DE2624002A1 - Vrfahren zur verwendung eines enzyms zur umwandlung einer organischen substanz in mindestens eine andere organische substanz durch enzymatische reaktion - Google Patents

Vrfahren zur verwendung eines enzyms zur umwandlung einer organischen substanz in mindestens eine andere organische substanz durch enzymatische reaktion

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BERLIN-DAHLEM 33 · PODBIELSKIALLEE 68 8 MÜNCHEN 22 . WIDENMAYERSTRASSE 49
BATTELLE MEMORIAL INSTITUTE BERLIN: DlF"-ING· R-mOller-börner
MÜNCHEN: DIPL.-ING. HANS-H. WEY
Berlin- den 26. Mai 1976 25 951
Verfahren zur Verwendung eines Enzyms zur Umwandlung einer organischen Substanz in mindestens eine andere organische Substanz durch enzymatische Reaktion
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfcihren zur Verwendung eines Enzyms zur Umwandlung einer organischen Substanz in mindestens eine andere organische Substanz durch enzymatische Reaktion, nach welchem man das Enzym durch kovalente Bindungen auf einem organischen, in wässrigem Milieu leslichen Polymer befestigt, so daß ein aktiver, in wässrigem Milieu löslicher enzymatischer Komplex gebildet wird, und nach welchem man diesen Komplex in aufgelöstem Zustand in einer wässrigen Lösung der umzuwandelnden Substanz während eines Zeitraums und bei einer Temperatur aufrechterhält, die ausreichen, um den gewünschten Umwandlungsgrad dieser Substanz zu erreichen.
Die Verwendung von Enzymen zur Umwandlung einer organischen Substanz in mindestens eine andere organische Substanz ist in der Industrie, insbesondere in der Nahrungsmittelindustrie bekannt.
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Die bekannten Verfahren der Verwendung eines Enzyms, um eine enzymatische Reaktion hervorzurufen, bestehen darin, das Enzym in aufgelöstem Zustand in ein im allgemeinen flüssiges Reaktionsmilieu einzuführen, das die Substanz (genannt "Substrat"), die man umwandeln will, umschließt, und dieses Reaktionsmilieu auf einer Temperatur und während eines Zeitraums zu halten, die ausreichen, urn den für diese Substanz gewünschten Grad der Umwandlung zu erreichen.
Bei der Anwendung dieser Verfahren ist es nicht möglich, am Ende der Reaktion den etwaigen nicht verbrauchten Überschuß an Enzymen zurück zu gewinnen. Daher zerstört man gewöhnlich die Restmenge an Enzymen an Ort und Stelle, um das Vorhandensein von Enzymen in Mischung mit den Reaktionsprodukt zu vermeiden.
Da Enzyme im allgemeinen teuer sind, kann man praktisch aus wirtschaftlichen Gründen nur geringe Mengen verwenden, was eine schwache enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit zur Folge hat, die in der Mehrzahl der Fälle nicht ausreicht, um Enzyme auf industrieller Basis zu verwenden. Nur im Fall von Enzymen, die relativ preiswert sind, wie Proteasen und Anblasen, kann eine Anwendung dieser Verfahren auf industrieller Basis in Betracht gezogen werden.
Nach neueren Verfahren verwendet man "stillgelegte" Enzyme, d.h. durch kovalente Bindungen auf einem geeigneten organischen Polymer befestigte Enzyme, wodurch ein aktiver enzymatischer Komplex erhalten wird.
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Diese letzteren Verfahren erlauben es, den möglichen Enzymüberschuß nach der enzyinati sehe η Reaktion erneut brauchbar zu machen. Diese Verfahren machen daher die Verwendung einer größeren Menge Enzyme möglich, als theoretisch für die Umwandlung der der enzymatischen Reaktion unterworfenen Substanz erforderlich ist, wodurch eine Erhöhung der Geschwindigkeit dieser Reaktion und damit des stündlichen Ausbringens erreicht wird.
Einerseits hat die Befestigung eines Enzyms auf einem Polymer in Form eines aktiven enzymatischen Komplexes allgemein zur Folge, daß die Stabilität des Enzyms verstärkt wird, und sie erlaubt andererseits in bestimmten Fällen, den für das Reaktionsmilieu nützlichen pH-Bereich zu erhöhen und die Steuerung des Ablaufs der enzymatischen Reaktion zu erleichtern.
Schließlich ermöglicht die Verwendung eines Enzyms in "stillgelegtem" Zustand in Form aktiven enzymatischen Komplexes, das man das von Enzymen freie Produkt unmittelbar aus der enzymatischen Reaktion erhält.
Man kann die Befestigung des Enzyms entweder auf einem in Wasser nicht löslichen Polymer vornehmen, so daß ein aktiver enzymatischer Komplex in festem, in wässrigem Milieu nicht löslichen Zustand gebildet wird, oder auf einem in Wasser löslichen Polymer, so daß ein aktiver, in wässrigem Milieu löslicher enzymatischer Komplex gebildet wird.
Im ersten Fall kann man den aktiven, nicht löslichen enzymatischen Komplex in Form von Pulverpartikeln in einer Säule verwenden, die den Chromatographiesäulen in Feststoff-
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phase entspricht, durch die hindurch man das Reaktionsmilieu laufen läßt, oder auch in Aufschlämmung in einem Behälter, der das Reaktionsmilieu enthält.
Dank der Tatsache, daß der aktive enzymatische Komplex sich in dem Reaktionsmilieu in festem Zustand befindet, kann man leicht und auf wenig kostspielige Weise die Trennung dieses Komplexes aus dem Reaktionsmilieu sowie seine Rückgewinnung am Ende der enzymatischen Reaktion erreichen.
Auf jeden Fall hat dieses Verfahren in dem Fall, wo eine Säule "/erwendet wird, den Nachteil, daß ein Zustopfen der Säule
riskiert wird oder daß ein "channeling" genanntes Phänomen (Abfließen des Reaktionsmilieus in Form von flüssigen Adern, die allein auf den Abschnitt der Säule beschränkt sind) erzeugt wird.
In dem Fall, wo man die enzymatische Reaktion in einem Behälter durchführt, hat die Verwendung eines festen, aktiven enzymatischen Komplexes den Nachteil, daß nur eine schwache Kontaktwirkung zwischen den Teilchen dieses Komplexes und der Substanz besteht, die man umwandeln will, und zwar als Folge 5er Schwierigkeit oder der Unmöglichkeit, daß dieses Milieu in das Innere dieser Teilchen eindringt.
Die Verwendung eines aktiven enzymatischen Komplexes in dem Reaktionsmilieu in aufgelöstem Zustand erlaubt es, die
enzymatische Reaktion in homogenem Flüssigmilieu durchzuführen, was die Wirksamkeit des Kontaktes zwischen dem enzymatischen Komplex und der umzuwandelnden Substanz verbessert und damit den Ertrag der Reaktion erhöht.
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Außerdem ist die Wirkung im allgemeinen größer, wenn das Enzym auf einem in wässrigem Milieu löslichen organischenPclyoie: befestigt wird, als wenn das gleiche Enzym auf einem unlöslichen organischen Polymer befestigt wird. Die Verwendung eines in wässrigem Milieu löslichen Polymers zur Befestigung des Enzyms erlaubt es also, einen enzymatischen Komplex zu erhalten, dessen spezifische Aktivität, ausgedrückt in Enzymeinheiten pro Masseeinheit des Komplexes, im allgemeinen höher liegt als die der enzymatischen Komplexe, die durch Befestigen des Enzyms auf einem unlöslichen Polymer erhalten werden.
(Eine Enzymeinheit ist definiert als die Enzymmenge, die die volle Umwandlung eines Mikromol an "Substrat" pro Minute unter optimalen Reaktionsbedingungen auslösen kann).
Andererseits liegt bei gegebenen Versuchsbedingungen die Aktivität eines Enzyms gegenüber einem "Substrat" mit erhöhter Molekularmasse allgemein in dem Fall höher, wo dieses Enzym auf einem in dem Reaktionsmilieu löslichen Polymer befestigt ist, als in einem Fall, wo dieses Enzym auf einem unlöslichen Polymer befestigt ist.
Die Verwendung eines aktiven enzymatischen Komplexes in Lösung in dem Reaktionsmilieu bietet auch gegenüber derjenigen eines unlöslichen festen, aktiven enzymatischen Komplexes den Vorteil, daß eine Ausbreitung von Mikroorganismen vermieden wird, die häufig im Fall fester enzymatischer Komplexe auftritt. Zu diesem Zweck genügt es, eine Filtrierung der Lösung aus dem löslichen enzymatischen Komplex vorzunehmen und zwar durch einen Mikrofilter hindurch, z.B. einen Filter mit Porengrößen in der Größenordnung von 0,2 Mikron so daß
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die Mikroorganismen zurückbehalten v/erden und eine sterile Lösung des aktiven enzymatischen Komplexes als Filtrat erhalten wird.
Die Verwendung bisher vorgeschlagener, aktiver enzymatischer Komplexe, die in wässrigem Milieu löslich sind, hat den Nachteil, daß ein Ultrafiltrationsvorgang des Reaktionsmilieus erforderlich ist, um das Reaktionsprodukt von dem enzymatischen Komplex zu trennen und letzteren für seine spätere Wiederverwendung zurück zu gewinnen. Eine solche Ultrafiltration erfordert die Verwendung eines teuren Materials und sie ist außerdem ein Grund für die Verringerung des Gesamtertrages des Verfahrens. Dieser Nachteil spricht also gegen die industrielle Verwertung aktiver, in wässrigem Milieu löslicher enzymatischer Komplexe.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Vorteile der Verwendung eines aktiven, unlöslichen enzymatischen Komplexes mit denen der Verwendung eines löslichen enzymatischen Komplexes zu verbinden, ohne die Nachteile zu haben.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird bei einem Verfahren zur Verwendung eines Enzyms zur Umwandlung einer organischen Substanz in mindestens eine andere organische Substanz durch enzymatische Reaktion der eingangs erwähnten Art erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß das organische Polymer unter denen ausgewählt wird, die einen in reversibler Weise ausfällbaren, aktiven enzymatischen Komplex bilden, unter Aufrechterhaltung seiner enzymatischen Aktivität nach Wiederauflösung und daß nach Erhalt des gewünschten Umwandlungsgrades der umzuwandelnden Substand der enzymatisch^ Komplex ausgefällt und von dem Reaktionsmilieu getrennt wird.
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In der vorliegenden Beschreibung bedeutet "in reversibler Weise ausfällbar", daß der enzymatische Komplex nach seiner Ausfällung wieder aufgelöst werden kann und daß er auch aus der derart erhaltenen Lösung erneut ausgefällt werden kann, wobei diese aufeinanderfolgenden Vorgänge des Ausfällens und der Wiederauflösung in unbestimmter Zahl wiederholt werden können, ohne Veränderungen der physikalischchemischen und enzymatischen Eigenschaften des Komplexes sowohl in aufgelöstem Zustand als auch in ausgefälltem Zustand zur Folge zu haben.
Es sei bemerkt, daß die Phänomene, die bei der Ausfällung und der Wiederauflösung des enzymatischen Komplexes ins Spiel gebracht werden können, nicht unbedingt "reversibel" im thermodynamxschen Sinn dieses Ausdrucks zu sein brauchen, d.h. daß sie thermische Austausche mit dem Außenmilieu nicht ausschließen.
Als in wasser lösliches organisches Polymer kann man z.B. ein Derivat der Polyacrylsäure, wie Polyacrylamid, verwenden oder auch ein Dextran, die Carboxymethylzellulose, das Polyäthyl-Glycol usw., wobei dieses Polymer chemische Gruppierungen aufweist, die ihm die Eigenschaft verleihen, in reversibler Weise in wässrigem Milieu Flocken auszufällen oder abzusondern aufgrund einer Veränderung mindestens eines physikalisch-chemischen Parameters dieses Milieus, wie seiner Temperatur, seines pH-Wertes, seiner Konzentration in Lösungszustand usw. oder auch aufgrund der Hinzufügung von Ionen in dieses Milieu, wie bivalenter oder trivalenter Metallionen, die in der- Lage sind, die Ausfällung des enzymatischen Komplexes hervorzurufen, verbunden mit der weiteren Verwendung von mindestens einem komplexbildenden Mittel dieser Ionen, um die Wiederauflösung des aktiven enzymatischen Komplexes hervorzurufen.
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Als organisches Polymer kann man insbesondere ein Derivat des Polyacrylamid mit Seitengruppen -COOH verwenden, die ihm die Eigenschaft verleihen, sich quantitativ und auf reversible Weise durch Senkung des pH-Wertes des Milieus unter einen Wert in der Größenordnung von 4,5 bis 5 bei Löslichkeit in dem gleichen Milieu mit einem höheren als diesem pH-Wert zu beschleunigen.
Im einzelnen kann man organische Polymere verwenden, die saure Seitengruppen des Benzoesäure- oder Isophtal-Typs umfassen. Derartige Polymere haben den Vorteil, bei einem pH-Wert unter 4,5 auf praktisch quantitative Weise ausfällbar zu sein, da das Verhältnis des nach der Ausfällung in Lösung verbleibenden Komplexes im Vergleich zur ursprünglichen Quantität im allgemeinen unter 1 ppm liegt.
Beispiel 1
A. Bereitung des aktiven enzymatischen Komplexes
Man läßt das AcryIsäurechlorid und die p-Aminobenzoesäure wie folgt reagieren:
CH = CH2 CH
C ==.0 + H„ f/ \\ COOH ^ C. 0
0OH
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Dann polymerisiert man das auf diese Weise erhaltene Monomer in wässrigem Milieu bei Stickstoffatmosphäre und in Gegenwart einer geringen Menge von N,N1 - Methylenbis-Acrylamid und Ammoniumpersulfat, wobei diese letztere Verbindung als Katalysator für die Polymerisation dient.
Man erhält auf diese Weise ein in Wasser lösliches Polymer, ein Derivat des Polyacrylamid, das aus linearen, miteinander verbundenen makromolekularen Ketten besteht, die die Folgeeinheit aufweisen:
CH
COOH
Man filtriert eine wässrige Lösung dieses Polymers durch Hindurchleiten durch einen Filter mit Poren von 0,22 Mikron, dann fällt man das Polymer durch Senkung des pH-Wertes auf 4,5 mittels einer wässrigen, mit Zitronensäure verdünnten Lösung in das Filtrat aus. Danach gewinnt und trocknet man den Niederschlag.
Man befestigt Glucose-Isomerase-Moleküle auf diesem Polymer, indem man wie folgt vorgeht:
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- Aufschlämmung des wie oben beschrieben erhaltenen Polymer-Niederschlags in Dioxan (im Verhältnis von 10 Millilitern Dioxan pro Gramm Niederschlag) und Hinzufügen von 1, 1 Millilitern N-Tributylamin auf lO Milliliter der Aufschlämmung?
- Abkühlung der Aufschlämmung auf 0° C und Zufügung von 0,4 Millilitern Äthyl-Chloroformat;
- Halten der Aufschlämmung bei 0° C während einer Dauer von Io Minuten, dann Hinzufügen von Io Millilitern der wässrigen Glucose-Isomerase-Lösung (20g pro Liter) auf 10 Milliliter Aufschlämmung;
- Halten der derart gebildeten Mischung während einer Dauer von 15 Minuten bei 0°C, dann Trockenverdampfen und Auflösen des derart erhaltenen Rückstandes in Wasser;
- Ausfällen des derart erhaltenen enzymatischen Komplexes durch Senkung des pH-Wertes mittels einer mit Zitronensäure verdünnten wässrigen Lösung auf 4,5;
- Waschen des Niederschlags mittels einer wässrigen Natriumchlorid-Lösung (0,IM), bis sich keine enzymatische Aktivität mehr in der Flüssigkeit zeigt, dann abschließendes Waschen mit destilliertem Wasser und Trocknen.
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- li -
Auf diese Weise erhält man einen in Wasser löslichen enzymatischen Komplex (mit über 4,5 liegendem pH-Wert), der eine enzymatische Aktivität entsprechend 1 500 enzymatischen Einheiten pro Gramm des Komplexes entwickelt (eine enzymatische Einheit wird definiert durch die Menge an in Mikromol ausgedrückter Fructose, die in 30 Minuten bei 50 C aus einer Glucoselösung von 0,66 M gebildet wird, wobei dieser enzymatische Komplex von Lösung umgeben ist).
B. Verwendung des enzymatischen Komplexes zur Umwandlung von Glucose in Fructose
Reaktionsmilieu : 250 Milliliter wässrige Lösung mit
12 Gew% Glucose.
Reaktionstemperatur : 50° C.
pH-Wert des Reaktionsmilieus während der enzymatischen Reaktion : 7,0.
Man führt zv/ei Versuche durch, den einen unter Verwendung von 0,13 g und den anderen unter Verwendung von Ig des aktiven enzymatischen Komplexes (wobei der Komplex vorher in etwas Wasser aufgelöst wurde).
Man erhöht die teilweise Umwandlung der Glucose in Fructose (51 Gew% Fructose, 49 Gew% Glucose) nach einer 40-stündigen Reaktionsdauer bei Verwendung von 0,18g des enzymatischen Komplexes und nach 9 Stunden bei Verwendung von Ig des enzymatischen Komplexes.
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Nach der Reaktion fällt man den enzymatischen Komplex durch Senkung des pH-Wertes des Reaktionsmxlieus mittels einer wässrigen Zitronensäurelösung auf 4,5; dann trennt man diesen Niederschlag vom Reaktionsmilieu, indem man ihn sich absetzen läßt.
Danach wäscht man diesen Niederschlag mittels einer wässrigen Zxtronensäurelösung mit einem pH-Wert von 4,5, löst ihn in Wasser, filtert die derart erhaltene Lösung durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 Mikron und fällt den enzymatischen Komplex durch Senkung des pH-Wertes auf 4,5 aus. Danach trocknet man ihn schließlich.
Der auf diese Weise erhaltene enzymatische Komplex in Pulverform kann wie oben ausgeführt auf gleiche Weise wieder verwendet werden, und zwar mit einer unveränderten enematischeη Aktivität.
Beispiel 2
Man geht vor wie in Beispiel 1, statt jedoch nach der Reakticr die Ausfällung des enzymatischen Komplexes durch Senkung des pH-Wertes des Reaktionsmilieus auf 4,5 zu bewirken, ruft man diese Ausfällung hervor, indem man diesem Milieu 2 Milliliter einer IM-Lösung von Calciumclorid CaCl,, mit einem pH-Wert von 7,0 hinzufügt, wobei der pH-Wert des Reaktionsmilieus auf dem Wert 7,O gehalten wird.
Auf diese Weise erhält man einen Niederschlag von 98% des aktiven enzymatischen Komplexes.
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Man trennt den derart aus dem Reaktionsmilieu erhaltenen Niederschlag durch Zentrifugieren, dann führt man ihn in einer v/ässrigen Lösung aus tetrasaurer Äthylendiaminsäure (Afchylendiainintetrasäure; Bekanntes komplexbildendes Mittel der Calciumionen). Auf diese Weise verursacht man die Wiederauflösung des aktiven enzymatischen Komplexes und man trennt den Äthylendiamintetrasäure-Calcium Komplex vom wässrigen Milieu der Wiederauflösung durch Dialyse. Durch erneute Umwandlung von Glucose in Fructose, wie im Beispiel 1 beschrieben, kann man die wässrige Lösung des enzymatischen Komplexes frei von derart erhaltenen Calciumionen wieder verwenden, wobei die Lösung im Vergleich zu ihrer ursprünglichen Aktivität eine unveränderte enzymatische Aktivität hat.
Beispiel 3
Man geht vor wie in den Beispielen 1 und 2, ruft jedoch die Ausfällung des enzymatischen Komplexes nach Reaktion durch gleichzeitiges Hinzufügen von 2 Millilitern IM-Lösung von Calciumchlorid mit einem pH-Wert von 7,0 und von 50 Millilitern -Äthanol in das Reaktionsmilieu hervor, wobei der pH-Wert des Reaktibnsmitteis auf 7,0 gehalten wird. Auf diese Weise erhält man die Ausfällung von 99,7% des aktiven enzymatischen Komplexes.
Beispiel 4
A. Bereitung des aktiven enzymatischen Komplexes
Man läßt ein Methylester der Polyacrylsäure aus linearen Makromolekülen mit der Folgeeinheit:
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CH,
CH
C= O
OCH^
und mit einer Molekularmasse von 80 000 mit Hydrazin bei 90°C derart reagieren, daß ein Hydrazid-Polyacrylaraid gebildet wird ( ein aus linearen Makromolekülen gebildetes Polymer mit der Folgeeinheit:
-CH:
CH-
NH
NH,
Man wandelt dann die Polyacrylamid-Hydrazid in entsprechende; Säurederivat um durch Reaktion bei 0 C in Gegenwart einer Mischung von Chlorwasserstoffsäure und Natriumnitrit nach folgender Reaktion:
— CH,
CH- NH2 NaNO2 + HCl CII2 - C
I
I
I
C =
I
NH-		 η S C
I
N
=0
wobei η die Anzahl der Folgeeinheiten pro Molekül der makromolekularen Substanz darstellt.
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Danach befestigt man Glucoamylase-Moleküle auf äem derart erhaltenen Polymer, indem man dieses Enzym bei O0C mit diesem Polymer in einem wässrigen Milieu mit einem pH-Wert von 9,4 reagieren läßt.
Auf diese Weise erhält man einen aktiven enzymatischen Komplex in Lösung in wässrigem Milieu, der aber nicht in reversibler Weise ausfällbar ist, wie dies für die enzymatischen Komplexe erforderlich ist, die für die Anwendung der Erfindung in Betracht gezogen werden. Um einen enzymatischen löslichen und in reversibler Weise ausfällbaren Komplex zu erhalten, bildet man ein Copolymer zwischen dem löslichen, nicht ausfällbaren Komplex, der wie beschrieben erhalten wird, und dem aus dem Acrylamid abgeleiteten Monomer, das die folgende Formal hat:
und das nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise bereitet wurde.
Zu diesem Zweck bereitet man eine wässrige Lösung, die in Mischung diesen.Komplex und dieses Monomer in aufgelöstem Zustand enthält, und ruft die Polymerisation des Monomers
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in dieser Lösung in Gegenwart von Ammoniumpersulfat bei Stickstoffatmosphäre hervor.
Man erhält so einen aktiven, in Wasser bei einem pH-Wert über 4,5 löslichen enzymatischen Komplex, der in reversibler Weise bei einem pH-Wert ausfällbar ist, der unter 4,5 liegt, der eine 4 SOO enzymatisch^ Einheiten pro Granen entsprechende enzymatische Aktivität aufweist (eine enzymatische Einheit entspricht dabei der Menge an Glucose, ausgedrückt in Mikromol, die in einer Minute bei 60 C aus einer wässrigen enzymatisch "verflüssigten" Amidon-Lösung erzeugt wird, die einen Gehalt von 30 Gew% Feststoff aufweist (handelsübliches Produkt, verkauft von der Firma A.E. Staley Manufacturing Co.)
B. Verwendung des enzymatischen Komplexes zur Umwandlung des Amidon in Glucose
Auf 25O Milliliter einer wässrigen Lösung aus "verflüssigtem" Amidon mit 30 Gew% Feststoff, die auf 60°C gehalten wird und deren pH-Wert auf 5 festgelegt wird, fügt man 2 g des aktiven, enzymatischen Komplexes hinzu, der löslich und ausfällbar ist und dessen Zubereitung oben beschrieben wurde, und man hält das derart erhaltene Reaktionsmilieu auf 60°C.
N^ch, 12 Stunden ist das Amidon fast vollständig in Glucose umgewandelt. Man läßt dann das Reaktionsmilieu auf Umgebungstemperatur abkühlen, dann senkt man seinen pH-Wert auf 4,5, so daß die Ausfällung des enzymatischen Komplexes hervorgerufen wird, und trennt dann diesen letzteren von dem Re^ktionsmilieu durch Zentrifugieren.
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Der auf diese Weise zurückgewonnene enzymatische Komplex kann mehrfach auf die oben beschriebene V7eise wieder verwendet werden, wobei sich eine enzymatische Aktivität ergibt die ebenso hoch liegt wie bei der ersten Verwendung.
Beispiel 5
A. Bereitung des aktiven enzymatischen Komplexes
Man geht vor wie in Beispiel 4 beschrieben und bereitet das Säure-Derivat aus Hydrazid-Polyacrylamid. Dann befestigt man Glucose-Isomerase-Moleküle auf diesem Polymer-Derivat, indem man in der ebenfalls in Beispiel 4 im Fall der Befestigung der Glucoamylase auf dem gleichen Polymer beschriebenen Weise vorgeht. Man erhält so einen enzymatischen Komplex.
Andererseits bereitet man ein Acrylmonomer mit der Formel
CH CH2
NH (CH2)
durch Reaktion des Acrylsaurechlorxd mit dem Diaminäthylen.
Man mischt das derart erhaltene Monomer in wässriger Lösung mit dem enzymatischen Komplex aus Glucoseisomerase und löst in dieser Lösung in Gegenwart von Aramoniumpersulfat unter Stickstoffatmosphäre die Polymerisation des Monomers aus.
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Dieser letztere enzymatische Komplex ist ein amphoteres Polymer, das in wässrigem Milieu löslich ist, aber durch Anpassung des pH-Wertes dieses Milieus auf 7,5 (isoelektrischer Punkt dieses Komplexes) ausgefällt wird.
B. Verwendung des enzymatischen Komplexes zur Umwandlung der Glucose in Fructose
Man geht vor wie in Beispiel 1, löst aber die Ausfällung des enzymatischen Komplexes nach der Reaktion durch Anpassung des pH-Wertes des Reaktionsmilieus auf den V7ert 7,6 aus.
Beispiel 6
A. Bereitung des aktiven enzymatischen Komplexes
Man wandelt das Carboxymethylcellulose-Hydrazid durch Reaktion bei O0C in Gegenwart von Natriumnitrid und Chlorwasserstoffsäure in ein entsprechendes Derivat um. Dann läßt man das derart gebildete Azid, stets bei OC, in wässrigem Milieu bei einem pH-Wert von 8,7 mit einer Ortho-Aminobenzoe-Säure und Lactase (Miles) reagieren. Für Ig Hydrazid-Derivat als Ausgangsstoff verwendet man O,5 g Lactase und O,2 g Ortho-Aminobenzoe-Säure.
Auf diese Weise erhält man einen aktiven, in Wasser löslichen enzymatischen Komplex mit einem pH-Wert, der über 4,5 liegt und in reversibler Weise bei einem pH-Wert unter 4,5 ausfällbar ist, der aus einer makromolekularen Polyanhydroglucose-
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Kette mit seitlichen Derivatgruppen der Ortho-Aminobenzoe-Säure und anderen seitlichen Gruppen besteht, die aus Lactasemolekulen bestehen, wobei alle diese Gruppen mit der Polyarihydroglucose-Kette durch Gruppen mit der Formel O — CH_ — CO —IsIH — verbunden sind.
Dieser enzymatische Komplex hat eine 520 Lactaseeinheiten pro Gramm entsprechende enzymatische Aktivität.
B. Verwendung des en zy ma ti sehe η Komplexes zur Umwandlung der Lactose in Galactose und Glucose
Auf 250 Milliliter einer wässrigen Lösung mit 5 Gew% Lactose mit einem pH-Wert von 6,6 und auf 40°C gehalten fügt man 1 g des in der oben beschriebenen Weise erhaltenen enzymatischen KoTtralexes bei.
Zwei Stunden lang läßt man die enzymatische Reaktion sich entwickeln und fällt den enzymatischen Komplex dann durch Senkung des pH-Wertes des Reaktionsmilieus auf 4,5 mittels einer durch Zitronensäure verdünnten Lösung aus. Man trennt den derart erhaltenen Niederschlag von dem Reaktionsmilieu, indem man ihn sich absetzen läßt. Der auf diese Weise zurückgewonnene enzymatische Komplex kann nach Reinigung durch Wiederauflösung in wässrigem Milieu bei einem pH-Wert von 7,0 und Filtration durch einen Filter, der beispielsweise Poren von O,22 Mikron hat, mehrere Male wieder verwendet werden, ohne seine ursprüngliche enzymatische Aktivität zu verlieren.
- 20 -
609850/1074
Die Analyse des Reaktionsmilieus zeigt nach Trennung des enzymatischen Komplexes, daß 30 % der ursprünglichen Lactose-Menge in Galactose und Glucose umgewandelt wurde.
Das vorbeschriebene Verfahren kann sehr verschiedene industrielle Anwendungen erhalten, insbesondere auf folgenden Gebieten:
- Veredelung von Lactoserum durch Hydrolyse der Lactose,
- Isomerisation der Glucose mittels Glucose-Isomerase zur Erlangung von Glucose- und Fructosesirup mit erhöhter Süßkraft,
- Erzeugung von Invertzucker aus Sucrose durch Inversion,
- Abbau des Amidon zu Glucose mittels Alpha-Amyläse und Amyloglucosidase,
- Erzeugung von Maltose aus Amiden mitteis Beta-Amyläse und Amyloglucosidase,
- Erzeugung von hoch-fermentierbaren Sirups für die Industrie der Bierherstellung.
Patentanspruch;
- 25 951
- 21 609850/1074

Claims (1)

  1. 262A002
    Patentanspruch
    Verfahren zur Verwendung eines Enzyms zur Umwandlung einer organischen Substanz in mindestens eine andere organische Substanz durch enzymatisch^ Reaktion, wonach das Enzym durch covalente Bindungen auf einem in wässrigem Milieu löslichen organischen Polymer befestigt wird, wodurch ein aktiver, in wässrigem Milieu löslicher enzymatischer Komplex erzeugt wird, und wonach dieser Komplex in aufgelöstem Zustand in einer wässrigen Lösung der umzuwandelnden Substanz während einer Zeitdauer und bei einer Temperatur gehalten wird, die ausreichen, um den gewünschten Umwandlungsgrad für diese Substanz zu erreichen, dadurch gekenn ze ichnet, daß das organische Polymer unter denen ausgewählt wird, die einen in reversibler Weise ausfällbaren, aktiven enzymatischen Komplex bilden unter Aufrechterhaltung seiner enzymatischen Aktivität nach Wiederauflösung und daß nach Erhalt des gewünschten Umwandlungsgrades der umzuwandelnden Substanz der enzymatische Komplex ausgefällt und von dem Reaktionsmilieu getrennt wird.
    Se/taP - 25 951
    609850/1074
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