DE3486179T3

DE3486179T3 - Verfahren zur Herstellung von Immunglobulinen

Info

Publication number: DE3486179T3
Application number: DE3486179T
Authority: DE
Inventors: Michael Alan Boss; John Henry Kenten; John Spencer Emtage; Clive Ross Wood
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: UCB Celltech Ltd
Priority date: 1983-03-25
Filing date: 1984-03-23
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2004-03-24
Also published as: WO1984003712A3; JP2594900B2; JPH07173200A; WO1984003712A2; EP0120694A3; EP0526953A1; GB2137631B; GB8407571D0; ATE91716T1; JP2001286291A; EP0120694B1; GB2137631A; EP0120694A2; DE3486179D1; JPS60500892A; DE3486179T2; JPH1080296A; EP0120694B2; US4816397A; GB8308235D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Immunglobulinmolekülen oder immunologisch funktionellen Ig-Fragmenten in Hefezellen, welche mit Hilfe von rekombinanten DNA-Techniken transformiert worden sind.
In den letzten Jahren haben Fortschritte in der Molekularbiologie auf der Grundlage rekombinanter DNA-Techniken zu Verfahren zur Herstellung heterologer (fremder) Polypeptide oder Proteine in Wirtszellen geführt, welche mit heterologen DNA-Sequenzen transformiert worden sind, die für die Herstellung dieser Produkte kodieren.
Theoretisch kann die rekombinante DNA-Technologie auf die Herstellung irgendeines heterologen Polypeptids oder Proteins in einer geeigneten Wirtszelle angewendet werden unter der Voraussetzung, daß geeignete kodierende DNA-Sequenzen identifiziert und zur Transformation der Wirtszelle verwendet werden können. In der Praxis haben sich jedoch bei der ersten Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie auf die Herstellung kommerziell interessanter Produkte hinsichtlich der Herstellung irgendeines spezifizischen Polypeptids oder Proteins besondere Probleme und Schwierigkeiten ergeben und der Erfolg der Anwendung dieser Technologie auf die Herstellung irgendeines bestimmten Polypeptids oder Produkts war nicht leicht vorhersehbar.
Eine große Anzahl heterologer einzelkettiger Polypeptide oder Proteine ist jedoch nunmehr von mittels rekombinanter DNA-Techniken transformierten Wirtszellen hergestellt worden. Beispiele für derartige heterologe einzelkettige Polypeptide oder Proteine schließen die humanen Interferone, die A- und B-Ketten des humanen Insulins, humanes und bovines Wachstumshormon, Somatostatin, Kälberprochymosin und Urokinase ein. Derartig transformierte Wirtszellen stellen reproduzierbar authentische heterologe Polypeptide oder Proteine bereit, welche im industriellen Maßstab unter Einsatz industrieller Fermentationstechnologie hergestellt werden können. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß einige dieser Polypeptide wie zum Beispiel Urokinase nach Sekretion aus einer Wirtszelle in Form zweikettiger Moleküle vorliegen. Das Molekül wird jedoch in derartigen Fällen von der Wirtszelle gemäß der Kodierung durch eine einzige DNA-Sequenz als ein einzelkettiges Polypeptid synthetisiert, welches in der Wirtszelle im Anschluß an die Synthese unter Bildung der zweikettigen Struktur gespalten wird.
Es ist bekannt, daß es sowohl bei Menschen als auch bei Tieren eine Reihe von Polypeptiden oder Proteinen mit einer vielkettigen Struktur gibt, in denen sich die Ketten nicht von der Spaltung eines durch eine einzige DNA-Sequenz kodierten einzelkettigen Polypeptids ableiten. In derartigen Fällen kann das für jedes der Ketten kodierende Gen an verschiedenen Stellen auf demselben Chromosom oder selbst auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sein. In diesen Fällen werden die Polypeptidketten getrennt voneinander synthetisiert und anschließend zur Bildung des vollständigen Moleküls miteinander verknüpft. Bis heute ist jedoch kein derartiges vielkettiges Polypeptid oder Protein unter Einsatz rekombinanter DNA-Techniken von einer einzigen Wirtszelle hergestellt worden.
Ein besonderes Beispiel für eine Klasse derartiger vielkettiger Polypeptide oder Proteine sind die Immunglobuline.
Die üblicherweise als Antikörper bezeichneten Immunglobuline sind Proteinmoleküle, die in Tieren von B-Lymphozyten als Reaktion auf fremde antigene Agenzien wie Bakterien, Viren und Fremdproteine gebildet werden. Die Immunglobuline umfassen einen äußerst wichtigen Teil des Immunsystems von Menschen und Tieren. Die Immunglobuline erkennen spezifische Teile der fremden Agenzien und binden an diese. Die spezifischen Bereiche sind als antigene Determinanten oder Antikörper-Bindungsstellen bekannt. Ein gegebenes Fremdagens weist wahrscheinlich eine Anzahl verschiedener antigener Determinanten auf.
Ein typisches Immunglobulin (Ig)-Molekül ist in 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt, auf die nunmehr Bezug genommen wird. Das Ig-Molekül umfaßt zwei identische Polypeptidketten von etwa 600 Aminosäureresten (gewöhnlich als die schweren Ketten, H, bezeichnet), welche mittels Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, und zwei identische kürzere Polypeptidketten von etwa 220 Aminosäureresten (gewöhnlich als die leichten Ketten, L, bezeichnet), wobei jede leichte Kette über eine Disulfidbrücke an ein Ende einer jeden schweren Kette wie dargestellt gebunden ist.
Wenn das Ig-Molekül in korrekter Weise gefaltet ist, liegt jede Kette in Form einer Anzahl distinkt globulärer Bereiche vor, welche gewöhnlich als Domäne bezeichnet werden und von einer eher linearen Polypeptidkette begleitet werden. Die leichten Ketten besitzen zwei derartige Domänen, von denen die eine eine variable Sequenz V_L und die andere eine konstante Sequenz C_L aufweist. Die schweren Ketten besitzen gegenüber der variablen Domäne V_L der leichten Kette eine einzige variable Domäne V_H und drei oder vier konstante Domänen C_H1-3 oder 4.
Sowohl die variablen Domänen der schweren wie auch der leichten Ketten enthalten jeweils drei hypervariable Regionen (HV1-3), die bei korrekter Faltung des Ig-Moleküls nebeneinander lokalisiert sind und die Antigen-Bindungsstelle bilden. Die Spezifität eines Ig-Moleküls ist durch diesen Bereich begründet, welcher die antigene Determinante erkennt und bindet.
Die konstanten Domänen des Ig-Moleküls sind an der Bindung der antigenen Determinante nicht beteiligt, vermitteln aber die durch das Binden des Ig-Moleküls an die antigene Determinante ausgelösten Abläufe. Es wird davon ausgegangen, daß dieses Aus lösen durch einen allosterischen Effekt hervorgerufen wird, welcher durch das Binden des Ig-Moleküls an die antigene Determinante induziert wird. Die konstante Domäne kann das Ig-Molekül zur Komplementbindung veranlassen oder Mastzellen zur Freisetzung von Histamin veranlassen.
Ig-Moleküle können in Klassen oder Unterklassen eingeteilt werden, was von der Anzahl ihrer möglichen konstanten Domänen der schweren Kette abhängt, wobei die Mäuse über acht derartige mögliche schwere Ketten verfügen. Demnach gehört beispielsweise ein Ig-Molekül mit einer schweren Kette μ zur Klasse IgM und eines mit einer schweren Kette γ₁ zur Klasse IgG₁.
Ig-Moleküle können ferner eine der beiden als Kappa bzw. Lambda bezeichneten leichten Ketten enthalten, welche verschiedene konstante Domänen und verschiedene Ausstattungen an variablen Domänen aufweisen.
Die Struktur des Ig-Moleküls und die der Lokalisierung der für die verschiedenen Domänen kodierenden Gene werden eingehend beschrieben von Early und Hood, Genetic Engineering, Principles and Methods, Band 3, Seiten 153–158 (herausgegeben von Setlow und Hollaender, Plenum Press).
Es ist bekannt, daß Ig-Moleküle unter Verdau mit ausgewählten Enzymen eine Anzahl immunologisch funktioneller Fragmente bilden können. Zwei derartige Fragmente sind als Fab- bzw. (Fab')₂-Fragment bekannt. Das Fab-Fragment umfaßt eine mit den V_H- und C_H1-Domänen der schweren Kette verknüpfte leichte Kette, wie in 1 dargestellt. Das (Fab')₂-Fragment besteht im wesentlichen aus zwei Fab-Fragmenten, die, gemäß Darstellung in 1, miteinander über einen kleinen zusätzlichen Bereich der schweren Ketten verknüpft sind. Diese Fragmente und andere ähnliche Fragmente können bei vielfältigen Tests und diagnostischen sowie medizinischen Verfahren eingesetzt werden.
Das für die Herstellung von Ig-Molekülen angewendete grundsätzliche Verfahren beinhaltet das Immunisieren empfänglicher Tiere mit dem antigenen Agens zur Herbeiführung einer Immunreaktion. Im allgemeinen wird das Tier ein zweites Mal immunisiert, um die Menge an Ig zu steigern. Das Tier wird anschließend ausgeblutet und das Ig wird aus dem Serum gewonnen.
Das Produkt dieses Verfahrens ist jedoch kein homogenes Protein. Das Tier bildet Ig-Moleküle verschiedener Klassen und ferner für jede der verschiedenen antigenen Determinanten des antigenen Agens spezifische Ig-Moleküle, wodurch das Blut des Tieres eine heterogene Mischung von Ig-Molekülen enthält. Zum Erhalt eines spezifischen Ig-Moleküls einer bestimmten Klasse und einer gewünschten Spezifität aus einer derartigen Mischung erfordert sehr schwierige und zeitaufwendige Trennverfahren.
Kürzlich ist es möglich geworden, ein homogenes Ig einer einzigen Klasse mit einer einzigen Spezifität unter Anwendung einer Technik herzustellen, die zuerst von Kohler und Milstein (Nature, 256, 495–479, 1975) beschrieben wurde. Die Technik beinhaltet die Fusion von Mutterzellen, die ein einziges Ig bilden, mit Krebszellen zur Schaffung einer das Ig bildenden monoklonalen Hybridomzelle. Das unter Anwendung dieses Verfahrens gebildete Ig wird gewöhnlich als monoklonaler Antikörper bezeichnet. Die Natur des monoklonalen Ig-Moleküls wird durch die Klasse und Spezifität des von der Mutterzelle gebildeten Ig-Moleküls bestimmt.
Kürzlich sind Versuche unternommen worden, rekombinante DNA-Techniken zur Herstellung von Fragmenten der Ig-Moleküle einzusetzen. Beispielsweise beschreiben Amster et al. (Nucleic Acids Research, 8, 9, 1980, Seiten 2055 bis 2065) das Klonieren von doppelsträngigen cDNA-Sequenzen, welche für eine leichte Kette eines Mäuse-Ig-Moleküls kodieren, in ein Plasmid. Ein mit dem Plasmid transformierter E. coli-Stamm synthetisierte ein Protein, welches die vollständige konstante Domäne der leichten Kette und etwa 40 Aminosäurereste von dessen variabler Region umfaßte.
Kemp und Cowman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, Seiten 4520 bis 4524) beschreiben das Klonieren von cDNA-Sequenzen, die für Fragmente der schweren Kette von Mäusen kodieren, und die Transformation eines E. coli-Stammes, welcher anschließend Polypeptidfragmente der schweren Kette synthetisierte.
In beiden Fällen wurden die Polypeptide als Fusionsproteine gebildet, in denen die Fragmente der Ig-Polypeptide mit zusätzlichen nicht-Ig-Polypeptidsequenzen und mit unvollständigen variablen Domänen fusioniert waren. Die auf dem Wege dieser Untersuchungen gebildeten Polypeptidketten waren daher keine immunologisch funktionellen Polypeptide, da sie nicht in der Lage waren, sich mit komplementären schweren oder leichten Ketten zu kombinieren, um Ig-Moleküle mit intakten Antigen-Bindungsstellen und einer immunologischen Funktion bereitzustellen.
Untersuchungen sind ebenfalls mit Säugetiersystemen durchgeführt worden. Beispielsweise berichten Falkner und Zachau (Nature, 298, 1982, Seiten 286 bis 288) das Klonieren von für leichte Ketten von Mäusen kodierenden cDNA-Sequenzen in ein Plasmid, welches eingesetzt wurde, um genomische Eukaryontenzellen zu transfizieren, welche anschließend transient leichte Ketten synthetisieren konnten.
Rice und Baltimore (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1982, Seiten 7862 bis 7865) berichten über die Transfektion eines funktionell rearrangierten Ig-Gens für die leichte Kette K in eine mit dem Mäuseleukämievirus transformierte lymphoide Zellinie. Die Zellinie ist anschließend in der Lage, das Gen kontinuierlich zu exprimieren. In beiden Fällen wurden die zur Transfektion der Säugerzellen verwendeten K-Gene aus Myelomzellen erhalten und die gebildeten K-Polypeptide wiesen eine unbestimmte immunologische Funktion auf.
Ein weiterer Ansatz wird veranschaulicht von einer Reihe von Artikeln von Valle et al. (Nature, 291, 1981, 338–340; Nature, 300, 1982, 71–74; und J. Mol. Biol., 160, 1982. 459–474), die die Mikroinjektion von mRNAs, die für schwere oder leichte Ketten eines Ig-Moleküls kodieren und aus einer Maus-Myelomlinie isoliert wurden, in Oozyten von Xenopus laevis beschrieben. Unter bestimmten Bedingungen wurden vollständige Ig-Moleküle gebildet. Die mRNAs wurden jedoch aus Myelomzellen erhalten und die Ig-Moleküle wiesen eine unbestimmte immunologische Funktion auf.
Es ist daher ersichtlich, daß es bisher nicht möglich gewesen ist, auf dem Wege der rekombinanten DNA-Technologie ein funktionelles Ig herzustellen.
Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Ig-Moleküls oder eines immunologisch funktionellen Ig-Fragments in einer einzigen Hefewirtszelle bereitgestellt, welches das Transformieren der Wirtszelle mit getrennten DNA-Sequenzen, die für die entsprechenden Polypeptidketten kodieren und zumindest die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten des Ig-Moleküls umfassen, und das getrennte Exprimieren jeder dieser Polypeptidketten in der transformierten einzigen Hefewirtszelle umfaßt.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ferner eine mit einem Vektor transformierte Hefewirtszelle zur Verwendung in einem Verfahren gemäß des ersten Aspektes der Erfindung wie in Anspruch 13 definiert bereitgestellt.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ferner eine mit zwei verschiedenen Vektoren transformierte Hefewirtszelle bereitgestellt, wobei der erste Vektor eine DNA-Sequenz umfaßt, die für eine Polypeptidkette kodiert, welche zumindest die variable Domäne der schweren Kette des Ig-Moleküls umfaßt, und der zweite Vektor eine DNA-Sequenz umfaßt, welche für eine Polypeptidkette kodiert, die zumindest die variable Domäne der leichten Kette des Ig-Moleküls umfaßt.
Bei der erfindungsgemäßen Herstellung von Ig-Molekülen wird darauf hingewiesen, daß die zur Transformation der Wirtszelle eingesetzten DNA-Sequenzen zumindest für die V_L- und V_H-Domänen eines Ig-Moleküls kodieren müssen, um ein funktionelles Molekül zu bilden. Darüber hinaus müssen diese Domänen komplementär zueinander sein, so daß sie bei der Zusammenfaltung der beiden Polypeptidketten eine Antigen-Bindungsstelle einer vorher festgelegten Spezifität bilden.
Vorzugsweise schließt das durch das Verfahren gebildete Ig-Molekül oder -Fragment eine vollständige leichte Kette und zumindest die C_H1-Domäne sowie die V_H-Domäne der schweren Kette ein. In am meisten bevorzugter Weise liefert das Verfahren ein vollständiges Ig-Molekül.
Vorteilhafterweise weist das erfindungsgemäß hergestellte Ig-Molekül oder funktionelle Fragment davon eine variable Region (gebildet von den V_L- und V_H-Domänen) auf, welche eine Bindungsstelle für eine klinisch oder industriell bedeutsame antigene Determinante definiert. Die zur Herstellung eines derartigen Moleküls erforderlichen kodierenden DNA-Sequenzen können aus natürlich vorkommenden oder hybridomalen (monoklonalen) Ig bildenden Zellen mit der gewünschten Spezifität abgeleitet werden.
Die konstanten Domänen des Ig-Moleküls oder -Fragments können vorliegendenfalls aus derselben Zellinie abgeleitet werden wie die variable Region. Die konstanten Domänen können jedoch in spezifischer Weise verändert, partiell oder vollständig weggelassen oder aus einer Zellinie abgeleitet werden, die eine andere Ig-Klasse produziert, um Ig-Moleküle oder -Fragmente mit den gewünschten Eigenschaften zu schaffen.
Beispielsweise kann ein Ig-Molekül mit variablen Domänen (V_H und V_L), welche identisch mit denen eines monoklonalen Antikörpers mit der gewünschten Spezifität sind, und einer konstanten Domäne(n) aus einem anderen monoklonalen Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften hergestellt werden, um beispielsweise eine menschliche Kompatibilität oder eine Komplementbindungsstelle bereitzustellen.
Derartige Veränderungen in der Aminosäuresequenz der konstanten Domänen können mittels geeigneter Mutation oder partieller Synthese und Austausch oder partieller oder vollständiger Substitution geeigneter Regionen der entsprechenden kodierenden DNA-Sequenzen erreicht werden. Substituierte konstante Domänenbereiche können aus kompatiblen rekombinanten DNA-Sequenzen erhalten werden.
Die Erfindung kann angewendet werden zur Herstellung von Ig-Molekülen oder -Fragmenten, die zur Immunaufreinigung bzw. für Immunoassays, cytochemisches Markieren und Targetting sowie für diagnostische oder therapeutische Verfahren geeignet sind. Beispielsweise kann das Ig-Molekül oder -Fragment an ein therapeutisch wirksames Protein wie Interferon oder an einen Blutgerinnungsfaktor wie zum Beispiel den Faktor VIII binden und kann daher verwendet werden, um ein Medium für eine Affinitätschromatographie zur Verwendung bei der Immunaufreinigung oder der Analyse des Proteins herzustellen.
Es wird ferner daran gedacht, daß das Ig-Molekül von einer Hefewirtszelle mit einer anderen an eine ihrer konstanten Domäne angehefteten Peptidkomponente synthetisiert werden kann. Solch eine weitere Peptidkomponente kann cytotoxisch oder enzymatisch sein. Alternativ kann die Komponente bei der Anheftung des Ig-Moleküls an ein biologisches Substrat wie eine Zelle oder ein Gewebe, oder an ein nicht-biologisches Substrat wie ein Chromatographiemedium geeignet sein. Eine derartige Peptidkomponente wird nachfolgend als strukturelle Peptidkomponente bezeichnet.
Es wird ferner in Aussicht gestellt, daß cytotoxische, enzymatische oder strukturelle Peptidkomponenten eher unter Anwendung im Stand der Technik bekannter herkömmlicher Peptid-chemikalischer Verfahren an das Ig-Molekül angeheftet werden könnten, als sie mit dem Ig-Molekül zu synthetisieren.
Das Ig-Molekül oder -Fragment kann ferner ein therapeutisches Mittel umfassen. Beispielsweise kann ein für das D-Blutgruppen-Antigen spezifisches Ig-Molekül oder -Fragment zur Vermeidung einer hämolytischen Krankheit des Neugeborenen geeignet sein.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Ig-Molekülen oder -Fragmenten kann jede geeignete rekombinante DNA-Technik eingesetzt werden. Es werden typische Expressionsvektoren wie Plasmide hergestellt, die DNA-Sequenzen umfassen, welche für jede der Ketten des Ig-Moleküls oder -Fragments kodieren.
Es wird davon ausgegangen, daß ein einziger Vektor hergestellt werden kann, der DNA-Sequenzen enthält, welche für mehr als eine dieser Ketten kodieren. Beispielsweise können die für die schweren und leichten Ig-Ketten kodierenden DNA-Sequenzen an verschiedenen Positionen desselben Plasmids insertiert werden.
Alternativ kann die für jede Kette kodierende DNA-Sequenz individuell in ein Plasmid insertiert werden, was zu einer Reihe von konstruierten Plasmiden führt, die jeweils für eine bestimmte Kette kodieren. Vorzugsweise sind die Plasmide, in die die Sequenzen insertiert werden, miteinander kompatibel.
Das oder jedes konstruierte Plasmid wird eingesetzt, um eine Hefewirtszelle derart zu transformieren, daß jede Wirtszelle DNA-Sequenzen enthält, die für jede der Ketten des Ig-Moleküls oder -Fragments kodieren.
Bei der Klonierung mit Hefesystemen schließen geeignete Expressinsvektoren Plasmide ein, die sich von einem 2 Mikron Ursprung ableiten.
Geeignete Hefewirtszellen, die zur Expression des Ig-Moleküls oder -Fragments eingesetzt werden können, schließen S. cervisiae ein.
Es ist beabsichtigt, daß die individuellen Ketten von der Wirtszelle in der weise prozessiert werden, daß sie das vollständige Polypeptid oder Protein bilden, welches vorteilhafterweise von der Wirtszelle ausgeschieden wird.
Es wird hervorgehoben, daß die vorliegende Anmeldung erstmalig die Möglichkeit aufzeigt, eine Hefewirtszelle in der Weise zu transformieren, daß sie zwei oder mehrere getrennte Polypeptide exprimieren kann, welche unter Bildung eines vollständigen Ig-Moleküls oder -Fragments zusammengefügt werden können. Im Stand der Technik gibt es keine Veröffentlichung oder Anregung der vorliegenden Erfindung, welche lediglich die Herstellung eines einzelkettigen heterologen Polypeptids oder Proteins aus jeder Wirtszelle betrifft.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben:
1 zeigt ein Diagramm eines typischen intakten Ig-Moleküls;
2 zeigt die Herstellung von Plasmiden zur direkten Synthese einer leichten λ-Kette in E. coli;
3 zeigt die Herstellung von Plasmiden zur direkten Synthese einer schweren μ-Kette in E. coli;
4 ist eine Darstellung der μ-mRNA-Sequenzen im Bereich des Initiationskodons;
5 zeigt die Herstellung von Plasmiden mit veränderter Sekundärstruktur im Bereich des Initiationskodons;
6 ist ein Polyacrylamidgel, welches die Expression und Verteilung des μ-Proteins aus E. coli B zeigt;
7 ist ein Polyacrylamidgel, welches Pulse-Chase-Autoratiogramme des μ-Proteins in E. coli B und in E. coli HB101 zeigt;
8 ist ein Polyacrylamidgel, welches die Ergebnisse der λ-Genexpression in E. coli zeigt;
9 ist ein Polyacrylamidgel, welches die Verteilung des rekombinanten leicht-kettigen λ-Polypeptids in den löslichen und unlöslichen Zellfraktionen zeigt;
10 ist ein Polyacrylamidgel, welches die Expression und Verteilung des λ-Proteins aus E. coli E103S zeigt;
11 zeigt die Ergebnisse der Fraktionierung des von E coli B exprimierten μ- und λ-Proteins auf DEAE-Sephacel;
12 zeigt die spezifische Haptenbindung rekonstituierter Ig-Moleküle; und
13 zeigt diue verschiedenartige Natur der Haptenbindung der rekonstituierten Ig-Moleküle.
In den folgenden Beispielen wird die Herstellung der leichten und schweren Ketten von Ig-Polypeptiden beschrieben, die aus monoklonalen Antikörpern stammen und die die antigene Determinante 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl (NP) erkennen und an diese binden, wobei als Wirtszellen E. coli und S. cerevisiae eingesetzt werden. Rekombinante DNA-Techniken wurden eingesetzt, um die Wirtszellen in die Lage zu versetzen, beide Polypeptidketten zu exprimieren.
Es ist davon auszugehen, daß die Erfindung auf die hier beschriebenen spezifischen Verfahren und Konstruktionen nicht beschränkt ist.
Herstellung des Plasmids zur Expression der leichten Lambda-Kette
2, auf die nunmehr Bezug genommen wird, zeigt in schematischer Weise das zur Herstellung eines Plasmids zur Expression einer leichten λ-Kette angewendete Verfahren.
Es wurde entschieden, daß Lambda-Gen in E. coli mittels direkter Expression des Gens zu exprimieren, welchem das eukaryotische Signalpeptid fehlt, welches aber einen Methionin-Initiatorrest am Aminoterminus (met-Lambda) enthält. Der beschrittene Weg zur bakteriellen Synthese von Met-Lambda bestand in der in vitro Rekonstruktion des Gens aus Restriktionsfragmenten eines cDNA-Klons und in der Verwendung synthetischer DNA-Fragmente zum Einbau in das bakterielle Plasmid pCT54 (Emtage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 3671 bis 3675, 1983). Dieser Vektor enthält den E. coli-trp-Promotor sowie den Operator und die Leader-Ribosomen-Bindungsstelle. Ferner besitzt der Vektor 14 Nukleotide stromabwärts der Ribosomen-Bindungsstelle einen Initiator ATG und im unmittelbaren Anschluß daran EcoR1- und Hind-III-Stellen sowie den Terminator für die E. coli RNA-Polymerase aus dem Bakteriophagen T7.
Als Quelle für die leichte Kette verwendeten wir ein Plasmid pABλ1-15, welches eine in die PstI-Stelle von pBR322 klonierte cDNA einer leichten λ₁-Kette voller Länge enthält. Diese leichteλ₁-Kette leitet sich aus einem mit S43 bezeichneten monoklona len Antikörper ab, welcher an 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl (NP)-Haptene bindet.
Um an dem 3'-Ende des Lambda-Gens eine HindIII-Stelle für den Einbau in die HindIII-Stelle von pCT54 zu schaffen, wurde die cDNA aus pABλ1-15 unter Verwendung von Pst1 herausgeschnitten. Die kohäsiven Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase glattendig gemacht und die synthetischen HindIII-Linkermoleküle der Sequenz 5'-CCAAGCTTGG-3' ligiert. Die DNA wurde mit HindIII geschnitten und das 850 bp umfassende Lambda-Gen wurde mittels Gelelektrophorese isoliert und in das mit HindIII geschnittene pAT153 unter Erhalt des Plasmids pATλ1-15 kloniert. Das 3'-Ende des Lambda-Gens wurde aus pATλ1-15 durch Schneiden mit HindII2 sowie einem partiellen Verdau mit SacI als ein 630 bp umfassendes Sacl-HindIII-Fragment isoliert (2 in 2). Das kohäsive Ende von HindIII wurde während der Isolierung des Fragments mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdärmen dephosphoryliert, um bei nachfolgenden Reaktionen ungewünschte Ligationen an diesem Ende zu verhindern.
Eine HinfI-Restriktionsstelle befindet sich zwischen den Kodons 7 und 8 der Lambda-Sequenz. Das 5'-Ende des Lambda-Gens wurde als ein Fragment zwischen HinfI und SacI mit 148 bp isoliert (1 in 2).
Zwei Oligodesoxyribonukleotide wurden erstellt, um die Kodons 1 bis 8 wiederherzustellen und sowohl einen Initiator ATG wie auch BclI- und HinfI-klebrige Enden zu schaffen. Die beiden zur Vereinfachung des Zusammenfügens des Gens chemisch synthetisierten Oligonukleotide hatten die Sequenzen:
pCT54 wurde sowohl mit BclI als auch mit HindIII geschnitten und die entstandenen linearen Moleküle wurden isoliert, mit den beiden Oligodesoxyribonukleotid-Linkern R44 und R45 sowie mit beiden Fragmenten 1 und 2 vermischt, und unter Verwendung von T4-Ligase ligiert (2). Die Mischung wurde verwendet, um E. coli-DH1 gegenüber Ampicillin Resistenz zu verleihen. Rekombinante Klone in pCT54 wurden aufgefunden durch Hybridisierung von DNA aus Replika-plattierten Kolonien auf Nitrocellulose mit einer aus dem pATλ1-15-Insert stammenden mittels Nicht-Translation gewonnenen Sonde.
Es wurde ein Klon aufgefunden, welcher mit der Lambda-cDNA hybridisierte und ferner das vorhergesagte Restriktionsfragmentmuster aufwies. Dieses Plasmid (bezeichnet mit pCT54 19-1) wurde von der ClaI-Stelle aus sequenziert, wobei sich herausstellte, daß es die vorbestimmte Sequenz mit der Abweichung aufwies, daß es im Bereich des vierten Kodons eine Mutation von CTG zu ATG gab, was zu einer Veränderung der Aminosäure von Valin zu Methionin führt.
Die Sequenz dieses Bereichs war:
Die Restriktions-Schnittstellen von pCT54 zwischen der Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz (AAGG), welche für das Binden der Ribosomen wichtig ist, und dem ATG erlauben die Einstellung des Abstandes zwischen SD und ATG, einem wichtigen Parameter bei der Bestimmung der Expressionsraten. Der Abstand zwischen SD und ATG wurde verkleinert durch Spalten des Plasmids mit ClaI oder BclI und durch Herstellung von glattendigen Spezies unter Verdau mit S₁-Nuklease. 2 μg der mit ClaI geschnittenen DNA wurden mit 200 Einheiten S₁-Nuklease 30 Minuten lang bei 30°C unter Anwendung standardisierter Pufferbedingungen verdaut. Sämtliche Proteine der Lösung wurden mittels Phenol entfernt und die DNA durch Fällung mit Ethanol gewonnen. Diese DNA führte nach Ligation mit T4-DNA-Ligase und Transformation in den E. coli-Stamm HB101 zu einer Reihe von Plasmiden, die die ClaI- oder BclI-Stelle verloren hatten.
Die Plasmide, welche ihre ClaI-Stelle verloren hatten, wurden hinsichtlich des den Initiator ATG umgebenden Bereichs sequenziert.
Um hohe Expressionsraten zu erreichen, wurde eine Reihe anderer Ansätze gefolgt. Zunächst wurde eine Reihe von Konstrukten erhalten, die erhöhte Mengen der durch Bal 31-Exonuklease entfernten 3'-nicht-translatierten Region der cDNA aufwiesen. Ferner wurde ein Plasmid mit einer hohen Kopiezahl hergestellt, welches λ-cDNA enthielt. Dieses Plasmid enthielt eine Par-Funktion (P. A. Meacock und S. N. Cohen, Cell, 20, 529–542, 1980) und lag zudem in hoher Kopiezahl vor. Schließlich wurden einer Reihe von Protease-Mangel bzw. HB101 gemeinsam mit dem pNP3-Plasmid und einem Protease-Deficient-Dominant-Acting-Plasmid (A. D. Grossman et al., Cell, 32, 151–159, 1983) transformiert.
Herstellung eines Plasmids zur Expression der schweren μ-Kette
Die aus dem an NP bindenden monoklonalen Antikörper B1-8 abgeleitete cDNA für die schwere μ-Kette voller Länge ist in die PstI-Stelle von pBR322 unter Erhalt des mit pABμ-11 bezeichneten Plasmids kloniert worden (Bothwell et al., Cell, 24, 625–637, 1981). Um hohe Expressionsraten zu erzielen, wurde die μ-cDNA ohne die eukaryotische Leadersequenz in pCT54 rekonstruiert. Die Herstellung des Plasmids zur Expression der schweren μ-Kette ist in 3 in Form eines Diagramms dargestellt. Zur Vereinfachung der Herstellung wurden zwei Oligonukleotide chemisch synthetisiert. Diese wiesen die folgenden Sequenzen auf:
Diese wurden mit einem mit BclI geschnittenen pCT54 unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert und das entstandene Plasmid wurde mit pCT54 Pst bezeichnet. Die Linker wurden geschaffen, um die Sequenz von pCT54 zwischen der BclI-Stelle und dem ATG zu ersetzen, um eine interne PstI-Stelle zu schaffen und die Sequenz des 5' zur PstI-Stelle gelegenen pABμ-11 bis zum Kodon +1 wieder herzustellen. pCT54 Pst wurde kurz mit PstI geschnitten, mit alkalischer Phosphatase behandelt und die DNA vollständiger Länge wurde aus einem 1%-igen Agarosegel isoliert. In gleicher Weise wurde pABμ-11 kurz mit PstI geschnitten und das μ-Insert vollständiger Länge wurde im Anschluß an eine Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Die μ-cDNA wurde mit dem vollständigen pCT54 Pst-Fragment unter Verwendung von T4 DNA-Ligase unter Standardbedingungen ligiert, wodurch ein mit pCT54μ bezeichnetes Plasmid geschaffen wurde, welches sich nach Restriktionsenzym-Analyse als das μ-Insert in vollständiger Länge enthaltend zeigte. Das Plasmid wurde im Bereich der 5'-Linkerregion sequenziert und wies die vorgegebene Sequenz auf:
was darauf hindeutete, daß es sich tatsächlich um ein Klon vollständiger Länge handelte. Unter vollständigem Verdau von pCT54μ mit PstI wurde ein Fragment von 1,4 Kb freigesetzt, welches mittels 0,8%-iger Agarose-Gelelektrophorese und Isolierung mittels Glaspulver gereinigt wurde. Dieses Fragment wurde mit dem PstI-geschnittenen pCT54 Pst (siehe oben) unter Verwendung von T4 DNA-Ligase unter Standardbedingungen ligiert und diente der nachfolgenden Transformation von HB101. Es wurde ein mit pNP1 bezeichnetes Plasmid isoliert, von dem mittels Analyse der Restriktionsmuster gefunden wurde, daß es das 1,4 Kb umfassende μcDNA-Fragment in einer geeigneten Orientierung aufwies ( 3). pNP1 war ein Plasmid, das ein geeignetes 5'-Ende für die Expression aufwies, während pCT54 ein geeignetes 3'-Ende enthielt. Das Gen vollständiger Länge wurde in pCT54 rekonstruiert, indem sowohl pNP1 als auch pCT54μ mit AvaI geschnitten wurden, welches einmal im Plasmid und einmal in dem μ-Gen schneidet. Beide Ansätze wurden auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt und das 1,9 Kb umfassende Fragment von pNP1 wie auch das 3,65 Kb umfassende Fragment von pCT54μ wurde isoliert. Im Anschluß an eine Behandlung des 3,65 Kb umfassenden pCT54μ-Fragments mit alkalischer Phosphatase wurden die beiden DNA-Stücke miteinander ligiert und. zur Transformation von HB101 verwendet. Ein mit pNP2 bezeichnetes Plasmid mit dem korrekten Restriktionsmuster wurde identifiziert. Es wurde im Bereich um den Initiator ATG sequenziert und zeigte die vorgegebene Sequenz:
Der Vektor pCT54 ist so konstruiert worden, daß er zwei Restriktionsschnittstellen (BclI und ClaI) zwischen der S-D-Sequenz (AAGG) und dem Initiationskodon einschließt, so daß der Abstand zwischen diesen Sequenzelementen variiert werden konnte. Da die meisten mRNAs aus E. coli zwischen der S-D-Sequenz und dem AUG 6 bis 11 Nukleotide aufweisen, wurde der Abstand in pNP2 durch Veränderung an der ClaI-Stelle vermindert. pNP2 wurde mit ClaI geschnitten und mit Sl inkubiert. Die Menge an S1-Nuklease wurde so eingestellt, daß einige DNA-Moleküle 1–2 zusätzliche Basenpaare als Ergebnis des enzymatischen "Knabberns" verlieren. Diese DNA führte nach Ligation mit T4-DNA-Ligase und Transformation des E. coli-Stammes HB101 zu einer Anzahl von Kolonien, die Plasmide ohne ClaI-Stelle beinhalteten. Die Sequenzen im Bereich des Initiationskodons für vier Plasmide pNP223, pNP261, pNP9 und pNP282 wurden bestimmt und sind in der folgenden Tabelle 1, Teil A dargestellt.
Die Untersuchung der Expression dieser Konstrukte in E. coli B erfolgte in drei Experimenten und die Konzentrationen an μ-Protein wurden mittels ELISA als relative Einheiten (ru) bestimmt, einer Messung der gegenüber pNP9 normalisierten Konzentration an μ. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1
Die Induktionen erfolgten durch Resuspendieren der Zellen mit einer Verdünnung von 1 : 50 aus Übernachtkulturen in Induktionsmedium bestehend aus: KHP₂O₄ (3 g/l), NaHP₂O₄ (6 g/l), NaCl (0,5 g/l), Difco Vitaminassay-Casaminosäuren (30 g/l), NH₄Cl (4 g/l), Glycerol (16 g/l), Prolin (0,5 g/l), Difco Hefeextrakt (lg/l), CaCl₂·6H₂O (0,022 g/l), MgSO₄·7H₂O (0,025 g/l), Thiamin (0,01 g/l) und Carbenicillin (0,1 g/l). Die Kulturen wurden bei 37°C geschüttelt und die Zellen mittels Zentrifugation geerntet.
Die ELISA-Assays erfolgten im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Patel et al. (Nucleic Acid Research, 10, 5606 bis 5620, 1982) unter Verwendung von affinitätsgereinigtem anti-Maus IgM der Ziege (Tago), und affinitätsgereinigtem anti-Maus IgM der Ziege (Tago) konjugiert mit Peroxidase, mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (Miles) als Substrat. Die bakteriellen Zellpellets wurden 2 Minuten lang in 9 M Harnstoff (BRL) gekocht und direkt auf die ELISA-Vorrichtung geladen, so daß sämtliche Vertiefungen 2,25 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 150 mM NaCl, 0,05 NP40 und 0,5% Casein enthielten (Hammarsten, B.D.H.).
Es wurde gefunden, daß die Veränderung des Abstandes zwischen S-D und ATG mit Nuklease Sl zu einer im Vergleich zum Mutterplasmid pNP2 gesteigerten Expression von μ führte, die jedoch lediglich gering ausfiel (Vergleich pNP9). Wie sich bei pPN9 bzw. pNP261 feststellen ließ, betrug der optimale Abstand von S-D zu AUG 9–10 Nukleotide.
Analyse der Sekundärstruktur
Haarnadelschleifen wurden durch Einsatz des von Dr. Roger Staden entwickelten Computerprogramms HAIRGU identifiziert. Die ΔG-Werte wurden errechnet wie von Trioco et al. beschrieben (Nature NB, 246, 40–41, 1973).
Die Analyse der potentiellen Sekundärstruktur der von pNP2 bzw. pNP9 (einem der Sl-Derivate von pNP2) kodierten μ-mRNA ergab eine ausgedehnte Anordnung möglicher Haarnadelschleifen. Der die Ribosomen-Bindungsstelle dieser mRNA enthaltende Bereich wurde eine gesteigerte Aufmerksamkeit zuteil, da die Maskierung der SD-Sequenzen und Initiationskodons in der Sekundärstruktur die Initiation der Translation hemmen kann. Es wurde gefunden, daß sich eine Haarnadelschleife bilden könnte, die das U und das G des Initiationskodons einschließt (vergleich 4). Diese Haarnadelschleife wird vollständig innerhalb kodierender Sequenzen gebildet und weist einen ΔG-Wert von –7,6 kcal auf. Es wurde keine die S-D-Sequenz maskierende Sekundärstruktur gefunden und auch keine solche, die wiederum die oben genannte Haarnadelschleife ausschloß und einen niedrigeren ΔG-Wert hatte.
Um zu überprüfen, ob sich die Expression des μ-Proteins durch Abweichungen beeinflussen läßt, die zu einer Veränderung der potentiellen Sekundärstruktur in der Region der Ribosomenbindung führen, setzten wir synthetische Oligonukleotide ein, um diese Region der μ-mRNA einer Mutagenese zu unterwerfen. Die Plasmide wurden hergestellt durch Insertieren eines Paares von Oligonukleotiden zwischen die glatt gemachte ClaI-Stelle und die 5'Pst-Stelle von μ in pNP2 (vergleich 5). Das angewendete Verfahren der Klonierung war jedoch aufgrund der Anwesenheit von vier Pst-Stellen in pNP2 vielstufig. Der Vektor pACYC184CM, der nicht über ClaI- und PstI-Stellen verfügt, wurde zuerst hergestellt, indem pACYC184 an seiner einzigen ClaI-Stelle geschnitten und die kohäsiven Enden unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase aufgefüllt und ligiert wurden. Danach wurde pACYC184CM mit BamHI geschnitten, und das BamHI-Fragment aus pNP2 mit der 5'μ-Sequenz wurde unter Bildung von pCMμ insertiert (vergleich 4). Der Vektor pCMμ enthielt einmalige ClaI- bzw. Pst-Stellen, die für die Klonierung des Oligonukleotids erforderlich waren (vergleich 5).
pCmμ wurde mit ClaI vollständig geschnitten, die Enden mit S1-Nuklease glatt gemacht, und anschließend mit PstI geschnitten. Das geschnittene Plasmid wurde auf einer Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und getrennt mit Paaren an Oligonukleotiden ligiert, wobei letztere in einem 100-fach molaren Überschuß vorlagen. Die eingesetzten Paare an Nukleotiden waren: R131 und R132 (für pNP11), R196 und R197 (für pNP12), und R202 und R203 (für pNP14). Diese weisen die unten dargestellten Sequenzen auf.
Die Ligationsmischung wurde anschließend zur Transformation von HB101 verwendet. Rekombinante Klone wurden mittels Koloniehybridisierung auf Nitrocellulosefiltern nachgewiesen, wobei eines von jedem Paar an Oligonukleotiden als Sonde eingesetzt wurde. Positive Klone wurden sequenziert und zeigten die korrekte Nukleotidsequenz. Die die klonierten Oligonukleotide enthaltenden μ-Sequenzen wurden in Form von EcoRV-BglII-Fragmenten herausgeschnitten. Diese wurden mit EcoRV-BglII geschnittenem pNP2 ligiert, um die vollständigen μ-Gene zu rekonstruieren (vergleich 5). Drei verschiedene Plasmide wurden gemäß dieses Vorgehens hergestellt: pNP11, pNP12 und pNP14 mit den in der obigen Tabelle 1 dargestellten Nukleotidsequenzen.
Im Konstrukt pNP11 wurde die potentiell schädigende Haarnadelschleife van pNP2 durch eine Veränderung der Reste in der degenerierten Position dreier Kodons und durch Einführen einer abweichenden A-D bis AUD-Sequenz entfernt. Diese Veränderungen ermöglichen der Region zwischen S-D und AUG eine Basenpaarung mit dem 5'-Ende der für μ kodierenden Sequenz, um eine Haarnadelschleife mit einem ΔG-Wert von –7,8 kcal zu bilden, was ungefähr demjenigen von pNP2 entspricht, aber die AUG- und S-D-Sequenzen exponiert läßt (vergleich 4). Die einzigen anderen sich gegenseitig ausschließenden Haarnadelschleifen weisen ΔG-Werte von –2,3, –3,6 bzw. +0,4 kcal auf.
Im Konstrukt pNP12 verbleibt die Sequenz von S-D bis AUG von pNP11, weist aber die Kodierungssequenz von pNP2 auf, so daß sich die Haarnadelschleife von pNP2 ausbilden kann (vergleich 4).
Das endgültige μ-Konstrukt war pNP14, welches die Sequenz zwischen S-D und AUG von pNP9 aufwies, aber die 5'-kodierende Se quenz von pNP11 besaß, so daß sich die Haarnadelschleife von pNP12 nicht bilden konnte. Das Konstrukt pNP14 hatte keine die S-D- oder μ-AUG-Sequenz maskierende Sekundärstruktur.
Die Expression des μ-Proteins von Konstrukten mit abweichenden Sekundärstrukturen der mRNA
E. coli B-Stämme, die die Plasmide pNP9, pNP11, pNP12 und pNP14 enthielten, wurden im Induktionsmedium kultiviert und es wurden Proben für einen ELISA-Assay entnommen. Die Konzentration an μ wurde in E. coli B-Zellen mit pNP11 im Vergleich zu denen mit pNP9 6–7 fach erhöht (vergleich Tabelle 1, Teil B). Das Plasmid pNP12, welches die Sequenz von S-D bis AUG von pNP11 aber die kodierende Sequenz von pNP9 umfaßte, zeigte im Vergleich zu pNP9 lediglich einen zweifachen Anstieg der Expressionsrate von μ.
Das Plasmid pNP14, welches die Sequenz zwischen S-D und AUG von pNP9 aber den für μ kodierenden 5'-Sequenzbereich von pNP11 aufwies und sich damit von pNP9 lediglich in drei Resten unterschied, zeigte im Vergleich zu pNP9 eine 90-fache Expression des μ-Proteins.
Ferner ist ein Plasmid pNP8 hergestellt worden, das ebenfalls vom trp-Promotor μ als Teil eines trpE-μ-Fusionsproteins exprimierte, welches die aminoterminalen 53 Aminosäuren von trpE und die carboxyterminalen 503 Aminosäuren von μ enthält. Der Grund zur Herstellung dieses Fusionsgens lag darin, daß μ eher von einer wirksamen bakteriellen Ribosomen-Bindungsstelle als von einer mit unbekannter Wirksamkeit translatiert wird. Anschließend kann die relative Wirksamkeit der Ribosomenbindung durch Vergleich der von pNP8 gebildeten Mengen an trpE-μ mit den von verschiedenen Konstrukten gebildeten μ-Mengen abgeschätzt werden. Bei Induktion des trpE-μ-Gens in pNP8 und Quantifizierung der Produkte durch ELISA wurde gefunden, daß die Expression von μ in pNP8 und pNP14 enthaltenden Stämmen sehr ähnlich war (vergleich Tabelle 1, Teil B). Die Sequenzen der Ribosomen-Bindungs stelle (RBS) von pNP11, pNP12 und pNP14 wurden erstellt, um die Hypothese zu untersuchen, daß eine Maskierung des Initiationskodons von der Sekundärstruktur zu einer Hemmung der Translationsinitiation führt, und um die Initiationsrate durch Freisetzung des Initiationskodons zu steigern. In pNP11 wurde die RBS-Haarnadelschleife von pNP2 und pNP9 durch Veränderung der für μ kodierenden 5'-Sequenz in der degenerativen Position dreier Kodons entfernt. Ferner wurde die Sequenz zwischen S-D und AUG verändert, um eine Basenpaarung dieser Region mit der 5' kodierenden Sequenz zu ermöglichen. Die Ergebnisse dieser Veränderungen führen dazu, daß das Initiationskodon in der Schleife der Haarnadel exponiert ist und sich die S-D-Sequenz an der Basis des Stammes befindet (vergleich 4). Diese Haarnadelschleife wies einen dem ΔG-Wert der Haarnadelschleife von pNP9 ungefähr entsprechenden ΔG-Wert auf. pNP11 enthaltende Stämme bildeten im Vergleich mit pNP9 enthaltenden 6–7 mal so viel μ. Um zu überprüfen, ob dieser Befund nicht eher auf die Abweichung in der Sequenz zwischen S-D und ATG als auf die Freisetzung des Initiationskodons zurückgeht, wurde pNP12 als Kontrolle geschaffen. Dieses Plasmid weist die Sequenz zwischen S-D und AUG von pNP11 auf, behält jedoch die für μ kodierende 5'-Sequenz von pNP9 bei, so daß sich die RBS-Haarnadelschleife von pNP11 nicht bilden kann, die Bildung der potentiell schädigenden Haarnadelschleife von pNP9 jedoch ermöglicht wird. Die Expressionsrate an μ von pNP12 war im Vergleich zu pNP9 lediglich zweifach gesteigert. Diese Steigerung liegt möglicherweise an dem veränderten Abstand zwischen S-D und AUG, an einem U in unmittelbarer 5'-Stellung zum Initiationskodon sowie daran, daß die Sequenz zwischen S-D und AUG arm an G ist, wobei sich jeder dieser Faktoren als vorteilhaft erwiesen hatte. Es ist daher wahrscheinlich, daß die gesteigerte Expression von pNP11 auf eine bevorzugte Sekundärstruktur der mRNA zurückgeht. Die RBS-Haarnadelschleife von pNP9 führt vermutlich zur Hemmung der Translation, während die Ausbildung einer weiteren Haarnadelschleife, welche das Initiationskodon exponiert, für die gesteigerte Expression verantwortlich ist.
Das Plasmid pNP14 wurde so hergestellt, daß es die Sequenz zwischen S-D und AUG von pNP9, aber die kodierende Sequenz von pNP11 besaß. Das Expressionsplasmid pNP14 unterschied sich somit von pNP9 in lediglich drei Resten in der degenerierten Position der drei Kodons, die pNP14 enthaltenden Stämme exprimierten im Vergleich zu den pNP9 enthaltenden 90-fach höhere Mengen an μ. Diese Steigerung der Expression kann nicht auf der Grundlage der drei veränderten Reste zur Optimierung der Kodonnutzung erklärt werden, da sie weniger favorisierte Kodons einführen, wie durch die Frequenz ihres Auftauchens in stark exprimierten E. coli-Genen festgestellt wurde.
Die gesteigerte Expression kann am besten durch die Vermeidung der Ausbildung von RBS-Haarnadelschleifen in pNP9 erklärt werden. Das beobachtete Ausmaß der Expressionssteigerung und die wenigen eingeführten Abweichungen hinsichtlich der Reste machen es schwierig, diese Ergebnisse unter Verweis auf die Veränderungen der Stabilität der mRNA zu interpretieren.
Die Expression von pNP8, welches das trpE-μ-Fusionsprotein aus einer nativen trpE-RBS kodiert, wurde ferner untersucht und zeigte eine mit pNP14 ungefähr vergleichbare Expressionsrate. Dies kann darauf hinweisen, daß die RBS von pNP14 hinsichtlich dessen Effizienz bei der Einleitung der Translationsinitiation der von trpE entspricht. Die native trpE-RBS von pNP8 und die von pNP14 wiesen keine Sekundärstrukturen auf, die den Gebrauch ihrer RBP-Sequenzen behinderten.
Expression des μ-Proteins in E. coli
Die das μ-Expressionsplasmid pNP11 enthaltenen E. coli B-Zellen wurden unter induzierenden Bedingungen und löslichen und unlöslichen Extrakten kultiviert und mittels SDS-PAGE analysiert. Eine neue Bande wurde beobachtet nach dem Färben des Gels mit Coomassie-Blue in der Proteine aus der unlöslichen Fraktion enthaltenden Spur (vergleich 6, Spur 2). Diese Bande wurde in der negativen Kontrollspur, welche Proteine aus derselben Fraktion aus pCT70 enthaltenden Zellen enthielt, nicht beobachtet worden (vergleich 6, Spur 3). Die neue Bande wanderte zu einer Position, die einem Protein mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 5% des tatsächlichen Molekulargewichts von nicht-glykosiliertem μ mit einem Wert von 62,5 Kd entspricht. Die Spuren wurden in doppelter Anzahl auf Nitrocellulose überführt und einem Western-Blotting unterworfen. Der Abgleich des gefärbten Gels mit dem Blot-Autoradiogramm bestätigt, daß diese neue Bande hinsichtlich der Antigenität mit IgM in Beziehung steht (vergleich 6, Spuren 4 und 8). Keine Bande wurde in den Extrakten der pCT70 enthaltenden Zellen gefunden (vergleich 6, Spuren 5 und 7). Lediglich eine geringe Menge an μ wurde in der löslichen Fraktion gefunden (vergleich 6, Spur 6).
Eine deutlich erhöhte Expressionsrate von μ im Vergleich zu HB101 wurde in E. coli B gefunden. Eine Pulse/Chase-Analyse zeigte, daß in E. coli B nach 60 minütigem Chase ein ähnlicher Level an μ-Protein nachgewiesen wurde (7, Spur 3), wie er nach der anfänglichen Markierungsdauer beobachtet worden war (7, Spur 1). Nach einem 10 minütigen Chase konnten in HB101 jedoch sehr kleine Mengen an μ-Protein nachgewiesen werden (7, Spur 7), und keine nach 30 Minuten (7, Spur 8), im Vergleich zu der Menge, die nach der anfänglichen Markierungsdauer nachgewiesen worden war (7, Spur 5).
Für die Pulse/Chase-Analyse erfolgten die Induktionen wie oben beschrieben mit der Ausnahme, daß das verwendete Medium folgende Bestandteile aufwies: Prolin (0,3 g/l), Leucin (0,1 g/l), Difco Methionin Assaymedium (5 g/l), Glucose (60 mg/l), Thiamin (10 mg/l), CaCl₂(22 mg/l), MgSO₄ (0,25 g/l), und Carbenicillin (0,1 g/l). Während des exponentiellen Wachstums wurden die Zellen 2 Minuten lang mit 30 μCi/ml L-[³⁵S]-Methionin pulsmarkiert, wonach unmarkiertes Methionin (100 μg/ml) zugegeben wurde und die Inkubation für die angegebenen Zeiten fortgeführt wurde.
Induzierte E. coli B-Zellen, die sich bei Untersuchung im Phasenkontrastmikroskop als pNP14 enthaltend erwiesen, enthielten Einschlußkörper.
Expression der leichten λ-Kette in E. coli
Eine frische 1 ml umfassende Übernachtkultur von E. coli HB101 oder RV308, die das zu untersuchende Plasmid enthielten, wurde in L-Broth (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) unter dem Zusatz von Carbenicillin auf 100 μg/ml kultiviert.
Eine Verdünnung von 1 : 100 dieser Kultur wurde in M9-Medium überführt (Maniatis, 1982, a.a.O.), welchem Glucose, Vitamin B1, Carbenicillin, Leucin und Prolin zugesetzt waren, und die Kulturen wurden 5–6 Stunden lang bei 37°C geschüttelt. Dann wurde 5-20 Minuten lang ³⁵S-Methionin zugegeben. Die Zellen wurden anschließend mittels Zentrifugation geerntet, durch 2 Minuten langes Kochen in 1% SDS lysiert und durch Zugabe eines Puffers bestehend aus 2% Triton X-100, 50 mM Tris pH-Wert 8, 0,15 M NaCl und 0,1 mM EDTA verdünnt. Die Immunpräzipitationen erfolgten durch Zugabe von Antiseren zu Aliquots von markierten E. coli-Extrakten, und nach einer Inkubation bei 4°C über Nacht wurden die Immunkomplexe durch Bindung an fixierte Staphylococcus aureus Zellen isoliert. Die Komplexe wurden durch Kochen in 60 mM Trispuffer pH-Wert 6,8 enthaltend 10% Glycerol, 3% SDS und 5 Mercaptoethanol aufgelöst und die freigesetzten Proteine auf 10%-igen oder 12,5%-igen Acrylamid/SDS-Gelen analysiert (Laemmli, UK. Nature, 227, 680–685, 1970). Die Gels wurden mit Coomassie Brillantblue zur Sichtbarmachung der Proteinbanden gefärbt, während markierte Proteine mittels Fluorographie unter Anwendung von 1M Natriumsalicylat auf einem Fuji-RX Filmnachgewiesen wurden.
pNP3 oder andere Plasmide enthaltende HB101 Zellen wurden unter induzierenden Bedingungen bis auf eine OD₆₀₀ von 0,6 kultiviert und die vorhandenen Proteine wurden mittels spezifischer Immunpräzipitation im wesentlichen wie oben beschrieben untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 8 dargestellt, in der die Spuren 1 und 2 Extrakte aus pCT54-19 bzw. pNP3 waren, welche mit normalem Kaninchenserum immunpräzipitiert worden waren. Die Spuren 3, 4 und 5 waren Extrakte, die mit anti-Lambda-Kaninchenserum immunpräzipitiert worden waren und repräsentieren pNP4 (Spur 3), pNP3 (Spur 4) und pCT54-19 (Spur 5). Die Position für unmarkiertes Lambda-Protein aus MOPC104E ist auf der linken Seite der 8 angezeigt. Sämtliche Plasmide bildeten ein Protein, welches mit die leichte λ-Kette enthaltendem anti-Maus-Kaninchenserum reagierte und mit der authentischen leichten λ₁-Kette aus dem Mausmyelom MOPC104E komigrierte. pNP3 produzierte jedoch die größte Menge an diesem Protein (vergleich Spur 4 mit den Spuren 3 und 5 der 8). Keine derartige Bande wurde mit einer Kontrollimmunopräzipitation unter Verwendung normalen Kaninchenserums nachgewiesen (8, Spuren 1 und 2). Untersuchungen unter Anwendung von kurzen Pulsen mit ³⁵S-Methionin, gefolgt durch ein Chasing mit Überschuß an kaltem Methionin zeigten, daß die rekombinante leichte λ-Kette eine Halbwertszeit von etwa 20 Minuten besaß.
Eine in vitro Transkription/Translation (Pratt et al., Nucleic Acids Research, 9, 4459–447, 1981) bestätigte, daß pNP3 für ein Protein kodierte, welches mit der authentischen leichten λ-Kette komigrierte. Dieses Produkt von 25 Kd wurde in vitro in einer mit der für β-Lactamase vergleichbaren Geschwindigkeit synthetisiert, was darauf hinweist, daß es in vivo zu einem Anteil von 0,5% an E. coli-Gesamtprotein snythetisiert wird. Diese Figur stimmt gut mit der Prozentzahl der in vivo synthetisierten rekombinanten λ-Produkte (0,4–2%) überein, wie sich aus der folgenden Gleichung ergibt:
Die Zellen wurden wie folgt aufgeschlossen (J. S. Emtage et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 3671–3715, 1983). Unter induzierenden Bedingungen kultivierte E. coli-HB101/pNP3-Zellen wurden geerntet und in 0,5 M Tris pH-Wert 8, 0,233 M NaCl, 5% Glycerol, enthaltend 130 g/ml Lysozym resuspendiert und 20 Minuten lang bei 4°C oder Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde Natriumdesoxycholat bis zu einer Endkonzentration von 0,05% sowie 10 μg DNAase 1 (aus Rinderpankreas) pro g Feuchtgewicht von E. coli zugegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten lang bei 15°C inkubiert, während dessen sich die Viskosität der Lösung deutlich verringerte. Der Extrakt wurde zentrifugiert (15 Minuten lang mit 10 000 g für kleine Volumina (1 ml) oder 1 Stunde für größere Volumina), um eine lösliche und eine unlösliche Fraktion zu erhalten.
Für die Immunpräzipitationen wurde die lösliche Fraktion in dem oben beschriebenen Triton enthaltenden Puffer verdünnt und die unlösliche Fraktion durch Kochen in 1% SDS nach Verdünnung in Triton-haltigem Puffer gelöst. pNP3 oder pNP4 enthaltende HB101 -Zellen wurden unter induzierenden Bedingungen kultiviert, mit [³⁵S]-Methianin pulsmarkiert, in lösliche und unlösliche Fraktionen getrennt und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 9 dargestellt, in welcher die Spuren 1 und 3 die lösliche Fraktion aus mit normalem Kaninchenserum bzw. mit anti-Lambda-Kaninchenserum immunpräzipitierten HB101-pNP3-Zellen wiedergeben und die Spuren 2 und 4 die unlösliche Fraktion aus mit normalem Kaninchenserum bzw. mit anti-Lambda-Kaninchenserum immunpräzipitierten HB101-pNP3-Zellen repräsentieren, und in welcher die Spuren 5 und 7 die lösliche Fraktion aus mit normalem Kaninchenserum bzw. anti-Lambda-Kaninchenserum immunpräzipitierten HB101-pNP4-Zellen wiedergeben, und in welcher die Spur 9 mit der löslichen Fraktion aus HB101-pNP3 und die Spur 10 mit der unlöslichen Fraktion aus HB101-pNP3 korrespondieren. Die Position des unmarkierten Lambda-Proteins aus MOPC104E ist auf der linken Seite der 9 angezeigt. Wenn ein derartiges Verfahren unter Einsatz von pNP3 durchgeführt wurde, war das rekombinante leichte λ-Kettenprotein eher in der unlöslichen Fraktion (9, Spur 4) als in der löslichen Fraktion (9, Spur 3) vorhanden. Eine mit der authentischen leichten λ₁-Kette komigrierende Bande von 25 Kd war weder bei der löslichen noch bei der unlöslichen Fraktion vorhanden, wenn sie mit normalem Kaninchenserum immunopräzipitiert worden waren (9, Spuren 1 und 2). Daraus leitet sich möglicherweise ab, daß sämtliche leichten Ig-Ketten wie in diesem spezifischen Beispiel fraktionieren.
Ohne Anwendung der spezifischen Immunpräzipitation war weder eine neue Proteinbande aus Extrakten von pNP3 enthaltenden HB101-Zellen sichtbar noch wurde eine Ansammlung von λ-Protein gefunden. Es wurde jedoch ein sehr großer Unterschied beobachtet wenn pNP3 in den K12-Stamm E103s eingeführt wurde. In diesem Stamm sammelte sich das λ-Protein während der Induktion bis zum Erreichen der stationären Phase (10, Spuren 3–5) bis zu einem im Vergleich zu HB101 150-fachen Wert an, wie mittels ELISA (Enzym-gekoppelter Immunoassay) bestimmt wurde. Diese Zellen enthielten Einschlußkörper, welche sich unter dem Lichtmikroskop refraktil zeigten, was als für hohe Expressionsrate an Fremdproteinen charakteristisches Phänomen bekannt ist. Eine Abschätzung des Prozentgehaltes an durch rekombinantes λ-Protein repräsentierten E. coli-Gesamtprotein wurde durch Auftrennung der Proteine mittels Gelelektrophorese erhalten, welche mit Coomassie Blue gefärbt und mit einem Joyce-Loebl-Chromoscan 3 gescannt wurden. Dieses Verfahren zeigt, daß λ das hauptsächlich vorhandene Protein war (10, Spur 5) und 13% des Gesamtproteingehalts von E. coli ausmacht. Das λ-Protein wies eine Halbwertszeit von 20 Minuten in HB101 auf, sammelte sich aber in sehr hoher Anzahl in E103s an, was darauf hindeutet, daß das λ-Protein in dem letztgenannten Stamm sehr viel stabiler war. Nach Zellyse und Zentrifugation der pNP3 enthaltenden HB101- bzw. E103s-Zellen, wurde die leichte λ-Kette nach Bestimmung mittels Färbung mit Coomassie Blue in der unlöslichen (10, Spuren 7 und 10) aber nicht in der löslichen Fraktion (10, Spur 6) nachgewiesen. Daß es sich bei der mit Coomassie Blue gefärbten Bande tatsächlich um das λ-Protein handelte, wurde mittels Western Blot Analyse bestätigt (10, Spuren 8–10). Die Anwesenheit derartig immunreaktiver Banden war für pNP3 enthaltende Zellen spezifisch. Wenn derselben Analyse Extrakte aus Zellen, die pCT70, einem Prochymosin exprimierenden Plasmid enthielten, zugeführt wurden, wurden keine Banden beobachtet. Die Anwendung dieser empfindlichen Technik zeigte, daß sich eine kleine Menge an λ-Protein in der löslichen Fraktion befand ( 10, Spur 9). Die Anwesenheit einer Anzahl distinkter immunreaktiver Proteine, die sämtlichst kleiner als Proteine vollständiger Größe sind, wurde ebenfalls beobachtet. Diese können aus proteolytischem Abbau des λ-Proteins, dem frühzeitigen Abbruch der Transkription oder aus einer internen Initiation der Translation resultieren.
Expression von μ- und Lambda-Polypeptiden in derselben Bakterienzelle
Die in den Expressionsplasmiden enthaltenen Igμ- und λ-Gene wurden in dieselbe E. coli-Zelle eingeführt, um die Synthese von sowohl Igμ- als auch λ-Polypeptiden zu steuern. Um die Inkompatibilität von Plasmiden zu beseitigen und einen zweiten antibiotischen Resistenzmarker bereitzustellen, wurden die trp-Promotor- und λ-Sequenzen auf einem HindIII-BamHI-Fragment aus pNP3 ausgeschnitten und in das HindIII-BamHI-Fragment von pACYC184 insertiert. Das resultierende Plasmid pACYCλ führte zu einem sehr geringen Wachstum von E. coli. Das schwache Wachstum wurde auf das Durchlesen der RNA-Polymerase in den Replikationsorigin zurückgeführt. Die Hemmung des Wachstums wurde jedoch durch das Klonieren des Transkriptionsterminators des Bakteriophagen T7 in die HindIII-Stelle des Plasmids pACYCλ praktisch beseitigt.
Dieser Terminator funktioniert in beiden Orientierungen. Das resultierende Plasmid pACλ T7-1 weist ein Resistenz-Gen gegen Chloramphenicol und einen Origin auf, der mit dem aus pBR322 abgeleiteten Origin von pNP14, dem Igμ exprimierenden Plasmid, kompatibel ist. Die Transformation derselben E. coli B-Zelle mit beiden Plasmiden erfolgte in zwei Stufen. Zunächst wurde pNP14 und dann pACλ T7-1 in zwei aufeinanderfolgenden Transformationen eingeführt, um gegenüber Ampicillin und Chloramphenicol resistente Klone zu erhalten.
Die aus diesem doppelt transformierten Klon erhaltenen E. coli B-Zellen wiesen Einschlußkörper und auf gefärbten Gelen zwei neue Polypeptidbanden der unlöslichen Fraktion nach der Lyse auf. Diese beiden Banden stimmen sowohl mit der mittels Western-Blotting für Igμ und Igλ nachgewiesenen immunologischen Aktivität als auch hinsichtlich ihrer erwarteten Molekulargewichte überein. Es ist damit gezeigt worden, daß der doppelt transformierte Klon beide heterologe Gene exprimiert. Dies ist bisher nicht gezeigt worden.
Die Anwesenheit der leichten λ-Kette in der unslöslichen Fraktion war ein sinnvoller Aufreinigungsschritt, da durch ihn sowohl das Protein konzentriert wurde als auch dessen Trennung von der Hauptmenge der löslichen E. coli-Proteine erfolgte.
Für ein weiteres Auf reinigen der leichten λ-Kette wurden die Zelltrümmer in 10 mM Tris-HCl pH-Wert 8,0, 25% Formamid, 7 M Harnstoff, 1 mM EDTA und 2 mM Dithiothreitol gelöst. Dieses Material wurde auf eine DEAE Sephacel-Säule (Pharmacia) (1 × 25 cm bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/h) geladen, welche mit 9 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl pH-Wert 8,0, 1 ml EDTA und 2 mM DTT equilibriert worden war. Die DEAE Sephacel-Säule wurde unter Anwendung eines NaCl-Gradienten von 0–150 mM in Probenpuffer entwickelt. Das mit dem Hauptpeak für Protein korrespondierende eluierte Peakmaterial der Immunreaktivität der leichten λ-Kette wurde auf eine Endkonzentration von 2,25 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 2 mM DTT verdünnt und auf eine Octyl-Sepharose-Säule (Pharmacia) (2,5 × 10 cm) geladen. Die Elution des Materials erfolgte mit einem Harnstoffgradienten von 2,25–9 M Harnstoff. Das Material des Peaks wurde vereinigt, gegen Ammoniumbicarbonat dialysiert und lyophilisiert. Im Anschluß an diese Behandlung wurde auf SDS-PAGE lediglich eine einzelne mit rekombinanten λ-Protein korrespondierende Bande des mit Coomassie Blue färbbaren Materials beobachtet.
Die schwere μ-Kette wurde von in 9M Harnstoff gelösten Pellets gereinigt durch Anionenaustauschchromatographie und Chromatofokussieren (Pharmacia).
Es war von größtem Interesse zu bestimmen, ob die gleichzeitige Expression von μ und λ zu einer Bildung von funktionalem IgM führen würde. Um dies nachzuweisen, wurden Extrakte aus E. coli hergestellt, die sowohl Igμ- als auch λ-Polypeptide enthielten, und diese wurden auf Antigenbindung untersucht. Wir wendeten einen zweistelligen Sandwich-ELISA an, mit welchem das Binden der μ-Kette an haptenyliertes bovines Serumalbumin (NIP-Caproat-BSA) nachgewiesen wird.
In dem NIP-Bindungsassay wird das bovine Serumalbumin (BSA) mit einer äquimolaren Menge an NIP-Cap-N-hydroxy-succinamind bei einem pH-Wert von 7,5 in 10 mM Phosphatpuffer umgesetzt. Das entstandene NIP-Cap-BSA wird von freiem NIP-Cap auf einer G-50 Sephadex-Säule getrennt.
Mikrotiterplatten (Nunc Immuno Plate 1 mit 96 Vertiefungen) werden mit 100 μl einer Lösung von 10 μg/ml NIP-BSA in 0,1 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Puffer mit einem pH-Wert von 9,6 (Beschichtungspuffer) bei 4°C über Nacht beschichtet.
Die beschichteten Platten werden anschließend für ein nichtspezifisches Binden durch Zugabe von 100 μl 0,5% Casein in Beschichtungspuffer (Blocking-Puffer) und einstündiger Inkubation bei 37°C blockiert.
Die beschichteten und blockierten Platten werden nachfolgend drei mal mit einem Puffer enthaltend 150 mM NaCl, 0,05% NP40, 20 mM Tris-H : Cl, pH-Wert 7,8 (Waschpuffer) gewaschen.
Die gewaschenen Platten werden von dem überschüssigen Waschpuffer durch Schütteln befreit und es erfolgt die Zugabe der Proben in ihrem Puffer oder typischerweise in 0,5% Casein in Waschpuffer (Probenpuffer) auf ein Endvolumen von 100 μl.
Um das Binden an NIP-BSA zu zeigen, wurden die zu untersuchenden Proben entweder mit NIP oder NP in freier Lösung bei verschiedenen Konzentrationen (von 60 bis 0,3 μM an NIP bzw. von 600 bis 3 μM für NP) angereichert.
Die Platten mit den Proben werden anschließend 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert und nachfolgend dreimal mit Waschpuffer gewaschen.
Die gewaschenen Platten werden dann mit 100 μl eines Konjugats von anti μ-Peroxidase (Verdünnung von 1 : 1000, TAGO Inc.) in Probenpuffer inokuliert und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Platten werden anschließend dreimal mit Waschpuffer gewaschen.
Die gewaschenen Platten werden mit 100 μl 0,1 M Natriumacetat-Citrat, pH-Wert 6,0, 0,1 mg/ml Tetramethylbenzidin, 13 mM H₂O₂ (Peroxidasesubstrat) inokuliert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 25 μl 2,5 M H₂SO₄ abgebrochen.
Die Mikrotiterplatten werden anschließend in einem Plattenlesegerät (Dynatech) bei 450 nm mit einer Referenz von 630 nm ausgewertet. Der 450-Wert wurde mit dem Wert eines Standardproteins B1-8 anti-NIP IgM in Beziehung gesetzt.
Dieser Assay zeigt eine Sensitivität von 60 pg B1-8 IgM. Die Extrakte wurden als lösliches und unlösliches Material hergestellt. Das unlösliche Material wurde in demselben Puffer gelöst, welcher bei der Lyse verwendet wurde, enthielt jedoch 8 M Harnstoff, wonach er für den Assay verdünnt wurde.
Um die Aktivität von Igμ und λ zu erhalten, wurden Extrakte der unlöslichen. Fraktion hergestellt und diese unter Pufferbedingungen dialysiert, bei denen ein Austausch von Disulfiden mit einer höheren Frequenz auftritt.
Die Herstellung der funktionalen Antikörper aus E. coli mit sowohl schweren als auch leichten Ketten erfolgte durch Lysieren der Zellen und Klären des Überstandes mittels Zentrifugation. Das unlösliche Material wurde gewaschen, anschließend mit Ultraschall behandelt (3 mal für jeweils 3 Minuten), und schließlich in 9M Harnstoff, 50 mM Glycin-NaOH pH-Wert 10,8, 1 mM EDTA und 20 mM 2-Mercaptoethanol gelöst. Dieser Extrakt wurde 40 Stunden lang gegen dreimal 20 Volumina an 100 mM KCl, 50 mM Glycin-NaOH pH-Wert 10,8, 5% Glycerol, 0,05 mM EDTA, 0,5 mM reduziertem Glutathion und 0,1 mM oxidiertem Glutathion dialysiert. Das Dialysat wurde durch 15 Minuten langes Zentrifugieren mit 30 000 g geklärt und direkt auf eine DEAE Sephacel geladen, und anschließend mit einem 0–0,5 M KCl aufweisenden linearen Gradienten in 10 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH-Wert 8,0, entwickelt.
Das gereinigte Igμ und λ wurde wie oben beschrieben behandelt mit der Ausnahme, daß keine Anionenaustauschchromatographie erfolgte. Die Zubereitung wurde schließlich gegen mit Phosphat gepufferte Saline, 5% Glycerol, 0,01% Natriumazid und 0,5 mM EDTA pH-Wert 7,4 dialysiert.
Die Ergebnisse aus Assays mit in dieser Weise bearbeitetem Material deuteten darauf hin, daß eine gewisse Aktivität erhalten wurde. Der Level an auf diese Weise erhaltener Aktivität war zu gering, als daß er Gegenstand weiterer Untersuchungen sein konn te. Daher wurde das entstandene Dialysat mittels Anionenaustauschchromatograpie gereinigt (11). Dieser Schritt führte zur Isolierung einer gegenüber der Hintergrundbindung an BSA signifikanten NIP-Cap-BSA-Bindungsaktivität (11). Die Analyse der Fraktionen auf ihren Gehalt an Igμ, ausgedrückt als B1-8 IgM-Äquivalente, führte zu zwei Aktivitätspeaks. Eine Korrelation dieses Befundes mit dem vollständigen Igμ auf Western-Blotting wurde nicht festgestellt. Der erste beobachtete Peak kein ein Fragment von Igμ darstellen. Die Trennung der NIP-CAP-BSA-Bindungsaktivität von der überwiegenden Menge an vollständigem Igμ und Protein weist darauf hin, daß die Hapten-Bindungsaktivität in einer besonderen molekularen Spezies enthalten ist, welche sich mit geringer Effizienz bildet.
Die Behandlung des unlöslichen Materials aus der Expression von Igμ in E. coli führte zu einem ähnlichen Profil an IgM-Protein, jedoch ohne NIP-Cap-BSA-Bindungsaktivität. Dies zeigt, daß die nachgewiesene Aktivität eine Eigenschaft der kombinierten Expression von Immunglobulin und nicht auf einen E. coli-Faktor oder allein auf die schwere Igμ-Kette zurückzuführen war.
Weitere Untersuchungen der Eigenschaften der Hapten (NIP-Cap-BSA)-Bindung wurden durchgeführt. Bei Verdünnung zeigten die Proben ein schwächeres Binden an Hapten in einer mit dem Originalantikörper vergleichbaren Weise (12). Sowohl bei den unverdünnten wie auch den verdünnten Proben führte freies Hapten zu einer überwiegenden Hemmung der Bindungsaktivität. Unter Verwendung von B1-8 Antikörper als Standard für das Binden an sowohl IgM als auch an Hapten wurde die spezifische Aktivität des zusammengefügten Antikörpers mit einem Wert von 1,4 × 10 g/g IgM-Äquivalenten berechnet. Dieser wert zeigt die uneffiziente Ausbeute an Aktivität, aber repräsentiert möglicherweise eine durch die oben beschriebene Überschätzung des Gehalts an vollständigem Igμ in diesen Fraktionen verursachten Unterschätzung der spezifischen Aktivität.
Die verschiedenartige Natur des rekombinierten Antikörpers
Die genaue Spezifität der Bindung an NIP-Cap-BSA wurde untersucht, indem die zusammengesetzten Antikörper mit B1-8 IgM in Gegenwart von freiem NIP-Cap und NP-Cap verglichen wurden ( 13). Sowohl B1-8 IgM als auch die zusammengesetzten Antikörper zeigten, daß zur Hemmung der NIP-Cap-BSA-Bindung höhere Konzentrationen an NP-Cap als an NIP-Cap erforderlich waren.
Die verschiedenartige Natur wird durch das molare Verhältnis von NIP zu NP bei einer Hemmung von 50% dargestellt. Die Konzentrationen an NIP und NP bei einer Hemmung von 50% (I50) waren für B1-8 und auch für die zusammengesetzten Antikörper gleich, wie in Tabelle 2 dargestellt. Auch die Verhältnisse von NP I50/NIP I50 waren ähnlich (Tabelle 2). Tabelle 2. Haptenkonzentration bei einer Hemmung von 50 (I50) der Bindung von Antikörper an Festphasen gebundenes NIP-Cap-BSA.

SA: Standardabweichung

Es ist damit gezeigt worden, daß es nicht nur möglich ist, die μ- und λ-Proteine mit intakten variablen Domänen zu exprimieren, sondern daß es auch möglich ist, sowohl μ- als auch λ-Proteine auf kompatiblen Plasmiden in derselben Zelle zu exprimieren. Letzteres ist bisher weder offenbart noch nahegelegt worden. Darüber hinaus ergab sich die Möglichkeit, aus E. coli-Zellen, die sowohl μ- als auch λ-Proteine exprimierten, funktionelle Ig-Moleküle zu. erhalten.
Herstellung von Expressionsplasmiden für Hefe
Die zur Expression in Hefe (Saccharomyces cerevisiae) verwendeten Plasmide gehen auf pBR322 und das 2 Mikron-Plasmid der Hefe zurück. Diese Plasmide sind Gegenstand der ebenfalls anhängigen europäischen Patentanmeldung EP 0 073 635 , auf die hier Bezug genommen wird. Das Hefe-Gen für Phosphoglyceratkinase (PGK) stellt die für die Initiation der Transkription erforderliche 5'-Sequenz bereit, und die Insertion von Genen kann an der einzigen BglII-Stelle des Plasmids pMA 3013 erfolgen, wie in der oben genannten Patentanmeldung beschrieben wird. Dieses Plasmid trägt nunmehr die neue Bezeichnung pMA91.
a) met-mu (μ)
BglII und BclI führen zu kompatiblen 5'-GATC-Enden. Das met-μ-Gen aus pNP2 wurde auf einem partiellen BclI-Fragment herausgeschnitten und mit der einzigen BglII-Stelle von pMA91 ligiert.
b) Prä-mu (μ)
Das die Präμ-cDNA vollständiger Länge enthaltende Plasmid pCT54μ wurde mit HindIII geschnitten. Dieses Enzym schneidet an der 3'-Seite der μ-cDNA. Diese HindIII-Stelle wurde durch Inkubation mit T4 DNA-Polymerase in Gegenwart aller 4 Nukleotide in eine BclI-Stelle umgewandelt. Der Linker R107 mit der Sequenz TTTTGATCAAAA, welcher eine interne BclI-Stelle aufweist, wurde mit der oben erhaltenen DNA ligiert. Nach der Ligation wurde ein Aliquot der entstandenen DNA mit BclI und AccI geschnitten und das μ AccI-BclI-Fragment wurde aus der resultierenden Mischung gelelektrophoretisch isoliert. Ein getrenntes Aliquot der entstandenen DNA wurde mit MboII geschnitten und mit chemisch synthetisierten Oligonukleotid-Linkern R121 und R112 ligiert, welche über kohäsive BclI- und MboII-Enden verfügen.
Die Ligation wurde abgebrochen und die resultierende DNA mit AccI geschnitten, um ein μMboII-AccI-Fragment zu ergeben, welches aus der resultierenden Mischung mittels Gelelektrophorese auf einem 5%-igen Polyacrylamidgel isoliert wurde.
Die beiden oben erhaltenen μ-Fragmente wurden miteinander ligiert und anschließend mit BclI geschnitten, um unerwünschte Ligationsprodukte zu beseitigen, wonach die resultierende PräμDNA mit dem mit BglII geschnittenen Plasmid pMA91 ligiert wurde.
Die entstandene Ligationsmischung wurde zur Transformation des E. coli-Stammes HB101 verwendet, welchem auf diese Weise Ampicillinresistenz verliehen wurde. Eine Kolonie der transformierten Bakterien wurde isoliert und enthielt ein Plasmid, welches das vorhergesagte Restriktionsmuster aufwies. Das 5'-Ende der insertierten DNA dieses Plasmids wurde sequenziert und wies die erwartete Sequenz einer Prä-μ cDNA auf.
c) met-lambda (λ)
Die met-λ DNA wurde in die BglII-Stelle des Plasmids pMA91 kloniert. Der Plasmid pCT54-Klon 1 wurde an der 3'-Stelle der met-λ cDNA mit HindIII geschnitten und diese Schnittstelle wurde in einer wie zuvor für pNP2 beschriebenen weise in eine BclI-Stelle umgewandelt. Anschließend wurde die plasmidäre DNA an der 5'-Seite des λ-Gens an der BclI-Stelle geschnitten und die resultierenden λ-DNA wurde in die BglII-Stelle von pMA91 kloniert.
d) Prä-lambda (λ)
Die Prä-λ cDNA wurde in pMA91 wie folgt rekonstruiert. Das Plasmid pCT54 wurde mit BclI und HindIII geschnitten und die resultierende Vektor-DNA mittels Gelelektrophorese isoliert und mit zwei synthetischen Oligonukleotiden R162 und R163 und den beiden Fragmenten aus Plasmid pATλ1-15 ligiert.
Diese Fragmente wurden durch Restriktion von pATλ1-15 mit FokI und HindIII und anschließender Isolierung des 5' gelegenen 300 Basenpaare umfassenden FokI-Fragments und des 3' gelegenen 600 Basenpaare umfassenden FokI-HindIII-Fragments mittels Gelelektrophorese isoliert. Die resultierende Ligationsmischung wurde zur Transformation des E. coli-Stammes HB101 verwendet, welcher dadurch Ampicillinresistenz verliehen wurde, und es wurde eine Bakterienkalonie isoliert, die ein Plasmid enthielt, welches das vorhergesagte korrekte Restriktionsmuster aufwies. Das 5'-Ende der insertierten DNA wurde sequenziert und wies die erwartete Sequenz einer Prä-λ cDNA auf. Dieses Plasmid wurde mit HindIII geschnitten und die resultierenden HindIII-geschnittenen Enden wurden durch Schaffung glatter Enden mit T4-Polymerase in eine BclI-Stelle überführt und mit dem Linker R107 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde anschließend mit BclI geschnitten und die Prä-λ cDNA aus einem BclI-Fragment gelelektrophoretisch isoliert. Dieses BclI-Fragment wurde dann mit BglI-geschnittenem pMA91 ligiert, um ein pMA91 Plasmid zu erhalten, welches die Prä-λ cDNA in voller Länge enthielt.
Expression von Immunglobulin-Genen in Hefe
Die aus pMA91 abgeleiteten wie oben beschrieben hergestellten Plasmide mit den Genen für Prä-λ und Prä-μ wurden zur Transformation des Wirtsorganismus Saccharomyces cerevisiae verwendet und die Gene für Pä-λ und Prä-μ wurden von den transformierten Zellen exprimiert.
Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm MD46 führte unter Transformation mit pMA91 Prä-λ oder pMA91 Prä-μ zu Kolonien, welche immun reaktive Proteine exprimierten, wie auf Western-Blots nachgewiesen wurde. Das Plasmid pMA91 Prä-λ enthaltende Hefezellen bildeten ein Protein, welches mit anti-λ-Antiserum reagierte und auf Polyacrylamidgelen mit bakteriell synthetisiertem reifen λ komigrierte. In gleicher Weise führten pMA91 Prä-μ enthaltende Hefezellen zu einem Protein, welches mit anti-μ-Antiserum reagierte und auf Polyacrylamidgelen mit bakteriell synthetisiertem reifem μ-Protein komigrierte. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, daß sowohl Prä-λ als auch Prä-μ in der Wirtszelle des Hefestammes in ihre entsprechenden reifen Proteine prozessiert werden.
Ferner zeigte sich, daß das μ-Proteinprodukt (aber nicht das λ-Protein) glykosyliert war. Die Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Tunicamycin mit einer Konzentration von 15 μg/ml inkubiert. Diese Verbindung führt in spezifischer Weise zur Unterbrechung der N-verknüpften Glykosylierung der Proteine. Zellextrakte aus Zellen, die unter Abwesenheit von Tunicamycin inkubiert worden waren, zeigten Banden von höherem Molekulargewicht (wie durch Western-Blotting nachgewiesen wurde), während die Extrakte aus Zellen, welche in Gegenwart von Tunicamycin inkubiert worden waren, keine derartigen Banden von höherem Molekulargewicht aufwiesen.
Bei einer Lyse der Zellen mit Glaskügelchen und einer Untersuchung der löslichen und unlöslichen Fraktionen stellte sich bei einer Western-Blot-Analyse heraus, daß die μ- und λ-Proteine ausschließlich in den unlöslichen Fraktionen vorlagen.
Sekretion
Nach Inkubation wurden die transformierten Hefezellen abzentrifugiert und es wurden Volumina von 1 ml Überstand entnommen und mit BSA-beschichteten 0,2 μM Millipore Filter filtriert, um jegliches verbleibendes zelluläre Material zu entfernen. Mit den filtrierten Überständen erfolgten sodann ELISA-Assays für das μ- und λ-Protein. Lediglich die Überstände der das Plasmid pMA91 Prä-λ enthaltenden Zellen zeigten nachweisbare Mengen an Immunglobulinprotein. Erhöhte Mengen an λ-Protein wurden in den Überständen festgestellt, wenn die Zellen in Minimalmedium bis zu einer OD₆₆₀ von 0,2 kultiviert und anschließend abzentrifugiert, in YPAB resuspendiert und bei einer OD₆₆₀ von 1,0 bis 1,5 geerntet worden waren. Auf diese Weise wird lediglich das λ-Protein aber nicht das μ-Protein von den Hefezellen ausgeschieden.
Intrazelluläre Lokalisierung
Nach der Inkubation wurden die das Plasmid pMA91 Prä-μ enthaltenden Zellen in Spheroblasten überführt, in 5% Essigsäure/95 Ethanol (Vol./Vol.) fixiert und mit Fluorescein-konjugiertem anti-Maus-μ der Ziege inkubiert. Die fixierten Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht und das μ-Protein wurde in der Peripherie der Spheroblasten und insbesondere in Vakuolen lokalisiert.
Expression von sowohl μ- als auch λ-Proteinen in denselben Zellen
Um beide Gene in der selben Wirtszelle zu exprimieren war es erforderlich, für die Transformation kompatible Plasmide bereitzustellen. Das Gen für Prä-λ wurde aus pMA91 Prä-λ auf einem HindIII-Fragment herausgeschnitten und in die HindIII-Stelle des Plasmids pLG89 (L. Griti und J. Davies, Gene, 25, 179–188, 1983) insertiert. Dieses Plasmid enthält einen ura3-Marker, welcher für eine positive Auswahl transformierter Wirtszellen eingesetzt werden kann. Ein geeigneter ura3^–-Wirtsorganismus ist der S. cerevisiae-Stamm X4003-5B. Dieser Stamm wurde mit den beiden Plasmiden pMA91 Prä-μ und pLG89 Prä-λ transformiert, wodurch Kolonien entstanden, welche sowohl den Marker für ura3 als auch den für leu2 enthielten. Nach Inkubation der transformierten Zellen wurden unter Anwendung der ELISA-Technik sowohl λ- als auch μ-Proteine in denselben Kulturen von X4003-5B nachgewiesen. Die Expressionsraten waren mit denen vergleichbar, die für die indi viduellen Gene in MD46-Zellen und für das λ-Gen allein in X4003-5B-Zellen erhalten wurden.
Ferner wurde zur Überprüfung der Zusammenlagerung der λ- und μ-Proteine in. vivo das folgende Verfahren durchgeführt:
Nach Wachstum bis zu einer OD₆₆₀ von etwa 1 wurden die transformierten X4003-5B-Zellen abzentrifugiert und entweder in einem 5 mM Boratpuffer bei pH 8,0 oder in einem Phosphatpuffer bei pH 5,8 mit oder ohne Detergens (z. B. 0,5% Triton X) resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden anschließend durch Vortexen mit Glaskügelchen in Puffer wie oben beschrieben lysiert und das unlösliche Material abzentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden Aliquots des Überstandes in einem NIP-Bindungsassay (wie zuvor für die zusammengesetzten μ- und λ-Proteine von E. coli beschrieben) analysiert. Eine spezifische Antigen-Bindungsaktivität wurde in dem Überstand nachgewiesen und diese Aktivität wurde von freiem NIP (dem spezifischen Antigen) in spezifischer Weise aufgehoben. Diese Ergebnisse zeigen, daß die μ- und λ-Proteine innerhalb der X4003-5B-Zellen exprimiert wurden und sich in vivo zu funktionellen Immunglobulinmolekülen zusammenlagerten.
Bei den obigen Experimenten war das zur Inkubation der transformierten Zellen eingesetzte Kulturmedium das Minimalmedium für Hefe (welches pro Liter 6,7 g Difco yeast Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 10 g Glucose und jeweils 200 mg von Histidin, Tryptophan, Methionin und Adenin enthielt). Wenn nur das λ-Protein exprimiert wurde, enthielt das Medium zusätzlich 200 mg/l Leucin, und wenn lediglich das μ-Protein exprimiert wurde, enthielt das Medium zusätzlich 200 mg/l Uracil.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines heterologen Ig-Moleküls oder eines immunologisch funktionellen Ig-Fragments in einer einzelnen Hefewirtszelle, welches das Transformieren der Wirtszelle mit getrennten DNA-Sequenzen mit entsprechend kodierenden Polypeptidketten, umfassend mindestens die variablen Domänen der schweren und leichten Ig-Ketten, und die getrennte Expression jeder der Polypeptidketten in der transformierten einzelnen Hefewirtszelle umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jede DNA-Sequenz individuell in einen Vektor insertiert wird und der individuelle Vektor zur Transformation der einzelnen Wirtszelle verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zwei DNA-Sequenzen in getrennte Abschnitte eines Vektors insertiert werden, welcher zur Transformation der einzelnen Wirtszelle verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei der oder jeder Vektor ein Plasmid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Wirtszelle S.cerevisiae ist
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Polypeptidketten von der Wirtszelle sekretiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Ig- Moleküls oder -Fragments mit mindestens einer konstanten Domäne, wobei die oder jede konstante Domäne aus der gleichen Quelle wie die variable Domäne, an die sie gebunden ist, stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Ig-Moleküls oder -Fragments mit mindestens einer konstanten Domäne, wobei die oder jede konstante Domäne aus einer Quelle stammt, welche unterschiedlich von der ist, aus welcher die variable Domäne, an die sie gebunden ist, stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die DNA-Sequenzen vollständige schwere und leichte Ig-Ketten kodieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die DNA-Sequenzen nur eine konstante Domäne kodieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei mindestens eine der DNA-Sequenzen mindestens die variable Region einer schweren oder leichten Ig-Kette und auch einen cytotoxischen, enzymatischen oder strukturellen Polypeptidteil kodiert, wodurch die Wirtszelle transformiert wird, um ein Ig-Molekül oder -Fragment herzustellen, welches daran gebunden den cytotoxischen, enzymatischen oder strukturellen Polypeptidanteil aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die DNA-kodierenden Sequenzen für das Ig-Molekül oder -Fragment aus einem oder mehreren monoklonalen Antikörper-erzeugenden Hybridomas stammen.
Vektor zur Verwendung in einem Verfahren aus einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend getrennte DNA-Sequenzen mit entsprechend kodierenden Polypeptidketten, umfassend mindestens die variablen Domänen der schweren und leichten Ig-Ketten.
Vektor nach Anspruch 13, welcher ein Plasmid ist.
Hefewirtszelle, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 13 oder Anspruch 14.
Hefewirtszelle, transformiert mit zwei getrennten Vektoren, wobei der erste Vektor eine DNA-Sequenz umfaßt, welche eine Polypeptidkette kodiert, welche mindestens die variable Domäne der schweren Ig-Kette umfaßt, und der zweite Vektor eine DNA-Sequenz umfaßt, welche eine Polypeptidkette kodiert, welche mindestens die variable Domäne der leichten Ig-Kette umfaßt.