DE2430877A1 - Verfahren zum nachweis elektrokinetischer stroeme und vorrichtung dafuer - Google Patents
Verfahren zum nachweis elektrokinetischer stroeme und vorrichtung dafuerInfo
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Description
1 River Road
SCHENECTADY, N.Y./U.S.A.
SCHENECTADY, N.Y./U.S.A.
Verfahren zum Nachweis elektrokinetischer Ströme und Vorrichtung
dafür
Die Erfindung betrifft ein elektrokinetisch.es Strömungssystem
mit oszillierendem Antrieb zum schnellen und genauen reproduzierbaren
Nachweis der fixierten Ladungsdichte eines Belages
bzw. Überzuges auf der inneren Oberfläche einer Durchflußbegrenzung, die in der Bahn der oszillierenden, stopfenähnlichen Flüssigkeitsströmung angeordnet ist. Die vorliegende Erfindung
kann zur Identifizierung biologischen Materials und zum Nachweis von Reaktionen zwischen einem Bezugsüberzug eines biologischen Materials und einem Überzug eines zweiten biologischen Materials dienen, wie beispielsweise für Antigen-Antikörper- ■ (oder Antikörper-Antigen-} Reaktionen.
bzw. Überzuges auf der inneren Oberfläche einer Durchflußbegrenzung, die in der Bahn der oszillierenden, stopfenähnlichen Flüssigkeitsströmung angeordnet ist. Die vorliegende Erfindung
kann zur Identifizierung biologischen Materials und zum Nachweis von Reaktionen zwischen einem Bezugsüberzug eines biologischen Materials und einem Überzug eines zweiten biologischen Materials dienen, wie beispielsweise für Antigen-Antikörper- ■ (oder Antikörper-Antigen-} Reaktionen.
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Stromdetektoren für alternierende Strömungen (alternating Streaming current detectors) für Messungen von Flockungsmittel-Wirkungen
auf suspendierte Teilchen in Strömungsmitteln (fluids) sind in den US-Patenten 3 399 133 und 3 526 827 beschrieben.
Nach der US-PS 3 399 133 wird eine wäßrige Flüssigkeit, die geladene
Teilchen enthält, unter Druck in einer Richtung an einer ersten Elektrode vorbei durch eine Kapillare und an einer zweiten Elektrode zur Entfernung aus dem System vorbeigeführt.
Die US-PS 3 526 827 beschreibt eine sich vertikal ausdehnende blinde Bohrung in Kombination mit einem Kolben (Stempel), der
in der Bohrung hin und her bewegt wird. Eine Elektrode ist am Boden und die andere am oberen Teil der Bohrung angeordnet. Die
Probenlösung wird durch die Bewegung des Kolbens in der Bohrung zwischen den Elektroden auf und ab bewegt, so daß ein alternierender
Stromimpuls' erzeugt wird.
Keine dieser PS beschreibt jedoch die Benutzung von durch alternierende
Strömungen erzeugten Strömen zur Identifizierung biologischen Materials oder zum Nachweis einer physikalischen und
chemischen Wechselwirkung zwischen biologischen Materialien an der Grenzfläche zwischen Schichten solcher Materialien. Bis heute
sind Techniken für Oberflächen-Grenzflächen-Messungen entwickelt worden, die beispielsweise die Reflexions-IR-Absorption, Oberflächenenergie-Messungen,
Markierung durch Isotropen oder Ellipsometrie einschließen. Verbesserte Apparate zur Durchführung
von Oberflächen-Grenzflächen-Messungen und auch zum Nachweis
des Adsorptionsphänomens und deren Änderungen würden von beträchtlichem Wert sein.
Erfindungsgemäß wurde ein Strömungs-Stromdetektor mit oszillierenden
Antriebsvorrichtungen entwickelt, in welchem man ein
Flüssigkeits-Durchsatzvolumen (volume rate of flow of liquid),
das als Funktion der Zeit variiert, durch eine Durchflußbegrenzung
(d.h. Kapillarbohrung) oszillieren läßt. Außerdem
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werden die Vorrichtungen geschaffen, durch welche die Durchflußbegrenzung
isoliert werden kann, und ebenso gut kann eine Durchflußverbindung
mit der Durchflußbegrenzung hergestellt werden, um ein Strömungsmittel zu dessen Innerem selektiv zirkulieren
zu lassen. Die Durchflußbegrenzung kann, wenn es vorgezogen wird, entfernbar ausgeführt sein.
Dieser;modifizierte Apparat ermöglicht die schnelle und genaue
Identifizierung von Belägen verschiedener biologischer Materialien,
die selektiv auf die innere Oberfläche der Durchflußbegrenzung (vorzugsweise eine Kapillare) aufgebracht wurden. Der
Apparat ermöglicht ebenfalls den Nachweis von Reaktionen zwischen einem Bezugsbelag eines biologischen Materials an der inneren
Oberfläche der Durchflußbegrenzung und einem Belag eines davon verschiedenen biologischen Materials, das darüber aufgebracht
wurde. Ein Beispiel für die letztere Möglichkeit wäre eine Antigen-Antikörper-
(oder Antikörper-Antigen-) Reaktion.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung
näher erläutert. Im einzelnen zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines oszillierenden Strömungs-Stromdetektors
gemäß der Erfindung,
Fig. 2 eine Kurve, die zeigt, daß das oszillierende Strömungssystem
mit einer turbulenten Strömung in der Kapillare betrieben wird,
Fig. 3 eine grafische Darstellung, in der die Oberflächenladung von unkontaminierten, freien Oberflächen verschiedener
Materialien gegen den pH-Wert aufgetragen sind,
Fig. 4 grafisch die charakteristischen pH-Spannungsverlaufe verschiedener
negativ geladener Blutproteine, wobei jedes getrennt als individuelle Schicht auf einem Substrat
adsorbiert ist.
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Pig· 5 grafisch den Effekt eines später aufgetragenen Belages von Humanserum auf eine Schicht von adsorbiertem Albumin,
Fig. 6 grafisch einen ähnlichen Effekt, wobei ein anderes Substrat
verwendet wurde und außerdem den Effekt der Auftragung von Kaninchen-Antiseren auf das Albumin/Humanserum-System,
Fig. 7 grafisch den umgekehrten Effekt wie Fig. 5, d.h. den Effekt eines Albuminbelages, der auf einen Belag von
Humanserum aufgetragen wurde,
Fig. 8 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen oszillierenden,
elektrokinetischen Strömungs-Stromsystems, das mit einer bevorzugten Kapillarbohrungs-Isolations-Vorrichtung
und einer Vorrichtung zum Einführen einer Serumprobe, zum Testen und zum Präparieren für eine neue
Probe ausgerüstet ist und
Fig. 9 ein Autoti trationssystem, das bei dem erfindungsgemäßen
Strömungs-Stromsystem zur Variation des pH-Wertes des
Elektrolyten angewendet wird.
Fig. 1 illustriert schematisch das erfindungsgemäße System,- das
ein analytisches Gerät zur Auffindung bzw. zum Nachweis von Reaktionen zwischen biologischen Materialien (z.B. Antigen-Antikörper-Reaktionen),
zum Messen der Verträglichkeit biologischen Materials mit nicht-biologischem Material, zum Identifizieren
von biologischen Materialien und zum Nachweis von Hormonen, Enzymen, Metaboliten u. dgl. durch das Verfahren der Immunitätsprobe betrifft. Bei dem letzteren Verfahren wird der interessierende
Gegenstand, z.B. das Wachstumshormon,.isoliert, ein Antikörper
dafür wird entwickelt und eine Schicht dieses Antikörpers wird auf die innere Oberfläche der Kapillare des hierin beschriebenen
Nachweissystems aufgebracht. Eine Serumprobe wird eingeführt und wenn eine Reaktion auftritt, ist der interessierende
Gegenstand im Serum zugegen.
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Im oszillierenden Strömungs-Stromdetektor 10 verbindet
Kapillare 11 ein Paar von Elektrolyt-Reservoirkammern 12 und Kapillare. Il könnte durch ein Diaphragma mit einem oder mehreren
durchgehenden Löchern darin ersetzt werden. Bei exakter Ausführung und richtigem Sitz der Dichtungen 11a und 11b kann
Kapillare 11 auswechselbar gestaltet werden. Die innere Bohrung durch Kapillare 1.1 kann einen Durchmesser im Bereich von
0,5 bis 5 nun, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 2 mm haben.
Vorzugsweise ist Kapillare 11. ein Rohr aus Glas, Metall oder
Plastik, das optimale Adhäsion für Materialschichten,· die darauf
.angebracht ..werden sollen, bietet.
Die Kammern 12 und 13 sind bis zu 3/4 mit einem Elektrolyten gefüllt, wie beispielsweise eine gepufferte Lösung von Mischungen,
deren Ionenstärke und pH-Wert sich mit dem zu verwendenden biologischen Material bzw. Materialien verträgt. Ein
geeigneter Elektrolyt für die hierin beschriebenen Teste ist 0,01 molares PO^ mit einem pH-Wert von 7,2. Die hierin gezeigte
oszillierende Antriebsvorrichtung (mechanischer Antrieb mit pneumatischer Kupplung) wird bevorzugt, jedoch
können auch andere Antriebs/Kupplungsanordnungen verwendet werden.
Es wird ein oszillierender Elektrolytdurchfluß durch Kapillare
11 bewirkt und aufrechterhalten durch die positive Wasserverdrängungspumpe
14, die Gasvolumen (gewöhnlich Luft) l6 und
nach oberhalb der Elektrolyt-Volumen treibt. Da Pumpe 14 Druck
auf Volumen 16 ausübt, wird ein Vakuum gleicher Größe auf Volumen 17 ausgeübt und umgekehrt. Anstelle dieser reziproken
pneumatischen Kupplung mit den Elektrolytvolumen könnte eine reziproke mechanische Kupplung verwendet werden, die ein
Diaphragma, das in jeder Elektrolytkammer angebracht ist, antreibt. -
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Pumpe 14 enthält zwei Kolben/Zylinder-Korabinationen 18
und 19, die durch eine nicht gezeigte^ durch einen Motor
getriebene Scots-h-gabel 21 in einer Gegentaktbewegung
bewegt werden. Spritzen (10 ml) sind passend für die Kolben/ Zylinder-Kombinationen. Die Frequenz der Gegentaktbewegung
(die sich daraus ergibt, dass ein sogenannter "Flüssigkeitskolben" in der Bohrung der Kapillare 11 oszilliert) kann
von etwa 0f3 bis 2 Hz variieren; vorzugsweise liegt die
Frequenz bei 1 Hz. Bei Verwendung von 10 ml-Spritzen liegt die Sp itzenvolumen-Verdrängungsrate bei etwa 10 cm /Sek.;
diese Verdrängungsvolumenrate variiert sinusförmig mit der Zeit wegen der Charakteristiken des Antriebsmechanismus.
Der Elektrolytfluss durch Kapillare 11 bewirkt ein Ungleichgewicht
der Ladung zwischen Kammern 12 und 13, wobei das
Ausmass dieses Ungleichgewichts direkt proportional der fixierten Ladungsdichte an der inneren Oberfläche der Kapillare
ist, wie es aus der elektrokinetischen Theorie gut bekannt ist. Die eine oder andere der reversiblen (nicht polarisierenden)
Elektroden mit grosser Oberfläche 22 und 23 sammelt die Überschussladung, die in eine Kammer injiziert wird und
gibt es in die andere Kammer zurück (Ladungsentzug) durch
einen Strom-Mess-Verstärker 24 mit niedriger Eingabe-Impedanz
(etwa 400 0hm oder weniger)·
Sowohl Platin-als auch Silber-Silberchlorid-Öektroden zeigen
_ befriedigende Ergebnisse und haben eine etwa gleich gute "
Le xs tun gslah ig-r ^ & &
Ylceit.Anderes Elektrodenmaterial, wie beispielsweise Gold,
Silber und dergleichen kann ebenfalls verwendet werden, wie es in der US-PS 3 399 133 ' . beschrieben "wird.
Die Messung des Strömungs -Stromes (im Gegensatz zur Messung
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des Strömungspotentials) vermeidet weitgehend den ElektrolytleitfäliigU—keitseffekt
in dem System, das einen viel grösseren Bereich verwendbarer Salzkonzentrationen
zulässt. Dieses Strömungs -Stromsystem in Kombination mit
dem Verstärker mit niedriger Eingangs-Impedanz 24 macht es möglich, Messungen bei menschlichen physiologischen Salzkonzentrationen auszuführenj wenn dieses erforderlich ist.
Ein sinusförmiger Wechselstrom der Grossenordnung von 10 Ampere
wird in dem beschriebenen System erzeugt, dieser Strom wird
Sp annungs
durch den Strom-zu- / -Verstärker 24 verstärkt, durch einen Polaritäts-sensitiven Synchrongleichrichter 26 gleichgerich-
durch den Strom-zu- / -Verstärker 24 verstärkt, durch einen Polaritäts-sensitiven Synchrongleichrichter 26 gleichgerich-
Gleichstrom , ' . ,
tet und als / -Wert auf dem Kurvenaufzeichner vom Potentiometer-Typ
27 aufgezeichnet. _ * - - .
Zusätzlich zur oszillierenden Antriebsvorrichtung wurde
- - Strömungserfindungsgemäss
der/ Stromdetektor 10 konstruiert, um die Isolierung der Bohrung der Kapillare 11 vom Rest des Systems
und auch um die selektive Einführung von Flüssigkeiten (bei-, spielsweise Blutproben) in die Bohrung für verschiedene Zwecke
zu ermöglichen. Eine bevorzugte Kapillar-Isolierungs- und Pröbeneinführungsanordnung wird in Fig. 8 gezeigt.
Der Isolierungsmechanismus, wie er in Fig. 1 gezeigt wird, besteht aus Druckventilen 28 und 29, die so angebracht sind,
dass sie mit den zurückgesetzten Teilen / bzw. 32 der Kapillare
diese
11 eine Dichtung bilden bzw./öffnen können. Die selektive Einführung und Entfernung von Flüssigkeiten in und aus der Bohrung der Kapillare 11 wird mit Hilfe von mit Ventilen versehenen Zuführungen 33 und 34 bewirkt. Ventilstangen 36 und 37 für Ventile 28 bzw. 29 erstrecken sich durch die Elektroden-Strukturen, die wiederum mit Hilfe von Dichtungen 38 und
11 eine Dichtung bilden bzw./öffnen können. Die selektive Einführung und Entfernung von Flüssigkeiten in und aus der Bohrung der Kapillare 11 wird mit Hilfe von mit Ventilen versehenen Zuführungen 33 und 34 bewirkt. Ventilstangen 36 und 37 für Ventile 28 bzw. 29 erstrecken sich durch die Elektroden-Strukturen, die wiederum mit Hilfe von Dichtungen 38 und
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in den Elektrolytkammern angebracht sind.
Das System ist stabil und reproduzierbar und kann leicht zur Erzeugung von vergleichenden Informationen des Typs,
wie sie in den Fig. 3 bis 7 angegeben sind, verwendet werden.
Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, ist der Flüssigkeits durchfluss
durch die Bohrung der Kapillare 11 turbulent. Obwohl die Abszisse
der Kurve in Fig. 2 in Umdrehungen/Minute der Pumpe angegeben ist, ist dieser Parameter direkt umwandelbar in die Fliessgeschwindigkeit«der
Kapillarbohrung in dem positiven Verdrängung sys tem von Fig# u Das bere chnete
Eintreten der Turbulenz liegt bei 19 U/Min., d.h. sie fällt
genau in den Beginn des steilen Anstieges der Leistung. Die Geschwindigkeit der Flüssigkeit in der Nähe der Wand der
Kapillarbohrung ist viel grosser bei turbulentem/ fluss ,
wodurch die Sensitivität der Vorrichtung über die Sensitivität, wenn der Fluss laminar wäre, wesentlich gesteigert
wird. Diese Turbulenz resultiert aus der Grosse des Hubvolumens, das durch Pumpe 14 möglich gemacht wird.
Eine Anzahl verschiedener Materialien wurde direkt auf die innere Oberfläche der Bohrung von Kapillare 11\ aufgetragen.
um als Substrate für die Adsorption von Proteinen darauf zu dienen.
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Art der Bohrungsoberfläche
Sauberes Glas
Methyliertes
Glas
Glas
Aminiertes Glas
Octadecyliertes
Glas
Glas
Polyäthylen
Silicon-Polycarbonat—Copolymer,
bei. Raumtemperatur "vulkanisiertes
Silicon
Silicon
Verfahren zur Herstel^ lung der Oberfläche
chemische Reinigung und Brennen
Verwendung von Tr ime thy Ich lor_-s i 1 an
Verwendung von Aminopropyltr iäthoxysilan
Verwendung von Octadecyl tr ich-lo rs.iLan
(ODTCS)
handelsübliches Röhrenmater.ial
über die Bohrung der Glaskapillare gegossen
um den entfernbaren Kern gegossen
Bezeichnung in Fig. 3
nicht gezeigt
Wie die Tabelle I zeigt, bewegt sich die Auswahl von Überzugsmaterial
von hydrophoben (niedrige Energie) Oberflächen bis zu benetzbaren (hohe Energie) Oberflächen. Die Verwendung
octadecylierten Glases ist repräsentativ für chemische
Modifikationen, die durchgeführt werden können mit der Oberfläche einer Glaskapillarbohrung. Die mit ODTCS so'hergestellte
Oberfläche ist hydrophob (Kontaktwinkel von 110°) und ermöglicht starke, vielfache Kontaktbindungen zu hydrophoben
Regionen in adsorbierenden Proteinen und Makromolekülen.
Die octadecylierten Glaskapillaren werden beispielsweise wie
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folgt hergestellt: Pyrexglas-Röhrenmaterial wurde in Stücke
von etwa 6 cm Länge geschnitten und etwa 2 Stunden mittels Chloroform entfettet; die Kapillaren wurden 4 Stunden lang
Ider Einwirkung von;
in 75 %iger HNO., geätzt, mit destilliertem Wasser gespült,/
50 % NaOH ausgesetzt, um OH-Stellen an der Glasoberfläche zu
bilden. Nach dem Spülen wurden die Kapillaren 6 Stunden lang auf 500°C erhitzt und einer Behandlung mit 10 Vol.%/Volumen
ODTCS in Toluol mit 0,5 Vol. %/Volumen TriäthylainLn 12 Stunden
lang bei etwa 22 C unterzogen. Die so hergestellten Kapillaren waren dann für die Adsorption von Überzügen verschiedener
biologischer Materialien, wie beispielsweise Proteine, Blutfraktionen, Hormone und dergleichen, an den
inneren Oberflächen der Bohrungen vorbereitet.
Wenn die Anwesenheit von Antikörpern im Serum nachgewiesen
zunächst
werden soll, wird das Antigen/an der inneren Oberfläche der Kapillarbohrung angebracht und ein Signal, daa proportional der charakteristischen Oberflächenladung der Grenzflächen-
werden soll, wird das Antigen/an der inneren Oberfläche der Kapillarbohrung angebracht und ein Signal, daa proportional der charakteristischen Oberflächenladung der Grenzflächen-
iKapilLare ist, gemessen..'
Oberfläche zwischenißeschichtung undyDie mit Antigen beschichtete
Oberfläche wird dann mit Blutserum oder einer Verdünnung davon behandelt. Wenn dieses Serum spezifische Antikörper-Proteine
(zusammen mit den anderen^nicht reagierenden Serum-Proteinen,
die normalerweise zugegen sind) enthält, werden die Antikörper mit dem ursprünglichen Antigenüberzug reagieren,
um einen neuenffest angebrachten Überzug zu bilden, der
eine andere charakteristische Ladung aufweist, womit angezeigt ist, dass eine Antigen-Antikörper-Reaktion aufgetreten ist,
Diese Reaktion hat zu einer Bindung geführt, die das Antikörperprotein und dessen Ladung zurückhält, Die Bindung ist stark
genug, dass das Antikörper-Protein beim Waschen nicht entfernt wird; wie es mit anderen Proteinen, die im Serum zugegen sind,
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erfolgt. Der Unterschied im elektrischen Signal zwischen
dem ursprünglichen Antigenüberzug und dem anschiiessenden
Antikörperuberzug ist ein Mass für die aufgetretene Reaktion, wie sie in Fig. 6 gezeigt wird.
Wie aus Fig. 3 eindeutig hervorgeht, wurden alle getesteten
Oberflächen (ausgenommen das nicht gezeigte aminierte Glas, das positiv erschien) stark negativ, sogar wenn ein Elektrolyt
aus destilliertem Wasser mit pH-Werten oberhalb von etwa 5 benutzt wurde. Die Bezeichnungen für die Kurven in Fig. 3
korrelieren mit den Buchstaben, wie sie in der letzten Spalte von Tabelle I angegeben sind. Die als Ordinate angegebenen
Spannungswerte der Kurven von Fig. 3 sind Gleichstromspannungen,
die ein Zeichen haben, das mit dem Zeichen der Ladung an der Kapillaroberfläche korreliert. Negative Soannungswerte
in der Kurve zeigen eine negativ fixierte Ladung an der Oberfläche
der Kapillarbohrung. Alle diese negativ geladenen Oberflächen adsorbieren negativ geladene Proteine schnell und ziemlich
stark bei einem pH^-Wert von 7, wie aus der Fig. 4 ersehen
werden kann. Bei den in Fig. 4 aufgezeigten Daten zeigt die Bohrung der Kapillare eine octadecylierte Oberfläche, von
der festgestellt wurde, dass sie leicht verschiedene'negativ
einem
geladene Blutproteine bei/pH-Wert von 7 adsorbierte. Eine
Korrelation der Abkürzungen, die die Kurven von Fig. 4 (sowie in Fig. 5 bis 7) zeigen, ist in Tabelle II angegeben.
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Abkürzung Material
BSA Rinderserumalbumin
FR1 . Fibrinogen
GP Glycoprotein
HS / menschliches Serum
RA-HS Kaninchen-Antiseren
Jedes der durch Adsorption verschiedener Blutproteine über dem octadecylierten Substrat hergestellten Schichtsysteme
zeigte seine eigenen charakteristischen pH-Spannungszeichen· Alle waren recht stabil und an diesem gleichen Substrat reproduzierbar.
Es gibt ein definitiv reproduzierbares pH-Spannungszeichen
für jeden Proteinüberzug.
Es wurde eine Bestimmung der Sensitivität dieses Systems zur Proteinadsorption an einem vorgegebenen Substrat durchgeführt.
Diese Bestimmung wurde unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) in einem Puffer (0,01 molarer Kaliumphosphatpuffer
von pH 7,4) und Borsilikat-Glas als Substrat durchgeführt. Es wurde gefunden, dass unterhalb
von etwa 2 χ 10 g/ml eine ungenügende Menge Gesamtprotein in der Bohrung der Kapillare 11 zugegen ist, um
eine vollständige Monoschicht über dieser Oberfläche zu ergeben, aber der wirkliche Effekt der Oberflächenschicht mit
dieser sehr kleinen Menge ist ausserordentlich gross. Wenn
-5
man annimmt, dass 2 χ 10 g/ml eine vollständige Monoschicht (ausgebreitet über die Oberfläche der Bohrung der Kapillare) ergeben, dann ist 1 % Abdeckung der Oberfläche ausreichend,
man annimmt, dass 2 χ 10 g/ml eine vollständige Monoschicht (ausgebreitet über die Oberfläche der Bohrung der Kapillare) ergeben, dann ist 1 % Abdeckung der Oberfläche ausreichend,
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beobachteten
um 50 % der Gesamtänderung in der*Ladungsdichte zu bewirken.
Die so nachgewiesene kleine Menge von BSA-Protein zeigt,
dass das System fähig ist, sehr kleine Konzentrationen von Proteinadsorption an der Oberfläche der Kapillarbohrung nachzuweisen.
Bei weiteren Arbeiten mit BSA wurde gefunden, dass, obwohl BSA an der Oberfläche der Bohrung der Glaskapillare
adsorbiert und Anti-BSA nachgewiesen wurde, wenn es mit dem BSA in Kontakt gebracht wurde, BSA sehr schnell vom Glas
desorbiert wird. Wenn jedoch die stark hydrophobe?octadecylierte
Oberfläche als Oberfläche für die Kapillarbohrung verwendet
wurde, blieb BSA während eines Zeitraums von 900 Stunden Aufbewahrung in Protein-freiem Puffer bei 40°C stabil.
Wie in Fig. 5 gezeigt wird, wurde eine Schicht von BSA in einem Puffer, die über einer octadecylierten Oberfläche an-
durch
gebracht war, vollständig 7 eine Schicht aus menschlichem Serum (HS) ersetzt (oder verdeckt), wenn die mit BSA
-■■■-. /
überzogene Oberfläche der Einwirkung von HS ausgesetzt wird. Octadecyliertes Glas wird der Einwirkung von Albumin ausgesetzt
(1 Gew.%/Volumen BSA in 0,02 molarer tris-HCl, pH 7,15 für 21 Stunden, um eine vollständige Beschichtung zu
erreichen) und dann wurde diese Oberfläche mit der Albuminschicht der Einwirkung von HS (0,7 Gew.%/Volumen HS in 0,02
molarer tris-HCl, pH 7,15 für 24 Stunden) ausgesetzt. Die tris-HCl wurde hergestellt, indem HCl zu Tris(hydroxymethyl)-•aminomethan
/~Trizma^ Base Reagent Grade_7 bis zu einem
pH-Wert von 7,15 zugesetzt wurde. Die erhaltene Schicht war
identisch mit einer Kontrolle (angezeigt durch die mit X bezeichneten Punkte)j in welcher HS allein an einer octadecylierten
Oberfläche adsorbiert und getestet wurde. Die untere
Kurve ist eine Kontrollkurve, die garantiert, dass die zu
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erwartende BSA-Schicht tatsächlich erhalten wurde, bevor die BSA-beschichtete Bohrung der Einwirkung von HS ausgesetzt
wurde.
Verdrängung
Di-e / einer BSA-Schicht von einer Silikon-Polycarbonat-Copolymerschicht, aufgetragen auf der Bohrungsoberfläche einer Glaskapillare, durch einen späteren Kontakt mit HS wird in Fig. 6 gezeigt. Das Ergebnis dieses Testes verifizierte die Ergebnisse in Fig. 5 mit einem anderen Substrat; nämlich
Di-e / einer BSA-Schicht von einer Silikon-Polycarbonat-Copolymerschicht, aufgetragen auf der Bohrungsoberfläche einer Glaskapillare, durch einen späteren Kontakt mit HS wird in Fig. 6 gezeigt. Das Ergebnis dieses Testes verifizierte die Ergebnisse in Fig. 5 mit einem anderen Substrat; nämlich
gewisses
dass ein»Protein» das im HS vorhanden ist, besser als Albumin
haftet.
Eine weitere Verifizierung dieses Schlusses ergab sich aus
der Feststellung^ ob BSA einevorher aufgegebene HS-Schicht
entweder ersetzen oder abdecken würde. Eine octadecylierte Oberfläche wurde 24 Stunden lang der Einwirkung von HS (7 χ
10 g/ml in 0,02 molarer tris-HCl, pH 7,15) und anschliessend
22 Stunden lang der Einwirkung von BSA (0,5 Gew.%/Volumen in 0,02 molarer tris-HCl, pH 7,15) unter im wesentlichen den
gleichen Bedingungen, wie sie in Verbindung mit den Daten von Fig. 5 angegeben wurden, ausgesetzt. Beim Vergleich von
Fig. 7 mit Fig. 5 ist ersichtlich, dass die erhaltene Oberfläche mit HS und deren Charakteristiken identisch blieben.
Jeglicher Ersatz oder Abdeckung von HS hätte die Kurve zurück in Richtung der Kurve mit den BSA-Charakteristiken gebracht.
Daraus konnte deshalb geschlossen werden, dass die durch HS gebildete Globulin-ähnliche Beschichtung stärker
haftete als die Albuminbeschichtung auf der gleichen Oberfläche und dass das Albumin nicht an der HS-Schicht haftete.
Andererseits wurde in einem anderen Test gefunden, dass, wenn eine Glycoproteinschicht der Einwirkung von Albumin ausgesetzt
wurde, eine unverwechselbare Veränderung nach den Albumincharakteristiken erfolgte, die möglicherweise der Einfügung von
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BSA in die Glycoprotein (GP)-Schicht zuzuschreiben ist.
Mit der erfindungsgemässen Vorrichtung durchgeführte. Versuche
wurden auch dazu benutzt, die Schnelligkeit zu bestimmen, mit welcher Oberflächen mit Protein beschichtet wurden,
wenn die Oberflächen mit Blut in Kontakt gebracht wurden. Wenn eine hydrophobe, oetadecylierte Oberfläche der
Einwirkung von Fibrinogen ausgesetzt wurde, wurde nach 10 Sekunden Einwirkungszeit eine Beschichtung erhalten, die im
wesentlichen mit einer Beschichtung, die bei viel längeren
Behandlungsphasen erhalten wurde, identisch war. Somit wurde im wesentlichen
eine'komplette Beschichtung innerhalb von 10 Sekunden
erhalten.
Die ,bevorzugte Kapillarisolierungsvorrichtung zusammen
der
mi ^Vorrichtung' zum Injizieren einer Probe (.z.B. Serum)
in die Kapillare zum Testen der Probe/Beschichtungsreaktion und zur Vorbereitung für die Injektion einer neuen Probe
sind schematisch in Fig. 8 dargestellt. Elemente 11 bis bleiben die gleichen wieYvergleichbare Anordnung in Fig.
Verstärker 24, Gleichrichter 26 und Aufzeichnungsgerät 27
werden nicht gezeigt, wohl aber die Leitungen 51 und 52
dem . '
die mitWerstärker 24 verbunden sein würden, um die
Elektroden 22 und 23 elektrisch damit zu verbinden. ,
Hohle,abgedichtete Gleitventile 53 und 54 dienen, wenn sie
•mit deren geflanschten.flexiblen Spitzen in den Dichtungskontakt mit den Enden der Kapillare 11 bewegt werden, in Kombination
nicht nur dazu, die Bohrung der Kapillare 11 zu isolieren/sondern dienen auch als Vorrichtung zur Einführung
von Material (und Entfernung von Material daraus) in die Kapillarbohrung.
Es ist bekannt, dass bestimmte Antigen-Antikörper-Reaktions-
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komplexe getrennt werden können, ohne dass dabei deren Reaktivität bei der Behandlung mit niedrigen pH-Werten
und/oder hohen Salzkonzentrationen zerstört wird. Deshalb kann eine Beschichtung, die irreversibel als Antigen-
oder Antikörperschicht an der inneren Kapillaroberfläche angebracht ist, wiederholt verwendet werden, wodurch die Durchführung
von wiederholten Testen, bei denen Blutproben nacheinander eingeführt werden, mit der Beschichtung möglich
ist, die zum Nachweis ergänzender Antikörper oder Antigenmaterialien, die in den Proben enthalten sind, dienen.
Wenn eine spezifische Antigen-oder Antikorperbeschichtung f
aufgetragen an der Wandung der Bohrung 11, gegeben ist, ist
es lediglich notwendig, die Ventile 53 und 54-mit den Enden
der Kapillare 11 in Kontakt zu bringen und (für die ursprüngliche
Probe) danach
Durchfluss
a) Ventil 56 in eine Nicht- / -Position zu bringen;
b) Ventil 57 so einzustellen, dass Serumprobe 58 aus
Wy
Probenhalterungsschenktisch 59 in Durchflussverbindung mit dem Inneren des GleitventiJs 54 gebracht wird;
Probenhalterungsschenktisch 59 in Durchflussverbindung mit dem Inneren des GleitventiJs 54 gebracht wird;
c) Ventil 61 so einzustellen, um den Durchfluss dadurch zu ermöglichen;
d) Pumpe 62 anzustellen, um die Inhalte des hohlen Gleit-
des
ventile 53, der Bohrung der Kapillare 11 und! Gleitventils
auszuleeren und dann diese Volumen mit einem Teil der Serumprobe -58 anzufüllen;
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e) Pumpe 62 abzustellen und das Probenmaterial für die Zeit, die zur Durchführung der Reaktion notwendig ist,
mit der Beschichtung der Bohrung in Kontakt zu belassen, sofern eine Reaktion erfolgt; und
f) Ventile 56 und 57 so einzustellen, dass Spülbehälter
63 in DurchfLussverbihdung . mit der Bohrung der Kapillare 11
gebracht wird (wobei Ventil 61 noch geöffnet ist)-, wodurch beim Anstellen von Pumpe 62 die Bohrung von Kapillare 11
von nicht reagierenden Serumkomponenten freigewasdien wird.
Dann wird beim Zurückführen der Ventile 53 und 54 die Boh-
den
rung von Kapillare 11 in Durchflussverbindung mitVElektrodenkammern
12 und 13 gebracht. Dann wird Pumpe 14 bewegt. Nachdem
das Auftreten einer Reaktion gemessen wurde, kann der reaktive Antikörper (oder Antigen) aus dem System eluiert
werden, indem Elutionslösung 64 in Durchflussverbindung mit der Bohrung der Kapillare 11 gebracht und diese Flüssigkeit
mit niedrigem pH-Wert und hohem Salzgehalt durch die Kapillare geführt wird, um die Bohrungsbeschichtung für den nächsten
Test zu regenerieren. Danach würde das Verfahren mit einer anderen Probe aus Schwenktisch 59 wiederholt werden.
Mit der gezeigten Anordnung kann der Elektrolyt auch gleichzeitig
aus den Kammern 12 und 13 via Ventile 66 und 67, Pumpe 68, Ventil- 69'und Abfallbehälter 71 entfernt werden. Auf ähnliche
Weise können Kammern 12 und 13 gleichzeitig mit sauberem Elektrolyt aus Behälter 72 durch die gleiche Serie von
Ventilen und Pumpe nachgefüllt werden.
Die Sensitivität und Stabilität kann verbessert werden, wenn
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"" I ο —
man Protein oder ein anderes biologisches Material an
durch
die Oberfläche bindet, wie beispielsweise/Kupplungsagentien,
wie sie in der US-PS 3 519 539 beschrieben werden. Ähnliche Versuche, biologisches Material (z.B.
irgendein Proteinmaterial mit reaktiven primären Aminogruppen) an die Glasoberfläche zu bringen, wurden von P.J.
Robinson et al in seinem Artikel "Porous glass as a Solid Support for Immobilization or Affinity Column Chromatography
of Enzymes", Biochim. Biophys. Acta 242 (1971) S. 659-661 und von H.H. Weetall in seinem Artikel "Storage Stability
of Water-insoluble Enzymes Covalently Coupled to Organic and Inorganic Carriers", Biochimica, Biophysica Acta 212
(1970) S. 1-7 beschrieben. Bei beiden Verfahren besteht der erste Schritt im Aufbringen von 3-Aminopropyltriäthoxysilan
(APTES) auf Glas unter Zurücklassung einer endständigen
im Artikel beschriebenen
Aminogruppe. Bei dernYkobinson-Y'' Verfahren wird dann das
Säurechlorid von. p-Nitrobenzoesäure mit der endständigen
Aminogruppe reagiert. Die Arylnitrogruppe wird reduziert und zu einem Aryldiazoniumsalz diazotiert. Das Aryldiazoniumsalz
wird dann mit den freien Aminogruppen der letztlich entstehenden Proteinschicht gekuppelt, wobei eine kovalente
Kupplung bis zurück zum Glas erfolgt. Das zweite, einfachere
Verfahren verwendet Glutar dialdehyd, um eine kuppelnde
Brücke zwischen der Aminogruppe vom APTES und den Aminogruppen vom Protein herzustellen. Diese Bindungen sind in einem wässrigen
Medium weniger beständig als die Azokupplungen, sind
jedoch besser als die physikalische Adsorption.
Die oben beschriebenen Verfahren (Robinson et al und Weetall)
sind nur zwei von vielen Verfahren, die dazu verwendet werden können, um Proteine oder anderes biologisches Material an
409884/1319
die Oberfläche von einem elektrokinetischen Strömungs-.system-Durchflussweg
zu binden. Das Substrat-Material kannn auch variieren (Polymere, Keramik, Metalle, Gele), Glas
ist nur ein Beispiel, Deshalb kann das Substratmaterial so ausgewählt und geändert werden, dass es für die Kupplungs-
fähigkeits ■ ■ .
und Leistungs/.erfordernisse .am besten . geeignet ist.
und Leistungs/.erfordernisse .am besten . geeignet ist.
Das in Fig. 9 schematisch gezeigte Autotitrationssystem
des
wird verwendet, um den pH-Wert/Elektrolyten in den Kammern
wird verwendet, um den pH-Wert/Elektrolyten in den Kammern
• ier 12 und 13 von Detektor 10 kontrollbar zu variieren, um
die Daten für die charakteristischen Kurven, wie sie in den Fig. 3 bis 7 gezeigt werden, zu ergeben.
Um eine pH-Titrationsabtastung zurErhaltung der Daten
durchzuführen, werden Ventile 81 und 82 so eingestellt,
dass Kammern 12 und 13 in Durchflussverbiridung mit
Abfallgefäss 83 kommen. Ein Vakuum wird in Gefäss 83 erzeugt und der Elektrolyt wird gleichzeitig aus den Gefässen
12 und 13 abgezogen.
Titrationsgefäss 84 wurde vorher mit sauberem, gepuffertem Elektrolyten aus Vorratsgefäss 86 gefüllt, indem man Luftdruck
darauf ausübte und Ventil 87 richtig einstellte. Gefäss 84 ist gross genug, um ein Elektrolytvolumen zu halten, das
den Elektrolytvolumen in beiden Gefässen 12 und 13äquivalent ist. Dagegen muss im Gefäss 84 der pH-Wert des Elektrolyten
Luftdruck eingestellt werden. Somit wird bei Anwendung von / auf
jdas Innere des Gefässes 84 reiner, pH-eingestellter Elektrolyt /das Ventil 88 gleichzeitig in die Gefässe 12 und 13 geführt
(Ventile 87, 81 und 82 müssen dabei richtig eingestellt sein).
Während der pH-Einstellung wird Radiometer 89 £ pH-Meter
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wie er von Radiometer Corporation, Kopenhagen hergestellt
wird_/ auf" den gewünschten pH-Wert eingestellt, damit wird elektrische Pumpe 91 automatisch angestellt und pumpt die
erforderliche Menge an Säure aus Behälter 92 in den im Gefäss 84 befindlichen Elektrolyten. Der Inhalt von Gefäss 84
wird mit Hilfe von Rührer 93 homogenisiert, während die Änderung des pH-Wertes durch pH-Sensor 94 verfolgt wird. Wenn
der pH-Wert sich dem in Radiometer 94 festgesetztenfwert nähert,
wird Pumpe 91 langsamer und, sobald der pH-Wert erreicht ist, bleibt die Pumpe stehen.
Wenn die überführung des pH-eingestellten Elektrolyten in · Gefässe 12 und 13 abgeschlossen ist, werden Ventile 81 und
82 geschlossen und das oben beschriebene V.erfahren wird durchgeführt, wobei die Gleichstrom- Spannung
( Strömungsatrom) des Überzuges der Kapillarbohrung bei
dem neuen pH-Wert bestimmt wird.
Nachdem die Abtastung von Ablesungen bei einer Serie von pH-Werten
vollständig war, der Elektrolyt verworfen und durch gepufferten Elektrolyten (pH 7,0)ersetzt wurde, wurde die
Gleich strom-Spannung für den gleichen Überzug nochmals bestimmt,
um den Wert mit der ursprünglichen Ablesung bei dem pH 7,0 zu vergleichen. Einige Proteine, die als Überzüge
auf Bohrungsoberflächen aus bestimmten Materialien aufgetragen wurden, zeigten geringe Abweichungen von den ursprünglichen
Ablesung^nach der Wiedereinführung des Puffers, während andere beträchtliche Abweichungen zeigten. Wenn die Abweichung
beträchtlich ist, wird die Titration wiederholt. Albumin an ODTCS ist recht gut reproduzierbar und GP an ODTCS ist bemerkenswert
gut reproduzierbar. In den Fällen, bei denen eine
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andere Kurve bei Wiederholung der Titration erhalten wurde,
sind zwei (öder mehrere) Kurven zur Identifizierung des biologischen
Materials vorhanden.
Grundsätzlich .dient das erfindungsgeniässe Verfahren zur
Charakterisierung von biologischem Material (z.B. dessen Identifizierung, dessen Adsorption am Substrat, dessen Wechselwirkung
mit einem Substrat und dergleichen)- Der Ausdruck "Reaktion" wie er hierin verwendet wurde, betrifft sowohl
physikalische als auch chemische Wechselwirkungen.
409884/1319
Claims (1)
- Patentansprüche1.) Vorrichtung zum Nachweisen elektrokinetischer Ströme, gekennzeichnet durch eine Kombination aus:a) einem Paar Elektrolytkammern mit elektrisch nicht leitenden Wandstrukturen,b) einer Vorrichtung zum Verbinden der Kammern zur Schaffung einer Durchflußverbindung durch eine Durchflußbegrenzung ζ w is ehe η ihnen,c) eine erste reversible Elektrode, die in die erste der Kammern hineinragt und die außerhalb dieser ersten Kammer elektrisch angeschlossen werden kan,d) eine zweite reversible Elektrode, die in die zweite Kammer hineinragt und die außerhalb dieser zweiten Kammer elektrisch angeschlossen werden kann, unde) eine Vorrichtung in Durchflußverbindung mit der ersten und zweiten Kammer, mit der gleichzeitig Druck In der ersten und Unterdruck in der zweiten Kammer und dann umgekehrt gleichzeitig Druck in der zweiten und Unterdruck in der ersten Kammer angewendet werden kann, wobei die Umkehr der Druck/ Unterdruck-Aktion gemäß einer festgelegten Frequenz erfoLgt,und bei teilweiser Füllung der Kammern mit Elektrolyt ein oszillierender Durchfluß des Elektrolyten durch die Durchflußbegrenzung bewirkt und beibehalten wird.. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Durchflußbegrenzung die Form einer Kapillarrohre hat.Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß eine Vorrichtung vorhanden ist, mit der die Bohrung der Kapillarröhre selektiv von der Durchflußverbindung mit dem offenen Volumen der Kammern isoliert werden kann.409884/13194. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennz e ich net , daß die Vorrichtung zur gleichzeitigen reversiblen Anwendung von Druck und Unterdruck auf die Kammern eine mechanische Antriebsvorrichtung mit pneumatischer Kupplung zu den beiden,Kammern ist.5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennz ei c h η e t , daß die.mechanische Antriebsvorrichtung ein Paar von KoIben/Zylinder-Kombinationen und Antriebsvorrichtungen für die Kolben ist, bei der die Volumen-Verdrängungsgeschwindigkeit für jeden Kolben sinusförmig mit der Zeit variiert.6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennz ei c h. η et , daß die Elektroden mit einem Verstärker verbunden sind, dessen Ausgang mit einer Gleichrichter/Aufzeichnungs-Kombination verbunden ist.7. Vorrichtung nach Anspruch 63 dadurch gekennz e ic h η e t , daß die innere Oberfläche der Durchflußbegrenzung mit einem biologischen Material überzogen ist.8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch' gekennz e ic h η e t , daß die Durchflußbegrenzung auswechsel-' bar ist.9· Vorrichtung nach" Anspruch 83 dadurch gekenn-z e i c h η e t , daß die Durchflußbegrenzung eine Kapillarröhre ist.10. Verfahren zum Charakterisieren eines biologischen Materials, dadurch gekennzeichnet 3 daßa) wenigstens eine Schicht des biologischen Materials auf die innere Oberfläche einer Durchflußbegrenzung aufgebracht wird,0988A/13 19b) ein oszillierender Durchfluß eines flüssigen Elektrolyten durch die Durchflußbegrenzung unter Kontakt mit der Schicht bewirkt wird, wobei die Volumengeschwindigkeit des Durchflusses als Punktion der Zeit variiert und der Elektrolyt einen vorher ausgewählten pH-Wert aufweist und elektrisch mit einem Elektrodenpaar verbunden bleibt, die an beiden Seiten der Durehflußbegrenzung angeordnet sind;c) der durch den oszillierenden Durchfluß des Elektrolyten erzeugte alternierende Strom verstärkt wird,d) der alternierende Strom gleichgerichtet unde) der Wert des resultierenden Gleichstromes aufgezeichnet wird.11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß der Elektrolyt automatisch auf den gewünschten pH-Wert titriert wird.12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß zwei Schichten verschiedener biologischer Materialien aufgetragen werden.13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß die zweite Schicht aus biologischem Material aufgetragen wird, indem man ein Volumen einschließlich der Bohrung der Dui*chflußbegrenzung isoliert und dann das zweite biologische Material in die Bohrung eingeführt wird.m. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichn.et , daß die zwei Schichten eine Antigen-Antikörper-Wechse!wirkung zeigen.15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß der oszillierende Durchfluß turbulent ist.409884/ 13 1916. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß die Oszillationsfrequenz im Bereich von 0,3 bis 2 Hz liegt.17. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß die Volumengeschwindigkeit ,des Durchflusses sinusförmig mit der Zeit variiert.18. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennz ei c h η e t ,daß das Aufbringen des aus wenigstens
einer Schicht bestehenden biologischen Materials durch chemische Bindung'bewirkt wird.19. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennz e ic h η e t , daß die Reihenfolge der Schritte bei
einer Reihe von pH-Werten für den Elektrolyten wiederholt
wird.988.4/1319
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