DE3509210A1

DE3509210A1 - METHOD FOR THE SCREENING OF CELL CULTURES FOR THE SELECTION OF CERTAIN SUBSTANCES IN SECONDARY CELLS

Info

Publication number: DE3509210A1
Application number: DE19853509210
Authority: DE
Inventors: Paul G. Washington D.C. Abrams; Allan P. Newburyport Mass. Jarvis; George A. Medfield Mass. Koch
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1984-05-24
Filing date: 1985-03-14
Publication date: 1985-11-28
Also published as: GB8428320D0; DK57885D0; IT1179899B; NL8500451A; SE8405105D0; SE8405105L; IT8468287A0; FR2564858A1; JPS60250256A; DK57885A; AU3450684A; GB2159171A; DE3509210C2; IL73344A0; BE902457A

Description

DAMON BIOTECH, INC.DAMON BIOTECH, INC.

Needham Heights, Massachusetts o2194 V.St.A.Needham Heights, Massachusetts o2194 V.St.A.

Verfahren zum Screening von Zellkulturen zur Selektion von bestimmte Substanzen sezernierenden ZellenMethod of screening cell cultures for the selection of certain substances secreting Cells

Die Erfindung betrifft die Selektion von Zellen, die eine bestimmte, angestrebte Substanz sezernieren, aus einer heterogenen Zellpopulation und insbesondere ein einfacheres Screeningverfahren für solche Zellkulturen einschließlich Rekombinant-DNA-und Hybridomverschmelzungsprodukten zur Selektion lebensfähiger Zellen, die die betreffende spezielle Substanz ausscheiden. The invention relates to the selection of cells which secrete a certain, desired substance, from a heterogeneous cell population and in particular a simpler screening method for such cell cultures including recombinant DNA and hybridoma fusion products to select viable cells that secrete the particular substance in question.

Die jüngsten Fortschritte bei der Herstellung und Modifizierung von biologischem Material, beispielsweise beim sog. Genetic Engineering sowie der Erzeugung monoklonaler Antikörper nach dem Hybridomverfahren, führten zu der Notwendigkeit, individuelle Zellen, die bestimmte SubstanzenRecent advances in the production and modification of biological material, for example in so-called genetic engineering and the production of monoclonal antibodies according to the Hybridoma procedures, led to the need individual cells that contain certain substances

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produzieren, identifizieren zu können.to be able to produce, identify.

Bei der Herstellung monoklonaler Antikörper wird beispielsweise eine heterogene Zellkultur, in der auch mindestens eine Zelle vorliegt, welche den betreffenden speziellen Antikörper erzeugt, mit einer immortalen Zellinie, beispielsweise Myelomzellen, verschmolzen. Auch unter den günstigsten Bedingungen ist dieses Verschmelzungsverfahren nur teilweise erfolgreich, da einige Zellen nicht verschmelzen, andere Zellen der Kultur statt mit den Myelomzellen miteinander verschmelzen und auch Verschmelzungen von Myelomzellen untereinander vorkommen. Selbst wenn angenommen wird, daß sämtliche Zellen der Zellkultur mit Myelomzellen verschmelzen, produzieren doch nur wenige Verschmelzungsprodukte die betreffende angestrebte Substanz. Demzufolge besteht Bedarf an einem Screening-Verfahren zur sicheren Selektion bestimmter spezieller Verschmelzungsprodukte. Eines der üblicherweise hierzu verwendeten Screening-Verfahren besteht in der Kultivierung der Zellen aus dem Verschmelzungsgemisch in Mikrotitrierschalen, dem Test der Flüssigkeit jedes Compartments der Mikrotitrierschalen auf die betreffende angestrebte Substanz und der Weiterkultivierung der Zellen jedes Compartments, die ein positives Testergebnis liefern. Bei dieser Verfahrensweise treten allerdings unter anderen folgende Probleme auf: Nach der Abtrennung der Zellen zur Weiterkultivierung besteht das Risiko einer physikalischen Beschädigung der Zellen; die Abtrennung der Zellen ist ferner schwierig durchzuführen.In the production of monoclonal antibodies, for example, a heterogeneous cell culture, in which there is also at least one cell that produces the specific antibody in question, fused to an immortal cell line such as myeloma cells. Even among the cheapest Under these conditions, this fusion process is only partially successful because some cells are not merge, other cells of the culture instead of merging with the myeloma cells and Myeloma cells also fuse with one another. Even if it is assumed that all Cells of the cell culture fuse with myeloma cells, but only produce a few fusion products the target substance in question. Accordingly, there is a need for a screening method for safe selection of certain special merger products. One of the commonly used for this The screening procedure consists in culturing the cells from the fusion mixture in microtiter dishes, test the liquid in each compartment of the microtiter dishes the target substance in question and the further cultivation of the cells of each compartment that contain a deliver a positive test result. In this procedure, however, the following occur among others Problems: After the cells have been separated for further cultivation, there is a risk of physical damage to cells; the separation of the cells is also difficult to carry out.

Hinzu kommt das Risiko einer Kontamination der Kulturen sowie einer Einwirkung von Fremdstoffen, beispielsweise Zellfragmenten und höhermolekularen Verunreinigungen , auf die Spezifität des Tests auf die betreffende angestrebte Substanz. Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, daß bestimmte Zellarten in Mikrotitrierschalen nicht gut kultivierbar sind.There is also the risk of contamination of the cultures and exposure to foreign substances, for example Cell fragments and higher molecular weight impurities, on the specificity of the test on the concerned targeted substance. Another difficulty is that certain types of cells in microtiter dishes are not easy to cultivate.

Auch das Rekombinant-DNA-Verfahren erfordert einen Screening-Schritt zur Selektierung lebensfähiger Rekombinanten. Beim üblichen Standardverfahren zur Rekombinantenerzeugung wird ein Plasmid oder ein anderer Vektor in eine Zelle, normalerweise einen prokaryotischen Organismus, eingeführt. Das Plasmid bzw der Vektor enthält ein Gen, das in die Zelle transscribiert werden kann, die dann die interessierende Substanz erzeugt. Bei der Hybridomtechnik bildet ein erheblicher Prozentsatz der Verschmelzungsprodukte der Plasmide bzw Vektoren mit Zellen keine lebensfähigen Kulturen, aus denen die interessierende Substanz gewonnen werden kann, so daß auch hier ein Screening-Schritt erforderlich ist. Ähnliche Verfahren wie zur Identifizierung von Hybridomzellen sind bei der Rekombinanttechnik üblich, wobei auch ähnliche Probleme und Schwierigkeiten vorliegen.The recombinant DNA method also requires one Screening step to select viable recombinants. The usual standard method for generating recombinants is a plasmid or a another vector introduced into a cell, usually a prokaryotic organism. The plasmid or the vector contains a gene that can be transcribed into the cell, which is then the one of interest Substance created. In the hybridoma technique, a significant percentage of the fusion products form the plasmids or vectors with cells are not viable cultures from which the interesting Substance can be obtained, so that a screening step is required here too. Similar procedures as for the identification of hybridoma cells are common in the recombinant technique, with similar ones There are problems and difficulties.

In der US-PS 4 352 883 ist ein Verfahren zur Einkapselung lebensfähiger Zellen einschließlich Hybridomzellen und genetisch modifizierter Zellen in semipermeablen Membranen angegeben. Nach der Einkapselung sind die Zellen in gesundem, lebensfähigem Zustand und zur Aufrechterhaltung eines normalen Stoffwechsels befähigt, wobei sie die normalerweise sezernierten Substanzen ebenfalls ausscheiden und auch innerhalbIn U.S. Patent 4,352,883 there is a method of encapsulating viable cells including hybridoma cells and genetically modified cells in semipermeable membranes. After encapsulation the cells are in a healthy, viable condition and necessary to maintain a normal metabolism empowered, excreting the normally secreted substances as well and also within

der Kapseln Zellteilung eintreten kann. Jüngste Ergebnisse zeigten, daß die Abmessungen der Poren der Kapselmembranen so kontrolliert bzw eingestellt werden können, daß ein Durchtritt von Zellen und hochmolekularen Verunreinigungen ausgeschlossen ist. Auf diese Weise ist es möglich, die Kapselmembranen als Filtermittel zu verwenden, wodurch die Prüfung auf die angestrebte Substanz erleichtert wird. Das Einkapselungsverfahren der US-PS 4 352 trägt ferner dazu bei, eine mechanische Beschädigung der Zellen zu vermeiden, und vereinfacht die Zellhandhabung. cell division can occur in the capsules. Recent results showed that the dimensions of the pores of the Capsule membranes can be controlled or adjusted so that a passage of cells and high molecular weight impurities is excluded. In this way it is possible to use the capsule membranes to be used as a filter medium, which makes testing for the desired substance easier will. The encapsulation process of U.S. Patent 4,352 also helps prevent mechanical damage of cells and simplifies cell handling.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges Screening-Verfahren zur Identifizierung von Zellen in einer gemischten Zellkultur anzugeben, die eine bestimmte interessierende Substanz ausscheiden. Das Verfahren soll dabei zur Selektion von Hybridomzellen geeignet sein, die einen bestimmten angestrebten monoklonalen Antikörper produzieren. Ferner soll auch die Identifizierung genetisch modifizierter Zellen möglich sein, die eine angestrebte Substanz ausscheiden. Das Verfahren soll die Identifizierung bzw Selektion von eine bestimmte interessierende Substanz produzierenden Hybridomzellen aus einer Zellkultur erlauben, die mindestens eine diese Substanz produzierende Zelle enthält.The invention is based on the object of a novel screening method for identification of cells in a mixed cell culture that secrete a particular substance of interest. The method should be suitable for the selection of hybridoma cells that have a specific produce the desired monoclonal antibody. Furthermore, the identification of genetically modified Cells that secrete a target substance may be possible. The procedure is intended to Identification or selection of hybridoma cells producing a certain substance of interest from a cell culture that contains at least one cell producing this substance.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.The problem is solved according to the claims.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.Advantageous further developments are the subject of the subclaims.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Screening einer Zellkultur zur Selektion von Zellen, die eine angestrebte Substanz sezernieren, ist durch folgende wesentlichen Schritte gekennzeichnet:The inventive method for screening a Cell culture for the selection of cells that secrete a target substance is by the following essential steps:

(A) Einkapseln der Zellen der Zellkultur in einer Vielzahl von Kapseln, die jeweils ein intrakapsuläres Volumen aufweisen, das von einer Membran vorgegeben ist, die für die angestrebte Substanz durchlässig, jedoch für die Zellen undurchlässig ist;(A) Encapsulate the cells of the cell culture in a variety of capsules, each one intracapsular Have volume, which is predetermined by a membrane for the desired Substance is permeable but impermeable to cells;

(B) Einbringen der eingekapselten Zellen in eine Einrichtung mit einer Vielzahl von Compartments, die jeweils ein extrakapsuläres Medium enthalten und auf die die eingekapselten Zellen verteilt werden;(B) placing the encapsulated cells in a facility having a plurality of compartments, each containing an extracapsular medium and onto which the encapsulated cells are distributed;

(C) Ablaufenlassen der Synthese der betreffenden Substanz durch die ausgewählte(n) Zelle(n) und deren Sekretion in das intrakapsuläre Volumen;(C) Allowing the synthesis of the substance in question to proceed through the selected cell (s) and their secretion into the intracapsular volume;

(D) Hindurchtretenlassen der sezernierten Substanz durch die Membran;(D) allowing the secreted substance to pass through the membrane;

(E) Prüfen des extrakapsulären Mediums jedes Compartments auf die sezernierte Substanz und(E) Examine the extracapsular medium of each compartment for the secreted substance and

(F) Wiederholung der Schritte (B) bis (E) mit den Kapseln aus einem Compartment, die in Schritt (E) ein positives Testergebnis ergaben, bis eine die zu selektierende Zelle enthaltende Kapsel identifiziert ist.(F) Repeat steps (B) to (E) with the capsules from a compartment that are in Step (E) gave a positive test result until one of the cells to be selected containing capsule is identified.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizie-The inventive method for identification

rung und Selektion von Zellen, die eine angestrebte Substanz sezernieren, aus einer heterogenen Zellpopulation ist durch folgende wesentlichen Schritte gekennzeichnet:tion and selection of cells that secrete a desired substance from a heterogeneous cell population is characterized by the following essential steps:

(1) Verschmelzen einer Vielzahl von Zellen, unter denen sich mindestens eine Zelle befindet, welche die angestrebte Substanz produziert, mit einer immortalen Zellinie unter Erzeugung einer heterogenen Population von verschmolzenen Zellen;(1) Fusion of a large number of cells, among which there is at least one cell which is the desired substance is produced with an immortal cell line to produce a heterogeneous population of fused cells;

(2) Einkapseln der Population in einer Vielzahl von Kapseln, die jeweils ein intrakapsuläres Volumen aufweisen, das von einer Membran vorgegeben ist, die für die angestrebte Substanz durchlässig, jedoch für die verschmolzenen Zellen undurchlässig ist;(2) Encapsulate the population in a plurality of capsules, each having an intracapsular volume have, which is predetermined by a membrane that is permeable to the desired substance, however is impervious to the fused cells;

(3) Einbringen der eingekapselten Zellen in eine Einrichtung mit einer Vielzahl von Compartments, die jeweils ein extrakapsuläres Medium enthalten, das befähigt ist, die Stoffwechseltätigkeit von die betreffende angestrebte Substanz sezernierenden Zellen zu unterhalten;(3) Place the encapsulated cells in a multi-compartment facility containing the each contain an extracapsular medium that is capable of the metabolic activity of the to maintain target substance secreting cells in question;

(4) Ablaufenlassen der Synthese der betreffenden Substanz durch die ausgewählte(n) Zelle(n) und deren Sekretion in das intrakapsuläre Volumen;(4) Allowing the synthesis of the substance in question to proceed through the selected cell (s) and theirs Secretion into the intracapsular volume;

(5) Hindurchtretenlassen der sezernierten Substanz durch die Membran;(5) allowing the secreted substance to pass through the membrane;

(6) Prüfen des extrakapsulären Medium jedes Compartments auf die sezernierte Substanz und(6) Examine the extracapsular medium of each compartment for the secreted substance and

(7) Wiederholung der Schritte (3) bis (6) mit den Kapseln aus einem Compartment, die in Schritt (6)(7) Repeat steps (3) to (6) with the capsules from a compartment, which were used in step (6)

ein positives Testergebnis ergeben, bis eine die zu selektierende Zelle enthaltende Kapsel identifiziert ist.give a positive test result until a capsule containing the cell to be selected is identified is.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Screening bzw zur Identifizierung einer ausgewählten Zelle, die eine interessierende Substanz sezerniert, beruht auf der Einkapselung einer heterogenen Zellkultur, die eine Vielzahl von Zellen enthält, in einer Vielzahl von Kapseln. Die Zellkultur kann eine beliebige Kultur darstellen, die mindestens eine Zelle enthält, welche die interessierende Substanz sezerniert_} beispielsweise Hybridomzellen, die durch Verschmelzung eines Lymphocyten mit einer immortalen Zellinie wie etwa Myelomzellen erzeugt wurden, oder genetisch modifizierte Zellen wie etwa Verschmelzungsprodukte einer prokaryotischen Zelle mit einem Vektor, der ein Gen enthält, das die Produktion der speziellen Substanz durch intrazelluläre Transskfiption codiert. Die Kapseln besitzen ein von einer Membran vorgegebenes intrakapsuläres Volumen, die für die Substanz durchlässig ist, nicht jedoch für die Zellen. Die Membran kann ferner auch so ausgelegt sein, daß sie den Durchtritt von Molekülen mit einer Molekülmasse oberhalb eines bestimmten Werts verhindert. Im Fall von Hybridomzellen werden die Zellen in einer Dichte eingekapselt, daß nicht mehr als eine Hybridomzelle pro Kapsel vorliegt; in diesem Fall kann dann ein einziger Klon erhalten werden.The method according to the invention for screening or identifying a selected cell which secretes a substance of interest is based on the encapsulation of a heterogeneous cell culture which contains a large number of cells in a large number of capsules. The cell culture can be any culture that contains at least one cell that secretes the substance of interest _} for example hybridoma cells created by the fusion of a lymphocyte with an immortal cell line such as myeloma cells, or genetically modified cells such as fusion products of a prokaryotic cell with a Vector containing a gene that codes for the production of the specific substance by intracellular transcription. The capsules have an intracapsular volume which is predetermined by a membrane and which is permeable to the substance, but not to the cells. The membrane can also be designed in such a way that it prevents the passage of molecules with a molecular mass above a certain value. In the case of hybridoma cells, the cells are encapsulated at a density such that there is no more than one hybridoma cell per capsule; in this case a single clone can then be obtained.

Die eingekapselten Zellen werden in einer Vorrichtung mit einer Vielzahl von Compartments kultiviert, wobei jedes Compartment ein extrakapsuläres Medium, vorzugsweise ein differentielles Kulturmedium, enthält. Die auszuwählende Zelle synthetisiert und sezerniert die betreffende Substanz in das intrakapsuläre Volumen, die wiederum durch die Membran hindurch in das extrakapsuläre Medium hinein austritt. Das extrakapsuläre Medium jedes Compartments wird auf die betreffende Substanz hin geprüft, wobei das Verfahren mit den Kapseln derjenigen Compartments wiederholt wird, die bei der Prüfung auf die betreffende Substanz ein positives Testergebnis liefern, bis die zu selektierende Zelle identifiziert ist. Die Compartments sind vorzugsweise Vertiefungen, beispielsweise von Mikrotitrierplatten oder -schalen, die das extrakapsuläre Medium und die Kapseln aufnehmen können. Im Fall von Hybridomzellen erleichtert die Möglichkeit, aus dem erhaltenen Verschmelzungsprodukt einen Klon erzeugen zu können, den Screening-Schritt, da keine Kapsel mehr als eine einzige Hybridomzelle enthält, wobei zugleich die Isolierung stabiler, Antikörper ausscheidender Hybridomzellen erheblich beschleunigt wird.The encapsulated cells are placed in a device cultivated with a large number of compartments, each compartment being an extracapsular medium, preferably a differential culture medium. The cell to be selected synthesizes and secretes the substance in question into the intracapsular volume, which in turn passes through the membrane exits through into the extracapsular medium. The extracapsular medium of each compartment is tested for the substance in question, the procedure using the capsules of those compartments repeats the test result that is positive when testing for the substance in question deliver until the cell to be selected is identified. The compartments are preferably wells, for example of microtitration plates or dishes that contain the extracapsular medium and the capsules can hold. In the case of hybridoma cells facilitates the possibility of getting out of the Fusion product to generate a clone, the screening step, since there is no longer a capsule as a single hybridoma cell, while isolating more stable, antibody-secreting Hybridoma cells is accelerated considerably.

Die nach dieser Verfahrensweise identifizierten Kapseln können ihrerseits als Immunisierungsmittel verwendet werden, wobei die Kapseln in ein Versuchstier injiziert werden können, das dann Antikörper gegen die ausgeschiedene Substanz erzeugt.Those identified by this procedure Capsules, in turn, can be used as immunization agents, with the capsules in an experimental animal can be injected, which then generates antibodies against the excreted substance.

Die identifizierten Kapseln können ferner auch in ein Wirtstier implantiert werden, beispiels-The identified capsules can also also be implanted in a host animal, for example

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weise in den Peritonealraum von Mäusen. Die sezernierte Substanz kann dann von der Implantationsstelle, vorzugsweise aus der vom Wirtstier aufgrund seiner Immunantwort auf die Implantation erzeugten Flüssigkeit, gewonnen werden.wise into the peritoneal space of mice. The secreted substance can then be removed from the implantation site, preferably obtained from the fluid produced by the host animal due to its immune response to the implantation will.

Das sehr breit anwendbare Erfindungskonzept erlaubt das Screening von Zellkulturen zur Selektion bestimmter Zellen, die eine interessierende Substanz sezernieren. Die Verfahrensweise eignet sich besonders in der Hybridomtechnik, da die Verschmelzungsprodukte von Lymphocyten mit einer immortalen Zellinie, beispielsweise Myelomzellen, einem Screening-Schritt unterworfen werden müssen, um festzustellen, welche der Zellen den betreffenden interessierenden monoklonalen Antikörper produziert. Die erfindungsgemäße Verfahrensweise eignet sich ebenso auch günstig für das Rekombinant-DNA-Verfahren. Aufgrund der Erfindungskonzeption kann das Screening in einer einfacheren, weniger schädlichen Weise als bei herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner besonders günstig zur Identifizierung von eine bestimmte Substanz erzeugenden Zellen anwendbar, die von einer örtlichen bzw räumlichen Festlegung abhängig sind.The very broadly applicable concept of the invention allows cell cultures to be screened for selection certain cells that secrete a substance of interest. The procedure is particularly suitable in hybridoma technology, as the products of fusion of lymphocytes with an immortal cell line, for example Myeloma cells need to be screened to determine which the cells produce the monoclonal antibody of interest. The procedure according to the invention is also suitable for the recombinant DNA method. Due to the concept of the invention, the screening can be carried out in a simpler, in a less harmful manner than traditional procedures. The method according to the invention is also particularly useful for identifying cells that produce a particular substance applicable, which are dependent on a local or spatial definition.

Zuerst wird eine heterogene Zellkultur hergestellt, welche die zu selektierende(n) Zelle(n) enthält. Eine zuvor hergestellte Zellkultur, beispielsweise eine Kultur von Hybridomzellen oder einer genetisch modifizierten Zellinie, kann verwendet werden; alternativ kann auch eine jeweils speziell für das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Kultur eingesetzt werden. Ein übliches VerfahrenFirst, a heterogeneous cell culture is produced which contains the cell (s) to be selected. A previously produced cell culture, for example a culture of hybridoma cells or a genetically modified cell line, can be used; alternatively, a special culture produced for the process according to the invention can be used. A common practice

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zur Erzeugung von Hybridomzellen (vgl G. Kohler und C. Milstein, Continuous Culture of Fused Cells Secreting Antibody of Predetermined Specificity, Nature 256 (1975) 495) geht beispielsweise von einer Kultur, zB von Lymphocyten aus Milz, aus, bei der zumindest einige Zellen die interessierende Substanz produzieren. Die Kultur wird dann nach herkömmlichen Verfahren in Einzelzellen aufgeteilt, beispielsweise durch Durchpassieren der Milz durch ein Drahtnetz. Die Zellen werden dann mit Zellen einer immortalen Zellinie zusammengemischt, beispielsweise Myelomzellen, worauf etwa durch Verschmelzung unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) Hybridomzellen erzeugt werden. Im einzelnen werden die Lymphocyten und Myelomzellen in einem Verschmelzungsmedium inkubiert, beispielsweise modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) nach Dulbecco, dem etwa 40 % PEG zugesetzt werden. Die Zellen werden dann aus der PEG-Lösung entnommen und vor dem Screening-Schritt zu einer Kultur wachsen gelassen. Die Myelomzellen sind hierbei vorzugsweise antibiotikumsempfindlich bzw erfordern Zusätze zum Medium, so daß ein differentielles Wachstumsmedium, beispielsweise ein Medium, das Wirkstoffe enthält, die nicht verschmolzene Zellen abtöten, als Trenneinrichtung herangezogen werden kann. Nach der Identifizierung lebensfähiger Hybridomzellen kann ein weiterer Screening-Schritt erforderlich sein, um festzustellen, ob diese Zellen die interessierende Substanz produzieren.for the generation of hybridoma cells (cf. G. Kohler and C. Milstein, Continuous Culture of Fused Cells Secreting Antibody of Predetermined Specificity, Nature 256 (1975) 495) is based, for example, on a culture, for example of lymphocytes from the spleen, in which at least some Cells produce the substance of interest. The culture is then divided into individual cells by conventional methods, for example by passing the spleen through a wire mesh. The cells are then mixed together with cells of an immortal cell line, such as myeloma cells, whereupon hybridoma cells are produced such as by fusion using polyethylene glycol (PEG). Specifically, the lymphocytes and myeloma cells are incubated in a fusion medium, for example Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) to which about 40 % PEG is added. The cells are then removed from the PEG solution and grown into culture prior to the screening step. The myeloma cells are preferably sensitive to antibiotics or require additives to the medium, so that a differential growth medium, for example a medium that contains active substances that kill non-fused cells, can be used as a separating device. Once viable hybridoma cells have been identified, an additional screening step may be required to determine whether these cells are producing the substance of interest.

Wenn genetisch modifizierte Zellen selektiert werden sollen, kann zu ihrer Herstellung nach dem Verfahren von F. Bolivar et al., Construction andIf genetically modified cells are to be selected, they can be produced according to the Method of F. Bolivar et al., Construction and

Characterization of New Cloning Vehicles, II, a multipurpose cloning system, gene 2^ (1977) 95-113, verfahren werden. Hierbei wird ein Plasmid oder ein Vektor unter Verwendung von Restriktionsenzymen in eine Zelle eingeführt, die dann nach üblichen Verfahren kultiviert wird. Das Plasmid bzw der Vektor enthalten ein Gen, das durch die Zelle transscribiert werden kann, die dann die interessierende Substanz produziert. Wie im Fall von Hybridomzellen ist auch hier die Verwendung eines differentiellen Wachstumsmediums für die Zellselektion günstig. Das Plasmid mit dem Gen, das die interessierende Substanz codiert, kann beispielsweise ferner ein Gen enthalten, das eine Differenzierung des Verschmelzungsprodukts von nicht verschmolzenen Produkten erlaubt; so kann das Plasmid beispielsweise bei gegen Rifamycin empfindlichen Zellen Rifamycinresistenz hervorrufen, wodurch die Verwendung eines Rifamycin enthaltenden differentiellen Wachstumsmediums beim Screening-Schritt ermöglicht wird.Characterization of New Cloning Vehicles, II, a multipurpose cloning system, gene 2 ^ (1977) 95-113. Here, a plasmid or a vector is made using Restriction enzymes are introduced into a cell, which is then cultured by conventional methods. The plasmid or the vector contain a gene that can be transcribed through the cell then produces the substance of interest. As in the case of hybridoma cells, this is also the case here Use of a differential growth medium for cell selection is favorable. The plasmid with the gene encoding the substance of interest may also contain, for example, a gene which allows differentiation of the merger product from non-merged products; so For example, the plasmid can induce rifamycin resistance in cells sensitive to rifamycin, whereby the use of a differential growth medium containing rifamycin in the screening step is made possible.

Nach der Erzeugung der Zellkolonie werden die Zellen eingekapselt. Hierzu wird das oben angegebene allgemeine Verfahren der US-PS 4 352 883 bevorzugt. Die Abmessungen der Poren der Mikrokapseln können bei dieser Verfahrensweise kontrolliert und eingestellt werden. Es ist dementsprechend möglich, Zellen einzukapseln, die sowohl IgG (Molekülmasse etwa 160.000) als auch IgM (Molekülmasse etwa 900.000) in die Kapseln hinein sezernieren, wobei das IgG frei durch die Membranporen hindurchtreten kann, während der Durchtritt von IgM im wesentlichen verhindert wird. Die Kapselmembran wirkt dabei alsAfter the cell colony has been created, the cells are encapsulated. For this purpose, the above is used general procedures of U.S. Patent 4,352,883 are preferred. The dimensions of the pores of the microcapsules can can be checked and adjusted in this procedure. It is accordingly possible Encapsulate cells that contain both IgG (molecular weight about 160,000) and IgM (molecular weight about 900,000) into the capsules, with the IgG passing freely through the membrane pores while the passage of IgM is substantially prevented. The capsule membrane acts as a

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Filter und verhindert den Durchtritt von Zellen bzw von hochmolekularen Verunreinigungen und Zellen.Filters and prevents the passage of cells or high molecular weight impurities and cells.

Wie oben angegeben, wird die Einkapselung vorzugsweise nach dem Verfahren der US-PS 352 883 durchgeführt. Hierbei wird die Zellkultur zunächst in bekannter Weise in eine fein verteilte Form gebracht und in einem wäßrigen Medium suspendiert, das sich zur Unterhaltung und Aufrechterhaltung der Stoffwechselprozesse eignet. Geeignete derartige Medien sind beispielsweise PBS (Ca/Mg-frei) nach Dulbecco, wie dem Fachmann geläufig ist. Eine wasserlösliche Substanz, die mit den Zellen physiologisch verträglich ist und die unter Ausbildung einer formbeständigen, zusammenhängenden temporären Kapsel oder gelierten Masse wasserunlöslich gemacht werden kann, wird dann dem Medium zugesetzt. Die resultierende Lösung wird anschließend in Tröpfchen übergeführt, welche die Zellen zusammen mit ihrem Wachstumsmedium enthalten; diese Tröpfchen werden unmittelbar darauf unter Ausbildung der temporären Kapseln wasserunlöslich gemacht. Das gelierbare Material kann ein nichttoxisches, wasserlösliches Material sein, das durch Temperaturänderung, pH-Änderung oder Änderung der Ionenumgebung wasserunlöslich gemacht werden kann, ohne daß hierdurch die Stoffwechselprozesse der Zellen nachteilig beeinflußt werden. Das gelierbare Material enthält vorzugsweise eine Vielzahl leicht ionisierbarer Gruppen, beispielsweise Carboxyl- oder Aminogruppen, die mit Polymeren, welche eine Vielzahl von Gruppen entgegengesetzter Ladung enthalten, unter Ausbildung von Salzbindungen reagieren können.As indicated above, encapsulation is preferably carried out according to the method of U.S. Patent 352 883 carried out. Here, the cell culture is first divided into a finely divided one in a known manner Formed and suspended in an aqueous medium, which is useful for entertainment and maintenance the metabolic processes are suitable. Suitable media of this type are, for example, PBS (Ca / Mg-free) according to Dulbecco, as is familiar to the person skilled in the art. A water-soluble substance that interacts with cells physiologically is compatible and the formation of a dimensionally stable, coherent temporary Capsule or gelled mass which can be made water-insoluble is then added to the medium. the resulting solution is then converted into droplets, which the cells together with their Contain growth medium; these droplets are immediately followed by the formation of the temporary Capsules made water-insoluble. The gellable material can be a non-toxic, water-soluble Material that becomes insoluble in water due to a change in temperature, a change in pH or a change in the ionic environment can be made without adversely affecting the metabolic processes of the cells will. The gellable material preferably includes a plurality of readily ionizable ones Groups, for example carboxyl or amino groups, associated with polymers containing a variety of groups Contain opposite charge, can react with the formation of salt bonds.

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Gegenwärtig bevorzugte gelierbare Materialien sind natürliche oder synthetische Polysaccharide und vorzugsweise Natriumalginat. Andere erfindungsgemäß günstig verwendbare Polysaccharide sind saure Fraktionen von Guargummi, Gummi arabicum, Carrageenan, Pectin, Traganthgummi und Xanthangummi. Diese Materialien können durch Umsetzung mit Kationen unter Ausbildung formbeständiger Massen 'vernetzt' und durch Abtrennung der vernetzenden Ionen durch Ionenaustausch oder Komplexbildung wieder in Lösung gebracht werden.Currently preferred gellable materials are natural or synthetic polysaccharides and preferably sodium alginate. Other polysaccharides which can be used favorably according to the invention are acidic Fractions of guar gum, gum arabic, carrageenan, pectin, tragacanth gum and xanthan gum. These materials can be 'cross-linked' by reaction with cations with the formation of dimensionally stable masses and by separating the crosslinking ions back into solution by ion exchange or complex formation to be brought.

Eine günstig verwendbare gelierbare Lösung enthält etwa 10 Zellen/ml in einer 1,0 bis 1,5-Hgen (G/V) Natriumalginatlösung.- Die Lösung wird anschließend in Tröpfchenform übergeführt, beispielsweise durch Hindurchdrücken der Lösung durch eine Vorrichtung mit einem Düsenkopf. Diese Vorrichtung besteht aus einem Gehäuse einer oberen Lufteinlaßdüse und einem länglichen Hohlkörper, der mit gleitender Reibung in einem Stopfen eingepaßt ist. Eine Injektionsspritze, beispielsweise eine 1O-ml-Spritze, die mit einer Schrittpumpe verbunden ist, ist oberhalb des Gehäuses vorgesehen, deren Nadel, beispielsweise eine mit Polytetrafluorethylen beschichtete Nadel von 0,25 mm Innendurchmesser, durch die gesamte Länge des Gehäuses hindurchgeht. Das Innere des Gehäuses ist so ausgebildet, daß die Spitze der Nadel einer konstanten laminaren Luftströmung ausgesetzt ist, die als Zerstäuber wirkt. Bei der Anwendung wird die Schrittpumpe betätigt, die inkrementweise aus der oberhalb des Gehäuses angeordneten Spritze, die mit der das einzukapselnde Material enthaltenden Lösung gefüllt ist, LösungströpfchenA gellable solution which can be used favorably contains about 10 cells / ml in a 1.0 to 1.5 Hgen (W / V) sodium alginate solution.- The solution is then converted into droplets, for example by forcing the solution through a device with a nozzle head. This device consists from a housing of an upper air inlet nozzle and an elongated hollow body, which is with sliding Friction is fitted in a plug. A syringe for injection, such as a 10 ml syringe that contains is connected to a step pump, is provided above the housing, the needle, for example a polytetrafluoroethylene coated needle 0.25 mm inside diameter, through the entire Length of the housing. The interior of the housing is designed so that the tip of the Needle is exposed to a constant laminar flow of air that acts as a nebulizer. In the application the step pump is actuated, incrementally from the pump located above the housing Syringe filled with the solution containing the material to be encapsulated, solution droplets

''original, inspected'' original, inspected

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herausdrückt, die an der Nadelspitze erscheinen. Die Tröpfchen werden jeweils vom Luftstrom 'abgeschnitten' und fallen etwa 2,5 bis 3,5 cm tief in eine Gelierungslösung, in der sie durch Absorption vernetzender Ionen unmittelbar in den Gelzustand übergehen. Vorzugsweise wird als Gelierungslösung eine Calciumionen enthaltende Lösung eingesetzt, beispielsweise eine Kochsalzlösung mit 1,2 % (G/V) Calciumchlorid. Der Abstand zwischen der Nadelspitze und der Oberfläche der CaCl^-Lösung ist groß genug, daß die Natriumalginat-Zellsuspension die physikalisch günstigste Form anzunehmen vermag, nämlich die Form einer Kugel, dh maximales Volumen bei minimaler Oberfläche. Die Luft im Rohr bläst durch eine Öffnung im Stopfen. Die gelierten, formbeständigen, aus kugelförmigen Teilchen bestehenden Massen bzw temporären Kapseln, die vorzugsweise einen Durchmesser von 50 μπι bis zu einigen mm aufweisen, sammeln sich in der Lösung als separate Phase an und können beispielsweise durch Absaugen abgetrennt werden.that appear at the tip of the needle. The droplets are each 'cut off' by the air stream and fall about 2.5 to 3.5 cm deep into a gelling solution, in which they immediately turn into a gel state through the absorption of crosslinking ions. A solution containing calcium ions is preferably used as the gelling solution, for example a saline solution with 1.2 % (w / v) calcium chloride. The distance between the tip of the needle and the surface of the CaCl ^ solution is large enough that the sodium alginate cell suspension can take on the physically most favorable shape, namely the shape of a sphere, ie maximum volume with minimal surface. The air in the tube blows through an opening in the stopper. The gelled, dimensionally stable masses or temporary capsules consisting of spherical particles, which preferably have a diameter of 50 μm to a few mm, collect in the solution as a separate phase and can be separated off, for example by suction.

wird
Im nächsten Schritt/um jede temporäre Kapselwill
In the next step / around each temporary capsule

herum durch Vernetzung von Oberflächenschichten der temporären Kapseln eine permanente Membran ausgebildet. Zur Vernetzung der gelierten Massen wird hierbei vorzugsweise eine wäßrige Lösung eines Polymers mit einer Vielzahl von Gruppen entgegengesetzter Ladung verwendet. Wenn carboxylgruppenhaltige oder andere saure Polysaccharide zur Erzeugung der temporären Kapseln verwendet werden, eignen sich polykationische Materialien, die mit sauren Gruppen reaktive Gruppen enthalten, beispielsweise Amine, Imine oder Amide,a permanent membrane is formed around it by crosslinking surface layers of the temporary capsules. In order to crosslink the gelled masses, an aqueous solution of a polymer is preferably used used in a variety of groups of opposite charge. When containing carboxyl groups or others If acidic polysaccharides are used to produce the temporary capsules, polycationic ones are suitable Materials that contain groups reactive with acidic groups, for example amines, imines or amides,

ORIGINAL KS7ORIGINAL KS7

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günstig als Vernetzungsmittel. Derzeit bevorzugte polykationische Materialien sind beispielsweise Polylysin, Polyethylenimin und Polyvinylamin. Die polykationischen Materialien reagieren mit den Säuregruppen am polyanionischen Material der gelierten Masse unter Ausbildung von Vernetzungen über Salzbindungen. Je nach dem verwendeten System kann es bevorzugt sein, die durch diese Reaktion gebildeten permanenten Kapseln mit einer Lösung einer Substanz umzusetzen, mit der freie kationische Gruppen besetzt werden können, beispielsweise durch Umsetzung der Kapseln mit einer Natriumalginatlösung niederer Konzentration.beneficial as a crosslinking agent. Currently preferred polycationic Materials are, for example, polylysine, polyethyleneimine and polyvinylamine. The polycationic Materials react with the acid groups on the polyanionic material of the gelled mass with formation of crosslinking via salt bonds. Depending on the system used, it may be preferred that the permanent capsules formed by this reaction to react with a solution of a substance with which Free cationic groups can be occupied, for example by reacting the capsules with a Low concentration sodium alginate solution.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Kapseln besitzen Membranen, deren Permeabilität so eingestellt ist, daß die erforderliche Filterfunktion entsprechend der Molekülmasse vorliegt, damit die interessierende Substanz die Membran passieren kann, während Verunreinigungen mit höherer Molekülmasse sowie Zellen innerhalb der Membran zurückgehalten werden. Wie oben erwähnt, können die Kapseln so ausgebildet werden, daß sie den freien Durchtritt von IgG erlauben, IgM jedoch im wesentlichen zurückhalten. Zur Unterstützung der Kontrolle und Einstellung der Porenabmessungen wurden zwei neue Verfahren angegeben, von denen das eine auf dem Aufbau mehrerer Schichten und das andere auf einem Hydratationseffekt beruhen. Beim ersten Verfahren werden die gelierten Kügelchen in polykationische Lösungen unterschiedlicher Ionenstärke oder unterschiedlicher Konzentration eingebracht. Die um die gelierten Kügelchen herum abgeschiedenen Materialschichten bilden dann eine Vielfachschichtstruktur. So können die temporären Kapseln beispielsweise in eineThe capsules used according to the invention have membranes whose permeability is adjusted in this way is that the necessary filter function is present in accordance with the molecular weight, so that the one of interest Substance can pass the membrane while higher molecular weight contaminants as well as cells be retained within the membrane. As mentioned above, the capsules can be designed so that they allow the free passage of IgG, but essentially hold back IgM. For support the control and adjustment of the pore dimensions, two new methods of which the one based on the build-up of several layers and the other based on a hydration effect. With the first procedure the gelled beads are converted into polycationic solutions of different ionic strength or different Concentration brought in. The layers of material deposited around the gelled beads then form a multilayer structure. For example, the temporary capsules can be in a

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Lösung von hochmolekularem Polylysin und anschließend in eine Lösung von niedermolekularem Polylysin oder PoIyvinylamin eingebracht werden. Der Kontakt mit der zweiten Lösung dient zur Ausbildung einer zweiten Membran, wodurch die Porengröße verringert wird.Solution of high molecular weight polylysine and then in a solution of low molecular weight polylysine or polyvinylamine be introduced. Contact with the second solution is used to form a second one Membrane, which reduces the pore size.

Beim zweiten Verfahren zur Kontrolle der Porenabmessung wird von der Feststellung Gebrauch gemacht, daß Alginatgele je nach ihrem Hydratationsgrad unterschiedliches Volumen aufweisen,wobei der Hydratationsgrad wiederum von der Ionenstärke der Metallionenlösung abhängt, in der diese Verbindungen in ein Hydratationsgleichgewicht gebracht werden. Um eine expandierte Alginatgelmasse herum gebildete Membranen sind gleichmäßiger als Membranen, die um nicht expandierte Gelmassen herum erzeugt wurden. Dieses Phänomen führte zusammen mit der Feststellung, daß um dichte Gele herum gebildete Membranen in der Regel intakt bleiben, wenn das Gel expandiert wird, zu einem Verfahren zur Vergrößerung der Porenabmessungen und zur Erzeugung verbesserter Membranen. So kann beispielsweise eine Membran mit einer Porengröße, die einer Molekülmasse von etwa 200.000 entspricht (dh ausreichend zur Freisetzung von IgG unter Zurückhaltung von IgM) unter Verwendung eines polykationischen Vernetzungsmittels mittlerer Molekülmasse um ein Zellen enthaltendes Gel hoher Dichte nach Gleichgewichtseinstellung und Expandieren der gelierten Massen mit einem einwertigen Kation bei niederer Ionenstärke hergestellt werden. Die Lösung der einwertigen Kationen führt zur Entfernung der Calciumionen und erhöht den Hydratationsgrad des Gels, was wiederum zur Vergrößerung der Poren führt.The second method of checking the pore size makes use of the determination that that alginate gels have different volumes depending on their degree of hydration, the degree of hydration in turn depending on the ionic strength of the metal ion solution depends in which these compounds are brought into hydration equilibrium. To a Membranes formed around expanded alginate gel mass are more uniform than membranes that are not expanded gel masses were created around. This phenomenon led to the finding that Membranes formed around dense gels usually remain intact when the gel is expanded into one Process for increasing pore dimensions and producing improved membranes. For example a membrane with a pore size corresponding to a molecular weight of about 200,000 (i.e. sufficient to release IgG with retention of IgM) using a polycationic Medium molecular weight crosslinking agent around a high density gel containing cells after equilibration and expansion of the gelled masses with a monovalent cation at low ionic strength. The solution of the monovalent Cations lead to the removal of the calcium ions and increase the degree of hydration of the gel, which in turn leads to the enlargement of the pores.

ORiSINAL INGrECTORiSINAL INGrECT

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Obgleich die oben genannten Verfahren zu einer Verbesserung der Permeabilitätskontrolle von Membranen führen, besitzen nach diesen Verfahren hergestellte Membranen keine scharfe Ausschlußgrenze für bestimmte Molekül massen. Die Poren jeder einzelnen Membran besitzen wechselnde Größe und führen daher nicht zum absoluten Ausschluß des Durchtritts von Molekülen mit hoher Molekülmasse. Der Durchtritt dieser Moleküle durch solche Membranen ist allerdings so langsam, daß er durch die Membranen praktisch ausgeschlossen ist. Dabei wird angenommen, daß die Poren durch die Zwischenräume zwischen den vernetzten Materialien, aus denen die Membranen aufgebaut sind, vorgegebene gekrümmte Gänge darstellen. Moleküle mit hoher Molekülmasse und daher einem höheren effektiven Volumen unterliegen einer größeren Zahl von Zusammenstößen mit der Membranstruktur, was ihren Durchtritt durch die Membran behindert. Sämtliche hier angegebenen quantitativen Permeabilitätsdaten beruhen auf empirischer Beobachtung der Diffusion von Molekülen bekannter Molekülmasse durch die Membran hindurch.Although the above methods improve the permeability control of membranes, Membranes produced by this process do not have a sharp exclusion limit for certain molecular masses. The pores of each individual membrane vary in size and therefore do not lead to an absolute Exclusion of the passage of molecules with a high molecular weight. The passage of these molecules through however, such a membrane is so slow that it is practically excluded by the membranes. It is assumed that the pores through the spaces between the crosslinked materials which the membranes are constructed represent predetermined curved passages. High molecular weight molecules and therefore subject to a greater number of collisions with a higher effective volume the membrane structure, which hinders their passage through the membrane. All of the quantitative ones given here Permeability data are based on empirical observation of the diffusion of molecules of known molecular mass through the membrane.

Die eingekapselten Zellen werden dann einige Tage in einem Wachstumsmedium kultiviert und danach in eine Screening-Einrichtung gebracht, die eine Vielzahl von Compartments aufweist, beispielsweise auf eine Mikrotitrierplatte mit 96 Vertiefungen oder etwa auf Weichagar. Vorzugsweise werden etwa 10 bis 100 Kapseln in jedes Compartment eingebracht. Die die betreffende angestrebte Substanz erzeugenden Zellen synthetisieren und sezernieren diese Substanz, die durch die Kapselmembran hindurch in das extrakapsuläre Medium hinein austritt. DasThe encapsulated cells are then cultured in a growth medium for a few days and thereafter brought into a screening facility that has a plurality of compartments, for example on a microtitration plate with 96 wells or on soft agar. Preferably about 10 to 100 capsules placed in each compartment. The target substance in question Generating cells synthesize and secrete this substance, which passes through the capsule membrane exits into the extracapsular medium. That

KSFECTEDKSFECTED

extrakapsuläre Medium jedes Compartments wird dann nach üblichen Verfahren, beispielsweise durch RIA oder Enzymassay,auf die betreffende Substanz geprüft. Das Verfahren kann mit Kapseln von jedem Compartment wiederholt werden, bei dem sich ein positives Testergebnis ergab, bis die selektierte Zelle identifiziert ist. Wenn möglich sollte der Wiederholungsschritt bei einer Kapseldichte von einer Kapsel pro Vertiefung erfolgen. Bei dieser Kapseldichte folgt aus einem positiven Testergebnis, daß die betreffende eingekapselte Zelle, welche die interessierende Substanz sezerniert, sich in der Mikrokapsel befindet.extracapsular medium of each compartment is then applied by conventional methods, for example by RIA, or enzyme assay, checked for the substance in question. The procedure can be done with capsules from anyone Compartment that gave a positive test result can be repeated until the selected Cell is identified. If possible, repeat the step with a capsule density of one capsule per well. With this capsule density, it follows from a positive test result that the encapsulated cell in question, which secretes the substance of interest, is in the microcapsule is located.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.The invention is explained in more detail below using an exemplary embodiment.

example

Durch Verschmelzung von Milzzellen von mit Azotobacter-Nitrogenase immunisierten Mäusen (BALB/c-Mäusen) nach dem Polyethylenglycolverfahren mit einer Myelomzellinie von BALB/c-Mäusen (GM 3570) wurde eine Zellinie erzeugt, die IgG-Antikörper gegen Azotobacter-Nitrogenase produzierte. Die Myelomzellinie, die kein IgG produziert, stammte vom Human Genetic Mutant Cell Repository.By fusing spleen cells from mice immunized with Azotobacter nitrogenase (BALB / c mice) using the polyethylene glycol method with a myeloma cell line from BALB / c mice (GM 3570) a cell line was generated that produced IgG antibodies to Azotobacter nitrogenase. the Myeloma cell line not producing IgG was obtained from the Human Genetic Mutant Cell Repository.

Die BALB/c-Hybridomzellen (Bezeichnung C25) wurden in einer 150 mM Natriumchloridlösung mit 1,34 I (G/V) Natriumalginat (NaG-Kelco) suspendiert. Die viskose Suspension wurde in eine 1O-ml-Spritze aufgezogen und dann auf den Düsenkopf der oben be-The BALB / c hybridoma cells (designation C25) were in a 150 mM sodium chloride solution with 1.34 I (w / v) sodium alginate (NaG-Kelco) suspended. The viscous suspension was poured into a 10 ml syringe pulled up and then on the nozzle head of the above

schriebenen Tropfenerzeugungsvorrichtung aufgesetzt. Die Tröpfchen wurden durch Inkontaktbringen mit einer 150 mM Natriumchloridlösung mit 1,2 I (G/V) Calciumchlorid in Gelform übergeführt. Die gelierten Kügelchen bildeten eine separate Phase und wurden durch Absaugen gewonnen. Die gelierten Kügelchen wurden dann dreimal mit 150 mM Natriumchloridlösung gewaschen und danach 6 min bei Raumtemperatur in einer Lösung von Poly-L-lysin (Sigma, Molekülmasse 65.000) einer Konzentration von 1 ,875 mg/ml inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kapseln mit 25 ml 5 mM CHES-Puffer (2-N-Cyclohexylaminoethansulfonsäure_}Sigma ) in 150 mM Natriumchloridlösung mit 0,2 % (G/V) Calciumchlorid), pH 7,5, dann einmal 150 mM Natriumchloridlösung mit 0,2 % (G/V) Calciumchlorid und schließlich einmal mit 150 mM Natriumchloridlösung gewaschen. Die Kapseln wurden dann weitere 4 min bei Raumtemperatur in 150 mM Natriumchloridlösung mit 0,06 % (G/V) NaG inkubiert, einmal in 150 mM Natriumchloridlösung gewaschen und weitere 15 min bei Raumtemperatur in 150 mM Natriumchloridlösung mit 55 mM Natriumeitrat inkubiert. Die Lösung wurde dann dekantiert und durch frische 55 mM Natriumcitrat-ZNatriumchloridlösung ersetzt. Die Kapseln wurden anschließend weitere 6 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach zweimal mit 150 mM Natriumchloridlösung, einmal mit modifiziertem Eagle-Medium nach Dulbecco (hoher Glucosegehalt) und einmal mit modifiziertem Eagle-Medium (hoher Glucosegehalt) nach Dulbecco mit einem Gehalt von 20 % Kälberfetalserum (FCS-Flow Laboratories) und Pennicillin, Streptomycin, 1 mM Glutamin und 5-10 M Mercaptoethanol gewaschen. Die nach diesem Verfahrenwritten drop generator attached. The droplets were made into gel form by contacting them with a 150 mM sodium chloride solution containing 1.2 I (w / v) calcium chloride. The gelled beads formed a separate phase and were collected by suction. The gelled beads were then washed three times with 150 mM sodium chloride solution and then incubated for 6 min at room temperature in a solution of poly-L-lysine (Sigma, molecular weight 65,000) at a concentration of 1.875 mg / ml. After the incubation, the capsules were washed with 25 ml of 5 mM CHES buffer (2-N-cyclohexylaminoethanesulfonic acid _} Sigma) in 150 mM sodium chloride solution with 0.2 % (w / v) calcium chloride), pH 7.5, then once 150 mM sodium chloride solution washed with 0.2 % (w / v) calcium chloride and finally once with 150 mM sodium chloride solution. The capsules were then incubated for a further 4 min at room temperature in 150 mM sodium chloride solution with 0.06 % (w / v) NaG, washed once in 150 mM sodium chloride solution and incubated for a further 15 min at room temperature in 150 mM sodium chloride solution with 55 mM sodium citrate. The solution was then decanted and replaced with fresh 55 mM sodium citrate-sodium chloride solution. The capsules were then incubated for a further 6 min at room temperature and then twice with 150 mM sodium chloride solution, once with modified Eagle medium according to Dulbecco (high glucose content) and once with modified Eagle medium (high glucose content) according to Dulbecco with a content of 20 % calf fetal serum (FCS-Flow Laboratories) and pennicillin, streptomycin, 1 mM glutamine and 5-10 M mercaptoethanol. The after this procedure

- Ιό -- Ιό -

erhaltenen Kapseln waren für IgG durchlässig, jedoch gegenüber IgM im wesentlichen undurchlässig.The capsules obtained were permeable to IgG, but essentially impermeable to IgM.

Die Zellen innerhalb der Kapseln wurden einige Tage in einem Kulturgefäß kultiviert und dann auf eine Mikrotitrierplatte mit 24 Vertiefungen zusammen mit Kulturmedium bei einer Konzentration von etwa 20 Volum-2 Kapsel und 80 Volum-! Kulturmedium aufgeteilt. Nach etwa 3 Tagen Inkubation wurden Proben aus jeder Vertiefung nach dem unten angegebenen Verfahren auf Gehalt an Anti-Azotobacter-Nitrogenase getestet. Der Inhalt der Vertiefungen, bei denen ein ■positives Testergebnis erhalten wurde, wurde in neuen Mikrotitrierplatten mit 24 Vertiefungen unter Verwendung des Kulturmediums weiter kultiviert, bis lebensfähige Hybridomzellen identifiziert wurden, die Anti-Azotobacter-Nitrogenase produzierten.The cells within the capsules were cultured in a culture vessel for a few days and then grown up a 24-well microtiter plate together with culture medium at a concentration of about 20 volume-2 capsules and 80 volume-! Divided culture medium. After about 3 days of incubation, samples were obtained from each well by the procedure given below tested for anti-Azotobacter nitrogenase content. The content of the wells where a ■ a positive test result was obtained in new microtiter plates with 24 wells below Use of the culture medium to continue culturing until viable hybridoma cells have been identified, which produced anti-Azotobacter nitrogenase.

Zur Ermittlung der Produktion von Anti-Azotobacter-Nitrogenase wurde folgendes Testverfahren herangezogen:The following test method was used to determine the production of anti-Azotobacter nitrogenase used:

Die Vertiefungen einer EIA-Mikrotitrierplatte mit 96 Vertiefungen (Linbro) wurden mit 100 μΐ einer Lösung von Azotobacter-Nitrogenase einer Konzentration von 10 pg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) beschichtet. Nach Inkubation über Nacht bei 4 ⁰C wurde überschüssige PBS-Lösung abgegossen, worauf die Vertiefungen mit einer 1-äigen Lösung von BSA in PBS nachbeschichtet wurden. Nach 1 h wurde die BSA-PBS-Lösung abgegossen. Die Proben wurden mit BSA-PBS-Lösung verdünnt; Standardlösungen wurden durch Verdünnen einer Lösung von gereinigter Anti-Azotobacter-Nitrogenase einer Konzentra-The wells of an EIA microtitration plate with 96 wells (Linbro) were coated with 100 μl of a solution of Azotobacter nitrogenase at a concentration of 10 pg / ml in phosphate-buffered saline (PBS). After overnight incubation at 4 ⁰ C excess PBS solution was decanted, were recoated after which the wells with a 1-äigen solution of BSA in PBS. After 1 hour, the BSA-PBS solution was poured off. The samples were diluted with BSA-PBS solution; Standard solutions were made by diluting a solution of purified anti-Azotobacter nitrogenase at a concentration

tion von 1 μg/ml in BSA-PBS hergestellt. Die Proben wurden dann 1 h bei 37 ⁰C inkubiert, worauf die Vertiefungen dreimal mit PBS-Lösung gewaschen wurden. Anschließend wurde in jede Vertiefung 1:1000 verdünntes, mit Peroxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG in BSA-PBS zugegeben. Nach 2 h Inkubation bei Raumtemperatur wurde jede Vertiefung fünfmal mit PBS-Lösung gewaschen und danach mit 100 μΐ einer 55 mM Natriumcitratlösung mit 4 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,02 Volum-! Wasserstoffperoxid, pH 4,5, versetzt. Nach 15 min wurde die Reaktion durch Zusatz von 100 μΐ 4 N HCl gestoppt. Die Platten wurden schließlich mit einem Plattenauswertegerät anhand einer Farbreaktion bezüglich der Aktivität an Anti-Azotobacter-Nitrogenase ausgewertet. tion of 1 μg / ml made in BSA-PBS. The samples were then incubated for 1 h at 37 ^° C., after which the wells were washed three times with PBS solution. Goat anti-mouse IgG in BSA-PBS, diluted 1: 1000 and conjugated with peroxidase, was then added to each well. After incubation for 2 hours at room temperature, each well was washed five times with PBS solution and then with 100 μl of a 55 mM sodium citrate solution containing 4 mg / ml of o-phenylenediamine and 0.02 volume! Hydrogen peroxide, pH 4.5, added. After 15 min, the reaction was stopped by adding 100 μΐ 4 N HCl. The plates were finally evaluated with a plate evaluation device on the basis of a color reaction with regard to the activity of anti-Azotobacter nitrogenase.

Aus dem obigen Beispiel ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine gegenüber herkömmlichen Verfahrensweisen wesentlich einfachere Selektion von Zellen ermöglicht, die eine bestimmte, angestrebte Substanz produzieren. Die Erfindungskonzeption ist zugleich in sehr breitem Rahmen praktisch anwendbar.From the above example it can be seen that the method according to the invention is compared to conventional ones Procedures enables a much simpler selection of cells that contain a certain, produce desired substance. At the same time, the concept of the invention is very broad practically applicable.

Claims

Expectations

characterized by the following steps:

(A) Encapsulate the cells of the cell culture in a variety of capsules, each one intracapsular Have volume that is predetermined by a membrane for the desired substance permeable but impermeable to the cells;

(B) Place the encapsulated cells in a facility with a plurality of compartments, each containing an extracapsular medium;

(C) Allowing the synthesis of the substance in question to proceed through the selected cell (s) and their secretion into the intracapsular volume;

(D) allowing the secreted substance to pass through the membrane;

(E) Examine the extracapsular medium of each compartment for the secreted substance

O192-DBH453-SF-Bk

and
(F) Repeat steps (B) through (E) with the capsules

from a compartment that gave a positive test result in step (E), up to the one to be selected Cell containing capsule is identified.

2. The method according to claim 1, characterized in that capsules are used in which the density of viable cells within the intracapsular volume is on average no larger than one cell / capsule.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that cells are selected which are a fusion product of a lymphocyte with a cell of an immortal

"Show cell line.

4. The method according to claim 3, characterized in that myeloma cells are used as immortal cell line.

5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in, that hybridoma cells are selected.

6. The method according to claim 5, characterized in that the hybridoma cells are fusion products of crossing species can be used.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in, that cells are selected which secrete a monoclonal antibody.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that that genetically modified cells are selected.

9. The method according to claim 8, characterized in that as

genetically modified cells fusion products a prokaryotic cell can be selected with a vector containing an expressible gene in which the targeted substance in question is coded.

10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that one is used as the extracapsular medium Culture medium is used for the selected cells.

11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that as a device with several Compartments facilities with wells are used in which the capsules and the extracapsular Medium can be provided.

12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that membranes are produced which are permeable to the intended substance in question, but to molecules with a molecular weight above a predetermined value and are essentially impermeable to the cells.

13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized by the additional process step the injection of the identified capsule (s) into a test animal to induce an immune response against the substance in question.

14. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized by the further process step of Implantation of the identified capsule (s) in a host animal and recovery of the desired one Substance-containing liquid from this

Host animal.

15. Method for identifying cells to be selected, which secrete a desired substance ', from a heterogeneous cell population,

characterized by the following steps:

(1) Fusion of a large number of cells, among which there is at least one cell which is the desired substance is produced with an immortal cell line to produce a heterogeneous population of fused cells;

(2) Encapsulate the population in a plurality of capsules, each having an intracapsular volume have, which is predetermined by a membrane that is permeable to the desired substance, however is impermeable to the fused cells;

(3) Place the encapsulated cells in a multi-compartment facility containing the each contain an extracapsular medium that is capable of the metabolic activity of the to maintain target substance secreting cells in question;

(4) Allowing the synthesis of the substance in question to proceed through the selected cell (s) and theirs Secretion into the intracapsular volume;

(5) allowing the secreted substance to pass through the membrane;

(6) Examine the extracapsular medium of each compartment on the secreted substance and

(7) Repeat steps (3) to (6) with the capsules from a compartment that received a positive in step (6) Test result until a capsule containing the cell to be selected is identified.

16. The method according to claim 15, characterized in that capsules are used in which the density of Cells within the intracapsular volume is on the statistical mean no larger than one Cell / capsule.

17. The method according to claim 15 or 16, that myeloma cells are used as immortal cell line.

18. The method according to claim 17, characterized in that that lymphocytes are used as cells.

19. The method according to any one of claims 15 to 18, characterized characterized in that hybridoma cells are used as fused cells.

20. The method according to any one of claims 15 to 19, characterized in that as a device with several Compartments facilities with wells are used in which the capsules and the extracapsular Medium can be provided.

21. The method according to any one of claims 15 to 20, that a culture medium for the extracapsular medium the selected cells is used.

22. The method according to claim 21, characterized in that a differential culture medium is used as the culture medium is used.

- D ~

23. The method according to any one of claims 15 to 22, characterized in that membranes are generated for the target substance in question are permeable, but for molecules with a molecular mass above a predetermined one Value and are essentially impermeable to the cells.

24. The method according to any one of claims 15 to 23, characterized by the additional method step the injection of the identified capsule (s) into a test animal to induce an immune response against the substance in question.

25. The method according to any one of claims 15 to 23, characterized by the further method step the implantation of the identified capsule (s) in a host animal and recovery of the relevant one desired substance-containing liquid from this host animal.