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Die Erfindung betrifft eine Trennvorrichtung und
ein Trennverfahren für
biomolekulares Probenmaterial, insbesondere Proteingemische nach
dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 bzw. 16.
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Ein Meilenstein der molekularbiologischen Forschung
war die Entschlüsselung
des menschlichen Genoms, d.h. die Sequenzierung der gesamten Erbinformation
des Menschen. Nun fokussiert sich die Forschung auf die Entschlüsselung
der Funktion des Genoms und auf die Genprodukte, die Proteine. Hier
möchte
man möglichst
ein Gesamtbild aller in einer bestimmten Zellpopulation bzw. einem
bestimmten Gewebe exprimierten Proteine. Die Identität und Quantität der Proteine
soll korreliert werden mit einem bestimmten Entwicklungszustand
oder mit dem physiologischen Zustand der Zelle bzw. des Gewebes.
So möchte
man, um einer funktionellen Beschreibung näher zu kommen, ein möglichst
genaues und quantitatives Bild aller Proteine gewinnen. Diese Forschung
der „Post-Genom"-Ära
bezeichnet man auch als Proteomik. Während es sich beim Genom um
eine prinzipiell statische Größe handelt, zeichnet
sich das Proteom eines Lebewesens durch seine von Temperatur, Nährstoffmilieu,
Einwirkung von Stress oder Medikamenten abhängige Veränderlichkeit aus. Es umfasst
demnach die Gesamtheit der Proteine, die von den Genen einer Zelle
oder eines Organismus unter bestimmten Umweltbedingungen in verschiedenen
Wachstumsphasen synthetisiert werden.
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Die Proteomik soll durch die Identifizierung und
Quantifizierung aller Proteine neue Erkenntnisse zur Funktion, Regulation
und Interaktion der Proteine liefern. Insbesondere sollen quantifizierbare
Unterschiede zwischen normalen Zellen und „entarteten", Krebs-Zellen bzw.
Unterschiede im Proteinrepertoire von „krank" und „gesund" aufgezeigt werden. Dies wiederum erlaubt
eine gezielte Suche nach therapeutisch wirksamen Substanzen.
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Um ein Proteom analysieren zu können, wird zunächst die
Gesamtmenge der Proteine in ihre einzelnen Komponenten aufgetrennt,
d.h. es werden die vielen Tausend einzelnen Proteine aus dem Gemisch physikalisch
separiert. Dies geschieht in der Regel durch die so genannte zweidimensionale
(2-D) Elektrophorese. Hierbei werden die Gesamtproteine aus einer
Zellpopulation oder einem Gewebe möglichst quantitativ isoliert.
Gegebenenfalls werden auch bestimmte Fraktionierungsschritte vorgenommen, wenn
man gezielt nur eine bestimmte Fraktion der Gesamtproteine untersuchen
möchte,
z.B. Proteine aus bestimmten Zellorganellen wie den Mitochondrien.
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Dann erfolgt in der ersten Dimension
eine isoelektrische Fokussierung (IEF). Dabei werden die Proteine
in einem speziellen Gel bzw. auf einem festen Träger in einem pH-Gradienten
anhand ihres isoelektrischen Punktes pl aufgetrennt. Die Proteine wandern
im elektrischen Feld und werden an ihrem pl, der für jedes
Protein charakteristisch ist, fokussiert. Dieser erste Schritt der
isoelektrischen Fokussierung erfordert bestimmte Elektrophorese-Geräte zur Aufnahme
von Membranen bzw. „Strips" mit immobilisierten
pH Gradienten bzw. Gele mit Ampholyt-Puffern. Der Prozess der isoelektrischen
Fokussierung dauert viele Stunden (24 bis 48h).
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Nach erfolgter isoelektrischer Fokussierung werden
die Gele bzw. die Membranen üblicherweise aus
der ersten Apparatur entnommen und in einem SDS (Natriumdodecylsulfat)-haltigen
Elektrophorese-Puffer äquilibriert.
Sodann wird jedes Gel, jede Membran in einer zweiten Gelapparatur
auf je ein neues, zweites Gel aufgebracht. Diese zweiten Gele bestehen
aus SDS/Polyacrylamid. Nach Anlegen einer elektrischen Spannung
senkrecht zu dem IEF-Gel wandern die fokussierten Proteine in das zweite
Gel ein und werden dort aufgrund Ihres Molekulargewichtes aufgetrennt.
Diese elektrophoretische Auftrennung kann ebenfalls viele Stunden
dauern (> 16 h).
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Im nächsten Schritt werden die so
aufgetrennten Proteine sichtbar gemacht. Dies geschieht durch einen
Färbeschritt
mit Coomassie Brilliant Blue, kolloidalem Coomassie, Silbernitrat
oder Fluoreszenz-Farbstoffen (SYPRO Red, SYPRO Ruby). Anschließend wird
das gefärbte
Gel – meist
mit einem digitalen Bildaufnahmesystem – photographiert bzw. die gefärbten Spots
dokumentiert. Um eine genauere wissenschaftliche Aussage machen
zu können,
müssen
entweder alle angefärbten
Proteine oder bestimmte, interessierende Proteine (z.B. solche,
die gegenüber
einer Referenz verändert
sind in Position und/oder Quantität) identifiziert und charakterisiert
werden. Dies geschieht normalerweise durch Massenspektroskopische
Verfahren. Am gebräuchlichsten
hierfür
ist die Analyse der Peptidfragmente eines bestimmten Spots durch
MALDI-TOF(Matrix-unterstützte
Laserdesorption/Ionisation-Flugzeit)-Massenspektrometrie. Dazu wird
wiederum eine vielstufige Prozessierung der einzelnen angefärbten Proteinspots
durchgeführt.
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Im ersten Schritt werden die angefärbten Protein-Spots
in möglichst
kleinem Volumen aus dem Gel isoliert. Dies geschieht manuell oder
mit automatischen, Software-gesteuerten Spot-Pickern. Die kleinen
Proteinhaltigen Gelstückchen
(wenige μl
Volumen) werden dann mit einem Puffer inkubiert, der dafür sorgt,
dass SDS und der Farbstoff aus dem Gel entfernt werden. Dann werden
die Gelstückchen
getrocknet, in einem für
Protease-Verdau geeignetem Puffer aufgenommen und mit einer Protease
(in der Regel Trypsin) inkubiert. Diese spaltet die im Gel enthaltenen
Proteine in definierte Fragmente. Anschließend werden die Proteinfragmente
(Peptide) mit Ammoniumbicarbonat aus dem Gel ausgewaschen bzw. eluiert.
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Die aus den einzelnen Gelstücken isolierten Peptide
werden dann separat auf einen Träger
für Massenspektrometrie
aufgebracht und nach Trocknen und gegebenenfalls Rekristallisation
der Massenspektrometrie unterworfen (MALDI-TOF). Die Daten aus der
Massenspektrometrie erlauben durch Vergleich mit geeigneten Datenbanken
die eindeutige Identifizierung des Proteins sowie die relative Quantifizierung
der Menge an Protein.
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Das oben geschilderte Verfahren der „klassischen" 2-D-Elektrophorese
mit Prozessierung für Massenspektrometrie
hat eine Reihe von Nachteilen:
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- – Es
braucht relativ große
Mengen an Gesamtprotein (Milligramm). Diese Mengen sind bei besonders
interessanten Fragestellungen oft nicht verfügbar, z.B. bei der Untersuchung
von Tumorgewebe.
- – Es
ist sehr zeitaufwendig und langwierig.
- – Es
beinhaltet sehr viele, zum Teil nur manuell ausführbare Teilschritte.
- – Es
bedarf einer Vielzahl von Geräten
(IEF-Elektrophorese, SDS-PAGE
Elektrophorese, Stainer, (mager, Spot-Picker, Gelstück-Imkubierer, Trockner,
Pipettierautomat etc.)
- – Es
erlaubt nur die Auftrennung von Proteinen, die der IEF zugänglich sind.
Viele, und gerade besonders interessante Proteinklassen, z.B. Membranproteine/Rezeptoren,
Zellkern- oder DNA-assoziierte Proteine können mit der IEF nicht oder nicht
gut aufgetrennt werden.
- – Der
Gesamtprozess ist nicht gut reproduzierbar.
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Bisher nicht als Produkt oder Prototypen
verfügbar
und testbar, jedoch in der Literatur oder in Patentanmeldungen beschrieben
(
US 6214191 ,
US 5599432 ,
EP 977030 , WO 0058721; Becker et al.,
J. Micromech. Microeng. 1988, 8, 24) wurden Elektrophorese-Chips
zum zweidimensionalen Auftrennen von Proteinen. Zur Weiterverarbeitung
wurden Möglichkeiten
der optischen Detektion beschrieben, jedoch keine dabei erhaltenen
Daten gezeigt. Solche Chips bieten zwar den Vorteil, sehr geringe
Proteinmengen auftrennen zu können.
Dem Fachmann ist aber klar, dass diese sehr kleinen Mengen optisch kaum
noch detektierbar sein werden.
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Ausgehend hiervon liegt der Erfindung
die Aufgabe zugrunde, die im Stand der Technik aufgetretenen Nachteile
zu vermeiden und eine Vorrichtung und ein Verfahren der eingangs
angegebenen Art zu verbessern, so dass auch sehr kleine Probenmengen
mit geringem Handhabungsaufwand in einem automatisierbaren Ablauf
zuverlässig
und mit hoher Genauigkeit verarbeitet bzw. analysiert werden können.
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Zur Lösung dieser Aufgabe wird die
in den unabhängigen
Patentansprüchen
angegebene Merkmalskombination vorgeschlagen.
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Die Erfindung geht von dem Gedanken
aus, eine in einem Bauteil integrierte dreidimensionale Transportstruktur
für das
Probenmaterial zu schaffen, um neben der Trennung von Probenkomponenten
auch deren gezielte Weiterverarbeitung zu ermöglichen. Dementsprechend wird
erfindungsgemäß vorgeschlagen,
daß das
Trennelement eine Kanalstruktur zum Ausschleusen von separierten
Probenkomponenten auf ein Trägersubstrat
in einer quer zu der Trennebene verlaufenden Transportrichtung aufweist.
Entsprechend ist es in verfahrensmäßiger Hinsicht vorgesehen,
dass die separierten Probenkomponenten quer zur Trennebene aus dem
Trennelement auf ein Trägersubstrat
ausgeschleust werden.
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Die Erfindung erlaubt eine schnelle,
leicht automatisierbare Auftrennung der Proteine sowie die direkte
Aufbringung auf ein Substrat in einem einzigen dreidimensionalen
Grundelement. Dadurch ist es möglich,
den gewonnenen Informationsgehalt einer zweidimensionalen Proteintrennung
ohne Informationsverlust in die dritte Dimension zu überführen. Erfindungsgemäß wird gesamte
Prozesskette, die sonst in separaten Geräten durchgeführt wird,
in einem einzigen Element zusammengefasst. Insbesondere werden die
manuellen Schritte auf das Aufbringen der Probe reduziert. Die Menge
an benötigtem biologischem
Material kann um mehrere Größenordnungen
reduziert werden, so dass Mikrogramm-Mengen für eine Analyse genügen. Durch
Integration von Teilschritten in einem einzigen Bauelement und durch
das Wegfallen manueller Zwischenschritte wird der Gesamtprozess
deutlich besser reproduzierbar und kontrollierbar. Außerdem lässt sich
die Gesamtprozessdauer auf wenige Stunden redu zieren. Dies erlaubt
ganz neue Arten von Fragestellungen zu bearbeiten, die bisher aufgrund
der relativ großen
notwendigen Materialmenge nicht zugänglich waren und ermöglicht eine
sehr viel feinere Diskriminierung biologischer Vorgänge. Als
Trägersubstrat
ist speziell eine Taägetplatte
für die
Massenspektroskopie vorgesehen. Grundsätzlich sind auch andere Einsatzzwecke
denkbar, beispielsweise funktionelle Assays für Aktivitäts- oder Bindungstests der separierten Proteine.
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Vorteilhafte Ausgestaltungen und
Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und
der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen sowie der
Zeichnung. Es zeigen in schematischer Weise
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1 und 2 eine Vorrichtung zum Trennen und
Weiterverarbeiten von Proteinen umfassend ein plattenförmiges Trennelement
in perspektivischer und vertikal abgebrochener Darstellung;
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3 einen
Vertikalschnitt durch das Trennelement nach 1;
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4 eine
Mittel- bzw. Trennplatte des Trennelements in perspektivischer Ansicht;
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5a eine
ausschnittsweise Draufsicht auf die Trennplatte nach 4 und die bodenseitig daran
anschließende
Kanalstruktur;
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5b einen
Schnitt entlang der Linie b-b der 5a mit
an die Kanalstruktur angeschlossener Trägerplatte;
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6 und 7 weitere Ausführungsformen
von Trennelementen in ausschnittsweiser perspektivischer Ansicht;
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8 einen
Positionierrahmen zur Verbindung mehrerer Trennelemente mit einer
massenspektroskopischen Trägerplatte
in schaubildlicher Darstellung; und
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9 eine
Aufnahmeeinheit zur Lagerung und Prozessierung von Trennelementen
in einem Vertikalschnitt.
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Die in der Zeichnung dargestellten
plattenförmigen
Trennelemente 10 bestehen im wesentlichen aus einer Trennplatte 12 zur
zweidimensionalen Separation von Proteinmaterial, einer quer dazu
wirksamen Transportbzw. Kanalstruktur 14 zum positionsgetreuen Ausschleusen
und Überleiten
der separierten Probenkomponenten auf eine für massenspektroskopische Untersuchungen
bestimmte Trägerplatte 16 und
einer Deckelplatte 18 sowie einer Bodenplatte 20 zur
beidseitigen Begrenzung der Trennplatte 12.
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Wie in 1 bis 3 dargestellt, besitzt die
Deckelplatte 18 eine schlitzförmig durchgehende Probenaufgabeöffnung 22,
eine zur Trennplatte 12 hin offene Deckelkammer 24,
eine in die Deckelkammer 24 mündende seitliche Einlassöffnung 26 und
eine zentrale Ventilöffnung 28.
Die Trennplatte 12 bildet in zwei übereinander liegenden Bereichen
ein dreidimensionales Kanalsystem, wobei ein in der Platten- bzw.
Trennebene liegender oberer zweidimensionaler Trennbereich 30 bodenseitig
durch die in der dritten Dimension verlaufende Kanalstruktur 14 begrenzt
ist. Die Bodenplatte 20 dient zur Stützung und Stabilisierung der
Plattenanordnung und enthält
eine zu der Kanalstruktur 14 hin offene Sammelkammer 32.
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Der Grundwerkstoff für das als
Verbundchip ausgebildete Trennelement 10 kann aus Silizium,
Polypropylen, Polycarbonat, anderen Polymeren (z.B. Polymethylmethacrylat,
Polyethylenterephtalat, Polystyrol, Polydimethylsiloxan), Kunstharz,
Keramik oder einem Metall oder verschiedener dieser Materialien
bestehen. Wichtig ist, dass der Grundwerkstoff die Formgebung mit
der notwendigen Präzision
erlaubt und vereinbar ist mit den zur Probenverarbeitung eingesetzten
Materialien. Zweckmäßig sollte der
Grundwerkstoff elektrisch isolierend und thermisch leitend sein,
um elektrophoretische Trennungen und gegebenenfalls eine effiziente
Kühlung
zu ermöglichen.
Das Trennelement 10 besitzt beispielsweise eine Grundfläche von
6 × 4
cm (entsprechend 1/4 einer üblichen
Mikrotiterplatte).
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Die in 4 gesondert
gezeigte Trennplatte 12 weist in der Plattenebene verlaufende
orthogonale Trennpfade 34, 36 zur sequentiellen
2D-Elektrophorese
auf. Zu diesem Zweck sind zwei Elektrodenpaare 38, 40 vorgesehen,
die über
elektrische Anschlussfahnen mit einer geeigneten Gleichspannung beaufschlagbar
sind.
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Der Trennpfad 34 der ersten
Dimension zwischen den Elektroden 38 wird durch eine langgestreckte
Ausnehmung 42 gebildet, in welcher ein Gelstreifen (nicht
gezeigt) mit einem präformierten pH-Gradienten
zur – isoelektrischen
Fokussierung (IEF) der Proteinmoleküle angeordnet ist. Dabei kann in
Speicherzonen 44 im Bereich der Elektroden 38 ein – Elektrophorese-Puffer
vorgelegt werden.
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Die Trennpfade der zweiten Dimension
sind durch eine Schar von zwischen den Elektroden 40 parallel
zueinander verlaufenden Kanälen 36 gebildet,
die entlang der Ausnehmung 42 verteilt angeordnet sind
und rechtwinklig davon abzweigen. Die Anzahl der Kanäle hängt von
der gewünschten
und erreichbaren Auflösung
bzw. Trennleistung der ersten Dimension ab. Sie kann zwischen 10
und mehreren Tausend liegen, bevorzugt 50 bis 500. Die Molekültrennung
in diesen Kanälen
erfolgt durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) in einem Natriumdodecylsulfat
(SDS)-haltigen Elektrophorese-Puffer. Die Aussparungen 46, 48 im
Bereich der Elektroden 40 können dabei als Pufferreservoir
dienen.
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Bei der Herstellung wird zunächst das SDS-PAGE
Trenngel in die Kanäle 36 der
zweiten Dimension und in die Pufferreservoirs 46, 48 eingebracht
und photopolymerisiert. Dabei kann die Ausnehmung 42 für den IEF-Gelstreifen mechanisch (Separator 50)
abgetrennt sein, um eine Vermischung der Gelsorten zu verhindern.
Vorteilhaft ist es auch, wenn die Kanäle 36 in ihrem Anfangsteil
mit einem Sammelgel befällt
werden, welches dem Trenngel vorgeschaltet ist. Durch das Sammelgel
können in
der späteren
Trennung die Proteine an der Grenzzone zum Trenngel gesammelt und
komprimiert werden, so dass schärfere
Zonen der einzelnen Proteinbanden entstehen.
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Wie am besten aus 5a, b ersichtlich, wird
die Kanalstruktur 14 durch am Boden der Trennkanäle 36 aufgereihte
Ausschleuskanäle 52 gebildet. Diese
verlaufen senkrecht zu der durch die Trennkanäle 36 aufgespannten
Trennebene und bilden eine über
den Trennbereich 30 verteilte Kanalmatrix, um ein abbildungsgetreues
Ausschleusen des bei der Molekül trennung
erhaltenen 2D-Musters zu ermöglichen,
wie es weiter unten näher
erläutert
wird. Die Anzahl der Ausschleuskanäle 52 pro Trennkanal 36 hängt wiederum
von der gewünschten
und erreichbaren Auflösung
der Trennung in der zweiten Dimension ab. Sie kann zwischen 10 und
1000 liegen, bevorzugt 30 bis 400. Vorteilhaft sind die Ausschleuskanäle 52 konisch
verjüngend
ausgebildet, beispielsweise mit einem oberen Einlassdurchmesser
von 100 μm und
einem unteren Mündungsquerschnitt
von 50 μm (5b). Es sind aber auch andere
Kanalgeometrien denkbar, um die Proteine nach erfolgter Trennung möglichst
verlustfrei in der dritten Dimension zu prozessieren.
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Zu diesem Zweck kann die Bodenplatte 20 abgenommen
und die Trennplatte mit ihrer Unterseite 54 mit einer für massenspektroskopische
Untersuchungen vorgesehenen Trägerplatte 56,
speziell einer für
Matrixunterstützte
Laserdesorption/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF)
ausgebildeten Taägetplatte
in Anlage gebracht werden. Die Trägerplatte kann aus unterschiedlichen
Materialien bestehen (Metalle, Kunststoffe, Polymere). Wichtig ist,
dass das Material mit der folgenden Massenspektrometrie kompatibel
ist, insbesondere für
MALDI-TOF leitfähig
ist. Entsprechend der flächigen
Verteilung der Ausschleuskanäle 52 können auf
einer an sich hydrophoben Oberfläche
der Trägerplatte 56 hydrophile
Ankerzonen 58 für
die zu übertragenden Substanzen
angeordnet sein. Die Position und Größe dieser Ankerzonen sind an
die Ausschleuskanäle angepasst,
so dass die eluierten Molekülfragmente direkt
aufgefangen werden und die beim Trennvorgang erreichte geometrische
Auflösung
auf der Trägetplatte
im wesentlichen erhalten bleibt.
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Die Kanäle 34, 36, 52 der
drei Dimensionen können
durchgehend in direktem Kontakt stehen, oder aber durch Barrieren
oder Ventile getrennt sein, die nur bei Übergang von der einen Dimension
in die andere geöffnet
werden. Der Kontakt kann mechanisch, durch Bewegen oder Drehen der
Kanäle,
hergestellt werden, oder es können
mechanische Barrieren vorgesehen sein. Die Kanaltrennung kann auch chemisch
erfolgen, z.B. durch Polymere, die zum gewünschten Zeitpunkt aufgelöst werden.
Denkbar ist es auch, die Kanäle
der verschiedenen Dimensionen durch semipermeable Membranen, deren
Permeabilität
gesteuert werden kann, zu trennen.
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Bei der in 6 gezeigten Ausführungsform sind die mit SDS-PAGE-Trenngel 60 gefüllten Trennkanäle 36 der
zweiten Dimension nach unten durch eine poröse Bodenschicht bzw. Fritte 62 begrenzt, welche
mit fluidisch miteinander kommunizierenden Mikroporen eine quer
zur Trennebene durchströmbare
Kanalstruktur 14 bildet. In diesem Sinne sind die vielen
eng beieinander liegenden Poren der Bodenschicht 62 als
mikroskopische Ausschleuskanäle
zu verstehen.
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Das in 7 gezeigte
Ausführungsbeispiel unterscheidet
sich zusätzlich
dadurch, dass anstelle diskreter Trennkanäle für die Trennung in der zweiten Dimension
eine ultradünne
Polyacrylamid-Gelschicht 64 vorgesehen ist, die gegebenenfalls über einen Zwischenstreifen
aus einem Sammelgel an den IEF-Gelstreifen seitlich angrenzt und
eine SDS-PAGE-Elektrophorese ermöglicht.
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Wie in 8 dargestellt,
können
vier Trennelemente 10 in einem Positionierrahmen 66 auf
einer massenspektroskopischen Trägerplatte 16 in
der Größe einer
Mikrotiterplatte gemeinsam positioniert und verarbeitet werden.
Die Trägerplatte 16 wird
dabei in vorbestimmtem Abstand zu der Austrittsseite der jeweiligen
Kanalstruktur 14 parallel positioniert, so dass die zu übertragenden
Moleküle
direkt auf die hydrophilen Ankerzonen 58 übertragen
werden können.
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Entsprechend dieser Anordnung lassen
sich die Trennelemente 10 zur Lagerung und Vorverarbeitung
in ein Vorratsbehältnis 68 einsetzen
und darin mittels einer lösbaren
Deckfolie 70 luftdicht einschließen (9). Die Übergabe in den Positionierrahmen 66 unter
Entfernung der Bodenplatten 20 kann durch einen geeigneten
Schiebemechanismus (nicht dargestellt) vereinfacht bzw. automatisiert
werden. Die gesamte Trennvorrichtung umfasst weitere Einheiten zur
Steuerung des Prozessablaufs, die dem Fachmann an sich bekannt sind
und hier nicht im einzelnen erläutert
werden.
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Zur Verarbeitung in dem Trennelement
bzw. Chip 10 wird eine geeignete Menge des Probenmaterials über die
Aufgabeöffnung 22 in
den ersten Trennpfad 34 eingebracht. Für eine typische Trennung wird
1 μg Gesamtprotein
in einem Volumen von ca. 50 nl Trägerflüssigkeit zugegeben. In Gegenwart geeigneter
Puffer und nach Anlegen einer elektrischen Spannung an die Elektroden 38 wandern
die Proteine im elektrischen Feld und pN-Gradienten bis zu einer
ihrem isoelektrischen Punkt entsprechenden Stelle. Nach erfolgter
Trennung in der ersten Dimension, die zeitlich gesteuert und nach
ca. einer Stunde abgeschlossen ist, wird die isoelektrische Fokussierung
durch Abschalten der elektrischen Spannung beendet.
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Grundsätzlich sind auch andere Trennmethoden
möglich,
z.B. aufgrund der Hydrophobizität der
Proteine (hydrophobe Interaktion) oder aufgrund der Affinität zu bestimmten
Substanzen (Affinitätstrennung).
Durch die Realisierung verschiedener Trennverfahren für die erste
Dimension neben der isoelektrischen Fokussierung wird die Analyse
von Proteinklassen ermöglicht,
die bisher nicht oder nur sehr ungenügend zugänglich waren. So lassen sich durch
hydrophobe Interaktion Membranproteine analysieren, während durch
Affinitätstrennung
oder durch ionische Interaktionen andere Klassen, z.B. DNA-bindende
Proteine, trennbar sind. Bei chromatographischen Methoden wandern
die Proteine in einem Flüssigkeitsstrom
und werden aufgrund ihrer Interaktion mit chromatographischen Material
unterschiedlich stark zurückgehalten.
Bei dieser Interaktion entsteht kein stabiler Gleichgewichtszustand,
sondern die Auftrennung ist dynamisch und muss nach einer bestimmten
Zeit gestoppt werden.
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Für
die Auftrennung in der zweiten Dimension kann es erforderlich sein,
dass der Puffer, der für die
Trennung in der ersten Dimension verwendet wurde, von den Proteinen
entfernt und diese in einem für
die Trennung der zweiten Dimension geeigneten Puffer umäquilibriert
werden. Dies kann direkt im Kanal 42 durch Überschichten
erfolgen, wobei der neue Puffer über
die Deckelplatte 18 zugeführt wird. Ebenfalls wird dann
der SDS-PAGE-Puffer in die beiden Pufferreservoirs 46, 48 eingefüllt. Anschließend wird Spannung
an die beiden Elektroden 40 angelegt und die IEF-fokussierten
Proteine wandern aus dem IEF-Streifen entsprechend der erreichten
Position in einen korrespondierenden Kanal 36 der zweiten
Dimension. Die Auftrennung der Proteine in den SDS-Polyacrylamidgefüllten Kanälen 36 der
zweiten Dimension erfolgt dann elektrophoretisch, wobei die verschiedenen
Proteine nach ihrem Molekulargewicht ge trennt werden. Diese SDS-PAGE-Gelelektrophorese,
die durch Zugabe geeigneter Markersubstanzen verfolgt werden kann,
ist nach ca. einer Stunde beendet. Dann wird die elektrische Spannung abgeschaltet.
Alternativ können
für die
Trennung in der zweiten Dimension natürlich auch die oben bereits
geschilderten Trennprinzipien der ersten Dimension (IEF, hydrophobe
Interaktion, Affinität,
ionische Interaktion) zur Anwendung kommen.
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Die weitere Verarbeitung der Proteine
bis zum Aufbringen auf den Träger 16 erfolgt
in einem Flüssigkeitsstrom über die
Kanalstruktur 14. Die erforderlichen Flüssigkeiten werden über die
Deckelkammer 24 eingeleitet, während die Ventilöffnung 28 das
Abströmen
der verdrängten
Luft ermöglicht.
Der Flüssigkeitsstrom
wird senkrecht zur Trennebene und in gleichmäßiger Verteilung durch den
Trennbereich 30 hindurchgeleitet, wobei die treibende Druckdifferenz
beispielsweise durch Anlegen eines Stützvakuums an der Sammelkammer 32 der
Bodenplatte 20 vergrößert werden
kann. Für
einen gleichmäßigen Fluss
im gesamten Trennbereich 30 ist eine waagrechte Ausrichtung
essentiell. Gegebenenfalls kann die homogene Flächenverteilung durch eine nicht
gezeigte Lochplatte, welche die Kanäle 36 überdeckt, verbessert
werden.
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In einem ersten Aufbereitungsschritt
für die spätere massenspektroskopische
Untersuchung wird SDS-freie Pufferlösung durch das Gel in den Kanälen 36 der
zweiten Dimension gelenkt. Diese entfernt SDS aus dem Gel und von
den separierten Proteinen, ohne die Position der Proteine zu verändern. Die Pufferlösung wird über die
Kanalstruktur 14 in die untere Sammelkammer 32 der
Bodenplatte 20 abgeleitet. Anschließend wird auf dieselbe Weise
eine genau dosierte Menge an Trypsin-Lösung zugeführt.
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Das Trypsin spaltet die Proteine
in definierte Polypeptide. Konzentration und Fluss des Trypsins werden
dabei so gesteuert, dass die Proteine möglichst vollständig gespalten
werden, ohne dass bereits signifikante Mengen der Spaltprodukte
aus dem Gel eluiert werden.
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Nach diesem Schritt wird durch einen
Schiebemechanismus die Bodenplatte 20 mit den Abfall-Eluaten
entfernt und die Trägerplatte 16 für die Massenspektrometrie
in dem Positionierrahmen 66 in einem genau definierten
Abstand von wenigen Mikrometern unter der freigelegten Kanalstruktur 14 der Trennplatte 12 positioniert.
Sodann werden die durch die Protease-Spaltung erzeugten Proteinfragmente durch
Zugabe eines definierten Volumens an Elutionspuffer durch die Deckelplatte
und gezielten Strom durch das Trenngel hindurch über die Ausschleuskanäle 52 eluiert.
Der Abstand zur Trägerplatte 16 ist dabei
so optimiert, dass das Eluat von den hydrophilen Ankern 58 auf
dem MALDI-Target 56 lokal gefangen wird.
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Dadurch entsteht auf dem Träger 16 gleichsam
ein Abziehbild der Molekülverteilung
im Trennbereich. Die Trennung der Proteine und die vorbereitende
Prozessierung für
die Massenspektrometrie kann somit in einem Chip integriert mit
minimalen Stoffmengen erfolgen, ohne dass ein externer Eingriff mit
Transferinstrumenten wie Mikropipetten erforderlich wäre.
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Zusammenfassend ist folgendes festzuhalten:
Die Erfindung betrifft eine Trennvorrichtung und ein Trennverfahren
für biomolekulares
Probenmaterial, insbesondere Proteingemische. Hierfür ist ein Trennelement 10 zur
zweidimensionalen vorzugsweise elektrophoretischen Separation von
Komponenten des Probenmaterials im Bereich 30 einer Trennebene
vorgesehen. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen,
dass das Trennelement
10 eine Kanal- oder Transferstruktur
14 zum ortsaufgelösten
Ausschleusen von separierten Probenkomponenten auf ein für massenspektroskopische
Untersuchungen ausgebildetes Trägersubstrat 16 in
einer quer zu der Trennebene verlaufenden Transportrichtung aufweist.