DE2716276A1 - Verfahren und vorrichtung zur immunologischen bestimmung von gentamycin - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur immunologischen bestimmung von gentamycin

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Description

Patentanwalts
Dr.-Ing. Wilhelm Boichel Bfel-ir.!?. V/ciigang Eeichel
6 Frankfurt a. M. 1 PcrkßiraJJe 13
8744
TECHIiICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Yef VStA
Verfahren und Vorrichtung zur immunologischen Bestimmung von Gentamicin
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Die Erfindung betrifft immunologische Bestimmungen und insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung von Gentamycin und ähnlichen Aminoglycosidantibiotika in biologischen Flüssigkeitsproben.
Gentamycin ist einer der wichtigsten Vertreter der Aminoglycosidantibiotika. Es besitzt die folgende Struktur:
H2N
Gentamycin C1 : R = R1 = Me Gentamycin C2 : R = Me, R' = H Gentamycin C1 : R=R1 = H
Gentamycinpräparate bestehen im allgemeinen aus einem Gemisch der genannten Komponenten.
Gentamycin ist höchst giftig, insbesondere im Hinblick auf die Ohren (Ototoxizität), wenn es im Kreislauf nur in zwei- bis dreifacher Menge des optimalen therapeutischen Spiegels vorhanden ist. Außerdem variieren die Ausscheidungsgeschv/indigkeiten von Gentamycin aus dem Blut von Patient zu Patient in starkem Maße. Es ist daher wesentlich, daß die klinische Behandlung mit Gentamycin in jedem Einzelfall von einer Überwachung des Gentamycinspiegels im Blut begleitet ist. Zur Zeit ist die geläufigste Bestimmung für Gentamycin eine biologische Bestimmung, bei der die Fähigkeit einer Blutprobe, das Wachstum von Bakterien zu inhibieren, abgeschätzt wird. Dieses Verfahren ist
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langsam, ungenau und erlaubt lediglich einen sehr niedrigen Probendurchsatz. Es ist fast sicher, daß diese Schwierigkeiten zur Zeit die klinische Anwendung von Gentamycin einschränken.
In neuerer Zeit wurden radioimmunologische Bestimmungsmethoden (Radioimmunoassays) für Gentamycin entwickelt und "beschrieben, diese sind schneller und besitzen eine größere Genauigkeit als die biologischen Bestimmungsverfahren sowie den zusätzlichen Vorteil der Immunspezifizität. Nachteilig an den Radioimmunoassays sind zunächst die üblichen Gefahren von Strahlungsunfällen, die beschränkte Lebensdauer der Markierung und das Erfordernis von Radioaktivitätszählungseinrichtungen. Außerdem ist eine besondere Abtrennungsstufe zur Isolierung der freien oder an Antikörper gebundenen markierten Fraktion zur quantitativen Bestimmung erforderlich. Drittens ist es schwierig, Gentamycin radioaktiv zu markieren. Mit Tritium markiertes Gentamycin, das im Handel erhältlich ist, ist bekanntermaßen unsauber, und die Anwendung der Markierung mit Tritium erfordert eine aufwendige Flüssigkeitsszintillationszählmethode. Die Vorteile der Markierung mit Radiojod (beispielsweise einfache quantitative Bestimmung durch Gammastrahlungsmessung) können nur erzielt werden, wenn man entweder zunächst das Gentamycin an einen geeigneten Träger koppelt und anschließend den Träger mit Radiojod markiert oder indem man Gentamycin an einen vorher mit Jod markierten Träger koppelt oder mit ihm umsetzt. Dieses sind verwickelte Verfahren, die sich oft nur schlecht reproduzieren lassen.
Es wurde nun ein immunologisches Verfahren zur Bestimmung von Gentamycin und anderen ähnlichen Aminoglycosidantibiotika gefunden, das die Verwendung radioaktiver Materialien vermeidet und gegenüber den oben erwähnten biologischen Bestimmungsmethoden eine Reihe von Vorteilen aufweist. Insbesondere wurde gefunden, daß, wenn man die
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AminoglycosidantiMotika mit einer fluoreszierenden Gruppe, wie beispielsweise der Fluoreseeingruppe, markiert, die Fluoreszenz des markierenden Bestandteils verringert wird, wenn das Antibiotikum mit einem bestimmten Antikörper behandelt wird. Folglich ist es möglich, den Antibiotikagehalt biologischer Flüssigkeitsproben zuverlässig und wirksam durch Bestimmung der Fluoreszenz festzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Gentamycin oder einem ähnlichen Aminoglycosidantibiotikum in einer biologischen Flüssigkeitsprobe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Gemisch aus der Probe, einer fluoreszenzmarkierten Verbindung und einem Antikörper gegenüber dem zu untersuchenden Antibiotikum und der fluoreszenzmarkierten Verbindung bildet, und die Fluoreszenz des so erhaltenen Gemisches mißt und dadurch die Menge an in der Probe enthaltenem Aminoglycosidantibiotikum bestimmt.
Unter fluoreszenzmarkierter Verbindung ist eine Verbindung zu verstehen, die eine fluoreszierende Gruppe enthält, deren Fluoreszenz verringert wird, wenn die Verbindung sich mit dem Antikörper verbindet. Als Antikörper kann beispielsweise ein Antiserum oder ein Immunoglobulin aus dem Antiserum verwendet werden. Auf diese Weise ist die Fluoreszenz des Gemisches geringer als die Fluoreszenz der markierten Verbindung, und zwar um den Betrag, der von der Menge des in der ursprünglichen Probe vorhandenen Aminoglycosidantibiotikums abhängt. Durch Messung der Fluoreszenz des Gemisches und Vergleichen mit beispielsweise einer Standardkurve kann, wie im einzelnen weiter unten beschrieben wird, die Menge an Aminoglycosidantibiotikum bestimmt werden.
Die fluoreszenzmarkierte Verbindung muß in der Lage sein, mit dem bei dem Verfahren verwendeten Antikörper einen Komplex zu bilden, und der Antikörper muß in der Lage sein,
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einen Komplex mit dem Gentamycin oder der anderen zu untersuchenden antibiotischen Verbindung zu bilden. Daraus folgt, daß die markierte Verbindung, abgesehen von dem markierten Anteil, die gleiche Struktur besitzen muß wie das Gentamycin oder das andere zu untersuchende Antibiotikum oder eine sehr ähnliche Struktur aufweisen muß, weil es sich sonst mit dem Antikörper nicht verbinden würde. Somit muß die bei dem Verfahren zur Bestimmung des Antibiotikums A verwendete markierte Verbindung entweder A selbst mit einer Fluoreszenzmarkierung sein oder eine A sehr ähnliche Verbindung sein, die ebenfalls eine Fluoreszenzmarkierung trägt.
Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kommt es nicht darauf an, einen Antikörper zu verwenden, der durch Verwendung des zu untersuchenden Antibiotikums oder ggf. der nahe verwandten Verbindung, die die Fluoreszenzmarkierung tragen soll, erzeugt worden ist. Der Antikörper kann statt dessen unter Verwendung eines anderen Materials erzeugt worden sein, jedoch ist dieses notwendigerweise in seiner Struktur dem zu untersuchenden Antibiotikum und der Markierungsverbindung sehr ähnlich, da sich sonst der Antikörper nicht mit diesen beiden Materialien verbinden würde.
Einige der Aminoglycosidantibiotika sind chemisch eng miteinander verwandt, und es wurde gefunden, daß beispielsweise Antigentamycinantiserum von Kaninchen sich nicht nur mit Gentamycin, sondern auch mit Sisosiycin und Schering 20569 verbindet. Kreuzreaktionen dieser Art erschweren es, eine Probe zu bestimmen, die zwei oder mehrere derartiger Antibiotika enthält, jedoch werden in der Praxis derartige Bestimmungen nur selten erforderlich. Normalerweise enthält die biologische Flüssigkeitsprobe lediglich ein einziges Aminoglycosidantibiotikum, und in diesen Fällen ist die Möglichkeit von Kreuzreaktionen von Vorteil. So ist beispielsweise zur Bestimmung von Gentamycin, Sisomycin
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oder Schering 20569 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lediglich ein Antiserum erforderlich, wie beispielsweise das Antigentamycinantiserum von Kaninchen. Dies bedeutet nicht nur, daß in einem klinischen Laboratorium die Vorratshaltung verringert werden kann, sondern auch, daß Antibiotika oder andere Medikamente bestimmt werden können, für die es schwierig ist, spezifische Antiseren herzustellen.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, die markierte Verbindung der zu untersuchenden Probe zuzusetzen und anschließend das Gemisch mit dem Antikörper zu versetzen. Alternativ kann der Antikörper auch zuerst mit der Probe vermischt und dem Gemisch danach die markierte Verbindung zugesetzt werden.
Die Bestimmung von Aminoglycosidantibiotika in der Probe kann nach der Messung der Fluoreszenz zweckmäßigerweise unter Verwendung einer Standardkurve durchgeführt werden. Eine Standardkurve für ein beliebiges System, d.h. ein aus Antibiotikum und fluoreszenzmarkiertem Antibiotikum oder aus einer anderen Verbindung und Antiserum bestehendes System kann beispielsweise wie folgt erhalten werden. Lösungen mit bekannter Konzentration an dem zu bestimmenden Antibiotikum werden im zusammengefaßtem normalem Serum (pooled normal serum) oder einem geeigneten Puffer hergestellt. Jede dieser Lösungen wird mit einer konstanten bekannten Menge eines fluoreszenzmarkierten Antibiotikums oder einer fluoreszenzmarkierten anderen Verbindung sowie mit so 'iel Antiserum versetzt, daß eine Lösung mit einer vorherbestimmten Verdünnung des Antiserums hergestellt wird. Die Fluoreszenzintensitäten der Lösungen werden danach gemessen und eine Standard- oder Normalkurve der Fluoreszenzintensität gegen die Konzentration an nicht markiertem Antibiotikum aufgetragen.
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— Q _
Eine derartige Kurve kann anschließend bei dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise wie folgt verwendet werden. Ein bekanntes Volumen der biologischen Flüssigkeitsprobe, die das zu bestimmende Antibiotikum enthält und die einen Puffer enthalten kann, wird mit einer konstanten, bekannten Menge des fluoreszenzmarkierten Antibiotikums oder der anderen fluoreszenzmarkierten Verbindung, die zur Herstellung der Standardkurve verwendet wurde, versetzt. Danach wird so viel Antiserum zugesetzt, bis die Verdünnung des Antiserums erreicht ist, die bei der Bestimmung der Standardkurve angewandt wurde. Die Fluoreszenzintensität des erhaltenen Gemisches wird gemessen und mit Hilfe der Standardkurve die Menge an Antibiotikum in der biologischen Flüssigkeitsprobe bestimmt.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung von Gentamycin, kann jedoch auch zur Bestimmung anderer Aminoglycosidantibiotika verwendet werden, wie beispielsweise von Streptomycin, Tobramycin, Neomycin, Kanamycin, Amikacin und dem erst kürzlich entdeckten Sisomycin und Schering 20569. Die Formeln für Sisomycin und Schering 20569 sind:
J OH NH.CH-
Sisomvcin
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- ίο -
NH2 H2N
Schering 20569
Bei der Bestimmung von Gentamycin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird als bevorzugte Fluoreszenzmarkierung Fluorescein verwendet, das an das Gentamycin beispielsweise dadurch gebunden werden kann, daß man Gentamycin mit Fluoresceinisothiocyanat zu Fluoresceinthiocarbamylgentamycin (im folgenden FTC-G genannt) umsetzt. Es können auch andere fluoreszierende Gruppen verwendet werden, wie beispielsweise die Dansyl-, Rhodamin-Fluorescamin-, Pyren- und 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanon-Gruppe. Die Eignung einer bestimmten fluoreszierenden Gruppe für ein bestimmtes System aus Antibiotikum und Antiserum kann leicht mit routinemäßigen Versuchen und Proben bestimmt werden. Die fluoreszierende Gruppe muß mit dem System als Ganzem verträglich sein, so daß sie einen verläßlichen und reproduzierbaren Fluoreszenzlöscheffekt zeigt, wenn sich der Komplex aus markiertem Antibiotikum und Antiserum gebildet hat.
In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuv/eisen, daß die Fluoreszenzlöschung nicht nur von der im einzelnen als Markierung verwendeten fluoreszierenden Gruppe, sondern auch von der Art des Antibiotikums und des Antiserums abhängt. Das Antiserum muß auch im Hinblick auf seine Eignung im Gesamtsystem ausgewählt werden. Auch hier führen routinemäßige Proben und Untersuchungen zum Auffinden des geeigneten
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Antiserums in einem bestimmten System aus Antibiotikum und fluoreszenzmarkierten Antibiotikum. Es wurde gefunden, daß bei Markierung von Gentamycin mit Fluorescein sich Kaninchenantisera eignen, die dadurch hergestellt worden sind, daß man Gentamycin, das mit Hilfe der Carbodiimidmethode an Rinderserumalbumin gekoppelt war, injizierte.
In dem besonderen Falle von Gentamycin/FTC-G/Kaninchenantiserum wird angenommen, daß die Fluoreszenzlöschung durch die Wechselwirkung zwischen der Fluoreszenzmarkierung und Gruppen des Antikörpermoleküls erfolgt.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt auch die sog. kompetitive Bindungstechnik, bei der zwischen dem markierten und unmarkierten Antigen (Antibiotikum) im Hinblick auf ihre Vereinigung mit einer beschränkten Menge Antikörper (Antiserum) Wettbewerb herrscht. Immunologische Bestimmungen mit kompetitiver Bindung sind bekannt und erfodern normalerweise die Abtrennung des gebundenen Komplexes aus Antikörper und Antigen von freiem Antigen. Diese Abtrennungsstufe, die beispielsweise bei dem Radiοimmunoassay notwendig ist, ist praktisch sehr unbequem. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung ist jedoch ein derartiger Abtrennungsschritt nicht erforderlich, was das erfindungsgemäße Verfahren in idealer Weise für Analysen mit kontinuierlichem Durchflußbetrieb geeignet macht. Dementsprechend umfaßt die Erfindung auch die Durchführung des Verfahrens in einem kontinuierlichen Durchflußbetrieb sowie die Vorrichtung hierfür.
Bei der kontinuierlichen Durchflußanalyse gemäß der Erfindung wird das Gemisch aus Probe, Antikörper und fluoreszenzmarkierter Verbindung in einer Leitung geführt und die Fluoreszenz gemessen. Gemäß einer bevorzugten Durchführungsform nach der US-PS 2 797 149 werden einzelne Gemischabschnitte, die durch Abschnitte eines inerten Fluids, wie beispielsweise von Luft, sowie gewünschtenfalls von einem
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Waschflüssigkeitsabschnitt getrennt sind, in der Leitung entlanggeführt. Das Gemisch kann in der Leitung selbst gebildet werden, indem in die Leitung phasengleich mit den bereits in der Leitung vorhandenen Abschnitten von Komponentengemischen eine oder mehrere weitere Komponenten zugeführt werden, wobei das Vermischen der Komponenten in der Leitung erfolgt, während das Gemisch hindurchfließt.
Von besonderem Vorteil ist es, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Analysen der in Rede stehenden Arzneimittel nach der geschilderten kontinuierlichen Durchflußmethode verhältnismäßig einfach durchgeführt werden können, wobei dies im wesentlichen ein Ergebnis der Tatsache ist, daß keine Abtrennungsstufe erforderlich ist. Auf diese Weise kann das in der Leitung fließende Gemisch zur direkten Messung unmittelbar einer Fluoreszenzzelle zu- oder durch sie hindurchgeführt werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es somit möglich, das zu untersuchende Arzneimittel im kontinuierlichen Fließbetrieb zu analysieren, was bisher unmöglich oder äußerst schwierig durchführbar gewesen ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt u.a. die weiteren folgenden Vorteile:
1. FTC-G läßt sich in ausgezeichneter Ausbeute aus leicht zugänglichen und wohlfeilen Ausgangsprodukten leicht herstellen.
2. FTC-G besitzt eine gute Haltbarkeit.
3. Wed^r müssen Strahlungsunfälle befürchtet werden, noch sind Radioaktivitätszählungseinrichtungen erforderlich.
4. Bei dem Verfahren ist ein Abtrennungsschritt nicht erforderlich.
5. Die Messung erfolgt durch herkömmliche Fluorimetrie.
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6. Wegen der Punkte 4. und 5. kann das Verfahren leicht automatisiert werden.
7. Die Bestimmung erfolgt sehr rasch. Lediglich wenige Minuten sind erforderlich, um zwischen Antikörper, FTC-G lind Gentamycin ein immunologisches Gleichgewicht zu erzielen, wonach das Ergebnis mit einer einzigen Fluoreszenzmessung erzielt wird.
8. Unter Berücksichtigung der oben erwähnten Kreuzreaktionen kann die Bestimmung für das bestimmte Antibiotikum als immunospezifisch angesehen werden.
9. Die Menge der erforderlichen Serumprobe ist sehr gering. 5/Ul oder weniger genügen für eine bestimmte Analyse.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1. Herstellung von fluoresceinmarkiertem Gentamycin (FTC-G)
Ein mmol Gentamycin und 1,25 mmol Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wurden 2 h bei Raumtemperatur in einem 0,05 molaren Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer vom pH 9,0 reagieren gelassen. 2 ml des Umsetzungsgemisches wurden auf eine G-15 Sephadexsäule (1 χ 97 cm) gegeben und mit dem oben erwähnten Carbonat/Bicarbonat-Puffer unter einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,8 ml/h eluiert. Säulenfraktionen (1,8 ml) wurden durch Radioimmunoassay auf Gentamycin und durch Fluoriemetrie auf Fluorescein analysiert. Fig. 1 der Zeichnungen stellt das Ergebnis dar. Nicht umgesetztes Gentamycin verließ die Säule zuerst. Danach erschien das gebildete FTC-G, gut von dem Gentamycinpeak getrennt. Nicht umgesetztes FITC wurde sehr fest auf der G-15 Säule gehalten und nicht eluiert.
Das gebildete FTC-G wurde in Lösung entweder gefroren oder bei 4 0C aufbewahrt. Elektrophoretische Charakterisierung ergab die Anwesenheit einer Hauptbande (wahrscheinlich
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mono-FTC-markiertes Gentaiaycin) und zwei kleinere Banden (Wahrscheinlich poly-FTC-markiertes Gentamycin).
Die unten angegebenen FTC-G-Konzentrationen sind auf"den Gentamycingehalt bezogen, wie er durch Radioimmunoassay festgestellt worden ist.
Beispiel 2. Herstellung von Antigentamycinsera
Kaninchen wurden mit Gentamycin immunisiert, das mit Hilfe der Carbodiimidmethode an Rinderserumalbumin gekoppelt war.
Beispiel 3. Immunologische Bestimmung von Gentamycin durch Fluoreszenzlöschung.
(i) Antikörperverdünnungskurve. Um zu optimalen Bestimmungsbedingungen zu gelangen, wurden 0,5 ml Mengen einer FTC-G-Lösung in 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 von einer Konzentration von 16,4 ng/ml einem Anti serum in demselben Puffer bis zu sich verdoppelnden Verdünnungen (1 ml) zugesetzt. Nachdem man einige Minuten zur Bildung des Gleichgewichts stehengelassen hatte, wurde die Fluoreszenzintensität gemessen (siehe Fig. 2 der Zeichnungen). Aus dieser Kurve wurde eine Endverdünnung an Antikörper von 1 /240 in 1,5 ml zur Herstellung der Standardkurve ausgewählt.
(II) Standardkurve. Gentamycin wurde in bekannten Mengen vermischtem (pooled) normalem menschlichem Serum zugesetzt. Aliquote Teile dieser Standardproben wurden auf 1/50 in 0,1 molarer Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7,5 verdünnt. 0,5 ml der verdünnten Standardproben wurden mit 0,5 ml einer Lösung von FTC-G in demselben Puffer mit einer Konzentration von 16,4 ng/ml und anschließend mit 0,5 ml eines in derselben Pufferlösung auf 1/80 verdünnten Antiserumlösung versetzt. Nachdem man einige Minuten zur Aus-
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bildung des Gleichgewichtes stehengelassen hatte, wurde die Fluoreszenzintensität der Bestimmungsgemische gemessen. Das Verhältnis von der Eigenfluoreszenz des vermischten normalen menschlichen Serums zur Gesamtfluoreszenzintensität der Bestimmungsgemische wurde unabhängig voneinander bestimmt, indem man 1 ml Phosphatpuffer zu 0,5 ml der verdünnten Standardproben hinzugab und die Fluoreszenz maß. Durch Subtraktion der Eigenfluoreszenzintensität des Serums von der Gesamtintensität der BeStimmungsgemische wurde die in Fig. 3 gezeigte Standardkurve ermittelt.
Beispiel 4. Bestimmung von Gentamycln in Proben aus Patientenserum
Serumproben von Patienten, die mit Gentamycin behandelt wurden, wurden nach dem Verfahren gemäß Beispiel 3, Abschnitt II bestimmt. Der Anteil der Eigenfluoreszenz jeder Serumprobe, die unabhängig festgestellt worden war, wurde von der Gesamtfluoreszenzintensität der entsprechenden Bestimmungsgemische subtrahiert und das erhaltene Ergebnis zur Bestimmung der Gentamycinmenge in der Serumprobe mit Hilfe einer geeigneten Standardkurve verwendet.
Fig. 4 zeigt die Korrelation zwischen Gentamycinspiegeln, die durch Fluoreszenzlöschungsimmunoassay bestimmt worden waren und solchen Spiegeln, die mit Hilfe eines üblichen biologischen Bestimmungsverfahrens von einem unabhängigen Laboratorium ermittelt worden waren. Die errechnete am besten passende Kurve ist dargestellt. Berücksichtigt man die bekanntermaßen auftretenden Ungenauigkeiten bei der biologischen Bestimmungstechnik, so zeigt die Kurve eine annehmbare Übereinstimmung beider Methoden, die für klinische Zwecke ausreichend ist.
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Beispiel 5. Kontinuierliches'Durchflußsystem zur automatischen GentamycinbeStimmung
In Fig. 5 ist eine Form eines Durchflußsystems dargestellt, das sich zur kontinuierlichen Durchflußanalyse eignet. Das System umfaßt eine Probeneinlaßleitung 1, eine Einlaßleitung 2 für FTC-G, eine Lufteinlaßleitung 3 und eine Einlaßleitung 4 für das Antiserum. Leitungen 2 und 3 treffen sich beim Abschnittsbilder 6, der mit der Abzweigung 7 verbunden ist, wo Leitungen 1 und 2 zusammentreffen. Stromabwärts von der Verbindungsstelle 7 ist Leitung 2 mit einer Mischschlange 8 versehen und führt weiter zur Verbindungsstelle 9, wo Leitung 4 einmündet. Stromabwärts von Verbindungsstelle 9 ist eine weitere Mischschlange 10 vorgesehen und schließlich ein Fluorimeter 11, das einen Abfallauslaß 12 sowie einen Auslaß 13 stromabwärts der Fluoreszenzzelle aufweist, der mit Leitung 5 verbunden ist und danach in's Freie führt. Das Fluorimeter 11 ist an das Aufzeichnungsgerät 14 angeschlossen.
Im Betrieb wird Leitung 2 mit einer gesteuerten Menge FTC-G beschickt und im Abschnittsbildner 6 durch Luft in Abschnitte aufgeteilt. Die zu bestimmende Probe (beispielsweise Serum), wird in der nötigen Verdünnung an der Einmündungsstelle 7 in den segmentierten Strom eingeführt, das Ganze in der Mischschlange 8 vermischt, wonach eine gesteuerte Menge Antiserum an der Einmündungsstelle 9 zugesetzt und das Ganze in der Mischschlange 10 vermischt wird, bevor es in das Fluorimeter 11 gelangt.
Beispiel 6. Automatisierte Gentamycinbestimmung; Standardkurve
Gentamycin wurde in bekannten Mengen vermischtem (pooled) normalem menschlichem Serum zugesetzt. Aliquote Teile dieser Standardproben wurden in 0,1 molarem Tris/HCl-Puffer vom pH 7,5 und einem Gehalt von 10 mmol Magnesium-
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Chlorid (Tris/MgCl^Puffer) auf 1 zu 100 verdünnt. Unter Verwendung des Strömungssystems gemäß Fig. 5 wurde auf folgende Weise eine Standardkurve hergestellt.
Die Standardproben wurden durch Eingangsleitung 1 in einer Geschwindigkeit von 0,16 ml/min gepumpt. Jede Probe wurde 1 min lang gepumpt, danach wurde wiederum 1 min Tris/ MgClp-Puffer als Waschflüssigkeit gepumpt, bevor die nächste Probe eingeführt wurde. Danach wurde durch Einlaßleitung 2 in einer Geschwindigkeit von 0,16 ml/min FTC-G in einer Konzentration von 8,2 ng/ml in Tris/MgClg-Puffer mit einem Gehalt von 0,1 Vol.-% des Detergents Triton X-100 gepumpt, während auf 1 zu 160 verdünntes Antiserum in Tris/MgCIp-Puffer mit einem Gehalt von 0,1 Vol.-% an dem Detergents Triton X-100 mit einer Geschwindigkeit von 0,16 ml/min durch Einlaßleitung 6 gepumpt wurde. Die vermischten Ströme wurden mit einer Geschwindigkeit von 0,42 ml/min (Leitung 5) durch die Fluorimeterfließzelle geführt. Die Gesamtfluoreszenzintensität der vermischten Ströme wurde auf dem Registrierstreifenanzeigegerät aufgezeichnet. Die Intensität, die während der Waschperioden registriert wurde (entsprechend der maximalen Bindung von FTC-G an das An-t±serum in Abwesenheit der Probe) wurde von der während des Durchtrittes jedes Bestimmungsgemisches durch die Fluorimeterfließzelle aufgezeichneten Intensität subtrahiert. Auf diese Weise wurde der Nettoanstieg an Fluoreszenzintensität, der auf Jede Probe zurückzuführen war, gemsssen. Nachdem die Standardproben das System passiert hatten, wurde die durch Leitungen 2 und 4 gepumpte Lösung durch Tris/MgClp-Puffer mit einem Gehalt an 0,1 Vol.-56 des Detergents Triton X-100 ersetzt. Danach wurden die Standardproben erneut durch das System geführt. Dabei wurde die Eigenfluoreszenzintensität der Standardserumproben gemessen. Durch Subtraktion der Eigenfluoreszenzintensität des Serums von der Zunahme der Nettofluoreszenzintensität, die für Jedes Bestimmungsgemisch gemessen wurde, wurde die in Fig. 6 dargestellte Standardkurve ermittelt.
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— Ί Ο —
Beispiel 7. Automatisierte Bestimmung von Gentamycin in Patientenserumproben
Serumproben von Patienten, die mit Gentamycin behandelt wurden, wurden gemäß der in Beispiel 6 beschriebenen Methode analysiert. Der Anteil der Eigenfluoreszenz jeder Serumprobe, unabhängig voneinander gemessen, wurde von der Zunahme der Nettofluoreszenzintensität, die für das entsprechende Bestimmungsgemisch ermittelt worden war, abgezogen, und das Ergebnis wurde zur Bestimmung der Gentamyeinmenge in der Serumprobe mit Hilfe einer geeigneten Standardkurve verwendet.
Fig. 7 zeigt die Korrelation zwischen den Gentamycinwerten, die durch automatisierten Fluoreszenzlöschimmunoassay bestimmt worden waren, und Werten, die von einem unabhängigen Laboratorium unter Verwendung üblicher biologischer Bestimmungsmethoden ermittelt worden waren. Die berechnete Linie der besten Zuordnung ist dargestellt. Berücksichtigt man die bekanntermaßen den biologischen Methoden anhaftende Ungenauigkeit, ist die Übereinstimmung zwischen beiden Methoden annehmbar und für klinische Zwecke zufriedenstellend.
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Claims (9)

  1. Patentansprüche
    1J Verfahren zur Bestimmung eines Aminoglycosidanti-Miiotikumc in einer biologischen Flüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus der Probe, einer fluoreszenzmarkierten Verbindung und einem Antikörper gegenüber dem zu bestimmenden Antibiotikum und der fluoreszenzmarkierten Verbindung bildet und die Fluoreszenz dieses Gemisches mißt und dadurch die Menge an in der Probe vorhandenem Aminoglycosidantibiotikum bestimmt.
  2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antibiotikum Gentamycin verwendet.
  3. 3» Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoreszenzmarkierte Verbindung fluoresceinmarkiertes Gentamycin verwendet.
  4. 4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluoresceinmarkiertes Gentamycin Fluoresceinthiocarbamylgentamycin verwendet.
  5. 5. Verfahren gemäß Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antikörper Antigentamycinantiserum des Kaninchens verwendet.
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    ORIGINAL INSPECTED
  6. 6. Verfahren zur Bestimmung eines der Antibiotika Gentamycin, Sisomycin, Schering 20569, Streptomycin, Tobramycin, Neomycin, Kanamycin und Amikacin in einer biologischen Flüssigkeitsprobe,
    dadurch gek ennzeichnet, daß man ein Gemisch aus der Probe, einer fluoreszenzmarkierten Verbindung, die eine Verbindung ist, die eine fluores-. zierende Gruppe trägt, deren Fluoreszenz reduziert wird, wenn die Verbindung sich mit dem Antikörper verbindet, und einem Antikörper gegenüber dem Antibiotikum und der fluoreszenzmarkierten Verbindung herstellt, die Fluoreszenz des Gemisches mißt, die gemessene Fluoreszenz mit Standardwerten vergleicht und damit die Menge an dem in der Probe vorhande nen Antibiotikum bestimmt.
  7. 7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip durchführt.
  8. 8. Verfahren gemäß Anspruch 7,
    dadurch gekennzeichnet, daß man Abschnitte des Gemisches, die durch Abschnitte eines inerten Fluids voneinander getrennt sind, in einer Leitung entlangströmen läßt und die Fluoreszenz'der Gemischabschnitte ohne Abtrennung eines Reaktionsproduktes von dem Gemisch mißt.
  9. 9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 7 oder 8, enthaltend eine Leitung, Mittel zum
    Hindurchströmenlassen des Gemisches durch die Leitung, eine Meßeinrichtung zur Messung der Fluoreszenz des Gemisches und eine Einrichtung zum Vergleichen der Fluoreszenz mit Standardwerten zur Bestimmung der Menge an Aminoglycosidantibiotikum in der Probe.
    709843/0905
DE19772716276 1976-04-15 1977-04-13 Verfahren und vorrichtung zur immunologischen bestimmung von gentamycin Granted DE2716276A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB15736/76A GB1573212A (en) 1976-04-15 1976-04-15 Immunoassay for gentamicin

Publications (2)

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