den Sensor-YA- und Sensor-YB-Eingängen der Schaltung verbunden
sind. Die Schaltung 180 ist ein intern getakteter Positions-/Digitalzahlgenerator,
der in Abhängigkeit von
der Relativposition des beweglichen Kissens in Bezug auf den festen
Streifen eine serielle Digitalzahl mit 3 Byte an Ausgängen OXA
und OYA liefert. Diese Zahl mit 3 Byte ist se riell und für Zeitsteuerzwecke
von einem Taktsignal XCLK oder YCLK begleitet.
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Sämtliche
der Burst-Signale mit 24 Bit haben jeweils eine Frequenz von etwa
24 kHz und treten alle 100 ms auf. Die Mess-Schaltung 118 erzeugt
daher alle 110 ms eine Zahl mit 3 Byte für die X-Position und eine Zahl
mit 3 Byte für
die Y-Position. Die Ausgänge
OXA und OXB sind mit dem seriellen Eingang IN bzw. dem Takteingang
CLK eines Schieberegisters 20 verbunden. Entsprechend ist
der Ausgang OYA und OYB der Schaltung 180 mit dem seriellen
Eingang IN und dem Takteingang CLK des Schieberegisters 220 verbunden. Das
Signal XCLK taktet alle 100 ms die 24 Bit der Positionszahl in das
Schieberegister 20. Diese Zahl wird dann im Schieberegister 20 gespeichert,
bis sie durch das Hauptsteuerprogramm verwendet wird. Die Y Position
mit 24 Bit wird seriell in den Eingang des Schieberegisters 220 eingegeben
und alle 100 ms durch das Signal YCLK in diese Anordnung getaktet.
Die Schieberegister 20 und 220 erhalten diese
Positionszahlen zwischen Kommunikationsimpulssignalen von der Mess-Schaltung 180.
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Die
Schieberegister 20 und 220 sind mit der Systemsteuerung 22 durch
die Adressleitungen A0–A15 ihres
Adressbusses und durch die Datenleitungen D0–D7 des Datenbusses verbunden.
Der Datenbus mit 8 Bit ist parallel mit den Byte-Ausgängen A,
B und C des Schieberegisters 20 und den Byte-Ausgängen A,
B und C des Schieberegisters 220 verbunden. Die Ausgänge repräsentieren
jeweils eines der Bytes eines Positonswortes mit 24 Bit für die X-
oder Y-Position. Die Ausgänge
werden durch die mit den Ausgängen
Q0–Q2
eines Decoders 24 verbundenen Eingangsleitungen A, B und
C aktiviert. Die Adressbusleitungen A0–A15 sind mit den Eingangsleitungen
des Decoders 24 verbunden.
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Der
Decoder 24 überträgt für jedes
Byte der Positionswörter
eine diesem speziell zugeordnete Adresse und aktiviert dieses Byte
vom entsprechenden Schieberegister, so dass es auf dem Datenbus 28 eingelesen werden
kann. Um beispielsweise die X-Position zu lesen, liefert die Systemsteuerung 22 die
Adresse, welche von dem Decoder 24 genutzt wird, um den
A-Ausgang des Schieberegisters 20 freizugeben, wonach dieses Byte über den
Datenbus 28 eingelesen wird. Danach liefert die Systemsteuerung 22 die
Adresse, welche den B-Ausgang des Schieberegisters 20 freigibt,
wonach dieses Byte vom Datenbus 28 gelesen wird. Danach
liefert die Systemsteuerung 22 die Adresse zur Freigabe
des C-Ausgangs des Schieberegisters 20 sowie zum Lesen
dieses Bytes. Die Wirkungsweise ist für das Lesen des Y-Positionswortes
aus dem Schieberegister 220 identisch.
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Das
Lesen und Laden der Schieberegister 20 und 220 ist
vollständig
asynchron. Da die Positionen der X- und Y-Koordinate alle 100 ms
aktualisiert werden, kann ein relativ einfaches Transferschema dieser
Art realisiert werden. Falls die Schieberegister 20 und 220 in
einen Schiebevorgang durchführen,
wenn die Positionswörter
durch den Computer gelesen werden, so nimmt die Software geeignete
Vergleiche vor, um festzustellen, ob die gelesene Eingangszahl eine
richtige Zahl ist oder das Schieberegister beim Lesen eine andere
Zahl eingegeben hat.
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Ein
Flussdiagramm des Unterprogramms, das die Schieberegister 20 und 220 liest,
ist in 23 detaillierter dargestellt.
Das Unterprogramm kann periodisch zur Festlegung der tatsächlichen
X-,Y-Position auf der Plattform 51 aufgerufen werden. Das
Programm beginnt durch zweimaliges Lesen und Speichern der X-Position
in Blöcken
A225–A231.
Es erfolgt ein Vergleich, ob die beiden gleich sind (A=B); ist dies
nicht der Fall, so folgt eine Rückführung auf
den Start. Ein drittes Lesen und Speichern in Blöcken A235 und A237 geht einem
Vergleich von A und C im Block A239 voran. Ein negativer Zweig beginnt
den Prozess noch einmal, während
ein positiver Zweig das Lesen der Y-Position in der gleichen Weise
startet. Die Technik erfordert drei Auslesungen zur Anpassung, bevor
die Zahl als die richtige Position angenommen wird, wobei die Möglichkeit
ausgeschlossen wird, dass der Tisch bewegt wurde oder die Schieberegister
Zwischenauslesungen geschoben haben.
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Da
die Vorrichtung 11 in verschiedenen Praxen, wie z.B. pathologischen
Praxen mit Personen unterschiedlicher Ausbildung und Kenntnis über Bildanalyse
verwendet werden kann, kann die Mikroskoplichtquelle 17a durch
unterschiedliche Personen unterschiedlich eingestellt werden, so
dass der Hintergrund nicht nur von Gerät zu Gerät, sondern auch zu unterschiedlichen
Zeiten in Abhängigkeit
vom Alter und der Natur der beleuchtenden Lampe eine unterschiedliche
Lichtintensität
besitzen kann. Sind die Zellobjekte DNA-Kerne, so können die
eingefärbten
Kerne dunkler erscheinen und besitzen stärker dunkle Graupegel als Zellen,
welche einen geringeren oder keinen DNA-Gehalt besitzen. Der spezielle
Lichtintensitätspegel
sollte in genauer und realer Weise bekannt sein; es ist daher wichtig,
dass eine Kalibrierung der Lichtintensität erfolgt, um Fehler zu eliminieren,
welche auftreten können,
falls Unterschiede in den Lichtintensitätspegeln nicht berücksichtigt
werden.
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Ein
weiteres Problem bei der breiten Verwendung einer Anlage der vorgenannten
Art ist der Anfärbungsfaktor,
womit gemeint ist, dass der Benutzer entweder eine große Menge
oder eine geringe Menge des Azur-A-Anfärbemittels aufbringen kann.
Dies führt
zu einer Änderung
des durch das Mikroskop 15 oder durch die Kamera 18 beobachten
Graupegels, welcher dann als der spezielle DNA-Gehalt analysiert
wird. Die Vorrichtung 11 muss daher kalibriert werden,
um durch den Anfärbungsfaktor
bedingte Unterschiede zu eliminieren, so dass eine realistische
Anzeige der tatsächlichen
Menge an Hämoglobin,
DNA oder Antigenen oder monoklonalen Antikörpern auf Zellen, usw. bei
der Analyse gewährleistet
ist.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird auf den Objektträger 14 ein
Kalibriermaterial 40 (5A) aufgebracht,
das es der beobachtenden Bedienungsperson im Kalibrierungsschritt
der Systemsoftware ermöglicht,
die Vorrichtung vor der Messung und Analyse von Probezellobjekten 12 auf
dem Objektträger 14 einzustellen
und zu kalibrieren.
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In
der dargestellten Ausführungsform
der Erfindung sind zwei unterschiedliche Kalibriermaterialien auf dem
Objektträger 14 vorgesehen,
wobei es sich bei dem ersten Kalibriermaterial um die Kontrollzellenobjekte 40 handelt,
welche gleichzeitig mit dem Anfärben
der Probezellenobjekte 12 eingefärbt werden. Das gleichzeitige
Anfärben
ermöglicht
die Analyse der Kontrollzellenobjekte zum Vergleich mit einer vorgegebenen
gespeicherten Referenzlichtenergie, einem Graupegel, oder der optischen
Dichte, welche die Kontrollzellenobjekte 40 nach dem Anfärben besitzen.
Sind die Zellobjekte entweder zu schwach oder zu stark angefärbt, so
kann der Betrag der Unterfärbung
oder Überfärbung quantitativ
analysiert und eingestellt werden, wie dies nachfolgend beschrieben
wird.
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Bei
der Erfindung enthält
das Kalibriermaterial ferner ein Referenzmaterial 45 für optische
Dichte, bei dem es sich gewöhnlich
um eine gedruckte Markierung auf dem Objektträger handelt, welcher eine vorgegebene
bekannte optische Dichte besitzt und als Bezug zur Kalibrierung
des Instrumentes verwendbar ist. Wie nachfolgend noch genauer beschrieben
wird, erhält
die Bedienungsperson von der Systemsoftware Befehle. Gemäß diesen
Befehlen stellt die Bedienungsperson manuell die Hintergrundlichtintensität der Quelle 17a ein, bis
die gewünschte
Intensität
für das
Referenzmaterial 45 erreicht ist. Wie nachfolgend erläutert wird,
wird durch diesen Schritt die Systemsteuerung 22 mit einer
Kalibrierung zur Auslesung der richtigen optischen Dichte der Objekte
auf dem Objektträger 14 versehen.
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Zur
Gewährleistung
der Integrität
des Systems kann es erwünscht
sein, eine Vollständigkeitsprüfung bzw.
einen Identifikationsschritt für
den Objektträger 14 durch
Analyse eines vorgegebenen und vorfestgelegten optischen Rasters
auf dem Objektträger
durchzuführen,
wobei die Graupegel und die physikalischen Abmessungen ausgelesen
und gemessen werden, bevor die Analyse begonnen werden kann. Dabei
kann das optische Vollständigkeitsraster
in der Form von Initialen CAS vorliegen, welche gemäß den 5A bis 5C oberhalb
der Kontrollzellenobjekte angeordnet sind. Wie ersichtlich kann
das Vollständigkeitsprüfmerkmal
das Kreuz 52 oder ein anderes geformtes Material auf dem
Objektträger 14 sein.
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Das
Lichtkalibrierungsmaterial 45 in Form eines Kreuzes 52 gemäß 5B kann
eine große
Anzahl unterschiedlicher Gestalten und Formen annehmen und kann
tatsächlich
lediglich die Grenze 54 für die Kontrollzellenobjekte,
ein Logo CAS oder eine andere Identifizierungsmarkierung sein, die
auf den Objektträger aufgebracht
ist, um eine vorgegebene optische Dichte zu gewährleisten, wenn die Lichtquelle
für das
Mikroskop 15 auf die gewünschte Intensität eingestellt
wird.
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Die
vorliegende Erfindung ist ferner für eine spätere Analyse der Probezellen 12 auf
dem Objektträger 14 und
zur Unterstützung
des Abrufs von im Speicher gespeicherten Zellenbildern oder für eine Rückkehr auf eine
gegebene Zelle für
eine zweite Betrachtung durch die Bedienungsperson oder eine andere
Person zu einem späteren
Zeitpunkt verwendbar. Zu diesem Zweck wird nach der Befestigung
des Objektträgers 12 auf dem
Mikroskopstativ 51 (1) in einer
bestimmten Position eine bestimmte Lage bzw. ein bestimmter Punkt auf
dem Objektträger,
beispielsweise die Mitte des Kreuzes 52 als Null/Null-X-Y-Referenzpunkt
definiert. Dieser Referenzpunkt dient zur Aufstellung einer Translationstabelle
für die
Positionsauslesungen durch die X-,Y-Sensoren. Ein Paar von Lageregistern
der Systemsteuerung 22 für den X- und den Y-Abstand
werden in diesem Punkt auf Null eingestellt, so dass anschließend sämtliche
Zellenlagen eine spezielle X- und Y-Koordinatenadresse vom Referenzpunkt
besitzen. Ein weiterer einfacher Punkt, mit dem die Lageeinstellungsmittel des
Mikroskopstativs 51 auffindbar sind, ist eine Ecke, wie
beispielsweise die rechte untere Ecke 53 der Kastengrenze 54,
innerhalb der die Referenzzellenobjekte 40 angeordnet sind,
Die Kastengrenze 54 ist auf dem Objektträger aufgedruckt
und kann an Stelle des speziellen Kreuzes 52 zur Kalibrierung
der optischen Dichte verwendet werden. Durch eine geeignete Logik
kann jeder Punkt auf dem Objektträger und dem Mikroskopstativ,
in dem die Klassifizierungsoperation beginnt, als Null-X- und Y-Lage in
den Lageregistern verwendet werden. Die X- und Y-Ko ordinaten werden
in dieser Lage anfänglich
auf Null eingestellt, wobei aus dieser Null-Lage für jede Bildfeldlage
eine Auslesung durchgeführt
wird.
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Der
Probeobjektträger 14 kann
jede Größe oder
Form besitzen; da jedoch Labortechniker und Pathologen mit bei Mikroskopen
verwendeten Glasobjektträgern
vertraut sind, ist der Träger 14 vorzugsweise
ein gebräuchlicher
Mikroskopobjektträger
aus Glas mit typischen Abmessungen von 7,62 × 2,54 cm (3 inch × 1 inch).
Der in 5A dargestellte Objektträger 14 besitzt
eine vorgedruckte Grenze 54, innerhalb der Referenz- oder
Kontrollzellenobjekte 40 angeordnet sind. Ferner besitzt
der Objektträger
einen Bereich 61 für
die Probezellenobjekte.
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Die
Kontrollzellenobjekte sind in dieser dargestellten Ausführungsform
der Erfindung lymphopiastoide Zellen bekannter Größe und Form
und bekannten DNA-Inhaltes. Die lymphoplastoiden Zellen können zum größten Teil
Zellen mit normalem DNA-Gehalt sein, obwohl bestimmte Zellen ein
doppeltes oder anderes Verhältnis
zum normalen DNA-Gehalt besitzen können, wie es für Krebszellen
typisch ist. Die Kontrollzellenobjekte können andere Zelltypen mit dunklen
Zentren oder Kernen sein, welche sich gut einfärben, wie beispielsweise Hühnerblutzellen
oder Truthahnzellen. Andererseits können die Zellobjekte 40 auch
auf den Objektträger
aufgedruckte Artefakte mit Zellform sein. Darüber hinaus können die
Zellobjekte 40 wie oben ausgeführt konventionelle Kunststoffkügelchen
mit vorgegebener Größe sein,
welche bei gleichzeitiger Behandlung mit Probezellenobjekten, wie
beispielsweise monoklonalen Antikörpern im Probebereich 61 auf
dem Objektträger mit
einer speziellen fluoreszierenden Anfärbung oder einer Enzymanfärbung reagieren.
Die Referenzzellenobjekte ändern
sich von Test zu Test, wobei die vorliegende Erfindung nicht auf
spezielle Tests oder Zellobjekte beschränkt ist.
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Ein
Pathologe bringt auf einem vorbereiteten Objektträger gemäß 5A mit
vorher aufgebrachten Kontrollzellenobjekten 40 zusätzlich die
Probezellobjekte 12 auf, welche in diesem Fall Zellen von
einem Gewebeschnitt (wie etwa einem Tumorgewebe) einer Punktierung
von Tumorgewebe oder eine Monoschicht von Blutzellen oder anderen
Zellen im Bereich 61 auf dem Objektträger sind. Der Pathologe färbt dann
die Kontrollzellenobjekte und die Probezellenobjekte zur Bildverbesserung
gleichzeitig an oder behandelt sie in anderer Weise. Die bevorzugten
Objektträger
sind mit einem Gefäß versehen,
in dem sich Flaschen mit einem Wirkstoff befinden, der für die Kontrollzellenobjekte
spezifisch ist. Zur DNA-Analyse enthält das Gefäß Flaschen mit einer Feulgen-Azur-A-Wirkstofflösung sowie
Flaschen mit einer Spülwirkstofflösung zur
spezifischen und quantitativen Anfärbung nuklearer DNA.
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Zur
Vorbereitung eines Objektträgers
wird das folgende Verfahren verwendet. Der Objektträger 14 besitzt
normale Kontrollzellen in einem Bereich sowie einen Raum für Probezellen
in einem anderen Bereich. Der Objektträger 14 wird 10 Minuten
lang in 10%-igem Formalin befestigt und anschließend beiseitegelegt, während für den Bereich 61 in
normales Paraffin eingebettete Abschnitte vorbereitet werden. Ist
auf dem bleibenden Abschnitt ein malignes oder fragwürdiges Gewebe
vorhanden, so wird der Objektträger 14 zur
Analyse des Abschnittes verarbeitet.
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Die
Verarbeitung besteht zunächst
aus der 65-minütigen
Behandlung des Objektträgers
in 5N Hydrochlorid für
eine Hydrolyse der nuklearen DNA. Der Objektträger wird anschließend für eine Anfärbeperiode
von zwei Stunden zu einen Behälter
mit Azur A-Färbemittel
gebracht. Danach wird der Objektträger in Spüllösung gewaschen, mit Ethanol
getrocknet, mit Zylen gereinigt, abgedeckt und montiert. In diesem
Punkt wird der Objektträger
permanent fixiert und ist jederzeit für eine Analyse bereit.
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Die
Systemsoftware zur DNA-Analyse kann nunmehr die Dichte der zellularen
DNA durch Ermittlung der optischen Dichte der Probezellen über das
Instrument
11 bestimmen. Generell kann die Masse eines
eingefärbten
Zellobjektes aus dessen optischer Dichte gemäß den in der Mikrospektrophoto metrie
bekannten Beer-Lambert-Gesetz gewonnen werden. Dabei gilt die Gleichung:
wobei
M die Masse des
Objektes in Picogramm
α die
Punktgröße in μm
2 Eλ den
Auslöschungskoeffizienten
des Anfärbemittels
bei der Wellenlänge
X in μm
2/pg
OD die optische Dichte jedes Punktes
(dimensionslos) bedeuten.
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Das
Instrument nutzt dieses Gesetz zur Ermittlung der Massenverteilung
einer Anzahl von Zellen oder Zellobjekten aus, welche dann auf statistischer
Basis, in Form eines Histogramms oder in Form eines anderen analytischen
Formates analysiert werden kann, wie dies nachfolgend noch diskutiert
wird. Die Punktgröße α ist durch
die Anzahl von Bildpunkten festgelegt, welche durch die Kamera 18 gemessen
werden. Die optische Dichte für
jeden Bildpunkt wird durch Einstellung des Lichtpegels, des Fokussierungspunktes
und durch Auslesens einer optischen Referenzdichte aus dem Kalibrierbereich
auf dem Objektträger
geeicht. Diese Kalibrierung ermöglicht
die Umsetzung der gemessenen Lichtpegel für jeden Bildpunkt in eine optische
Dichte als dimensionslose Größe.
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Die
Kalibrierung für
den Auslöschungskoeffzienten
erfolgt durch Messung der optischen Dichte für eine Vielzahl von Kontrollzellen
zur Bestimmung einer Spitze für
die Verteilung in relativen Masseeinheiten. Da der Spitzen-DNA-Gehalt für die Kontrollzellenverteilung
bekannt ist, können
die Zellen im Messfeld unter Ausnutzung der relativen OD-Einheiten
gemessen und sodann unter Nutzung der Kontrollzellenkalibrierung
direkt in Picogramm überführt werden.
Ist beispielsweise bekannt, dass die Kontrollzellen 5,96 pg an DNA
(Truthahnzellen) enthalten und eine Gruppe von Kalibrierzellen eine
Spitzenverteilung von 11.000 relativen OD-Einheiten zeigen, so besitzt
eine normale Gruppe von menschlichen Zellen (mit einem bekannten
DNA- Gehalt von 7,18
pg) eine Spitze in ihrer Verteilung bei etwa 13.250 relativen OD-Einheiten.
Ferner kann jede andere relative OD-Einheitsmessung direkt in Picogramm überführt werden,
in dem der aus der Gruppe von Kalibrierzellen gefundene Auslöschungskoeffizient
bestimmt und ausgenutzt wird.
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Die
Systemsoftware zur DNA-Analyse ist ein durch ein Menü gesteuertes
Programm, das interaktive Informationsschirmbilder auf dem Monitor 63 ausnutzt,
um die Bedienungsperson bei der Durchführung der beschriebenen Messungen
an mehreren Zellen oder Zellunterpopulationen zu unterstützen. In 10 ist
die visuelle Schirmstruktur des auf dem Monitor 62 erscheinenden
Programms dargestellt. Ein Hauptschirmbild 150 liefert
Information hinsichtlich des Kalibrier- und Analysestatus der Vorrichtung
und liefert eine optische Liste zum Aufrufen dreier weiterer Primär-Informationsschirmbilder.
Ein visuelles Beispiel des Hauptschirmbildes ist in 11 dargestellt.
Die drei Primär-Informationsschirmbilder
entsprechen den drei Betriebsfunktionen des Programms, wobei das
Kennzeichnungsschirmbild 156 der Kennzeichnungsfunktion,
ein Kalibrierschirmbild 152 der Kalibrierfunktion (optische
Dichte und Anfärbung)
und ein Analyseschirmbild 154 der Analysefunktion entspricht.
Die Schirmbilder 152, 154 und 156 stellen
eine optische Liste bzw. ein Menü dar,
in dem einer der Sondervorgänge
in das Hauptschirmbild 150 übergeht.
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Ferner
kann der Benutzer das Kalibrierschirmbild 152 aus dem Analyseschirmbild 154 eingeben
oder den Vorgang umgekehrt durchführen. Die beiden anderen Schirmbilder
sind als Sondervorgänge
aus dem Analyseschirmbild 154 verfügbar und dienen zur Einstellung
der Grenze des Betrachtungsfeldes im Einstellgrenzschirmbild 158 sowie
zur Anzeige der X-,Y-Koordinaten
der Felder, die im X-,Y-Feldschirmbild 160 gemessen werden.
Eine Darstellung des Kalibrierschirmbildes ist in 12 gezeigt,
während
Darstellungen des Analyseschirmbildes und des X-,Y-Feldkoordinatenschirmbildes
in 13 bzw. 14 gezeigt
sind.
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Bei
Betrieb der Einheit steht dem Pathologen eine Anzahl von Sondervorgängen oder
Funktionen aus einem Menü auf
jedem Schirmbild zur Verfügung,
unter denen er wählen
kann, um Daten zu erfassen und diese Daten zu verarbeiten. Generell
liegt das Programm als ein Menü vor,
das anhand des in 11 gezeigten Hauptschirmbilds
gesteuert wird, welches ein Hauptmenü von Sondervorgängen gemäß 15 angibt.
Das Hauptmenü A10
besteht aus fünf
Hauptschirmbildfunktionen einschließlich einer Kennzeichnungsfunktion A12,
einer Kalibrierfunktion A14, einer Analysefunktion A16, einer Hilfsfunktion
A18 und einer Austrittsfunktion A20.
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Die
Kennzeichnungsfunktion ermöglicht
es einem Benutzer, Information hinsichtlich Patientenidentifizierung,
Vermehrungszahl und DNA-Umwandlungszahl einzugeben. Die DNA-Umwandlungszahl
ist diejenige Zahl, durch welche die erste und zweite Spitzenmasse
geteilt wird, um den ersten und zweiten Spitzenindex zu erhalten
(11). Anfänglich
wird die Zahl für
normale menschliche Zellen auf einen Standard von 7,18 Picogramm/Zelle
eingestellt. Die Vorrichtung kann jedoch auch zur Messung nicht
menschlicher Zellen verwendet werden, wobei der Index auf den gewünschten
Index geändert
werden kann. Die DNA-Indexzahl muss größer oder gleich 1,0 und kleiner
oder gleich 99,99 sein. Liegt die Umwandlungszahl nicht in diesem
Bereich, so darf der Benutzer die Analyse-Option weder im Hauptschirmbild
noch im Kalibrierschirmbild wählen.
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Die
drei während
der Kennzeichnungsfunktion eingegebenen Informationslinien erscheinen
auf jedem Schirmbild mit Ausnahme des X-,Y-Feldkoordinatenschirmbildes.
Der Kennzeichnungsvorgang wird durch Drücken entweder der Eingabetaste
oder der Austrittstaste eingeleitet. Durch Drücken der Eingabetaste werden Änderungen
gesichert, welche in den drei Informationszeilen durchgeführt werden.
Bei Drücken
der Austrittstaste werden in den drei Zeilen durchgeführte Änderungen
ignoriert. Die während
der Kennzeichnungsfunktion gespeicherte Information wird bei Auslösung des
Programms nicht aufbewahrt.
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Die
Auswahl der Kalibrierfunktion bewirkt eine Änderung der Anzeige auf dem
Monitor 62 vom Hauptschirmbild in das Kalibrierschirmbild
gemäß 12.
Die Sondervorgänge
des Kalibrierschirmbildes gemäß 16 sind
diejenigen, welche zur Durchführung
der Kalibrierung des Instrumentes hinsichtlich optischer Dichte
und Anfärbungsfaktor
der Kontrollzellen notwendig sind. Eine Kalibrierung der Vorrichtung 11 muss
bei jeder Wahl eines neuen Objektträgers durchgeführt werden,
um den Lichtpegel und den Anfärbefaktor
zu normieren.
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Die
Wahl der Analysefunktion bewirkt eine Änderung der Anzeige vom Hauptschirmbild
auf den Monitor 62 in das Analyseschirmbild nach 13.
Das Analyseschirmbild enthält
das Menü für die Funktionen,
welche zur Durchführung
der Datenerfassung und der DNA-Messungen an den Probe zellen notwendig
sind. Diese Funktionen sind vollständiger in 17 dargestellt.
Zur Auswahl der Analysefunktion müssen drei Kriterien erfüllt sein.
Zunächst
muss die Einstell-Lichtfunktion im Kalibrierschirmbild wenigstens
einmal erfolgreich durchgeführt
worden sein. Die Einstellungslichtfunktion ist erfolgreich, wenn
das laufende Bild weiß ist
und der Lichtpegel zwischen 129 und 131 liegt. Zweitens muss die
Kalibrier-Kontrollzellenzählung
zwischen 50 und 512 liegen. Schließlich muss die DNA Umwandlungszahl
größer oder
gleich 1,0 und kleiner oder gleich 99,99 sein.
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Die
Austrittsfunktion ermöglicht
es dem Benutzer, den Programmbetrieb aus dem Hauptschirmbild zu beenden.
Das Drücken
der Austrittstaste entspricht der Wahl der Austrittsfunktion. Ist
die Austrittsoperation entweder durch Wahl des Austritts oder Drücken der
Austrittstaste spezifiziert, so muss der Benutzer seinen Austrittsbefehl
bestätigen.
Zur Annahme der Bestätigung
wählt der
Benutzer die Ja-Taste. Um die Bestätigung zurückzuweisen, wählt er die
Nein-Taste oder drückt
die Austrittstaste.
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Die
Optionen für
das Kalibriermenü sind
in 16 gezeigt. Zu den Kalibriermenü-Wahlmöglichkeiten zählen eine
Einstell-Lichtfunktion A24, eine X-,Y-Einstell-Funktion A26, eine Fokussierungsfunktion
A32, eine Messfunktion A36, eine X-,Y-Funktion A38, eine Analysefunktion
A28, eine Löschfunktion
A30, eine Hilfsfunktion A34, sowie eine Austritts- bzw. Rückkehrfunktion
A40 in das Hauptschirmbild. Die Lichteinstellfunktion A24 berechnet
den Hintergrundlichtpegel für
das laufende Bild. Der Lichtpegel kann eingestellt werden, bis er
in einem standardisierten Bereich liegt. Die Einstell-Lichtfunktion sollte
wenigstens einmal erfolgreich durchgeführt worden sein, bevor die
Analyse-, Fokussierungs- und Messfunktion gewählt wird. Für genaueste Ergebnisse sollte
der Lichtpegel exakt gleich 130 sein. Der Lichtpegelwert wird auf
dem Kalibrierschirmbild durch das Wort "Lichtpegel" angezeigt. Ist der Lichtpegel erfolgreich
eingestellt, so wird im Messprogramm eine Bildrauschsubtraktion
durchgeführt.
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Die
Lichtquelfenkalibrierung realisiert eine Anzahl von Ergebnissen
einschließlich
einer Hilfe bei der Fokussierung des Mikroskops durch Aktualisierung
eines Grauskalenhistogramms, das in der generell in 22 dargestellten
und "Verteilung
der Lichtintensität" bezeichneten Form
vorliegen kann. Das dargestellte Histogramm zeigt einen Vergleich
des einfallenden Lichtes I0 und des übertragenen
Lichtes It mit dem einen Graupegelwert besitzenden übertragenen
Licht und dem einen Graupegelwert besitzenden auffallenden Licht. Die
Bedienungsperson hat die Plattform zur Betrachtung des Lichtkalibriermaterials 45 auf
dem Monitor 37 bewegt. Die Bedienungsperson betrachtet
das Lichtkalibriermaterial 45 und das System berechnet
ein Histogramm dieses Rasters durch Eingabe von Licht aus den Bildelementen
aus den Bildelementen dieses Feldes. Die Bedienungsperson stellt
dann den Intensitätspegel
der Quelle 17a zur Änderung
der Lichtpegelauslesung auf dem Schirm ein. Die Bedienungsperson
führt dies
durch abwechselndes Auswählen
der Funktion und Einstellen der Quelle 17a aus, bis die
richtige Auslesung auf dem Schirm erscheint. Ist die Lichtquelle
eingestellt, um die linke und rechte Spitze It und
I0 für
das übertragene
und auffallende Licht bei den gewünschten Graupegeln mit 130
als Hintergrundlichtintensität
zu erzeugen, so ist das System geeicht. Die Systemsoftware der Vorrichtung 11 nutzt
den I0- und It-Wert
zum Aufstellen einer internen Kalibriertabelle für die optische Dichte derart
aus, dass die für
jedes Bildelement er fasste Lichtintensität auf diese Tabelle bezogen
ist und in der analysierten Bildszene als eine spezielle optische
Dichte aufweisend bekannt ist.
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Bei
digitalen Abbildungsgeräten
wird zum Erkennen der tatsächlichen
optischen Dichte für
ein dunkles Objekt bekanntlich weiß (I0)
als Referenz genutzt. Durch Kalibrieren des Gerätes hinsichtlich der optischen Dichte
können
die eintreffenden Bilddaten durch Nachschlagetabellen in der Bildverarbeitungsschnittstelle 21 derart
umgesetzt werden, dass die optische Ausgangsdichte zur direkten
proportionalen Darstellung linear addiert werden können, wobei
sich in diesem Fall um die DNA-Mengen in den Probeobjekten handelt.
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Die
X-,Y-Einstell-Funktion A26 bildet die Einstellung des Ursprungs
für das
Objektträger-X-,Y-Koordinatensystem.
Mit diese Funktion wird die laufende Bild- bzw. Feldlage durch Nullstellung
eines Paars von Lageregistern in der Software als Ursprung eingestellt.
Generell wird das Mikroskopstativ 51 bewegt, bis eine leicht
erkennbare Markierung, beispielsweise als Kreuz 52, sichtbar
ist. Diese Markierung wird dann zur erneuten Nullstellung des Koordinatensystems
als Mittel zur Neueinstellung vorher gemessener Felder genutzt.
Die X-,Y-Einstell-Funktion wird für jeden gewählten neuen Objektträger genutzt.
Ist die X-,Y-Einstell-Funktion nicht ausgeführt worden, so arbeiten die
X-,Y-Funktionen des Kalibrier- und Analyseschirmbildes sowie die
Funktionen im X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild nicht korrekt. Die
X-,Y-Einstell-Funktion
kann lediglich genutzt werden, wenn die Kalibrier-Kontrollzellenzählung gleich
Null ist. Wird das Mikroskopstativ 51 bewegt, wenn sich die
Einstell-X-,Y-Operation in Ausführung
befindet, so ist der Koordinatenursprung fehlerhaft. Das Programm liefert
eine Information auf dem Schirmbild, um der Bedienungsperson kenntlich
zu machen, wann die Einstell-X-,Y-Operation erfolgreich ist. In Reaktion
auf eine nicht erfolgreiche Funktion wählt die Bedienungsperson lediglich
die X-,Y-Einstell-Funktion aus dem Menü neu und versucht die Funktion
erneut.
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Die
Messfunktion A36 dient zur Durchführung der Kontrollzellen- oder
Kontrollobjektkalibrierung zur Normierung des Anfärbungsfaktors.
Ist die Messfunktion gewählt,
so wird die Kamerabilderfassung gestoppt, wobei sich der Zeiger 170 auf
dem Kalibrierschirmbild auf das Wort "Messoperationen" gemäß 12 bewegt. Wenn
der Zeiger 170 sich in dieser Lage befindet, kann der Benutzer
Messoperationen durch Aktivierung der numerischen Sperre spezifizieren.
Eine Identifizierung, wie beispielsweise ein in magenta eingefärbter Kasten wird
um ein identifiziertes Zellenobjekt angeordnet. Durch Anwendung
einer Anzahl von Tastenoperationen gemäß 18 kann
die Bedienungsperson einen nachfolgend noch genauer beschriebenen
interaktiven Auswahl- und Ausschlussprozess durchführen.
-
Während der
Kontrollzeilenkalibrierung bewegt die Bedienungsperson das Mikroskopstativ
durch Drehen der konventionellen X- und Y-Knöpfe 110 und 17 (1),
um die Kontrollzellenobjekte 40 in das Sichtfeld auf dem
Monitorschirm 37 zu schieben. Befindet sich ein einzelnes
Zellobjekt 40 in einem Kasten oder einer Identifizierungsgrenze,
so drückt
die Bedienungsperson eine Taste auf der Tastatur 36 zur
Eingabe der Messung der summierten optischen Dichte für dieses
Kontrollzellenobjekt. Nach Analyse einer geeigneten Anzahl von Kontrollzellenobjekten
erhält
die Bedienungsperson ein Histogramm gemäß 12 auf
dem Videomonitor 62, das ihr die Kontrollzellenobjekt-Chromosomensatzverteilung
mit einer relativen Menge an DNA zeigt. Die tatsächlich für die Kontrollzellenobjekte
gemessenen summierten relativen optischen Dichtewerte werden in der
Systemsteuerung 22 intern mit einer vorgegebenen Standard-
oder Referenzmenge an DNA verglichen, welche die Kontrollzellen
bekanntermaßen
besitzen. Enthalten im vorliegenden Beispiel die Steuerzellen 5,96 Picogramm
an DNA pro Zelle, so entspricht eine optische Dichtemessung von
etwa 8700 relativen OD-Einheiten dieser Masse. Die tatsächliche
durch die Bedienungsperson gefundene summierte optische Dichte wird
in den gespeicherten Referenz-DNA-Wert geteilt, um einen Faktor
zu erzeugen, durch den der Auslöschungskoeffizient
für Abweichungen
im Anfärbmittel
von einer perfekten Anfärbung
einzustellen.
-
Die
X-,Y-Funktion A38 bewirkt bei Auswahl auf dem Kalibrierschirmbild
eine Anzeige der X-,Y-Koordinaten des laufenden Bildes oder Feldes
auf dem Monitor 37. Die Koordinaten werden kontinuierlich
angezeigt, bis der Benutzer eine Taste drückt (mit Ausnahme CTRL, ALT
oder SHIFT). Wurde der gleiche Ursprung für den Objektträger 14 eingestellt,
so kann daher die Bedienungsperson durch Einstellen der Plattform 51 und Betrachten
der Koordinatenänderung
das gleiche vorher aufgezeichnete Bild finden. Die X-,Y-Einstell-Funktion
A26 muss vorher erfolgreich durchgeführt worden sein, um die X-,Y-Funktion
wählen
zu können.
-
Die
Löschfunktion
A30 bewirkt ein Löschen
aller gespeicherten Datenbilder. Nach Auswahl einer Löschfunktion
wird der Benutzer aufgefordert, die Operation zu bestätigen. Um
die Bestätigung
anzunehmen, wählt
der Benutzer die Ja-Taste zur Bestätigung, während er zum Ausschluss der
Bestätigung
die Nein-Taste wählt
oder die ESC-Taste drückt.
-
Die
Fokussierungsfunktion A32 gewährleistet
eine Farbverstärkung
für das
Bild, so dass der Benutzer eine genauere Fokussierung des Bildes
durchführen
kann. Die Systemsteuerung 22 liefert automatisch unterschiedliche
Farben für
Abstufungen des Graupegels im Bild. Die Bedienungsperson stellt
dann die Fokussierungsmittel des Mikroskops 15 ein, bis
das z.B. auf eine Kante des Kastens fokussierte Objekt eine klare
Farbabgrenzung zeigt. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die beiden
getrennten Pegel oder die Grauskala der Kante fokussiert sind. Ohne
Farbe ist dies weitaus schwieriger, weil die beiden Graupegel nahe
beieinanderliegen und ohne Farbverstärkung nicht unterschieden werden
können.
Die Einstell-Lichtfunktion A24 muss mindestens einmal erfolgreich
durchgeführt
worden sein, um die Fokussierungsfunktion zu wählen. Um das Bild in seiner
ursprünglichen
Farbe neu zu bilden, wird die Fokussierungsfunktion ein zweites
Mal gewählt.
Ist das in der Farbe verstärkte
Bild vorhanden, wenn der Benutzer die Messfunktion wählt, so
wird das Bild automatisch auf seine ursprüngliche Farbe zurückgeführt.
-
Durch
das Auswählen
der Analysefunktion A28 wird die Anzeige vom Kalibrierschirmbild
in das Analyseschirmbild geändert.
Das Analyseschirmbild liefert ein Menü der Funktionen gemäß 17,
welche zur Durchführung
der DNA-Messungen bei zellularem Material erforderlich sind. Zur
Auswahl der Analysefunktion müssen
drei Kriterien erfüllt
sein. Erstens muss die Einstell-Lichtfunktion im Kalibrierschirmbild
wenigstens einmal erfolgreich ausgeführt worden sein. Zweitens muss
die Kalibrier-Kontrollzeilenzählung
zwischen 50 und 512 liegen und schließlich muss die DNA Umwandlungszahl
größer oder
gleich 1,0 und kleiner oder gleich 99,99 sein. Die Analysefunktion
im Kalibriermenü wirkt
in der gleichen Weise wie die Analysefunktion im Hauptschirmbild.
-
Die
Analysefunktions-Optionen im Analysemenü sind in 17 ausführlicher
dargestellt. Das Analysemenü ermöglicht die
Auswahl einer Klassifizierungsfunktion A44, einer Fokussierungsfunktion
A46, einer Prüflichtfunktion
A48, einer Zweitauswahlfunktion A50, einer Bereichs 1–2 Funktion
A52, einer Skalenfunktion A54, einer Anzeige-X-,Y-Funktion A56,
einer Grenzfunktion A58, einer Lösch-X-,Y-Funktion
A60, einer Hilfsfunktion A62, einer Berichtsfunktion A64 und einer
Rückkehrfunktion
auf das Hauptmenü A66.
-
Die
Lichtprüffunktion
A48 berechnet den Lichtpegel des laufenden Bildes. Der Lichtpegelwert
wird auf dem Analyseschirmbild durch das Wort "Lichtpegel" gemäß 13 angezeigt.
-
Die
Zweitauswahlfunktion A50 ermöglicht
es dem Benutzer, die zweite Spitze in dem auf dem Analyseschirmbild
angezeigten Histogramm auszuwählen.
Die Masse, der DNA-Index und der Bereich der zweiten Spitze werden
auf dem Schirmbild unter den Wörtern "zweite Spitze" angezeigt. Die Zeitauswahlfunktion
kann nicht ausgewählt
werden, wenn die gezeigte Zellzählung
gleich Null ist. Die gezeigte Zellzählung wird durch das Wort "gezeigt" angezeigt. Nach
Wahl der Zweitauswahlfunktion bewegt sich der Zeiger auf einen Satz
von Pfeilen, wobei die Lage der laufenden zweiten Spitze im Histogramm
gelb hervorgerufen wird. Zunächst
wird die am weitesten rechts liegende Histogrammdatenstelle als
zweite Spitze gewählt.
Durch Wahl des linken Pfeils wird die Lage der zweiten Spitze nach
links bewegt, während
bei Wahl des rechten Pfeils durch den Benutzer die Lage der zweiten
Spitze nach rechts bewegt wird. Jedes Mal, wenn ein Pfeil gewählt wird,
werden die laufenden Spitzendaten auf dem Bildschirmbild aktualisiert.
-
Unter
der Horizontalachse des Histogramms erscheint eines von drei Symbolen
unterhalb der Lage der zweiten Spitze. Ein "kleiner als"-Symbol erscheint, wenn die zweite Spitze
im Bereich Eins liegt. Ein "größer als"-Symbol erscheint, wenn die zweite Spitze
in einem Bereich Zwei liegt. Ein Aufwärtspfeilsymbol erscheint, wenn
die zweite Spitze weder im Bereich Eins noch im Bereich Zwei liegt.
Der Zweck für
die drei Symbole besteht darin, dass die Lage der zweiten Spitze
nach Auslösung
der Zweitwahloperation identifiziert werden kann. Die vertikale
gelbe Linie verschwindet, wenn die Zweitauswahlfunktion einmal ausgelöst ist.
Der Benutzer drückt
die ESC-Taste um die Zeitauswahloperation auszulösen. Die Daten für die zweite
Spitze werden ferner automatisch gelöscht, wenn eine der folgenden
Analyseschirmbildfunktionen gewählt
ist: Löschen,
Berichten, Skalieren oder Hauptfunktion.
-
Die
Klassifizierungsfunktion A44 ermöglicht
dem Benutzer, die Zellen oder Objekte im laufenden Bild zu klassifizieren.
Ist die Klassifizierungsfunktion gewählt, so wird der Benutzer aufgefordert,
die Operation zu bestätigen.
Zur Annahme der Bestätigung
wählt der
Benutzer die Ja-Taste, während
er zum Ausschluss der Bestätigung
die Nein-Taste wählt
oder die ESC-Taste drückt.
Ist die Klassifizierung bestätigt,
so stoppt die Kameraerfassung und der Zeiger bewegt sich auf das
Wort "Klassifizierungsoperation". Befindet sich der
Zeiger in dieser Stellung, so kann der Benutzer die Klassifizierungsoperationen
spezifizieren. Die numerische Sperre wird zur Freigabe dieser Funktionen
aktiviert. Ebenso wie bei der Messfunktion wird ein in Magenta gefärbter Kasten
um eine laufende Zelle angeordnet, wobei die Operationen es dem
Benutzer ermöglichen,
diese Zellenidentifizierung zur Identifizierung und Klassifizierung
der darin befindlichen Zellen durch das Bild zu bewegen.
-
Die
X-,Y-Anzeige-Funktion A56 dient zum Ändern die Anzeige vom Analyseschirmbild
in das X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild (14). Das
X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild zeigt die X-,Y-Koordinaten der ersten
512 Bilder an, welche klassifiziert und gespeichert werden. Ferner
enthält
das Schirmbild die Funktionen, die das Sortieren der Bildfelder
durch Koordinaten ermöglichen.
Die X-,Y-Einstell-Funktion im Kalibrierschirmbild muss erfolgreich
durchgeführt
worden sein, bevor die Anzeige-X-,Y-Funktion gewählt wird.
-
Das
X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild besitzt mehrere Funktionen. Eine
der Funktionen, die "Nächstlage"-Funktion, sortiert
die X-,Y-Koordinaten in Abhängigkeit
vom Abstand von der laufenden X-,Y-Feldlage. Die X-Funktion sortiert
die X-,Y-Koordinaten in Abhängigkeit
vom X-Koordinatenwert. Ist eine Schleife vorhanden, so legt die
Y-Koordinate die Sortierungsfolge fest. Entsprechend sortiert die
Y-Funktion die X-,Y-Koordinaten in Abhängigkeit vom Y-Koordinatenwert.
Ist eine Schleife vorhanden, so legt die X-Koordinate die Sortierungsfolge
fest. Die "Feldnummer"-Funktion sortiert
die X-,Y-Koordinaten
in Abhängigkeit
von der Koordinatenfeldnummer. Die Feldnummer ist die Reihenfolge,
in der die Bilder klassifiziert werden.
-
Die
Seitenaufwärtsfunktion,
falls vorhanden, ermöglicht
dem Benutzer, die vorhergehende Seite von X-,Y-Koordinaten anzuzeigen,
und die Seitenabwärtsfunktion,
falls vorhanden, ermöglicht
das Anzeigen der nächsten
Seite von X-,Y-Koordinaten anzuzeigen. Die Austrittsfunktion ändert die
Anzeige vom X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild auf das Analyseschirmbild.
Das Drücken
der Austrittstaste entspricht der Wahl der Austrittsfunktion.
-
Durch
Wahl der X-,Y-Funktion werden die X-,Y-Koordinaten des laufenden
Feldes angezeigt. Die Koordinaten werden kontinuierlich angezeigt,
bis der Benutzer eine Taste drückt
(mit Ausnahme CTRL, ALT und SHIFT). Die X-,Y-Einstell-Funktion im Kalibrierschirmbild
muss erfolgreich durchgeführt
wor den sein, bevor die X-,Y-Funktion gewählt wird. Die X-,Y-Funktion
im X-,Y-Feldkoordinatenschirmbild
wirkt ebenso wie die X-,Y-Funktion im Kalibrier- und Analyseschirmbild.
-
Die
Löschfunktion
A60 löscht
alle auf Datenbereiche bezogenen Analysen. Nach Wahl der Löschfunktion
wird der Benutzer aufgefordert, die Löschoperation zu bestätigen. Zur
Annahme der Bestätigung
wählt der Benutzer
die Ja-Taste, während
er zum Ausschluss der Bestätigung
die Nein-Taste wählt
oder die ESC-Taste drückt.
-
Die
Fokussierungsfunktion A46 realisiert eine Farbverstärkung für das Bild,
so dass der Benutzer eine genauere Fokussierung des Bildes durchführen kann.
Die Fokussierungsfunktion im Analyseschirmbild arbeitet ebenso wie
die Fokussierungsfunktion im oben beschriebenen Kalibrierschirmbild.
-
Die
Bereich 1–2-Funktion
A52 ermöglicht
es dem Benutzer, zwei Bereiche in dem im Analyseschirmbild angezeigten
Histogramm zu spezifizieren. Der Zweck dieser Funktion besteht darin,
die Zellzählung
in bestimmten Bereichen im Histogramm zu identifizieren. Die Bereich
1–2-Funktion
kann nicht gewählt
werden, wenn die gezeigte Zellzählung
gleich Null ist. Die Zellzählungen
werden im unteren rechten Teil des Schirmbildes angezeigt. Nach
Wahl der Bereich 1–2-Funktion
bewegt sich der Zeiger auf eine Zahlenzeile unterhalb der Histogramm-Horizontalachse.
Die Zahlenzeile ermöglicht
dem Benutzer, die Lagen des Bereiches 1 und des Bereiches 2 zu spezifizieren.
Der Benutzer gibt eine "1" zur Spezifizierung
ein, dass die laufende Histogrammlage zum Bereich 1 gehört. Der
Benutzer gibt eine "2" zur Spezifizierung
ein, dass die Lage zum Bereich 2 gehört. Der Benutzer gibt eine "0" zur Spezifizierung ein, dass die laufende
Histogrammlage weder zum Bereich 1 noch zum Bereich 2 gehört. Der
Benutzer kann einen Bereich 1 ohne einen Bereich 2 jedoch nicht
einen Bereich 2 ohne einen Bereich 1 spezifizieren. Werden beide
Bereiche spezifiziert, so muss der Bereich 1 links vom Bereich 2
spezifiziert werden. Der Bereich muss als kontinuierlich spezifiziert
werden. Zum Austritt aus der Bereich 1–2-Funktion drückt der Benutzer
die Eingabe- oder ESC-Taste. Drückt
der Benutzer die Eingabetaste, so wird der Bereich 1 des Histogramms
in grün
und der Bereich 2 in Magenta hervorgehoben. Die Bereichszellzählungen
werden ebenfalls angezeigt. Das Drücken der ESC-Taste bewirkt,
dass das Programm durchgeführte Änderungen
nicht berücksichtigt.
Bereich 1- und Bereich 2-Daten werden automatisch gelöscht, wenn
eine der folgenden Funktionen gewählt wird: Klassifizieren, Löschen, Berichten,
Skalieren oder Hauptfunktion.
-
Die
Analysefunktion A42 wird nun anhand der
20 und
21 genauer
beschrieben. Die Bedienungsperson wählt eine Zahl von Feldlagen
360,
361 und
362 im
Objektträgerprüfbereich
61 zur
Analyse. Die Bedienungsperson bewegt die X- und Y-Knöpfe
110 und
17 für das Mikroskopstativ
51 zur
Bewegung eines ersten hinsichtlich des DNA-Gehaltes sowie gegebenenfalls
hinsichtlich der Zellmorphologie zu analysierenden Feldes von Probezellenobjekten
in das Betrachtungsfeld auf dem Monitorschirm
37 (
20).
Das Programm ordnet dann einen Kasten beispielsweise
300 auf
einem auf dem Monitor
37 angezeigten speziellen Probezellenobjekt
12 an,
wobei der Benutzer dann eine Taste benutzt, um die Abtastung der
Bildpunkte (Bildelemente) des Probeobjektes auszulösen, wobei
die Zellen entsprechend klassifiziert werden, wie dies im US-Patent
4,453,266 beschrieben ist,
woraus die summierte optische Dichte für das Zellprobenobjekt, d.h.
einen eingefärbten
Zellkern, sowie dessen Fläche,
Rundung und andere Klassifizierungsinformation erzeugt wird. Ferner
stehen der Bedienungsperson auf der Tastatur
36 mehrere
manuell betätigbare
Zellklassifizierungstasten zur Verfügung, von denen er eine Taste
bekannter Kategorie, etwa Typ 0-Normalzelle; Typ 1-Krebszelle; Typ
2-Krebszelle; Typ 3-Krebszelle; usw. drückt. Auf dem Monitorschirm
62 erscheint
ein Analysehistogramm, das den DNA-Gehalt der Zellen im Feld anzeigt. Die
Bedienungsperson wählt
eine Zellenzahl in jedem Feld bzw. Bereich und bewegt dann das Mikroskopstativ,
um eine Anzahl anderer Felder von Probezellen in das Betrachtungsfeld
zu bringen und erfasst und analysiert eine Anzahl dieser Probezellen,
bis er den Eindruck hat, genug Zellen für eine repräsentative Probe zu haben.
-
Zu
diesem Zeitpunkt wird auf dem Monitorschirm 62 ein Histogramm
der dargestellten Art angezeigt, das die Anzahl von Zellen eines
speziellen DNA-Gehaltes
sowie die DNA-Gehaltmittelwerte für jede der Referenzspitzen
zeigt, wie dies beispielsweise in 13 dargestellt
ist. Durch Drücken
einer Drucktaste auf der Tastatur 36 kann die Bedienungsperson
das Histogramm gemäß 13 auf
den Drucker 38 ausdrucken. Die Daten für Probezellen werden ebenfalls
intern in der Systemsteuerung 22 für einen späteren Abruf und einem Vergleich
mit Daten jeder neuen Probe für
den gleichen Patienten zur Analyse in bezug auf den Fortschritt
oder Rückschritt
eines Patienten gespeichert.
-
Die
Arbeitsweise der Analysefunktion nun wird anhand von 19 und 20 eingehender
beschrieben, in denen ein visuelles Feld dargestellt ist, das vorher
im Instrument gespeichert wurde. Das Feld enthält eine Anzahl von Zellenobjekten,
welche hinsichtlich des DNA-Gehaltes klassifiziert und gemessen
werden sollen. Gelangt das Programm anfänglich in diese Betriebsart,
so wird das erste Objekt im Feld durch rasterförmiges Abtasten der Bildpunkte
des Feldes identifiziert, bis ein Zellobjekt erkannt ist. Ist ein
Zellobjekt einmal erkannt, so kann ein Identifizierungsmittel wie
beispielsweise der Kasten 300 um das Objekt gezeichnet
werden. Dies gewährleistet
eine visuelle Identifizierung für
die Bedienungsperson zur Bestimmung, welches Zellobjekt gegenwärtig gemessen
wird. Zusätzlich
zur Messung stehen die Bedienungsperson mehrere Zusatzfunktionen
im Analysemenü zur
Verfügung.
Die primäre
Zusatzfunktion für
die Bedienungsperson besteht in der Klassifizierung eines laufenden
Objektes im Block A202. Die Bedienungsperson führt dies durch Drücken einer
der numerischen Tasten 0–5
aus, wodurch das Zellobjekt des identifizierenden Kastens automatisch
in die gewählte
Klassifikation 0–5
gebracht wird. Wird das Objekt als Abfall, nicht jedoch als abnormale
Zelle oder als nicht identifizierendes Zellobjekt identifiziert,
so kann die Bedienungsperson das laufende Objekt durch Wahl einer
9 auf der Tastatur ausschließen,
wie dies im Block A204 angegeben ist.
-
Nach
Klassifizierung oder Ausschluss des Objekts im Kasten 300 kann
die Bedienungsperson den Identifizierungskasten zum nächsten ungemessenen
im Block A208 festgelegten Objekt bewegen. Eine Bedienungsperson
führt dies
durch Drücken
der Tasten CTRL/F2 aus, wodurch das Programm den Kasten 300 löscht und
das nächste
identifizierbare Zellobjekt sucht. Dieses Zellobjekt wird aufgefunden,
wonach ein weiterer Identifizierungskasten 302 um dieses
Objekt gezogen wird, um der Bedienungsperson die von ihr ausgeführte Funktion
anzuzeigen. Auf diese Weise kann die gesamte Gruppe von Zellobjekten
klassifiziert und gemessen oder durch Wiederholen dieses Prozesses
ausgeschlossen werden. 20 zeigt den Vorgang der Abtastung
eines Zellobjektes, das Umgeben dieses Objektes mit einem Identifizierungskasten
und die Klassifizierung bzw. den Ausschluss des Objektes. Auf diese
Weise durchläuft
das Programm den Analysevorgang vom Objekt 300 zu 302, 304, 306, 308, 310, 312 usw.
-
Wenn
eines der zu klassifizierenden Zellobjekte nicht so aussieht, wie
es nach Meinung der Bedienungsperson erforderlich wäre, dann
sollte und kann es darüber
hinaus nicht in eine der obengenannten Klassifizierungen eingebracht
werden; sollte die Bedienungsperson aus irgendeinem Grunde glauben,
er habe das vorhergehende Objekt fehlerhaft klassifiziert, so kann
er in Block A206 durch Drücken
von CTRL/F1 den Identifizierungskasten auf das vorher gemessene
Objekt zurückbewegen.
Nach Identifizierung aller im speziellen Feld angezeigten Zellobjekte
hat die Bedienungsperson die Wahl, durch Betätigen des X-,Y-Einstellmechanismus
auf ein anderes Feld überzugehen,
um mehr Zellen für
die spezielle Analyse bereitzustellen.
-
Hat
die Bedienungsperson festgestellt, dass genug Zellen analysiert
sind, so kann sie die Analysefunktion durch Drücken entweder der Eingabetaste
oder der Austrittstaste die Analysefunktion beenden. Beendet sie
die Analysefunktion durch Drücken
der Eingabetaste, wie dies im Block A212 dargestellt ist, so werden
die für
jede der Messungen gesammelten Daten bewahrt. Wird die Analysefunktion
jedoch durch Drücken der
ESC-Taste beendet, so werden im Block A216 die Daten nicht bewahrt.
-
Die
Berichtsfunktion A64 ermöglicht
es dem Benutzer, zu spezifizieren, welche Zellklassifikationen in dem
auf dem Schirm des Monitors
62 angezeigten Histogramm enthalten
sein sollen. Nach Wahl der Berichtsfunktion kann der Zeiger auf
eine Optionsliste bewegt werden, welche der Bedienungsperson die
Spezifizierung der Zelltypen ermöglicht.
Die folgende Tabelle spezifiziert, welche Taste die Bedienungsperson
drückt, um
einen speziellen Zelltyp auszuwählen.
Zelltyp | Taste |
Normal | 0
oder n |
1 | 1 |
2 | 2 |
3 | 3 |
4 | 4 |
Lymphkörper | 5
oder L |
-
Jede
Kombination der Typen für
die Berichtsdaten ist zulässig.
Das Programm ignoriert von den in der Tabelle aufgelisteten Zeichen
verschiedene Zeichen. Die Bedienungsperson steigt durch Drücken der
Eingabe- oder Austrittstaste aus der Berichtsoperation aus. Drückt die
Bedienungsperson die Eingabetaste, so ändert er die Typen im Histogramm
auf diejenigen, welche spezifiziert wurden. Wird jedoch die Austrittstaste
gewählt,
so ignoriert das Programm alle durchgeführten Änderungen und kehrt normal
zurück.
Der Funktionsbereich 1 oder 2 sowie die Daten der zweiten Spitze
werden automatisch gelöscht,
wenn die Berichtsfunktion durchgeführt wird.
-
Die
Skalierungsfunktion A54 ermöglicht
es der Bedienungsperson, die Skala der Horizontalachse des auf dem
Analyseschirmbild dargestellten Histogramms zu ändern. Es sind drei wählbare Skalen
von 0–16, 0–32 und
0–64 vorhanden.
Wird die Skalierungsfunktion gewählt,
wenn die laufende Skala gleich 0–16 ist, so ist die neue Skala
gleich 0–32.
Wird die Skalierungsfunktion gewählt,
wenn die laufende Skala gleich 0–32 ist, so ist die neue Skala gleich
0–64.
Wird die Skalierungsfunktion gewählt,
wenn die laufende Skala gleich 0–64 ist, so ist die neue Skala
entsprechend gleich 0–16.
Bei dieser Funktion werden der Bereich 1, der Bereich 2 und die
Daten für
die zweite Spitze automatisch gelöscht, wenn die Skalierungsoperation
durchgeführt
wird.
-
Die
Grenzfunktion A58 ändert
die Anzeige auf dem Monitor 37 vom Analyseschirmbild in
das Einstellgrenzschirmbild. Das Einstellgrenzschirmbild enthält Funktionen,
welche zur Änderung
der Zellgrenze, d.h. des Schwellwertes erforderlich sind. Beim Adressieren
des Grenzschirmbildes wird die Kamerabilderfassung angehalten.
-
Die
Schrittfunktion ermöglicht
der Bedienungsperson, den Betrag zu verändern, um den sich die Grenze ändert, wenn
eine der Pfeiltasten gewählt
wird. Der Wert muss im Bereich von 0–128 liegen. Ist die Schrittgröße gewählt, so
bewegt sich der Zeiger auf die Stelle auf dem Schirm, an welcher
der Benutzer einen neuen Schrittgrößenwert tippen kann. Zum Austritt
aus der Schrittgrößenfunktion
wird die Eingabe- oder Austrittstaste verwendet. Beim Drücken der
Eingabetaste wird die Schrittgrößenänderung
bewahrt, während
beim Drücken der
Austrittstaste jede bereits durchgeführte Änderung ignoriert wird. Anfänglich ist
der Schrittgrößenwert gleich
Eins.
-
Die
Aufwärtspfeilfunktion
vergrößert die
Zellgröße um den
Wert der Schrittgröße, während die
Abwärtsbereichsfunktion
die Zellgrenze um den Wert der Schrittgröße verringert. Die Austrittsfunktion ändert die Anzeige
vom Adressgrenzschirmbild in das Analyseschirmbild. Das Drücken der
Austrittstaste entspricht der Wahl der Austrittsfunktion.
-
Generell
wird durch die Vorrichtung ein interaktives Schema zum Sammeln und
Analysieren von Daten zwecks Sammelns spezieller Parameter sowohl
für die
Kalibrierzellobjekte als auch die Probezellobjekte verwendet. Jedes
gewählte
Feld wird auf dem Monitor 37 angezeigt, wobei entweder
die Messoperation des Kalibrierschirmbildes oder die Klassifizierungsoperation
des Analyseschirmbildes gewählt
wird.
-
Ein
Software-Flussdiagramm eines die interaktiven Operationen für die Kalibriertastenoperationen und
die Analysetatenoperationen gemäß den 18 und 19 realisierenden
Unterprogramms ist in 24 dargestellt. Wählt die
Bedienungsperson entweder die Messoperationen oder die Klassifizierungsoperationen, so
wird dieses Programm aufgerufen, um den Auswahlprozess sowohl für die Kalibrierzellenobjekte
als auch die Probezellenobjekte durchzuführen. Das Programm beginnt
im Block A300 durch bildpunktweises Ausführen einer Rasterabtastung
des gespeicherten Bildes, bis ein Bildpunkt aufgefunden wird, welcher
größer als der
Schwellwert ist. Der Test für
diese Operation wird im Block A302 durchgeführt. Wird kein Bildpunkt aufgefunden,
welcher größer als
der Schwellwert ist, so legt der Block A304 fest, ob die Abtastung
vollständig
ist. Ist dies nicht der Fall, so kehrt das Programm zum Block A300
zurück,
wobei die Abtastung fortgesetzt wird, bis alle Bildpunkte im Bildfeld
getestet sind. Sind alle Bildpunkte getestet, so werden die Abtastparameter
im Block A308 rückgesetzt
und das Zellobjektraster im Block A310 aktualisiert.
-
Wenn
festgestellt wird, dass ein Bildpunkt größer als der Schwellwert ist,
so kennzeichnet das Programm das Objekt im Block A306. Die Kennzeichnungsoperation
wird nachfolgend im einzelnen beschrieben. Die individualisierten
Zellobjekte im digitalisiertem Bild werden durch eine Szenenanalysetechnik
lokalisiert, bei der die Rasterabtastung des digitalisierten Bildes
erfolgt, um jeden Bildpunkt oberhalb des kritischen Schwellwertes
zu lokalisieren. Die Technik führt
sodann eine Vierernachbarschaftsanalyse benachbarter Bildelemente
durch und fährt
fort, in sich wiederholender Form oberhalb des Schwellwertes liegende "Nachbarn der Nachbarn" zu lokalisieren,
bis der gesamte Bereich eines Zellobjektes definiert ist. Diese
Technik wird gegenüber
anderen Szenenanalysetechniken, wie beispielsweise einer Auffindung
einer lokalen Grenze aus einem Gradientenbild, bevorzugt, weil sie bei
der Unterscheidung des wahren Bereiches einer Zelle, insbesondere
bei Zellen mit irregulären
oder nadelförmigen
Ansätzen
irrtumssicher ist.
-
Die
vier Bildpunkte (oben, unten, rechts und links), welche den anfänglich lokalisierten
Bildpunkt umgeben und an diesen angrenzen, werden sequentiell untersucht,
um den nächsten
Bildpunkt mit einer optischen Dichte bzw. einen Graupegelwert oberhalb
des Schwellwertes zu identifizieren. Liegt beispielsweise der oberhalb
des ersten Bildpunktes liegende Bildpunkt nicht über dem Schwellwert, so wird
er aus dem Kennzeichnungsprogramm herausgenommen. Der nächste Bildpunkt
(rechts) im Uhrzeigersinn wird sodann untersucht und kann oberhalb
des Schwellwertes liegen. Ist dies der Fall, so wird dann dieser
Bildpunkt identifiziert und im Speicher gespeichert, wobei der Bildpunkt
ein Teil des Bereichs einer Zelle ist. Anschließend werden die Adresse und
die Dichte des gefundenen Bildpunktes in einer Pushdown-Liste gespeichert,
und die vier Nachbarbildpunkte dieses Bildpunktes werden im gleichen
Uhrzeigersinn untersucht. Dies wird rekursiv fortgeführt, bis
oberhalb eines Schwellwertes für
einen speziellen Bildpunkt keine Nachbarn gefunden werden. An diesem
Punkt werden die früheren
Bildpunkte in der Pushdown-Liste erneut untersucht, um den Nachbarsuchprozess
fortzusetzen, bis die vollständige
Anzahl von einen Bereich definierenden Bildpunkten, d.h. das Zellobjekt,
identifiziert ist. Es werden also die Bildpunkte oberhalb des Schwellwertes
des Bereiches identifiziert, wobei ein vollständiger geschlossener Bereich
für eine
Zelle definiert ist.
-
Nachdem
ein Zellobjekt bezeichnet worden ist, wird wie gezeigt eine Zellobjekttabelle
(24C) für das
Objekt aufgestellt. Die Tabelle listet die Adresse ihres Eintrittspunkt-Bildpunktes,
die Anzahl von Bildpunkten im Objekt, die X-,Y-Punkte für den Minimum-
und Maximumpunkt des Objektes, ein Zählwert der Bildpunkte im Umfang
des Objektes, die Summe der optischen Dichte der Objektbildpunkte,
für das
Objekt realisierte Klassifizierungen sowie die X-,Y-Koordinaten
des Feldes auf, zu dem das Objekt gehört. Eine Vielzahl der Zellobjekttabellen
umfassen ein als Feldraster bezeichnetes und in 24A dargestelltes Zwischenraster, das zur Speicherung
der für
das relevante gegenwärtige
Feldbild entwickelten interaktiven Daten benutzt wird.
-
Im
Block A312 stellt das Programm fest, ob ein automatisches Kennzeichensignal
vorher gesetzt worden ist. Ist dies der Fall, so verzweigt sich
das Programm unmittelbar zum Block A316, oder falls nicht, negativ zum
Block A313. Sodann wird im Block A313 unter Verwendung der X-,Y-Grenzen
ein Kasten bzw. eine Identifizierungsgrenze um das Objekt angeordnet.
Diese Betriebsart identifiziert für die Bedienungsperson ein
spezielles Objekt im Feld. Im Block A314 wird eine Tastenhandhabung
eingegeben, um die Bedienungsperson zum Drücken einer Taste zu veranlassen,
wodurch festgelegt wird, welche der Tastenfunktionen nach 18 oder 19 durchzuführen ist.
Der Tasten-Bediener legt ferner fest, welche Operation entweder
zur Kalibrierung oder Analyse durchzuführen ist, wobei lediglich die
der vorhandenen Betriebsart zugeordneten Tasten freigegeben werden,
während
sämtliche
anderen Tasten gesperrt werden. Ist eine Taste gegeben, so legen Blöcke A326
bis A342 die gewählte
Funktion und den Fortgang der Routine fest.
-
Im
Block A326 detektierte Tasten 0–5
gewährleisten
die Akzeptanz eines Kalibrierungsobjektes oder die Klassifizierung
eines Probeobjektes. Wird eine derartige Taste detektiert, so setzt
ein bestätigender
Zweig das Programm im Block A316 fort. Im Block A318 wird das Objekt
erneut gekennzeichnet, während
das Objekt im Block A320 (rot) gefärbt wird, um der Bedienungsperson
anzuzeigen, dass es angenommen oder klassifiziert worden ist. Die
Bedienungsperson klassifiziert die Zellobjekte in unterschiedliche
Kategorien auf der Basis von sichtbaren Anhaltspunkten, beispielsweise
morphologisch. Die Zellen für
die Analyse können
in eine normale Klasse 0 oder in eine von mehreren abnormalen Klassen
1–5 klassifiziert
werden. Die Datenklasse des Objektes wird an ihrer Stelle in der
zugehörigen
Objektdatentabelle im Block A316 gespeichert. Kalibrierobjekte werden
als Typ 0 bzw. normal klassifiziert. Das Programm kehrt dann zum
Block A300 zu rück,
in dem die Bildabtastregister zur Abtastung des Feldes für das nächste Objekt
inkrementiert werden.
-
Wurde
hingegen durch Tastendrücken
eine 9 betätigt,
was im Block A328 getestet wird, so bedeutet dies, dass entweder
ein Kalibrierzellobjekt oder ein laufendes Probezellenobjekt ausgeschlossen
wurde. Damit wird im Block A322 das ausgeschlossene Zellobjekt gegenüber einem
angenommenen bzw. klassifizierten Zellobjekt in unterschiedlicher
Farbe (weiß)
eingefärbt,
wobei das Programm zur Auffindung eines weiteren Objektes im Block
A300 zur Abtastprogrammeingabe zurückkehrt. Die Anfärbung des
Zellobjektes zeigt der Bedienungsperson an, dass das Objekt in diesem
Feld analysiert worden ist, während
das Anfärben
des Objektes in einer anderen Farbe das Objekt von angenommenen
bzw. klassifizierten Zellobjekten unterscheidet.
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Wird
jedoch die Taste CTRL/F1 gedrückt,
was im Block A336 getestet wird, dann möchte die Bedienungsperson den
identifizierenden Kasten zum letzten vorher gemessenen Objekt zu
bewegen. Das Programm fragt dann das Feldraster ab, um den letzten
Objektzeiger im Block A346 aufzufinden. Dieser Zeiger dient zur
Erzeugung des Kastens um das vorhergehende Zellobjekt durch Transformation
der Steuerung auf den Block A313 vor dem neuen Drücken einer
Taste im Block A314. Durch Verwendung einer Serie von CTRL/F1-Tasten
kann die Bedienungsperson den identifizierenden Kasten selektiv
in Rückwärtsrichtung
vom vorher gemessenen Zellobjekt zum vorher gemessenen Zellobjekt
bewegen. Wünscht
die Bedienungsperson nach dem Anordnen des Kastens um ein spezielles
Zellobjekt dieses Zellobjekt erneut zu klassifizieren, hat er die
Möglichkeit,
es mit den Tasten 0–5
im Block A326 zu klassifizieren.
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Der
identifizierende Kasten kann durch Wahl der Taste CTRL/F2 zum nächsten ungemessenen
Zellobjekt bewegt werden. Diese Taste wird im Block A338 getestet,
wobei bei ihrer Auffindung eine unmittelbare Rückkehr der Programmsteuerung
auf die Bildabtasteingabe im Block A300 erfolgt. Der Effekt dieser
Operation besteht darin, der Bedienungsperson das Übersprin gen
des vorhandenen Zellobjektes und die Bewegung des identifizierenden
Kastens auf das nächste
Zellobjekt zu ermöglichen,
ohne dass die vorhandene Zelle abgewiesen oder angenommen wird.
Aufeinanderfolgendes Drücken
von CTRL/F2 bewegt den Kasten durch die Zellen nach vorne, ohne
sie zu messen.
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Erscheinen
sämtliche
Zellobjekte in einem speziellen Feld normal als Probezellen, oder
wie es generell mit Kontrollzellen der Fall ist, so sind sie annehmbar,
wobei die Bedienungsperson möglicherweise wünscht, sie
automatisch zu klassifizieren. Zu diesem Zweck drückt die
Bedienungsperson die Taste CTRL/F3. Dies wird im Block A339 detektiert,
wobei die Steuerung zum Block A341 fortschreitet, in dem ein Automatikbetriebsart-Kennzeichensignal
gesetzt wird. Das Programm kehrt sodann zur Eingabe der Bildabtastung
im Block A300 zurück.
An Stelle des Durchlaufens der normalen Folge der Anordnung eines
Kastens um das nächste
Objekt und des Wartens auf einen Tastendruck, schreitet das Programm
jedoch automatisch fort, um den Rest der Zellen eines Feldes automatisch
zu klassifizieren. Das gesetzte Automatikbetriebsart-Kennzeichensignal
wird im Block A313 abgetastet, wobei das Programm die Steuerung
automatisch auf den Block A316 weiterführt. Automatisch klassifizierte
Zellen werden als normal oder als Typ 0 eingeteilt. Über die
Blöcke A300,
A302, A306, A313, A316, A318 und A320 wird also eine Abtast- und
Kennzeichnungsschleife abgearbeitet, bis die Abtastung des gesamten
Feldes abgeschlossen ist, was im Block A304 erfasst wird.
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Eine
weitere durch die Bedienungsperson wählbare Option ist die Zellschneidfunktion,
welche durch Drücken
der Taste CTRL/F4 eingegeben wird. Diese Taste wird im Block A342
detektiert und überträgt die Steuerung
auf den Zellschneid-Funktionsbetrieb im Block A352. Werden die Tasten
CTRL und F4 gedrückt,
so gibt der Benutzer den Zellschneidbetrieb ein. In diesem Betrieb
kann der Benutzer Schnittlinien innerhalb des identifizierenden
Kastens durchführen.
Die Bedienungsperson kann keine Schnittlinie über einen Bildpunkt führen, welcher
zu einer gemessenen oder ausgeschlossenen Zel le gehört. Eine
gemessene Zelle ist eine Zelle, die als Typ 0, 1, 2, 3, 4 oder 5
klassifiziert worden ist. Um eine Zellschneidoperation durchzuführen, muss eine
numerische Sperre aktiviert werden. An der Stelle, an welcher der
Schnitt stattfinden soll, wird ein Fadenkreuz angeordnet. Die folgende
Tabelle listet die durchführbaren
Zellschneidoperationen sowie die Taste auf, welche gedrückt werden
muss, um die gewünschte
Operation zu wählen.
Die Funktion ermöglicht
die Trennung von sich überlappenden
Zellen durch künstliches
Herstellen eines Umrisses, nämlich
eines Schnittes zwischen den beiden Bereichen. Das Kennzeichnungsprogramm
kennzeichnet daher lediglich einen Bereich als ein Zellobjekt.
(TASTE) | (AKTION) |
0 | Aufspalten
ein- und ausschalten |
1 | Um
einen Schritt abwärts
und nach links gehen |
2 | Um
einen Schritt abwärts
gehen |
3 | Um
einen Schritt abwärts
und nach rechts gehen |
4 | Um
einen Schritt nach links gehen |
5 | Zur
Kastenmitte gehen |
6 | Um
einen Schritt nach rechts gehen |
7 | Um
einen Schritt aufwärts
und nach links gehen |
8 | Um
einen Schritt aufwärts
gehen |
9 | Um
einen Schritt aufwärts
gehen und nach rechts gehen |
ENTER | Letzten
Schritt erneut ausführen
(bis zu 100 Pixel) |
ESC | Austritt
aus dem Zellaufspaltungsmodus |
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Ein
Schritt umfasst drei Bildpunkte. Bei Beginn eines neuen Schnittes
wird der erste Bildpunkt nicht geschnitten. Für die Operation 5 bewegt sich
das Fadenkreuz nicht, wenn der Mittenbildpunkt zu einer gemessenen
oder ausgeschlossenen Zeile gehört.
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Nach
Durchführung
des Zellschneidens im Block A352 werden die Abtastregister auf den
Eingabepunkt des speziellen Objektschnittes gesetzt. Das Programm
kehrt sodann zur Abtasteingabe im Block A300 zurück. Da das Zellobjekt den gleichen
Eingabepunkt jedoch einen unterschiedlichen Umriß hat, kennzeichnet das Kennzeichnungsprogramm
(Block A306) das Zellobjekt als neuen Schnitt.
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Eine
weitere von der Bedienungsperson wählbare Option ist die Auswahl
eines Objektes in einem Feld. Die Wahl dieser Betriebsart erfolgt
durch Drücken
der CTRL/F5-Taste, welche im Block A340 erfasst wird. Eine bestätigende
Verzweigung vom Block A340 überträgt die Steuerung
auf den Block A348, in dem der Wählobjektbetrieb
eingegeben wird.
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Werden
die CTRL- und FS-Taste gedrückt,
so gibt der Benutzer den Wählbetrieb
ein. Zur Durchführung
einer Wähloperation
muss eine numerische Sperre aktiviert werden. Im laufenden Auswahlpunkt
erscheint ein Fadenkreuz. Die folgende Tabelle listet die durchführbaren
Auswahloperationen sowie die Taste auf, die gedrückt werden muss, um die gewünschte Operation
zu wählen.
(TASTE) | (AKTION) |
0 | Fadenkreuz-Bewegungsschrittgröße wählen [5
oder 15] |
1 | Um
einen Schritt abwärts
und nach links gehen |
2 | Um
einen Schritt abwärts
gehen |
3 | Um
einen Schritt abwärts
und nach rechts gehen |
4 | Um
einen Schritt nach links gehen |
5 | Zur
Bildmitte gehen |
6 | Um
einen Schritt nach rechts gehen |
7 | Um
einen Schritt aufwärts
und nach links gehen |
8 | Um
einen Schritt aufwärts
gehen |
9 | Um
einen Schritt aufwärts
und nach rechts gehen |
ESC | Austritt
auf Wählbetrieb |
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Erfolgt
der Austritt aus dem Auswahlmodus, so bewegt sich der Kasten zunächst auf
die erste ungemessene Zeile nach dem Auswahlpunkt. Sind nach dem
Fadenkreuz keine Zellen vorhanden, so geht der Kasten zur nächsten unklassifizierten
Zelle.
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Nachdem
das Objekt durch die oben beschriebene Technik gewählt ist,
werden die Abtasterregister im Block A348 auf den Eingabepunkt dieses
speziellen Objektes gesetzt und das Programm kehrt auf die Abtasteingabe
im Block A300 zurück.
Dadurch wird unter Verwendung der X-,Y-Grenzen der Identifizierungskasten
um das Objekt erzeugt und der Bedienungsperson die Möglichkeit
gegeben, sodann eine weitere Taste zu drücken und weitere Messungen
und Klassifizierungen für
das ausgewählte
Objekt durchzuführen.
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Eine
weitere Funktion wird durch die Taste CTRL/F6 realisiert, welche
im Block A330 getestet wird. Diese Maßnahme gibt einer Bedienungsperson
die Möglichkeit,
den Identifizierungskasten durch Lesen des im Block A324 angezeigten
nächsten
Zellobjektes vorwärtszubewegen
und im Block A313 einen Kasten um das gewählte Objekt zu zeichnen. Die
Taste CTRL/F1, CTRL/F2 ermöglicht
es daher einer Bedienungsperson, eine vorhergehende Zellklassifizierung
durch Vorwärts-
bzw. Rückwärtsschalten
durch die Pointer der vorher gemessenen Zellen schnell zu überprüfen.
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Wird
im Block A332 die Eingabetaste erkannt, so wird die Steuerung des
Programms auf den Block A310 übertragen.
In diesem Block wird das Zellobjektraster (24B)
mit dem vorhandenen Feldraster aktualisiert, um alle für die speziellen
Objekte im Feld gesammelten Daten zu speichern. Andererseits führt die
Erfassung der Austrittstaste das Programm unmittelbar an die Stelle
in der Software zurück,
wo es abgerufen wurde.
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Es
ist ersichtlich, dass die dargestellte Steuerung 22 zur
Durchführung
der Zellklassifikation und der Analyse der optischen Dichte programmiert
ist.
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Eine
derartige Klassifikation und Analyse entspricht den im US-Patent
4,453,266 angegebenen Maßnahmen
für die
Klassifizierung von roten Blutkörperchen,
wobei die vorliegende Erfindung insbesondere bei der Analyse von
roten Blutkörperchen
anwendbar ist, wobei an Stelle des DNA-Gehaltes im oben beschriebenen
Sinne die optische Dichte des Hämoglobingehaltes
gemessen wird. Wie bei der Analyse von roten Blutkörperchen üblich, müssen diese
für die
Bildverstärkung
nicht angefärbt
werden, so dass der Anfärbungseichschritt
für rote
Blutkörperchen
entfallen kann, wenn die in den oben genannten Bacus-Patenten angegebene spezielle
Lichtwellenlänge
zur Anwendung kommt.
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Eine
weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht in einer genauen
Messung von Hämoglobin
in tatsächlichen
Picogramm zur Kalibrierung anderer Instrumente, beispielsweise eines
Coulter-Zählers. In
einem derartigen Prozess besitzen die Kontrollblutzellen 40 einen
bekannten vorgegebenen Hämoglobinwert,
wobei die Probeblutzellen 12 mit unbekanntem Hämoglobinwert
auf den Probebereich 61 gebracht werden. Anschließend wird
die Vorrichtung geeicht, um das Histogramm für den Hämoglobingehalt der Probezellen 12 anzuzeigen.
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Es
ist ferner darauf hinzuweisen, dass die verschiedenen Kalibrierschritte
entfallen oder kombiniert und gleichzeitig durchgeführt werden
können,
statt in der Anordnung und Reihenfolge durchgeführt zu werden, die für die bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung bei der Durchführung
einer DNA-Analyse beschrieben wurden. Die Anwendung der vorliegenden
Erfindung zur Antigenanalyse kann die Schritte des Anbindens von monoklonalen
Antikörpern
an die Probe- und Kontrollzellenobjekte enthalten. Später können die
monoklonalen Antikörper
mit einem Enzym-Färbemittel
gepaart werden. Ferner können
die monoklonalen Antikörper
mit einem fluoreszierenden Material gepaart werden. Danach kann
das fluoreszierende Anfärbemittel
mit einer Wellenlänge
erregt werden, welche die Fluoreszenz anregt, wobei die Probeobjekte
in bezug auf die Wellenlänge, bei
der die Fluoreszenzemission auftritt, mit einer anderen Wellenlänge beobachtet
werden.
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Wird
das Antigen für
einen bestimmten Virus gebildet, so können die Kontrollzellen-Probeobjekte
mit einer für
das Genom des Virus spezifischen Nukleinsäureprobe behandelt werden.
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Obwohl
eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung gezeigt wurde, wird
Fachleuten ersichtlich sein, dass an der Erfindung zahlreiche Modifikationen
und Veränderungen
vorgenommen werden können.
Die Erfindung ist in den angefügten
Ansprüchen
definiert.