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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberDE3027105 C2
Publication typeGrant
Application numberDE19803027105
Publication date25 Aug 1988
Filing date17 Jul 1980
Priority date20 Jul 1979
Also published asCA1128881A, CA1128881A1, DE3027105A1, US4342828
Publication number19803027105, 803027105, DE 3027105 C2, DE 3027105C2, DE-C2-3027105, DE19803027105, DE3027105 C2, DE3027105C2, DE803027105
InventorsFumimaro Utsunomiya Jp Takaku, Katsuhiro Yokohama Jp Ogasa, Morio Kuboyama, Nobuya Tokio/Tokyo Jp Yanai, Muneo Kodaira Jp Yamada, Yoshiteru Tokio/Tokyo Jp Watanabe
ApplicantMorinaga Milk Industry Co. Ltd., Tokio/Tokyo, Jp, The Green Cross Corp., Osaka, Jp
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: DPMA, Espacenet

DE 3027105 C2
Abstract  available in
Claims(8)  translated from German
1. Verfahren zur Herstellung eines Faktors mit stimulierender Wirkung auf die Proliferation und Differenzierung menschlicher granulopoetischer Stammzellen, dadurch gekennzeichnet , daß man Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut in einem ein Glykoproteid enthaltenden Gewebekulturmedium vermehrt und den gebildeten Faktor aus der Kulturflüssig keit isoliert, wobei das Glykoproteid dadurch erhalten worden ist, daß man die in menschlichem Urin enthaltenen Proteine konzentriert, die erhaltenen Proteine zur Abtrennung von Verunreinigungen mit einem Kationenaus tauscher behandelt, das Eluat zur Adsorption des Glykoproteids mit einem Anionenaustauscher behandelt, das Glykoproteid aus dem Anionenaustauscher mit einer Salz lösung mit linearem Konzentrationsgradient eluiert, das Eluat der Gelfiltrationschromatographie an einem stark vernetzten Polymergel unterwirft, um das Glykoproteid zu entwickeln, und die Fraktionen mit relativen Elutions volumen (das erforderliche Volumen des Lösungsmittels, das zum Eluieren der Substanz von der Säule erforderlich ist, zu Leervolumen der Gelsäure) von 1,11 bis 1,60 auf fängt. 1. A method for producing a factor with stimulatory activity on proliferation and differentiation of human granulopoetischer stem cells, characterized in that increased monocytes and macrophages from human peripheral blood in a a glycoprotein containing tissue culture medium, and the formed factor from the culture liquid speed isolated, wherein the glycoprotein has been obtained by concentrating the proteins present in human urine, treating the obtained proteins for the removal of impurities with a cation-exchanger, the eluate is treated to adsorb the Glykoproteids with an anion exchanger, the glycoprotein from the anion exchanger with a salt solution with linear concentration gradient eluted, the eluate of the gel filtration chromatography is subjected to a highly crosslinked polymer gel, to develop the glycoprotein, and the fractions having relative elution volume (the required volume of solvent which is necessary to elute the substance from the column to empty volume of the Gelsäure ) of 1.11 to 1.60 on catches.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermehrung der Monozyten und Makrophagen in Gegenwart von Serum durchführt. 2. The method according to claim 1, characterized in that one carries out the propagation of the monocytes and macrophages in the presence of serum.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serum menschliches Serum einsetzt. 3. The method according to claim 2, characterized in that one uses human serum as serum.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serum in einer Menge von mindestens 5%, bezogen auf das Volumen des Mediums, einsetzt. 4. The method according to claim 3, characterized in that the serum in an amount of at least 5%, based on the volume of the medium is used.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Glykoproteid, welches die Bildung von mensch lichen Granulozyten stimuliert, in einer Menge von mindestens 0,1 µl/ml Medium einsetzt. 5. The method according to claim 1, characterized in that, employing the glycoprotein which stimulates the formation of human granulocytes union in an amount of at least 0.1 ul / ml medium.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Glykoproteid, welches die Bildung von Mäuse makrophagen und Granulozyten stimuliert, in einer Menge von mindestens 500 Einheiten/ml Medium einsetzt. 6. The method according to claim 1, characterized in that the glycoprotein is used, which the formation of macrophages and granulocytes stimulated mice, in an amount of at least 500 units / ml of medium.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Glykoproteid als teilweise gereinigtes Material einsetzt, das noch Harnproteine enthält. 7. The method according to claim 1, characterized in that the glycoprotein is used as partially purified material which still contains urinary proteins.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Monozyten und Makrophagen, die in das Gewebekulturmedium überimpft werden, mindestens 10⁵/ml beträgt. 8. The method according to claim 1, characterized in that the number of monocytes and macrophages, are inoculated into the tissue culture medium, at least 10⁵ / ml.
Description  translated from German

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines die Proliferation und Differenzierung menschlicher granulo poetischer Stammzellen stimulierenden Faktors, nachstehend als Colony stimulating factor (CSF) bezeichnet, gemäß Anspruch 1. Dieser Faktor ist ein Arzneistoff, der zur Behandlung von Granulo zytopenie beim Menschen eingesetzt werden kann. The invention relates to a method for producing a proliferation and differentiation of human granulo poetic stem cell stimulatory factor, hereinafter referred to as Colony stimulating factor (CSF) referred to, according to claim 1. This factor is a drug for the treatment of cytopenia granulocytes can be used in humans , Die Unter ansprüche nennen Ausgestaltungen der Erfindung. The call sub-claims of the invention.

Es ist bekannt, daß CSF eine Schlüsselfunktion bei der Granulopoesis und der Bildung von Monozyten und/oder Makro phagen in vivo hat, CSF wirkt im menschlichen Körper auf die Blutstammzellen, welche die Mutterzellen für die Granulo zyten, Monozyten und Makrophagen darstellen; It is known that CSF phage a key role in the Granulopoesis and the formation of monocytes and / or macro has in vivo, CSF acts in the human body to the blood stem cells, which cytes the parent cells for granulocytes, monocytes and macrophages represent; vgl. D. Metcalf, Experimental Haematology, Bd. 1 (1973), S. 185 bis 201. Der Vorschlag der Verwendung von CSF als Arzneistoff zur Behand lung von Granulozytopenie stammt von T. Fumimaro, Igaku no Ayumi (Progress in Medical Science), Bd. 95, Nr. 2 (1975), S. 41 bis 50. Bisher wurde jedoch CSF als Arzneistoff nicht eingesetzt, weil der Mechanismus der Bildung von Granulo zyten, Monozyten und Makrophagen in vivo kompliziert ist, das Verhalten von CSF dabei noch teilweise unbekannt ist und es schwierig war, große Mengen CSF in pharmakologisch annehmbarer Qualität herzustellen. see. D. Metcalf, Experimental Haematology, vol. 1 (1973), pp 185 to 201. The proposal of using CSF as a drug for treat- ment of granulocytopenia is authored by T. Fumimaro, Igaku no Ayumi (Progress in Medical Science) , vol. 95, no. 2 (1975), pp 41 to 50. So far, however, was not used CSF as a drug, because the mechanism of formation of granulocytes phocytes, monocytes and macrophages in vivo is complicated, the behavior of CSF while still is partially unknown and it was difficult to produce large amounts of CSF in pharmacologically acceptable quality.

CSF kann auch als Diagnostikum verwendet werden. CSF can also be used as a diagnostic. Es ist bekannt, daß die Bestimmung der Anzahl von auf CSF-reagierenden Zellen in Knochenmarkzellen von erheblicher Bedeutung für die Prognose von Patienten ist, die an myelogener Leukämie leiden; It is known that the determination of the number of on-CSF responsive cells in bone marrow cells of considerable importance for the prognosis of patients suffering from myelogenous leukemia; vgl. Nakao und Takaku, Proliferation and Differantia tion of Blood Cells - Fundamental and Clinical Aspects, S. 29, Verlag Kagaku Hyoron-sha Co., Japan, 1975. CSF eignet sich als Reagens (Bezugsstimulator) für diesen Zweck. see Nakao and Takaku, proliferation and Differantia tion of Blood Cells -. Fundamental and Clinical Aspects, page 29, published by Kagaku Hyoron-sha Co., Japan, 1975. CSF is suitable as a reagent (Bezugsstimulator) for this purpose. Ebenso wie im vorstehenden Fall der Verwendung als Arznei stoff ist CSF auch zur Diagnose bis jetzt nicht eingesetzt worden, weil es schwierig war, größere Mengen mit ausrei chender Qualität für diagnostische Zwecke herzustellen. Just as in the previous case being used as drug substance CSF has not been used for the diagnosis until now because it was difficult to produce large quantities with suffi cient quality for diagnostic purposes.

Zur Herstellung von CSF, das unmittelbar auf die Stammzellen wirkt, sind verschiedene Verfahren bekannt, beispiels weise die Züchtung von Leukozyten aus menschlichem peripherem Blut (GB Price und Mitarb., Biochemical Journal, Bd. 148 (1975), S. 209 bis 217), menschlichen Plazentazellen (vgl. AW Burges und Mitarb., Blood, Bd. 49, Nr. 4 (1977), S. 573 bis 583) oder bestimmten Krebszellen, die CSF bilden (vgl. N. Osawa und Mitarb., Acta Hematologica Japonica, Bd. 42, Nr. 2 (1979), S. 237). For the production of CSF, which acts directly on the stem cells, various methods are known, as example the cultivation of leukocytes from human peripheral blood (GB Price et al., Biochemical Journal, Vol. 148 (1975), pp 209-217) , human placental cells (see FIG. AW Burges et al., Blood, Vol. 49, Nr. 4 (1977), pp 573-583) or certain cancer cells forming CSF (see FIG. N. Osawa et al., Acta Hematologica Japonica, vol. 42, no. 2 (1979), p 237). Möglicherweise sind von den vorstehend beschriebenen Verfahren die Verfahren von Price und Mitarb. Perhaps many of the methods described above, the method of Price et al. und Burges und Mitarb. and Burges et al. zur Herstellung von CSF für pharmazeutische Zwecke geeignet. suitable for the production of CSF for pharmaceutical purposes. Die üblichen Ver fahren unter Verwendung von Leukozyten oder menschlichen Plazentazellen sind jedoch lediglich Labormethoden zur Gewinnung kleiner Mengen CSF, und sie sind zur technischen Herstellung von CSF ungeeignet. The usual Ver drive using leukocytes or human placental cells, however, are only laboratory methods for the production of small amounts of CSF, and they are for the industrial production of CSF inappropriate. Weiterhin muß zur Herstellung von CSF nach dem bekannten Verfahren das Medium zur Züchtung der Zellen Serum enthalten. Must continue for the production of CSF by the known method, the medium for culturing the cells contain serum. In Abwesenheit von Serum wird nämlich kein CSF gebildet. In the absence of serum, no CSF is formed viz. In der Regel wird Rinderserum oder fetales Kälberserum verwendet. In general, bovine serum or fetal calf serum is used. Zur Vermeidung von Neben wirkungen (Sensibilisierung und anaphylaktischer Schock) durch diese Fremdproteine in den Medien ist es erforderlich, die Proteine nach der Vermehrung der Zellen abzutrennen oder menschliches Serum zu verwenden. To avoid side effects (sensitization and anaphylactic shock) by these foreign proteins in the media, it is necessary to separate the proteins according to the multiplication of the cells, or to use human serum. Die Abtrennung dieser Proteine aus dem gebildeten CSF im Medium ist umständlich und schwierig, und die Verwendung von menschlichem Serum ist teuer. The separation of these proteins in the CSF formed in the medium is cumbersome and difficult, and the use of human serum is expensive.

Die Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von CSF zu entwickeln, das in technischem Umfang durchführbar ist und CSF liefert, das sich zur Behandlung von Granulozytopenie in der Humanmedizin ohne Nebenwirkungen und als Reagens zur Diagnose von myelogener Leukämie eignet. The invention is thus based on the object of developing a process for the production of CSF, which can be performed on an industrial scale and CSF delivered which is suitable for the treatment of granulocytopenia in human medicine without side effects and as a reagent for the diagnosis of myelogenous leukemia.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. This object is achieved by the invention.

Das aus menschlichem Urin isolierte, erfindungsgemäß verwendete Glykoprotein, welches die Bildung von menschlichen Granulozyten stimuliert (nachstehend als Glykoproteid H bezeichnet), ist in der DE-OS 29 10 745 beschrieben. The isolated from human urine used in the invention glycoprotein which stimulates the formation of human granulocytes (hereinafter referred to as glycoprotein H), is described in DE-OS 29 10 745. Ein Glykoproteid, welches die Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten stimuliert, nachstehend als Glykoproteid M bezeichnet, das aus menschlichem Urin isoliert wird, ist als ein Sialinsäure enthaltendes Glykoproteid beschrieben; A glycoprotein which stimulates the formation of mice macrophages and granulocytes, hereinafter referred to as M glycoprotein, which is isolated from human urine is described as a glycoprotein containing sialic acid; vgl. Stanley und Metcalf, Australien Journal of Experimental Biological Medical Science, Bd. 47 (1969), S. 467 bis 483, Stanley und Mitarb., Federation Proceedings, Bd. 34, Nr. 13 (1975), S. 2272-2278 und Laukel et al., Journal of Cellular Physiology, Bd. 94 (1978), S. 21 bis 30. see. Stanley and Metcalf, Australia Journal of Experimental Biological Medical Science, Vol. 47 (1969), pp 467-483, Stanley et al., Federation Proceedings, Vol. 34, Nr. 13 (1975), pp 2272- 2278 and Laukel et al., Journal of Cellular Physiology, Vol. 94 (1978), pages 21 to 30th

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete synthetische Zellkulturmedium kann ein übliches synthetisches Medium für Gewebekulturen oder Zellkulturen sein, beispielsweise McCoy′s 5A-Medium (TA McCoy, M. Maxwell und PF Kruse, Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., Bd. 100 (1959), S. 115 bis 118), Nährgemisch HAMF-10 (RG Ham, Exp. Cell Res., Bd. 29, S. 515 bis 526), RPMI-1640 (vgl. S. Iwakata, JT Grace Jr., NYJ of Med., Bd. 64 (1964), S. 2279 bis 2282) oder ein durch Aminosäuren ergänztes Eagle′s MEM Medium (vgl. H. Eagle, Science Bd. 130 (1959), S. 432. The synthetic cell culture medium used in the process according to the invention can be a conventional synthetic medium for tissue cultures or cell cultures, such as McCoy's 5A medium (TA McCoy, M. Maxwell and PF Kruse, Proc. Soc. Exper. Biol. And Med., Vol. 100 (1959), pp 115 to 118), nutrient mixture HAMF-10 (Ham RG, Exp. Cell Res., Vol. 29, pp 515-526), RPMI-1640 (see pp. Iwakata, JT Jr Grace ., NYJ of Med., Vol. 64 (1964), pp 2279-2282) or by amino acids-supplemented Eagle's MEM medium (see, H. Eagle, Science, Vol. 130 (1959), p 432nd

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend näher beschrieben. The inventive process is described hereinafter.

(1) Isolierung der Monozyten und Makrophagen (1) Isolation of monocytes and macrophages

Mittels einer heparinisierten Spritze wird venöses Blut von gesunden Versuchspersonen entnommen, in ein steriles Reagensglas abgefüllt und 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Using a heparinized syringe is taken from healthy subjects filled in a sterile test tube and allowed to stand at room temperature for 1 to 2 hours venous blood. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsschritte werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. All subsequent steps are performed under aseptic conditions. Nach dem Stehen wird die obere Leukozyten enthaltende Schicht abgetrennt, einmal mit einem synthetichen Gewebe-Kultur medium gewaschen und danach einer Dichte- Gradientenzentrifugation unterworfen (vgl. T. Mahmood und WA Robinson, Blood, Bd. 51, Nr. 5 (1978), S. 879 bis 887), um die Leukozytenschicht in eine Schicht zu fraktionieren, die Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten sowie eine wei tere Granulozyten enthaltende Schicht enthält. After standing, the upper layer containing leukocytes was separated, washed once with a synthetichen tissue-culture medium and then subjected to density gradient centrifugation subject (see FIG. T. Mahmood and Robinson WA, Blood, Vol. 51, Nr. 5 (1978), p 879-887), to fractionate the buffy coat in a layer, the monocytes, macrophages, and lymphocytes and granulocytes contains a white tere-containing layer. Die erstgenannte Schicht wird isoliert. The former layer is isolated. Es wird eine Zellfraktion erhalten, die in einem synthetischen Gewebekulturmedium suspendiert wird. There is obtained a cell fraction which is suspended in a synthetic tissue culture medium. Nachstehend wird dieses Gewebekulturmedium kurz als Medium bezeichnet. Below this tissue culture medium is referred to briefly as a medium. Die Zellsuspension wird zentrifugiert und der erhaltene Überstand verworfen. The cell suspension is centrifuged and the resulting supernatant discarded. Die erhaltenen sedimentierten Zellen werden mit dem gleichen Medium mindestens zweimal gewaschen. The resulting pelleted cells are washed at least twice with the same medium. Hierauf werden die gewaschenen Zellen in einem geringen Volumen des gleichen Mediums sus pendiert. Thereafter, the washed cells are pended in a small volume of the same medium sus. Ein Teil der erhaltenen Suspension wird entnommen und die Zahl der Zellen mittels eines automatischen Blutzellenzählgeräts bestimmt. A portion of the resulting suspension is removed and determine the number of cells by means of an automatic Blutzellenzählgeräts. Das Zahlenverhältnis von Monozyten und Makrophagen zu Lymphozyten wird unter dem Mikroskop an einem Ausstrich bestimmt, der nach Wright- Giemsa gefärbt ist. The number ratio of monocytes and macrophages to lymphocytes is determined under the microscope on a smear, which is colored by Wright-Giemsa. Die Zellensuspension wird in einer Petrischale aus Glas oder Kunststoff so verteilt, daß die Zahl der Inokula (Monozyten und Makrophagen) dem vorge schriebenen Wert entspricht, vorzugsweise 10⁵ bis 10⁷ pro Petrischale. The cell suspension is distributed in a petri dish of glass or plastic so that the number of inocula (monocytes and macrophages) corresponds to the pre-signed value, preferably 10⁵ to 10⁷ per petri dish. Sodann wird ein synthetisches Gewebekultur medium zugegeben, das mit 5 bis 20 Volumprozent Serum ergänzt ist. Then, a synthetic tissue culture medium added, supplemented with 5 to 20 volume percent serum. Hierauf läßt man die Petrischale 2 Stunden an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid bei 37°C stehen. Then the Petri dish is allowed to stand for 2 hours in moist air containing 5% carbon dioxide at 37 ° C. Während dieser Zeit verankern sich die Monozyten und Makro phagen an der Bodenfläche der Petrischale, während die Lymphozyten im Medium suspendiert bleiben. During this time, monocytes and macro phages anchor on the bottom surface of the petri dish, whereas the lymphocytes remain suspended in the medium. Das Medium wird sodann verworfen und die Petrischale wird mehrmals mit einem Medium ohne Serum oder mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. The medium is then discarded, and the Petri dish is washed several times with a medium without serum or with a physiological saline solution. Nach dieser Behandlung ist der größte Teil der Lymphozyten abgetrennt, während die Monozyten und Makrophagen am Boden der Petrischale haften. After this treatment, most of the lymphocytes is separated, while the monocytes and macrophages adhere to the bottom of the Petri dish. Die mikroskopische Unter suchung ergibt, daß mindestens 95% der Zellen, die am Boden der Petrischale haften, Monozyten und Makrophagen sind, und ihre Zahl 10⁵ bis 10⁷ pro Petrischale beträgt. The microscopic investigation shows that at least 95% of the cells adhering to the bottom of the Petri dish, monocytes and macrophages, and their number is 10⁵ to 10⁷ per petri dish.

(2) Züchtung bzw. Vermehrung der Monozyten und Makrophagen (2) breeding or propagation of the monocytes and macrophages

Die Petrischale mit den Monozyten und Makrophagen wird mit einem synthetischen Medium versetzt, das gegebenenfalls mit Serum ergänzt ist und das mindestens 0,1 µg/ml Medium Glyko proteid (H) oder eine Glykoproteid (H) enthaltende Fraktion oder mindestens 500 Einheiten/ml Medium Glykoproteid (M) oder eine Glykoproteid (M) enthaltende Fraktion enthält. The petri dish with the monocytes and macrophages is added with a synthetic medium which is optionally supplemented with serum and containing at least 0.1 g / ml medium glyco proteid (H) or a glycoprotein (H) or fraction containing at least 500 units / ml of medium glycoprotein (M) or a glycoprotein (M) containing fraction contains. Die Einsaatdichte der Monozyten und Makrophagen beträgt mindestens 10⁵/ml Medium. The seeding density of monocytes and macrophages is at least 10⁵ / ml of medium. Das beimpfte Medium wird 1 bis 7 Tage bei 37°C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid inkubiert. The inoculated medium is incubated for 1-7 days at 37 ° C in humid air with 5% carbon dioxide. Dabei wird CSF in das Medium abgegeben. In this CSF is released into the medium. Das verwendete synthetische Medium ist das vorstehend erwähnte Gewebekulturmedium. The synthetic medium used is the tissue culture medium mentioned above.

Die optimalen Bedingungen zur Herstellung von CSF nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hinsichtlich Züchtungsdauer, Menge des zugesetzten Glykoproteids, Einsaatdichte, Menge des zugesetzten Serums und Art des verwendeten Mediums werden nachstehend in den Ausführungsbeispielen noch näher beschrieben. The optimum conditions for the production of CSF method according to the invention in respect of the culture period, amount of added Glykoproteids, seeding density, amount of added serum and type of media used are described in more detail below in the examples.

Zur Herstellung von CSF für pharmazeutische Zwecke wird erfindungsgemäß ein Medium verwendet, das durch menschliches Serum ergänzt ist, oder es wird ein serumfreies Medium ver wendet, um Sensibilisierung und anaphylaktischen Schock durch Fremdproteine zu vermeiden. For the production of CSF for pharmaceutical purposes, a medium is used according to the invention, which is complemented by human serum, or it is a serum-free medium used ver to prevent sensitization and anaphylactic shock due to foreign proteins. Zur Herstellung von CSF für diagnostische Zwecke kann andererseits ein Medium ver wendet werden, das durch Rinderserum oder fetales Kälber serum ergänzt ist. For the production of CSF for diagnostic purposes a medium may alternatively be used, provided that is supplemented by bovine serum or fetal calf serum. Ferner ist es möglich, auch Kulturflaschen anstelle von Petrischalen zu verwenden. Further, it is possible to use also culture flasks instead of Petri dishes. Schließlich können die vermehrten Monozyten und Makrophagen auch wieder holt verwendet werden. Finally, the increased number of monocytes and macrophages may also be used again obtained.

(3) Glykoproteide (3) glycoproteids

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Glykoproteide werden aus menschlichem Urin isoliert. The glycoproteins used in the process according to the invention can be isolated from human urine. Sie stimulieren die Bildung menschlicher Granulozyten oder Mäusemakrophagen und Granulozyten. They stimulate the formation of human granulocytes or mice macrophages and granulocytes. Es kann auch eine Fraktion verwendet werden, die diese Glykoproteide enthält. It can also be used a fraction containing these glycoproteins.

Daß zur Stimulierung der Bildung menschlicher Granulozyten geeignete Glykoproteid kann nach der JP-OS 1 40 707/79 und der entsprechenden DE-OS 29 10 745 gewonnen werden. That to stimulate the formation of human granulocytes appropriate glycoprotein may be recovered 29 10 745 according to the JP-OS 1 707/79 40 and the corresponding DE-OS. Das Ver fahren ist nachstehend erläutert. The United drive is explained below.

Frischer Urin von gesunden Versuchspersonen wird mit verdünnter Säure oder Base auf einen pH-Wert von 6 bis 9, vor zugsweise 7 bis 8 eingestellt und zur Abtrennung von Ver unreinigungen zentrifugiert. Fresh urine of healthy subjects is adjusted to 8 with dilute acid or base to a pH of 6 to 9, preferably 7 before and centrifuged to remove impurities Ver. Der erhaltene Überstand wird mit einem Silicium enthaltenden Adsorptionsmittel, beispiels weise Kieselgel, Kieselgel-Magnesiumsilikat, Diatomeenerde, Quarzglas oder Bentonit, behandelt, und die adsorbierten Bestandteile werden mit einer alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von mindestens 9 eluiert. The supernatant obtained is a silicon-containing adsorbent, the example as silica gel, silica gel-magnesium silicate, diatomaceous earth, silica glass or bentonite, treated, and the adsorbed components are eluted with an alkaline solution having a pH of at least 9. Die zum Eluieren verwendete alkalische Lösung ist nicht kritisch. The alkaline solution used for elution is not critical. Vorzugsweise wird eine wäßrige Lösung von Ammoniak oder Natriumhydroxid in einer Konzentration von 0,3 bis 1,5 molar verwendet. Preferably, an aqueous solution of ammonia or sodium hydroxide in a concentration of 0.3 to 1.5 molar is used. Das erhaltene Eluat wird auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt und mit einem Neutralsalz, beispielsweise Ammoniumsulfat, bis zu einer Sättigung von 70% versetzt, um die aktive Substanz auszusalzen. The eluate is adjusted to a pH value of 7 to 8 and treated with a neutral salt, such as ammonium sulfate, up to a 70% saturation to salt out the active substance. Es wird eine das Glykoproteid enthaltende Roh fraktion gewonnen. It is a glycoprotein containing the crude fraction obtained.

Die erhaltene Rohfraktion wird in einer geringen Menge einer alkalischen Lösung gelöst, durch Ultrafiltration von nieder molekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht bis höchsten 10 000 befreit und sodann zur Abtrennung der in der Lösung enthaltenen Verunreinigungen mit einem Kationenaustauscher behandelt, beispielsweise mit Carboxymethyldextran, Carboxymethylcellulose oder Phosphorcellulose. The crude fraction is dissolved in a small amount of an alkaline solution, freed by ultrafiltration of low molecular weight substances having a molecular weight up to highest 10000 and then treated to remove the impurities contained in the solution with a cation exchanger, such as carboxymethyl dextran, carboxymethyl cellulose or phosphocellulose. Vor dieser Behandlung mit dem Kationenaustauscher werden sowohl die das Glykoproteid enthaltende Rohfraktion als auch der Ionenaus tauscher mit einer vorzugsweise 0,01 bis 0,15 molaren Puffer lösung auf einen pH-Wert von 6 bis 8 äquilibriert, damit die Behandlung mit dem Austauscher bei nahezu neutralem pH-Wert durchgeführt werden kann. Prior to this treatment with the cation exchanger, both the crude fraction containing the glycoprotein as well as the Ionenaus exchanger equilibrated with a preferably 0.01 to 0.15 molar buffer solution to a pH value of 6 to 8, so that the treatment with the exchanger at almost neutral pH can be performed. Der größte Teil des Glykoproteids wird vom Ionenaustauscher nicht adsorbiert. Most of the Glykoproteids is not adsorbed by the ion exchanger. Nach dem Konzen trieren des Eluats wird das Konzentrat mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 8 äquilibriert und in einen Anionenaustauscher, beispielsweise DEAE-Cellulose gegeben, der mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, um das Glykoproteid an dem Anionenaustauscher zu adsorbieren. After concen the eluate missing the concentrate is equilibrated with a dilute buffer solution of pH 6 to 8 and, in an anion exchanger such as DEAE-cellulose, is equilibrated with the same buffer to adsorb the glycoprotein to the anion exchanger. Hieraus wird das adsorbierte Glykoproteid mittels einer linearen Konzentrationsgradientenlösung einer 0,1 bis 0,3 molaren Salzlösung, beispielsweise einer Natriumchloridlösung, eluiert. Hence the adsorbed glycoprotein by means of a linear concentration gradient of 0.1 to 0.3 molar salt solution such as a sodium chloride solution eluted. Das Glykoproteid wird bei einer Salzkonzentration von mindestens 0,1 molar eluiert, jedoch ist eine genaue Abtrennung schwierig. The glycoprotein is eluted molar at a salt concentration of at least 0.1, but a precise separation is difficult. Die Eluatfraktionen bei 0,1 bis 0,3 molarer Salzkonzentration werden vereinigt. The eluate fractions at 0.1 to 0.3 molar salt concentration are combined. Erforderlichenfalls wird die vereinigte Fraktion entsalzt und konzentriert. If necessary, desalted and concentrated the combined fraction. Diese Fraktion wird als Fraktion A bezeichnet. This fraction is called fraction A. Die Fraktion A kann als solche im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Fraction A can be used as such in the process according to the invention. Die Glykoproteidfraktion kann auch durch Adsorption an einem Anionenaustauscher und stufenweises Eluieren mit einer 0,1 bis 0,3 molaren Salzlösung gereinigt werden, bevor man diese Fraktion der Eluierung mit einem linearen Konzentrations gradienten unterwirft. The Glykoproteidfraktion can also be purified by adsorption on an anion exchanger and eluting stepwise with a 0.1 to 0.3 molar salt solution, before this fraction gradient elution with a linear concentration subjects.

Zur weiteren Reinigung wird die Fraktion A der Gelchromato graphie an einem stark vernetzten Polymergel mit einem Wasser aufnahmewert von 10 bis 20 ml/g, beispielsweise Sephadex G-150 oder Biogel P-100, unterworfen. For further purification, the fraction A is the Gelchromato chromatography on a highly crosslinked polymer gel with a water consumption figure of 10 to 20 ml / g, for example, Sephadex G-150 or Biogel P-100 subject. Die aktiven Substanzen werden mit einem 0,05 bis 0,1 molarem Salzpuffer entwickelt und Fraktionen mit einem relativen Ausflußwert von 1,11 bis 1,60, vorzugsweise 1,11 bis 1,45, werden gesammelt, entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. The active substances can be developed with a 0.05 to 0.1 molar salt buffer, and fractions having a relative Ausflußwert 1.11 to 1.60, preferably 1.11 to 1.45, are collected, desalted and concentrated, or freeze-dried. Diese Fraktion wird als Fraktion B bezeichnet. This fraction is called fraction B.

Die auf diese Weise erhaltene Fraktion B kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. The fraction obtained in this way, B can also be used in the inventive method. Das relative Ausflußvolumen ist das Verhältnis Ve : Vo, wobei Ve das erforderliche Volumen des Lösungsmittels ist, um die Substanz in der Säule zu eluieren, und Vo das Leervolumen der Gelsäure darstellt. The relative Flow rate is the ratio Ve Vo, Ve is wherein the required volume of solvent to elute the substance in the column, and Vo represents the void volume of the Gelsäure.

Zur weiteren Reinigung wird das erhaltene Präparat in einer verdünnten Pufferlösung mit einem Salzgehalt von 1,0 bis 2,0 molar, beispielsweise einer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0 gelöst, die 1,0 bis 2,0 molar an Natriumchlorid ist. For further purification, the product obtained is molar in a dilute buffer solution with a salt content of 1.0 to 2.0, for example, a phosphate buffer solution of pH 6.0 to 8.0, preferably 6.0 to 7.0 solved the 1.0 to 2.0 molar in sodium chloride. Die Lösung wird der Affini tätschromatographie an einem Zucker-affinen Adsorptions mittel, beispielsweise Concanavalin A - Sepharose 4B, unter worfen, das mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. The solution is the Affini tätschromatographie medium to a sugar-affinity adsorption, such as Concanavalin A - Sepharose 4B, under discarded, which has been equilibrated with the same buffer solution. Das an der Affinitätssäule adsorbierte Glykoproteid wird mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, eluiert, die 1,0 bis 2,0 molar an Salz ist und die 20 bis 100 mMol eines Saccharids, beispiels weise α -Methyl-D-glukosid, enthält. The adsorbed to the affinity column is glycoprotein with a dilute buffer solution of pH 6.0 to 8.0, preferably 6.0 to 7.0, eluting the molar salt of 1.0 to 2.0 and 20 to 100 mmol of a saccharide example as α-methyl-D-glucoside contains. Die das Glykoproteid ent haltenden Fraktionen werden vereinigt, erforderlichenfalls ent salzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. The ent the glycoprotein containing fractions were combined, concentrated and where necessary ent salted or freeze-dried. Diese Fraktion kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. This fraction can also be used in the process according to the invention.

Zur weiteren Reinigung wird die erhaltene Fraktion der präparativen Zonenelektrophorese unterworfen. For further purification, the resulting fraction is subjected to preparative zone electrophoresis. Als Trägermedium wird beispielsweise ein Polyacrylamidgel oder Agargel vom pH-Wert 7,0 bis 9,0 verwendet. As a carrier medium a polyacrylamide gel or agar gel is used on the pH 7.0 to 9.0, for example. Es wird eine hochgereinigte Glykoproteidfraktion aus dem Trägermedium durch Eluieren mit einer kalten verdünnten Salzlösung erhalten. This gives a highly purified Glykoproteidfraktion from the carrier medium by elution with a cold dilute salt solution. Diese Fraktion wird entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. This fraction was desalted and concentrated or lyophilized. Dieses gereinigte Glykoproteid kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. This purified glycoprotein may also be used in the process according to the invention.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Glykoproteid, das die Bildung von Mäusegranulozyten und Makrophagen stimuliert, ist ebenfalls in den vorstehend erwähten Druckschriften beschrieben. The glycoprotein used in the process according to the invention, which stimulates the production of Mäusegranulozyten and macrophages is also described in the above erwähten publications. Die präparativen Verfahren von Stanley und Metcalf, Stanley und Mitarb. The preparative method of Stanley and Metcalf, Stanley et al. und Laukel und Mitarb. and Laukel et al. sind nach stehend in den Beispielen 6, 5 und 7 im einzelenn beschrieben. are after standing in Examples 6, 5 and 7 described in einzelenn.

Die biologische Aktivität der Glykoproteidpräparate gegenüber Knochenmarkzellen der Maus wird auf die nachstehend beschriebene Weise bestimmt und in Einheiten ausgedrückt. The biological activity of Glykoproteidpräparate compared with bone marrow cells of mice is determined in the following manner and expressed in units. 1 ml McCoy′s 5A Medium, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, 0,3% Agar und 1×10⁵ Knochenmarkzellen von Mäusen des Stammes C 57 Bl/6J, wird mit 0,1 ml des zu bestimmenden Glyko proteids bzw. einer Glykoproteidfraktion versetzt. 1 ml of McCoy's 5A medium supplemented with 20% fetal calf serum, 0.3% agar and 1 × 10⁵ bone marrow cells of mice of the strain C57 Bl / 6J, with 0.1 ml of the identified glyco proteids or a Glykoproteidfraktion was added. Das auf diese Weise hergestellte, das Glykoproteid enthaltende Medium wird in eine Petrischale aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 35 mm gegeben und 7 Tage bei 37°C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid inkubiert. The medium thus prepared, containing the glycoprotein is placed in a plastic Petri dish with a diameter of 35 mm and incubated for 7 days at 37 ° C in humid air with 5% carbon dioxide. Danach wird die Zahl der einzelnen Kolonien, die jeweils mindestens 50 Zellen enthalten, unter dem Mikroskop bestimmt. Thereafter, the number of individual colonies, each of which contains at least 50 cells as determined under the microscope. Die biologische Aktivität einer Probe, die eine Kolonie bildet, entspricht einer Einheit. The biological activity of a sample which forms a colony corresponding to a unit. Zur Bestimmung des Reinigungsgrades einer Glykoproteidprobe wird die spezifische Aktivität nach folgender Gleichung berechnet: To determine the degree of purification of a Glykoproteidprobe the specific activity is calculated according to the following equation:

Die spezifische Aktivität nimmt mit fortschreitender Reini gung zu. The specific activity increases with the progress of Home Care. Das dem Medium zugesetzte Glykoproteid bzw. die Glykoproteidfraktion kann ein gereinigtes Präparat mit hoher spezifischer Aktivität sein. The glycoprotein added to the medium or the Glykoproteidfraktion may be a purified preparation of high specific activity. Vorzugsweise wird ein Präparat mit niedrigerer Aktivität eingesetzt, das während der Reinigung erhalten wird. Preferably, a preparation is used with a lower activity, which is obtained during cleaning.

Das Glykoproteid (H) wird dem Medium in einer Menge von mindestens 0,1 µg, vorzugsweise 10 bis 100 µg/ml Medium zugesetzt, während das Glykoproteid (M) dem Medium in einer Menge von mindestens 500 Einheiten, vorzugsweise mindestens 1000 Einheiten pro ml Medium zugegeben wird. The glycoprotein (H) is the medium in an amount of at least 0.1 micrograms, preferably 10 to 100 micrograms / ml of medium added during the glycoprotein (M) to the medium in an amount of at least 500 units, preferably at least 1000 units per ml medium is added.

(4) Gewinnung der aktiven Substanz aus dem Medium (4) recovering the active substance from the medium

Das CSF enthaltende Medium wird von der Petrischale entfernt und 5 bis 10 Minuten bei 1000 bis 2000 g zentrifugiert. The CSF-containing medium is removed from the petri dish and centrifuged at 1000-2000 g for 5 to 10 minutes. Es wird ein Überstand erhalten, der hochaktives CSF enthält. This gives a supernatant, which contains highly active CSF.

Dieser Überstand eignet sich zur Herstellung eines Reagens oder eines Bezugsreagens zur Bestimmung der Bildung von Kolonien menschlicher granulopoetischer Stammzellen. This supernatant is suitable for the preparation of a reagent or a Bezugsreagens for determining the formation of colonies of human granulopoetischer stem cells. Zu diesem Zweck wird die Aktivität des Überstandes derart einge stellt, das 0,1 ml des Überstandes eine CSF-Aktivität auf weist, die zur Bildung von mindestens 100 menschlichen Granulozytenkolonien ausreicht. To this end, the activity of the supernatant is turned in such a way is, on the 0.1 ml of the supernatant has a CSF activity, sufficient for the formation of at least 100 human granulocyte colony. Die Lösung wird durch ein Membranfilter filtriert, aseptisch in ein Gefäß abgefüllt und luftdicht verschlossen. The solution is filtered through a membrane filter, aseptically filled into a vessel and hermetically sealed. Es wird ein flüssiges Reagens erhalten. There is obtained a liquid reagent. Ein Reagens in Pulverform kann durch Gefriertrocknen des erhaltenen sterilen Filtrats unter aseptischen Bedin gungen hergestellt werden. A reagent in powder form may be prepared by freeze-drying the obtained filtrate under aseptic sterile condi tions.

Für pharmazeutische Zwecke wird das unter Verwendung eines serumfreien Mediums erhaltene konditionierte Medium oder ein durch menschliches Serum ergänztes Medium gegen Wasser dialysiert und durch Membranfiltration sterilisiert. For pharmaceutical purposes, the conditioned medium or supplemented by human serum medium obtained using a serum-free medium is dialyzed against water and sterilized by membrane filtration. Erfor derlichenfalls wird das Filtrat konzentriert, aseptisch in ein Gefäß abgefüllt und luftdicht verschlossen. Neces sary, the filtrate is concentrated aseptically filled into a vessel and hermetically sealed. Es wird ein Präparat in flüssiger Form erhalten. It is available in liquid form preparation. Zur Herstellung von Präparaten in Pulverform wird die dialysierte Lösung durch Membranfiltration sterilisiert und unter aseptischen Bedin gungen gefriergetrocknet. For the manufacture of preparations in powder form, the dialyzed solution is sterilized by membrane filtration and freeze-dried under aseptic conditions Bedin.

Zur weiteren Behandlung von CSF für pharmazeutische Zwecke wird der vorstehend erwähnte Überstand in eine hochmolekulare Fraktion (Molekulargewicht oberhalb 5000 oder 10 000) und eine niedermolekulare Fraktion (Molekulargewicht unter 5000 oder 10 000) mittels einer Ultrafiltrationsmembran (Molekular gewichtschnitt 5000 oder 10 000) getrennt. For further treatment of CSF for pharmaceutical purposes, the aforementioned supernatant into a high molecular fraction (molecular weight above 5000 or 10000) and a low molecular fraction (molecular weight below 5,000 or 10,000) by means of an ultrafiltration membrane (molecular weight cut-off 5000 or 10000) separately. Beide Fraktionen enthalten zwar CSF, doch liegen in der hochmolekularen Fraktion mindestens 90% des CSF vor. Although both fractions containing CSF, but are in the high molecular weight fraction is at least 90% of the CSF before.

Ein pharmazeutisches Präparat kann durch Konzentrieren der niedermolekularen Fraktion unter vermindertem Druck herge stellt werden. A pharmaceutical preparation can be provide by concentrating the low molecular weight fraction under reduced pressure Herge. Das Konzentrat der hochmolekularen Fraktion wird in einer 0,01 bis 0,1 molaren Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0 gelöst und mit einem Anionenaustauscherharz, beispielsweise DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex behandelt, die mit dieser Pufferlösung äquilibriert worden sind. The concentrate of high molecular weight fraction is dissolved in a 0.01 to 0.1 molar buffer solution of pH 6.0 to 8.0 and treated with an anion exchange resin such as DEAE-cellulose, DEAE-Sephadex QAE-Sephadex or, with the this buffer solution were equilibrated. Das CSF wird am Austauscherharz adsorbiert und sodann mit einer 0,1 bis 0,3 molaren Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0 eluiert. The CSF is adsorbed on exchange resin and then eluted with a 0.1 to 0.3 molar buffer solution of pH 6.0 to 8.0. Es wird ein gereinigtes Produkt erhalten. There is obtained a purified product.

Das erhaltene Eluat kann durch Konzentrieren und anschließende Molekularsieb-Chromatographie durch Gelfiltration weiter gereinigt werden. The eluate obtained can be purified by concentrating and subsequent molecular sieve chromatography by gel filtration on. Als Gel für die Gelfiltration kommen bei spielsweise Sephadex G 150, Biogel P-100 und Ultragel AcA-44 in Frage. As a gel for gel filtration come in play, Sephadex G 150, Biogel P-100 and Ultragel AcA-44 in question.

Bei der Herstellung von CSF in einem serumfreien Medium kann die Behandlung mit einem Anionenaustauscherharz entfallen, und die Reinigung erfolgt unmittelbar durch Gelchromato graphie. In the production of CSF in a serum-free medium, the treatment can be dispensed with an anion exchange resin and the purification is carried out directly by chromatography Gelchromato. Eine geeignete Entwickler-Pufferlösung bei der Gel chromatographie ist eine 0,01 bis 0,3 molare Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0. A suitable developer buffer solution in gel chromatography is a 0.01 to 0.3 molar buffer solution of pH 6.0 to 8.0. Die bei der Gelfiltration erhaltenen CSF-aktiven Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet. The CSF obtained from the gel filtration-active fractions are pooled and concentrated, desalted and freeze-dried. Es wird ein gereinigtes CSF- Präparat erhalten. There is obtained a purified CSF preparation.

Die auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen gereinigten CSF-Präparate werden durch Immunelektrophorose unter Ver wendung von menschlichem Antiserum und Rinderantiserum auf verunreinigende Proteine untersucht. The data obtained in the manner described above purified CSF specimens are examined by Immunelektrophorose under Ver use of human and bovine antiserum antiserum to contaminating proteins. Spuren an menschlichen Globulin-ähnlichen Proteinen und Serumalbumin und Globulin- ähnlichen Proteinen, die vermutlich aus dem fetalen Kälber serum stammen, werden in CSF-Präparaten gefunden, die aus einem durch fetales Kälberserum ergänztem Medium stammen. Traces of human globulin-like proteins and serum albumin and globulin-like proteins, probably dating from the fetal calf serum, are found in CSF specimens derived from a supplemented with fetal calf serum medium. Da praktisch keine derartigen Eiweißkörper in CSF-Präparaten feststellbar sind, die in dem serumfreien Medium herge stellt wurden, können diese Präparate unmittelbar als Arznei stoffe verwendet werden, da sie keine Nebenwirkungen verur sachen. Since practically no such body protein are detectable in CSF preparations, which provides in the serum-free medium were Herge, these preparations can be used directly as drug substances, as they Doomed no side effects things.

Zur Injektion können die flüssigen Präparate als solche ver wendet werden, während die pulverförmigen Präparate in sterilem pyrogenfreiem Wasser, steriler physiologischer Kochsalz lösung oder ähnlichen Lösungen zunächst gelöst werden müssen. For injection, the liquid preparations as such may be used, provided during the powdered preparations in sterile pyrogen-free water, sterile physiological saline solution or similar solutions must first be solved. Diese Präparate können Patienten zur Behandlung von Granulozytopenie gegeben werden. These preparations can be given to patients for the treatment of granulocytopenia. Die Tagesdosis beträgt mindestens 77,8 mg/kg Körpergewicht. The daily dose is at least 77.8 mg / kg body weight.

Versuchsbeispiel 1 Experimental Example 1 Bestimmung der Inkubationszeit Determination of the incubation period (1) Isolierung von Monozyten und Makrophagen und Herstellung des Glykoproteids (1) Isolation of monocytes and macrophages and production of the Glykoproteids

Monozyten und Makrophagen werden auf die nachstehend in Beispiel 1 (1) beschriebene Weise isoliert. Monocytes and macrophages are isolated to below in Example 1 (1) described manner. Die bei dem Experiment verwendeten Glykoproteide werden auf die nach stehend in Beispiel 1 (2) und Beispiel 5 (2) beschriebene Weise hergestellt. The glycoproteins used in the experiment are prepared in the after standing in Example 1 (2) and Example 5 (2) described manner. Das gemäß Beispiel 1 (2) hergestellte Glykoproteid (H) war ein stark gereinigtes Produkt der letzten Reinigungsstufe, während das gemäß Beispiel 5 (2) hergestellte Glykoproteid (M) ein Produkt von Standard reinheit (spezifische Aktivität 180 000) war. According to Example 1 (2) produced glycoprotein (H) was a highly purified product of the last purification step, while in Example 5 (2) glycoprotein was produced (M) is a product of standard purity (specific activity of 180 000).

(2) Inkubation der Monozyten und Makrophagen (2) incubation of the monocytes and macrophages

Zwei Medien mit jeweils 100 µg/ml Glykoproteid (H) und 2 glykoproteidfreie Medien werden hergestellt. Two media containing 100 ug / ml glycoprotein (H) and 2 glykoproteidfreie media are manufactured. Für die Medien wird serumfreies McCoy′s 5A-Medium sowie ergänztes McCoy′s 5A-Medium mit 20% fetalem Kälberserum verwendet. For the media, serum-free McCoy's 5A medium and supplemented McCoy's 5A medium is used with 20% fetal calf serum.

Jede Petrischale, die am Boden haftende Monozyten und Makrophagen enthält, wird mit jeweils einem der vier genannten Medien in einer Menge von 10⁶ Monozyten und Makro phagen pro ml Medium versetzt. Each Petri dish containing adherent monocytes and macrophages to the ground is added per ml of medium, phage with each of the four media referred to in an amount of from 10⁶ monocytes and macro. Jedes Medium wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (3) inkubiert. Each medium was incubated in the same manner as in Example 1 (3). Vor der Inku bation sowie nach Inkubationszeiten von 1, 3, 5 und 7 Tagen werden vorbestimmte Volumina des Mediums jeder Petrischale entnommen. Before and after incubation Inku bation of 1, 3, 5 and 7 days predetermined volumes of the medium are taken each petri dish.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wird wiederholt, jedoch wird das Glykoproteid (M) in einer Menge von 1000 Ein heiten/ml Medium anstelle des Glykoproteids (H) verwendet. The process described above is repeated except that the glycoprotein (M) is used in an amount of 1000 A units / ml of medium in place of the Glykoproteids (H).

(3) Bestimmung von CSF im konditionierten Medium (3) Determination of CSF in the conditioned medium

Die CSF-Aktivität jedes konditionierten Mediums wird anhand der Bildung von Kolonien menschlicher Knochenmarkzellen bestimmt. The CSF activity of each conditioned medium is determined by the formation of colonies of human bone marrow cells. Das Knochenmark wird vom Brustbein (Sternum) einer gesunden Versuchsperson mittels einer heparinisierten Spritze nach Sternumpunktur entnommen. The bone marrow is taken from the breastbone (sternum) a healthy subject using a heparinized syringe after Sternumpunktur. Sodann wird das ent nommene Knochenmark 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert, um das "buffy coat" zu isolieren. Then, the bone marrow ent made centrifuged for 10 minutes at 1000 g, to isolate the "buffy coat". Das "buffy coat" wird mit McCoy′s 5A Medium gewaschen, in McCoy′s 5A Medium, das 20% Serum enthält, suspendiert, in einer Petrischale ausgebreitet und mit mehreren mg/ml Medium pulverisiertem und sterili siertem Carbonyleisen versetzt. The "buffy coat" is washed with McCoy's 5A medium in McCoy's 5A medium containing 20% serum, suspended, spread in a petri dish and mixed with several mg / ml medium and sterili dized powdered carbonyl iron. Danach wird die Petrischale 1 bis 2 Stunden bei 37°C in einen Inkubator eingestellt. Thereafter, the Petri dish is 1 to 2 hours at 37 ° C is set in an incubator. Danach werden die phagozytischen Zellen, die die Carbonyl eisenteilchen phagozytierten, am Boden der Petrischale mittels eines Magneten fixiert und die überstehende Zellsuspension wird isoliert. Thereafter, the phagocytic cells that phagocytosed iron particles carbonyl, fixed to the bottom of the Petri dish using a magnet and the supernatant cell suspension is isolated. Die suspendierten Zellen sind nicht anhaftende, nicht phagozytierende Knochenmarkzellen, die zur Bestim mung der CSF-Aktivität benutzt werden. The suspended cells are non-adherent, non-phagocytic bone marrow cells used for the determina tion of the CSF activity. Diese Knochemark zellen werden durch Zentrifugieren gewaschen und in einem kleinen Volumen des Mediums suspendiert. This Knochemark cells are washed by centrifugation and suspended in a small volume of the medium. Die Zahl der kern haltigen Zellen in der Suspension wird nach Behandlung mit Essigsäure-Gentianaviolett-Farbstoff gezählt. The number of nucleated cells in the suspension is counted by treatment with acetic acid-gentian violet dye.

Die nicht anhaftenden, nicht phagozytierenden kernhaltigen Zellen werden in McCoy′ 5A Medium übertragen, das 0,3% Agar und 20% fetales Kälberserum enthält. The non-adherent, non-phagocytic nucleated cells are transmitted in McCoy '5A medium containing 0.3% agar and 20% fetal calf serum. Die Einsaatdichte beträgt 2×10⁵ Zellen pro ml Medium. The seeding density is 2 × 10⁵ cells per ml of medium. Nach Zugabe des konditio nierten Mediums in einer Menge von 0,1 ml/ml Medium wird das beimpfte Medium 10 Tage bei 37°C an feuchter, 5% Kohlen dioxid enthaltender Luft inkubiert. Ned be conditioned after the addition of the medium in an amount of 0.1 ml / ml medium, the inoculated medium is incubated for 10 days at 37 ° C in a humid, 5% carbon dioxide-containing air. Nach der Inkubation wird die Zahl der Kolonien unter den entstandenen Zellaggregaten unter einem Mikroskop gezählt. After incubation the number of colonies is counted among the resulting cell aggregates under a microscope. Der Ausdruck Kolonie bedeutet hier ein Zellaggregat, das mindestens 40 Zellen enthält. The term as used herein means a colony cell aggregate, containing at least 40 cells. Die CSF-Aktivität wird ausgedrückt durch die Anzahl der Kolonien. The CSF activity is expressed by the number of colonies.

Sie ist ein Maß für die Bildung von CSF. It is a measure for the formation of CSF. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. The results are summarized in Table I.

Tabelle I Table I

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß durch Zusatz des Glyko proteids die CSF-Bildung am dritten Tag der Inkubation ihr Maximum erreicht. From Table I it can be seen that the CSF proteids formation on the third day of incubation achieved by the addition of glyco its maximum. Bei dem 20% fetales Kälberserum enthaltenden Medium ist die CSF-Bildung deutlich höher in Gegen wart des Glykoproteids als in Abwesenheit des Glykoproteids (übliches Verfahren). Medium in which 20% fetal calf serum containing the CSF formation is significantly higher in presence of the counter Glykoproteids than in the absence of Glykoproteids (conventional method). Im serumfreien Medium wird CSF nach Zusatz des Glykoproteids gebildet, während CSF in Abwesen heit des Glykoproteids kaum entsteht. In serum-free medium CSF is formed after the addition of Glykoproteids while CSF hardly arises in absentia unit of Glykoproteids.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß bei der Herstellung von CSF durch Züchtung und Vermehrung von Monozyten und Makrophagen in vitro die Glykoproteide die Bildung von CSF stimulieren, unabhängig davon, ob das Medium Serum ent hält. From the results it is evident that in the production of CSF by culturing and proliferation of monocytes and macrophages stimulate the glycoproteins in vitro the formation of CSF, regardless of whether the medium holding serum ent. Es wurde ferner festgestellt, daß die Inkubations dauer 3 bis 7 Tage, vorzugsweise 3 Tage beträgt. It was also found that the incubation period is 3 to 7 days, preferably 3 days. Wenn keine Monozyten und Makrophagen eingeimpft werden, kann keine CSF- Aktivität im konditionierten Medium beobachtet werden, unabhängig davon, ob das Glykoproteid vorliegt. If no monocytes and macrophages are inoculated, no CSF activity in the conditioned medium can be observed regardless of whether the glycoprotein is present.

Versuchsbeispiel 2 Experimental Example 2 Versuche mit unterschiedlichen Mengen Glykoproteid Experiments with different amounts of glycoprotein

Durch Zusatz der Glykoproteide (H) und (M) wie im Versuchs beispiel 1 zu McCoy′s 5A Medium, ergänzt mit 20% fetalem Kälberserum sowie serumfreien McCoy′s 5A Medium werden Medien hergestellt. By addition of the glycoproteins (H) and (M) as in the experiment example 1 in McCoy's 5A medium supplemented with 20% fetal calf serum and serum-free McCoy's 5A medium are produced media. Im Fall des Glykoproteids (H) werden 0,1, 1,0, 10,0 bzw. 100 µg/ml Medium zugegeben. In the case of Glykoproteids (H) 0.1, 1.0, 10.0 and 100 ug / ml of medium was added. Im Fall des Glykoproteids (M) werden 100, 500, 1000 bzw. 2000 Einheiten/ml Medium zugegeben. In the case of Glykoproteids (M) 100, 500, 1000 or 2000 units / ml of medium is added. Jedes Medium wird schließlich in die Petrischale gegeben, die an ihrem Boden anhaftende Monozyten und Makrophagen enthält. Each medium is finally added to the petri dish, which contains adhesive on its bottom monocytes and macrophages. Sodann werden die Petri schalen 3 Tage in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 inkubiert. Are then incubated for 3 days in Petri cups the same manner as in Experimental Example 1. Die CSF-Aktivität jedes konditionierten Mediums wird wie im Versuchsbeispiel 1 bestimmt, um die CSF-Bildung festzustellen. The CSF activity of each conditioned medium is determined as in Experimental Example 1 to determine the CSF production. Zum Vergleich werden Proben verwendet, die durch Inkubieren jedes Mediums ohne Zusatz von Glyko proteid erhalten wurden. For comparison, samples are used, which were obtained by incubating proteid each medium without the addition of glyco. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt. The results are summarized in Table II.

Tabelle II Table II

Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß mit zunehmenden Mengen an Glykoproteid die CSF-Bildung ansteigt. From Table II it is seen that with increasing amounts of glycoprotein increases CSF formation. Aus diesen Ergeb nissen sowie den in Tabelle I mitgeteilten Ergebnissen (nach dreitägiger Inkubation) ist ersichtlich, daß die CSF- Bildung durch die Gegenwart von 0,1 µg Glykoproteid (H) oder 500 Einheiten Glykoproteid (M) pro 1 ml Medium deutlich erhöht ist. Resulting from these results as well as the results reported in Table I (after three days of incubation) it is evident that the formation of CSF by the presence of 0.1 ug glycoprotein (H) or 500 units glycoprotein (M) per 1 ml of the medium is significantly increased , Im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt daher die Menge des zugesetzten Glykoproteids pro 1 ml Medium mindestens 0,1 µg, vorzugsweise 10 bis 100 µg bei Verwendung von Glykoproteid (H) und mindestens 500 Einheiten, vorzugs weise mindestens 1000 Einheiten Glykoproteid (M). In the process of the invention, therefore, the amount of added Glykoproteids per 1 ml of medium at least 0.1 micrograms, preferably 10 to 100 micrograms when using glycoprotein (H) and at least 500 units, preferably, at least 1000 units glycoprotein (M).

Versuchsbeispiel 3 Experimental Example 3 Versuche mit unterschiedlicher Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen Experiments with different seeding density on monocytes and macrophages

Das Versuchsbeispiel 1 wird wiederholt. Experimental Example 1 is repeated. Es wird eine Reihe von konditionierten Medien erhalten, jedoch beträgt die Ein saatdichte an Monozyten und Makrophagen 0, 10³, 10⁴, 10⁵ bzw. 10⁶/ml. There is obtained a set of conditioned media, however, the amounts A seeding density of monocytes and macrophages 0, 10³, 10⁴, 10⁵ or 10⁶ / ml. 1 µg Glykoproteid (H) bzw. 500 Einheiten Glyko proteid (M) werden zu 1 ml McCoy′s 5A Medium gegeben, das mit 20% fetalem Kälberserum ergänzt ist, bzw. zu 1 ml serum freiem McCoy′s 5A Medium. 1 ug glycoprotein (H) or 500 units glyco proteid (M) are added to 1 ml of McCoy's 5A medium supplemented with 20% fetal calf serum, and 1 ml of serum-free McCoy's 5A medium. Die Inkubationsdauer beträgt 3 Tage. The incubation period is 3 days. Die erhaltenen konditionierten Medien werden auf CSF-Aktivität untersucht, um die Bildung von CSF in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 zu bestimmen. The resulting conditioned media are tested for CSF activity in order to determine the formation of CSF in the same manner as in Experimental Example 1. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt: The test results are summarized in Table III:

Tabelle III Table III

Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß in jedem Fall große Mengen CSF gebildet werden, wenn die Einsaatdichte mindestens 10⁵ Zellen/ml beträgt. From Table III it can be seen that in each case large amounts of CSF are recognized when the seeding density is at least 10⁵ cells / ml. Im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt daher die Einsaatdichte mindestens 10⁵ Monozyten und Makrophagen pro 1 ml Medium. In the process of the invention, therefore, the seeding density is at least 10⁵ monocytes and macrophages per 1 ml of medium.

Versuchsbeispiel 4 Experimental Example 4 CSF-Produktion in verschiedenen Medien CSF production in various media

Hinsichtlich der CSF-Produktion werden vier verschiedene handelsübliche Gewebekulturmedien oder Zellkulturmedien mitein ander verglichen. Regarding the CSF production four different commercially available tissue culture media or cell culture media are mitein other compared. Als Medien werden McCoy′s 5A Medium, Nährge misch HAMF-10, RPMI-1640 und Eagle′s MEM Medium ergänzt mit Aminosäuren verwendet. As media is McCoy's 5A medium Nährge mixed HAMF-10, RPMI-1640 medium supplemented and Eagle's MEM with amino acids used. Jedes dieser Medien, die nicht durch Serum ergänzt sind, wird mit 1,0 µg/ml Glykoproteid (H) bzw. 500 Einheiten/ml Glykoproteid (M) versetzt. Any of these media, which are not supplemented with serum, is treated with 1.0 ug / ml glycoprotein (H) or 500 units / ml glycoprotein (M) was added. Die erhaltenen Medien werden 3 Tage in gleicher Weise wie in Versuchs beispiel 1 inkubiert. The media obtained are incubated for 3 days in the same way as in experiment example 1. Hierauf werden die erhaltenen konditionierten Medien in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 auf CSF-Bildung untersucht. Thereafter, the resulting conditioned media are analyzed in the same manner as in Experimental Example 1 on CSF production. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt. The results are summarized in Table IV.

Tabelle IV Table IV

Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß sämtliche vier Medien für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind. From Table IV it can be seen that all four media are suitable for the novel process. Die CSF- Bildung ist im MEM Medium etwas niedriger als in den anderen Medien. The CSF formation is somewhat lower than in the other media in MEM medium.

Versuchsbeispiel 5 Experimental Example 5 Versuche mit Medium mit unterschiedlichen Mengen Serum Experiments with medium containing different amounts serum

Auf die gleiche Weise wie in Versuchsbeispiel 1 werden konditionierte Medien hergestellt, McCoy′s 5A Medium wird mit 0, 5, 10, 20 oder 30% menschlichem Serum oder fetalem Kälberserum versetzt. In the same manner as in Experimental Example 1, conditioned media are produced, McCoy's 5A medium is treated with 0, 5, 10, 20 or 30% human serum or fetal calf serum. Beide Seren werden 30 Minuten auf 58°C erhitzt. Both sera were heated at 58 ° C for 30 minutes. Sodann werden 1 µg/ml Medium des Glykoproteids (H) bzw. 500 Einheiten/ml Medium Glykoproteid (M) zugesetzt. Then be added to 1 ug / ml of the medium Glykoproteids (H) or 500 units / ml medium glycoprotein (M). Die Einsaatdichte des Monozyten Makrophagen in jedes Medium be trägt 10⁵/ml und die Inkubationsdauer 3 Tage. The seeding density of monocytes macrophages in each medium be transmits 10⁵ / ml and the incubation time 3 days. Die erhaltenen konditionierten Medien werden auf CSF-Aktivität in gleicher Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 untersucht, um die Bildung von CSF zu bestimmen. The resulting conditioned media are tested for CSF activity in the same manner as in Comparative Example 1 to determine the formation of CSF. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammen gefaßt. The results are grouped together in Table V.

Tabelle V Table V

Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß mit zunehmender Menge an Serum die Bildung von CSF ansteigt. From Table V it is evident that as the amount of serum, the formation of CSF increases. Erfindungsgemäß kann CSF in einem serumfreien Medium gebildet werden, doch kann das Medium mit Rinderserum oder fetalem Kälberserum versetzt werden, um größere Mengen CSF für diagnostische Zwecke herzustellen. According to the invention CSF are formed in a serum-free medium, but the medium may be added bovine serum or fetal calf serum, to produce larger quantities of CSF for diagnostic purposes. Die wirksame Menge an zugesetztem Serum beträgt mindestens 5%, vorzugsweise mindestens 10%. The effective amount of added serum is at least 5%, preferably at least 10%.

Versuchsbeispiel 6 Experimental Example 6 Versuche mit einer Glykoproteid-Fraktion und einer hochgereinigen Fraktion Experiments with a glycoprotein fraction and a fraction hochgereinigen

In den Versuchsbeispielen 1 bis 5 wird gereinigtes Glyko proteid als aktive Substanz mit einer stimulierenden Wirkung bei der Bildung menschlicher Granulozyten (Fall I) und andererseits Glykoproteid von Standardreinheit (spezifische Aktivität 180 000) als aktive Substanz mit stimulierender Wirkung bei der Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten (Fall II) verwendet. In Experimental Examples 1 to 5 purified Glyko is proteid as the active substance having a stimulating effect in the formation of human granulocytes (case I), and on the other hand glycoprotein of standard purity (specific activity 180,000) as the active substance having a stimulating effect in the formation of mice macrophages and granulocytes (Case II). Im vorliegenden Versuchsbeispiel soll gezeigt werden, daß im erfindungsgemäßen Verfahren ein halb gereinigtes Präparat anstelle des gereinigten Glykoproteids im Fall I und eine weniger gereinigte Fraktion sowie ein hochgereinigtes Präparat anstelle des Glykoproteids von Standardreinheit im Fall II verwendet werden kann. In the present experiment example shows that the method of the invention a semi-purified preparation instead of the purified Glykoproteids in case I and a less purified fraction and a highly purified preparation instead of Glykoproteids of standard purity in Case II can be used.

Die verwendeten glykoproteidhaltigen Fraktionen entsprechend Fall I sind die Fraktionen A und B, deren Herstellung nach stehend in Beispiel 1 beschrieben ist. The glykoproteidhaltigen fractions used according to case I are the fractions A and B whose preparation is described in Example 1, after standing. Diese Fraktionen werden zu serumfreiem McCoy′s 5A Medium in Mengen von 0, 0,5, 1,0, 5,0 bzw. 10 mg/ml entsprechend 0, 8,3, 16,6, 83,3 bzw. 166,6 µg/ml Medium ausgedrückt als aktives Glyko proteid in der Fraktion und in Mengen von 0, 41, 7, 83,4, 417 und 834 µg/ml Medium ausgedrückt als aktives Glykoproteid in der Fraktion B zugesetzt. These fractions are to serum-free McCoy's 5A medium in amounts of 0, 0.5, 1.0, 5.0 and 10 mg / ml, corresponding to 0, 8.3, 16.6, 83.3 and 166, 6 .mu.g / ml expressed as the active medium glyco proteid in the fraction and in amounts of 0, 41, 7, 83.4, 417 and 834 ug / ml of medium as the active glycoprotein expressed in the fraction B was added. Die Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen in jedes Medium beträgt 10⁵/ml und die Inkubationsdauer 3 Tage. The seeding density of monocytes and macrophages in each medium is 10⁵ / ml and the incubation time 3 days. Es werden konditionierte Medien durch Inkubieren unter sonst gleichen Bedingungen wie im Versuchs beispiel 1 erhalten. There are conditioned media obtained by incubating under the same conditions as in experiment 1, for example.

Da die Fraktionen A und B menschliches Serumalbumin enthalten, das im Urin vorliegt, werden Vergleichsproben durch Zusatz von menschlichem Serumalbumin zu McCoy′s 5A Medium in einer Menge entsprechend der Menge zugesetzt, die auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten Medien ent halten ist. Since the fractions A and B contain human serum albumin that is present in urine, comparative samples are added by the addition of human serum albumin to McCoy's 5A medium in an amount corresponding to the amount which is to keep the above-described manner, media prepared ent. Die Inkubationsbedingungen sind die gleichen, wie sie vorstehend beschrieben sind. The incubation conditions are the same as described above.

Jedes konditionierte Medium wird auf CSF-Aktivität in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 untersucht, um die Bildung von CSF nachzuweisen. Each conditioned medium is assayed for CSF activity in the same manner as in Experimental Example 1, to detect the formation of CSF. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt. The results are summarized in Table VI.

Wie im Fall II ist das Glykoproteidpräparat im vorliegenden Versuchsbeispiel die Fraktion C (spezifische Aktivität 21 000), die Fraktion D (spezifische Aktivität 54 000) sowie das hochgereinigte Präparat (spezifische Aktivität 1 240 000), dessen Herstellung in Beispiel 5 beschrieben ist. As in the case II the Glykoproteidpräparat in the present experimental example is the fraction C (specific activity 21 000), the fraction D (specific activity 54 000) and the highly purified preparation (specific activity 1 240 000), whose preparation is described in Example 5. Die konditionierten Medien werden auf die vorstehend im Zusammenhang mit Fall I beschriebene Weise hergestellt, jedoch werden die Fraktionen C und D sowie das hochgereinigte Präparat (vgl. Beispiel 5) den Medien jeweils in Mengen von 0, 100, 500, 1000 und 2000 Einheiten/ml Medium anstelle der beschriebenen Mengen der Fraktionen A und B (vgl. Bei spiel 1) zugesetzt. The conditioned media prepared in the above in connection with the case I described manner, but the fractions C and D and the highly purified preparation (see Example 5.) Are the media in amounts of 0, 100, 500, 1000 and 2000 units / ml medium instead of the described amounts of the fractions added A and B (see. In game 1). Die Vergleichsversuche mit menschlichem Serumalbumin entfallen. The comparative experiments with human serum albumin accounts. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt. The results are summarized in Table VI.

Tabelle VI Table VI

Einfluß des Reinheitsgrades des Glykoproteids mit stimulierender Wirkung auf die Bildung menschlicher Granulozyten. Influence the degree of purity of the Glykoproteids with stimulating effect on the formation of human granulocytes.

Die CSF-Bildung in einem Medium, dem die Fraktion A oder B zugesetzt wird, ist höher als im Vergleichsmedium. The CSF production in a medium supplemented with fraction A or B added is higher than in the same medium. Dies zeigt, daß das Glykoproteid die CSF-Bildung anregt. This indicates that the glycoprotein stimulates CSF production. Im Ver gleich mit dem in Tabelle II gezeigten Beispiel, bei dem 10 µg/ml Glykoproteid dem serumfreien Medium zugesetzt wurden, ist in dem in Tabelle VI gezeigten Beispiel die CSF-Bildung höher. In comparison with the same as shown in Table II example in which 10 ug / ml glycoprotein was added to the serum-free medium, in the example shown in Table VI, the CSF-formation is higher. In diesem Beispiel wurden 0,5 mg/ml der Fraktion A (8,3 µg/ml Glykoproteid) zugesetzt. In this example, 0.5 mg / ml of fraction A (8.3 ug / ml glycoprotein) were added. Dies ist eine geringe Menge Glykoproteid. This is a small amount of glycoprotein. Dies scheint auf dem Einfluß von Serum albumin und anderen unbekannten Bestandteilen des mensch lichen Urins zu beruhen, die der Fraktion A vorliegen. This seems albumin on the influence of serum and other unknown ingredients based of the Human urine available to the Group A.

Wenn man das Medium mit zugesetzter Fraktion A mit dem Medium mit zugesetzter Fraktion B hinsichtlich der CSF- Bildung vergleicht, ist ersichtlich, daß bei einer zugesetzten Menge von 0,5 oder 1,0 mg/ml beide Fraktionen etwa ver gleichbar sind, daß jedoch bei höheren Konzentrationen der Fraktion B die CSF-Bildung niedriger ist. When comparing the medium with added fraction A with the medium with added Group B with respect to the CSF formation, it is apparent that when an added amount of 0.5 or 1.0 mg / ml, both fractions are approximately comparable ver, however, that at higher concentrations of fraction B CSF formation is lower. Dies beruht ver mutlich darauf, daß der Gehalt an menschlichem Serumalbumin aus Urin in der Fraktion A größer ist als in der Fraktion B und der Zusatz der Fraktion B in Mengen von mehr als 5 mg/ml eine zu starke Zugabe von Glykoproteid bewirkt. This is due presumably ver that the content of human serum albumin in urine from the fraction A is greater than in the fraction B and the fraction B, the addition in amounts greater than 5 mg / ml of an excessive addition of glycoprotein. Unter Berücksichtigung aller dieser Ergebnisse bestehen Gründe zu der Annahme, daß unter das Serumalbumin, das im menschlichen Urin enthalten ist, und das Glykoproteid eine syner gistische Wirkung bei der Bildung von CSF ausüben, und daß eine maximale CSF-Bildung erhalten wird, wenn das Medium mit etwa 100 µg/ml Glykoproteid versetzt wird. Considering all these results consist reasons to believe that under the serum albumin contained in human urine, and exercise the glycoprotein a syner gistische effect in the formation of CSF, and that a maximum CSF production is obtained when the medium is mixed with about 100 ug / ml glycoprotein.

Bei Verwendung des Glykoproteids mit stimulierender Wirkung bei der Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten (Fall II) ist aus Tabelle VI folgendes ersichtlich: Die CSF-Bildung nimmt etwa proportional der Menge an dem Medium zugesetztem Glykoproteid zu. When using the Glykoproteids with stimulating effect on the formation of mice macrophages and granulocytes (case II) the following is evident from Table VI: The CSF formation increases roughly proportional to the amount of the medium added to glycoprotein. Im Vergleich mit den in Tabelle II gezeigten Ergebnissen unter Verwendung eines serumfreien Mediums ist die CSF-Bildung im vorliegenden Ver such höher, wenn die Fraktion C oder D verwendet wird, obwohl die Menge des dem Medium zugesetzten Glykoproteids die gleiche ist wie im vorhergehenden Fall. In comparison with the results using a serum-free medium shown in Table II, the CSF-formation of the present process is examined higher when the Group C or D is used, although the amount of the medium added Glykoproteids is the same as in the previous case. Dies beruht anscheinend auf dem Einfluß unter anderem des Serumalbumins, das in den Fraktionen C und D enthalten ist, die aus mensch lichem Urin stammen. This is due apparently to the influence of, inter alia, the serum albumin contained in fractions C and D, derived from human urine Lichem. Aus den Ergebnissen, die bei Verwendung von hochgereinigtem Glykoproteid erhalten werden, ist ersichtlich, daß zwar die CSF-Produktion mit zunehmender Menge an Glykoproteid ansteigt, der Anstieg jedoch geringer ist als bei Verwendung der Fraktionen C und B und dem Präparat von Standardreinheit (Tabelle II). From the results that are obtained with the use of highly purified glycoprotein, it can be seen that while the CSF production with increasing amount increases to glycoprotein, the increase, however, is lower than with the use of the fractions C and B and the preparation of standard purity (Table II ). Aus den vorstehenden Ergebnissen kann man schließen, daß in serumfreien Medien das Serum albumin und andere Substanzen aus menschlichem Urin die gleiche Rolle spielen, wie das Serum im Hinblick auf die CSF-Produktion. From the above results it can be concluded that in serum-free media the serum albumin, and other substances from human urine play the same role as the serum in relation to the CSF production.

In jedem Falle ist es deshalb im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft, dem Medium ein rohes Glykoproteid anstelle eines gereinigten Glykoproteids zuzusetzen. In any case, it is therefore in the process of the invention advantageously, the medium to add a crude glycoprotein instead of a purified Glykoproteids. Bei Verwen dung eines rohen Glykoproteidpäparats wird es in einer Menge von mindestens 0,1 µg/ml Medium im Fall I oder in einer Menge von mindestens 500 Einheiten/ml Medium im Fall II ein gesetzt. In Verwen formation of a crude Glykoproteidpäparats it is set in an amount of at least 0.1 ug / ml of medium in the case I or in an amount of at least 500 units / ml of medium in a case II.

Versuchsbeispiel 7 Experimental Example 7 Bestimmung der wirksamen Dosis und der akuten Toxizität von CSF Determining the effective dose and the acute toxicity of CSF

Die wirksame Dosis und die akute Toxizität (LD ₅₀) des erfin dungsgemäß hergestellten CSF werden an Tieren folgendermaßen bestimmt. The effective dose and acute toxicity (LD ₅₀) of the CSF inven tion prepared according to be determined in animals follows.

Ein Gemäß Beispiel 3 hergestelltes konditioniertes Medium wird durch Membranfiltration sterilisiert und sodann durch eine Ultrafiltrationsmembran (molekulare Trenngrenze: 10 000) filtriert, hierauf konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet. A prepared according to Example 3 conditioned medium is sterilized by membrane filtration and then passed through an ultrafiltration membrane (molecular cut-off: 10,000), filtered thereon concentrated, desalted and freeze-dried. Es wird CSF in Pulverform erhalten. It is obtained in powder form CSF. Nach der im Vergleichsbeispiel 1 beschriebenen Bestimmungsmethode beträgt die Zahl der Koloniebildung bei menschlichen Knochen markzellen 4500/mg. Determined by the method described in Comparative Example 1, the number of colony formation in human bone marrow cells is 4500 / mg. Zum Vergleich wird der Versuch mit Knochenmarkzellen von Mäusen des Stammes C3H/He wiederholt. For comparison, the test with bone marrow cells from mice of the strain C3H / He is repeated. Die Zahl der Koloniebildung mit Knochenmarkzellen der Maus beträgt 7000/mg. The number of colony formation by bone marrow cells of the mouse is 7000 / mg.

80 sechs Wochen alte männliche Mäuse des Stammes C3H/He mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g werden will kürlich in 16 Untergruppen von jeweils 5 Tieren unterteilt. 80 six week old male mice of the strain C3H / He wants to be with an average body weight of 20 g arbitrarily divided into 16 sub-groups of 5 animals each. Die Untergruppen werden willkürlich zusammengestellt, und es werden vier Gruppen von jeweils vier Untergruppen gebildet. The sub-groups shall be made arbitrary, and it will be four groups of four subgroups formed.

Das auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellte CSF wird in steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst. The CSF prepared in the manner described above is dissolved in sterile physiological saline. Es werden drei Lösungen mit 1 mg/0,1 ml (für die Gruppe I), 2 mg/0,1 ml (für die Gruppe II) und 4 mg/0,1 ml (für die Gruppe III) hergestellt. There are three solutions prepared with 1 mg / 0.1 ml (for Group I), 2 mg / 0.1 mL (for group II) and 4 mg / 0.1 ml (for Group III). Die Mäuse werden subkutan mit der Lösung in einer Tagesdosis von 0,1 ml/Maus an fünf aufein anderfolgenden Tagen gespritzt. The mice are injected subcutaneously with the solution in a daily dose of 0.1 ml / mouse of five other aufein following days. Nach 1, 3, 7 und 11 Tagen nach Beginn der Verabreichung werden Blutproben aus fünf Mäusen einer Untergruppe jeder Gruppe entnommen (die Unter gruppen, denen Blut entnommen wurde, wurden für den weiteren Versuch nicht mehr verwendet). After 1, 3, 7 and 11 days after the start of administration, blood samples from five mice of a subset of each group are removed (the sub-groups, where blood was drawn, have not been used for another attempt). Die Zahl der Leukozyten in den periphären Blutgefäßen wird mittels eines automatischen Blutzellenzählgerätes bestimmt. The number of leukocytes in the peripheral blood vessels is determined by means of an automatic Blutzellenzählgerätes. Die Zahl der Granulozyten wird unter dem Mikroskop nach Wright-Giemsa-Färbung gezählt, um die Zunahme der Zahl der Leukozyten und Granulozyten nach CSF- Gabe zu bestimmen. The number of granulocytes is counted under a microscope after Wright-Giemsa staining to determine the increase in the number of leukocytes and granulocytes by handing CSF. Eine Gruppe (Gruppe I), der 0,1 ml sterile physiologische Kochsalzlösung ohne CSF gegeben wurde, wird in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben behandelt und als Kontrollgruppe verwendet. One group (group I), which was given 0.1 ml of sterile normal saline without CSF is treated in the same manner as described above and used as a control group. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt. The test results are summarized in Table VII.

Tabelle VII Table VII

Anmerkung: Note:
1. Die Zahlenwerte bedeuten die Zahl der Blutzellen pro 1 mm³ Blut×10 -2 . 1. The numbers indicate the number of blood cells per 1 × 10 -2 mm³ blood.
2. Die angegebenen Werte sind die Durchschnittswerte von jeweils 5 Mäusen. 2. The values given are the mean values of 5 mice each.

Im Vergleich zur Kontrollgruppe I zeigt die Gruppe II nach CSF-Gabe eine nahezu zweifache Zunahme der Zahl der Leuko zyten und eine nahezu dreifache Zunahme der Zahl der Granulo zyten 11 Tage nach Versuchsbeginn (6 Tage nach Beendigung der Gabe). Compared to the control group I, group II facing CSF administration, a nearly two-fold increase in the number of white cells and an almost threefold increase in the number of granulocytes cytes 11 days after start of the experiment (6 days after completion of dosing). Im Vergleich mit der Gruppe I zeigt die Gruppe IV eine etwa 4,5fache Zunahme der Zahl der Leukozyten und eine etwa 8fache Zunahme der Zahl der Granulozyten. Compared with the group I, group IV shows an approximately 4.5-fold increase in the number of leukocytes and an approximately 8-fold increase in the number of granulocytes. Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die wirksame Tagesdosis bei Mäusen etwa 50 mg/kg Körpergewicht beträgt. From the above results it is evident that said effective daily dose in mice is about 50 mg / kg body weight. Da die koloniebildende Aktivität des verwendeten CSF in im vorstehend beschriebenen Versuch um einen Faktor von 1,556 höher ist im Falle von Knochenmarkzellen der Maus als im Falle von mensch lichen Knochenmarkzellen entspricht die wirksame Dosis bei einem Patienten mit Granulozytopenie, die bei menschlichen Knochenmarkzellen eine Wirkung zeigt, die dem Effekt bei Mäusen entspricht, etwa einer Tagesdosis von 77,8 mg/kg Körper gewicht. As the colony-forming activity of CSF used in described in the above experiment by a factor of 1.556 is higher in the case of bone marrow cells of the mouse than in the case of human union bone marrow cells corresponds to the effective dose in a patient with granulocytopenia, showing an effect in human bone marrow cells, which corresponds to the effect in mice, a dose of about 77.8 mg / kg body weight. Die akute Toxizität wird unter Verwendung des gleichen CSF untersucht, wie in dem vorstehend beschriebenen Test zur Bestimmung der Dosis und an Mäusen des gleichen Stammes (6 bis 8 Wochen alt, durchschnittliches Körperge wicht 20,4 g). The acute toxicity is examined using the same CSF, as in the test described above for determining the dose and on mice of the same strain (6-8 weeks old, average weight Körperge 20.4 g). Es werden keine Todesfälle beobachtet bei einer Versuchsgruppe von 5 männlichen und 5 weiblichen Mäusen, denen 4,0 g CSF/kg Körpergewicht gegeben wurden. There are no deaths observed in a test group of 5 male and 5 female mice to which 4.0 g CSF / kg body weight was added. Dementsprechend ist die akute Toxizität so gering, daß sie nach dem vorstehend beschriebenen Versuch nicht bestimmt werden kann. Accordingly, the acute toxicity is so low that it can not be determined from the experiment described above.

Beispiel 1 Example 1 (1) Isolierung von Monozyten und Makrophagen (1) Isolation of monocytes and macrophages

200 ml Blut aus peripheren Gefäßen von gesunden Versuchs personen werden in einem Gefäß aufgefangen, das 1000 Einheiten Heparin enthält. 200 ml of blood from peripheral vessels of healthy test persons are collected in a vessel containing 1000 units of heparin. Der Inhalt des Gefäßes wird durch vor sichtiges Bewegen vermischt. The contents of the vessel is mixed by sichtiges before moving. Hierauf wird das heparinisierte Blut in einen sterilen Glaszylinder mit einem Durchmesser von 20 mm und einem Fassungsvermögen von 200 ml verbracht und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Thereupon, the heparinized blood is placed in a sterile glass cylinder with a diameter of 20 mm and a capacity of 200 ml and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Danach wird die obere, die Leukozyten enthaltende Schicht vorsichtig mit abpipettiert, mit serumfreiem McCoy′s 5A Medium auf das Doppelte des ursprünglichen Volumens verdünnt und 15 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Thereafter, the upper layer containing the leucocytes is carefully diluted to twice the original volume with pipetted off, with serum-free McCoy's 5A medium and centrifuged at 1500 g for 15 minutes. Der Überstand wird verworfen. The supernatant is discarded. Die sedimentierten Leukozyten werden in 20 ml McCoy′s 5A Medium suspendiert und die Suspension wird über eine Natriummetrizoatlösung (Dichte 1,077) in einem Zentrifugen rohr beschichtet und 30 Minuten bei 400 g zentrifugiert. The sedimented leucocytes are suspended in 20 ml McCoy's 5A medium, and the suspension is coated on a Natriummetrizoatlösung (density 1.077) in a centrifuge tube and centrifuged at 400 g for 30 minutes. Die weiße Schicht, die Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten am Boden der oberen Schicht enthält, wird mit einer Pipette aufgenommen, mit McCoy′s 5A Medium gewaschen und 10 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. The white layer containing monocytes, macrophages and lymphocytes at the bottom of the upper layer is added with a pipette, washed with McCoy's 5A medium and centrifuged at 1500 g for 10 minutes. Der Überstand wird verworfen. The supernatant is discarded. Diese Behandlung wird noch zweimal wiederholt. This treatment is repeated twice more. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen werden in 20 ml McCoy′s 5A Medium sus pendiert. The thus obtained cells are pended in 20 ml of McCoy's 5A medium sus. Ein Teil wird zur Zählung der Zellen mit einem automatischen Blutzellenzählgerät verwendet. A portion is used for counting the cells with an automatic Blutzellenzählgerät. Es wird ein Aus strich der Suspension hergestellt, mit Wright-Giemsa-Farb stoff gefärbt, und die Zahl der Lymphozyten sowie die Zahl der Monozyten und Makrophagen wird morphologisch bestimmt, um das Zellenverhältnis festzustellen. There is a dash from the suspension prepared, stained with Wright-Giemsa-color cloth, and the number of lymphocytes as well as the number of monocytes and macrophages is morphologically determined to determine the cell ratio. Der Anteil der Mono zyten und Makrophagen beträgt 25,5%. The proportion of mono cytes and macrophages is 25.5%.

Jeweils 5 ml der erhaltenen Suspension werden in vier Petri schalen mit einem Durchmesser von 15 cm gegeben. Each 5 ml of the resulting suspension cups in four Petri with a diameter of 15 cm given. Sodann werden 30 ml McCoy′s 5A Medium zugesetzt, das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt ist. Then, 30 ml of McCoy's 5A medium added, supplemented with 10% fetal calf serum. Danach werden die Petrischalen 2 Stunden bei 37°C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid stehengelassen. Thereafter, the Petri dishes are allowed to stand for 2 hours at 37 ° C in humid air with 5% carbon dioxide. Hierauf wird das Medium abgegossen, und es werden 30 ml McCoy′s 5A Medium zugesetzt. Then, the medium is poured off, and it will be added to 30 ml of McCoy's 5A medium. Nach ziemlich kräftigem Schütteln wird das Medium zur Abtrennung der Lymphozyten verworfen. After quite vigorous shaking the medium for the separation of lymphocytes is discarded. Der Anteil der verbleibenden Monozyten und Makrophagen wird auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt. The proportion of the remaining monocytes and macrophages is determined in the manner described above. In jeder Petrischale beträgt der Anteil 95%. In each Petri dish, the proportion is 95%.

(2) Herstellung des Glykoproteids (2) Preparation of Glykoproteids

Das Glykoproteid wird nach der JP-OS 1 40 707/79 und der entsprechenden DE-OS 29 10 745 hergestellt. The glycoprotein prepared according to the JP-OS 40 1 707/79 and the corresponding DE-OS 29 10 745.

400 Liter frischer Urin von gesunden Versuchspersonen werden mit 10prozentiger Natronlauge auf einen pH-Wert von 8 ein gestellt und bei 0°C und 15 000 g zentrifugiert. 400 liters of fresh urine of healthy subjects are provided with a 10prozentiger sodium hydroxide to a pH of 8 and centrifuged at 0 ° C and 15 000 grams. Unlösliche Substanzen werden sedimentiert. Insoluble substances are sedimented. Der Überstand wird mit 10prozentiger Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und auf eine Säule mit den Abmessungen 10×80 cm gegeben, die mit Kieselgel gefüllt ist. The supernatant is adjusted to a pH of 7 with 10prozentiger hydrochloric acid and applied to a column having dimensions 10 × 80 cm filled with silica gel. Die am Kieselgel adsorbierten Bestandteile werden mit 40 Liter 5prozentiger wäßriger Ammoniaklösung eluiert. The adsorbed on silica gel components are eluted with 40 liters of 5 per cent aqueous ammonia solution. Das erhaltene Eluat wird mit 1 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, mit pulverisiertem Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt und 15 bis 18 Stunden bei 0°C stehengelassen. The eluate obtained is adjusted with 1 N sulfuric acid to a pH of 7.5, mixed with powdered ammonium sulfate to 70prozentiger saturation and allowed to stand at 0 ° C for 15 to 18 hours. Sodann wird die entstandene Fällung abfiltriert. Then, the resultant precipitate was filtered off.

Die erhaltene Fällung wird in 2 Liter 5prozentiger wäßriger Ammoniaklösung gelöst, in einen Dialyseschlauch gegeben und gegen 0,05 molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 gründ lich dialysiert. The precipitate is dissolved in 2 liters of 5 per cent aqueous ammonia solution, placed in a dialysis bag and dialyzed against 0.05 Thoroughly molar phosphate buffer solution of pH 6.5. Danach wird die dialysierte Lösung, dh das Retentat, mit der genannten Pufferlösung auf 10 Liter aufgefüllt und auf eine Säule mit den Abmessungen 4×40 cm gegeben, die mit CM-Sephadex C-50 Ionenaustauscher gefüllt ist. Thereafter, the dialyzed solution, that is, the retentate, filled up with said buffer solution to 10 liters and applied to a column with the dimensions 4 × 40 cm, which is filled with CM-Sephadex C-50 ion exchanger. Dieser Austauscher ist vorher mit 0,05 molarer Phosphat pufferlösung äquilibriert worden. This exchanger was equilibrated with 0.05 molar phosphate buffer solution. Die Verunreinigungen werden duch Adsorption am Ionenaustauscher entfernt. The impurities are removed Duch adsorption on ion exchangers. Das Eluat wird gesammelt. The eluate is collected.

10 Liter des erhaltenen Eluats werden unter Verwendung eines "Diaflow" Hohlfaser-Konzentrators (Typ DC-30) konzentriert. 10 liters of the resulting eluate using a "Diaflow" hollow fiber concentrator (DC-30) concentrated. Das Konzentrat wird sodann 15 bis 18 Stunden bei 5°C gegen eine 0,1 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialy siert. The concentrate is then 15 to 18 hours at 5 ° C dialy Siert against a 0.1 M tris-HCl buffer solution of pH 7.0. Die dialysierte Lösung, dh das Retentat, wird mit der gleichen Pufferlösung auf 1 Liter aufgefüllt und auf eine Säule mit den Abmessungen 4,0×40 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist. The dialyzed solution, that is, the retentate is replenished with the same buffer solution to 1 liter and applied to a column with the dimensions 4.0 × 40 cm, which is filled with DEAE-cellulose. Diese Cellulose ist vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden. This cellulose has been previously equilibrated with the same buffer solution. Nach dem Waschen mit 0,1 molarer cis-HCl-Pufferlösung werden die adsorbierten Bestandteile mit 0,1 molarer tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,3 molar an Natriumchlorid ist. After washing with 0.1 molar cis-HCl buffer solution, the adsorbed ingredients with 0.1 molar tris-HCl buffer solution of pH 7.0 are eluted, which is 0.3 molar in sodium chloride. Das erhaltene Eluat wird gegen 0,1 molare tris-HCl-Puffer lösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. The eluate was dialyzed against 0.1 M tris-HCl buffer solution of pH 7.0.

Die erhaltene dialysierte Lösung wird erneut auf eine Säule mit den Abmessungen 4,0×40 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. The dialyzed solution obtained is added again to a column with the dimensions 4.0 × 40 cm, which is filled with DEAE-cellulose which had been previously equilibrated with the same buffer solution. Sodann wird die Säule mit einer linearen Konzentrationsgradientenlösung von Natriumchlorid (Chloridionenkonzentrationsgradient 0,1 bis 0,3 molar) eluiert. Then, the column is eluted with a linear concentration gradient of sodium chloride (0.1 to 0.3 molar Chloridionenkonzentrationsgradient). Es werden die Fraktionen aufgefangen, die bei Chloridionen Konzentrationen von 0,15 bis 0,25 molar eluiert werden. Are collected fractions eluted at molar chloride ion concentrations from 0.15 to 0.25. Die Fraktionen werden vereinigt und mit pulverisiertem Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt. The fractions are combined and treated with powdered ammonium sulphate up to saturation 70prozentiger. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, in einer kleinen Menge 0,1 molarer tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. The resulting precipitate is filtered off, dissolved in a small amount of 0.1 M Tris-HCl buffer solution of pH 7.0 and dialyzed against the same buffer. Die erhaltene dialysierte Lösung wird als Fraktion A bezeichnet. The dialyzed solution is referred to as Fraction A.

20 ml der erhaltenen dialysierten Lösung werden an einer mit Sephadex G-150 gefüllten Säule mit den Abmessungen 4,0×60 cm entwickelt. 20 ml of the resulting dialyzed solution to be developed on a column filled with Sephadex G-150 column with the dimensions 4.0 x 60 cm. Die Säule ist vorher mit 0,1 molarer tris-HCl- Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden. The column is previously equilibrated with 0.1 M Tris-HCl buffer solution of pH 7.0. Die Frak tionen, die einem relativen Ausflußwert von 1,11 bis 1,45 entsprechen, werden aufgefangen. The Frak tions, corresponding to a relative Ausflußwert 1.11 to 1.45, are collected. Die Fraktionen werden ver einigt und gegen destilliertes Wasser gründlich dialysiert. The fractions are combined and dialyzed extensively against ver distilled water. Die erhaltene dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. The dialyzed solution is freeze-dried. Es werden etwa 500 mg eines Pulvers erhalten, das als Frak tion B bezeichnet wird. There are about 500 mg of a powder obtained, which is referred to as a frac tion B.

200 mg des erhaltenen Pulvers werden in einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst, die 1,0 molar an Natriumchlorid ist. 200 mg of the resulting powder is dissolved in a 0.02 M phosphate buffer solution of pH 7.0 which is 1.0 molar in sodium chloride. Die Lösung wird auf eine 100 ml fassende Säule gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4B gefüllt, und die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. The solution is added to a 100-ml column filled with concanavalin A-Sepharose 4B, and that has been previously equilibrated with the same buffer solution. Die Säule wird gründlich mit einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen, die 1,0 molar an Natriumchlorid ist. The column was thoroughly washed with a 0.02 M phosphate buffer solution of pH 7.0, which is 1.0 molar sodium chloride. Sodann wird die Säule mit einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 50 millimolar an α -Methyl-D-glykosid und 1,0 molar an Natriumchlorid ist. Then, the column is eluted with a 0.02 M phosphate buffer solution of pH 7.0 containing 50 mM of α-methyl-D-glycoside and 1.0 molar with respect to sodium chloride. Das Eluat wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. The eluate was dialyzed against distilled water. Die dialysierte Lösung wird sodann gefriergetrocknet. The dialyzed solution is then freeze-dried.

Etwa 50 mg des erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers werden in 1 ml einer 0,125 molaren tris-Glycin-Pufferlösung vom pH-Wert 6,8 gelöst, die 10% Glycerin enthält. About 50 mg of the resulting freeze-dried powder are dissolved in 1 ml of a 0.125 molar tris-glycine buffer solution of pH 6.8 containing 10% glycerol. Die Lösung wird bei 10 Milliampere unter Kühlung in einer präparativen Elektrophoresevorrichtung der Elektrophorese unterworfen. The solution is subjected at 10 milliamps, with cooling in a preparative electrophoresis electrophoresis. Es wird ein 8prozentiges Acrylamidgel mit den Abmessungen 20×25 mm vom pH-Wert 8,9 verwendet. It is a 8prozentiges acrylamide gel with the dimensions 20 x 25 mm from the pH 8.9 is used. Die Fraktion mit einer relativen Beweglichkeit von 0,46 wird mit einer 0,025 mola ren tris-Glycin-Pufferlösung vom pH-Wert 8,3 eluiert und sodann gegen destilliertes Wasser dialysiert. The fraction with a relative mobility of 0.46 was eluted with a 0.025 mola ren tris-glycine buffer solution of pH 8.3 and then dialyzed against distilled water. Die erhaltene dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. The dialyzed solution is freeze-dried. Es werden etwa 10 mg Glykoproteid erhalten. This gives about 10 mg glycoprotein. Beim Wiederholen des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden etwa 30 mg Glykoproteid erhalten. When repeating the process described above about 30 mg glycoprotein can be obtained.

(3) Züchtung der Monozyten und Makrophagen (3) cultivation of monocytes and macrophages

Das auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltene Glyko proteid wird zu 30 ml eines McCoy′s 5A Medium gegeben, das 20% fetales Kälberserum enthält, und zwar in einer Menge von 100 µg/ml Medium. The glyco obtained in the manner described above is added to 30 ml of a proteid McCoy's 5A, where medium containing 20% fetal calf serum, in an amount of 100 g / ml medium. 30 ml des erhaltenen Mediums werden in jeweils eine Petrischale gegossen, die anhaftende Makrophagen und Monozyten enthält, wie dies vorstehend unter Ziffer (1) des Beispiels beschrieben ist. 30 ml of the resultant medium poured into each petri dish, the adherent macrophages and monocytes contains, as above under point (1) of the example is described. Die Populationsdichte der Monozyten und Makrophagen in dem Medium beträgt 10⁶/ml. The population density of monocytes and macrophages in the medium is 10⁶ / ml. Das hergestellte Medium wird 3 Tage bei 37°C an feuchter Luft mit 5% Kohlendioxid inkubiert. The medium obtained is incubated for 3 days at 37 ° C in humid air with 5% carbon dioxide. Es wird ein CSF-enthaltendes konditioniertes Medium erhalten. There is obtained a CSF-containing conditioned medium.

(4) Reinigung von CSF in dem konditionierten Medium (4) Purification of CSF in the conditioned medium

Die Medien aus den Petrischalen werden 10 Minuten bei 2°C und 2000 g zentrifugiert. The media from the Petri dishes are centrifuged at 2 ° C and 2000 g for 10 minutes. Es werden etwa 120 ml eines klaren Überstandes erhalten, der mittels einer Ultrafiltrations membran mit einer molekularen Trenngrenze von 10 000 konzentriert wird. There are approximately 120 ml of a clear supernatant is obtained and is concentrated by an ultrafiltration membrane having a molecular separation limit of 10,000. Das erhaltene Konzentrat wird mit 100 ml einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,2 ver setzt und erneut auf 5 ml konzentriert. The concentrate is mixed with 100 ml of a 0.05M tris-HCl buffer solution of pH 7.2 ver is concentrated to 5 ml again.

Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,0×60 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. The resulting solution is applied to a column with the dimensions 2.0 × 60 cm, which is filled with DEAE-cellulose and which has previously been equilibrated with a 0.05 molar tris-HCl buffer solution of pH 7.0. Sodann wird das CSF mit einer linearen Gradientenkonzentration von Kochsalz (0 bis etwa 3 molar) eluiert. Next, the CSF is eluted with a linear gradient concentration of sodium chloride (0 to about 3 molar). Die aktive Substanz enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mittels der vorstehend genannten Ultrafiltrationsmembran konzentriert. The fractions containing the active substance are combined and concentrated by the above-mentioned ultrafiltration membrane. Hierauf wird die konzentrierte Lösung auf eine Säule mit den Abmessungen 2,0×90 cm gegeben, die mit Sephadex G-150 gefüllt ist und die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Thereafter, the concentrated solution is applied to a column with the dimensions 2.0 × 90 cm, which is filled with Sephadex G-150 and which had been previously equilibrated with a 0.05 molar tris-HCl buffer solution of pH 7.0 is. Sodann wird die Säule mit der gleichen Pufferlösung entwickelt. Then, the column is developed with the same buffer solution. Es werden diejenigen Fraktionen aufgefangen, die einem Molekulargewicht von 65 000 bis 90 000 sowie die Fraktionen, die einem Molekular gewicht von 30 000 bis 60 000 entsprechen. There are those collected fractions corresponding to a molecular weight of 65,000 to 90,000, and the fractions of molecular weight 30,000 to 60,000. Diese Fraktionen werden vereinigt und mittels der Ultrafiltrationsmembran konzentriert. These fractions are combined and concentrated by the ultrafiltration membrane. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird mit destilliertem Wasser versetzt, entsalzt und konzentriert. The concentrated solution is mixed with distilled water, desalted and concentrated. Es werden etwa 5 ml einer Lösung erhalten, die gereinigtes CSF enthält. There are obtained about 5 ml of a solution containing purified CSF. Diese Lösung besitzt eine Aktivität, bestimmt gemäß Versuchsbeispiel 1, entsprechend der Bildung von 41 000 Kolonien menschliche Granulozyten/ml. This solution has an activity determined in accordance with Test Example 1, corresponding to the formation of 41 000 colonies human granulocyte / ml.

Beispiel 2 Example 2

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und zur Herstellung des gereinigten Glykoproteids behandelt. In a similar manner as in Example 1 monocytes and macrophages are isolated from human peripheral blood and treated to produce the purified Glykoproteids. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz des gereinigten Glykoproteids zu serumfreiem McCoy′s 5A Medium in einer Menge von 100 µg/ml Medium hergestellt worden ist. It is used a medium which has been prepared by addition of the purified Glykoproteids to serum-free McCoy's 5A medium in an amount of 100 g / ml medium. Es werden etwa 5 ml einer gereinigten CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten wie in Beispiel 1. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 16 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung. There are about 5 ml of a solution containing purified CSF obtained in a similar manner as in Example 1. This solution exhibits an activity corresponding to formation of human granulocyte colony 16,000 / ml solution.

Beispiel 3 Example 3

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und zur Herstellung der glykoproteidhaltigen Fraktion (Fraktion A) behandelt. In a similar manner as in Example 1 monocytes and macrophages are isolated from human peripheral blood and treated to prepare the glykoproteidhaltigen fraction (fraction A). Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz dieser Fraktion zu serumfreiem McCoy′s 5A Medium in einer Menge von 5 mg (83,3 mg Glykoproteid)/ml Medium her gestellt worden ist. It is a medium used for the serum-free by the addition of this fraction McCoy's 5A medium in an amount of 5 mg (83.3 mg glycoprotein) / ml medium has been put forth. Es werden etwa 120 ml eines kondi tionierten Mediums erhalten. This gives about 120 ml of a kondi tioned medium. Dieses konditionierte Medium wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. This conditioned medium was dialyzed against distilled water. Die dialysierte Lösung wird unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur konzentriert. The dialyzed solution is concentrated under reduced pressure at low temperature. Es werden etwa 5 ml einer CSF-enthaltenden Lösung erhalten. This gives about 5 ml of CSF-containing solution. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entspre chend der Bildung von 36 700 menschlichen Granulozytenkolonien/ ml Lösung. This solution exhibits activity accordingly the formation of human granulocyte colony-36700 / ml solution.

Beispiel 4 Example 4

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut abgetrennt und zur Herstellung der glykoproteidhaltigen Fraktion (Fraktion B) behandelt. In a similar manner as in Example 1 monocytes and macrophages are removed from human peripheral blood and to prepare the glykoproteidhaltigen fraction (fraction B) treated. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz dieser Fraktion zu McCoy′s 5A Medium, das 10% menschliches Serum enthält, in einer Menge von 1 mg (83,3 µg Glyko proteid)/ml Medium hergestellt worden ist. It is a medium used which, in an amount of 1 mg (83.3 ug glyco proteid) by the addition of this fraction to McCoy's 5A medium containing 10% human serum / ml of medium has been manufactured. Es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten wie in Beispiel 1. Diese Lösung hat eine Akti vität entsprechend der Bildung von 43 200 menschlichen Granulo zytenkolonien/ml Lösung. There are about 5 ml of solution containing a purified CSF in a similar manner as in Example 1. This solution has a Akti ity corresponding to the formation of human granulocytes 43,200 zytenkolonien / ml solution.

Beispiel 5 Example 5 (1) Herstellung des Glykoproteids (1) Preparation of Glykoproteids

Nach der Methode von Stanley und Mitarb. By the method of Stanley et al. aaO, werden Glyko proteid und glykoproteidhaltige Fraktionen folgendermaßen hergestellt: supra, glyco be made proteid and glykoproteidhaltige fractions as follows:
400 Liter frischer Urin von gesunden Versuchspersonen werden gegen Wasser durch eine Ultrafiltrationsmembran dialysiert. 400 liters of fresh urine of healthy subjects are dialyzed against water through an ultrafiltration membrane. Die dialysierte Lösung wird auf einen pH-Wert von 7,4 einge stellt und auf eine Säule mit den Abmessungen 2×15 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist, und die vorher mit einer 0,03 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,4 äquilibriert worden ist. The dialyzed solution is adjusted to a pH value of 7.4 is introduced and added to a column with the dimensions 2 x 15 cm, which is filled with DEAE-cellulose, and the previously with a 0.03 molar tris-HCl buffer solution has been equilibrated to the pH value 7.4. Die aktiven Substanzen werden an der DEAE-Cellulose adsorbiert. The active substances are adsorbed on the DEAE-cellulose. Hierauf werden die aktiven Substanzen mit 20 Liter einer 0,1 molaren tris-HCl-Puffer lösung gewaschen, die 0,04 molar an Natriumchlorid ist. Thereafter, the active substances with 20 liters of a 0.1 molar tris-HCl buffer are washed solution is 0.04 molar in sodium chloride. Sodann werden die aktiven Substanzen mit 20 Liter einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,15 molar an Natriumchlorid ist. Then, the active substances with 20 liters of a 0.1 molar tris-HCl buffer solution of pH 7.0 eluted, which is 0.15 molar in sodium chloride. Das erhaltene Eluat wird gegen destil liertes Wasser dialysiert. The eluate was dialyzed against water Destil profiled. Es wird die Fraktion C erhalten. This gives the fraction C.

Die erhaltene dialysierte Lösung wird mit Calciumphosphatgel in einer Menge von 58 ml Gel/g Protein versetzt. The dialyzed solution is treated with calcium phosphate gel in an amount of 58 ml gel / g protein. Die aktiven Substanzen werden am Gel adsorbiert. The active substances are adsorbed on the gel. Sodann wird das Calcium phosphatgel abfiltriert, zweimal mit 20 Liter einer 0,005 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 gewaschen und mit 5 Liter einer 0,025 molaren Phosphatpufferlösung eluiert. Then, the calcium phosphate gel is filtered off, washed twice with 20 liters of a 0.005 molar phosphate buffer solution of pH 6.5 and eluted with 5 liters of a 0.025 molar phosphate buffer solution. Das Eluat wird 10 Minuten bei 12 000 g zentrifugiert. The eluate is centrifuged at 12,000 g for 10 minutes. Der erhaltene Überstand wird gegen destilliertes Wasser dialy siert. The supernatant obtained is Siert dialy against distilled water. Sodann wird die dialysierte Lösung unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingedampft. Then, the dialyzed solution is evaporated under reduced pressure to about 50 ml. Das erhaltene Konzentrat wird mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung äquilibriert, auf eine Säule mit den Abmessungen 2,5×90 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. The concentrate obtained is equilibrated with a 0.1 molar tris-HCl buffer solution, added to a column with the dimensions 2.5 x 90 cm, which is filled with DEAE-cellulose, and which was previously equilibrated with the same buffer solution. Sodann wird mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung eluiert, die Natriumchlorid in einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,15 molar enthält. Is then eluted with a 0.1 molar tris-HCl buffer solution containing sodium chloride in a linear molar concentration gradient from 0 to 0.15. Die glykoproteidhaltigen Fraktionen werden aufgefangen und mittels einer Ultrafiltrations membran konzentriert (Fraktion D). The glykoproteidhaltigen fractions are collected and measured using an ultrafiltration membrane-concentrated (Group D).

Das erhaltene Konzentrat wird der Gelfiltration an einer Säule mit den Abmessungen 2,5×110 cm unterworfen, die mit Biogel P-100 gefüllt ist, das vorher mit einer 0,03 molaren tris-HCl-Pufferlösung äquilibriert worden ist. The concentrate obtained is subjected to gel filtration on a column with the dimensions 2.5 × subjected to 110 cm, which is filled with Biogel P-100, which has previously been equilibrated with a 0.03 molar tris-HCl buffer solution. Es werden 230 mg Glykoproteid erhalten (Produkt von Standardreinheit). There are 230 mg of glycoprotein obtained (product of standard purity).

100 mg dieses Produktes werden in einer 0,1 molaren Acetat pufferlösung vom pH-Wert 6,0 gelöst, die 1,0 molar NaCl, 0,001 molar MgCl₂, 0,001 molar MnCl₂ und 0,001 molar CaCl₂ ist. 100 mg of this product are in a 0.1 molar acetate buffer solution of pH 6.0 released, which is 1.0 molar NaCl, 0.001 molar MgCl₂, 0.001 and 0.001 molar molar MnCl₂ CaCl₂. Die Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 36×1,0 cm gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4B gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquili briert worden ist. The solution is applied to a column having the dimensions 36 × 1.0 cm, which is filled with concanavalin A-Sepharose 4B which has been previously-calibrated with the same buffer solution äquili. Es wird mit einer 0,1 molaren α -Methyl-D- glukosidlösung eluiert. It is eluted with a 0.1 molar glukosidlösung α-methyl-D. Es werden 8 mg Glykoproteid (hoch gereinigtes Produkt) erhalten. Are obtained (highly purified product) 8 mg glycoprotein.

Die biologische Aktivität gegenüber Knochenmarkzellen der Maus der Glykoproteidpräparate unterschiedlicher Reinheit werden nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt. The biological activity on bone marrow cells of mice of different purity Glykoproteidpräparate be determined by the method described above. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt. The results are summarized in Table VIII.
Probe Sample spezifische Aktivität specific activity halbgereinigtes Produkt semi-purified product
Fraktion A Fraction A 21 000 21000 Fraktion B Group B 54 000 54000 Produkt von Standardreinheit Product of standard purity 180 000 Of 180 000 hochgereinigtes Produkt highly purified product 1 240 000 1 240 000

(2) Züchtung von Monozyten und Makrophagen und Reinigung von CSF im konditionierten Medium (2) culturing monocytes and macrophages and purification of CSF in the conditioned medium

Die Verfahren von Beispiel 1 (3) und 1 (4) werden wiederholt, jedoch werden 1000 Einheiten/ml Medium des Glykoproteids von Standardreinheit anstelle des hochgereinigten Glyko proteids verwendet. The procedure of Example 1 (3) and 1 (4) are repeated, but 1000 units / ml of medium Glykoproteids of standard purity instead of the highly purified glyco be used proteids. Es werden etwa 5 ml einer gereinigten CSF-haltigen Lösung erhalten, die eine Aktivität entsprechend der Bildung von 35 000 menschlichen Granulozyten kolonien/ml Lösung besitzt. There are obtained about 5 ml of a purified CSF-containing solution, the colonies / ml solution has an activity corresponding to formation of 35,000 human granulocytes.

Beispiel 6 Example 6

Beispiel 5 wird wiederholt, und es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung erhalten. Example 5 is repeated, and there are about 5 ml of purified CSF-containing solution obtained. Es wird jedoch ein Glykoproteid verwendet, das nach der Methode von Stanley und Metcalf, aaO anstelle der Methode von Stanley und Mitarb. However, it is used a glycoprotein which. According to the method of Stanley and Metcalf, cited above, instead of the method of Stanley et al hergestellt worden ist. has been established. Die gereinigtes CSF ent haltende Lösung in diesem Beispiel zeigt eine Aktivität ent sprechend der Bildung von 9800 menschlichen Granulozyten kolonien/ml der Lösung. The purified CSF ent stop solution in this example demonstrates activity accordingly the formation of human granulocyte colony 9800 / ml of solution.

20 Liter menschlicher Urin wird gegen Leitungswasser bei Raumtemperatur während 8 bis 12 Stunden dialysiert. 20 liters of human urine dialyzed against tap water at room temperature for 8 to 12 hours. Sodann wird die dialysierte Lösung mit 75 g DEAE-Cellulose versetzt, die mit Wasser und 100 ml einer 1,0 molaren tris- HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Then, the dialyzed solution was treated with 75 g of DEAE-cellulose which has been equilibrated with water and 100 ml of a 1.0 molar Tris-HCl buffer solution of pH 7.0.

Das erhaltene Gemisch wird grundsätzlich vermischt, damit sich das Glykoproteid an der DEAE-Cellulose adsorbiert. The resulting mixture is mixed in principle, so that the glycoprotein adsorbed to the DEAE cellulose. Nach der Abtrennung des Überstandes wird die DEAE-Cellulose dreimal mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. After separation of the supernatant, the DEAE-cellulose is washed three times with a 0.1 molar tris-HCl buffer solution of pH 7.0, which is 0.05 molar in sodium chloride. Hierauf wird das adsobierte Glykoproteid mit 300 ml einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,5 molar an Natriumchlorid ist. Thereupon, the adsobierte glycoprotein is eluted with 300 ml of a 0.1 molar tris-HCl buffer solution of pH 7.0 which is 0.5 molar in sodium chloride. Dieses Verfahren wird sechsmal wiederholt. This procedure is repeated six times. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei 40°C konzentriert und gegen eine 0,1 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. The eluate is concentrated under reduced pressure at 40 ° C and dialyzed against a 0.1 molar tris-HCl buffer solution of pH 7.0. Die dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,3×44 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. The dialyzed solution is applied to a column with the dimensions 2.3 × 44 cm, which is filled with DEAE-cellulose and which has previously been equilibrated with a 0.1 molar tris-HCl buffer solution of pH 7.0. Das Glykoproteid wird an der DEAE-Cellulose adsobiert. The glycoprotein is adsorbed on the DEAE-cellulose. Danach wird die Säule mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. Then the column is washed with the same buffer solution is 0.05 molar in sodium chloride. Hierauf wird das adsorbierte Glykoproteid nach der Natriumchlorid- Konzentrationsgradienten-Eluierungsmethode mit einem Gradienten von 0,1 bis 0,5 molar Natriumchlorid im gleichen Puffer eluiert. Then the adsorbed glycoprotein is eluted by concentration gradient of sodium chloride-Eluierungsmethode with a gradient of 0.1 to 0.5 molar sodium chloride in the same buffer. Das Eluat wird gegen Wasser dialysiert. The eluate was dialyzed against water. Die erhaltene dialysierte Lösung wird unter vermindertem Druck einge dampft und gefriergetrocknet. The dialyzed solution is concentrated by evaporation and freeze-dried under reduced pressure. Das gefriergetrocknete Material wird in einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und auf eine Säule mit den Abmessungen 2,3×150 cm gegeben, die mit Sephadex G-150 gefüllt ist und die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. The freeze-dried material is dissolved in a 0.1 molar Tris-HCl buffer solution of pH 7.0 and applied to a column with the dimensions 2.3 x 150 cm, which is filled with Sephadex G-150 and with the same buffer solution is equilibrated. Es wird die Glykoproteidfraktion aufgefangen. It is collected the Glykoproteidfraktion. Diese Fraktion wird dialy siert und gefriergetrocknet. This fraction is dialy Siert and freeze-dried. Es werden etwa 12 mg eines Pulvers mit einer spezifischen Aktivität von etwa 36 000 bei Knochenmarkzellen der Maus enthalten. It will contain about 12 mg of a powder having a specific activity of about 36 000 from bone marrow cells of the mouse.

Beispiel 7 Example 7

Monozyten und Makrophagen werden aus menschlichem peripherem Blut auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise abge trennt. Monocytes and macrophages are separated abge from human peripheral blood in the manner described in Example 1. Es wird eine Glykoproteid enthaltende Fraktion auf die nachstehend beschriebene Weise nach der Methode von Laukel und Mitarb., aaO hergestellt und zu serumfreiem McCoy′s 5A Medium in einer Menge von 2000 Einheiten/ml gegeben. It is a glycoprotein containing fraction prepared in the manner described below by the method of Laukel et al., Supra, and added to serum-free McCoy's 5A medium in an amount of 2000 units / ml. Unter Verwendung dieses Mediums wird die Züchtung in ähnlicher Weise wie im Beispiel 5 durchgeführt. Using this medium, the cultivation is carried out in a similar manner as in Example 5. Es werden 120 ml eines konditionierten Mediums erhalten. There are an additional 120 ml of conditioned medium. Dieses Medium wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. This medium is dialyzed against distilled water. Sodann wird die dialysierte Lösung unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur auf etwa 5 ml konzentriert. Then, the dialyzed solution is concentrated under reduced pressure at low temperature to about 5 ml. Es wird eine CSF enthaltende Lösung erhalten, die eine Aktivität ent sprechend der Bildung von 29 000 menschlichen Granulozyten kolonien/ml Lösung aufweist. This gives a CSF-containing solution accordingly the formation of human granulocytes 29,000 colonies / ml solution has an activity.

50 Liter menschlicher Urin werden gegen laufendes Leitungs wasser mittels einer Ultrafiltrationsmembran (CL 100) dialysiert. 50 liters of human urine dialyzed against running water line with an ultrafiltration membrane (CL 100). Die erhaltene dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 10×30 cm gegeben, die mit DEAE- Cellulose gefüllt ist, die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,3 äquilibriert worden ist. The dialyzed solution is applied to a column having dimensions 10 × 30 cm, which is filled with DEAE cellulose, which had been previously equilibrated with a 0.05 molar tris-HCl buffer solution of pH 7.3. Das Glykoproteid wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert. The glycoprotein is adsorbed on the DEAE-cellulose. Danach wird die Säule mit einer 0,05 molaren tris-HCl- Pufferlösung vom pH-Wert 7,3 gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. Then the column is washed with a 0.05 molar Tris-HCl buffer solution of pH 7.3, which is 0.05 molar in sodium chloride. Hierauf wird das Glykoproteid mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die 0,3 molar an Natrium chlorid ist. Thereupon, the glycoprotein is eluted with the same buffer solution, the molar with respect to sodium chloride is 0.3. Das erhaltene Eluat wird gegen 0,05 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0 dialysiert, die 0,5 molar an NaCl, 2 millimolar an CaCl₂ und 2 millimolar an MgCl₂ ist. The resulting eluate is dialyzed against 0.05 molar tris-HCl buffer solution of pH 8.0, which is 0.5 molar of NaCl, 2 mM CaCl₂ and at 2 mM of MgCl₂. Die erhaltene dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,6×40 cm gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4B gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. The dialyzed solution is applied to a column with the dimensions 2.6 x 40 cm, which is filled with concanavalin A-Sepharose 4B which was previously equilibrated with the same buffer solution. Das am Säulen inhalt adsorbierte Glykoproteid wird mit der gleichen Pufferlösung gewaschen. The adsorbed on the column contents glycoprotein is washed with the same buffer solution. Hierauf wird das Glykoproteid mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die 0,15 molar an a -Methyl- D-mannosit ist. Thereupon, the glycoprotein is eluted with the same buffer solution which is 0.15 molar in a methyl-D-mannosit. Das erhaltene Eluat wird durch Ultrafiltra tion konzentriert. The eluate is concentrated by Ultrafiltra tion. Es werden etwa 7 ml einer Fraktion erhalten, die 6 mg Glykoproteid in 1 ml enthält. This gives about 7 ml of a fraction containing 6 mg of glycoprotein in 1 ml. Die spezifische Aktivität dieser Fraktion beträgt etwa 20 000 bei Knochenmarkzellen der Maus. The specific activity of this fraction is about 20 000 from bone marrow cells of the mouse.

Beispiel 8 Example 8

Monozyten und Makrophagen werden aus menschlichem peripherem Blut gemäß Beispiel 1 abgetrennt. Monocytes and macrophages are separated from human peripheral blood according to Example 1. Es wird eine glykoproteid haltige Fraktion (Fraktion D) in gleicher Weise wie in Beispiel 5 hergestellt und zu McCoy′s 5A Medium gegeben, das 10% menschliches Serum enthält. It is a glycoprotein containing fraction (fraction D) prepared in the same manner as in Example 5 and added to McCoy's 5A medium containing 10% human serum. Die Fraktion D wird in einer Menge von 2000 Einheiten/ml Medium zugegeben. The fraction D was added in an amount of 2000 units / ml of medium. Unter Verwendung dieses Mediums werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten, wie in Beispiel 5. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 24 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung. Using this medium, approximately 5 ml of solution containing a purified CSF can be obtained in a similar manner as in Example 5. This solution exhibits an activity corresponding to formation of human granulocyte colony 24,000 / ml solution.

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Citing PatentFiling datePublication dateApplicantTitle
US956737111 Oct 201514 Feb 2017Yeda Research And Development Co. Ltd.Short beta-defensin-derived peptides
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International ClassificationA61K38/00, C07K14/535, C12N1/38
Cooperative ClassificationA61K38/00, C07K14/535, C12N1/38
European ClassificationC07K14/535, C12N1/38
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2 Jan 19878110Request for examination paragraph 44
25 Aug 1988D2Grant after examination
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1 Jun 19898328Change in the person/name/address of the agent
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9 Jun 19938328Change in the person/name/address of the agent
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