DE3027105A1

DE3027105A1 - Verfahren zur herstellung eines die proliferation und differenzierung menschlicher granulopoetischer stammzellen stimulierenden faktors

Info

Publication number: DE3027105A1
Application number: DE19803027105
Authority: DE
Inventors: Morio Kuboyama; Katsuhiro Ogasa; Fumimaro Takaku; Yoshiteru Watanabe; Muneo Yamada; Nobuya Yanai
Original assignee: Green Cross Corp Japan; Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1979-07-20
Filing date: 1980-07-17
Publication date: 1981-02-12
Also published as: SE8005256L; GB2058081A; FR2461500A1; SE451850B; DE3027105C2; US4342828A; CA1128881A; GB2058081B; CH644520A5; FR2461500B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines die Proliferation und Differenzierung menschlicher granulopoetischer Stammzellen stimulierenden Faktors, nachstehend als Colony stimulating factor (CSF) bezeichnet. Dieser Faktor ist ein Arzneistoff, der zur Behandlung von Granulo-

10 zytopenie beim Menschen eingesetzt werden kann.

Es ist bekannt, daß CSF eine Schlüsselfunktion bei der Granulopoesis und der Bildung von Monozyten und/oder Makrophagen in vivo/ CSF wirkt im menschlichen Körper auf die Blutstammzellen, welche die Mutterzellen für die Granulozyten, Monozyten und Makrophagen darstellen; vgl. D.Metcalf, Experimental Haematology, Bd. 1 (1973), S. 185 bis 201. Der Vorschlag der Verwendung von CSF als Arzneistoff zur Behandlung von Granulozytopenie stammt von T. Fumimaro, Igaku no Ayumi (Progress in Medical Science), Bd. 95, Nr. 2 (1975), S. 41 bis 50. Bisher wurde jedoch CSF als Arzneistoff nicht eingesetzt, weil der Mechanismus der Bildung von Granulozyten, Monozyten und Makrophagen in vivo kompliziert ist, das Verhalten von CSF dabei noch teilweise unbekannt ist und es schwierig war, große Mengen CSF in pharmakologisch annehmbarer Qualtität herzustellen.

CSF kann auch als Diagnostikum verwendet werden. Es ist bekannt, daß die Bestimmung der Anzahl von auf CSF-reagierenden Zellen in Knochenmarkzellen von erheblicher Bedeutung für die Prognose von Patienten ist, die an myelogener Leukämie leiden; vgl. Nakao und Takaku, Proliferation and Differantiation "of Blood Cells - Fundamental and Clinical Aspects, S. 29, Verlag Kagaku Hyoron-sha Co., Japan, 1975. CSF eignet sich als Reagens (Bezugsstimulator)für diesen Zweck. Ebenso wie im vorstehenden Fall der Verwendung als Arznei-

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stoff ist CSF auch zur Diagnose bis jetzt nicht eingesetzt worden, weil es schwierig war, größere Mengen mit ausreichender Qualität für diagnostische Zwecke herzustellen.

Zur Herstellung von CSF, das unmittelbar auf die Stammzellen wirkt, sind verschiedene Verfahren bekannt, beispielsweise die Züchtung von Leukozyten aus menschlichem peripherem Blut (G.B. Price u. Mitarb., Biochemical Journal, Bd. 148 (1975), S. 209 bis 217), menschlichen Plazentazellen ( vgl. A.W. Burges u. Mitarb., Blood, Bd. 49, Nr. 4 (1977), S. 573 bis 583) oder bestimmten Krebszellen, die CSF bilden (vgl. N*0sawa u. Mitarb., Acta Hematologica Japonica, Bd. 42, Nr. 2 (1979), S. 237). Möglicherweise sind von den vorstehend beschriebenen Verfahren die Verfahren von Price u. Mitarb, und Burges u. Mitarb, zur Herstellung von CSF für pharmazeutische Zwecke geeignet. Die üblichen Verfahren unter Verwendung von Leukozyten oder menschlichen Plazentazellen sind jedoch lediglich Labormethoden zur Gewinnung kleiner Mengen CSF, und sie sind zur technischen Her-20

stellung von CSF ungeeignet. Weiterhin muß zur Herstellung von CSF nach dem bekannten Verfahren das Medium zur Züchtung der Zellen Serum enthalten. In Abwesenheit von Serum wird nämlich kein CSF gebildet. In der Regel wird Rinderserum

oder fetales Kälberserum verwendet. Zur Vermeidung von Neben-25

Wirkungen (Sensibilisierung und anaphylaktischer Schock)

durch diese Fremdproteine in den Medien ist es erforderlich, die Proteine nach der Vermehrung der Zellen abzutrennen oder menschliches Serum zu verwenden. Die Abtrennung dieser Proteine aus dem gebildeten CSF im Medium ist umständlich und 30

schwierig, und die Verwendung von menschlichem Serum ist teuer.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von CSF zu entwickeln, das in techni-35

schem Umfang durchführbar ist und CSF liefert, das sich zur

Behandlung von Granulozytopenie in der Humanmedizin ohne

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Nebenwirkungen und als Reagens zur Diagnose von myelogener Leukämie eignet. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. 5

Das aus menschlichem Urin isolierte, erfindungsgemäß verwendete Glykoprotein, welches die Bildung von menschlichen Granulozyten stimuliert (nachstehend als Glykoprotein H bezeichnet),ist in der DE-OS 2 910 745 beschrieben. Ein GIykoprotein, welches die Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten stimuliert, nachstehend als Glykoprotein M bezeichnet, das aus menschlichem Urin isoliert wird, ist als ein Sialinsäure enthaltendes Glykoprotein beschrieben; vgl. Stanley und Metcalf, Australien Journal of Experimental Biological Medical Science, Bd. 47 (1969), S. 467 bis 483, Stanley u. Mitarb., Federation Proceedings, Bd. 34, Nr. 13 (1975), S. 2272 - 2278 und Laukel et al., Journal of Cellular Physiology, Bd. 94 (1978), S. 21 bis 30.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete synthetische Zellkulturmedium kann ein übliches synthetisches Medium für Gewebekulturen oder Zellkulturen sein, beispielsweise McCoy's 5A-Medium ( T.A. McCoy, M. Maxwell und P.F. Kruse, Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., Bd. 100 (1959), S. 115 bis 118), Nährgemisch HAMF-10 (R.G. Harn, Exp. Cell Res., Bd. 29, S. 515 bis 526), RPMI-1640 (vgl. S. Iwakata, J.T. Grace Jr., N.Y.J.of Med., Bd. 64 (1964), S. 2279 bis 2282) oder ein durch Aminosäur'en ergänztes Eagle's MEM Medium

(vgl. H. Eagle, Science Bd. 130 (1959), S. 432. 30

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend näher beschrieben .

(1) Isolierung der Monozyten und Makrophagen 35

Mittels einer heparinisierten Spritze wird venöses Blut von

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gesunden Versuchspersonen entnommen, in ein steriles

Reagensglas abgefüllt und 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsschritte werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Nach 5 dem Stehen wird die obere Leukozyten enthaltende Schicht abgetrennt, einmal mit einem synthetischen Gewebe-Kulturmedium gewaschen und danach einer Dichte-Gradientenzentrifugation unterworfen (vgl. T. Mahmood und W.A. Robinson, Blood, Bd. 51, Nr. 5 (1978), S. 879 bis 887),

um die Leukozytenschicht in eine Schicht zu fraktionieren, die Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten sowie eine weitere Cranulozyten enthaltende Schicht/ Die erstgenannte Schicht wird isoliert. Es wird eine Zellfraktion erhalten, die in einem synthetischen Gewebekulturmedium suspendiert wird. Nachstehend wird dieses Gewebekulturmedium kurz als Medium bezeichnet. Die Zellsuspension wird zentrifugiert und der erhaltene überstand verworfen. Die erhaltenen sedimentierten Zellen werden mit dem gleichen Medium mindestens zweimal gewaschen. Hierauf werden die gewaschenen Zellen in einem geringen Volumen des gleichen Mediums suspendiert. Ein Teil der erhaltenen Suspension wird entnommen und die Zahl der Zellen mittels eines automatischen Blutzellenzählgeräts bestimmt. Das Zahlenverhältnis von Monozyten und Makrophagen zu Lymphozyten wird unter dem Mikroskop an einem Ausstrich bestimmt, der nach Wright-Giemsa gefärbt ist. Die Zellensuspension wird in einer Petrischale aus Glas oder Kunststoff so verteilt, daß die Zahl der Inokula (Monozyten und Makrophagen) dem vorgeschriebenen Wert entspricht, vorzugsweise 10 bis 10 pro Petrischale. Sodann wird ein synthetisches Gewebekulturmedium zugegeben, das mit 5 bis 20 Volumprozent Serum ergänzt ist. Hierauf läßt man die Petrischale 2 Stunden an feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid bei 37⁰C stehen. Während dieser Zeit verankern sich die Monozyten und Makro-

phagen an der Bodenfläche der Petrischale, während die Lymphozyten im Medium suspendiert bleiben. Das Medium wird

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sodann verworfen und die Petrischale wird mehrmals mit einem Medium ohne Serum oder mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Nach dieser Behandlung ist der größte Teil der Lymphozyten abgetrennt, während die Monozyten und Makrophagen am Boden der Petrischale haften. Die mikroskopische Untersuchung ergibt, daß mindestens 95 % der Zellen, die am Boden der Petrischale haften, Monozyten und Makrophagen sind, und

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ihre Zahl 10 bis 10 pro Petrischale beträgt.

(2) Züchtung bzw. Vermehrung der Monozyten und Makrophagen

Die Petrischale mit den Monozyten und Makrophagen wird mit einem synthetischen Medium versetzt, das gegebenenfalls mit Serum ergänzt ist und das mindestens 0,1 ug/ml Medium Glykoprotein (H) oder eine Glykoprotein (H) enthaltende Fraktion oder mindestens 500 Einheiten/ml Medium Glykoprotein (M) oder eine Glykoprotein (M) enthaltende Fraktion enthält. Die Einsaatdichte der Monozyten und Makrophagen beträgt mindestens 10 /ml Medium. Das beimpfte Medium wird 1 bis 7 Tage bei 37°C an feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Dabei wird CSF in das Medium abgegeben. Das verwendete synthetische Medium ist das vorstehend erwähnte Gewebekulturmedium.

Die optimalen Bedingungen zur Herstellung von CSF nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hinsichtlich Züchtungsdauer, Menge des zugesetzten Glykoproteins, Einsaatdichte, Menge des zugesetzten Serums und Art des verwendeten Mediums werden nachstehend in den Ausführungsbeispielen noch näher beschrieben.
30

Zur Herstellung von CSF für pharmazeutische Zwecke wird erfindungsgemäß ein Medium verwendet, das durch menschliches Serum ergänzt ist, oder es wird ein serumfreies Medium verwendet, um Sensibilisierung und anaphylaktischen Schock ^ durch Fremdproteine zu vermeiden. Zur Herstellung von CÖF für diagnostische Zwecke kann andererseits ein Medium ver-

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wendet werden, das durch Rinderserum oder fetales Kälberserum ergänzt ist. Ferner ist es möglich, auch Kulturflaschen anstelle von Petrischalen zu verwenden. Schließlich können die vermehrten Monozyten und Makrophagen auch wieder-

5 holt verwendet werden.

(3) Glykoproteine

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Glykoproteine werden aus menschlichem Urin isoliert. Sie stimulieren die Bildung menschlicher Granulozyten oder Mäusemakrophagen und Granulozyten. Es kann auch eine Fraktion verwendet werden, die diese Glykoproteine enthält.

Daß zur Stimulierung der Bildung menschlicher Granulozyten geeignete Glykoprotein kann nach der JP-OS 140 707/79 und der entsprechenden DE-OS 2 910 745 gewonnen werden. Das Verfahren ist nachstehend erläutert.

Frischer Urin von gesunden Versuchspersonen wird mit verdünnter Säure oder Base auf einen pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 8 eingestellt und zur Abtrennung von Verunreinigungen zentrifugiert. Der erhaltene Oberstand wird mit einem Silicium enthaltenden Adsorptionsmittel, beispielsweise Kieselgel, Kieselgel-Magnesiumsilikat, Diatomeenerde, Quarzglas oder Bentonit, behandelt, und die adsorbierten Bestandteile werden mit einer alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von mindestens 9 eluiert. Die zum Eluieren verwendete alkalische Lösung ist nicht kritisch. Vorzugsweise wird

³⁰ eine wäßrige Lösung von Ammoniak oder Natriumhydroxid in

einer Konzentration von 0,3 bis 1,5 molar verwendet. Das erhaltene Eluat wird auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt und mit einem Neutralsalz, beispielsweise Ammoniumsulfat,bis zu einer Sättigung von 70 % versetzt, um die aktive Substanz auszusalzen. Es wird eine das Glykoprotein enthaltende Rohfraktion gewonnen.

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Die erhaltene Rohfraktion wird in einer geringen Menge einer alkalischen Lösung gelöst, durch Ultrafiltration von niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht bis

höchstens 10 000 befreit und sodann zur Abtrennung der in der 5

Lösung enthaltenen Verunreinigungen mit einem Kationenaustauscher behandelt, beispielsweise mit Carboxymethyldextran, Carboxymethylcellulose oder Phosphorcellulose. Vor dieser Behandlung mit dem Kationenaustauscher werden sowohl die das Glykoprotein enthaltende Rohfraktion als auch der Ionenaustauscher mit einer vorzugsweise 0,01 bis 0,15 molaren Pufferlösung auf einen pH-Wert von 6 bis 8 äquilibriert, damit die Behandlung mit dem Austauscher bei nahezu neutralem pH-Wert durchgeführt werden kann. Der größte Teil des Glykoproteins wird vom Ionenaustauscher nicht adsorbiert. Nach dem Konzentrieren des Eluats wird das Konzentrat mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 8 äquilibriert und in einen Anionenaustauscher, beispielsweise DEAE-Cellulose gegeben, der mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, um das

Glykoprotein an dem Anionenaustauscher zu adsorbieren.

Hieraus wird das adsorbierte Glykoprotein mittels einer linearen Konzentrationsgradientenlösung einer 0,1 bis 0,3 molaren Salzlösung, beispielsweise einer Natriumchloridlösung, eluiert. Das Glykoprotein wird bei einer Salzkonzentration

von mindestens 0,1 molar eluiert, jedoch ist eine genaue Ab-25

trennung schwierig. Die Eluatfraktionen bei 0,1 bis 0,3 molarer Salzkonzentration werden vereinigt. Erforderlichenfalls wird die vereinigte Fraktion entsalzt und konzentriert. Diese Fraktion wird als Fraktion A bezeichnet. Die Fraktion A kann als

solche im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Die 30

Glykoproteinfraktion kann auch durch Adsorption an einem

Anionenauustauscher und stufenweises Eluieren mit einer 0,1 bis 0,3 molaren Salzlösung gereinigt werden, bevor man diese Fraktion der Eluierung mit einem linearen Konzentrationsgradienten unterwirft.
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Zur weiteren Reinigung wird die Fraktion A der Gelchromatographie an einem stark vernetzten Polymergel mit einem Wasseraufnahmewert von 10 bis 20 ml/g, beispielsweise Sephadex G-150 oder Biogel P-100/ unterworfen. Die aktiven Substanzen werden mit einem 0,05 bis 0,1 molarem Salzpuffer entwickelt und Fraktionen mit einem relativen Ausflußwert von 1,11 bis 1,60, vorzugsweise 1,11 bis 1,45, werden gesammelt, entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Diese Fraktion wird als Fraktion B bezeichnet.

Die auf diese Weise erhaltene Fraktion B kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Das relative

Ausflußvolumen ist das Verhältnis Ve : Vo, wobei Ve das erforderliche Volumen des Lösungsmittels ist, um die Substanz in der Säule zu eluieren, und Vo das Leervolumen der Gelsäule darstellt.

• Zur weiteren Reinigung wird das erhaltene Präparat in einer verdünnten Pufferlösung mit einem Salzgehalt von 1,0 bis 2,0 molar, beispielsweise einer Phosphatpafferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0 gelöst, die 1,0 bis 2,0 molar an Natriumchlorid ist.Die Lösung wird der Affinitätschromatographie an einem Zucker-affinen Adsorptionsmittel, beispielsweise Concanavalin A - Sepharose 4 B, unterworfen, das mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Das an der Affinitätssäule adsorbierte Glykoprotein wird mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, eluiert, die 1,0 bis 2,0 molar an Salz ist und die 20 bis 100 mMol eines Saccharide, beispielsweise a-Methyl-D-glukosid, enthält. Die das Glykoprotein enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, erforderlichenfalls entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Diese Fraktion kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

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Zur weiteren Reinigung wird die erhaltene Fraktion der präparativen Zonenelektrophorese unterworfen. Als Trägermedium wird beispielsweise ein Polyacrylamidgel oder Agargel vom pH-Wert 7,0 bis 9,0 verwendet. Es wird eine hochgereinigte Glykoproteinfraktion aus dem Trägermedium durch Eluieren mit einer kalten verdünnten Salzlösung erhalten. Diese Fraktion wird entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet. Dieses gereinigte Glykoprotein kann ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Glykoprotein, das die Bildung von Mäusegranulozyten und Makrophagen stimuliert, ist ebenfalls in den vorstehend erwähnten Druckschriften beschrieben. Die präparativen Verfahren von Stanley und Metcalf, Stanley und Mitarb, und Laukel u. Mitarb, sind nachstehend in den Beispielen 6, 5 und 7 im einzelnen beschrieben.

Die biologische Aktivität der Glykoproteinpräparate gegenüber Knochenmarkzellen der Maus wird auf die nachstehend beschriebene Weise bestimmt und in Einheiten ausgedrückt. 1 ml McCoy's 5A Medium, ergänzt mit 20 % fötalem Kälberserum, 0,3 % Agar und 1 χ 10 Knochenmarkzellen von Mäusen des Stammes C 57 B1/6J, wird mit 0,1 ml des zu bestimmenden Glykoproteins bzw. einer Glykoproteinfraktion versetzt. Das auf diese Weise hergestellte, das Glykoprotein enthaltende Medium wird in eine Petrischale aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 35 mm gegeben und 7 Tage bei 37⁰C an feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Danach wird die Zahl der einzelnen Kolonien, die jeweils mindestens 50 Zellen enthalten, unter dem Mikroskop bestimmt. Die biologische Aktivität einer Probe, die eine Kolonie bildet, entspricht einer Einheit. Zur Bestimmung des Reinigungsgrades einer Glykoproteinprobe wird die spezifische Aktivität nach folgender Gleichung

35 berechnet:

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Einheit der Probe Spezifische Aktivität =

Menge des Glycoproteins C oder der Glykoproteinfrak-

tion in mg.

Die spezifische Aktivität nimmt mit fortschreitender Reinigung zu. Das dem Medium zugesetzte Glykoprotein bzw. die Glykoproteinfraktion kann ein gereinigtes Präparat mit ho-

her spezifischer Aktivität sein. Vorzugsweise wird ein

Präparat mit niedrigerer Aktivität

eingesetzt, das während der Reinigung erhalten wird.

Das Glykoprotein (H) wird dem Medium in einer Menge von mindestens 0,1 μg_/ vorzugsweise 10 bis 100 μg/ml Medium zugesetzt, während das Glykoprotein (M) dem Medium in einer Menge von mindestens 500 Einheiten, vorzugsweise mindestens 1000 Einheiten pro ml Medium zugegeben wird.

(4) Gewinnung der aktiven Substanz aus dem Medium

Das CSF enthaltende Medium wird von der Petrischale entfernt und 5 bis 10 Minuten bei 1000 bis 2000 g zentrifugiert. Es

wird ein Überstand erhalten, der hochaktives CSP enthält. 25

Dieser Überstand eignet sich zur Herstellung eines Reagens oder eines Bezugsreagens zur Bestimmung der Bildung von Kolonien menschlicher granulopoetischer Stammzellen. Zu diesem Zweck wird die Aktivität des Überstandes derart einge-30

stellt, das 0,1 ml des Überstandes eine CSF-Aktivität aufweist, die zur Bildung von mindestens 100 menschlichen Granulozytenkolonien ausreicht. Die Lösung wird durch ein Membranfilter filtriert, aseptisch in ein Gefäß abgefüllt und luftdicht verschlossen. Es wird ein flüssiges Reagens erhal-

ten. Ein Reagens in Pulverform kann durch Gefriertrocknen des erhaltenen sterilen Filtrats unter aseptischen Bedingungen hergestellt werden.

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Für pharmazeutische Zwecke wird das unter Verwendung eines serumfreien Mediums erhaltene konditionierte Medium oder ein durch menschliches Serum ergänztes Medium gegen Wasser dialysiert und durch Membranfiltration sterilisiert. Erfor-

derlichenfalls wird das Filtrat konzentriert, aseptisch in ein Gefäß abgefüllt und luftdicht verschlossen. Es wird ein Präparat in flüssiger Form erhalten. Zur Herstellung von Präparaten in Pulverform wird die dialysierte Lösung durch Membranfiltration sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen gefriergetrocknet.

Zur weiteren Reinigung von CSF für pharmazeutische Zwecke wird der vorstehend erwähnte Überstand in eine hochmolekulare Fraktion (Molekulargewicht oberhalb 5000 oder 10 000) und eine niedermolekulare Fraktion (Molekulargewicht unter 5000 oder 10 000) mittels einer Ultrafiltrationsmembran ( Molekulargewichtschnitt 5 000 oder 10 000) getrennt. Beide Fraktionen enthalten zwar CSF, doch liegen in der hochmolekularen Fraktion mindestens 90 % des CSF vor.
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Ein pharmazeutisches Präparat kann durch Konzentrieren der niedermolekularen Fraktion unter vermindertem Druck hergestellt werden. Das Konzentrat der hochmolekularen Fraktion

wird in einer 0,01 bis 0,1 molaren Pufferlösung vom pH-Wert 25

6,0 bis 8,0 gelöst und mit einem Anionenaustauscherharz, beispielsweise DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex oder QAE-Sephadex behandelt, die mit dieser Pufferlösung äquilibriert worden

sind. Das CSF wird am Austauscherharz adsorbiert und sodann mit einer 0,1 bis 0,3 molaren Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0 eluiert. Es wird ein gereinigtes Produkt erhalten.

Das erhaltene Eluat kann durch Konzentrieren und anschließende Molekularsieb-Chromatographie durch Gelfiltration weiter gereinigt werden. Als Gel für die Gelfiltration kommen beispielsweise Sephadex G 150, Biogel P-100 und Ultragel AcA-44 in Frage.

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Bei der Herstellung von CSF in einem serumfreien Medium kann die Behandlung mit einem Anionenaustauscherharz entfallen, und die Reinigung erfolgt unmittelbar durch Gelchromatographie. Eine geeignete Entwickler-Pufferlösung bei der GeI-Chromatographie ist eine 0,01 bis O,3 molare Pufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0. Die bei der Gelfiltration erhaltenen CSF-aktiven Fraktionen werden vereinigt und konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet. Es wird ein gereinigtes CSF-

Präparat erhalten. 10

Die auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen gereinigten CSF-Präparate werden durch Immunelektrophorose unter Verwendung von menschlichem Antiserum und Rinderantiserum auf verunreinigende Proteine untersucht. Spuren an menschlichen

Globulin-ähnlichen Proteinen und Serumalbumin und Globulinähnlichen Proteinen, die vermutlich aus dem fetalem Kälberserum stammen, werden in CSF-Präparaten gefunden, die aus einem durch fetales Kälberserum ergänztem Medium stammen. Da praktisch keine derartigen Eiweißkörper in CSF-Präpara-

ten feststellbar sind, die in dem serumfreien Medium hergestellt wurden, können diese Präparate unmittelbar als Arzneistoffe verwendet werden, da sie keine Nebenwirkungen verursachen.

Zur Injektion können die flüssigen Präparate als solche verwendet werden, während die pulverförmigen Präparate in sterilem pyrogenfreiem Wasser, steriler physiologischer Kochsalzlösung oder ähnlichen Lösungen zunächst gelöst werden müssen.

Diese- Präparate können Patienten zur Behandlung von Granulozyto-30

penie "gegeben werden. Die Tagesdosis beträgt mindestens 77,8

mg/kg Körpergewicht.

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1 Versuchsbeispiel 1

Bestimmung der Inkubationszeit

(1) Isolierung von Monozyten und Makrophagen und Herstellung des Glykoproteins

Monozyten und Makrophagen werden auf die nachstehend in Beispiel 1 (1) beschriebene Weise isoliert. Die bei dem Experiment verwendeten Glykoproteine werden auf die nach-

¹^ stehend in Beispiel 1 (2) und Beispiel5(2) beschriebene Weise hergestellt. Das gemäß Beispiel 1 (2) hergestellte Glykoprotein (H) war ein stark gereinigtes Produkt der letzten Reinigungsstufe, während das gemäß Beispiel 5 (2) hergestellte Glykoprotein (M) ein Produkt von Standard-

^ reinheit (spezifische Aktivität 180 000) war.

(2) Inkubation der Monozyten und Makrophagen

Zwei Medien mit jeweils 100 ug/ml Glykoprotein (H) und ²^ 2 glykoproteinfreie Medien werden hergestellt. Für die Medien wird serumfreies llcCoy's 5A-Medium sowie ergänztes McCoy's 5A-Medium mit 20 % fetalem Kälberserum verwendet.

Jede Petrischale, die am Boden haftende Monozyten und

Makrophagen enthält, wird mit jeweils einem der vier genannten Medien in einer Menge von 10 Monozyten und Makrophagen pro ml Medium versetzt. Jedes Medium wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (3) inkubiert. Vor der Inkubation sowie nach Inkubationszeiten von 1, 3, 5 und 7 Tagen

werden vorbestimmte Volumina des Mediums jeder Petrischale

entnommen.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wird wiederholt, jedoch wird das Glykoprotein (M) in einer Menge von 1000 Einheiten/ml Medium anstelle des Glykoproteins (H) verwendet.

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(3) Bestimmung von CSF im konditioniertem Medium

Die CSF-Aktivität jedes konditionierten Mediums wird anhand

der Bildung von Kolonien menschlicher Knochenmarkzellen g

bestimmt. Das Knochenmark wird vom Brustbein (Sternum)

einer gesunden Versuchsperson mittels einer heparinisierten Spritze nach Sternumpunktur entnommen. Sodann wird das entnommene Knochenmark 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert, um

das buffy coat zu isolieren. Das buffy coat wird mit 10

McCoy's 5A Medium gewaschen, in McCoy's 5A Medium, das 20 % Serum enthält, suspendiert, in einer Petrischale ausgebreitet und mit mehreren mg/ml Medium pulverisiertem und sterilisiertem Carbonyleisen versetzt. Danach wird die Petrischale

1 bis 2 Stunden bei 37 C in einen Inkubator eingestellt. Danach werden die phagozytischen Zellen, die die Carbony1-eisenteilchen phagozytierten, am Boden der Petrischale mittels eines Magneten fixiert und die überstehende Zellsuspension wird isoliert. Die suspendierten Zellen sind nicht anhaftende, nicht phagozytierende Knochenmarkzellen, die zur Bestim-20

mung der CSF-Aktivität benutzt werden. Diese Knochenmarkzellen werden durch Zentrifugieren gewaschen und in einem kleinen Volumen des Mediums suspendiert. Die Zahl der kernhaltigen Zellen in der Suspension wird nach Behandlung mit Essigsäure-Gentianaviolett-Farbstoff gezählt.

Die nicht anhaftenden, nicht phagozytxerenden kernhaltigen Zellen werden in McCoy's 5A Medium übertragen, das 0,3 % Agar und 20 % fetales Kälberserum enthält. Die Einsaatdichte beträgt 2 χ 10 Zellen pro ml Medium. Nach Zugabe des konditionierten Mediums in einer Menge von 0,1 ml/ml Medium wird das beimpfte Medium 10 Tage bei 37°C an feuchter, 5 % Kohlendioxid enthaltender Luft inkubiert. Nach der Inkubation wird die Zahl der Kolonien unter den entstandenen Zellaggregaten unter einem Mikroskop gezählt. Der Ausdruck Kolonie bedeutet hier ein Zellagg3?egat, das mindestens 40 Zellen enthält. Die CSF-Aktivität wird ausgedrückt durch die Anzahl der Kolonien.

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Sie ist ein Maß für die Bildung von CSF. Die Ergebnisse
sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

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Züchtungs bedingungen	CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro konditioniertes Medium	ohne Glyko protein	0,1 ml	ohne Glyko protein
Inkubations dauer , Tage	Medium mit 20 % fetalem Kälberserum	0	serumfreies Medium	0
	mit Glyko protein	3 jf 1	mit Glyko protein	0
Glykoprotein (H) vor der Inkubation	O	24 + 3	0	1 jf 1
1	13 + 3	23 jf 1	2 + 1	0
3	116 + 4	16 + 4	25 + 2	0
5	117 jf 3	O	20 + 1	0
7	98 + 1	6 jf 4	18 + 1	0
Glykoprotein (M) vor der Inkubation	O	29 + 8	0	3 jf 1
1	20 + 8	30 jf 4	O	4 + 1
3	89 + 6	16 jf 2	35 + 4	2 +_ 1
5	86 jf 3	30 jf 6
7	69 jf 4	23 + 4

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß durch Zusatz des Glykoproteins die CSF-Bildung am dritten Tag der Inkubation ihr Maximum erreicht. Bei dem 20 % fetales Kälberserum enthaltenden Medium ist die CSF*Bildung deutlich höher in Gegenwart des Glycoproteins als in Abwesenheit des Glykoproteins (übliches Verfahren). Im serumfreien Medium wird CSF nach
Zusatz des Glykoproteins gebildet, während CSF in Abwesenheit des Glykoproteins kaum entsteht.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß bei der Herstellung von CSF durch Züchtung und Vermehrung von Monozyten und

Makrophagen in vitro die Glykoproteine die Bildung von CSF

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1 stimulieren, unabhängig davon, ob das Medium Serum enthält. Es wurde ferner festgestellt, daß die Inkubationsdauer 3 bis 7 Tage, vorzugsweise 3 Tage beträgt. Wenn keine Monozyten und Makrophagen eingeimpft werden., kann keine CSF-/

Aktivität im konditionierten Medium beobachtet werden, unabhängig davon, ob das Glucoprotein vorliegt.

Versuchsbeispiel 2 Versuche mit unterschiedlichen Mengen Glykoprotein.

Durch Zusatz der Glykoproteine (H) und (M) wie im Versuchsbeispiel 1 zu McCoy's 5A Medium, ergänzt mit 20 % fetalem Kälberserum sowie serumfreien McCoy's 5A Medium werden Medien hergestellt. Im Fall des Glykoproteins (H) werden

15 0,1 ,1,0, 10,0 bzw. 100 μg/ml Medium zugegeben. Im Fall des Glykoproteins (M) werden 100 , 500 , 1000 üzw. 2000 Einheiten/ml Medium zugegeben. Jedes Medium wird schließlich in die Petrischale gegeben, die an ihrem Boden anhaftende Monozyten und Makrophagen enthält. Sodann werden die Petri-

schalen 3 Tage in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 inkubiert. Die CSF-Aktivität jedes konditionierten Mediums wird wie im Versuchsbeispiel 1 bestimmt, um die CSF-BiI-dung festzustellen. Zum Vergleich werden Proben verwendet, die durch Inkubieren jedes Mediums ohne Zusatz von Glykoprotein erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.

L J

030067/0783

Zl

10 15 20

- 19 Tabelle II

zugesetztes Glyko	CSF-Aktivität (Zahl	der Kolonien)	serumfreies
protein	pro 0,1 ml konditioniertes Medium	Medium
	Medium mit 20 %
	fetalem Kälber
	serum	1 +_ 1
Glykoprotein (H)		9 + 1
0 (Vergleich)	24 + 3	25 + 2
0,1	51+2	53 + 3
1,0	116 + 4	80 + 4
10,0	166 + 10
100,0	170 + 8
Glykoprotein (M)		2 +_ 1
(Einheiten/ml)		6 + 3
0 (Vergleich)	21 +_ 6	13 + 6
100	28 + 3	49 + 6
500	96 + 10	85 +_ 8
1000	129 + 8
2000	170 + 6

25 30

Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß mit zunehmenden Mengen an Glykoprotein die CSF-Bildung ansteigt. Aus diesen Ergebnissen sowie den in Tabelle I mitgeteilten Ergebnissen (nach dreitägiger Inkubation) ist ersichtlich, daß die CSF-Bildung durch die Gegenwart von 0,1 μg Glykoprotein (H) oder 500 Einheiten Glykoprotein (M) pro 1 ml Medium deutlich erhöht ist. Im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt daher die Menge des zugesetzten Glykoproteins pro 1 ml Medium mindestens 0,1 μg, vorzugsweise 10 bis 100 μg bei Verwendung von Glykoprotein (H) und mindestens 500 Einheiten, vorzugsweise mindestens 1000 Einheiten Glykoprotein (M).

35

030087/0783

~ι

- 20 -

Versuchsbeispiel 3

Versuche mit unterschiedlicher Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen

Das Versuchsbeispiel 1 wird wiederholt. Es wird eine Reihe von konditionieren Medien erhalten, jedoch beträgt die Ein-

3 4 saatdichte an Monozyten und Makrophagen O,10 ,1O ,10 bzw. 10 /ml. 1 [ig Glykoprotein (H) bzw. 500 Einheiten Glykoprotein (M) werden zu 1 ml McCoy's 5A-Medium gegeben, das mit 20 % fetalem Kälberserum ergänzt ist, bzw. zu 1 ml serumfreiem McCoy's 5a Medium. Die Inkubationsdauer beträgt 3 Tage. Die erhaltenen konditionierten Medien werden auf CSF-Aktivität untersucht, um die Bildung von CSF in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 zu bestimmen. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Einsaatdichte	CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro 0,1 ml konditioniertes Medium	serumfreies Medium
Medium mit Glyko protein (H) 0 10³ 10⁴ 10⁵ 10⁶	Medium mit 20 % fe talem Kälberserum	0 0 6 +_ 1 25 +_ 2 69 J₁ 5 0 0 8 - + 4 31 +_ 3 74 + 2
Medium mit Glyko protein (M) 0 10³ 10⁴ 10⁵ 10⁶	0 13 + 1 20 +_ 2 116 _+ 4 185 J₁ 7
0 19 + 6 29 +_ 10 98 + 6 169 + 9

030067/0753

Aus Tabelle III ist ersichtlich, daß in jedem Fall große Mengen CSF gebildet werden, wenn die Einsaatdichte mindestens 10 Zellen/ml beträgt. Im erfindungsgemäßen Verfahren beträgt daher die Einsaatdichte mindestens 10 Monozyten

⁵ und Makrophagen pro 1 ml Medium.

Versuchsbeispiel 4
CSF-Produktion in verschiedenen Medien

Hinsichtlich der CSF-Produktion werden vier verschiedene handelsübliche Gewebekulturmedien oder Zellkulturmedien miteinander verglichen. Als Medien werden McCoy's 5A Medium, Nährgemisch HAMF-10, RPMI-1640 und Eagle's MEM Medium ergänzt mit Aminosäuren verwendet. Jedes dieser Medien, die nicht durch Serum ergänzt sind, wird mit 1,0 μg/ml Glykoprotein (H) bzw. 500 Einheiten/ml Glykoprotein (M) versetzt. Die erhaltenen Medien werden 3 Tage in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 inkubiert. Hierauf werden die erhaltenen konditionierten Medien in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 1 auf CSF-Bildung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Medium	CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro 0,1 ml konditioniertes Medium	mit Glykoprotein (M)
McCoy's 5 A HAMF - 10 RPMI - 1640 MEM	mit Glykoprotein • (H)	83 + 6 76+8 81 +_ 1 46+5
69 +_ 5 71+3 75 + 3 48 + 1

Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß sämtliche vier Medien für das erfindungsgemä-ße Verfahren geeignet sind. Die CSF-Bildung ist im MEM Medium etwas niedriger als in den anderen Medien.

030087/0783

ΓΙ

- 22 -

Versuchsbeispiel 5

Versuche mit Medium mit unterschiedlichen Mengen Serum

10

25 30

Auf die gleiche Weise wie in Versuchsbeispiel 1 werden konditionierte Medien hergestellt, McCoy's 5 A Medium wird mit 0 , 5 , 10 , 20 oder 30 % .menschlichem Serum oder fetalem Kälberserum versetzt. Beide Seren werden 30 Minuten auf 58°C erhitzt. Sodann werden 1 μg/ml Medium des Glykoproteins (H) bzw. 500 Einheiten/ml Medium Glykoprotein (M) zugesetzt. Die Einsaatdichte der Monozyten Makrophagen in jedes Medium beträgt 10 /ml und die Inkubationsdauer 3 Tage. Die erhaltenen konditionierten Medien werden auf CSF-Aktivität in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 untersucht, um die Bildung von CSF zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V

35

	CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro 0,1 ml konditioniertes Medium	mit fetalem Kälberserum
Zugesetztes Serum	mit menschlichem Serum
Medium mit Glyko- protein (H)		25 + 2
0	25 + 2	43 + 1
5	55 + 1	98 + 3
10	120 + 5	116 + 4
20	150 + 3	108 + 2
30	141 + 2
Medium mit Glyko- protein (M)		21+8
0	21 +8	51 + 4
5	49+6	89 + 2
10	109 + 5	102 + .6
20	124 + 7	92. + 5
30	123 +_ 8

0300S7/07S3

-23- 3Q27105¹

Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß mit zunehmender Menge an Serum die Bildung von CSF ansteigt. Erfindungsgemäß kann CSF in einem serumfreien Medium gebildet werden, doch kann das Medium mit Rinderserum oder fetalem Kälberserum versetzt werden, um größere Mengen CSF für diagnostische Zwecke herzustellen. Die wirksame Menge an zugesetztem Serum beträgt mindestens 5 %, vorzugsweise mindestens 10 %.

Versuchsbeispiel 6

Versuche mit einer Glykoprotein-Fraktion und einer hochgereinigten Fraktion.

In den Versuchsbeispielen 1 bis 5 wird gereinigtes Glykoprotein als aktive Substanz mit einer stimulierenden Wirkung bei der Bildung menschlicher Granulozyten (Fall I) und andererseits Glykoprotein von Standardreinheit (spezifische Aktivität 180 000) als aktive Substanz mit stimulierender Wirkung bei der Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten (Fall II) verwendet. Im vorliegenden Versuchsbeispiel soll gezeigt werden, daß im erfindungsgemäßen Verfahren ein halbgereinigtes Präparat anstelle des gereinigten Glykoproteins im Fall I und eine weniger gereinigte Fraktion sowie ein hochgereinigtes Präparat anstelle des Glykoproteins von

Standardreinheit im Fall II verwendet werden kann. 25

Die verwendeten glykoproteinhaltigen Fraktionen entsprechend Fall I sind die Fraktionen A und B, deren Herstellung nachstehend in Beispiel 1 beschrieben ist. Diese Fraktionen werden zu serumfreiem McCoy's 5 A Medium in Mengen von 0 , 0,5 , 1,0 , 5,0 bzw. 10 mg/ml entsprechend 0 , 8,3 , 16,6, 83,3 bzw. 166,6 μg/ml Medium ausgedrückt als aktives Glykoprotein in der Fraktion und in Mengen von 0 , 41, 7 , 83,4 , 417 und 834 μg/ml Medium ausgedrückt als aktives Glykoprotein in der Fraktion B zugesetzt. Die Einsaatdichte an Monozyten und Makrophagen in jedes Medium beträgt 10 /ml und die Inkubationsdauer 3 Tage. Es werden konditionierte Medien durch

L J

030067/0763

^Γ -24- 30271Q5¹

Inkubieren unter sonst gleichen Bedingungen wie im Versuchsbeispiel 1 erhalten.

Da die Fraktionen A und B menschliches Serumalbumin enthalten, das im-Urin vorliegt, werden Vergleichsproben durch Zusatz von menschlichem Serumalbumin zu McCoy's 5 A Medium in einer Menge entsprechend der Menge zugesetzt, die auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten Medien enthalten ist. Die Inkubationsbedingungen sind die gleichen, ^ wie sie vorstehend beschrieben sind.

Jedes konditionierte Medium wird auf CSP-Aktivität in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel 1 untersucht, um die Bildung von CSF nachzuweisen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI ^ zusammengefaßt.

Wie im Fall II ist das Glykoproteinpräparat im vorliegenden Versuchsbeispiel die Fraktion C (spezifische Aktivität

21 000), die Fraktion D (spezifische Aktivität 54 000) soon

wie das hochgereinigte Präparat (spezifische Aktivität

1 240 000), dessen Herstellung in Beispiel 5 beschrieben ist. Die konditionierten Medien werden auf die vorstehend im Zusammenhang mit Fall I beschriebene Weise hergestellt, jedoch werden die Fraktionen C und D sowie das hochgereinigte

Präparat ( vgl. Beispiel 5) den Medien jeweils in Mengen von 0 , 100 , 500 , 1000 und 2000 Einheiten/ml Medium anstelle der beschriebenen Mengen der Fraktionen A und B (vgl. Beispiel 1) zugesetzt. Die Vergleichsversuche mit menschlichem Serumalbumin entfallen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI

zusammengefaßt..

030087/0783

- 25 Tabelle VI

Zugesetzte Menge	CSF-Aktivität (Zahl der Kolonien) pro 0,1 ml konditioniertes Medium	Fraktion B	Vergleich
Glykpprotein von Beispiel 1 (mg/ml)	Fraktion A	0 59 + 1 114 + 1 103 +_ 3 98 + 4	0 4 +■ 1 6 + 2 14 + 2 26 +_ 1
O 0,5 1,0 5,0 10,0	0 6O + 1 121 + 1 170 +_ 3 148 + 2	Fraktion D	Hochgerei nigtes Prä parat
Glykoprotein von Beispiel 5 (Einheiten/ml)	Fraktion C	2 + 1 10 +_ 4 37 + 4 66 + 5 113 + 6	2 +_ 1 ⁵I² 10+3 21 + 4 44 +_ 9
0 100 50O looo 20OO	2 + 1 8 J₁ 2 36 + 6 74 J₁ 5 122 + 8

Einfluß des Reinheitsgrades des Glykoproteins mit stimulierender Wirkung auf die Bildung menschlicher Granulozyten.

Die CSF-Bildung in einem Medium, dem die Fraktion A oder B zugesetzt wird/ ist höher als im Vergleichsmedium. Dies zeigt, daß das Glykoprotein die CSF-Bildung anregt. Im Vergleich mit dem in Tabelle II gezeigten Beispiel, bei dem 10 μg/ml Glykoprotein dem serumfreien Medium zugesetzt wurden, ist in dem in Tabelle VI gezeigten Beispiel die CSF-Bildung höher. In diesem Beispiel wurden 0,5 mg/ml der Fraktion A (8,3 μg/ml GIy oprotein) zugesetzt. Dies ist eine geringe Menge Glykoprotein. Dies scheint auf dem Einfluß von Serumalbumin und anderen unbekannten Bestandteilen des menschliehen Urins zu beruhen, die der Fraktion A vorliegen.

030067/0783

Wenn man das Medium mit zugesetzter Fraktion A mit dem Medium mit zugesetzter Fraktion B hinsichtlich der CSF-Bildung vergleicht, ist ersichtlich, daß bei einer zugesetzten Menge von 0,5 oder 1,0 mg/ml beide Fraktionen etwa vergleichbar sind, daß jedoch bei höheren Konzentrationen der Fraktion B die CSF-Bildung niedriger ist. Dies beruht vermutlich darauf, daß der Gehalt an menschlichem Serumalbumin aus Urin in der Fraktion A größer ist als in der Fraktion B und der Zusatz der Fraktion B in Mengen von mehr als 5 mg/ml

10 eine zu starke Zugabe von Glykoprotein bewirkt. Unter Berücksichtigung aller dieser Ergebnisse bestehen Gründe zu der Annahme, daß unter das Serumalbumin, das im menschlichen Urin enthalten ist, und das Glykoprotein eine synergistische Wirkung bei der Bildung von CSF ausüben, und daß

15 eine maximale CSF-Bildung erhalten wird, wenn das Medium mit etwa 100 μg/ml Glykoprotein versetzt wird.

Bei Verwendung des Glykoproteins mit stimulierender Wirkung bei der Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten

20 (Fall II) ist aus Tabelle VI folgendes ersichtlich:

Die CSF-Bildung nimmt etwa proportional der Menge an dem Medium zugesetztem Glykoprotein zu. Im Vergleich mit den in Tabelle II gezeigten Ergebnissen unter Verwendung eines serumfreien Mediums ist die CSF-Bildung im vorliegenden Versuch höher, wenn die Fraktion C oder D verwendet wird, obwohl die Menge des dem Medium zugesetzten Glykoproteins die gleiche ist wie im vorhergehenden Fall. Dies beruht anscheinend auf dem Einfluß unter anderem des Serumalbumins, das in den Fraktionen C und D enthalten ist, die aus menschlichem Urin stammen. Aus den Ergebnissen, die bei Verwendung von hochgereinigtem Glykoprotein erhalten werden, ist ersichtlich, daß zwar die CSF-Produktion mit zunehmender Menge an Glykoprotein ansteigt, der Anstieg jedoch geringer ist als bei Verwendung der Fraktionen C und B und dem Präparat von Standardreinheit (Tabelle II). Aus den vorstehenden Ergebnissen kann man schließen, daß in serumfreien Medien das Serum-

030ÖS7/0783

Γ Π

albumin und andere Substanzen aus menschlichem Urin die gleiche Rolle spielen, wie das Serum im Hinblick auf die CSF-Produktion.

In jedem Falle ist es deshalb im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft, dem Medium ein rohes Glykoprotein anstelle eines gereinigten Glycoproteins zuzusetzen. Bei Verwendung eines rohen Glykoproteinpräparats wird es in einer Menge von mindestens 0,1 μg/ml Medium im Fall I oder in einer Menge von mindestens 500 Einheiten/ml Medium im Fall II eingesetzt.

Versuchsbeispiel 7

Bestimmung der wirksamen Dosis und der akuten Toxizität von CSF

Die wirksame Dosis und die akute Toxizität (LD₁. ) des erfindungsgemäß hergestellten CSF werden an Tieren folgendermaßen bestimmt.

Ein Gemäß Beispiel 3 hergestelltes konditioniertes Medium wird durch Membranfiltration sterilisiert und sodann durch eine Ultrafiltrationsmembran (molekulare Trenngrenze : 10 000) filtriert, hierauf konzentriert, entsalzt und gefriergetrocknet. Es wird CSF in Pulverform erhalten. Nach der im Versuchsbeispiel 1 beschriebenen Bestimmungsmethode beträgt die Zahl der Koloniebildung bei menschlichen Knochenmarkzellen 45OO/mg. Zum Vergleich wird der Versuch mit Knochenmarkzellen von Mäusen des Stammes C3H/He wiederholt. Die Zahl der Koloniebildung mit Knochenmarkzellen der Maus beträgt 7000/mg.

80 sechs Wochen alte männliche Mäuse des Stammes C3H/He mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g werden willkürlieh in 16 Untergruppen von jeweils 5 Tieren unterteilt. Die Untergruppen werden willkürlich zusammengestellt, und es

030087/0763

' werden vier Gruppen von jeweils vier Untergruppen gebildet.

Das auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellte CSF wird in steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Es ° werden drei Lösungen mit 1 mg/0,1 ml (für die Gruppe I), 2 mg/0,1 ml (für die Gruppe II) und 4 mg/0,1 ml (für die Gruppe III) hergestellt. Die Mäuse werden subkutan mit der Lösung in einer Tagesdosis von 0,1 ml/Maus an fünf aufeinanderfolgenden Tagen gespritzt. Nach 1,3,7 und 11 Tagen nach Beginn der Verabreichung werden Blutproben aus fünf Mäusen einer Untergruppe jeder Gruppe entnommen (die Untergruppen, denen Blut entnommen wurde, wurden für den weiteren Versuch nicht mehr verwendet). Die Zahl der Leukozyten in den periphären Blutgefäßen wird mittels eines automatischen Blutzellenzählgerätes bestimmt. Die Zahl der Granulozyten wird unter dem Mikroskop nach Wright-Giemsa gezahlt, um die Zunahme der Zahl der Leukozyten und Granulozyten nach CSF-Gabe zu bestimmen. Eine Gruppe (Gruppe I), der 0,1 ml sterile physiologische Kochsalzlösung ohne CSF gegeben wurde, wird

in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben behandelt und

als Kontrollgruppe verwendet. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

L -J

030067/0783

ro cn

Tabelle VII

I

(Vergleich)

20

Granulo-
zyten

Leuko
zyten

4

II

Leuko
zyten

5

III

IV

Granulo-
zyten

to

Gruppe

Leuko
zyten

7

14+7

53 jf

9

Granulo-
zyten

51 jf

10

Granulo-
zyten

Leuko
zyten

20+5

Nr.
Versuchsdauer,
Tage

55 +

_%B

12 + 8

63 +

8

13 jf 8

98 +

8

16 jf 4

59+8

60 jf 8

1

59 +

8

12 jf 4

74 jf

9

18 + 4

140 +

14

40 + 10

123 jf 6

102 + 14

3

⁴¹I,

15 jf 6

102 +

28 jf 6

185 +

60 jf 9

201 jf 5

121 + 21

7

58 +

45 + 10

75 + 13

260 + 19

11

Anmerkung: 1. Die Zahlenwerte bedeuten die Zahl der Blutzellen pro 1 mm³ Blut χ

-2

2. Die angegebenen Werte sind die Durchschnittswerte von jeweils 5 Mäusen.

NJ

ÜiJ

Im Vergleich zur Kontrollgruppe I zeigt die Gruppe II nach CSF-Gabe eine nahezu zweifache Zunahme der Zahl der Leukozyten und eine nahezu dreifache Zunahme der Zahl der Granulozyten 11 Tage nach Versuchsbeginn (6 Tage nach Beendigung der Gabe). Im Vergleich mit der Gruppe I zeigt die Gruppe IV eine etwa 4,5-fache Zunahme der Zahl der LeuKOzyten und eine etwa 8-fache Zunahme der Zahl der Granulozyten. Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die wirksame Tagesdosis bei Mäusen etwa 50 mg/kg Körpergewicht beträgt. Da die koloniebildende Aktivität des verwendeten CSF in im vorstehend beschriebenen Versuch um einen Faktor von 1,556 höher ist im Falle von Knochenmarkzellen der Maus als im Falle von menschlichen Knochenmarkζellen entspricht die wirksame Dosis bei einem Patienten mit Granulozytopenie, die bei menschlichen

15 Knochenmarkzellen eine Wirkung zeigt, die dem Effekt bei

Mäusen entspricht, etwa einer Tagesdosis von 77,8 mg/kg Körpergewicht. Die akute Toxizität wird unter Verwendung des gleichen CSF untersucht, wie in dem vorstehend beschriebenen Test zur Bestimmung der Dosis und an Mäusen des gleichen Stammes (6 bis 8 Wochen alt, durchschnittliches Körpergewicht 20,4 g). Es werden keine Todesfälle beobachtet bei einer Versuchsgruppe von 5 männlichen und 5 weiblichen Mäusen, denen 4,0 g CSF/ kg Körpergewicht gegeben wurden. Dementsprechend ist die akute Toxizität so gering, daß sie nach dem vorstehend beschriebenen Versuch nicht bestimmt werden kann.

Beispiel 1 (1) Isolierung von Monozyten und Makrophagen

200 ml Blut aus peripheren Gefäßen von gesunden Versuchspersonen werden in einem Gefäß aufgefangen, das 1000 Einheiten Heparin enthält. Der Inhalt des Gefäßes wird durch vorsichtiges Bewegen vermischt. Hierauf wird das heparinisierte Blut in einen sterilen Glaszylinder mit einem Durchmesser von 20 mm und einem Fassungsvermögen von 200 ml verbracht und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird die

L J

030087/0783

obere, die Leukozyten enthaltende Schicht vorsichtig mit abpipettiert, mit serumfreiem McCoy's 5 A Medium auf das Doppelte des ursprünglichen Volumens verdünnt und 15 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.

Die sedimentierten Leukozyten werden in 20 ml McCoy's 5 A Medium suspendiert und die Suspension wird über eine Natriummetrizoatlösung (Dichte 1,077) in einem Zentrifugenrohr beschichtet und 30 Minuten bei 400 g zentrifugiert. Die weiße Schicht, die Monozyten, Makrophagen und Lymphozyten ^ am Boden der oberen Schicht enthält, wird mit einer Pipette aufgenommen, mit McCoy's 5 A Medium gewaschen und 10 Minuten bei 1500 g zentrifugiert. Der überstand wird verworfen. Diese Behandlung wird noch zweimal wiederholt. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen werden in 20 ml McCoy's 5 A Medium suspendiert. Ein Teil wird zur Zählung der Zellen mit einem automatischen Blutzellenzählgerät verwendet. Es wird ein Ausstrich der Suspension hergestellt, mit Wright-Giemsa Farbstoff gefärbt, und die Zahl der Lymphozyten sowie die Zahl der Monozyten und Makrophagen wird morphologisch bestimmt,

um das Zellenverhältnis festzustellen. Der Anteil der Monozyten und Makrophagen beträgt 25,5 %.

Jeweils 5 ml der erhaltenen Suspension werden in vier Petrischalen mit einem Durchmesser von 15 cm gegeben. Sodann wer-

den 30 ml McCoy 's 5 A Medium zugesetzt, das mit 10 % fetalem Kälberserum ergänzt ist. Danach werden die Petrischalen 2 Stunden bei 37⁰C an feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid stehengelassen. Hierauf wird das Medium abgegossen, und es werden 3O ml McCoy's 5 A Medium zugesetzt. Nach ziemlich kräf-

tigern Schütteln wird das Medium zur Abtrennung der Lymphozyten verworfen. Der Anteil der verbleibenden Monozyten und Makrophagen wird auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt. In jeder Petrischale beträgt der Anteil 95 %.

030067/0763

¹ (2) Herstellung des Glykoproteins

Das Glykoprotein wird nach der JP-OS 140 707/79 und der

entsprechenden DE-OS 2 910 745 hergestellt. 5

400 Liter frischer Urin von gesunden Versuchspersonen^ werden mit lOprozentiger Natronlauge auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und bei 0⁰C und 15 000 g zentrifugiert. Unlösliche Substanzen werden sedimentiert. Der Überstand wird mit lOprozentiger Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und auf eine Säule mit den Abmessungen 10 χ 80 cm gegeben, die mit Kieselgel gefüllt ist. Die am Kieselgel adsorbierten Bestandteile werden mit 40 Liter 5prozentiger wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das erhaltene Eluat wird mit 1 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, mit pulverisiertem Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt und 15 bis 18 Stunden bei O⁰C stehengelassen. Sodann wird die entstandene Fällung abfiltriert.

Die erhaltene Fällung wird in 2 Liter 5prozentiger wäßriger Ammoniaklösung gelöst, in einen Dialyseschlauch gegeben und gegen 0,05 molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 gründlich dialysiert. Danach wird die dialysierte Lösung, d.h.

das Retentat, mit der genannten Pufferlösung auf 10 Liter

aufgefüllt und auf eine Säule mit den Abmessungen 4 χ 40 cm gegeben, die mit CM-Sephadex C-50 Ionenaustauscher gefüllt ist. Dieser Austauscher ist vorher mit 0,05 molarer Phosphatpufferlösung äquilibriert worden. Die Verunreinigungen werden

durch Adsorption am Ionenaustauscher entfernt. Das Eluat

wird gesammelt.

10 Liter des erhaltenen Eluats werden unter Verwendung eines "Diaflow" Hohlfaser-Konzentrators (Typ DC-30) konzentriert.

Das Konzentrat wird sodann 15 bis 18 Stunden bei 5⁰C gegen 35

eine 0,1 molare.tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Die dialysierte Lösung, d.h. das Retentat, wird mit

030067/0763

^Γ -33- 3027

der gleichen Pufferlösung auf 1 Liter aufgefüllt und auf eine Säule mit den Abmessungen 4,0 χ 40 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist. Diese Celululose ist vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden. Nach dem Waschen mit 0,1 molarer cis-HCl-Pufferlösung werden die adsorbierten Bestandteile mit 0,1 molarer tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,3 molar an Natriumchlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen 0,1 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert.

Die erhaltene dialysierte Lösung wird erneut auf eine Säule mit den Abmessungen 4,0 χ 40 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Sodann wird die Säule mit einer linearen Konzentrationsgradientenlösung von Natriumchlorid (Chloridionenkonzentrationsgradient 0,1 bis 0,3 molar) eluiert. Es werden die Fraktionen aufgefangen, die bei Chloridionen Konzentrationen von 0,15 bis 0,25 molar eluiert werden. Die Fraktionen werden vereinigt und mit pulverisiertem Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, in einer kleinen Menge 0,1 molarer tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird als Fraktion A bezeichnet.

20 ml der erhaltenen dialysierten Lösung werden an einer mit Sephadex G-150 gefüllten Säule mit den Abmessungen 4,0 χ 60 cm entwickelt. Die Säule ist vorher mit 0,1 molarer tris-HCl-Puf ferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden. Die Fraktionen, die einem relativen Ausflußwert von 1,11 bis 1,45 entsprechen, werden aufgefangen. Die Fraktionen werden vereinigt und gegen destilliertes Wasser gründlich dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. Es werden etwa 500 mg eines Pulvers erhalten, das als Frak-

³⁵ tion B bezeichnet wird.

030067/0783

200 mg des erhaltenen Pulvers werden in einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst, die 1,0 molar an Natriumchlorid ist. Die Lösung wird auf eine 100 ml fassende Säule gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4 B gefüllt, und die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die Säule wird gründlich mit einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen, die 1,0 molar an Natriumchlorid ist. Sodann wird die Säule mit einer 0,02 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 50 millimolar an a-Methyl-D-glukosid und 1,0 molar an Natriumchlorid ist. Das Eluat wird gegen destilliertes Wasser dialysiert» Die dialysierte Lösung wird sodann gefriergetrocknet.

Etwa 50 mg des erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers werden in 1 ml einer 0,125 molaren tris-Glycin-Pufferlösung vom pH-Wert 5,8 gelöst, die 10 % Glycerin enthält. Die Lösung wird bei 10 Milliampere unter Kühlung in einer präparativen

Elektrophoresevorrichtung der Elektrophorese unterworfen. 20

Es wird ein 8prozentiges Acrylamidgel mit den Abmessungen

20 χ 25 mm vom pH-Wert 8,9 verwendet. Die Fraktion mit einer relativen Beweglichkeit von 0,46 wird mit einer 0,025 molaren tris-Glycin-Pufferlösung vom pH-Wert 8,3 eluiert und sodann gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. Es werden etwa 10 mg Glykoprotein erhalten. Beim wiederholen des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden etwa 30 mg Glykoprotein erhalten.

(3) Züchtung der Monozyten und Makrophagen

Das auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltene Glykoprotein wird zu 30 ml eines McCoy's 5 A Medium gegeben, das 35 20 % fetales Kälberserum enthält, und zwar in einer Menge

von 100 μg/ml Medium. 30 ml des erhaltenen Mediums werden in

L J

030067/0763

302710?

jeweils eine Petrischale gegossen, die anhaftende Makrophagen und Monozyten enthält, wie dies vorstehend unter Ziffer (1) des Beispiels beschrieben ist. Die Populationsdichte der Monozyten und Makrophagen in dem Medium beträgt 1O /ml.

Das hergestellte Medium wird 3 Tage bei 37 C an feuchter Luft mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Es wird ein CSF-enthaltendes konditioniertes Medium erhalten.

(4) Reinigung von CSF in dem konditionierten Medium 10

Die Medien aus den Petrischalen werden 10 Minuten bei 2 C und 2000 g zentrifugiert. Es werden etwa 120 ml eines klaren Überstandes erhalten, der mittels einer Ultrafiltrationsmembran mit einer molekularen Trenngrenze von 10 000 konzentriert wird. Das erhaltene Konzentrat wird mit 100 ml einer O,O5 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,2 versetzt und erneut auf 5 ml konzentriert.

Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,0 χ 60 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Sodann wird das CSF mit einer linearen Gradientenkonzentration von Kochsalz (0 bis etwa 3 molar) eluiert. Die aktive Substanz enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mittels der vorstehend genannten Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Hierauf wird die konzentrierte Lösung auf eine Säule mit den Abmessungen 2,0 χ 90 cm gegeben, die mit Sephadex G-150 gefüllt ist und die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Sodann wird die Säule mit der gleichen Pufferlösung entwickelt. Es werden diejenigen Fraktionen aufgefangen, die einem Molekulargewicht von 65 000 bis 90 000 sowie die Fraktionen, die einem Molekulargewicht von 30 000 bis 60 000 entsprechen. Diese Fraktionen

werden vereinigt und mittels der Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird mit

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destilliertem Wasser versetzt, entsalzt und konzentriert. Es werden etwa 5 ml einer Lösung erhalten, die gereinigtes CSF enthält. Diese Lösung besitzt eine Aktivität, bestimmt gemäß Versuchsbeispiel 1, entsprechend der Bildung von 41 000 Kolonien menschliche Granulozyten/ml.

Beispiel 2

Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und

10 zur Herstellung des gereinigten Glykoproteins behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz des gereinigten Glykoproteins zu serumfreien McCoy's 5 A Medium in einer Menge von 100 μg/ml Medium hergestellt worden ist. Es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in

ähnlicher Weise erhalten wie in Beispiel 1. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 16 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.

Beispiel 3

20 in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und zur Herstellung der glykoproteinhaltigen Fraktion (Fraktion A) behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz dieser Fraktion zu serumfreiem McCoy's 5 A Medium in

²⁵ einer Menge von 5 mg (83,3 mg Glykoprotein)/ml Medium hergestellt worden ist. Es werden etwa 120 ml eines konditionierten Mediums erhalten. Dieses konditionierte Mediuni wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wird unter vermindertem Druck bei niedriger Tempera-

30 tür konzentriert. Es werden etwa 5 ml einer CSF-enthaltenden Lösung erhalten. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 36 700 menschlichen Granulozytenkolonien/ ml Lösung.

Beispiel 4

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 werden Monozyten und

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Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut abgetrennt und zur Herstellung der glykoproteinhaltigen Fraktion (Fraktion B) behandelt. Es wird ein Medium verwendet, das durch Zusatz dieser Fraktion zu McCoy's 5 A Medium, das 10 % menschliches Serum enthält, in einer Menge von 1 mg (83,3 μg Glykoprotein)/ml Medium hergestellt worden ist. Es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten wie in Beispiel 1. Diese Lösung hat eine Aktivität entsprechend der Bildung von 43 200 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.

Beispiel 5 (1) Herstellung des Glykoproteins.

Nach der Methode von Stanley u. Mitarb. a.a.O., werden Glykoprotein und glykoproteinhaltige Fraktionen folgendermaßen hergestellt:

400 Liter frischer Urin von gesunden Versuchspersonen werden gegen Wasser durch eine ültrafiltrationsmembran dialysiert.

Die dialysierte Lösung wird auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und auf eine Säule mit den Abmessungen 2 χ 15 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist, und die vorher mit einer 0,03 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,4 äquilibriert worden ist. Die aktiven Substanzen werden an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Hierauf werden die aktiven Substanzen mit 20 Liter einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung gewaschen, die 0,04 molar an Natriumchlorid ist. Sodann werden die aktiven Substanzen mit 20 Liter einer 0,1 molaren tris-HCL-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,15 molar an Natriumchlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Es wird die Fraktion C erhalten.

Die erhaltene dialysierte Lösung wird mit Calciumphosphatgel in einer Menge von 58 ml Gel/g Protein versetzt. Die aktiven Substanzen werden am Gel adsorbiert. Sodann wird das Calciumphosphatgel abfiltriert, zweimal mit 20 Liter einer 0,005 mo-

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1 laren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 gewaschen und

mit 5 Liter einer 0,025 molaren Phosphatpufferlösung eluiert. Das Eluat wird 10 Minuten bei 12 000 g zentrifugiert. Der erhaltene überstand wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingedampft. Das erhaltene Konzentrat wird mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung äquilibriert, auf eine Säule mit den Abmessungen 2,5 χ 90 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Sodann wird mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung eluiert, die Natriumchlorid in einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,15 molar enthält. Die glykoproteinhaltigen Fraktionen werden aufgefangen und mittels einer Ultrafiltrations-

15 membran konzentriert. (Fraktion D).

Das erhaltene Konzentrat wird der Gelfiltration an einer Säule mit den Abmessungen 2,5 χ 110 cm unterworfen, die mit Biogel P-100 gefüllt ist, das vorher mit einer 0,03 molaren tris-HCl-Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es werden 230 mg Glykoprotein erhalten (Produkt von Standardreinheit).

100 mg dieses Produktes werden in einer 0,1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 gelöst, die 1,0 molar NaCl,

0,001 molar MgCl₃, 0,001 molar MnCl₃ und 0,001 molar CaCl₃ ist. Die Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 36 χ 1,0 cm gegeben, die mit Konkanavalin A-Sepharose 4 B gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es wird mit einer 0,1 molaren cx-Methyl-D-

30 glukosidlösung eluiert. Es werden 8 mg Glykoprotein (hochgereinigtes Produkt) erhalten.

Die biologische Aktivität gegenüber Knochenmarkzellen der Maus der GIykoproteinpräparate unterschiedlicher Reinheit 35 werden nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.

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Tabelle VIII

Probe	spezifische Aktivität
halbgereinigtes Produkt Fraktion A Fraktion B Produkt von Standardreinheit hochgereinigtes Produkt	21 000 54 000 180 000 1 240 000

(2) Züchtung von Monozyten und Makrophagen und Reinigung von CSF im konditionierten Medium

20

Die Verfahren von Beispiel 1(3) und 1 (4) werden wiederholt, jedoch werden 1000 Einheiten/ ml Medium des Glycoproteins von Standardreinheit anstelle des hochgereinigten Glykoproteins verwendet. Es werden etwa 5 ml einer gereinigten CSF-haltigen Lösung erhalten, die eine Aktivität entsprechend der Bildung von 35 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung besitzt.

25 30

Beispiel 6

Beispiel 5 wird wiederholt, und es werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung erhalten. Es wird jedoch ein Glykoprotein verwendet, das nach der Methode von Stanley und Metcalf, a.a.O. anstelle der Methode von Stanley u. Mitarb, hergestellt worden ist. Die gereinigtes CSF enthaltende Lösung in diesem Beispiel zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 9800 menschlichen Granulozytenkolonien/ml der Lösung.

35

20 Liter menschlicher Urin wird gegen Leitungswasser bei Raumtemperatur während 8 bis 12 Stunden dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung mit 75 g DEAE-Cellulose versetzt, die mit Wasser und 100 ml einer 1,0 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist.

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Das erhaltene Gemisch wird gründlich vermischt, damit sich das Glykoprotein an der DEAE-CeIlulose adsorbiert. Nach der Abtrennung des Überstandes wird die DEAE-Cellulose dreimal mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. Hierauf wird das adsorbierte Glykoprotein mit 300 ml einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,5 molar an Natriumchlorid ist. Dieses Verfahren wird sechsmal wiederholt. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei 40 C konzentriert und gegen eine 0,1 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Die dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit dem Abmessungen 2,3 χ 44 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist und die vorher mit einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Das Glykoprotein wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Danach wird die Säule mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. Hierauf wird das adsorbierte Glykoprotein nach der Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten-Eluierungsmethode mit einem Gradien-

ten von 0,1 bis 0,5 molar Natriumchlorid im gleichen Puffer eluiert. Das Eluat wird gegen Wasser dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material

wird in einer 0,1 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 25

7,0 gelöst und auf eine Säule mit den Abmessungen 2,3 χ 150 cm

gegeben, die mit Sephadex G-150 gefüllt ist und die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Es wird die Glykoproteinfraktion aufgefangen. Diese Fraktion wird dialysiert und gefriergetrocknet. Es werden etwa 12 mg eines PuI-30

vers mit einer spezifischen Aktivität von etwa 36 000 bei

Knochenmarkzeilen der Maus erhalten.

Beispiel 7

Monozyten und Makrophagen werden aus menschlichem peripherem Blut auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise abgetrennt. Es wird eine Glykoprotein enthaltende Fraktion auf

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die nachstehend beschriebene Weise nach der Methode von Laukel u. Mitarb., a.a.O. hergestellt und zu serumfreiem McCoy's 5 A Medium in einer Menge von 2 000 Einheiten/ml gegeben. Unter Verwendung dieses Mediums wird die Züchtung in ähnlicher Weise wie im Beispiel 5 durchgeführt. Es werden 120 ml eines kondxtionierten Mediums erhalten. Dieses Medium wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur auf etwa 5 ml konzentriert. Es wird ^ eine CSF enthaltende Lösung erhalten, die eine Aktivität entsprechend der Bildung von 29 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung aufweist.

50 Liter menschlicher Urin werden gegen laufendes Leitungswasser mittels einer Ultrafiltrationsmembran (CL 100) dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 10 χ 30 cm gegeben, die mit DEAE-Cellulose gefüllt ist, die vorher mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,3 äquilibriert worden

ist. Das Glykoprotein wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert.

Danach wird die Säule mit einer 0,05 molaren tris-HCl-Puf ferlösung vom pH-Wert 7,3 gewaschen, die 0,05 molar an Natriumchlorid ist. Hierauf wird das Glykoprotein mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die 0,3 molar an Natrium-

Chlorid ist. Das erhaltene Eluat wird gegen 0,05 molare tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0 dialysiert, die 0,5 molar an NaCl, 2 millimolar an CaCl- und 2 millimolar an MgCl₂ ist. Die erhaltene dialysierte Lösung wird auf eine Säule mit den Abmessungen 2,6 χ 40 cm gegeben, die mit

Konkanavalin A-Sepharose 4B gefüllt ist, die vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Das am Säuleninhalt adsorbierte Glykoprotein wird mit der gleichen Pufferlösung gewaschen. Hierauf wird das Glykoprotein mit der

gleichen Pufferlösung eluiert, die 0,15 molar an a-Methyl-35

D-mannosit ist. Das erhaltene Eluat wird durch Ultrafiltration konzentriert. Es werden etwa 7 ml einer Fraktion erhal-

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¹ ten, die 6 mg Glykoprotein in 1 ml enthält. Die spezifische Aktivität dieser Fraktion beträgt etwa 20 000 bei Knochenmarkzellen der Maus.

⁵ Beispiel 8

Monozyten und Makrophagen werden aus menschlichem peripherem Blut gemäß Beispiel 1 abgetrennt. Es wird eine glykoproteinhaltige Fraktion (Fraktion D) in gleicher Weise wie in Beispiel 5 hergestellt und zu McCoy's 5 A Medium gegeben, das 10 % menschliches Serum enthält. Die Fraktion D wird in einer Menge von 2 000 Einheiten/ml Medium zugegeben. Unter Verwendung dieses Mediums werden etwa 5 ml einer gereinigtes CSF enthaltenden Lösung in ähnlicher Weise erhalten, wie in Beispiel 5. Diese Lösung zeigt eine Aktivität entsprechend der Bildung von 24 000 menschlichen Granulozytenkolonien/ml Lösung.

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Claims

" Verfahren zur Herstellung eines die Proliferation und Differenzierung menschlicher granulopoetischer Stammzellen stimulierenden Faktors " Priorität: 20. 7. 1979, Japan, Nr. 92 355/79 20 15. 5. 1980, Japan, Nr. 64 625/80 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines die Proliferation und Differenzierung menschlicher granulopoetischer Stammzellen stimulierenden Faktors, dadurch gekennzeichnet, daß man Monozyten und Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut in eine» Gewebekulturmedium vermehrt, das ein Glykoprotein aus menschlichem Urin enthält, welches die Bildung von menschlichen Granulozyten oder Mäusemakrophagen und Granulozyten stimuliert, und den gebildeten Faktor aus der Kulturflüssigkeit isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermehrung der Monozyten und Makrophagen in Gegenwart von Serum durchführt.

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3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serum menschliches Serum verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, man

daß/das Serum in einer Menge von mindestens 5 %, bezogen auf das Volumen des Mediums verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Glykoprotein, welches die Bildung von menschlichen Granulozyten stimuliert, in einer Menge von mindestens 0,1 μg/ml Medium verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß man ein Glykoprotein, welches die Bildung von Mäusemakrophagen und Granulozyten stimuliert, in einer Menge von mindestens 500 Einheiten/ml Medium verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

man als Glykoprotein ein teilweise gereinigtes Material

verwendet, das noch Harnproteine enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Monozyten und Makrophagen, die in das Gewebekulturmedium überimoft werden, mindestens 10 /ml beträgt.

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