DE19653494A1

DE19653494A1 - Verfahren zur entkoppelten, direkten, exponentiellen Amplifikation und Sequenzierung von DNA Molekülen unter Zugabe einer zweiten thermostabilen DNA Polymerase und dessen Anwendung

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Publication number: DE19653494A1
Application number: DE19653494A
Authority: DE
Inventors: Svante Dr Paeaebo; Christian Kilger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 1998-06-25
Also published as: US6225092B1; US20040146911A1; EP0854196A1; EP0854196B1; DE69702333D1; DE69702333T2; ATE194015T1; US20020177129A1; JPH10225297A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur entkoppelten, direkten, exponentiellen Amplifikation und Sequenzierung von DNA Molekülen durch die Zugabe einer zweiten thermostabilen DNA Polymerase wie auch auf die Anwendung besagten Verfahrens. Entkoppelte, direkte, exponentielle Amplifikation und Sequenzierung von DNA Molekülen durch die Zugabe einer zweiten thermostabilen DNA Polymerase wird im folgenden als "DEXTAQ" bezeichnet.

Technische Grundlagen

DNA Sequenzbestimmung wie von Sanger et. al. ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) entwickelt, wird für gewöhnlich mit einer T7 DNA Polymerase (Tabor, S. und Richardson, C. C. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080) durchgeführt. Dieses Verfahren erfordert verhältnismäßig große Mengen eines gereinigten, einzelsträngigen DNA Templates. Vor kurzem wurde Cycle Sequencing entwickelt (Murray, V. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 8889). Dieses Verfahren erfordert kein einzelsträngiges Template und erlaubt die Initiierung der Sequenzreaktion mit verhältnismäßig geringen Mengen an Template. Jedoch muß die Template DNA bis zu fast gänzlicher Homogenität gereinigt werden und wird in der Regel entweder mittels Klonierung in Plasmide (Bolivar, F. et. al., (1977) Gene 2, 95-113) und anschließender Plasmidreinigung (Birnboim, H. C. und Doly, J. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) oder mittels Amplifikation durch die PCR hergestellt (Mullis, K. B. und Faloona, F. A. (1987) Methods Enzymol. 155, 335-350).

In einer früheren Entwicklung des Cycle Sequencing, die als "gekoppelte Amplifikation und Sequenzierung" oder "CAS" bezeichnet wird, haben Ruano und Kidd ((1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2815-2819) gezeigt, daß man ein Zweistufenprotokoll verwenden kann, um Sequenzen aus DNA Templates zu generieren. In der ersten Stufe werden 15 PCR Zyklen mit Taq DNA Polymerase in Abwesenheit von Dideoxynukleotiden durchgeführt, um eine ausreichende Menge an Sequenziertemplate herzustellen. In einer zweiten Stufe, in der Dideoxynukleotide hinzugegeben werden, produziert CAS die Sequenz als auch die zusätzliche Amplifikation der Zielsequenz.

In Abwandlung dieses Protokolls wurde gezeigt, daß es möglich ist, geringe Mengen eines ungereinigten PCR Produktes in einem zweistufigen Protokoll zur Sequenzierung zu verwenden, wenn in der zweiten Stufe, wo die Sequenzierung durchgeführt wird, zwei Primer verwendet werden.

US 5,427,911 bezieht sich auch auf gekoppelte Amplifikation und Sequenzierung und offenbart ein Verfahren zur Sequenzierung eines DNA Segments, das den Schritt der Amplifikation von DNA Segmenten, um eine ausreichende Menge von Template zur Sequenzierung zu erhalten, und den Schritt der simultanen Synthese verkürzter Sequenzprodukte aus besagtem Template DNA Segment durch die nachträgliche Zugabe eines Dideoxynukleotides und eines markierten Primers in die Reaktion umfaßt.

Viele DNA Polymerasen, einschließlich Taq DNA Polymerase, die in gekoppelten DNA Sequenzierungreaktionen verwendet werden, wie oben beschrieben, diskriminieren stark zwischen den ddNTPs und inkorporieren vorzugsweise dNTPs, wenn sie mit einem Gemisch von sowohl ddNTPs als auch dNTPs beschickt werden. Daher erfordert die Optimierung des CAS Prozesses sorgfältige Titration der Dideoxynukleotide.

Da ferner gekoppelte Amplifikation und Sequencing von der Menge der Ausgangs DNA, der Distanz zwischen den beiden Primern und der Konzentrationen und den Verhältnissen der ddNTPs und dNTPs zueinander abhängen, erfordert die Optimierung der gekoppelte Amplifikation und Sequence Reaktionen (CAS), daß die Reaktionen für ein bestimmtes DNA Fragment individuell optimiert werden.

Andere bekannte thermostabile Polymerasen, die für die Sequenzierung verwendet werden, z. B. Thermo Sequenase und Taquenase, tragen eine Mutation, die als "Tabor-Richardson" Mutation (Tabor, S. & Richardson, C. C. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6339-6343) bekannt ist, bei der in der Spalte des Enzymes, welche während der Polymerisation des entstehendes DNA Moleküls verantwortlich ist für die Diskriminierung zwischen der Inkorporation von entweder Deoxynukleotiden oder Dideoxynukleotiden, anstelle eines Phenylalanins ein Tyrosin steht. Derartige Enzyme oder funktionelle Derivate davon haben eine gesteigerte Fähigkeit, Dideoxynukleotide in DNA zu inkorporieren und können dazu verwendet werden, die Uniformität von Bandenintensitäten bei Sequenzierreaktionen zu verbessern.

Diese gesteigerte Fähigkeit, Dideoxynukleotide zu inkorporieren, führt jedoch zu einer reduzierten Produktion von Template DNA ganzer Länge beim Cycle Sequencing, da terminierte Stränge nicht als Template ganzer Länge in darauffolgenden Zyklen verwendet werden können. Es werden daher signifikante Mengen von Ausgangs DNA Template Molekülen benötigt, um eine lesbare DNA Sequenz zu erhalten.

Des weiteren wächst die statistische Wahrscheinlichkeit, daß Kettentermination stattfinden wird, weil ein Dideoxynukleotid in ein entstehendes DNA Molekül inkorporiert wird, in dem Maße, in dem die Distanz zwischen den beiden Primern vergrößert wird, und die Menge an Produkt ganzer Länge wird reduziert.

Daher limitiert die Anwendung einer thermostabilen Polymerase, die eine "Tabor-Richardson" Mutation trägt, nach dem heutigen Stand der Technik, den Abstand, in dem die zwei Primer auf dem zu sequenzierenden DNA Molekül plaziert werden können, was wiederum die Auswahl der Primer, welche in einer gegebenen Sequenzreaktion verwendet werden können, einschränkt.

Daher erfordern die oben beschriebenen Verfahren die Unterbrechung zwischen der ersten Stufe zur exponentiellen Amplifikation der Template DNA, und der zweiten Stufe zur Synthese verkürzter DNA Moleküle, als auch die individuelle Optimierung eines gegebenen DNA Fragments, was mühsam und zeitaufwendig sein kann und zu Fehlern beiträgt, insbesondere beim Sequenzieren großer Mengen von DNA Molekülen oder beim Verarbeiten großer Mengen an Proben in der Klinik oder im Labor oder bei der Sequenzierung rarer Proben für forensische oder archäologische Studien.

Es wäre aus diesem Grunde von Vorteil, ein Verfahren für die Sequenzierung von Nukleinsäuren verfügbar zu haben, das gleichzeitig die exponentielle Amplifikation der Moleküle ganzer Länge und der Moleküle verkürzter Länge in der Reaktion verstärkt, was zu einer Reduzierung der benötigten Menge an Ausgangsnukleinsäuremolekülen führt und keine Unterbrechung des exponentiellen Amplifikationsschrittes und des Sequenzierschrittes erforderlich macht, so daß die gesamte Reaktion schneller und mit weniger Manipulationen durchgeführt werden kann.

Des weiteren wäre es auch von Vorteil, ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen verfügbar zu haben, welches eine Vergrößerung des Abstands erlaubt, in der die beiden Primer auf dem zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekül positioniert werden können, verhältnismäßig unabhängig von der Distanz besagter Primer ist und im allgemeinen keine Optimierung der Reaktionsbedingungen für jedes zu sequenzierende DNA Fragment erforderlich macht.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbessertes, schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen zur Verfügung zu stellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Nukleinsäuresequenzierung zur Verfügung zu stellen, welches gleichzeitig die exponentielle Amplifikation von Molekülen ganzer Länge sowie von Molekülen verkürzter Länge in der Reaktion steigert, was zu einer Reduzierung der Ausgangsmenge an Nukleinsäuremolekülen, die für die Cycling Reaktion erforderlich sind, führt.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen zur Verfügung zu stellen, das in einer ununterbrochenen Art und Weise, in einem einzigen Schritt, in einem einzigen Behältnis, durchgeführt werden kann.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Sequenzierung von Nukleinsäure zur Verfügung zu stellen, das zu einer Vergrößerung des Abstandes führt, in dem die beiden Primer auf dem zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekül positioniert werden können.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Sequenzierung der Nukleinsäure zur Verfügung zu stellen, welches das Signal-Rausch-Ver hältnis spezifischer, korrekt terminierter Moleküle zu unspezifisch terminierten Molekülen erhöht.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Anwendung des Verfahrens der Erfindung zur Sequenzbestimmung in der medizinischen Diagnostik, Forensik und Populationsgenetik zur Verfügung zu stellen.

Weitere Aufgaben der Erfindung gehen aus der Beschreibung für den Fachmann hervor.

Die Thermo-Cycling Reaktion der vorliegenden Erfindung beinhaltet einen ersten Primer und einen zweiten Primer, die dazu dienen, gleichzeitig genügend Template Moleküle ganzer Länge sowie Moleküle verkürzter Länge zu produzieren, die zur Sequenzierung des Nukleinsäuremoleküls beitragen. Entweder ist ein Primer markiert und der andere nicht, oder beide sind unterschiedlich markiert. Außerdem enthält jede Reaktion anfangs das zu sequenzierende Nukleinsäuretemplate sowie eine Pufferlösung und die vier Deoxynukleotide oder Derivate davon und ein Dideoxynukleotid oder ein Derivat davon. Wahlweise kann eine thermostabile Pyrophosphatase zugegeben werden. Vier Reaktionen, jeweils eine zur Bestimmung von jeder Base, werden angesetzt.

Im Gegensatz zu den in der Technik bekannten Verfahren, hat man jedoch nun erstaunlicherweise festgestellt, daß direkte, exponentielle Amplifikation und Sequenzierung durchgeführt werden können, indem man zwei verschiedene Arten von DNA Polymerasen in die anfängliche Cycle Sequencing Reaktion zugibt: Eine erste thermostabile DNA Polymerase und eine zweite thermostabile DNA Polymerase mit einer verminderten Fähigkeit, Dideoxynukleotide zu inkorporieren, im Vergleich zu besagter, erster, thermostabilen DNA Polymerase. Die erste DNA Polymerase produziert hauptsächlich verkürzte Produkte, die während der Zyklen exponentiell akkumulieren und zur Sequenzleiter, die generiert wird, beitragen, wohingegen die zweite DNA Polymerase, die eine verminderte Fähigkeit im Vergleich zu besagter, erster, thermostabilen DNA Polymerase besitzt, Dideoxynukleotide zu inkorporieren, in erster Linie Produkte ganzer Länge produziert, die exponentiell akkumulieren und in darauffolgenden Zyklen sowohl als Template für die Produktion weiterer DNA Stränge ganzer Länge dienen, als auch Templates für Extensionen, die zur Sequenzreaktion beitragen. Somit führt die Kombination der unterschiedlichen Eigenschaften der beiden Polymerasen, d. h. die Fähigkeit der ersten DNA Polymerase, effizienter Dideoxynukleotide zu inkorporieren und die Fähigkeit der zweiten DNA Polymerase, effizienter Deoxynukleotide zu inkorporieren, zu einer ausgesprochen gesteigerten Effizienz in der entkoppelten, direkten, exponentiellen Amplifikations- und Sequenzreaktion.

Daher bietet das Verfahren der vorliegenden Erfindung (DEXTAQ) ein Verfahren zur Nukleinsäuresequenzierung, das gleichzeitig die exponentielle Amplifikation von sowohl Molekülen ganzer Länge als auch der von verkürzten Molekülen der Thermo-Cycling-Reak tion steigert und zu einer Reduzierung der Menge an anfänglichen Nukleinsäuremolekülen führt, die für die Reaktion erforderlich sind und auf diese Weise die Sequenzierung von Einzelkopie-DNA-Fragmenten von so geringen Mengen, wie ca. 60 ng genomischer DNA, ermöglicht.

Da außerdem alle Reagenzien, die für die exponentielle Amplifikation, sowohl der Fragmente ganzer Länge als auch der verkürzten Fragmente, in dem anfänglichen Reaktionsgemisch vorhanden sind, erzielt das Verfahren der vorliegenden Erfindung (DEXTAQ) die gleichzeitige, exponentielle Produktion eines Sequenziertemplates und einer Sequenzleiter in einem einzigen Röhrchen, ohne der Notwendigkeit, die Thermo-Cycling Reaktion zu unterbrechen. Unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Nukleinsäuresequenz in einem einzigen Schritt zu bestimmen.

Des weiteren erlaubt das Verfahren der vorliegenden Erfindung (DEXTAQ) die Vergrößerung des Abstandes, in dem die beiden Primer auf dem Template-Nukle insäuremolekül positioniert werden können.

Somit werden die oben beschriebenen Aufgabe und die Zielsetzung der vorliegenden Erfindung dadurch gelöst, indem eine Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen in einer Thermo-Cycling-Reaktion zur Verfügung gestellt wird, welches anfänglich ein Nukleinsäuremolekül, einen ersten Primer, einen zweiten Primer, einen Reaktionspuffer, eine erste thermostabile DNA Polymerase, Deoxynukleotide oder deren Derivate, und ein Dideoxynukleotid oder ein Derivat davon beinhaltet und dadurch gekennzeichnet ist, daß die Thermo-Cycling-Reaktion zusätzlich eine zweite thermostabile DNA Polymerase beinhaltet, die im Vergleich zu besagter erster, thermostabilen DNA Polymerase, eine verminderte Fähigkeit hat, Dideoxynukleotide zu inkorporieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß jede Thermo-Cycling-Reaktion zur Bestimmung der Position von A, G, C und T in besagtem DNA Molekül in einem einzigen Schritt, in einem einzigen Behältnis, Gefäß oder Röhrchen durchgeführt wird.

Als thermostabile, erste DNA Polymerase wird die Verwendung einer DNA Polymerase bevorzugt, die in dem Puffer oder unter den Bedingungen die für das Thermo-Cycling verwendet werden, im Vergleich zu Wild-Typ Taq DNA Polymerase eine verminderte Diskriminierung zwischen den vier ddNTPs hat. Noch bevorzugter wird eine DNA Polymerase verwendet, welche eine "Tabor-Richardson" Mutation trägt oder ein funktionelles Derivat hiervon, welche auch keine 5'-3' Exonucleaseaktivität hat, wie z. B. AmplitaqFS^TM (Taq DNA Polymerase (-exo5'-3') (F667Y), Tabor und Richardson (1995), loc. cit.), Taquenase^TM (Taq DNA Polymerase Δ235 (-exo5'-3') (F667Y), Tabor und Richardson (1995), loc. cit.) und ThermoSequenase^TM (Taq DNA Polymerase (-exo5'-3') (F667Y), Tabor und Richardson (1995), loc. cit.) sowie Gemische hiervon oder andere DNA Polymerasen und Gemische davon, welche thermostabil sind, können ebenso in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Verwendung von Thermosequenase oder irgend einer anderen DNA Polymerase, die eine große Fähigkeit besitzt, ddNTPs zu inkorporieren, wird im Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.

Als thermostabile, zweite DNA Polymerase mit verminderter Fähigkeit Dideoxynukleotide im Vergleich zu besagter erster, thermostabiler DNA Polymerase zu inkorporieren wird die Verwendung einer DNA Polymerase bevorzugt, welche keine "Tabor-Richardson" Mutation trägt, wie z. B. Taq DNA Polymerase, Tth DNA Polymerase, Klentaq (Taq DNA Polymerase (-exo5'-3'), Korolev et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9246-9268.

Die Verwendung von Taq DNA Polymerase im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird besonders bevorzugt.

Die vorliegende Erfindung bietet auch die Möglichkeit, drei oder mehr DNA Polymerasen in diesem Verfahren zu verwenden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das Verhältnis besagter Primer bevorzugt größer als 1 : 1, bevorzugter noch zwischen etwa 2 : 1 zu etwa 3 : 1 und am bevorzugtesten 2 : 1.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung haben besagte Primer eine solche Länge, so daß das Signal-Rausch-Verhältnis der spezifischen verkürzten DNA Molekülen gegenüber den unspezifischen DNA Molekülen groß genug ist, um das Lesen der Sequenz nicht substantiell zu verhindern. Bevorzugterweise haben besagte Primer eine Länge von mindestens 18 Nukleotiden.

Die Synthese von Primern kann mittels dem Stand der Technik bekannten Verfahren geschehen. Es können z. B. Primer unter Anwendung bekannter Verfahren synthetisiert werden, die die Stabilität oder Funktion besagter Primer während des Nukleinsäuresequenzierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung nicht signifikant verändern.

Ferner werden die PNA-DNA Hybrid-Oligonucleotide (siehe Finn, P. J. et al., N.A.R. 24, 3357-3363 (1996), Koch, T. et al., Tetrahedron Letters, 36, 6933-6936 (1995), Stetsenko, D. A., et al., Tetrahedron Letters 37, 3571-3574 (1996), Bergmann, F et al., Tetrahedron Letters 36, 6823-6826 (1995) und Will, D. W. et al., Tetrahedron 51, 12069-12082 (1995)) ebenfalls als Primer für das erfindungsgemäße Verfahren angesehen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird besagter erster Primer markiert. Des weiteren wird bevorzugt, daß besagter erster Primer und zweiter Primer unterschiedlich markiert sind. Als Einzel- oder differenzielle Markierungsagenzien und Verfahren können jegliche dem Stand der Technik bekannten Agenzien oder Verfahren verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie die Stabilität oder Funktion besagten Primers im DNA Sequenzierungsverfahren der vorliegenden Erfindung nicht signifikant verändern. Zum Beispiel können einzelne und differenzielle Markierungen aus der Gruppe bestehen, die solche Enzyme, beinhaltet wie β-Galaktosidase, alkalische Phosphatase Peroxidase, und Enzymsubstrate, Coenzyme, Farbstoffe, Chromophore, fluoreszente, chemolumineszente und bioluminiszente Markierungen wie FITC, Cy5, Cy5.5, Cy7, Texas-Rot und IRD40 (Chen et al. (1993), J. Chromatog. A 652 : 355-360 und Kambara et al. (1992), Electrophoresis 13: 542-546) Liganden oder Haptene wie z. B. Biotin und radioaktive Isotope wie z. B. ³H, ³⁵S, ³²P, ¹²⁵I und ¹⁴C.

DEXTAQ ist gegenüber verschiedenen Puffern und unterschiedlicher Deoxynukleotid- und Dideoxynukleotidkonzentrationen verhältnismäßig unempfindlich.

Die Anzahl der Thermozyklen kann von etwa 18 bis etwa 50 Zyklen, je nach der Menge an Template DNA und deren Reinheit betragen.

Pufferkomponenten, die verwendet werden können, können Tris-HCl mit einem pH von etwa 9,0 bis 9,5 und einer Konzentration von etwa 10 bis 30 mM, Amoniumsulfat mit einer Konzentration von etwa 10 bis 20 mM, vorzugsweise 15 mM, MgCl₂ mit einer Konzentration von etwa 3,5 bis 5,5 mM, wahlweise etwa 0,05 mM Mercaptoethanol, etwa 0,28% Tween20® und/oder etwa 0,02% Nonidet 40® einschließen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.

Deoxynukleotide können aus dGTP, dATP, dTTP und dCTP ausgewählt werden, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Zusätzlich können auch Derivate von Deoxynukleotiden gemäß der Erfindung verwendet werden, welche als solche Deoxynukleotide definiert sind, die in der Lage sind, durch eine thermostabile DNA Polymerase in wachsende DNA Moleküle inkorporiert zu werden, die in der Thermo-Cycling-Reaktion synthetisiert werden. Solche Derivate schließen Thionukleotide, 7-deaza-2'-dGTP, 7-deaza-2'-dATP sowie Deoxyinosine Triphosphat, das auch als Ersatz Deoxynukleotid für dATP, dGTP, dTTP oder dCTP verwendet werden kann, ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die oben erwähnten Deoxynukleotide und Derivate davon werden bevorzugt bei einer Konzentration von etwa 300 µM bis 2 mM verwendet.

Dideoxynukleotide können aus ddGTP, ddATP, ddTTP und ddCTP ausgewählt werden, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Zusätzlich können auch Derivate von Dideoxynukleotiden gemäß der Erfindung verwendet werden, die als solche Dideoxynukleotide definiert sind, die in der Lage sind, durch eine thermostabile DNA Polymerase in wachsende DNA Moleküle inkorporiert zu werden, die in der Thermo-Cycling-Reaktion synthetisiert werden. Solche Derivate können radioaktive Dideoxynukleotide (ddATP, ddGTP, ddTTP und ddCTP) oder Dideoxynukleotide (ddATP, ddGTP, ddTTP und ddCTP), welche mit FITC, Cy5, Cy5.5, Cy7 und Texas-Rot u. a. markiert sind, einschließen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Bevorzugte Konzentrationen der ddNTPs liegen zwischen etwa 1 und 5 µM.

Das bevorzugte Verhältnis von dNTPs zu ddNTPs (dNTPs : ddNTPs), welches im Verfahren gemaß der Erfindung verwendet wird, liegt zwischen 100 : 1 bis 1000 : 1, bevorzugter zwischen 300 : 1 bis 600 : 1.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird besagtes Verfahren bei einer Temperatur ausgeführt, bei der das Signal-Rausch Verhältnis der spezifischen, verkürzten DNA Moleküle gegenüber den unspezifischen DNA Molekülen groß genug ist, um das Lesen der Sequenz nicht substantiell zu behindern. Bei menschlichen Einzelkopie DNA Sequenzen reduziert eine höchst mögliche Annealingtemperatur den Hintergrund drastisch. Hierfür werden die Annealing- und Syntheseschritte der Thermo-Cycling-Reaktion bei einer Temperatur von mindestens 55°C, vorzugsweise bei 66°C, und am meisten bevorzugt bei mindestens etwa 68°C ausgeführt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung kann das zu sequenzierende Nukleinsäuremolekül als gesamtgenomische DNA vorliegen, die sich vorzugsweise in einem unklonierten oder ungereinigten Zustand befindet. Vorzugsweise hat die genomische DNA eine Länge von mehr als oder gleich 2 kb. DEXTAQ funktioniert gut mit etwa 60 ng gesamtgenomischer DNA, funktioniert aber auch mit geringeren Mengen an DNA, wenn Multikopiefragmente analysiert werden. Andere Formen von DNA, die als Template verwendet werden können, beinhalten gereinigte, partiell gereinigte oder ungereinigte klonierte DNA, wie z. B. ungereinigte Plasmid DNA aus bakteriellen Kolonien und klonierte oder unklonierte mitochondriale DNA u. a. Des weiteren ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung verhältnismäßig unabhängig von der Basenzusammensetzung des Templates.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung kann das zu sequenzierende Nukleinsäuremolekül als RNA vorliegen. Ein Gemisch von zwei Polymerasen wird verwendet: Eine erste DNA Polymerase gemäß der Erfindung z. B., die eine "Tabor-Richardson" Mutation enthält oder ein funktionelles Derivat hiervon, wie ThermoSequenase, und eine zweite DNA Polymerase mit der Fähigkeit, RNA in DNA revers zu transkribieren und der Fähigkeit als PCR Enzym zu fungieren. Als eine zweite DNA Polymerase für das Verfahren der Erfindung, in welcher RNA als Template verwendet wird, kann jede thermostabile DNA Polymerase verwendet werden, die reverse Transkriptaseaktivität besitzt. Bevorzugterweise wird Taq DNA Polymerase (Jones et al., Nucl. Acids Res. 17: 8387-8388 (1989) oder Tth DNA Polymerase (Myers et al., Biochemistry 30: 7666-7672 (1991)), und noch bevorzugter Tth DNA Polymerase verwendet. Tth Polymerase revers transkribiert das RNA Template in DNA, welche dann von beiden Enzymen verwendet werden kann: Tth Polymerase wird primär Produkte ganzer Länge erzeugen, welche als Template dienen können, und ThermoSequenase wird verkürzte Produkte (ddNTP Inkorporation) und dadurch eine Sequenzleiter erzeugen.

Geeignete Puffer schließen jene, die in: Myers et. al. (1991) Biochemistry 30: 7666-7672 beschrieben sind, ein. Der folgende Puffer kann für beide Polymerasen verwendet werden und garantiert die Funktion beider Polymerasen: 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 40 mM KCl, 1 mM MnCl₂. Eine reverse Transkription unter Verwendung eines Reaktionspuffers und wahlweise MgCl₂ bei einer Konzentration von etwa 1 mM bis 5 mM und die auch beide Polymerasen, beide Primer und Nukleotide, umfaßt, wird einem Inkubationsschritt (15 Minuten bei 70°C) unterzogen. Danach wird die MgCl₂ Konzentration auf zwischen 1 mM und 5 mM eingestellt und eine DEXTAQ Reaktion durchgeführt.

Als Lieferant für Nukleinsäuremoleküle im erfindungsgemäßen Verfahren sind Körperflüssigkeiten wie Samen, Urin, Blut oder Fraktionen dessen, Haare, eine einzelne Zelle, Zellen oder Fraktionen davon, hartes Gewebe wie Knochen und weiches Gewebe oder Fraktionen davon und Zellkulturen oder Fraktionen davon, geeignet.

Vorliegende Erfindung stellt auch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines gegebene Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung, z. B. zur Sequenzierung mit 2 Markierungen von Shotgun Genbanken bei Genomprojekten großen Umfangs und in der medizinischen Diagnostik, der Forensik und der Populationsgenetik. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann zur Detektion genetischer Mutationen oder Polymorphismen, zur Identifizierung des Ursprungs der sequenzierten Nukleinsäure oder zur Detektion der Anwesenheit fremder oder infektiöser Agenzien in einer Probe verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf alle Kombinationen aller Verfahrensweisen der obigen Verfahren.

Die Sequenzreaktionen können nach Vorbereitung direkt auf ein Sequenzgel aufgebracht werden, wie z. B. nach der Zugabe eines gewöhnlicherweise verwendeten Aufgabepuffers (z. B. Formamid, das 20 mM EDTA (pH 7,4) und 6 mg/ml Dextran Blau enthält) und Denaturierung (z. B. bei 96°C für 4 Minuten). Die Sequenzleiter kann in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren gelesen werden. Das Verfahren der Erfindung ist gut für die Automatisierung geeignet. Da die zwei Primer in der Reaktion unterschiedlich mit Markierungen versehen sein können, die z. B. mit zwei verschiedenen Wellenlängen detektiert werden können, erlaubt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die gleichzeitige Sequenzierung beider Stränge eines Templates und die Detektion beider Reaktionen in einer oder mehreren Gelspuren. Generell können viele DEXTAQ Reaktionen, die mit unterschiedlichen Farbstoffen durchgeführt werden, gleichzeitig in den gleichen Röhrchen gemacht werden und auf eine Sequenziermaschine aufgegeben werden, die mit mehreren Lasern ausgestattet ist, oder mittels anderer Methoden detektiert werden, wie z. B. Autoradiographie.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Fig. 1 Schematische Darstellung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung (DEXTAQ). Eine erste Polymerase der vorliegenden Erfindung (A), welche eine "Tabor-Richardson" Mutation für die Diskriminierung zwischen ddNTPs trägt, inkorporiert präferenziell ddNTPs und erzeugt die Sequenzleiter. Eine zweite Polymerase der vorliegenden Erfindung, die im Vergleich zu besagter erster thermostabilen DNA Polymerase (B) eine verminderte Fähigkeit aufweist, Dideoxynukleotide zu inkorporieren, inkorporiert vorzugsweise dNTPs und erzeugt hauptsächlich Produkte ganzer Länge und versorgt die entkoppelte, direkte, exponentielle Amplifikation und Sequenzreaktion mit zusätzlichem Sequenziertemplate.

Fig. 2 60 ng von gesamtgenomischer DNA wurden einer direkten, entkoppelten Sequenzierreaktion unterzogen unter Verwendung von 6 pmol eines FITC markierten Primers (CCR5-2) und 3 pmol eines unmarkierten Primers (CCR5-1). Der in allen Fenstern dargestellte Abschnitt ist lediglich 20 Basenpaare vom Ende des Templates entfernt und die letzten Basen sind Teil des zweiten Template erzeugenden Primers. Keine zusätzliche Taq DNA Polymerase wurde der Reaktion beigegeben, die im Fenster A gezeigt wird. Zunehmende Mengen an Taq DNA Polymerase wurden den Reaktionen hinzugegeben, die in Fenster B (0,25 units), C (0,5 units), D (1,0 units) und E (2,0 units) gezeigt sind. Die A.L.F. Software war in Fällen, wo keine Taq DNA Polymerase zugegeben worden war, nicht in der Lage, eine Sequenz zu prozessieren. Ein besseres Verhältnis zwischen Signal und Rauschen ist in den Fällen sichtbar, wo Taq DNA Polymerase zugegeben worden war.

Fig. 2A 60 ng von gesamtgenomischer DNA wurden einer entkoppelten, direkten Amplifikation- und Sequenzierreaktion unterzogen unter Verwendung equimolarer Mengen, d. h. jeweils 3 pmol eines FITC markierten Primers (CCR5-2) und eines unmarkierten Primers (CCR5-1). Die A.L.F. Software war in der Lage, 290 Basen zu prozessieren. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von 0,25 units Taq DNA Polymerase und Standard ThermoSequenase Reagenzien durchgeführt.

Fig. 3 Eine entkoppelte, direkte, exponentielle Amplifikations- und Sequenzreaktion wurde in Kombination mit unterschiedlichen thermostabilen Polymerasen, welche die "Tabor-Richardson" Mutation nicht tragen, durchgeführt. Fenster "A" zeigt eine Reaktion, bei der 2,5 units Klentaq Polymerase zu einer direkten, entkoppelten Amplifikation- und Sequenzierreaktion zugegeben wurden, welche mit 60 ng gesamtgenomischer DNA durchgeführt wurde. Fenster "B" zeigt eine direkte, entkoppelte, exponentielle Amplifikations- und Sequenzierreaktion, die mit standard Taq DNA Polymerase durchgeführt wurde, und Fenster "C" eine Reaktion, bei der 0,25 units Tth Polymerase zugegeben wurden.

Fig. 4 300 ng von gesamtgenomischer menschlicher DNA wurden einer direkten, entkoppelten Amplifikation- und Sequenzierreaktion unter Verwendung nicht-equimolarer Mengen von Primern unterzogen, d. h. 6 pmol eines FITC markierten Primers (CCR5-2) und 3 pmol eines unmarkierten Primers (CCR5-3). Die Primer umspannen eine Region von 560 Basenpaaren des menschlichen Einzelkopiegens CCR5. Die A.L.F. Software war in der Lage, 260 Basen zu prozessieren. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von 0,25 units Taq DNA Polymerase und Standard ThermoSequenase Reagenzien durchgeführt.

Fig. 5 4 µl eines Bakterienkolonielysates wurden einer direkten, entkoppelten Amplifikation- und Sequenzierreaktion unter Verwendung nicht-equimolarer Mengen an differenziell markierten Primern unterzogen, d. h. 6 pmol eines FITC markierten Primers (universal) und 3 pmol eines Cy5 markierten Primers (reverse). Die Primer umspannen eine Region von 650 Basenpaaren des Plasmidinserts. Die A.L.F. Software war in der Lage, 502 Basen für den FITC markierten Primer zu prozessieren. Die Abbildung zeigt die Kurvenergebnisse im Falle des FITC markierten Universal Primers. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von 0,25 units Taq DNA Polymerase und Standard ThermoSequenase Reagenzien durchgeführt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird näher durch die folgenden nichteinschränkenden Beispiele genauer beschrieben.

Beispiel 1 Template Präparation

Gesamtgenomische DNA wurde ausgehend von 2 ml Blutproben unter Verwendung eines Schnellreinigungskits (Cambridge Molecular Technologies Ltd., Cambridge, UK) präpariert. Gereinigte DNA wurde in ddH₂O auf eine Konzentration von 175 ng pro µl verdünnt.

Sequenzierreagenzien und Bedingungen

Unmarkierte und FITC-markierte Oligonukleotide wurden mit einem ABI DNA/RNA Synthesizers, Model 392 synthetisiert. Cy5 markierte Oligonukleotide wurden von der Firma Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland) bezogen. Die folgenden Oligonukleotide wurden verwendet: (CCR5-1), 5'-GGC TGG TCC TGC CGC TGC TTG TCA T-3'; (CCR5-2) 5'-CTG CTC CCC AGT GGA TCG GGT GTA AAC-3'; (CCR5-3) 5'-CAC CTT TGG GGT GGT GAC AAG TGT OAT-3' (Samson, M. et al., Biochemistry 35 (11), 3362-3367 (1996)), (universal Primer) 5'-CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3' und (revers) 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3' (Pharmacia Biotech). Direkte, exponentielle Amplifikations- und Sequenzierreaktionen wurden unter Verwendung von Thermosequenasereagenzien (2) durchgeführt. Ein 24 µl Gemisch bestehend aus 6 pmol eines FITC-markierten und 3 pmol eines unmarkierten, 6 pmol eines FITC-markierten und 3 pmol eines Cy5-markierten, oder 3 pmol eines FITC-markierten und 3 pmol eines unmarkierten Primers, gesamtgenomischer DNA (0,5 bis 8 µl mit einer Konzentration von 120 ng/µl) und zusätzlicher Polymerase, sofern erforderlich (0,1 bis 2 µl, je nach unit Definition), wurden angesetzt und Aliquote von je 6 µl wurden zu 2 µl Thermosequenase Terminationsmix gegeben. Die Sequenzreaktionen wurden in einem Thermocycler mit heizbarem Deckel durchgeführt (MJ-Research, Watertown, MA). Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 5 µl Formamid (20 mM EDTA (pH 7,4) und 6 mg/ml Dextran Blau) gestoppt, worauf eine Denaturierung von 4 Minuten bei 95°C folgte. Die Sequenzreaktionen wurden auf einem A.L.F. (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) analysiert. In allen Fällen wurden HydroLink Long Ranger^TM (FMC, Rockland, ME) Gele und 30 cm Glasplatten verwendet. Die Gelbedingungen entsprachen den Empfehlungen des Herstellers.

Beispiel 2

Zwei Oligonukleotide mit einer Länge von 25 und 27 Nukleotiden, welche 382 Basenpaare des CCR5 Gens umspannen, wurden synthetisiert. Eines der beiden Oligonukleotide wurde am 5'-Ende mit Flurescein (CCR5-2) markiert, wohingegen das andere (CCR5-1) nicht markiert war. Zwei Reaktionen wurden angesetzt, wobei jede 6 pmol des markierten und 3 pmol des unmarkierten Primers, 500 ng gesamtgenomische DNA und ThermoSequenase Reagenz, welches aus Enzym, Reaktionspuffer und Deoxy- und Dideoxygemische bestand, enthielt. Eine der beiden Reaktionen wurde mit 2,5 units von Standard Taq Polymerase versehen. Die Reaktionen wurden bei 95°C für 3 Min. inkubiert, um eine vollständige Denaturierung der Template DNA zu ermöglichen. Danach wurden 45 Zyklen, bestehend aus jeweils 30 Sek. bei 68°C und 40 Sek. bei 95°C, durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von Formamid und Erhitzung auf 95°C für 4 Min. gestoppt und denaturiert, ehe sie auf eine A.L.F. Sequenzierapparatur aufgegeben wurden.

Wo keine zusätzliche Taq DNA Polymerase zugegeben worden war, war der A.L.F. in der Lage, 344 Basen zu prozessieren. Wenn hingegen 0,25 units Taq Polymerase der direkten, exponentiellen Amplifikations- und Sequenzierreaktion zugegeben wurden, wurden 351 Basen ermittelt. Eine visuelle Analyse der A.L.F. Kurven zeigte, daß dort, wo Taq DNA Polymerase zugegeben worden war, sich die Signal Intensität verbesserte. Außerdem wurden die vielen Stops am Anfang des Laufs, welche typisch sind für die direkte, exponentielle Amplifikations- und Sequenzierreaktion weitgehend an Intensität reduziert und die Signalstärke blieb gleichbleibend hoch in Richtung auf den amplifizierenden Primer, wohingegen, wo keine Taq DNA Polymerase zugegeben worden war, das Signal nach 200 Basenpaaren schwächer erschien. Das Signal am Ende des Laufs, das dem Produkt ganzer Länge entspricht, war stärker in der Reaktion, wo Taq DNA Polymerase zugegeben worden war.

Beispiel 3

Um die Entdeckung zu bestätigen, daß zusätzliche Taq DNA Polymerase in der Lage ist, den exponentiellen Faktor zu verstärken und den Hintergrund zu reduzieren und auch um die Menge an Taq DNA Polymerase zu bestimmen, die für einen optimalen Effekt benötigt wird, wurde eine verringerte Menge an Template DNA in Verbindung mit variierenden Mengen an Taq DNA Polymerase verwendet. Fünf Reaktionen wurden angesetzt, wobei jede 120 ng gesamtgenomischer DNA, 6 pmol des markierten und 3 pmol des unmarkierten Primers und ThermoSequenasereagenz enthielten. Bei einer Reaktion wurde keine zusätzliche Taq Polymerase hinzugegeben. Bei den anderen 4 Reaktionen wurden jeweils 0,25, 0,5, 1,0 und 2,0 units Taq Polymerase hinzugegeben. Um eine mögliche Auswirkung durch den Taq Polymerase Aufbewahrungspuffer auszuschließen, wurde der Aufbewahrungspuffer jener Reaktion zugegeben, welcher keine Polymerase zugegeben worden war. Die Reaktionen wurden den oben beschriebenen Zyklen unterworfen.

Wo keine Taq DNA Polymerase zugegeben worden war, war der A.L.F. Manager nur in der Lage, ein paar Basen zu prozessieren und die Signalintensitäten waren zu niedrig, um als nützlich für die Routinesequenzierung erachtet zu werden. Wo 0,25 units und 0,5 units zugegeben worden waren, war der A.L.F. Manger in der Lage, jeweils 374 Basen und 364 Basen zu prozessieren. Wo 1 unit Taq Polymerase zugegeben worden war, wurden 226 Basen durch den A.L.F. Manger ermittelt.

Die Reaktionen wurden unter identischen Bedingungen wiederholt, jedoch unter Verwendung einer sogar noch geringeren Menge genomischer DNA. 60 ng Template DNA wurden mit variierenden Mengen an Taq DNA Polymerase sequenziert. Kein Signal war detektierbar, wo keine Taq Polymerase zugegeben worden war, jedoch war der A.L.F. Manger erneut in der Lage, die Sequenz in den Fällen, wenn zwischen 0,1 und 0,4 units Taq Polymerase zugegeben worden waren (Fig. 2) zu prozessieren.

Beispiel 4

Von den thermostabilen Polymerasen mit fehlender "Tabor-Richardson" Mutation wurde eine Anzahl verschiedener Polymerasen im Hinblick auf ihre Wirkung auf die direkte, exponentielle Amplifikations- und Sequenzreaktion getestet. Tth Polymerase, Klentaq (U.S. Patent No. 5, 436, 149, Korolev, S., et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9264-9268), Sequitherm® und Standard Taq DNA Polymerase wurden mit 60 ng gesamtgenomischer DNA gecycled. Es wurden unterschiedliche Unitmengen für alle Polymerasen von zwischen 0,25 bis 25 units (im Falle von Klentaq) getestet (Fig. 3). Beste Ergebnisse wurden mit Taq DNA Polymerase erzielt.

Beispiel 5

Um zu testen, ob DEXTAQ auf Einzelkopie DNA Sequenzen angewendet werden kann, wenn Primer in einem Abstand von über 500 Basenpaaren Entfernung zueinander positioniert sind, wurden 300 ng gesamtgenomischer, menschlicher DNA einer entkoppelten, direkten, exponentiellen Amplifikations- und Sequenzreaktion unter Verwendung nicht-equimolarer Mengen eines FITC markierten und eines unmarkierten Primers (6 pmol: 3 pmol), die eine Region von 560 Basenpaaren des menschlichen Einzelkopiegens umspannen, unterzogen. Gute Sequenzkurven wurden auf eine Länge von etwa 300 Basenpaaren erhalten (Fig. 4).

Beispiel 6

Um zu testen, ob DEXTAQ auch auf die Plasmidsequenzierung von rohen, bakteriellen Lysaten angewendet werden kann, und um zu prüfen, ob DEXTAQ unter Anwendung zweier differentiell markierter Primer durchgeführt werden kann, wurden 4 µl eines bakteriellen Kolonielysats einer entkoppelten, direkten, exponentiellen Amplifikations- und Sequenzreaktion unter Verwendung nicht-equimolarer Mengen differentiell markierter Primer unterzogen, d. h. 6 pmol eines FITC markierten Primers (universal) und 3 pmol eines Cy5 markierten Primers (reverse). Die Primer umspannen eine Länge von 650 Basenpaaren des Plasmidinserts. Die A.L.F. Software war in der Lage, im Falle des FITC markierten Primers, 502 Basen zu prozessieren (Fig. 5).

Claims

1. Verfahren zur Sequenzierung eines Nukleinsäuremoleküls in einer Thermocycling Reaktion, die anfänglich ein Nukleinsäuremolekül, einen ersten Primer, einen zweiten Primer, einen Reaktionspuffer, eine erste thermostabile DNA Polymerase, Deoxynukleotide oder Derivate davon und mindestens ein Dideoxynukleotid oder ein Derivat davon beinhaltet, und dadurch gekennzeichnet ist, daß die Thermocycling Reaktion zusätzlich eine zweite thermostabile DNA Polymerase enthält, welche im Vergleich zu besagter erster thermostabilen DNA Polymerase eine reduzierte Fähigkeit besitzt, Dideoxynukleotide zu inkorporieren.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Verfahren in einem Schritt, in einem einzigen Behältnis, Gefäß oder Röhrchen durchgeführt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte thermostabile Polymerase in dem Puffer oder unter den Bedingungen, die für Thermo-Cycling verwendet werden, im Vergleich zu Wild-Typ-Taq DNA Polymerase eine verminderte Diskriminierung zwischen den vier ddNTPs hat.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß besagte thermostabile Polymerase eine DNA Taq Polymerase mit einer "Tabor-Richardson" mutation ist, welcher auch die 5'-3, Exonukleaseaktivität fehlt, oder ein funktionelles Derivat davon.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß besagte thermostabile Polymerase, Taq DNA Polymerase (-exo5'-3') (F667Y) oder ein funktionelles Derivat davon ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß besagte zweite thermostabile DNA Polymerase, Taq Polymerase oder ein funktionelles Derivat davon ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis besagter Primer ungleich 1 ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis besagter Primer etwa 2 : 1 ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß besagter erster Primer markiert ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß besagter erster Primer und besagter zweiter Primer unterschiedlich markiert sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die 3, Enden des ersten und des zweiten Primers auf dem DNA Template in einem Abstand, der größer als oder gleich 500 Basen ist, positioniert sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Annealing Schritte der Thermocycling Reaktion bei einer Temperatur von mindestens etwa 55°C durchgeführt werden

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Thermocycling Reaktion zusätzlich eine thermostabile Pyrophosphatase enthält.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Primer eine Länge von mindestens 18 Nukleotiden haben.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Nukleinsäuremolekül genomische DNA ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Nukleinsäuremolekül RNA ist, besagte erste Polymerase eine thermostabile DNA Polymerase mit reverser Transkriptase Aktivität ist.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß besagte erste Polymerase Tth DNA Polymerase oder ein funktionelles Derivat hiervon ist, und die Reaktion in Gegenwart von MnCl₂ oder Mn Acetat durchgeführt wird

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Lieferant der zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle, ein Lieferant ist, ausgewählt aus Körperflüssigkeiten wie Samen, Urin, Blut oder Blutproben, Haaren, einer einzelnen Zelle, Zellen oder Fraktionen davon, Gewebe oder Fraktionen davon und Zellkulturen.

19. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Bestimmung der Sequenz einer Nukleinsäure.

20. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Detektion genetischer Mutationen oder Polymorphismen.

21. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Identifizierung des Ursprungs der sequenzierten Nukleinsäure.

22. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Detektion der Gegenwart fremder oder infektiöser Agenzien in einer Probe.