DE102008025328A1 - Detecting HIV in a blood sample comprises providing and optionally concentrating the sample, extracting viral nucleic acids, adding the extract to PCR master mix and performing amplification and detecting the amplified viral nucleic acids - Google Patents
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- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren, Zusammensetzungen und Testkits für die Amplifikation und Detektion von humanem Immundefizienzvirus (HIV). Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Multiplex-PCR-Verfahren, welches durch die Anwendung von multiplen Primersets/Sondensets alle bisher bekannten Subtypen von HIV-1, einschließlich der Gruppe M- und der Gruppe O-Isolate, sowie alle Subtypen von HIV-2 amplifizieren kann. Dabei erfolgt die Amplifikation der HIV-1 Subtypen bevorzugt in zwei konservierten Genomregionen, um das Risiko einer falsch negativen Reaktion durch spontane Mutationen des HIV signifikant gegenüber bisher beschriebenen HIV-Nachweisverfahren zu reduzieren.The The present invention relates to methods, compositions and test kits for the amplification and detection of human Immunodeficiency virus (HIV). In particular, the present invention relates to a multiplex PCR method, which by the application of multiple primer sets / probe sets all previously known subtypes of HIV-1, including the group M and the group O isolates, as well as all subtypes of HIV-2 can amplify. This takes place the amplification of the HIV-1 subtypes preferentially conserved in two Genome regions to reduce the risk of a false negative reaction spontaneous mutations of HIV significant compared to date to reduce the HIV detection method described.
Hintergrund der ErfindungBackground of the invention
Das erworbene Immundefizienzsyndrom (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS) wird durch das humane Immundefizienzvirus (HIV) verursacht. Das HI-Virus kann in zwei Gruppen differenziert werden: HIV-1 und HIV-2. Beide Gruppen zeigen eine genetische Verwandtschaft, jedoch eine Variabilität in der Erbinformation. Gegenwärtig werden in der Literatur 10 Subtypen von HIV-1 (Gruppe M umfassen die Subtypen A–I und Gruppe O umfasst den Subtyp O1 und O2) identifiziert. Diese große genetische Variabilität unter den HIV-Isolaten macht es extrem schwierig, Verfahren, umfassend die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), sowie Primer und Sonden zu entwerfen, welche alle Subtypen von HIV-1 und alle HIV-2-Subtypen effizient detektieren. Ferner muss damit gerechnet werden, dass aufgrund der fehlenden „Proof-Reading” Funktion der reversen Transkriptase weitere Mutationen bei HI-Viren auftreten werden und somit die Anzahl der Subtypen zunehmen wird.The acquired immune deficiency syndrome (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS) is caused by the human immunodeficiency virus (HIV). The HI virus can be differentiated into two groups: HIV-1 and HIV-2. Both groups show a genetic relationship, however a variability in genetic information. Currently In the literature, 10 subtypes of HIV-1 (Group M) will be included the subtypes A-I and group O include the subtypes O1 and O2) identified. This great genetic variability among the HIV isolates, it makes it extremely difficult to complete procedures the polymerase chain reaction (PCR), as well as primers and probes design all subtypes of HIV-1 and all HIV-2 subtypes detect efficiently. Furthermore, it must be expected that due to the missing "proof-reading" function the reverse transcriptase further mutations in HI viruses occur and thus the number of subtypes will increase.
Gegenwärtig
beschriebene Methoden basierend auf Multiplex-PCR beschreiben die
Amplifikation in jeweils einer Genomregion pro Virus (
Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Methoden für die Detektion aller bekannten HIV-1 Subtypen und HIV-2 Subtypen zur Verfügung zu stellen, um insbesondere im Blutspendewesen das Risiko für falsch negative Ergebnisse, wie verursacht durch Spontanmutationen in einer Genomregion von HIV, zu reduzieren.Therefore It is an object of the present invention, means and methods for the detection of all known HIV-1 subtypes and HIV-2 Subtypes to provide, especially in the blood donation the Risk of false negative results as caused by Spontaneous mutations in a genome region of HIV, reduce.
Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention
Die vorliegende Erfindung überwindet die oben aufgeführten Probleme und stellt Mittel zur Amplifikation und Detektion von hoch divergenten HIV-1 und HIV-2 Isolaten zur Verfügung.The The present invention overcomes the above Problems and provides means for amplification and detection of high divergent HIV-1 and HIV-2 isolates are available.
Die oben aufgeführte Aufgabe wird gelöst durch das zur Verfügung stellen von Verfahren für die Detektion aller bekannten HIV-1 Subtypen und/oder HIV-2 Subtypen in aus Blut abgeleiteten Proben, bevorzugt umfassend eine parallele Amplifikation in zwei konservierten Genombereichen des HIV. Somit wird das Risiko für falsch negative Ergebnisse durch Spontanmutationen in einer Genomregion von HIV reduziert. Die Erfindung stellt weiterhin Zusammensetzungen und Testkits zur Verfügung, die insbesondere für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind.The The above object is achieved by the provide methods for detection all known HIV-1 subtypes and / or HIV-2 subtypes in from blood derived samples, preferably comprising a parallel amplification in two conserved genomic regions of HIV. Thus, the risk for false negative results due to spontaneous mutations in a genome region reduced by HIV. The invention further provides compositions and test kits available, in particular for the methods of the invention are suitable.
Verschiedene andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung offensichtlich.Various Other objects and advantages of the present invention will become apparent the detailed description of the invention.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Amplifikation von HIV-Nukleinsäuren. Die Verfahren umfassen das in Kontaktbringen einer Probe, von der angenommen wird, dass sie HIV-Nukleinsäuren enthält, mit vier verschiedenen NTPs, einer reversen Transkriptase sowie ggf. RNase-Inhibitoren, einer thermostabilen DNA-Polymerase in der Gegenwart von Oligonukleotiden für die Amplifikation von HIV-1 Nukleinsäuren, von Oligonukleotiden für die Amplifikation von HIV-2 Nukleinsäuren sowie in Gegenwart von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotiden als Sonden für die Amplifikation von HIV-1 Zielnukleinsäuren, Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotiden als Sonden für die Amplifikation von HIV-2 Zielnukleinsäuren sowie in Gegenwart von Oligonukleotiden für die Amplifikation/Detektion einer internen Kontrolle sowohl in der Ausführungsform einer kompetitiven internen Kontrolle (z. B. HIV-1 interne Kontrolle) sowie in der Ausführungsform einer nicht kompetitiven internen Kontrolle (z. B. Bacteriophage MS2).The present invention relates to methods for amplifying HIV nucleic acids. The methods include contacting a sample suspected of containing HIV nucleic acids with four different NTPs, a reverse transcriptase, and optionally RNase inhibitors, a thermostable DNA polymerase in the presence of oligonucleotides for the amplification of HIV-1 nucleic acids, oligonucleotides for the amplification of HIV-2 nucleic acids and in the presence of fluorescent dye labeled oligonucleotides as probes for the amplification of HIV-1 target nucleic acids, fluorescent dye-labeled oligonucleotides as probes for the amplification of HIV-2 target nucleic acid and in the presence of oligonucleotides for the amplification / detection of an internal control both in the embodiment of a competitive internal control (eg HIV-1 internal control) and in the embodiment of a non-competitive internal control (eg bacteriophage MS2). ,
Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description the invention
Erfindungsgemäße Detektions- und ScreeningverfahrenInventive detection and screening methods
Wie oben ausgeführt, wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zur Detektion von HI-Viren in aus Blut abgeleiteten Proben gelöst.As stated above, the object is achieved by to provide a method of detection of HI viruses in blood-derived samples.
Das
erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgenden
Schritte:
In einem ersten Schritt (a) werden aus Blut abgeleitete
Proben zur Verfügung gestellt.The method according to the invention comprises the following steps:
In a first step (a) blood-derived samples are provided.
Im nächsten optionalen Schritt (b) werden die aus Blut abgeleiteten Proben konzentriert.in the next optional step (b) are those derived from blood Concentrated samples.
Im nächsten Schritt (c) erfolgt die Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine erste interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution.in the The next step (c) is the extraction of the viral Nucleic acids using a lysis buffer, which comprises a first internal control nucleic acid, and using heated nuclease-free water for elution.
Im nächsten Schritt (d) werden die viralen Nukleinsäure-Extrakte aus dem vorhergehenden Schritt (c) erhalten.in the next step (d) are the viral nucleic acid extracts obtained from the previous step (c).
Im nächsten Schritt (e) wird ein PCR-Mastermix hergestellt. Der PCR-Mastermix umfasst einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst. Der PCR-Mastermix umfasst weiterhin einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst.in the next step (e), a PCR master mix is prepared. The PCR master mix comprises a set of oligonucleotides that are specific for HIV-1 nucleic acids and at least each a sense primer, an antisense primer, a first probe and a second probe. The PCR master mix also includes a Set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids is and in each case at least one sense primer, an antisense primer and a third probe.
Der PCR-Mastermix umfasst weiterhin eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist. Die Sonden sind mit jeweils mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Die erste, zweite und dritte Sonde ist dabei bevorzugt jeweils mit mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert und die fünfte Sonde ist mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet.Of the PCR master mix also includes a fourth probe that is specific for the internal control nucleic acid. The Probes are labeled with at least one fluorescent dye each. The first, second and third probe is preferably each with labeled at least a first fluorescent dye and the fifth Probe is labeled with at least one second fluorescent dye which is different from the first fluorescent dye.
Im nächsten Schritt (f) werden die viralen Nukleinsäure-Extrakte (aus Schritt d) zum PCR-Mastermix zugegeben und die Nukleinsäuren amplifiziert. Im nachfolgenden Schritt (g) erfolgt die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren, d. h. der viralen Nukleinsäuren (wenn vorhanden) und der internen Kontroll-Nukleinsäure.in the next step (f) are the viral nucleic acid extracts (from step d) to the PCR master mix and the nucleic acids amplified. In the following step (g), the detection takes place the amplified nucleic acids, d. H. the viral nucleic acids (if present) and the internal control nucleic acid.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst bevorzugt die folgenden Schritte:
- a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
- b) optional, Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben,
- c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution,
- d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c),
- e) Herstellen eines PCR-Mastermixes, umfassend einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, und einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, und weiter umfassend eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, wobei die erste, zweite und dritte Sonde bevorzugt mit mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert sind, und wobei die vierte Sonde mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet,
- f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, und
- g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.
- a) providing blood-derived samples,
- b) optionally, concentrating the blood-derived samples,
- c) extraction of the viral nucleic acids using a lysis buffer comprising an internal control nucleic acid and using heated nuclease-free water for elution,
- d) obtaining the viral nucleic acid extracts from step c),
- e) preparing a PCR master mix comprising a set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids and each comprising at least one sense primer, an antisense primer, a first probe and a second probe, and a set of oligonucleotides, the is specific for HIV-2 nucleic acids and each comprises at least one sense primer, an antisense primer and a third probe, and further comprising a fourth probe specific for the internal control nucleic acid, wherein the first, second and third Preferably, the probe is labeled with at least one first fluorescent dye, and wherein the fourth probe is labeled with at least one second fluorescent dye different from the first fluorescent dye.
- f) adding the viral nucleic acid extracts from step d) to the PCR master mix and performing the nuc Acetic acid amplification, and
- g) detection of the amplified viral nucleic acids and the amplified internal control nucleic acid.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Aufgabe weiterhin gelöst durch das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zur Detektion von HIV-1 und/oder HIV-2 in aus Blut abgeleiteten Proben.In In a preferred embodiment, the object remains solved by providing a method for the detection of HIV-1 and / or HIV-2 in blood-derived Rehearse.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von dem oben genannten Verfahren in der Zusammensetzung des PCR-Mastermixes, der in Schritt (e) hergestellt wird.This inventive method differs from the above-mentioned method in the composition of the PCR master mix, which is produced in step (e).
Der PCR-Mastermix umfasst (für den Nachweis von HIV-1) einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst. Bevorzugt werden die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von verschiedenen konservierten Regionen, bevorzugt zwei verschiedenen konservierten Regionen, der HIV-1-Genotypen abgeleitet.Of the PCR master mix includes (for the detection of HIV-1) one Set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids is and at least two pairs of each a sense primer and an antisense primer and at least two pairs of one each first probe and a second probe. Preference is given to Nucleotide sequences of the primers and probes of various conserved Regions, preferably two different conserved regions, the Derived from HIV-1 genotypes.
Und/oder der PCR-Mastermix umfasst (für den Nachweis von HIV-2) einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst.And or the PCR master mix includes (for the detection of HIV-2) a set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids is and in each case at least one sense primer, an antisense primer and a third probe.
Der PCR-Mastermix umfasst weiterhin eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist. Die Sonden sind mit jeweils mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Die erste, zweite und dritte Sonde ist dabei bevorzugt jeweils mit mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert und die vierte Sonde ist mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet.Of the PCR master mix also includes a fourth probe that is specific for the internal control nucleic acid. The Probes are labeled with at least one fluorescent dye each. The first, second and third probe is preferably each with labeled at least a first fluorescent dye and the fourth Probe is labeled with at least one second fluorescent dye which is different from the first fluorescent dye.
Dieses Verfahren zur Detektion von HIV-1 und/oder HIV-2 in aus Blut abgeleiteten Proben der vorliegenden Erfindung umfasst bevorzugt die folgenden Schritte:
- a) zur Verfügung stellen von aus Blut abgeleiteten Proben,
- b) optional, Konzentrieren der aus Blut abgeleiteten Proben,
- c) Extraktion der viralen Nukleinsäuren unter der Verwendung eines Lyse-Puffers, der eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfasst, und unter der Verwendung von erhitztem Nuklease-freiem Wasser zur Elution,
- d) Erhalten der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt c),
- e) Herstellen eines PCR-Mastermixes, umfassend für den Nachweis von HIV-1 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst, wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden von verschiedenen konservierten Regionen der HIV-1-Genotypen abgeleitet werden (insbesondere von zwei verschiedenen konservierten Regionen der HIV-1-Genotypen, insbesondere der bekannten HIV-1-Genotypen), und/oder für den Nachweis von HIV-2 einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, und weiter umfassend eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, wobei die erste, zweite und dritte Sonde bevorzugt mit jeweils mindestens einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, und wobei die vierte Sonde mit mindestens einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, der sich von dem ersten Fluoreszenzfarbstoff unterscheidet,
- f) Zugabe der viralen Nukleinsäure-Extrakte aus Schritt d) zum PCR-Mastermix und Durchführen der Nukleinsäure-Amplifizierung, und
- g) Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren und der amplifizierten internen Kontroll-Nukleinsäure.
- a) providing blood-derived samples,
- b) optionally, concentrating the blood-derived samples,
- c) extraction of the viral nucleic acids using a lysis buffer comprising an internal control nucleic acid and using heated nuclease-free water for elution,
- d) obtaining the viral nucleic acid extracts from step c),
- e) preparing a PCR master mix comprising, for the detection of HIV-1, a set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids and at least two pairs each of a sense primer and an antisense primer and at least two pairs of each a first probe and a second probe, wherein the nucleotide sequences of the primers and probes are derived from different conserved regions of the HIV-1 genotypes (in particular from two different conserved regions of the HIV-1 genotypes, in particular the known HIV-1 genotypes ), and / or for the detection of HIV-2, a set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids, each comprising at least one sense primer, an antisense primer and a third probe, and further comprising a fourth probe, which is specific for the internal control nucleic acid, wherein the first, second and third probe preferably with at least one first fluorescent dye mark t, and wherein the fourth probe is labeled with at least one second fluorescent dye different from the first fluorescent dye,
- f) adding the viral nucleic acid extracts from step d) to the PCR master mix and performing the nucleic acid amplification, and
- g) detection of the amplified viral nucleic acids and the amplified internal control nucleic acid.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei den aus Blut abgeleiteten Proben um Blutproben oder um Bestandteile des Blutes enthaltende Proben, insbesondere handelt es sich um Vollblut, Plasma, Serum oder zelluläre Blutbestandteile enthaltende Proben. Die zelluläre Blutbestandteile enthaltenden Proben sind dabei ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Erythrozyten, Thrombozyten oder Plasmaprodukten.According to the invention the blood derived samples are blood samples or in particular blood containing samples of blood components whole blood, plasma, serum or cellular blood components containing samples. Containing the cellular blood components Samples are selected from the group consisting from erythrocytes, platelets or plasma products.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl zum Screening von Einzelproben als auch zum Screening von gepoolten Proben. In einer Ausführungsform werden die aus Blut abgeleiteten Proben zu mindestens einem Probenpool zusammengeführt. Von jeder für das Screening vorgesehenen Probe bzw. Probenpool werden bevorzugt mindestens 3000 μl (3 ml) Probe bzw. Probenpool benötigt. Untersucht werden bevorzugt Plasmaproben mit einem Mindestvolumen von 100 μl. Hierbei können Minipools bevorzugt von einer Poolgröße zwischen 3 und 96 Proben hergestellt und untersucht werden.The method according to the invention is suitable both for the screening of individual samples and for the screening of pooled samples. In one embodiment, the blood-derived samples are min at least one sample pool merged. Of each sample or sample pool intended for the screening, preferably at least 3000 μl (3 ml) of sample or sample pool are required. Plasma samples with a minimum volume of 100 μl are preferred. Minipools can preferably be prepared and analyzed from a pool size of between 3 and 96 samples.
Der Begriff „Oligonukleotide” bezieht insbesondere sich auf ein Molekül, welches eines oder mehrere Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide umfasst, wie z. B. Primer, Sonden und Nukleinsäurefragmente, die detektiert werden sollen.Of the The term "oligonucleotides" refers in particular refers to a molecule containing one or more deoxyribonucleotides or ribonucleotides, such as. Primers, probes and nucleic acid fragments, to be detected.
Der Begriff „Primer” bezieht sich insbesondere auf ein Oligonukleotid, welches entweder natürlich vorkommt oder synthetisch hergestellt wird und welches in der Lage ist, als ein Ausgangspunkt der Synthese zu agieren, wenn es unter Bedingungen gebracht wird, unter welchen die Synthese eines Primer-Extensionsprodukts komplementär zu einem Nukleinsäurestrang induziert wird. Dabei werden geeignete Reaktionsbedingungen (Temperatur, pH-Werte) für eine Amplifizierungs-Reaktion gewählt.Of the Term "primer" refers in particular to an oligonucleotide which is either naturally occurring or is produced synthetically and which is capable of, as a starting point of the synthesis to act when under conditions under which the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid strand becomes. In this case, suitable reaction conditions (temperature, pH values) chosen for an amplification reaction.
Um HIV-Zielnukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung zu amplifizieren, werden bevorzugt Primersets aus folgenden Oligonukleotiden ausgewählt: To amplify HIV target nucleic acids according to the present invention, primer sets are preferably selected from the following oligonucleotides:
Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure mindestens eine Region, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann. Erfindungsgemäß umfasst eine interne Kontroll-Nukleinsäure außerdem Regionen, an denen sich Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, spezifisch anlagern können, so dass die interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert werden kann.According to the invention an internal control nucleic acid at least one region, to which a probe can hybridize or attach specifically. According to the invention, an internal control nucleic acid comprises also regions where primers, such as sense primers and antisense primers that can specifically attach so that the internal control nucleic acid can be amplified.
Erfindungsgemäß ist die mindestens eine Region der internen Kontroll-Nukleinsäure, an die eine Sonde hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern kann, unterschiedlich zu Sequenzen des Zieltargets, der Nukleinsäuren der HI-Viren, HIV-1 und HIV-2, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden sollen. Das heißt eine Sonde, die spezifisch für die viralen Nukleinsäuren ist, wird nicht an die interne Kontroll-Nukleinsäure hybridisieren bzw. sich spezifisch anlagern. Daher wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine weitere (vierte) Sonde verwendet, deren Sequenz von der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet wurde.According to the invention the at least one region of the internal control nucleic acid, to which a probe can hybridise or specifically attach, different from sequences of the target, the nucleic acids the HIV viruses, HIV-1 and HIV-2, with the inventive Procedures are to be detected. That means a probe, which is specific for the viral nucleic acids, will not hybridize to the internal control nucleic acid or attach themselves specifically. Therefore, in the inventive Method uses a further (fourth) probe whose sequence of derived from the internal control nucleic acid.
Es wird bevorzugt, dass die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz ist bzw. eine Nukleinsäure ist, die eine kompetitive oder eine nicht kompetititve Nukleotidsequenz umfasst.It it is preferred that the internal control nucleic acid is a competitive or non-competitive nucleotide sequence or a nucleic acid which is a competitive or a noncompetitive nucleotide sequence.
Erfindungsgemäß zeichnet sich eine kompetitive Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure dadurch aus, dass sich die Regionen, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern können, nicht unterscheiden von den respektiven Regionen der Nukleinsäuren der HI-Viren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden sollen. Das heißt dieselben Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, führen zur Amplifikation der nachzuweisenden viralen Nukleinsäuren und zur Amplifikation der internen kompetitiven Kontroll-Nukleinsäure.Draws according to the invention a competitive nucleotide sequence or nucleic acid characterized in that the regions in which primers are specific can not attach for amplification differ from the respective regions of the nucleic acids the HI viruses, with the method according to the invention to be detected. That means the same primers like sense primers and antisense primers, lead to amplification the viral nucleic acids to be detected and for amplification the internal competitive control nucleic acid.
Dahingegen sind die Regionen einer nicht kompetitiven Nukleotidsequenz bzw. Nukleinsäure, an denen sich Primer spezifisch für eine Amplifikation anlagern können, verschieden zu den respektiven Regionen der viralen Nukleinsäuren. Das heißt die Primer, wie Sense-Primer und Antisense-Primer, die zur Amplifikation der nachzuweisenden viralen Nukleinsäuren führen, amplifizieren nicht zugleich die interne nicht kompetitive Kontroll-Nukleinsäure.On the other hand, the regions of a non-competitive nucleotide sequence or nucleic acid on which primers can attach specifically for amplification are different to the respective regions of the viral nucleic acids. That is, the primers, such as sense primers and antisense primers used for amplification the viral nucleic acids to be detected do not simultaneously amplify the internal non-competitive control nucleic acid.
Weiter bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine Nukleotidsequenz, deren Zuckerbestandteil Desoxyribose oder Ribose ist. Weiter bevorzugt handelt es sich bei einer internen Kontroll-Nukleinsäure um eine Nukleotidsequenz aus DNA, RNA oder modifizierten Nukleotiden, aber auch um DNA- oder RNA-Konstrukte, insbesondere synthetisierte DNA- oder RNA-Konstrukte.Further Preferably, it is an internal control nucleic acid to a nucleotide sequence whose sugar constituent deoxyribose or Ribose is. More preferably, it is an internal control nucleic acid a nucleotide sequence of DNA, RNA or modified nucleotides, but also to DNA or RNA constructs, in particular synthesized DNA or RNA constructs.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleotidsequenz. Für den Nachweis von HIV, insbesondere von HIV-1, hat die interne Kontroll-Nukleinsäure bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 16 oder ein Komplementär davon.In Another preferred embodiment is the internal one Control nucleic acid a competitive nucleotide sequence. For the detection of HIV, in particular of HIV-1, the internal control nucleic acid prefers the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 16 or a complement thereof.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleotidsequenz. Für den Nachweis von HIV, insbesondere von HIV-2, hat die interne Kontroll-Nukleinsäure bevorzugt eine nicht kompetitive Nukleotidsequenz und ist ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2.In Another preferred embodiment is the internal one Control nucleic acid is a non-competitive nucleotide sequence. For the detection of HIV, especially of HIV-2, the internal control nucleic acid prefers a non-competitive Nucleotide sequence and is selected from the nucleotide sequence of Bacteriophage MS2.
Für den Nachweis einer solchen Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 umfasst der PCR-Mastermix in den erfindungsgemäßen Verfahren weiterhin einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für MS2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer und einen Antisense-Primer umfasst.For the detection of such a nucleotide sequence of bacteriophage MS2 includes the PCR master mix in the invention The process continues with a set of oligonucleotides specific for MS2 nucleic acids is and at least one sense primer and an antisense primer.
Bevorzugt ist dabei der Sense-Primer ausgewählt ist aus SEQ ID NOs. 10, 12 und 14 und der Antisense-Primer ist bevorzugt ausgewählt aus SEQ ID NOs. 11, 13 und 15, wobei bevorzugt aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer ausgewählt wird SEQ ID NOs. 10 und 11, SEQ ID NOs. 12 und 13, SEQ ID NOs. 14 und 15. Für die entsprechenden Sonden, siehe unten.Prefers is the sense primer is selected from SEQ ID NOs. 10, 12 and 14 and the antisense primer is preferably selected from SEQ ID NOs. 11, 13 and 15, wherein preferably from the following pairs each selected a sense primer and an antisense primer SEQ ID NOs. 10 and 11, SEQ ID NOs. 12 and 13, SEQ ID NOs. 14 and 15. For the corresponding probes, see below.
Unter einer Multiplex-PCR versteht man die Amplifikation von mindestens zwei Nukleinsäuresequenzen in einem Amplifikationsschritt. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Nukleinsäuren von HI-Viren, insbesondere HIV-1 und/oder HIV-2, durch eine geeignete Wahl der Primer- und Sonden-Sequenzen amplifiziert, sofern sie (die Viren) in der Untersuchungsprobe vorhanden sind. Ferner wird die zugegebene interne Kontroll-Nukleinsäure amplifiziert und überwacht damit die Amplifikation, vor allem in negativen Untersuchungsproben, in denen keine Amplifikation viraler Nukleinsäuren stattfindet.Under A multiplex PCR is understood to mean the amplification of at least two nucleic acid sequences in an amplification step. In the method according to the invention, the nucleic acids of HI viruses, in particular HIV-1 and / or HIV-2, by a suitable Choice of primer and probe sequences amplified, provided they (the Viruses) are present in the test sample. Furthermore, the added internal control nucleic acid amplified and monitored so that the amplification, especially in negative specimens, in which no amplification of viral nucleic acids takes place.
Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet einen PCR-Mastermix.The The method according to the invention uses a PCR master mix.
Für jede Zielnukleinsäure wird im allgemeinen ein Set von mindestens 2 Primern verwendet. Eine Vielzahl von Sets an Primern kann simultan verwandt werden, um eine Vielzahl von Zielnukleinsäuren zu amplifizieren.For each target nucleic acid will generally be a set of at least 2 primers used. A variety of sets of primers can be used simultaneously be used to target a variety of target nucleic acids to amplify.
Für den gleichzeitigen Nachweis von HI-Viren, insbesondere von HIV-1 und HIV-2, umfasst der PCR-Mastermix bevorzugt:
- – einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, und
- – einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, und weiterhin
- – eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist.
- A set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids and at least one Sen se primer, an antisense primer, a first probe and a second probe, and
- A set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids, each comprising at least one sense primer, an antisense primer and a third probe, and further
- A fourth probe specific for the internal control nucleic acid.
In einer bevorzugten Ausführungsform für den Nachweis von HI-Viren, insbesondere von HIV-1 und/oder HIV-2, umfasst der PCR-Mastermix:
- – für den Nachweis von HIV-1: einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und mindestens zwei Paare aus jeweils einem Sense-Primer und einem Antisense-Primer und mindestens zwei Paare aus jeweils einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde umfasst, wobei die Nukleotidsequenzen der Primer und Sonden bevorzugt von verschiedenen konservierten Regionen der bekannten HIV-1-Genotypen abgeleitet werden,
- – für den Nachweis von HIV-2: einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst, und weiterhin
- – eine vierte Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist.
- For the detection of HIV-1: a set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids and at least two pairs of one sense primer and one antisense primer and at least two pairs each of a first probe and a second probe wherein the nucleotide sequences of the primers and probes are preferably derived from different conserved regions of the known HIV-1 genotypes,
- For the detection of HIV-2: a set of oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids, each comprising at least one sense primer, an antisense primer and a third probe, and further
- A fourth probe specific for the internal control nucleic acid.
Methoden
für die Präparation und Verwendung von Sonden
und Primern werden zum Beispiel beschrieben in
Die
Anmelder begannen die Entwicklung ihres PCR-Amplifikationssystems
für HI-Viren durch die Identifikation von hoch konservierten
Sequenzregionen von HIV-1 sowie HIV-2. Primer wurden für
konservierte Regionen unter Zuhilfenahme der aktuellen Literatur
(
Die erfindungsgemäßen Satze Oligonukleotide aus je mindestens einem Sense-Primer, einem Antisense-Primer und mindestens einer Sonde sind spezifisch für die Nukleinsäuren von HIV-1 bzw. HIV-2. Die Sequenzen des Sense-Primers, des Antisense-Primers und der Sonden werden bevorzugt abgeleitet von in den Gendatenbanken veröffentlichen Nukleotidsequenzen von HIV-1 und HIV-2.The sets according to the invention oligonucleotides from each at least one sense primer, one antisense primer and at least a probe are specific to the nucleic acids of HIV-1 and HIV-2, respectively. The sequences of the sense primer, the antisense primer and the probes are preferably derived from in the gene databases publish nucleotide sequences of HIV-1 and HIV-2.
Eine wesentliche Innovation der vorliegenden Erfindung besteht in der simultanen Amplifikation der HIV-1 Zielnukleinsäure in den konservierten Regionen 5' LTR sowie gag. In der vorliegenden Erfindung wurden somit Primersets für HIV-1 und HIV-2 entwickelt, welche miteinander kompatibel sind und daher kombiniert werden können. Die Primer und Fluoreszenz markierten Oligonukleotide (Sonden) wurden dabei so gewählt, dass alle bisher bekannten Isolate von HIV-1 und HIV-2 detektiert werden können. Aufgrund der fehlenden Proof-Reading Funktion der reversen Transkriptase besteht bei Retroviren eine höhere Gefahr für das Auftreten von neuen Mutationen sowie neuen Genotypen bzw. Subtypen. Die Anmelder haben dieses Hindernis dahingehend überwunden, dass der Nachweis der HIV Zielnukleinsäure in mehreren Regionen erfolgt.A essential innovation of the present invention is in the simultaneous amplification of HIV-1 target nucleic acid in the conserved regions 5 'LTR and gag. In the present Invention thus primer sets for HIV-1 and HIV-2 were developed, which are compatible with each other and therefore can be combined. The primers and fluorescently labeled oligonucleotides (probes) were chosen so that all previously known isolates of HIV-1 and HIV-2 can be detected. Due to the lack of proof-reading function of reverse transcriptase exists in retroviruses a higher risk of occurrence new mutations and new genotypes or subtypes. The applicants have overcome this obstacle to the effect that the Detection of HIV target nucleic acid in multiple regions he follows.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Nukleotidsequenzen der Oligonukleotide, die spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren sind, von konservierten Regionen der (bekannten) HIV-1-Genotypen/Isolate, insbesondere der 5'-LTR-Region und der gag-Region, abgeleitet.In a preferred embodiment of the invention The method will be the nucleotide sequences of the oligonucleotides, the specific for HIV-1 nucleic acids are conserved Regions of the (known) HIV-1 genotypes / isolates, in particular the 5'-LTR region and the gag region, derived.
Bevorzugt ist:
- – der Sense-Primer ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 1, 3, 5 und 6 oder Komplementären davon,
- – der Antisense-Primer ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 2, 4 und 7 oder Komplementären davon,
- – die erste Sonde ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 19 und 21 oder Komplementären davon und
- – die zweite Sonde ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NOs. 20 und 22 Komplementären davon,
wobei SEQ ID NOs. 5–7, 21 und 22 von der HIV-1 5'-LTR-Region abgeleitet wurden.Preference is given to:
- The sense primer selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 1, 3, 5 and 6 or complements thereof,
- The antisense primer selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 2, 4 and 7 or complements thereof,
- The first probe selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 19 and 21 or complements tare of it and
- The second probe selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs. 20 and 22 complementary ones,
wherein SEQ ID NOs. 5-7, 21 and 22 were derived from the HIV-1 5 'LTR region.
Hier wird das Verfahren zum Nachweis von HIV-1 verwendet.Here the method is used to detect HIV-1.
Besonders
bevorzugt wird dabei aus folgenden Paaren aus jeweils einem Sense-Primer
und einem Antisense-Primer ausgewählt SEQ ID NOs. 1 und
2, SEQ ID NOs. 3 und 4, SEQ ID NOs. 5 und 7, SEQ ID NOs. 6 und 7;
und/oder
wird aus folgenden Paaren aus jeweils einer ersten Sonde und einer
zweiten Sonde ausgewählt SEQ ID NOs. 19 und 20, SEQ ID
NOs. 21 und 22.Particular preference is given to selecting from the following pairs of in each case one sense primer and one antisense primer SEQ ID NOs. 1 and 2, SEQ ID NOs. 3 and 4, SEQ ID NOs. 5 and 7, SEQ ID NOs. 6 and 7;
and / or is selected from the following pairs of in each case a first probe and a second probe SEQ ID NOs. 19 and 20, SEQ ID NOs. 21 and 22.
Weiter bevorzugt werden folgende Kombinationen der Paare verwendet: More preferably, the following combinations of the pairs are used:
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Nukleotidsequenzen der Oligonukleotide, die spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren sind, von konservierten Regionen der (bekannten) HIV-2-Genotypen/Isolate, insbesondere der 5'-LTR-Region, abgeleitet.In a preferred embodiment of the invention The method will be the nucleotide sequences of the oligonucleotides, the specific for HIV-2 nucleic acids are conserved Regions of the (known) HIV-2 genotypes / isolates, in particular the 5'-LTR region derived.
Bevorzugt hat der Sense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 8 oder ein Komplementär davon, der Antisense-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 9 oder ein Komplementär davon und die dritte Sonde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 23 oder ein Komplementär davon. Hier wird das Verfahren zum Nachweis von HIV-2 verwendet.Prefers the sense primer has the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 8 or a complement thereof, the antisense primer the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 9 or a complement thereof and the third Probe the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 23 or a general partner from that. Here, the method for the detection of HIV-2 is used.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Nukleotidsequenz der vierten Sonde, die spezifisch für die interne Kontroll-Nukleinsäure ist, von der Sequenz der internen Kontroll-Nukleinsäure abgeleitet.In a preferred embodiment of the invention Procedure is the nucleotide sequence of the fourth probe that is specific for the internal control nucleic acid is, from derived from the sequence of internal control nucleic acid.
Aufgrund der genetischen Diversität und dem Vorhandensein von multiplen Genotypen und Subtypen, stellt die Entwicklung eines Co-Amplifikationssystems für die simultane Detektion von HIV-1 und HIV-2 eine extreme erfinderische Herausforderung dar. Zentrale Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Primerinteraktionen zwischen mindestens 11 Primern (ausgewählt aus SEQ ID NOs. 1–9) sowie 7 fluoreszenz-markierten Oligonukleotidsonden (ausgewählt aus SEQ ID NOs. 19–23) zu minimieren, sowie Nebenproduktbildungen, welche sowohl die Assay-Sensitivität als auch möglicherweise die Spezifität reduzieren können, zu vermeiden. Ferner war es notwendig, eine interne Kontrolle („Interna”) zu den Amplifikationsprimern zuzufügen. Dabei gibt es zwei bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Zum einen besteht die Möglichkeit, eine kompetitive interne Kontrolle zu verwenden (wie SEQ ID NO. 16), die für die Amplifikation die Primer von HIV-1 verwendet und für die Detektion ein spezielles Fluoreszenz-markiertes Oligonukleotid (Sonde, wie SEQ ID NO. 24) verwendet. Zum anderen besteht eine Ausführungsform in der Verwendung einer nicht kompetitiven internen Kontrolle (z. B. Bacteriophage MS2) unter Verwendung von Oligonukleotidprimern (ausgewählt aus SEQ ID NOs. 10–15) und eines Fluoreszenz-markierten Oligonukleotides (Sonde, ausgewählt aus SEQ ID NOs. 25–27).Due to genetic diversity and the presence of multiple genotypes and subtypes, the development of a co-amplification system for the simultaneous detection of HIV-1 and HIV-2 is an extremely inventive challenge. Central to the present invention was to facilitate primer interactions between at least 11 Primers (selected from SEQ ID Nos. 1-9) as well as 7 fluorescently-labeled oligonucleotide probes (selected from SEQ ID Nos. 19-23) as well as by-product formations which may reduce both assay sensitivity and possibly specificity avoid. Furthermore, it was necessary to add an internal control ("internals") to the amplification primers. There are two preferred embodiments of the invention. First, it is possible to use a competitive internal control (such as SEQ ID NO: 16) that uses the primers of HIV-1 for amplification and a specific fluorescence-labeled oligonucleotide (probe, such as SEQ ID NO: 24) used for detection. On the other hand, one embodiment is the use of a non-competitive internal control (eg bacteriophage MS2) using oligonucleotide primers (selected from SEQ ID NOs. 10-15) and a fluorescently-labeled oligonucleotide (probe selected from SEQ ID NOs 25-27).
Ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine kompetitive Nukleotidsequenz und hat die Sequenz SEQ ID NO. 16, dann hat die vierte Sonde bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 24.is the internal control nucleic acid is a competitive nucleotide sequence and has the sequence SEQ ID NO. 16, then the fourth probe has been preferred the nucleotide sequence of SEQ ID NO. 24th
Ist die interne Kontroll-Nukleinsäure eine nicht kompetitive Nukleotidsequenz und hat insbesondere eine Nukleotidsequenz von Bacteriophage MS2 hat, dann hat die vierte Sonde bevorzugt eine Nukleotidsequenz ausgewählt von SEQ ID NOs. 25, 26 oder 27.is the internal control nucleic acid is a non-competitive Nucleotide sequence and in particular has a nucleotide sequence of Bacteriophage MS2 has, then the fourth probe preferably has one Nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs. 25, 26 or 27th
Hier werden folgende Kombinationen der Primer-Paare mit der vierten Sonde bevorzugt: Here, the following combinations of the primer pairs with the fourth probe are preferred:
Bei einer „Sonde” handelt es sich um ein Oligonukleotid, welches an den Enden mit bestimmten Fluorochromen markiert/gelabelt wurde. Nach dem physikalischen Prozess des Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET-Prinzip), welches 1946 von Theodor Förster beschrieben wurde, wird die einströmende Energie vom Reporter Molekül auf ein Quenchermolekül übertragen. Nach dem spezifischen Anlagern der Oligonukleotide an die Nukleinsäure-Zielsequenz, wird durch die Exonukleasefunktion der Polymerase die Distanz zwischen dem Reporter und dem Quencher vergrößert, so dass der so genannte Förster Radius (r) zunimmt und anschließend der Energietransfer vom Reporter auf den Quencher nicht mehr erfolgen kann. In diesem Fall wird eine zunehmende Emission der Fluoreszenzwellenlänge des Reportermoleküls detektiert. Unter der Verwendung bekannter Verfahren des Standes der Technik können die Sonden mit einem spezifischen Bindungsliganden (z. B. Biotin), einem Enzym (z. B. Glukoseoxidase, Peroxidasen, Originase oder alkalischer Phosphatase), Radioisotopen, elektronendichten Reagenzien, Chromogenen, Fluorogenen, phosphoreszierenden Resten oder Pheritin markiert werden. Bevorzugt dabei ist die Markierung mittels spezifischer Fluochrome.at a "probe" is an oligonucleotide, which at the ends marked / labeled with certain fluorochromes has been. After the physical process of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET principle), which was created in 1946 by Theodor Förster has been described, is the incoming energy from the reporter Transfer molecule to a quencher molecule. After specifically annealing the oligonucleotides to the nucleic acid target sequence, is the distance between the exonuclease function of the polymerase Enlarged the reporter and the quencher, so that the so-called Förster radius (r) increases and then the energy transfer from the reporter to the quencher no longer take place can. In this case, there will be an increasing emission of the fluorescence wavelength of the reporter molecule detected. Using known Prior art methods can use the probes with a specific binding ligand (eg biotin), an enzyme (eg glucose oxidase, peroxidases, originase or alkaline phosphatase), Radioisotopes, electron-dense reagents, chromogens, fluorogens, phosphorescent residues or pheritin. Prefers the marking is by means of specific fluochromes.
Die Sonden, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind bevorzugt mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, insbesondere solche, die für Realtime-PCR geeignet sind. Dabei handelt es sich bevorzugt um einen Fluoreszenzdonor oder -reporter und einen Fluoreszenzakzeptor oder -quencher sind. Eine Sonde ist bevorzugterweise mit einem Paar aus jeweils einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher (einem FRET-Paar bzw. Fluoreszenzfarbstoffpaar) markiert.The Probes used in the method according to the invention are preferably labeled with fluorescent dyes, in particular those that are suitable for real-time PCR. It acts it is preferably a fluorescence donor or reporter and a Fluorescence acceptor or quencher. A probe is preferably with a pair of each a fluorescent donor or reporter and a fluorescence acceptor or quencher (a FRET pair or Fluorescent dye pair).
Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzdonoren oder -reporter sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cyan 500, 6-FAM, VIC, HEX, Yakima Yellow, BDP, TMR, NED, TET, Texas Red, LC610, Cy5 und LC670 vergleichbaren Fluoreszenzdonoren/–reportern. Erfindungsgemäß geeignete Fluoreszenzakzeptoren oder -quencher sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus TAMRA, MGP, Black Hole Quencher 1, Black Hole Quencher 2, BodiPy 564/570, BBQ, DDQ und Cy5 oder vergleichbaren Fluoreszenzakzeptoren/-quenchern.According to the invention suitable Fluorescence donors or reporters are selected from the Group consisting of Cyan 500, 6-FAM, VIC, HEX, Yakima Yellow, BDP, TMR, NED, TET, Texas Red, LC610, Cy5 and LC670 comparable Fluoreszenzdonoren / -reportern. According to the invention suitable Fluorescence acceptors or quenchers are selected from the group consisting of TAMRA, MGP, Black Hole Quencher 1, Black Hole Quencher 2, BodiPy 564/570, BBQ, DDQ and Cy5 or similar Fluoreszenzakzeptoren / -quenchern.
Es wird bevorzugt, dass die erste und die zweite und die dritte Sonde jeweils mit dem gleichen Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert ist.It it is preferred that the first and the second and the third probe each labeled with the same fluorescent dye pair.
Für die erste, zweite und dritte Sonde: wird eine einheitliche Fluoreszenzmarkierung am 5'-Ende der Sonden bevorzugt und am 3'-Ende wird ein Blackhole-Quencher bevorzugt.For the first, second and third probe: becomes a uniform fluorescent label at the 5 'end of the probes preferred and at the 3' end becomes a blackhole quencher prefers.
Es wird weiterhin bevorzugt, dass sich das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten, zweiten und dritten Sonde von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der vierten Sonde unterscheidet.It is further preferred that the fluorescent dye pair the first, second and third probes of the fluorescent dye pair the fourth probe is different.
Bevorzugt unterscheidet sich die Fluoreszenzmarkierung am 5'-Ende, wie FAM für die erste, zweite und dritte Sonde (HIV-Nukleinsäureamplifikation) und Cy5 für die vierte Sonde (interne Kontrolle).Prefers the fluorescence label differs at the 5 'end, like FAM for the first, second and third probe (HIV nucleic acid amplification) and Cy5 for the fourth probe (internal control).
Wenn HIV-1 und HIV-2 gleichzeitig nachgewiesen werden sollen, kann sich das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten und zweiten Sonde von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der dritten Sonde unterscheiden, welche sich wiederum von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar der vierten Sonde unterscheiden.If HIV-1 and HIV-2 can be detected simultaneously the fluorescent dye pair of the first and second probes of the Fluorescent dye pair of the third probe distinguish which in turn, from the fluorescent dye pair of the fourth probe differ.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fluoreszenzfarbstoffpaar der ersten, zweiten und dritten Sonde FAM und TAMRA und ist das Fluoreszenzfarbstoffpaar der vierten Sonde VIC und TAMRA. Alternativ werden Kombinationen von FAM und Black Hole Quenchern sowie VIC und Black Hole Quenchern bevorzugt.In a preferred embodiment is the fluorescent dye pair the first, second and third probes FAM and TAMRA and is the Fluorescent dye pair of the fourth probe VIC and TAMRA. Alternatively Combinations of FAM and Black Hole Quenchers as well as VIC and Black Get quenchers preferred.
Der Vorteil einer geeigneten Wahl der Paare der Fluoreszenzfarbstoffe ist es, dass aufgrund der unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen gleichzeitig zwei Fluoreszenz-Emissionen (z. B. von FAM und VIC) oder auch mehrere (z. B. 3) Fluoreszenz-Emissionen beobachtet werden können und damit jeweils auf die An- bzw. Abwesenheit von HI-Viren, insbesondere HIV-1 und/oder HIV-2, und interner Kontroll-Nukleinsäure rückgeschlossen werden kann. Dabei ist zu beachten, daß sich die Anregungs- und Emissionswellenlängen jeweils nicht überlappen bzw. interagieren.Of the Advantage of a suitable choice of the pairs of fluorescent dyes is it because of the different excitation and emission wavelengths two fluorescence emissions simultaneously (eg from FAM and VIC) or several (eg 3) fluorescence emissions are observed can and thus each on the presence or absence of HI viruses, especially HIV-1 and / or HIV-2, and internal control nucleic acid can be deduced. It should be noted that the excitation and emission wavelengths do not overlap or interact.
Es liegt im Können des Fachmanns, jeweils geeignete Fluoreszenzfarbstoffpaare auszuwählen. Dabei sollen die unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt werden, dass eine gegenseitige Überstrahlung bzw. Überlagerung der Fluoreszenzemissionen (bzw. sogenanntes „bleed through”) vermieden wird.It is within the skill of the artisan, each suitable fluorescent dye pairs select. In this case, the different fluorescent dyes be chosen so that a mutual overshoot or overlay fluorescence emissions (or so-called bleed-through) is avoided.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind eine oder mehrere der Sonden Hydrolyse-Sonden oder Molecular Beacons.In A preferred embodiment is one or more the probes hydrolysis probes or molecular beacons.
Bevorzugterweise umfasst das Konzentrieren der Proben in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens Zentrifugieren. Dabei werden bevorzugterweise, die in der Probe enthaltenen Bestandteile, wie Zellen und Viren, angereichert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mit Barcode etikettierte Gefäße, die die Proben enthalten, zunächst 15 Minuten bei mind. 5000 × g und anschließend 1 Stunde bei mindestens 48.000 × g zentrifugiert. Anschließend wird jeweils der Überstand verworfen.preferably, comprises concentrating the samples in step b) of the invention Procedure centrifuging. In this case, preferably, in the sample contained ingredients, such as cells and viruses, enriched. In a preferred embodiment, with barcode labeled vessels containing the samples, first 15 minutes at least 5000 × g and then Centrifuged for 1 hour at least 48,000 × g. Subsequently each supernatant is discarded.
Die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt i) ist bevorzugt ausgewählt aus Multiplex-PCR, insbesondere Multiplex-Realtime-PCR, TMA (Transkription mediated amplification), LCR, NASBA und SDA.The Nucleic acid amplification in step i) is preferred selected from multiplex PCR, in particular multiplex real-time PCR, TMA (Transcription mediated amplification), LCR, NASBA and SDA.
Die Nukleinsäure-Amplifizierung in Schritt f) ist bevorzugt eine Multiplex-PCR, weiter bevorzugt eine Multiplex-Realtime-PCR. Bevorzugt erfolgt zunächst eine reverse Transkription, bei der die vorhandene virale RNA und die interne Kontroll-RNA in eine cDNA umgeschrieben wird. Im weiteren erfolgt dann die Amplifikation der cDNA durch eine DNA-Polymerase.The Nucleic acid amplification in step f) is preferred a multiplex PCR, more preferably a multiplex real-time PCR. Preferably, a reverse transcription first takes place, in which the existing viral RNA and the internal control RNA in a cDNA is rewritten. In the further then the amplification takes place the cDNA by a DNA polymerase.
Die Detektion der amplifizierten viralen Nukleinsäuren erfolgt bevorzugt mittels des Realtime-Prinzips. Bindet/hybridisiert dabei eine Sonde an ihrer Zielsequenz, wird der Reporter der Sonde durch die Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase, wie Taq-Polymerase, im Verlauf der Amplifikation abgespalten. Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer (FRET) vom Reporter zum Quencher kann somit aufgrund der räumlichen Distanz nicht mehr erfolgen. Die emittierte Energie des Reporters wird als positives Signal aufgezeichnet. Da der Reporter der für die viralen Nukleinsäuren spezifischen Sonde (z. B. FAM-markierte Sonde) Fluoreszenz in einem anderen Wellenbereich emittiert als der Reporter der weiteren Sonde, die für die interne Kontroll-Nukleinsäure spezifisch ist (z. B. VIC-markierte Sonde), können beide Amplifikationen voneinander unterschieden werden.The Detection of the amplified viral nucleic acids takes place preferably by means of the real-time principle. Binds / hybridizes a probe at its target sequence, the reporter of the probe is going through the exonuclease function of DNA polymerase, such as Taq polymerase, cleaved during the amplification. The fluorescence resonance energy transfer (FRET) from reporter to quencher can thus be due to the spatial distance not done anymore. The emitted energy of the reporter is called recorded positive signal. As the reporter of for the viral nucleic acid-specific probe (eg FAM-labeled Probe) emits fluorescence in a different wavelength range than the reporter of the additional probe responsible for the internal control nucleic acid is specific (eg, VIC-labeled probe), both Amplifications can be distinguished from each other.
Die
generellen Prinzipien und Bedingungen für die Amplifikation
und die Detektion von Nukleinsäuren unter der Verwendung
von der Polymerase Kettenreaktion (PCR) sind sehr gut bekannt, wobei
die Details davon in zahlreichen Referenzen zur Verfügung
gestellt werden, einschließlich
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen und TestkitsCompositions according to the invention and test kits
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von Zusammensetzungen, die zum Nachweis von HI-Viren, insbesondere HIV-1 und/oder HIV-2, geeignet sind, gelöst. Diese erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden bevorzugt in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.The Task is further according to the invention by the provide compositions for detection HI viruses, in particular HIV-1 and / or HIV-2, are suitable, solved. These compositions according to the invention are preferred in the process of the invention used.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-1-Nukleinsäuren ist und jeweils mindestens einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer, eine erste Sonde und eine zweite Sonde umfasst, und/oder einen Satz Oligonukleotide, der spezifisch für HIV-2-Nukleinsäuren ist und mindestens jeweils einen Sense-Primer, einen Antisense-Primer und eine dritte Sonde umfasst. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiterhin bevorzugt eine vierte Sonde, die spezifisch für eine interne Kontroll-Nukleinsäure ist.A Composition according to the invention comprises a Set of oligonucleotides specific for HIV-1 nucleic acids and in each case at least one sense primer, an antisense primer, a first probe and a second probe, and / or a set Oligonucleotides specific for HIV-2 nucleic acids and at least one sense primer each, an antisense primer and a third probe. An inventive Composition further preferably comprises a fourth probe, the specific for an internal control nucleic acid is.
Bei einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann es sich um einen PCR-Mastermix handeln, wie er in Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt und für die Amplifizierung der viralen Nukleinsäuren und der internen Kontroll-Nukleinsäure verwendet wird.at It can be a composition of the invention be a PCR master mix, as in step e) of the invention Method and for the amplification of the viral Nucleic acids and the internal control nucleic acid is used.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weiterhin eine interne Kontroll-Nukleinsäure umfassen.A Composition according to the invention can continue include an internal control nucleic acid.
Die Auswahl der Nukleotidsequenzen für Primer, Sondern und interne Kontroll-Nukleinsäuren etc. wurde bereits oben bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeführt.The Selection of nucleotide sequences for primers, but and internal control nucleic acids etc. have already been listed above in the description of the method according to the invention executed.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von HIV-1 umfasst
- – mindestens zwei Oligonukleotide, die ausgewählt sind aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 1 bis 7, bevorzugt ausgewählt aus den Paaren SEQ ID NOs. 1 und 2, SEQ ID NOs. 3 und 4, SEQ ID NOs. 5 und 7, SEQ ID NOs. 6 und 7; oder deren Komplementäre und
- – mindestens ein Oligonukleotid ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO. 19 bis 22 oder deren Komplementäre.
- At least two oligonucleotides selected from nucleotide sequences SEQ ID NOs. 1 to 7, preferably selected from the pairs SEQ ID NOs. 1 and 2, SEQ ID NOs. 3 and 4, SEQ ID NOs. 5 and 7, SEQ ID NOs. 6 and 7; or their complements and
- - At least one oligonucleotide selected from the nucleotide sequences SEQ ID NO. 19 to 22 or their complementaries.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von HIV-2 umfasst Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 8 und 9 oder deren Komplementäre und ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 23 oder ein Komplementär davon.A Composition according to the invention for detection of HIV-2 comprises oligonucleotides having the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 8 and 9 or their complements and an oligonucleotide with the nucleotide sequence SEQ ID NO. 23 or a general partner from that.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zum Nachweis von HI-Viren, insbesondere HIV-1 und HIV-2, umfasst Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 1 bis 9 oder deren Komplementäre sowie Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 23 oder deren Komplementäre.A Composition according to the invention for detection HI viruses, particularly HIV-1 and HIV-2, include oligonucleotides with the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 1 to 9 or their complementaries as well Oligonucleotides with the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 19 to 23 or their complements.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiterhin bevorzugt ein Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 24 oder ein Komplementär davon.A Composition according to the invention further comprises preferably an oligonucleotide having the nucleotide sequence SEQ ID NO. 24 or a complement thereof.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst weiterhin bevorzugt
- – mindestens zwei Oligonukleotide, die ausgewählt sind aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 10 bis 15, bevorzugt ausgewählt aus den Paaren SEQ ID NOs. 10 und 11, SEQ ID NOs. 12 und 13, SEQ ID NOs. 14 und 15; oder deren Komplementäre und
- – mindestens ein Oligonukleotid ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO. 25 bis 27 oder deren Komplementäre.
- At least two oligonucleotides selected from nucleotide sequences SEQ ID NOs. 10 to 15, preferably selected from the pairs SEQ ID NOs. 10 and 11, SEQ ID NOs. 12 and 13, SEQ ID NOs. 14 and 15; or their complements and
- - At least one oligonucleotide selected from the nucleotide sequences SEQ ID NO. 25 to 27 or their complementaries.
Die Sonden einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind bevorzugt jeweils mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Die zwei Fluoreszenzfarbstoffe sind bevorzugt ein Paar, bestehend aus einem Fluoreszenzdonor oder -reporter und einem Fluoreszenzakzeptor oder -quencher. Der Fluoreszenzdonor oder -reporter ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cyan 500, 6-FAM, VIC, HEX, Yakima Yellow, BDP, TMR, NED, TET, Texas Red, LC610, Cy5 und LC670. Der Fluoreszenzakzeptor oder -quencher ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus TAMRA, MGP, Black Hole Quencher 1, Black Hole Quencher 2, BodiPy 564/570, BBQ, DDQ und Cy5. Die Auswahl der Fluoreszenzfarbstoffe etc. wurde bereits oben bei der Beschreibung der erfindungsgemäßen Verfahren ausgeführt.The Probes of a composition according to the invention are preferably each labeled with two fluorescent dyes. The two fluorescent dyes are preferably a pair consisting from a fluorescent donor or reporter and a fluorescence acceptor or quenching. The fluorescent donor or reporter is selected from the group consisting of Cyan 500, 6-FAM, VIC, HEX, Yakima Yellow, BDP, TMR, NED, TET, Texas Red, LC610, Cy5 and LC670. Of the Fluorescence acceptor or quencher is selected from the Group consisting of TAMRA, MGP, Black Hole Quencher 1, Black Hole Quencher 2, BodiPy 564/570, BBQ, DDQ and Cy5. The selection of fluorescent dyes etc. has already been mentioned above in the description of the invention Procedure executed.
In einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung sind die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 27 oder deren Komplementäre mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert.In a composition of the invention are the Oligonucleotides with the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 19 to 27 or their complements with two fluorescent dyes marked.
Bevorzugt sind Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 19 bis 23 mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoffpaar markiert, das sich von dem Fluoreszenzfarbstoffpaar, mit dem Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NOs. 24 bis 27 markiert sind, unterscheidet.Prefers are oligonucleotides with the nucleotide sequences SEQ ID NOs. 19 to 23 each labeled with a fluorescent dye pair, which is from the fluorescent dye pair, with the oligonucleotides with the Nucleotide sequences SEQ ID NOs. 24 to 27 are marked, different.
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen von Testkits zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von HI-Viren in aus Blut abgeleiteten Proben.The Task is further according to the invention by the provide test kits for implementation a method according to the invention for detection of HI viruses in blood-derived samples.
Ein erfindungsgemäßer Testkit umfasst
- – mindestens eine der erfindungsgemäßen hierin beschriebenen Zusammensetzungen,
- – Reagenzien und Hilfsstoffe für die Extraktion viraler Nukleinsäuren aus aus Blut abgeleiteten Proben und/oder für die Nukleinsäure-Amplifizierung.
- At least one of the compositions according to the invention described herein,
- - Reagents and excipients for the extraction of viral nucleic acids from blood-derived samples and / or for nucleic acid amplification.
Ein PCR-Reagenz bezieht sich auf irgendeines der Reagenzien, die als essentiell für die PCR angesehen werden, nämlich ein Set an Primern für eine Zielnukleinsäure, eine DNA Polymerase, eine reverse Transkriptase, PCR-Puffer und ein oder mehrere Desoxyribonukleosid-5-Triphosphate (dNTPs).One PCR Reagent refers to any of the reagents identified as be considered essential for the PCR, namely a set of primers for a target nucleic acid, a DNA polymerase, a reverse transcriptase, PCR buffer and one or more deoxyribonucleoside 5-triphosphates (dNTPs).
Eine
DNA-Polymerase ist ein Enzym, welches Desoxynukleosid-Monophosphat-Moleküle
an das 3'-Hydroxylende des Primers in einem Komplex von Primer und
Matrize addiert. Bevorzugt sind thermostabile DNA-Polymerasen, von
denen eine Zahl im Stand der Technik einschließlich derjenigen,
die im Detail in
Die
PCR-Reagenzien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
werden in der PCR in geeigneten Konzentrationen zur Verfügung
gestellt und verwendet, um die Amplifikation der Zielnukleinsäure(n) zu
ermöglichen. Die minimale Menge der DNA-Polymerase ist
im Allgemeinen mindestens ungefähr 0,5 Einheiten pro 100
Mikroliter Lösung, wobei ungefähr 2–25
Einheiten pro 100 Mikroliter Lösung bevorzugt werden und
von ungefähr 7–20 Einheiten pro 100 Mikroliter
Lösung weiter bevorzugt werden. Die minimale Menge jedes
Primers, der bei der Amplifikation verwendet wird, ist mindestens
ungefähr 0,075 Mikromolar, wobei ungefähr 0,1–2
Mikromolar bevorzugt werden, aber andere Mengen sind im Stand der
Technik bekannt. Die PCR-Reagenzien können individuell
oder in zahlreichen Kombinationen oder alle in einer gepufferten
Lösung, die einen pH-Wert im Bereich von ungefähr
pH 7–pH 9 aufweist, unter der Verwendung irgendeines geeigneten Puffers,
wovon viele im Stand der Technik bekannt sind, bereitgestellt werden.
Die amplifizierten Nukleinsäuren können auf einer
Reihe von bekannten Wegen detektiert werden, wie z. B. denjenigen,
die im
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen illustriert.The The present invention is illustrated in the following examples.
In der vorliegenden Erfindung, wie z. B. in den beschriebenen Beispielen, kann gezeigt werden, dass die Verwendung von unterschiedlichen Primersets und Sondensets die gleichzeitige Amplifikation von HIV-1 Nukleinsäuren sowie HIV-2 Nukleinsäuren ermöglicht. Somit existiert ein neues Verfahren sowohl für das Screening von Blutspenden in Pools von bis zu 96 Einzelproben als auch für das Screening von Einzelproben. Der Vorteil der gemeinsamen Amplifikation in einem Reaktionsansatz liegt im geringeren Materialverbrauch an Reagenzien, Enzymen, Primern sowie in einer Reduzierung der Amplifikationsgeräte (Thermocycler). Ferner reduziert sich durch die vorliegende Erfindung das Risiko von falsch negativen Ergebnissen durch spontane Mutationen im Primer/Sondenbereich des HIV-1 Virus. Bezugnehmend auf die Prävalenz von HIV-1 für Deutschland stellt gerade dieses Virus eine besondere Situation dar, die in den 90ziger Jahren zum AIDS Skandal führte und seitdem der besonderen Aufmerksamkeit verdient.In the present invention, such as. As in the examples described, it can be shown that the use of different primer sets and sets of probes allows the simultaneous amplification of HIV-1 nucleic acids and HIV-2 nucleic acids. Thus, a new method exists for the screening of blood donations in pools of up to 96 individual samples as well as for the screening of individual samples. The advantage of the common amplification in a reaction mixture is the lower material consumption of reagents, enzymes, primers and a reduction of the amplification devices (thermocycler). Further, the present invention reduces the risk of false negative results due to spontaneous mutations in the primer / probe region of the HIV-1 virus. Referring to the prevalence of HIV-1 in Germany, it is precisely this virus that represents a special situation that became AIDS in the 1990s Scandal led and deserves special attention since then.
BeispieleExamples
Materialien und MethodenMaterials and methods
In der bevorzugten Ausführungsform ist als PCR-Puffer QuantiTect Multiplex PCR Mastermix (QTMP, Qiagen, Hilden, Deutschland) zu verwenden. Der optimierte PCR Puffer enthält eine Magnesiumchlorid-Konzentration von 11 Millimolar sowie eine HotStarTaq DNA-Polymerase (rekombinierte 94 kDa) DNA-Polymerase, isoliert aus Thermus aquaticus und kloniert in E. Coli), dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP/dUTP) Ultrapur Rox (passive Referenz Fluoreszenzfarbstoff) sowie RNase freies Wasser.In of the preferred embodiment is QuantiTect as PCR buffer Multiplex PCR Mastermix (QTMP, Qiagen, Hilden, Germany). The optimized PCR buffer contains a magnesium chloride concentration of 11 millimolar and a HotStarTaq DNA polymerase (recombined 94 kDa) DNA polymerase, isolated from Thermus aquaticus and cloned in E. Coli), dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP / dUTP) Ultrapur Rox (passive reference fluorescent dye) and RNase-free water.
An weiteren Enzymen werden in der bevorzugten Ausführungsform die SuperScript III der Firma Invitrogen (MMLV RT mit RNase H-Aktivität; 200 IU/μl) verwandt. Als weiteres Enzym zur Vermeidung von einer Kontamination mit RNasen wird RNasin der Firma Promega (Ribonuklease Inhibitor; 40 IU/μl) verwandt.At other enzymes are in the preferred embodiment the SuperScript III from Invitrogen (MMLV RT with RNase H activity; 200 IU / μl). As another enzyme to avoid RNasin from Promega becomes a contaminant with RNases (Ribonuclease inhibitor, 40 IU / μl).
Als Primer werden die Oligonukleotide mit den SEQ ID NO. 1–11 sowie als Sonden die Oligonukleotide mit den SEQ ID NO. A–E sowie die Sonde (SEQ ID NO F) für eine kompetitive interne Kontrolle sowie bevorzugt die Sonde (SEQ ID NO G) für eine nicht-kompetitive interne Kontrolle verwendet.When Primers are the oligonucleotides having the SEQ ID NO. 1-11 and as probes, the oligonucleotides having the SEQ ID NO. A-E and the probe (SEQ ID NO F) for a competitive internal Control and preferably the probe (SEQ ID NO G) for a non-competitive internal control used.
Die Amplifikation erfolgt mittels Realtime-PCR mit speziellen Oligonukleotiden, die am 5'-Ende mit verschiedenen Fluorochromen (Reporter-Fluochrom) gelabelt sind und am 3'-Ende einen Quencher (Quencher-Fluochrom) aufweisen. Für die vorliegende Erfindung sind folgende Fluorochrome geeignet: Cyan 500, 6-FAM, VIC, HEX, Yakima Yellow, TET, NET, Texas Red, LC610, Cy5, LC670. Für die Amplifikation von HIV-Zielnukleotidsequenzen (HIV-1 Nukleinsäuren und HIV-2 Nukleinsäuren) wird für die Oligonukleotide (Sonden) mit den SEQ ID NOs. A–E eine einheitliche Fluoreszenz-Markierung am 5'-Ende empfohlen. Am 3' Ende wird ein Blackhole-Quencher empfohlen.The Amplification takes place by means of real-time PCR with special oligonucleotides, at the 5'-end with different fluorochromes (reporter fluochrome) are labeled and at the 3'-end a quencher (quencher-fluochrome) exhibit. The following are for the present invention Fluorochromes suitable: Cyan 500, 6-FAM, VIC, HEX, Yakima Yellow, TET, NET, Texas Red, LC610, Cy5, LC670. For the amplification of HIV target nucleotide sequences (HIV-1 nucleic acids and HIV-2 nucleic acids) is used for the oligonucleotides (probes) with the SEQ ID NOs. A-E a uniform fluorescent label recommended at the 5'-end. At the 3 'end a blackhole quencher is recommended.
Die Fluoreszenzfarbstoff-gelabelten Oligonukleotide (Sonden) für die interne Kontrolle weisen am 5'-Ende einen Fluoreszenzfarbstoff auf, der sich von den Fluoreszenzfarbstoff-gelabelten Oligonukleotide (Sonden) für die Detektion der HIV-Nukleinsäuren unterscheidet (z. B. 6-FAM für HIV-Nukleinsäureamplifikation und Cy5 für interne Kontrollen). Erfindungsgemäß können folgende interne Kontrollen verwandt werden: SEQ ID NO. F für die kompetitive interne Kontrolle und SEQ ID NO. G–I für die nicht kompetitive interne Kontrolle.The Fluorescent dye-labeled oligonucleotides (probes) for the internal control has a fluorescent dye at the 5 'end different from the fluorescent dye-labeled oligonucleotides (probes) differentiates for the detection of HIV nucleic acids (eg, 6-FAM for HIV nucleic acid amplification and Cy5 for internal controls). According to the invention the following internal controls are used: SEQ ID NO. F for the competitive internal control and SEQ ID NO. G-I for the non-competitive internal control.
Als interne positive Kontrolle wurde eine kompetitive Kontrollsequenz zur HIV-1 Zielnukleinsäurensequenz mit Hilfe einer in vitro Transkription hergestellt sowie eine nicht-kompetitive interne Kontrollsequenz aus dem Bacteriophagen MS2 verwandt.When internal positive control became a competitive control sequence to the HIV-1 target nucleic acid sequence using an in vitro Transcription produced as well as a non-competitive internal control sequence from the bacteriophage MS2.
Für die Herstellung der kompetitiven internen Kontrolle wurde folgendes DNA Oligonukleotid synthetisiert.For the production of the competitive internal control became as follows DNA oligonucleotide synthesized.
Es erfolgt eine Amplifikation mit folgenden Primern: SEQ ID NO. 17: There is an amplification with the following primers: SEQ ID NO. 17:
SEQ ID NO. 18: SEQ ID NO. 18:
Nach erfolgter Amplifikation sowie der Darstellung des Amplifikats im Agarose-Gel erfolgte eine Gelextraktion mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskits sowie eine anschließende in vitro Transkription mit Hilfe des in-Vitro-Transkription Kit der Firma Ambion. Nach erfolgter Aufreinigung mit Mega Clear (Firma Ambion) sowie dem Poly(A)Purist mRNA wird die interne Kontrolle in Konzentrationen zu 3000 Kopien/μl aliquotiert.To Successful amplification and the representation of the amplificate in Agarose gel was gel extracted using the Qiagen Gel Extraction Kit and subsequent in vitro transcription with help the in-vitro transcription kit of the company Ambion. After successful Purification with Mega Clear (Ambion) and the poly (A) purist mRNA becomes the internal control in concentrations of 3000 copies / μl aliquoted.
Für die nicht-kompetitive interne Kontrolle wurde der Bacteriophage MS2 von der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig bezogen. Die Analyse erfolgte an Realtime Cycler der Firma ABI (ABI PRISM 7000, ABI PRISM 7300, ABI PRISM 7500).For the non-competitive internal control was the bacteriophage MS2 from the German collection of microorganisms and cell cultures in Brunswick. The analysis was performed on Realtime Cycler Company ABI (ABI PRISM 7000, ABI PRISM 7300, ABI PRISM 7500).
Für die Amplifikation zum Nachweis der Zielnukleinsäure wurde folgendes Cyclerprogramm verwendet.
- 1. 55°C 1–60 Minuten mit einer bevorzugten Zeit von 20 Minuten einmal
- 2. 95°C 1–30 Minuten mit einer bevorzugten Zeit von 15 Minuten einmal
- 3. 95°C 1–30 Sekunden gefolgt von 62°C 10 Sekunden–5 Minuten mit bevorzugten Zeiten von 10 Sekunden, 95°C und 30 Sekunden bei 62°C. Insgesamt 2–20 Wiederholungen
- 4. 95°C 2 Sekunden–2 Minuten gefolgt von 56°C 10 Sekunden–2 Minuten mit einer bevorzugten Zeit von 93°C 10 Sekunden und 56°C 40 Sekunden mit 50 Wiederholungen
- 1. 55 ° C 1-60 minutes with a preferred time of 20 minutes once
- 2. 95 ° C 1-30 minutes with a preferred time of 15 minutes once
- 3. 95 ° C for 1-30 seconds followed by 62 ° C for 10 seconds-5 minutes with preferred times of 10 seconds, 95 ° C and 30 seconds at 62 ° C. A total of 2-20 repetitions
- 4. 95 ° C 2 seconds-2 minutes followed by 56 ° C 10 seconds-2 minutes with a preferred time of 93 ° C 10 seconds and 56 ° C 40 seconds with 50 repetitions
Experimenteexperiments
Die
Anmelder begannen die Entwicklung ihres PCR-Amplifikationssystems
für HI-Viren durch die Identifikation von hoch konservierten
Sequenzregionen von HIV-1 sowie HIV-2. Primer wurden für
konservierte Regionen unter Zuhilfenahme der aktuellen Literatur
(
Des Weiteren wurden die einzelnen Primersysteme bezüglich ihrer gegenseitigen Verträglichkeit in einem geeigneten Puffersystem überprüft.Of Further, the individual primer systems were compared to their mutual compatibility in a suitable buffer system.
– Analytische Sensitivität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz- Analytical sensitivity of HIV-1 or HIV-2 in the multiplex approach
Anschließend wurde die formulierte Entwicklung bezüglich der analytischen Sensitivität bezogen auf HIV-1 sowie HIV-2 mit Hilfe einer Probitanalyse untersucht. Die Probitanalyse wurde mit dem Programm SPSS 12.0 (nicht log-converted) durchgeführt.Subsequently became the formulated development concerning the analytical Sensitivity to HIV-1 and HIV-2 with the help of a Probit analysis examined. The probit analysis was done with the program SPSS 12.0 (not log-converted).
Diesbezüglich wurden jeweils im Multiplex-Mix je Verdünnungsstufe 24 Replikate in 8 unterschiedlichen Verdünnungsstufen in Minipools (96 Proben pro Pool) untersucht.In this regard, were each in the multiplex mix per dilution stage 24 Replicates in 8 different dilution levels in mini pools (96 samples per pool).
Für HIV-1: wurden am WHO Standard NIBSC 97/650 HIV-1 folgende Konzentrationen untersucht: 2000 IU/ml, 1000 IU/ml, 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 3,13 IU/ml und 0,31 IU/ml.For HIV-1: were at the WHO standard NIBSC 97/650 HIV-1 following concentrations investigated: 2000 IU / ml, 1000 IU / ml, 500 IU / ml, 250 IU / ml, 125 IU / ml, 62.5 IU / ml, 3.13 IU / ml and 0.31 IU / ml.
Für HIV-2: wurden anhand einer quantifizierten Plasmakonserve HIV-2 folgende Konzentrationen untersucht: 2000 IU/ml, 1000 IU/ml, 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 3,13 IU/ml und 0,31 IU/ml.For HIV-2: were measured using a quantified plasma HIV-2 investigated the following concentrations: 2000 IU / ml, 1000 IU / ml, 500 IU / ml, 250 IU / ml, 125 IU / ml, 62.5 IU / ml, 3.13 IU / ml and 0.31 IU / ml.
Die Extraktion erfolgte mittels QIAamp ViralRNA Kit, die Analyse mittels ABI PRISM® 7000 SDS).The extraction was carried out using QIAamp Kit ViralRNA, analysis by ABI PRISM ® 7000 SDS).
Es zeigte sich eine analytische Sensitivität bezogen auf 1 ml Einzelspende von 434,7 IU/ml für HIV-1 und von 795 IU/ml für HIV-2. Die maximale analytische Sensitivität pro prozessiertes Volumen beträgt 4,5 IU/ml für HIV-1 und 8,3 Kopien/ml für HIV-2.It showed an analytical sensitivity with respect to 1 ml single donation of 434.7 IU / ml for HIV-1 and 795 IU / ml for HIV-2. The maximum analytical sensitivity per processed volume is 4.5 IU / ml for HIV-1 and 8.3 copies / ml for HIV-2.
– Analytische Spezifität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz- Analytical specificity of HIV-1 or HIV-2 in the multiplex approach
Bezüglich
der analytischen Spezifität wurden Untersuchungen mit potentiell
kreuzreaktiven Erregern (Polivirus Typ 1, Typ 2, Typ 3, Echovirus
Typ 6, Typ 7, Typ 9, Typ 11, Typ 30, Coxsackievirus A9, B1, B2,
B3, B4, B5, CMV, Humanes Herpes Virus A1, Humanes Herpes Virus A2,
Adenovirus, Staphylococcus aureus, Escherichia Coli, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca, Bacillus
cereus, Hepatitis B Genotyp A, B, C, D, E, F; Hepatitis C Genotyp
1A, 1B, 2A, 2B, 2C, 2I, 3, 4, 5) durchgeführt. Dabei zeigte
sich keine Kreuzreaktivität mit potentiell kreuzreaktiven
Erregern, sondern eine HIV-1 spezifische Amplifkation (Tabelle 1)
bzw. eine HIV-2 spezifische Amplifkation (Tabelle 2). Bezüglich
HIV-1 wurde eine Untersuchung an Genotypen Panels mit den Subtypen
der Gruppe M, A, B, C, D, E, F, G und H sowie der Gruppe O durchgeführt.
Es zeigte sich eine Amplifikation aller bekannter Subtypen. Tabelle 1 Spezifitätstestung
des DRK HIV-1 PCR Kits mit potentiell kreuzreaktiven Erregern
– Diagnostische Sensitivität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz- Diagnostic sensitivity of HIV-1 or HIV-2 in the multiplex approach
Zur
Analyse der diagnostischen Sensitivität wurden jeweils
100 Positivkontrollen mit einer Konzentration des Dreifachen der
95% Nachweisgrenze (1800 IU/ml HIV-1; 2400 Kopien/ml HIV-2) analysiert.
Dabei zeigte sich eine diagnostische Sensitivität größer
99,9%.
für HIV-1:
for HIV-1:
– Diagnostische Spezifität von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex Ansatz- Diagnostic specificity of HIV-1 or HIV-2 in the multiplex approach
Zur
Untersuchung der diagnostischen Spezifität wurden jeweils
500 negative Poolproben analysiert. Untersucht wurden jeweils 500
Pool-Proben im Zeitraum von Januar bis März 2008. Es zeigte
sich eine diagnostische Spezifität größer
99,8%.
für HIV-1:
for HIV-1:
– Robustheit von HIV-1 bzw. HIV-2 im Multiplex AnsatzRobustness of HIV-1 or HIV-2 in the multiplex approach
Die Robustheit wurde alternierend an 8 Reihen von HIV-1 positiven Proben (106 IU/ml) und negativen Proben analysiert, ein identisches Verfahren wurde anschließend für HIV-2 Proben durchgeführt. Es zeigte sich ein robustes Verfahren. Eine Kontamination konnte ausgeschlossen werden.Robustness was analyzed alternately on 8 rows of HIV-1 positive samples (10 6 IU / ml) and negative samples, and an identical procedure was subsequently performed for HIV-2 samples. It showed a robust process. Contamination could be excluded.
Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows Sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can of the official publication platform of the DPMA become.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
- - EP 0727497 B1 [0003] - EP 0727497 B1 [0003]
- - EP 0630973 A2 [0003] - EP 0630973 A2 [0003]
- - DE 69833160 T2 [0003] - DE 69833160 T2 [0003]
- - US 4683195 [0076] US 4683195 [0076]
- - US 4683202 [0076] US 4683202 [0076]
- - US 4965188 [0076, 0093, 0094] US 4965188 [0076, 0093, 0094]
- - US 4889818 [0093] US 4889818 [0093]
Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature
- - Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Vol. 1–3, Hrsg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 [0044] Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3, eds. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. [0044]
- - Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987 (mit periodischen Aktualisierungen) und Innis et al., PCR-Protokolle [0044] Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987 (with periodic updates), and Innis et al., PCR Protocols [0044] Current Protocols in Molecular Biology, Ed.
- - A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990 [0044] - A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990 [0044]
- - http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi [0044] - http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi [0044]
- - C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258–1266 [0045] C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258-1266 [0045]
- - C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302–4308 [0045] C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302-4308 [0045]
- - Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316–7321 [0045] Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316-7321 [0045]
- - Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478–483 [0045] - Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478-483 [0045]
- - J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551–4557 [0045] J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551-4557 [0045]
- - C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258–1266 [0108] C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258-1266 [0108]
- - C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302–4308 [0108] C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302-4308 [0108]
- - Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316–7321 [0108] Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316-7321 [0108]
- - Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478–483 [0108] - Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478-483 [0108]
- - J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551–4557 [0108] - J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551-4557 [0108]
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Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE112015005476B4 (en) | 2014-12-04 | 2023-01-26 | Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. | METHOD AND SYSTEM FOR DETECTING AND DISTINGUISHING BETWEEN AT LEAST TWO DYES |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
EP0630973A2 (en) | 1993-05-14 | 1994-12-28 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Diagnostic compositions, elements, methods & test kits for amplification & detection of two or more DNA's using primers having matched melting temperatures |
EP0727497B1 (en) | 1995-02-17 | 2003-04-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Primers and probes for the detection of HIV |
DE69833160T2 (en) | 1997-06-25 | 2006-09-14 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Amplification and detection of HIV-1 and / or HIV-2 |
-
2008
- 2008-05-27 DE DE200810025328 patent/DE102008025328B4/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683202B1 (en) | 1985-03-28 | 1990-11-27 | Cetus Corp | |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683195B1 (en) | 1986-01-30 | 1990-11-27 | Cetus Corp | |
US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
EP0630973A2 (en) | 1993-05-14 | 1994-12-28 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Diagnostic compositions, elements, methods & test kits for amplification & detection of two or more DNA's using primers having matched melting temperatures |
EP0727497B1 (en) | 1995-02-17 | 2003-04-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Primers and probes for the detection of HIV |
DE69833160T2 (en) | 1997-06-25 | 2006-09-14 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Amplification and detection of HIV-1 and / or HIV-2 |
Non-Patent Citations (16)
Title |
---|
A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990 |
Adam MacNeil, Journal of Virology, 2006, 7316-7321 |
C. Drosten et al., Clinical Chemistry, 2006, 1258-1266 |
C. Drosten et al., Journal of Clinical Microbiology, 2001, 4302-4308 |
Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987 (mit periodischen Aktualisierungen) und Innis et al., PCR-Protokolle |
Dreier J. u.a.: Use of bacteriophage MS2 as an internal control in viral reverse transcription-PCR assays. In: J. of Clinical Microbiology (2005) 43 (9) 4551-4557 * |
Drosten C. u.a.: TaqMan 5'-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening. In: J. of Clinical Microbiology (2001) 39 (12) 4302- 4308 * |
Drosten C. u.a.: Ultrasensitive monitoring of HIV-1 viral load by a low-cost real-time reverse transcription-PCR assay with internal control for the 5' long terminal repeat domain. In: Clin . Chem. (2006) 52 (7) 1258-66 * |
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi |
J. Dreier et al., Journal of Clinical Microbiology, 2005, 4551-4557 |
Kevin PO-Connell et al., Applied Environmental Microbiology, 2006, 478-483 |
MacNeil A. u.a.: Genomic sites of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) integration: similarities to HIV-1 in vitro and possible differences in vivo. In: J. of Virology (2006) 80 (15) 7316-7321 * |
O' Connell K. P. u.a.: Real-time fluorogenic reverse transcription-PCR assays for detection of bacteriophage MS2. In: Applied and Environmental Microbiology (2006) 72 (1) 478-483 * |
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Vol. 1-3, Hrsg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 |
Vet J.A.M. u.a. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (1999) 96 (11) 6394-9 * |
Vet J.A.M. u.a. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. (1999) 96 (11) 6394-9 Drosten C. u.a.: Ultrasensitive monitoring of HIV-1 viral load by a low-cost real-time reverse transcription-PCR assay with internal control for the 5' long terminal repeat domain. In: Clin . Chem. (2006) 52 (7) 1258-66 Drosten C. u.a.: TaqMan 5'-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening. In: J. of Clinical Microbiology (2001) 39 (12) 4302- 4308 MacNeil A. u.a.: Genomic sites of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) integration: similarities to HIV-1 in vitro and possible differences in vivo. In: J. of Virology (2006) 80 (15) 7316-7321 O' Connell K. P. u.a.: Real-time fluorogenic reverse transcription-PCR assays for detection of bacteriophage MS2. In: Applied and Environmental Microbiology (2006) 72 (1) 478-483 Dreier J. u.a.: Use |
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Publication number | Publication date |
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