DE102010033722A1 - Method for eliminating unwanted radiation portions from light detected from illuminated sample by laser scanning microscope, involves passing acousto optical tunable filter through two pole components - Google Patents

Method for eliminating unwanted radiation portions from light detected from illuminated sample by laser scanning microscope, involves passing acousto optical tunable filter through two pole components Download PDF

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Abstract

The method involves actuating an acousto optical tunable filter (AOTF). Illuminating light is faded out in a light case or a beam detour unit. A sample light is irradiated toward a detector. Unwanted light is faded out by the AOTF. The AOTF is passed through two pole components when irradiation takes place in two incident directions stretching along a plane, which is vertical to a propagation plane of a longitudinal wave of the AOTF and the irradiating directions symmetrical to the propagation direction. Independent claims are also included for the following: (1) a laser scanning microscope (2) a method for operating a laser scanning microscope.

Description

Stand der Technik:State of the art:

  • Jang-Woo You et al., Opt. Express (2008), Vol. 16, No. 26 pp. 21505Jang-Woo You et al., Opt. Express (2008), Vol. 16, no. 26 pp. 21505
  • Donley et al., Rev. Sci. Instrum. (2005), Vol. 76, pp. 063112Donley et al., Rev. Sci. Instrum. (2005), Vol. 76, pp. 063112
  • US-5377003US 5377003
  • US-6982818 B2US-6982818 B2
  • US-6963398 B2US-6963398 B2
  • US 6510001US 6510001
  • US 6654165US 6654165
  • US 2003/01 331 89US 2003/01 331 89

WO 99/42884 beschreibt die Nutzung eines AOTF als Hauptfarbteiler in einem Laser-Scanning-Mikroskop. Die Einkopplung von Beleuchtungslicht und das Ausblenden von Anregungslicht erfolgen über die erste Ordnung des AOTF. Das Probenlicht verbleibt in der nullten Beugungsordnung. In DE 19936573 A1 wird etwas Ähnliches beschrieben. WO 99/42884 describes the use of an AOTF as the main color splitter in a laser scanning microscope. The coupling of illumination light and the hiding of excitation light take place via the first order of the AOTF. The sample light remains in the zeroth diffraction order. In DE 19936573 A1 something similar is described.

In DE 10241472 A1 wird unter Verwendung dispersiver und polarisationsdrehender Elemente eine Aufteilung von Anregungs- und Detektionslicht vorgenommen.In DE 10241472 A1 a division of excitation and detection light is made using dispersive and polarization rotating elements.

Die Wellenlängen werden spektral räumlich separiert.The wavelengths are spectrally spatially separated.

zeigt den Detektionsstrahlengang des ZEISS LSM 710 ( http://www.zeiss.de/C1256CFB00332E16/0/F7BE630BECC94A08C12573F3005483 F4/$file/60-1-0001_d.pdf ) shows the detection beam path of the ZEISS LSM 710 ( http://www.zeiss.de/C1256CFB00332E16/0/F7BE630BECC94A08C12573F3005483 F4 / $ file / 60-1-0001_e.pdf )

Zur Darstellung eines Laser-Scanning-Mikroskopes wird weiterhin auf DE 19702753 verwiesen.To represent a laser scanning microscope is still on DE 19702753 directed.

Das Licht zweier Laser oder Lasergruppen LQ1 und LQ2 gelangt jeweils über Hauptfarbteiler HFT1 und HFT2 zur Trennung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang, die schaltbar als dichroitische Filterräder ausgebildet sein können und auch auswechselbar sein können um die Auswahl der Wellenlängen flexibel zu gestalten, und das Beleuchtungslicht reflektieren zunächst über einen Scanner, bestehend vorzugsweise aus zwei unabhängigen galvanometrischen Scanspiegeln für die X- und Y Ablenkung, in Richtung einer (nicht dargestellten Scanoptik SL und über diese und das Mikroskopobjektiv in üblicher Weise auf die Probe. Das Probenlicht gelangt in Rückrichtung durch die Teiler HFT1, HFT2 hindurch in Richtung der Detektion D.The light of two laser or laser groups LQ1 and LQ2 passes through main color splitter HFT1 and HFT2 for the separation of illumination and detection beam path, which can be configured as switchable dichroic filter wheels and can also be interchangeable to make the selection of wavelengths flexible, and reflect the illumination light first via a scanner, consisting preferably of two independent galvanometric scanning mirrors for the X and Y deflection, in the direction of a (not shown scanning optics SL and on this and the microscope objective in the usual way to the sample.) The sample light passes in the return direction through the divider HFT1 , HFT2 in the direction of detection D.

Hier passiert das Detektionslicht zunächst ein Pinhole PH über eine dem Pinhole vor- und nachgeordnete Pinholeoptik PHO und eine Filteranordnung F zur schmalbandigen Ausfilterung unerwünschter Strahlungsanteile, bestehend beispielsweise aus Notchfiltern, und gelangt über einen Strahlteiler BS, der optional bei entsprechender Schaltung über einen transmissiven Anteil eine Auskopplung auf externe Detektionsmodule ermöglicht, einen Spiegel M sowie weitere Umlenkungen auf ein Gitter G zur spektralen Aufspaltung der Detektionsstrahlung.Here, the detection light passes first a pinhole PH via a Pinholeoptik upstream and downstream Pinholeoptik PHO and a filter arrangement F for narrow-band filtering unwanted radiation components, consisting for example Notchfiltern, and passes through a beam splitter BS, optionally with appropriate circuit via a transmissive component Extraction to external detection modules allows a mirror M and further deflections on a grid G for spectral splitting of the detection radiation.

Die vom Gitter G aufgespalteten divergenten Spektralanteile werden mittels eines abbildenden Spiegels IM kollimiert und gelangen in Richtung einer Detektoranordnung, die aus einzelnen PMT1, PMT2 im Randbereich und einem zentral angeordneten Mehrkanaldetektor MPMT besteht.The divergent spectral components split by the grating G are collimated by means of an imaging mirror IM and pass in the direction of a detector arrangement consisting of individual PMT1, PMT2 in the edge region and a centrally arranged multichannel detector MPMT.

Anstelle des Mehrkanaldetektors kann auch ein weiterer Einzeldetektor verwendet werden.Instead of the multichannel detector, a further single detector can also be used.

Vor einer Linse L1 befinden sich zwei senkrecht zur optischen Achse verschiebbare Prismen P1, P2 im Randbereich; die einen Teil der Spektralanteile vereinigen, die über die Linse L1 auf die einzelnen PMT1 und 2 fokussiert werden. Der restliche Teil der Detektionsstrahlung wird nach Durchgang durch die Ebene der PMT1 und 2 über eine zweite Linse L2 kollimiert und spektral separiert auf die einzelnen Detektionskanäle des MPMT gerichtet.In front of a lens L1, there are two prisms P1, P2, which are displaceable perpendicular to the optical axis, in the edge region; which combine a part of the spectral components which are focused on the individual PMT1 and 2 via the lens L1. The remaining part of the detection radiation is collimated after passage through the plane of the PMT1 and 2 via a second lens L2 and spectrally separated directed to the individual detection channels of the MPMT.

Durch Verschiebung der Prismen P1, P2 kann in flexibler Weise eingestellt werden, welcher Teil des Probenlichtes über den MPMT spektral separiert detektiert wird und welcher Teil über die Prismen P1, P2 zusammengefasst durch PMT1 und 2 detektiert wird.By shifting the prisms P1, P2 it is possible to adjust in a flexible manner which part of the sample light is detected spectrally separated by the MPMT and which part is detected by the prisms P1, P2 summarized by PMT1 and 2.

Problemstellungproblem

Der Kontrast der Bildgebung in einem Laser-Scanning-Microskop wird entscheidend durch die Effizienz der Unterdrückung der spektralen Anteile der Anregungsstrahlung im Spektrum des Detektionslichtes bestimmt. Im Wesentlichen ermöglicht ein geeigneter Hauptfarbteiler, das Anregungslicht einer oder mehrerer Strahlungsquellen sowohl auf den Detektionsstrahlengang aufzufädeln als auch das an der Probe reflektierte bzw. gestreute Licht räumlich von dem Fluoreszenzlicht zu trennen. Konventionell werden hierfür Hauptfarbteiler bestehend aus einem oder mehreren dichroitischen Spiegeln eingesetzt, die auf maximale Unterdrückung einer bestimmten Anzahl fester Bereiche im Spektrum der transmittierten Strahlung optimiert sind. Allerdings erweisen sich die festen Filtereigenschaften der dichroitischen Spiegel als Nachteil, falls die Auswahl der Anregungswellenlängen geändert werden soll. Dagegen gewährleistet ein auf die gewünschten Anregungswellenlängen einstellbarer Hauptfarbteiler zwar die angestrebte Flexibilität bezüglich der Filtereigenschaften, doch ermöglichen solche Anordnungen nur eine eingeschränkte Unterdrückung des Anregungslichtes im Detektionsstrahlengang.The contrast of the imaging in a laser scanning microscope is decisively determined by the efficiency of the suppression of the spectral components of the excitation radiation in the spectrum of the detection light. In essence, a suitable main color splitter enables the excitation light of one or more radiation sources to be threaded onto the detection beam path as well as to spatially separate the light reflected or scattered from the sample from the fluorescent light. Conventionally, main color separators consisting of one or more dichroic mirrors are used which are optimized for maximum suppression of a certain number of fixed regions in the spectrum of the transmitted radiation. However, the fixed filter properties of dichroic mirrors prove to be a disadvantage if the choice of excitation wavelengths is to be changed. On the other hand, although a main color divider which can be set to the desired excitation wavelengths ensures the desired flexibility with regard to the filter properties, However, such arrangements allow only a limited suppression of the excitation light in the detection beam path.

Mit Hilfe eines zusätzlich im Strahlengang des Detektionslichtes angeordneten Emissionsfilters soll es möglich sein, die restlichen spektralen Anteile des Anregungslichtes aus dem Detektionsstrahlengang auszublenden. Um weiterhin die Flexibilität des Gesamtsystems bezüglich deren Filtereigenschaften zu gewährleisten, soll der Emissionsfilter auf die Anregungswellenlängen gezielt einstellbar sein. Somit soll die Kombination aus einem durchstimmbaren Hauptfarbteiler und einem durchstimmbaren Emissionsfilter eine spektral flexible und effiziente Unterdrückung der Strahlungsanteile des Anregungslichtes im Spektrum der Detektionsstrahlung ermöglichen.With the aid of an additionally arranged in the beam path of the detection light emission filter, it should be possible to hide the remaining spectral components of the excitation light from the detection beam path. In order to further ensure the flexibility of the overall system with regard to their filter properties, the emission filter should be selectively adjustable to the excitation wavelengths. Thus, the combination of a tunable main color divider and a tunable emission filter should enable a spectrally flexible and efficient suppression of the radiation components of the excitation light in the spectrum of the detection radiation.

Als Emissionsfilter für die Nutzung in einem Fluoreszenz-Mikroskop eignet sich ein akusto-optischer durchstimmbarer Filter (acousto-optical tunable filter – AOTF). Dieses aktiv-schaltbare optische Element ermöglicht, die spektralen Anteile des an der Probegestreuten oder reflektieren Laserlichts aus dem Detektionsstrahlengang der Fluoreszenz zu entfernen. Allerdings bewirkt eine einmalige Filterung lediglich eine Unterdrückung der Anregungsstrahlung im Detektionsspektrum von weniger als 2OD (optische Dichten, entspricht einer Transmission von 0.01). Des Weiteren erfährt die Strahlung in konventionellen AOTF's aufgrund des Kristallschnittes durch Dispersion eine räumlich-spektrale Aufspaltung. Die einmalige Nutzung eines einzelnen konventionellen AOTF erfordert eine zusätzliche Nachfilterung und eine optische Korrektur der spektralen Aufspaltung.The emission filter for use in a fluorescence microscope is an acousto-optical tunable filter (AOTF). This actively-switchable optical element makes it possible to remove the spectral components of the laser scattered or reflected by the sample from the detection beam path of the fluorescence. However, a one-time filtering only causes a suppression of the excitation radiation in the detection spectrum of less than 2OD (optical densities, corresponding to a transmission of 0.01). Furthermore, the radiation in conventional AOTFs due to the crystal cut by dispersion undergoes a spatial-spectral splitting. The single use of a single conventional AOTF requires additional post-filtering and optical correction of the spectral splitting.

Vorteile, Wirkungen und Beschreibung der ErfindungAdvantages, effects and description of the invention

Ein erfindungsgemäßes, auf AOTFs basierendes Emissionsfilter, das einen zweimaligen Durchlauf des Fluoreszenzlichtes durch das AOTF erlaubt, hat den Vorteil, dass eine hohe (> 3OD) und sehr schmalbandige (< 2 nm FWHM) Unterdrückung von Anregungslicht im Spektrum des Fluoreszenzlichtes erreicht wird, wobei zudem die zu filternde Mittenwellenlänge frei auf die verwendeten Laserwellenlängen einstellbar ist. Des Weiteren verfügen die erfindungsgemäßen Anordnungen über sehr hohe Transmission von bis zu 90% für Fluoreszenzlicht und erlauben die simultane Filterung von mehreren Anregungswellenlängen, wobei für jede Polarisationsrichtung einer Wellenlänge eine Ansteuerfrequenz geschaltet wird.An AOTF-based emission filter according to the invention, which allows the fluorescent light to pass through the AOTF twice, has the advantage that a high (> 3OD) and very narrow-band (<2 nm FWHM) suppression of excitation light in the spectrum of the fluorescent light is achieved In addition, the center wavelength to be filtered is freely adjustable to the laser wavelengths used. Furthermore, the arrangements according to the invention have a very high transmission of up to 90% for fluorescent light and allow the simultaneous filtering of several excitation wavelengths, wherein a drive frequency is switched for each polarization direction of a wavelength.

Das ist ein Vorteil gegenüber bekannten Anordnungen, wo das Detektionslicht nur in einer Polarisationsrichtung, die der Anregungsstrahlungspolarisation entspricht, gefiltert wird. Eine vergleichbare Anordnung nach dem Stand der Technik, basierend auf dielektrischen Notchfiltern, die je nach verwendeter Laserwellenlänge in den Strahlengang sequentiell eingeschwenkt werden, würde bei simultaner Filterung von vier Anregungswellenlängen einen Transmissionsgrad für Fluoreszenzlicht von lediglich 85% aufweisen und zudem deutlich breitere Sperrbänder (ca. 10–25 nm FWHM in Abhängigkeit von der Wellenlänge) in das Spektrum einfügen, was besonders zu Lasten der Detektion des Fluoreszenzmaximums ginge.This is an advantage over known arrangements where the detection light is filtered only in a direction of polarization corresponding to the excitation radiation polarization. A comparable arrangement according to the prior art, based on dielectric notch filters, which are sequentially swiveled into the beam path depending on the laser wavelength used, would have a transmittance for fluorescent light of only 85% with simultaneous filtering of four excitation wavelengths and also significantly wider stop bands (ca. 10-25 nm FWHM depending on the wavelength) in the spectrum, which would be particularly at the expense of the detection of the fluorescence maximum.

Der AOTF weist vorteilhaft zueinander parallele Ein- und Austrittsflächen auf.The AOTF advantageously has mutually parallel entry and exit surfaces.

Das hat gegenüber der Darstellung in den Vorteil, dass in der O. Ordnung eine spektrale Aufspaltung vermieden wird.This has opposite the representation in the advantage that in the O. order a spectral splitting is avoided.

Ein AOTF gemäß 1a mit nicht parallelen Ein- und Austrittsflächen kann aber für die Erfindung genutzt werden wenn durch entsprechende fachmännisch ausgebildete Optik die Dispersion in der nullten Ordnung, beispielsweise durch Kollimationsoptiken, ausgeglichen wird.An AOTF according to 1a but with non-parallel entry and exit surfaces can be used for the invention when the dispersion in the zeroth order, for example by Kollimationsoptiken is compensated by appropriate expert-trained optics.

Weiterhin könnten bei Verwendung eines AOTF nach 1a die L1 und L2, beispielsweise in 2 übereinanderliegen, was an Ihrer Ausblendung aber nichts ändern würde.Furthermore, when using an AOTF after 1a the L1 and L2, for example in 2 on top of each other, which would not change your fade out.

Beschreibung der AbbildungenDescription of the pictures

Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen:List of used reference signs:

  • AOTF, AOTF1, AOTF2:AOTF, AOTF1, AOTF2:
    Akustooptischer einstellbarer (tunable) FilterAcousto-optic tunable filter
    OA:OA:
    Optische Achse des AOTF KristallsOptical axis of the AOTF crystal
    D, D1, D2:D, D1, D2:
    ObjektlichtObjektlicht
    Ln:ln:
    Laser 1 – n zur ProbenbeleuchtungLaser 1 - n for sample illumination
    L1, L2:L1, L2:
    Beispielhaft zwei unterschiedliche Wellenlängen von LnFor example, two different wavelengths of Ln
    PBS:PBS:
    PolstrahlteilerPolstrahlteiler
    s, p:s, p:
    Polarisationskomponentenpolarization components
    M1–M12:M1-M12:
    Spiegelmirror
    BB:BB:
    Blende, Lichtblocker oder Lichtfalle oder LichtumleitungAperture, light blocker or light trap or light redirection
    BDP:BDP:
    Doppelbrechendes PolarisationsprismaBirefringent polarization prism
    QWP:QWP:
    ViertelwellenplatteQuarter-wave plate
    HWP:HWP:
    HalbwellenplatteHalf-wave plate
    F1, F2:F1, F2:
    Ringförmige FilteranordnungAnnular filter arrangement

zeigt schematisch das Funktionsprinzip einer optischen Anordnung, die ein akusto-optisch durchstimmbares Filter (acousto-optical tunable Filter – AOTF) umfasst und eine spektral flexible einstellbare räumliche Trennung der ausgewählten spektralen Anteile des einfallenden Lichts von der Reststrahlung ermöglicht. AW bezeichnet darin die Ausbreitungsrichtung der akustischen Welle im AOTF. schematically shows the principle of operation of an optical arrangement comprising an acousto-optically tunable filter (AOTF) and a spectrally flexible adjustable spatial separation of the selected spectral components of the incident light from the residual radiation allows. AW denotes therein the propagation direction of the acoustic wave in the AOTF.

Ein AOTF besteht aus einem anisotropen doppelbrechenden optischen Kristall, an den ein Piezokristall gekoppelt ist. Im Allgemeinen erfährt die eingehende unpolarisierte Strahlung beim Durchqueren des Kristalls eine räumliche Trennung in die zueinander senkrecht linear polarisierten ordentlichen und außerordentlichen Strahlen. Durch das Anlegen einer an die ausgewählte Wellenlänge und die Polarisation des einfallenden Lichts angepassten Radiofrequenz an den Piezokristall wird in dem AOTF-Kristall eine Ultraschallwelle erzeugt, die sich durch den Kristall fortpflanzt. In einem nichtkollinearen AOTF bewirkt die Wechselwirkung der propagierenden Strahlung mit dieser Schallwelle eine Beugung eines durch die Periodizität der Schallwelle vorgegebenen spektralen Anteils des Lichts, wobei die Ablenkung abhängig von dem Polarisationszustand in die erste bzw. minus erste Beugungsordnung erfolgt. Die restlichen spektralen Anteile werden transmittiert und legen die nullte Beugungsordnung fest. Abhängig von dem Polarisationszustand der Strahlung ist es möglich, mittels eines AOTF's mehrere schmalbandige spektrale Bereiche aus dem Licht einer breitbandigen Quelle auszuwählen und räumlich von der Reststrahlung zu trennen. Ein geeignetes räumliches Filter ermöglicht es, diese spektralen Anteile aus dem Strahlengang auszublenden. Für die Strahlung in der nullten Beugungsordnung wirkt hierdurch ein AOTF wie ein schmalbandiges durchstimmbares Notchfilter, der ausgewählte Anteile im Lichtspektrum unterdrückt.An AOTF consists of an anisotropic birefringent optical crystal to which a piezocrystal is coupled. In general, the incoming unpolarized radiation undergoes a spatial separation into the perpendicularly linearly polarized ordinary and extraordinary rays as it traverses the crystal. By applying a radio frequency adapted to the selected wavelength and the polarization of the incident light to the piezoelectric crystal, an ultrasonic wave is generated in the AOTF crystal, which propagates through the crystal. In a non-collinear AOTF, the interaction of the propagating radiation with this sound wave causes a diffraction of a predetermined by the periodicity of the sound wave spectral component of the light, wherein the deflection is carried out depending on the polarization state in the first or minus first diffraction order. The remaining spectral components are transmitted and determine the zeroth diffraction order. Depending on the polarization state of the radiation, it is possible to select a plurality of narrow-band spectral regions from the light of a broadband source by means of an AOTF and to spatially separate them from the residual radiation. A suitable spatial filter makes it possible to hide these spectral components from the beam path. For the radiation in the zeroth diffraction order, an AOTF acts as a narrow-band, tunable notch filter, which suppresses selected components in the light spectrum.

In ist ein erfindungsgemäßes durchstimmbares Emissionsfilter schematisch dargestellt.In an inventive tunable emission filter is shown schematically.

Hier wie in den weiteren nachfolgenden Abbildungen kann der erfindungsgemäße Emissionsfilter im Detektionsstrahlengang eines LSM wie anhand 11 beispielhaft beschrieben, angeordnet sein, vorteilhaft hinter dem Detektionspinhole, in einem kollimierten Strahlengang (In 11 durch das Pinhole PH und die Optik PHO dargestellt).Here, as in the other subsequent figures, the emission filter according to the invention in the detection beam path of an LSM as shown 11 by way of example, be arranged, advantageously behind the detection pinhole, in a collimated beam path (In 11 represented by the pinhole PH and the optics PHO).

Dargestellt ist Probenlicht D mit unterschiedlicher Polarisierung.Shown is sample light D with different polarization.

Die Anteile des Beleuchtungslichtes In werden beispielhaft mit L1 und L2 bezeichnet, die unterschiedliche Wellenlängen aufweisen.The portions of the illumination light In are exemplified by L1 and L2 having different wavelengths.

D und L bilden gemeinsam das vom Objekt stammende Licht D + L.D and L together form the light D + L originating from the object.

Hier wird zunächst davon ausgegangen, dass das Beleuchtungslicht in der Regel eine lineare Polarisation aufweist, die den Polteiler PBS daher nur in einer Richtung passiert.Here, it is initially assumed that the illumination light generally has a linear polarization, which therefore only passes the pole splitter PBS in one direction.

Diese optische Anordnung umfasst ein einzelnes AOTF, das von dem Objektlicht (D + L) zweimal durchlaufen wird. Die Einkopplung des Objektlichtes (D + L) in die Anordnung und die Auskopplung der von den ungewünschten spektralen Anteilen gefilterten Strahlung in Richtung des Detektors erfolgt an einem polarisierenden Strahlteilerwürfel (PBS). Hier wird das p-polarisierte Objektlicht (D + L) transmittiert und durchläuft das AOTF. Durch das Anlegen der geeigneten Frequenzen am AOTF werden die Strahlungsanteile des Anregungslichtes (L1, L2) in die ersten Ordnungen gebeugt und mittels der geeigneten räumlichen Filter (BB1) aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet. Die Filter BB können Lichtfallen oder Strahlumlenkeinheiten sein, die gegebenenfalls auch eine Weiterverwertung des Anregungslichtes für die Beleuchtung der Probe ermöglichen könnten. Die Filter BB sind hier vereinfacht als Raumblenden mit einem Durchgang für das Probenlicht dargestellt.This optical arrangement comprises a single AOTF which is traversed twice by the object light (D + L). The coupling of the object light (D + L) into the arrangement and the extraction of the radiation filtered by the unwanted spectral components in the direction of the detector takes place on a polarizing beam splitter cube (PBS). Here, the p-polarized object light (D + L) is transmitted and passes through the AOTF. By applying the appropriate frequencies to the AOTF, the radiation components of the excitation light (L1, L2) are diffracted into the first orders and masked out of the detection beam path by means of the suitable spatial filters (BB1). The filters BB can be light traps or beam deflecting units, which could possibly also enable a further utilization of the excitation light for the illumination of the sample. The filters BB are shown here in simplified form as room apertures with a passage for the sample light.

Das p-polarisierte Detektionslicht (D1) durchläuft den PBS, bleibt in der nullten Beugungsordnung des AOTF und wird mit Hilfe eines Spiegels (M1) in sich selbst zurückreflektiert.The p-polarized detection light (D1) passes through the PBS, remains in the zeroth order of diffraction of the AOTF and is reflected back into itself by means of a mirror (M1).

Das an M1 reflektierte Licht durchquert das AOTF ein zweites Mal, wodurch eine erneute Filterung des Detektionslichtes (D1) möglich ist. Um die eingehende und ausgehende Strahlung am polarisierenden Strahlteiler (PBS) voneinander trennen zu können, wird zwischen den AOTF und den Spiegel (M) eine achromatische Viertelwellenplatte (QWP) zur Drehung der Polarisationsebene des p Anteils angeordnet. Das Detektionslicht (D1) durchquert erneut das AOTF, wobei der Polarisationszustand der zurückreflektierten Strahlungsanteile infolge eines doppelten Durchgangs durch die Viertelwellenplatte um 90° gedreht wird. Ein zweiter an die resultierende s-Polarisation der ausgewählten spektralen Anteilen angepasster Satz von Frequenzen bewirkt erneut eine räumliche Separation der Strahlungsanteile des Anregungslichtes (L1, L2) von dem Detektionslicht (D1). Mittels der räumlichen Filter BB2 wird die von der Probe gestreute oder reflektierte Strahlung aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet. Abschließend erfährt das von den spektralen Anteilen des Anregungslichtes bereinigte s-polarisierte Detektionslicht (D) an dem polarisierenden Strahlteiler (PBS) eine Ablenkung und wird in Richtung des Detektors geleitet.The light reflected at M1 traverses the AOTF a second time, allowing the detection light (D1) to be filtered again. In order to be able to separate the incoming and outgoing radiation at the polarizing beam splitter (PBS), an achromatic quarter wave plate (QWP) is arranged between the AOTF and the mirror (M) for rotation of the polarization plane of the p component. The detection light (D1) again traverses the AOTF, the polarization state of the reflected radiation portions being rotated by 90 ° as a result of a double pass through the quarter wave plate. A second set of frequencies, adapted to the resulting s-polarization of the selected spectral components, again causes a spatial separation of the radiation components of the excitation light (L1, L2) from the detection light (D1). By means of the spatial filter BB2, the radiation scattered or reflected by the sample is masked out of the detection beam path. Finally, the s-polarized detection light (D), which has been cleared of the spectral components of the excitation light, undergoes a deflection at the polarizing beam splitter (PBS) and is directed in the direction of the detector.

Die s-polarisierte Komponente der von der Probe kommenden Strahlung (D + L), die im wesentlichen aus dem Probenlicht, insbesondere Fluoreszenzlicht besteht, wird an dem PBS reflektiert und mit Hilfe einer Anordnung bestehend aus einem Viertelwellenplatte (QWP) und einem Spiegel (M2) gedreht als p-polarisiertes Detektionslicht (D2) auf den Detektionsstrahlengang wieder aufgekoppelt. Hierbei wird angenommen, dass die für die Anregung genutzte Beleuchtungsstrahlung p-polarisiert ist und der Polarisationszustand nach der Wechselwirkung mit der Probe beibehalten wird. Daher wird der s-polarisierte Anteil des Objektlichtes (D + L) als nahezu frei von Strahlungsanteilen des Anregungslichtes betrachtet.The s-polarized component of the radiation coming from the sample (D + L), which consists essentially of the sample light, in particular Fluorescence light is reflected on the PBS and with the aid of an arrangement consisting of a quarter wave plate (QWP) and a mirror (M2) rotated as p-polarized detection light (D2) coupled to the detection beam path again. In this case, it is assumed that the illumination radiation used for the excitation is p-polarized and the state of polarization is maintained after the interaction with the sample. Therefore, the s-polarized portion of the object light (D + L) is considered to be almost free of radiation components of the excitation light.

Der an M2 reflektierte nunmehrige p Anteil durchquert den PBS in Richtung der Detektion DE.The now reflected p component reflected at M2 passes through the PBS in the direction of the detection DE.

In ist ein weiteres erfindungsgemäßes durchstimmbares Emissionsfilter in Seitenansicht und Draufsicht von oben schematisch dargestellt.In is a further inventive tunable emission filter in side view and plan view from above shown schematically.

In Erweiterung von werden hier sowohl der s als auch der p Anteil des Probenlichtes, vorzugsweise des Fluoreszenzlichtes, vom AOTF gefiltert.In extension of Here both the s and the p portion of the sample light, preferably the fluorescent light, filtered by the AOTF.

Diese optische Anordnung ermöglicht mittels eines einzelnen AOTF beide Polarisationskomponenten des Objektlichts (D + L) von den Strahlungsanteilen des Anregungslichts (L1, L2) effizient zu bereinigen. Hierzu werden beide Polarisationsanteile des Objektlichts (D + L) an einem polarisierenden Strahlteiler (PBS) räumlich voneinander getrennt und aus unterschiedlichen Winkeln in das AOTF eingekoppelt.This optical arrangement makes it possible, by means of a single AOTF, to efficiently clean both polarization components of the object light (D + L) from the radiation components of the excitation light (L1, L2). For this purpose, both polarization components of the object light (D + L) are spatially separated from one another at a polarizing beam splitter (PBS) and coupled from different angles into the AOTF.

Der s-Anteil wird am PBS reflektiert und gelangt über einen Spiegel M5 auf den AOTF während der p-Anteil durch den PBS hindurch auf den AOTF gelangt.The s component is reflected at the PBS and reaches the AOTF via a mirror M5 while the p component passes through the PBS onto the AOTF.

Besonders vorteilhaft lässt sich diese Anordnung ausgestalten, indem die beiden Ebenen, die zum einen durch die beiden einfallenden Strahlen (Draufsicht in der Abbildung) und zum anderen durch die Ausbreitungsrichtung der Schallwelle und der optischen Achse (Seitenansicht in der Abbildung) aufgespannt werden, senkrecht aufeinander stehen. In diesem Fall ist die Phasenanpassung der Eingangsstrahlen an die akustische Welle nicht kritisch, so dass die Orientierung der Eingangsstrahlen innerhalb der erwähnten Ebene beliebig ist und lediglich der Aperturanpassung des AOTF-Kristalls unterliegt.Particularly advantageous, this arrangement can be configured by the two planes, which are spanned on the one hand by the two incident rays (top view in the figure) and the other by the propagation direction of the sound wave and the optical axis (side view in the figure) perpendicular to each other stand. In this case, the phase matching of the input beams to the acoustic wave is not critical, so that the orientation of the input beams within the mentioned plane is arbitrary and subject only to the aperture fitting of the AOTF crystal.

Die Anteile können auch symmetrisch, d. h. unter gleichem Winkel zu OA eingestrahlt werden, wie in unten auch dargestellt. In diesem Fall ist die Phasenanpassung für beliebige Orientierungen der beiden erwähnten Ebenen zueinander gegeben.The components can also be radiated symmetrically, ie at the same angle to OA as in also shown below. In this case, the phase matching for any orientations of the two mentioned levels is given to each other.

Somit erfolgt die Einkopplung beider Polarisationsanteile unter den gleichen Bedingungen für die Phasenanpassung. Durch das Anlegen der an die Polarisationskomponenten (p und s) der Anregungsstrahlung (L1, L2) angepassten akustischen Frequenzen werden die Strahlungsanteile des Anregungslichtes (L1, L2) in die ersten Ordnungen gebeugt und mittels eines räumlichen Filters BB1 aus dem Detektionsstrahlengang ausgeblendet. Beide Polarisationsanteile des Detektionslichtes (D1, D2) bleiben jeweils in der nullten Ordnung und werden jeweils mittels eines Spiegels (M3 und M4) in sich selbst reflektiert.Thus, the coupling of both polarization components takes place under the same conditions for phase matching. By applying the acoustic frequencies adapted to the polarization components (p and s) of the excitation radiation (L1, L2), the radiation components of the excitation light (L1, L2) are diffracted into the first orders and masked out of the detection beam path by means of a spatial filter BB1. Both polarization components of the detection light (D1, D2) each remain in the zeroth order and are each reflected by means of a mirror (M3 and M4) in itself.

Die reflektierten Anteile durchlaufen das AOTF ein zweites Mal, wodurch eine erneute Filterung der Anteile des Detektionslichtes (D1, D2) durch Ausblendung von L1, L2 an BB2 möglich ist. Um die eingehende und ausgehende Strahlung am polarisierenden Strahlteiler (PBS) voneinander trennen zu können, wird zwischen dem AOTF und den Spiegeln (M3, 4) für beide Polarisationsanteile (D1, D2) jeweils eine achromatische Viertelwellenplatte QWP angeordnet. Somit erfahren beide Anteile des Detektionslichts (D1, D2) infolge des doppelten Durchgangs durch die jeweilige Viertelwellenplatte (QWP) eine Drehung der Polarisationsrichtung um 90°. Beide Polarisationsanteile des Detektionslichts (D1, D2) werden an dem polarisierenden Strahlteiler (PBS) wieder räumlich überlagert, reflektiert und auf den Detektionsstrahlengang DE aufgekoppelt.The reflected components pass through the AOTF a second time, whereby a new filtering of the portions of the detection light (D1, D2) by blanking L1, L2 to BB2 is possible. In order to be able to separate the incoming and outgoing radiation at the polarizing beam splitter (PBS), an achromatic quarter wave plate QWP is arranged between the AOTF and the mirrors (M3, 4) for both polarization components (D1, D2). Thus, both portions of the detection light (D1, D2) undergo a rotation of the polarization direction by 90 ° due to the double passage through the respective quarter wave plate (QWP). Both polarization components of the detection light (D1, D2) are again spatially superimposed on the polarizing beam splitter (PBS), reflected and coupled onto the detection beam path DE.

zeigt eine Erweiterung der in der vorgestellten Anordnung. Hier durchlaufen beide Polarisationsanteile des Objektlichtes (D + L) getrennt jeweils eine in der beschriebene Filteranordnung mit vorteilhaft identisch aufgebauten AOTF1 und 2. shows an extension of the in the presented arrangement. Here pass through both polarization components of the object light (D + L) separately each one in the described filter arrangement with advantageously identically constructed AOTF1 and 2.

Es wird also davon ausgegangen, dass auch das Anregungslicht Ln unterschiedliche Polarisationsanteile s und p enthalten kann.It is therefore assumed that the excitation light Ln can also contain different polarization components s and p.

An PBS erfolgt eine Aufteilung von D + Ln in Polarisationsanteile s (reflektiert in Richtung AOTF1 über M8) und p (transmittiert in Richtung AOTF2).A division of D + Ln into polarization components s (reflected in direction AOTF1 via M8) and p (transmitted in direction AOTF2) takes place on PBS.

Wie in wird das Objektlicht an Spiegeln M2, M7 reflektiert, durch QWP gedreht und durchläuft die AOTF1 und 2 jeweils zweimal, unter zweimaliger Filterung des Anregungslichtes Ln durch BB1 bzw. BB2.As in the object light is reflected at mirrors M2, M7, rotated by QWP, and passes through the AOTF1 and 2 twice each, filtering the excitation light Ln twice through BB1 and BB2, respectively.

Nach der zweiten Filterung im Rücklauf werden die s- und p-Polarisationskomponenten des Detektionslichtes (entsprechend D1 und D2) an dem polarisierenden Strahlteilerwürfel (PBS) wieder überlagert und zu dem Detektor DE geleitet.After the second filtering in the return, the s and p polarization components of the detection light (corresponding to D1 and D2) are again superimposed on the polarizing beam splitter cube (PBS) and directed to the detector DE.

Der s- und p Anteil ist nach der Drehung nunmehr ein p- und s Anteil und wird an PBS reflektiert (s Anteil) bzw. transmittiert (p Anteil) The s and p components are now a p and s component after the rotation and are reflected on PBS (s component) or transmitted (p component)

Hierdurch ist es möglich beide Polarisationsanteile des Objektlichtes effizient zu filtern, unabhängig von dem Polarisationszustand des Anregungslichtes.This makes it possible to efficiently filter both polarization components of the object light, regardless of the polarization state of the excitation light.

In ist ein erfindungsgemäßes durchstimmbares Filter dargestellt, das zwei identische und vorteilhaft identisch angesteuerte AOTF umfasst. Das Objektlicht wird hier mittels eines polarisierenden Strahlteilerwürfels (PBS) in die optische Anordnung eingekoppelt, wobei s- und p-Polarisationskomponenten eine Ringanordnung, gebildet aus Spiegel M9, AOTF1, Spiegel M10, Spiegel M11 und AOTF2, in entgegen gesetzter Richtung getrennt durchlaufen. Jede Polarisationskomponente durchquert also sequenziell (hintereinander) beide AOTF's, die identisch auf beide Polarisationen der ausgewählten spektralen Anteile eingestellt sind. Bei jedem Durchgang durch ein AOTF werden die Spektralanteile L1, L2 der Anregungsstrahlung aus dem Detektionslicht beider Polarisationszustände (D1 und D2) an BB1, BB2 ausgeblendet. Nach der Filterung werden beide Polarisationskomponenten s und p der Detektionsstrahlung (D1 und D2) an dem PBS überlagert und in Richtung des Detektors geleitet.In an inventive tunable filter is shown which comprises two identical and advantageously identically controlled AOTF. Here, the object light is coupled into the optical arrangement by means of a polarizing beam splitter cube (PBS), wherein s and p polarization components pass through a ring arrangement formed by mirrors M9, AOTF1, mirrors M10, mirrors M11 and AOTF2 in the opposite direction. Each polarization component thus traverses sequentially (one behind the other) both AOTFs, which are set identically to both polarizations of the selected spectral components. During each pass through an AOTF, the spectral components L1, L2 of the excitation radiation from the detection light of both polarization states (D1 and D2) are masked out at BB1, BB2. After filtering, both polarization components s and p of the detection radiation (D1 and D2) are superimposed on the PBS and directed in the direction of the detector.

Die Viertelwellenplatten QWP können hier entfallen, weil der zunächst an PBS reflektierte s Anteil nach Durchlauf von AOTF1 und AOTF2 am PBS wieder in Richtung DE gespiegelt wird, während der zunächst an PBS transmittierte p Anteil nach Durchlauf von AOTF2 und AOTF1 in entgegengesetzter Richtung wieder von PBS in Richtung DE transmittiert wird.The quarter wave plates QWP can be dispensed with here, because the s component initially reflected at PBS is mirrored again in the direction DE after passage of AOTF1 and AOTF2 on the PBS, while the p portion initially transmitted to PBS returns to PBS after passing AOTF2 and AOTF1 in the opposite direction is transmitted in the direction of DE.

zeigt ein erfindungsgemäßes Emissionsfilter, das ein einziges AOTF umfasst. shows an inventive emission filter comprising a single AOTF.

Zu beachten ist dass die Orientierung des Teilerspiegels von PBS hier in Bezug auf die bisherigen Darstellungen in 25 um 90 Grad gedreht ist.Note that the orientation of the splitter mirror of PBS here in relation to the previous representations in 2 - 5 turned 90 degrees.

Die p-Polarisation (Polarisationsrichtung des Anregungslichtes) des Objektlichtes wird hier mit Hilfe eines polarisierenden Strahlteilerwürfels (PBS) an PBS reflektiert und in eine ringförmige Filteranordnung (F1) eingekoppelt, die aus einem Umlenkspiegel M12, einer Halbwellenplatte HWP, Umlenkspiegeln M13, M14 sowie einem AOTF besteht.The p-polarization (polarization direction of the excitation light) of the object light is here reflected by means of a polarizing beam splitter cube (PBS) to PBS and coupled into an annular filter assembly (F1) consisting of a deflection mirror M12, a half-wave plate HWP, deflection mirrors M13, M14 and a AOTF exists.

Das s-polarisierte Objektlicht wird als nahezu frei von den Strahlungsanteilen des Anregungslichtes angenommen, an PBS reflektiert und direkt in Richtung des Detektors DE geführt. Die p-Polarisationskomponente des Objektlichtes durchläuft als p1 das AOTF, wobei die Spektralanteile des Anregungslichtes L1, L2 wie schon oben beschrieben an BB aus dem Strahlengang ausgeblendet werden. Mittels einer achromatischen Halbwellenplatte (HWP) wird die Polarisation des p-polarisierten Detektionslichtes (D1) um 90° gedreht, es entsteht s1. Hierdurch wird s-polarisiertes Detektionslicht (D1) s1 am PBS reflektiert und durchläuft erneut als s2 das AOTF und die Halbwellenplatte (HWP), wobei nach dem zweitem Durchlauf die p-polarisierten Anteile p2 durch PBS hindurchgehen und also aus der Filteranordnung (F1) mittels des polarisierenden Strahlteilers (PBS) ausgekoppelt werden und zusammen mit dem ungefilterten s-polarisierten Objektlicht S in Richtung des Detektors DE geführt werden.The s-polarized object light is assumed to be almost free of the radiation components of the excitation light, reflected on PBS and guided directly in the direction of the detector DE. The p-polarization component of the object light passes through the AOTF as p1, the spectral components of the excitation light L1, L2 being blanked out of the beam path at BB as described above. By means of an achromatic half-wave plate (HWP), the polarization of the p-polarized detection light (D1) is rotated by 90 °, resulting in s1. As a result, s-polarized detection light (D1) s1 is reflected at the PBS and again passes through the AOTF and the half-wave plate (HWP) as s2, the p-polarized portions p2 passing through PBS after the second pass and thus out of the filter arrangement (F1) of the polarizing beam splitter (PBS) and are guided together with the unfiltered s-polarized object light S in the direction of the detector DE.

zeigt eine Erweiterung der in der dargestellten Anordnung auf Fälle, wo nicht von einer eindeutigen Orientierung der Polarisation der Strahlungsanteile D und Ln ausgegangen werden kann. In D und Ln liegt also eine gemischte Polarisation vor. shows an extension of the in the arrangement shown to cases where it can not be assumed that a clear orientation of the polarization of the radiation components D and Ln. In D and Ln, therefore, there is a mixed polarization.

Die Orientierung des Teilerspiegels in PBS entspricht der in .The orientation of the splitter mirror in PBS corresponds to that in ,

Die p-polarisierten Anteile p des Objektlichtes (D + L) werden am polarisierenden Strahlteiler (PBS) transmittiert und durchlaufen die in der beschriebene Filteranordnung (F1) doppelt, die einen AOTF1 umfasst, weil sie durch HWP in s Anteile gedreht werden und somit an PBS reflektiert werden und den AOTF1 nochmals durchlaufen. Hierdurch werden die Strahlungsanteile des Anregungslichtes (L1, L2) effizient aus dem Detektionslicht (D1) ausgeblendet. Die bereinigte Strahlung wird anschließend, nun wiederum ein p-Anteil, mittels des polarisierenden Strahlteilers (PBS) aus der Ringanordnung ausgekoppelt, wobei die p- und s-polarisierten Anteile räumlich überlagert werden. Um die auch möglichen Strahlungsanteile des Anregungslichtes aus dem s-polarisierten Objektlicht auszublenden, wird der Filteranordnung F1 über einen Spiegel M15 ein zweiter AOTF2 nachgeordnet, das auf die spektralen Bereiche des zur Anregung genutzten Lichtes (L1, L2) eingestellt ist. Die Strahlungsanteile des Anregungslichtes (L1, L2) werden hierdurch in Richtung des Detektionsstrahlengangs sowohl bezüglich des s- als auch des p-polarisierten Lichtes ausgeblendet. Insgesamt kann also mit dieser Anordnung der p-Anteil der am PBS ankommt, zweimal durch den AOTF1 und einmal durch AOTF2 und der s Anteil einmal durch AOTF2 bezüglich der störenden Strahlungsanteile gefiltert werden. Um die Transmission der Anordnung in Bezug auf Fluoreszenzlicht zu erhöhen, kann in Anordnung F1 auf einen Umlauf verzichtet werden, da noch eine Nachfilterung durch AOTF2 erfolgt. Dazu wird HWP entweder entfernt oder motorisch um 45° gedreht, wodurch keine Umorientierung der Polarisation erfolgt.The p-polarized portions p of the object light (D + L) are transmitted at the polarizing beam splitter (PBS) and pass through the in the described filter arrangement (F1), which includes an AOTF1, because they are rotated by HWP in s shares and thus reflected on PBS and the AOTF1 go through again. As a result, the radiation components of the excitation light (L1, L2) are efficiently masked out of the detection light (D1). The cleaned radiation is then, in turn, a p-portion, coupled out by means of the polarizing beam splitter (PBS) from the ring assembly, wherein the p- and s-polarized components are spatially superimposed. In order to hide the possible radiation components of the excitation light from the s-polarized object light, the filter arrangement F1 is followed by a mirror M15, a second AOTF2 downstream, which is set to the spectral regions of the light used for excitation (L1, L2). The radiation components of the excitation light (L1, L2) are thereby masked out in the direction of the detection beam path both with respect to the s and the p polarized light. Overall, therefore, with this arrangement, the p-portion that arrives at the PBS can be filtered twice by the AOTF1 and once by AOTF2 and the s-portion once by AOTF2 with respect to the interfering radiation components. In order to increase the transmission of the arrangement with respect to fluorescent light, a circulation can be dispensed with in arrangement F1, since there is still a post-filtering by AOTF2. For this purpose, HWP is either removed or rotated by 45 °, which does not reorient the polarization.

zeigt ein erfindungsgemäßes durchstimmbares Emissionsfilter, das eine Erweiterung der in der beschriebenen Anordnung darstellt. shows a tunable emission filter according to the invention, an extension of the in represents described arrangement.

Hier sind zwei PBS mit entgegengesetzter Orientierung der Teilerschicht vorgesehen.Here are two PBS provided with opposite orientation of the splitter layer.

Die p-polarisierten Anteile des Objektlichtes (D + L) durchlaufen die der entsprechende Filteranordnung (F1) wieder doppelt, die ein AOTF1 umfasst. Auf die Beschreibung von wird verwiesen.The p-polarized portions of the object light (D + L) pass through the corresponding filter arrangement (F1) again twice, which includes an AOTF1. On the description of will be referred.

Abschließend wird die von den Strahlungsanteilen des Anregungslichtes L1, L2 an BB bereinigte Detektionsstrahlung (D1) mit den s-polarisierten Strahlungsanteilen von D + Ln an PBS1 wieder räumlich überlagert und gelangt in Richtung von PBS2. Eine der Filteranordnung (F1) nachgeordnete achromatische Halbwellenplatte (HWP) dreht den Polarisationszustand der aus s und p Anteilen bestehenden Strahlung um 90°.Finally, the detection radiation (D1) which is adjusted by the radiation components of the excitation light L1, L2 to BB is spatially superimposed again on the PBS1 with the s-polarized radiation components of D + Ln and arrives in the direction of PBS2. An achromatic half-wave plate (HWP) arranged downstream of the filter arrangement (F1) rotates the polarization state of the radiation consisting of s and p portions by 90 °.

Hierdurch werden das von den Strahlungsanteilen des Anregungslichtes bereinigte Detektionslicht (D1) als s-polarisierte Strahlung am zweiten polarisierenden Strahlteiler (PBS2) reflektiert und in Richtung des Detektors DE geführt. Die p-polarisierten Anteile des Objektlichtes werden am PBS2 transmittiert und in eine weitere, 6 entsprechende ringförmige Filteranordnung (F2) eingekoppelt. Diese umfasst ein einziges AOTF2 und ist in der Wirkung mit F1 identisch.As a result, the detection light (D1), which has been cleared of the radiation components of the excitation light, is reflected as s-polarized radiation on the second polarizing beam splitter (PBS2) and guided in the direction of the detector DE. The p-polarized portions of the object light are transmitted on PBS2 and into another, 6 corresponding annular filter assembly (F2) coupled. This includes a single AOTF2 and is identical in effect to F1.

Die Strahlung durchläuft also die Anordnung F2 wieder doppelt, wobei der Polarisationszustand des Detektionslichtes (D2) bei jedem Durchlauf mittels einer achromatischen Halbwellenplatte (HWP) um 90° gedreht wird.The radiation thus passes through the arrangement F2 again twice, wherein the polarization state of the detection light (D2) is rotated by 90 ° with each pass by means of an achromatic half-wave plate (HWP).

Die Frequenzen des AOTF sind für beide Polarisationszustände an die spektralen Bereiche des Anregungslichtes (L1, L2) angepasst. Somit werden die ungewünschten spektralen Anteile des Anregungslichtes L1, L2 an BB bei jedem Durchlauf aus dem Detektionsstrahlengang (D2) gezielt ausgeblendet. Das p-polarisierte, ebenfalls von den Strahlungsanteilen des Anregungslichtes bereinigte Licht (D2) wird am polarisierenden Strahlteiler (PBS) transmittiert und zusammen mit D1 in Richtung des Detektors DE geführt.The frequencies of the AOTF are adapted to the spectral regions of the excitation light (L1, L2) for both polarization states. Thus, the unwanted spectral components of the excitation light L1, L2 are blinded to BB at each pass from the detection beam path (D2) targeted. The p-polarized light (D2), which is likewise cleared of the radiation components of the excitation light, is transmitted at the polarizing beam splitter (PBS) and guided together with D1 in the direction of the detector DE.

zeigt eine vorteilhafte Variante der beispielsweise sinngemäß in der beschriebenen Anordnung. Das unpolarisierte Objektlicht (D + L) durchläuft ein doppelbrechendes Polarisationsprisma, das vorzugsweise als Kalkspatstab (BDP) ausgeführt ist. Hierdurch werden die s- und p-polarisierten Anteile des Objektlichtes (D + L) räumlich getrennt und verlaufen vorzugsweise parallel, wobei der Polarisationszustand der s-Komponente mittels einer achromatischen Halbwellenplatte (HWP1), die dem doppelbrechenden Element BDP nachgeordet ist, um 90° gedreht wird. Beide parallel verlaufenden, beide p-polarisierten Teilstrahlen werden mit Hilfe eines polarisierenden Strahlteilers (PBS) in die Filteranordnung, die ein einziges AOTF umfasst und bereits in der beschrieben wurde, eingekoppelt. Hier werden die Strahlungsanteile des Anregungslichtes (L1, L2) aus dem Detektionsstrahlengang (D) beider Teilstrahlen simultan ausgeblendet und die bereinigten Detektionsstrahlen, nunmehr durch QWP gedreht, am polarisierenden Strahlteiler (PBS) reflektiert. Der Polarisationszustand einer der Teilstrahlen wird mittels einer weiteren achromatischern Halbwellenplatte HWP2 um 90° gedreht. Die beiden zueinander orthogonal polarisierten Teilstrahlen werden in einem zweiten doppelbrechenden Element, das vorzugsweise als Kalkspatstab (BDP) ausgeführt ist, räumlich zu einem unpolarisierten Detektionsstrahl (D) überlagert und in Richtung des Detektors DE geführt. Somit ermöglicht diese Anordnung eine simultane doppelte Filterung des Objektlichts mit Hilfe eines einzigen AOTF. shows an advantageous variant of, for example, mutatis mutandis in the described arrangement. The unpolarized object light (D + L) passes through a birefringent polarization prism, which is preferably designed as Kalkspatstab (BDP). As a result, the s- and p-polarized portions of the object light (D + L) are spatially separated and preferably parallel, wherein the polarization state of the s-component by means of an achromatic half-wave plate (HWP1), which is nachgeordet the birefringent element BDP, by 90 ° is turned. Both parallel, both p-polarized partial beams are using a polarizing beam splitter (PBS) in the filter assembly comprising a single AOTF and already in the was described, coupled. Here, the radiation components of the excitation light (L1, L2) are simultaneously masked out of the detection beam path (D) of both partial beams and the cleaned detection beams, now rotated by QWP, are reflected at the polarizing beam splitter (PBS). The polarization state of one of the partial beams is rotated by 90 ° by means of another achromatic half-wave plate HWP2. The two mutually orthogonally polarized partial beams are spatially superimposed in a second birefringent element, which is preferably designed as Kalkspatstab (BDP), to an unpolarized detection beam (D) and guided in the direction of the detector DE. Thus, this arrangement allows a simultaneous double filtering of the object light by means of a single AOTF.

Das zweite doppelbrechende Element BDP2 kann auch optional vorgesehen sein und die Strahlung aus PBS kann auch direkt auf den Detektor DE gelangen.The second birefringent element BDP2 may also be optionally provided and the radiation from PBS may also pass directly to the detector DE.

Im Unterschied zu der eingangs zitierten US 6982818 kann hier eine Direktkopplung durch Verwendung des PBS erfolgen.In contrast to the cited above US 6982818 Here, a direct coupling can be done by using the PBS.

zeigt eine vorteilhafte Variante der beispielsweise sinngemäß in dargestellten Anordnung, die ein einziges AOTF umfasst. Das linear polarisierte Detektionslicht (D1) durchläuft das AOTF doppelt in der nullten Beugungsordnung, wobei die Strahlungsanteile des Anregungslichtes (L1, L2) bei jedem Durchgang aus dem Detektionsstrahlengang (D1) ausgeblendet werden. Hierdurch wird eine effektive Filterung des Objektlichtes (D + L) möglich. shows an advantageous variant of, for example, mutatis mutandis in illustrated arrangement comprising a single AOTF. The linearly polarized detection light (D1) passes through the AOTF twice in the zeroth diffraction order, whereby the radiation components of the excitation light (L1, L2) are masked out of the detection beam path (D1) on each pass. As a result, an effective filtering of the object light (D + L) is possible.

Wird die Blende (BB) (eine der Blenden) durch ein Spiegel (M) ersetzt, so ist vorteilhaft zusätzlich auch eine Einkopplung der polarisierten Beleuchtungsstrahlung (L1, L2) in Richtung der Probe über die erste Beugungsordnung möglich.If the diaphragm (BB) (one of the diaphragms) is replaced by a mirror (M), coupling of the polarized illumination radiation (L1, L2) in the direction of the sample over the first diffraction order is advantageously also possible.

In diesem Fall dient diese Anordnung überraschend auch als durchstimmbarer Hauptfarbteiler, wobei das Detektionslicht (D1) doppelt gefiltert wird.In this case, this arrangement also surprisingly serves as a tunable main color splitter, wherein the detection light (D1) is filtered twice.

Dies ist vorteilhaft auch bei den anderen Darstellungen 29 möglich und wurde dort gestrichelt dargestellt (Als Einkoppelung beispielsweise s-polarisierter Laserstrahlung). Eine gleichzeitige Einkopplung und Auskopplung ist technisch ohne weiteres machbar und sinnvoll.This is also advantageous in the other representations 2 - 9 possible and was shown in dashed lines there (as coupling example, s-polarized laser radiation). A Simultaneous coupling and decoupling is technically feasible and reasonable.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Claims (3)

Anordnung und/oder Verfahren zur Eliminierung unerwünschter Strahlungsanteile aus detektiertem Licht das von einer beleuchteten Probe kommt, mit einem Beleuchtungsstrahlengang und einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Detektor zur Detektion des von der beleuchteten Probe kommenden Probenlichts das Anteile von in der Probe angeregtem Licht (Anregungslicht) und Beleuchtungslicht enthält, wobei im Detektionsstrahlengang mindestens ein akustooptischer durchstimmbarar Filter AOTF) vorgesehen ist und über mindestens ein Polarisationselement eine Aufspaltung des Probenlichtes in Polkomponenten (Polanteile), vorzugsweise zueinander senkrecht, erfolgt wobei mindestens eine Polkomponente mindestens zweimal denselben AOTF durchläuft oder einen ersten und mindestens einen zweiten AOTF durchläuft.Arrangement and / or method for eliminating unwanted radiation components from detected light which comes from an illuminated sample, with an illumination beam path and a detection beam path with at least one detector for detecting the sample light coming from the illuminated sample, the proportion of light excited in the sample (excitation light) and At least one acousto-optic tunable filter AOTF) is provided in the detection beam path and at least one polarization element splits the sample light into pole components (pole portions), preferably perpendicular to one another, wherein at least one pole component passes through the same AOTF at least twice or a first and at least one second AOTF goes through. Anordnung und/oder Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den Einsatz oder die Verwendung mindestens einer der nachfolgenden Merkmale, Verfahrensschritte oder Strukturen: – Polarisationselement ist ein Polteiler – beim zweiten Durchlauf durch einen AOTF oder den Durchlauf durch einen zweiten AOTF wird die Polarisationsrichtung gedreht so dass die Polanteile beide in Richtung Detektion gelangen – ein AOTF wird so angesteuert dass das polarisierte Anregungslicht in nullter Ordnung durch den AOTF hindurchgeht und das Beleuchtungslicht in erster Ordnung ausgeblendet wird – Ausblendung des Beleuchtungslichtes in eine Lichtfalle oder eine Strahlumlenkeinheit zur Weiterverwendung – Vereinen beider auf identische Weise behandelter Polarisationsrichtungen des Probenlichtes an einem Polarisationsstrahlteiler und Weiterleiten des Probenlichtes in Richtung Detektor – die Ausblendung des unerwünschten Lichtes nach dem AOTF erfolgt sowohl beim ersten als auch beim zweiten Eintritt in den AOTF oder beim Eintritt in einen ersten AOTF und beim Eintritt in einen zweiten AOTF, jeweils nach dem AOTF – beim Durchlauf durch den AOTF in Hin- und Rückrichtung ist auf beiden Seiten des AOTF eine Ausblendung vorgesehen – der AOTF wird von zwei Polkomponenten zweimal durchlaufen, wobei die Einstrahlung vor und nach dem AOTF in zwei eine Ebene aufspannenden Einfallsrichtungen erfolgt, die Ebene senkrecht zur Ausbreitungsebene der Longitudinalwelle des AOTF liegt und die Einstrahlrichtungen vorzugsweise symmetrisch zur Ausbreitungsrichtung liegen – der AOTF wird durch mindestens eine Polkomponente jeweils mindestens zweimaldurchlaufen – ein AOTF wird von mindestens einer Polkomponente zweimal durchlaufen – ein AOTF wird von mindestens einer Polkomponente zweimal durchlaufen, ein zweiter einmal – zur Polteilung und/oder Vereinigung der Polkomponenten wird ein doppelbrechendes Polarisationsprisma, vorzugsweise als Kalkspatstab (BDP) ausgebildet, eingesetzt, ein AOTF wird von mindestens einer Komponente zweimal durchlaufen – über Umlenkspiegel wird eine Ringanordnung für das Detektionslicht mit einem oder mehreren AOTF erzeugt – eine Auskopplung aus der Ringanordnung erfolgt über den Polteiler – zur Anwendung als Hauptfarbteiler wird über die erste Beugungsordnung in den AOTF Beleuchtungslicht eingekoppeltArrangement and / or method according to claim 1, characterized by the use or the use of at least one of the following features, method steps or structures: - Polarization element is a pole splitter - The second pass through an AOTF or the passage through a second AOTF, the polarization direction is rotated so that the pole parts both come in the direction of detection An AOTF is driven so that the polarized excitation light passes through the AOTF in zeroth order and the illumination light is faded out in the first order - Blanking of the illumination light in a light trap or a Strahlumlenkeinheit for further use - Combining both treated in an identical manner polarization directions of the sample light on a polarization beam splitter and forwarding the sample light in the direction of the detector - The blanking of unwanted light after the AOTF occurs both at the first and second entry into the AOTF or when entering a first AOTF and when entering a second AOTF, after the AOTF respectively - when passing through the AOTF in back and forth direction, a blanking is provided on both sides of the AOTF - The AOTF is traversed twice by two pole components, wherein the irradiation takes place before and after the AOTF in two directions of incidence, the plane is perpendicular to the propagation plane of the longitudinal wave of the AOTF and the irradiation directions are preferably symmetrical to the propagation direction - The AOTF is at least twice pass through at least one Polkomponente each An AOTF is traversed twice by at least one pole component An AOTF is run twice by at least one pole component, a second one once - For pole pitch and / or union of the pole components, a birefringent polarization prism, preferably formed as Kalkspatstab (BDP) is used, an AOTF is traversed twice by at least one component - About deflecting a ring assembly for the detection light is generated with one or more AOTF - A decoupling from the ring assembly via the pole divider - For use as a main color splitter is coupled via the first diffraction order in the AOTF illumination light Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) und/oder Betriebsverfahren für ein LSM, nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche.Laser scanning microscope (LSM) and / or operating method for an LSM, according to at least one of the preceding claims.
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