CN1946743A - 透明质酸/甲氨蝶呤化合物 - Google Patents

透明质酸/甲氨蝶呤化合物 Download PDF

Info

Publication number
CN1946743A
CN1946743A CNA2005800129632A CN200580012963A CN1946743A CN 1946743 A CN1946743 A CN 1946743A CN A2005800129632 A CNA2005800129632 A CN A2005800129632A CN 200580012963 A CN200580012963 A CN 200580012963A CN 1946743 A CN1946743 A CN 1946743A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mtx
conjugate
phe
molecular weight
aqueous solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2005800129632A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1946743B (zh
Inventor
池谷仁志
守川忠志
高桥浩一
田村达也
冈町晃
石泽武宣
佐藤晴彦
樋口义信
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Denki Kagaku Kogyo KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd, Denki Kagaku Kogyo KK filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN1946743A publication Critical patent/CN1946743A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1946743B publication Critical patent/CN1946743B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D475/00—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
    • C07D475/06—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with a nitrogen atom directly attached in position 4
    • C07D475/08—Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with a nitrogen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C07K9/003—Peptides being substituted by heterocyclic radicals, e.g. bleomycin, phleomycin

Abstract

可用作关节疾病治疗药物的透明质酸/甲氨蝶呤缀合物。本发明涉及可用作关节疾病治疗药物的透明质酸/甲氨蝶呤缀合物，其包含透明质酸和通过含有1到8个氨基酸的肽链的接头与所述酸的羧基连接的甲氨蝶呤。

Description

透明质酸/甲氨蝶呤化合物
                      技术领域
本发明涉及透明质酸-甲氨蝶呤缀合物及其制药用途。
                      背景技术
骨关节炎(下文也称为“OA”)是一种所谓的变性疾病，它基于衰老而发生。在当今老龄化社会中，OA患者的数量已经稳定地增加，但还没有建立适当的诊断或治疗方法。认为OA的初期病理学改变是由于衰老而由机械压力导致的关节软骨的退化和磨损。这些改变以极慢的速度进展并导致病痛逐渐地增进。
目前OA药物疗法在全身治疗中使用：1)解热镇痛剂(对乙酰氨基酚)或，2)非甾体抗炎药(下文也称为NSAID)，或在局部治疗(关节内注射)中使用：3)透明质酸(下文也称为HA)制剂，和4)甾体制剂。当包括NSAID在内的全身性药物疗法没有减轻病痛或关节局部的肿胀时，再进行甾体制剂的关节内注射，它具有最好的抗炎活性。然而，甾体制剂在安全性方面存在问题，例如，因为它们可引起关节内注射综合征(类固醇性关节病)，并且可能具有全身性副作用。因此，HA制剂作为比甾体制剂更安全的关节内注射剂替代方案正在变得更有用。
HA是由N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸重复单元组成的内源性多糖。HA作为构成滑液的主要成分用于保持滑液的粘弹性、承载能力和润滑作用，并且，在软骨基质中，它通过与软骨蛋白多糖结合形成被称为聚集蛋白聚糖的聚合物而在维持其持水量和粘弹性中发挥着主要作用。
由于分子量约600,000道尔顿的HA或其交联产物向膝关节内注射消除了OA引起的疼痛，因此HA制剂广泛用作OA治疗剂。进一步地，与正常滑液中存在的HA分子量接近的高分子量型HA制剂(产品名称：SuvenylTM，制造和销售：Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.)就适应症而言在日本被批准用于消除伴随有类风湿性关节炎(下文也称为RA)的膝盖疼痛。在这方面上，据说HA的分子量与其效力相互关联，并且高分子量型HA的作用更加持久，且比低分子量型HA更加有效。
通常认为HA制剂逆转了由OA(或RA)病理学症状引起的滑液粘性和弹性受损，以消除疼痛。然而，外加HA制剂的效果持续很长一段时间，尽管HA几天之内就从滑液中消失了。因此，也提示了外加HA制剂可能通过不同于上述改善滑液粘弹性的机理消除疼痛的可能性。机理的实例包括对OA滑膜炎的抑制作用，这将在下文描述。
OA疼痛和炎症的病理学机制仍然存在很多不清楚的地方，但是近来注意力已经集中于与滑膜炎机理的可能联系上，滑膜炎是由软骨退化继发引发的。OA滑膜炎被认为是促进OA病理学症状的主要加剧因素，因为它不仅成为疼痛和炎症症状如关节积水或发热的主要原因，而且通过蛋白酶、细胞因子和自由基的产生加速了关节破坏。除此之外，OA滑膜炎没有显示如在RA中看到的显著的增殖性变化，而是有很多与RA滑膜炎共同的方面，例如滑膜细胞增殖、血管生成、充血、滑膜下水肿和纤维化。因此，从有效消除OA中的疼痛和炎症以预防其病理学症状进程的观点来看，控制OA滑膜炎是重要的，
HA对滑膜的作用还没有完全阐明，但是从使用同位素的实验已知，HA在滑膜中积聚和存在的时间比在关节腔中的时间更长。也已经报道，识别HA的受体(CD44和RHAMM(HA-介导的运动性受体))存在于构成滑膜组织的滑膜细胞表层，并且滑膜细胞具有通过其表层上的CD44将分子量甚至为2,000,000或更高的HA掺入细胞的机制。这些发现提示，HA的至少部分疼痛消除作用是通过它对滑膜作用的产生的；然而，HA制剂没有足够的效力来抑制OA滑膜炎本身诱导的炎性症状，因此，他们对于显示强炎性症状的OA和RA的作用还远远不够。
控制滑膜炎的药物是被称作疾病修饰抗风湿药(下文也称为DMARD)的用于治疗RA的一类公知的药物。其中，甲氨蝶呤(下文也称为MTX)是有如下优点的药物，例如，具有极好的效力，并且在它的效果发挥之前具有相对短的时间。然而，在除了它治疗的关节以外的区域中，已知由于MTX的作用机制使得MTX引起了严重的副作用(肝病、造血病、肺病、胃肠道紊乱等)，因为MTX的使用仅被批准用于全身性给药(在日本目前只有MTX胶囊已经被批准作为药物用于治疗RA；其片剂和注射剂还没有被广泛批准)。因此，在MTX的使用中充分监测其副作用和对副作用的发生采取措施是非常必要的。由于非常害怕此类副作用，包括MTX在内的滑膜炎-抑制药物还没有被批准用于其它关节疾病作为适应症例如OA，其症状比RA的症状较为缓和。因此，如果发现能减轻MTX全身性副作用的方法或能使MTX仅在需要MTX有益效果发生的区域发挥其作用的方法，将不仅能提供更安全的RA疗法，而且将MTX用于广泛的关节疾病也是可能的。
已经尝试了很多将MTX的作用仅定位于关节和滑膜内的方法作为减轻MTX副作用和仅仅发挥其想要的作用的手段。例如，已经报道了单独局部(关节内)施用MTX的方法；然而，不能发挥其充分的有益效果，因为MTX很快就从关节腔内消失了。也已经报道了利用巨噬细胞的吞噬能力，使用形成了脂质体的MTX来改善其在关节的贮留；然而，尚未证实其临床有用性。因此，为了减少MTX作为关节疾病治疗药的副作用和仅发挥期望的作用，仍然需要进行技术改进。
如上所述，滑膜是其中HA易于积聚的组织。除此之外，滑膜细胞具有通过HA受体例如CD44将HA掺入细胞的机制。因此，HA似乎具有提供在滑膜内积聚药物的载体的可能性。之前已经报道了将HA用作药物内部载体的几种技术。然而，在创造适用于关节疾病治疗药、尤其是适用于以MTX为代表的滑膜炎治疗药的药物递送系统(下文也称为DDS)方面，几乎没有将HA应用于技术的已知实例。
之前报道的已知实例包括多糖-药物缀合物，其中，药物与包括HA在内的多糖通过肽链缀合(专利文献1：日本专利Laid-Open第05-39306号，专利文献2：国际公布WO 94/19376，等等)。每篇文献都涉及用于抗癌药的DDS技术，并且强调DDS技术改善了药物向癌组织内的传递。
在日本专利Laid-Open第05-39306号中使用了MTX，打算用作抗癌药物。然而，由于该技术的特征在于提高MTX向癌组织内的传递和它在体内不具备长期的持久性，因此，为了增强抗癌效果，MTX的结合率变高了(在专利文献的实验实施例中从6.4％变为19％)，而且HA的分子量降低了(该专利文献的实验实施例中是100,000道尔顿)。除此之外，肽链与HA的羟基通过异脲键合的结合使得缀合物在水溶液中更加不稳定。
也有报道的实例，在每个实例中，HA与药物缀合形成的缀合物已经用作关节疾病的治疗药。例如，国际公布WO 99/59603(专利文献3)公开了一种缀合物，其中，HA与药物通过间隔基例如亚丁基胺基团(-C4H8NH-)或亚辛基胺基团(-C8H16NH-)缀合。该专利文献描述了这样的缀合物可以在药物保持缀合的状态下发挥有益效果，假定有益效果在细胞外部。在该缀合物中，事实上，药物与HA通过间隔基的缀合是相对较强的，因此这项技术难以应用到药物上，药物像MTX不能发挥有益效果除非它从缀合物中释放出来。
此外，该专利文献涉及使用基质金属蛋白酶抑制剂(下文也称为MMPI)作为药物的缀合物，并且公开的实验实施例也仅涉及MMPI缀合物。没有明确公开使用MTX作为药物的缀合物，也没有描述缀合物作为药物的有用性。
国际公布WO 02/44218(专利文献4)公开了使用间隔基制备的HA-药物缀合物，在间隔基中，特别的基团(降冰片烯)进一步结合于13-氨基-4，7，10-三氧杂十三烷基，并且在降冰片烯和HA的羟基之间形成了氨基甲酸酯键。然而，该缀合物也似乎倾向于显示如专利文献2中的细胞外有益效果；在药物保持缀合的状态下发挥作用。因此，该技术难以应用于药物例如MTX，药物不能发挥有益效果除非它从缀合物上释放。除此之外，专利文献3涉及使用MMPI作为药物的缀合物，并且没有给出使用MTX作为药物的缀合物的指示。
如前所述，以上提及的文献中没有一篇描述了使用MTX的HA-MTX缀合物，也没有一篇给出了使用HA-MTX缀合物作为关节疾病治疗药的描述或指示。
除此之外，本发明人已经证明，在已知是现有技术的合成HA-药物缀合物的方法中，在合成过程中HA的分子量极大地降低导致了HA有益效果的丧失。合成HA-药物缀合物的常规方法使用了有机合成反应的一般条件和后处理，但为了制备高分子量的HA和药物的缀合物，该方法需要进一步改进。
如上所述，用作药物的HA-药物缀合物，尤其是适合于治疗关节疾病的高分子量HA-药物缀合物，它的制剂，和合成该缀合物的制备目前都还未知。
专利文献1：日本专利Laid-Open第5-39306号
专利文献2：国际公布WO94/19376小册子
专利文献3：国际公布WO99/59603小册子
专利文献4：国际公布WO02/44218小册子
发明的公开
本发明要解决的问题
本发明的目的是提供用作关节疾病治疗药的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物(conjugate)。
                      解决问题的方法
本发明人已经发现透明质酸-甲氨蝶呤缀合物，其中，甲氨蝶呤通过含肽链的接头与透明质酸的羧基缀合，具有作为关节疾病治疗药的突出效果，从而完成了本发明。
因此，本发明一方面提供了透明质酸-甲氨蝶呤缀合物(conjugate)，其中，甲氨蝶呤通过含1到8个氨基酸的肽链的接头与透明质酸的羧基缀合。在本发明的一个实施方案中，接头包含由1到8个氨基酸组成的肽链和C2-20亚烷基二胺链，在所述C2-20亚烷基二胺链中任选地插入1到5个氧原子和/或其任选被羧基或C1-6烷氧羰基取代。
本发明另一方面还提供了上述透明质酸-甲氨蝶呤缀合物，其中，与接头缀合的甲氨蝶呤用式(I)、(II)、(III)或(IV)表示：
[式1]
Figure A20058001296300121
[式2]
Figure A20058001296300122
[式3]
[式4]
其中，R1和R2各自独立地是羟基、氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基或二-C1-6烷氨基；
L0是接头的缀合位置。
本发明进一步的方面提供了上述透明质酸-甲氨蝶呤缀合物，其中，包含肽链的接头和与接头缀合的甲氨蝶呤用式(I’)或(II’)表示：
[式5]
[式6]
Figure A20058001296300133
其中，R1和R2各自独立地是羟基、氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基或二-C1-6烷氨基；
L是式(X)表示的接头：
[式7]
Figure A20058001296300141
其中，Q1与那里结合的-NH-一起形成由1到8个氨基酸组成的肽链；肽链内包含的氨基酸残基各自独立地任选被一个或多个选自C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧羰基、甲酰基、C1-6烷基磺酰基和C6-10芳基磺酰基的基团取代或保护；肽链内包含的酰胺键各自独立地在氮原子上任选被一个或多个C1-6烷基和/或C1-6烷基羰基取代；并且残基内包含的羧基各自独立地任选转变成任选被一个或两个C1-6烷基取代的酰胺基；
R11和R12各自独立地是氢原子或C1-6烷基；
Q2是C2-20亚烷基，其中，亚烷基任选含有1到5个插入其中的氧原子和/或任选被羧基或C1-6烷氧羰基取代；和
[HA]代表与透明质酸的缀合位置，并且接头与透明质酸内包含的羧基形成酰胺键。
本发明的其它方面还提供了关节疾病的药物组合物和治疗药，其各自包含上述透明质酸-甲氨蝶呤缀合物作为有效成分。
本发明进一步的方面提供了下式(Va)或(Vb)化合物，它可以用于制备上述透明质酸-甲氨蝶呤缀合物：
[式8]
[式9]
Figure A20058001296300151
其中，R1和R2各自独立地是羟基、氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基或二-C1-6烷氨基；
L1是式(X’)表示的接头：
[式10]
Figure A20058001296300152
其中，Q1与那里结合的-NH-一起形成由1到8个氨基酸组成的肽链；肽链内包含的氨基酸残基各自独立地任选被一个或多个选自C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧羰基、甲酰基、C1-6烷基磺酰基和C6-10芳基磺酰基的基团取代或保护；肽链内包含的酰胺键各自独立地在氮原子上任选被一个或多个C1-6烷基和/或C1-6烷基羰基取代；并且残基内包含的羧基各自独立地任选转变成任选被一个或两个C1-6烷基取代的酰胺基；
R11和R12各自独立地是氢原子或C1-6烷基；和
Q2是C2-20亚烷基，其中，亚烷基任选含有1到5个插入其中的氧原子和/或任选被羰基或C1-6烷氧羰基取代。
本发明进一步的方面还提供了用于制备上述透明质酸-甲氨蝶呤缀合物的方法，它包括将上述式(Va)或(Vb)化合物与透明质酸反应并将透明质酸的羧基转变为N-取代的酰胺基的步骤。
下面详细描述本发明。
本发明的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物(HA-MTX缀合物)是新的化合物。根据本发明，其中，甲氨蝶呤(MTX)通过包含肽链的接头与透明质酸(HA)的羧基结合的结构被用作将透明质酸HA与MTX缀合的方式，以允许该缀合物保持HA的疼痛-消除作用和具有MTX的滑膜炎-减轻作用。因此，本发明的HA-MTX缀合物将积聚在滑膜上，然后掺入滑膜细胞内，以在细胞内发挥MTX的有益效果。
因此，当施用到OA或RA患者的膝关节内时，本发明的HA-MTX缀合物如常规HA制剂一样基于HA的特性发挥疼痛-消除作用，而当其积聚在滑膜组织中时同时逐渐掺入到滑膜细胞中，并释放MTX以持续发挥滑膜炎-抑制作用。相比于其口服给药，这能使得MTX的剂量大大降低，从而可以不必担心全身性副作用，这对口服给药来说是有问题的。进一步地，在给药部位，HA制剂和MTX可以发挥不同于它们各自作用机制的药理学作用，因此可以预期它们之间有协同有益效果。
因此，根据本发明的HA-MTX缀合物，提供了用于关节疾病的非常规的极好的治疗药物，它具有HA作为关节内药物的方面，通过该药物可以仅在受治疗的关节内安全地发挥MTX的滑膜炎-抑制作用。
本发明的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物(HA-MTX缀合物)是通过包含肽链的接头与透明质酸的羧基缀合的甲氨蝶呤。
对于本发明目的来说，“透明质酸(HA)”没有特别限制，但例如是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的二糖聚合物，该聚合物具有50,000到10,000,000道尔顿的平均分子量。透明质酸的盐不受特别受限制但包括，例如钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、锌盐、铁盐、铵盐和季铵盐。透明质酸或其盐及其混合物的具体实例包括SuvenylTM(制造和销售：Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.)；ArtzTM(制造：SeikagakuCorporation，销售：Kaken Pharmaceutical Co.，Ltd.)；和OpeganTM(制造：Seikagaku Corporation，销售：Santen Pharmaceutical Co.，Ltd.)。对于本发明目的来说，“透明质酸衍生物”是指具有HA骨架的衍生自HA的物质。透明质酸衍生物不受特别地限制但包括，例如其中一个或多个羧基被酯化的HA(例如，苄基酯化的HA(商品名：HyaffTM，购自Fidia Advanced Biopolymers)，通过使用甲醛交联而进一步聚合的HA(例如商品名：SynviscTM，购自Biomatrix)，和通过将HA中的一个或多个羟基乙酰化而获得的乙酰化HA。
为了不减小其中的HA的疼痛-消除效果，本发明的HA-MTX缀合物优选拥有与临床证实了疼痛-消除效果的HA具有可比性的分子量大小和粘弹性。具体地，HA-MTX缀合物优选具有600,000到6,000,000道尔顿、更优选800,000到6,000,000道尔顿、特别优选1,000,000到5,000,000道尔顿的分子量，这要考虑如下因素：增加的分子量导致粘弹性增加，这会使得它难以处理，以及HA作为内部载体的效果。
在此，通过从特性粘度(limiting viscosity)计算粘度平均分子量的方法确定原料HA和HA-MTX缀合物的分子量。使用下列公式可以计算从特性粘度([η])到粘度平均分子量(Mw)的转换。
Mw＝([η]/0.00036)1.282
在本发明含肽链的接头中，肽链由氨基酸组成。氨基酸的实例包括天然α-氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、门冬氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸和色氨酸；和非天然α-氨基酸，例如具有烷基侧链的α-氨基酸(例如正缬氨酸、正亮氨酸或t-亮氨酸)、被环烷基取代的丙氨酸或甘氨酸(例如环戊基丙氨酸、环己基丙氨酸或环己基甘氨酸)，和被芳基取代的丙氨酸或甘氨酸(例如吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸、取代的苯丙氨酸或苯基甘氨酸)，β-氨基酸，例如β-丙氨酸，γ-氨基酸，例如γ-氨基丁酸，和氨基磺酸，例如牛磺酸。本发明肽链中的氨基酸也包括其残基被适当取代或保护的那些氨基酸。例如，可以使用保护基保护残基官能团。用于该目的的保护基是现有技术公知的，它的一些实例在本说明书的其它段落中描述。引入各个取代基和保护基尤其是保护基的方法可为现有技术公知的。
接头可只由氨基酸组成，或在肽链内或肽链末端可包含衍生自非氨基酸化合物的部分。例如，接头包括含有肽链的接头，其中，二氨基化合物例如亚烷基二胺或氧杂亚烷基二胺或二羧酸化合物例如琥珀酸连接在肽链内部或肽链末端。当接头在肽链内部或肽链末端包含非氨基酸化合物并且接头与MTX和透明质酸的羧基相连时，在肽链末端优选存在二氨基化合物例如亚烷基二胺或氧杂亚烷基二胺；特别优选在肽链末端存在乙二胺或4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺。构成肽链的氨基酸不受特别限制，但考虑到对蛋白酶的亲和力，优选α-氨基酸；包含与MTX缀合的肽链的接头末端优选是α-氨基酸。
构成肽链的氨基酸数目不受特别限制，但通常是1到8个，优选1到6个，特别优选1到4个。构成肽链的氨基酸残基可以各自独立地被一个或多个基团适当取代或保护。这些基团的非限制性实例包括C1-6烷基，C1-6烷基羰基，C1-6烷氧羰基(例如甲氧羰基、乙氧羰基、(正-或异-)丙氧羰基，和(正-、仲-或叔-)丁氧羰基)，甲酰基，C1-6烷基磺酰基(例如甲磺酰基、乙磺酰基和(正-或异-)丙磺酰基)，和C6-10芳基磺酰基(例如苯磺酰基、(邻-、间-或对-)甲苯磺酰基和(1-或2-)萘磺酰基)。作为取代或保护的结果，例如，残基内包含的羧基可转变成C1-6烷氧羰基；其中的羟基可转变成C1-6烷氧基或C1-6烷基羰基氧基；其中的氨基可转变成C1-6烷氨基、二-C1-6烷氨基、C1-6烷基羰基氨基或N-C1-6烷基-C1-6烷基羰基氨基。另外，残基内包含的羰基被任选转变成被一个或两个C1-6烷基任选取代的酰胺基。当含氮杂环如吲哚环和咪唑环包含在残基内时，环上的氮原子可各自独立地被C1-6烷基或C1-6烷基羰基保护。当残基中包含胍基的时候，其中包含的氮原子也可被C1-6烷基或C1-6烷基羰基保护。氮原子的其它保护基没有特殊限制，但也可选自常用基团，例如上述烷氧羰基、甲酰基、C1-6烷基磺酰基和C1-6芳基磺酰基。当残基中包含硫羟基时，它可被C1-6烷基或C1-6烷基羰基保护。另外，肽中包含的酰胺键也可被C1-6烷基和/或C1-6烷基羰基取代，并且可例如转变成-CON(C1-6烷基)-。
构成肽链的氨基酸序列不受特殊限制，但其实例包括以下那些。在这方面上，当活体内存在靶蛋白酶，并且底物识别的氨基酸序列已知时，也可使用包含识别位点和/或切割位点的氨基酸序列。
包含1个氨基酸的肽链：Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val等。优选的是Phe，Tyr，Ile和Glu。
包含2个氨基酸的肽链：PhePhe，PheGly，PheLeu，TyrPhe，TrpPhe，PheTrp，PheTyr，GlyPhe，GlyGly等。优选的是PhePhe和PheGly。
包含3个氨基酸的肽链：PheGlyGly，PheLeuGly，PhePheGly，AsnPhePhe，GlyPhePhe，LeuPhePhe，LeuAlaLeu，AlaValAla，GlyAlaPhe，GlyPheAla，GlyIleAla，GlyIlePhe，GlyLeuAla，GlyValAla，GlyValPhe，GlyGlyGly等。优选的是AsnPhePhe。
包含4个氨基酸的肽链：GlyPheLeuGly，GlyPhePheLeu，GlyPhePheAla，GlyPheTyrAla，GlyPheGlyPhe，GlyPheGlyGly，GlyGlyPheGly，GlyGlyPheTyr，GlyGlyGlyGly，LeuAlaLeuAla，AlaLeuAlaLeu，AlaGlyValPhe，GluAsnPhePhe等。优选的是GlyPheLeuGly。
本发明的接头可具有例如用以上式(X)表示的结构，其中，Q1与那里结合的-NH-一起形成上述包含1到8个氨基酸的肽链。另外，Q2是其中被任选插入了1到5个氧原子或任选被羧基或C1-6烷氧羰基取代的C2-20亚烷基。Q2的具体实例包括乙烷-1，2-二基、丙烷-1，3-二基、丁烷-1，4-二基、戊烷-1，5-二基、己烷-1，6-二基，庚烷-1，7-二基、辛烷-1，8-二基、壬烷-1，9-二基、癸烷-1，10-二基、2-甲基丙烷-1，3-二基、2-甲基丁烷-1，4-二基、3-甲基丁烷-1，4-二基、3-甲基戊烷-1，5-二基、3-乙基戊烷-1，5-二基、2-甲基己烷-1，6-二基、3-甲基己烷-1，6-二基、4-甲基庚烷-1，7-二基、3-氧杂戊烷-1，5-二基、3-氧杂己烷-1，6-二基、4-氧杂己烷-1，6-二基、3-氧杂庚烷-1，7-二基、4-氧杂庚烷-1，7-二基、4-氧杂辛烷-1，8-二基、3，6-二氧杂辛烷-1，8-二基、3，6-二氧杂壬烷-1，9-二基、3，6-二氧杂-4-甲基壬烷-1，9-二基、4，7-二氧杂癸烷-1，10-二基、4，9-二氧杂十二烷-1，12-二基、和4，7，10-三氧杂十三烷-1，13-二基。优选实例包括乙烷-1，2-二基、戊烷-1，5-二基、3-氧杂戊烷-1，5-二基、3，6-二氧杂辛烷-1，8-二基、4，7-二氧杂癸烷-1，10-二基、4，9-二氧杂十二烷-1，12-二基、和4，7，10-三氧杂十三烷-1，13-二基。
本发明的HA-MTX缀合物可采取任何缀合形式，只要MTX是通过含肽链的接头与HA的羧基缀合的。因此，含肽链的接头可以缀合于：
1)MTX的α-位羧基；
2)MTX的γ-位羧基；或
3)MTX的氨基，
并且两个以上的这些缀合模式可共同存在(例如，与MTX的α-位羧基结合的缀合物和与MTX的γ-位羧基结合的缀合物可共同存在)。然而，考虑到对蛋白酶的亲和力和合成，含肽链的接头优选与MTX的α-位羧基和/或其γ-位羧基结合，更优选MTX的α-位羧基。
根据本发明的HA-MTX缀合物，含肽链的接头特别优选是由α-氨基酸组成并且在肽链末端具有二氨基化合物的含肽链的接头；并且接头的结合模式特别优选由如下结合组成的结合模式：肽链的N-末端与MTX的α-位羧基通过酰胺键合结合，和肽链的C-末端与HA的羧基经由二氨基化合物通过酰胺连接结合。
在本发明的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物中，除了被接头修饰以外，甲氨蝶呤(MTX)部分可通过已知方法制备成前药形式。
当用于本文中时，“C1-6烷基”指的是1-6个碳原子的直链或支链烷基，该基团的实例包括甲基、乙基、正-丙基、异-丙基、正-丁基、仲-丁基、异-丁基、叔-丁基、正-戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基和正-己基。
当用于本文中时，“C1-6烷基羰基”指的是1-6个碳原子的直链或支链烷基羰基，该基团的实例包括含有之前定义的烷基作为烷基部分的那些，例如乙酰基、丙酰基、2-甲基丙酰基或2，2-二甲基丙酰基。
当用于本文中时，“C1-6烷氧基”指的是1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，该基团的实例包括含有之前定义的烷基作为烷基部分的那些，例如甲氧基、乙氧基或正-丙氧基。
当用于本文中时，“C1-6烷氨基”指的是1-6个碳原子的直链或支链烷氨基，该基团的实例包括含有之前定义的烷基作为烷基部分的那些，例如甲氨基、乙氨基或正丙氨基。
当用于本文中时，“二-C1-6烷氨基”指的是1-6个碳原子的直链或支链二烷氨基，该基团的实例包括含有之前定义的烷基作为烷基部分的那些，烷基可相同或不同，例如二甲氨基、乙基甲氨基、二乙氨基或乙基-正-丙氨基。
当用于本文中时，“二-C2-20亚烷基”指的是2-20个碳原子的直链或支链亚烷基，该基团的实例包括亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚辛基和亚癸基(decalene group)。
当用于本文中时，“C1-6烷氧羰基”指的是1-6个碳原子的直链或支链烷氧羰基，该基团的实例包括含有之前定义的烷基作为烷基部分的那些，例如甲氧羰基、乙氧羰基或正-丙氧羰基。
当用于本文中时，“C1-6烷基磺酰基”指的是1-6个碳原子的直链或支链烷基磺酰基，该基团的实例包括含有之前定义的烷基作为烷基部分的那些，例如甲磺酰基、乙磺酰基或正-丙磺酰基。
当用于本文中时，“酰化”包括C1-6烷基羰基化和苯甲酰化；苯甲酰基任选被C1-6烷基、卤原子、C1-6烷氧基等取代。
本发明HA-MTX缀合物中的MTX缀合率优选在这样的范围内，即发挥有益效果并且不用担心副作用。当用于本文中时，“MTX缀合率”从下列公式计算：
[式11]
Figure A20058001296300211
MTX缀合率没有特殊限制，但考虑到有益效果的发挥，优选0.5％或更高，更优选1.0％或更高。另一方面，缀合率优选小于10％，以将MTX作用集中于给药局部，并减小MTX的全身副作用。另外，当缀合物有高分子量和高MTX缀合率时，考虑到本发明的HA-MTX缀合物引起其不溶解，从而在合成方面带来麻烦，因此MTX缀合率优选为0.5％或更高，且小于4.5％，特别优选1.0％或更高，且小于4.5％。
本发明的HA-MTX缀合物也可以盐的形式存在，但考虑到其应用，因此盐优选为药学可接受的盐。盐的实例包括钠、钾、钙、铝、锌、铁、铵和季铵盐。
在本发明HA-MTX缀合物的合成中，HA、含肽链的接头和MTX可以适当比例结合。例如，有一个作为例子的路线，其中，含HA-肽链的接头在引入MTX之前就构成了，另一个路线是，其中含MTX-肽链的接头在引入HA之前就构成了。使用常规的酰胺缀合反应所采用的溶剂和缩合剂，并且如果需要的话，和反应促进添加剂，在-20℃到40℃的温度下反应数分钟到数天，可进行各个缀合反应。典型的溶剂包括水、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、二烷、甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿等，或其混合物。缩合剂的实例包括碳二亚胺化合物，例如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺；二环己基碳二亚胺，或二异丙基碳二亚胺，苯并三唑-1-基-氧-三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，和1-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉。反应促进添加剂的实例包括活性酯剂(active ester agent)，例如N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-羧亚胺(carboximide)、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、或3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三唑；和pH调节剂，例如三乙胺、N-甲基吗啉、N，N-二异丙基乙胺、或三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺。在该反应中，有可能对于官能团例如氨基酸侧链(例如，羟基、羰基或氨基)使用在常规有机合成中广泛采用的保护基。
在此，为了防止HA分子量降低，优选采用以下路线，其中，考虑到便于控制缀合反应，在引入HA之前就先构成了含MTX-肽链的接头。溶剂优选水、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙醇或其混合物，最优选水和四氢呋喃混合物，其中，其混合比最优选1∶1。缩合剂优选水溶性的，最优选1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，它最优选以HA中羧基的0.1当量加入。对于活性酯剂来说，反应促进添加剂最优选3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三唑，它最优选以HA中羧基的0.1当量加入。PH调节剂最优选三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺；反应过程中的pH最优选6到7。反应温度优选-10℃到30℃，最优选0℃到15℃。反应时间优选1小时到48小时，最优选12小时到24小时。
当用于本文中时，“关节疾病”具体指代以下疾病，例如关节软骨缺损、骨关节炎(包括没有明显起因的原发病，和其中存在起因疾病的继发病)、肩周炎、类风湿性关节炎、反应性关节炎、病毒性关节炎、化脓性关节炎、结核性关节炎或神经性关节病，并进一步包括这些疾病中的关节疼痛(例如类风湿性关节炎的膝关节疼痛)。当用于本文中时，“关节疾病治疗药”不仅包括用于治疗上述关节疾病的药物，而且包括用于预防这些疾病、抑制病况进程(防止存在的状况恶化或持续)等的药物。
通过向有效量的本发明缀合物适当加入药学可接受的载体、赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、香料或着色剂等，本发明的HA-MTX缀合物可以药物组合物的形式使用。含本发明HA-MTX缀合物作为有效成分的药物组合物优选用作关节疾病的治疗药，并且特别优选采用给药至关节内的局部制剂的形式。
作为非限制性实例，当本发明的HA-MTX缀合物被制成关节疾病治疗药时，它可以所需浓度溶于例如生理盐水或磷酸盐生理盐水中，以制成注射剂的形式。在这种情况下，通过加入酸或碱可任选将溶液调节至所需pH。通过加入无机盐也可将溶液调节至所需的盐浓度，无机盐包括单价金属盐如钠或钾，或二价金属盐如镁、钙或锰。另外，可任选加入稳定剂等。如此制备的本发明HA-MTX缀合物溶液可分布、预先装在配置注射器等中。当施用含本发明HA-MTX缀合物作为有效成分的关节疾病治疗药时，每次给患者给药的1到3mL溶液可使用浓度为0.01％到10％w/v、优选0.1％到2.0％w/v、特别优选0.5％到1.5％w/v的HA-MTX缀合物。然而，剂量可根据医师指示、受治疗患者、疾病类型和严重性、HA-MTX缀合物的分子量等而改变至最佳剂量。
如以下实施例所述，当对病态发生在膝关节内的关节炎模型进行关节内给药时，本发明的HA-MTX缀合物对滑膜炎发挥了减轻作用，这在HA是看不到的。另外，本发明人已经发现，相对于具有较低分子量(300,000道尔顿)的HA-MTX缀合物，分子量为600,000道尔顿或更高，尤其是800,000道尔顿或更高的HA-MTX缀合物对滑膜炎的减轻作用被证实是非常高的。
                  附图的简要说明
图1是一组显示测定试验物质和对照物质(分子量1900,000的透明质酸和分子量800,000的透明质酸)粘弹性结果的图；
图2是显示在试验物质处理组和对照(HA和赋形剂)组中，从mBSA刚注射到膝关节内后开始，膝关节肿胀的时间过程的图；
图3是显示图2中试验物质处理组和对照组图的AUC的图；
图4是一组显示在实施例1物质处理组和对照(HA和盐水)组中，从刚诱导胶原关节炎后开始，膝关节宽度的时间过程的图。左图显示了经处理的右膝关节的时间过程，右图显示了未经处理的左膝关节的时间过程。在这些图中，显示了平均值±平均值的标准误；
图5是显示在实施例1物质处理组和对照(HA和盐水)组中，从刚诱导胶原酶OA模型关节炎后开始到20天以后，膝关节肿胀的时间过程的图。在该图中，显示了平均值±平均值的标准误；和
图6是显示在实施例2-2物质处理组和盐水处理组中，在胶原酶OA模型的胫骨内侧坪内，软骨变性程度的图。在该图中，显示了平均值±平均值的标准误。
                  实现本发明的最佳模式
根据下列实施例进一步详细描述本发明。然而，本发明并不打算限制至这些实施例。
实施例
实施例1-1
生产2-[N-[N-[N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰基]-α-(O5-甲基谷氨酰基)]苯丙氨酰基]苯丙氨酰基氨基]乙胺：MTX-α-PhePhe-NH-C2H4-NH2(化合物1)
(a)制备Cbz-Phe-NH-C2H4-NH-Boc(化合物1a)
将N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸(Cbz-Phe：7.16g，25.4mmol)、N-叔丁氧羰基-乙二胺盐酸盐(5.00g，25.4mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBT：4.28g，28.0mmol)和N-甲基吗啉(NMM：3.07mL，28.0mmol)溶于100mL二甲基甲酰胺(DMF)，然后在搅拌和冰冷却下向其中加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC：5.36g，28.0mmol)，接着室温搅拌1天。将10％柠檬酸水溶液加到反应溶液中，并将沉淀出的固体溶于氯仿和少量甲醇，接着在用硫酸钠干燥以前用饱和碳酸氢钠溶液和饱和盐水溶液洗涤该溶液。减压浓缩，接着用硅胶柱色谱纯化所得剩余物(洗脱溶剂：氯仿∶甲醇＝95∶5)，得到9.69g标题化合物白色固体。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.37(9H，s)，2.69-3.19(6H，m)，4.12-4.22(1H，m)，4.93(2H，dd，J＝12.9Hz，J＝15.1Hz)，6.75(1H，br.t)，7.22-7.33(10H，m)，7.48(1H，d，J＝8.6Hz)，8.05(1H，br.t)
LC/MS：441.9(M+H+)464.1(M+Na+)
(b)制备Cbz-PhePhe-NH-C2H4-NH-Boc(化合物1b)
将化合物1a(9.69g，21.9mmol)溶于200mL甲醇，然后向其中加入500mg 10％钯碳，接着在氢气氛下室温搅拌1天。从反应混合物中滤除催化剂，接着减压浓缩。将该剩余物、Cbz-Phe(6.92g，23.1mmol)、HOBT(3.71g，24.2mmol)和NMM(2.66mL，24.2mmol)溶于50mL二甲基甲酰胺(DMF)，然后在搅拌下和用冰冷却下向其中加入EDC(4.64g，24.2mmol)，接着室温搅拌1天。将水加到反应溶液中，然后在干燥前用10％柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤。用硅胶柱色谱纯化所得剩余物(洗脱溶剂：氯仿∶甲醇＝90∶10)，得到12.8g标题化合物白色固体。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.37(9H，s)，2.62-3.18(8H，m)，4.18-4.29(1H，m)，4.40-4.51(1H，m)，4.93(2H，s)，6.72(1H，br.t)，7.10-7.32(15H，m)，7.46(1H，d，J＝8.6Hz)，7.97(1H，br.t)，8.11(1H，d，J＝7.9Hz)
LC/MS：588.8(M+H+)611.1(M+Na+)
(c)制备Cbz-Glu(OMe)PhePhe-NH-C2H4-NH-Boc(化合物1c)
将化合物1b(11.1g，18.9mg)溶于800mL甲醇、50mL DMF和500mL THF，然后向其中加入1.00g 10％钯碳，接着在氢气氛下室温搅拌1天。从反应混合物中滤除催化剂，接着减压浓缩。将该剩余物、N-苄氧羰基-L-谷氨酸-γ-甲酯(Cbz-Glu(OMe)：5.58g，18.9mmol)、HOBT(3.18g，20.8mmol)和NMM(2.29mL，20.8mmol)溶于100mL DMF，然后在搅拌和冰冷却下向其中加入EDC(3.99g，20.8mmol)，接着室温搅拌2天。在搅拌和冰冷却下向该反应溶液中加入10％柠檬酸，并在用硅胶柱色谱纯化(洗脱溶剂：二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)前用5％碳酸氢钠溶液和水洗涤生成的沉淀物，接着加入甲醇，生成沉淀物，得到11.1g标题化合物的白色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.36(9H，s)，1.64-1.80(2H，m)，2.17-2.23(2H，m)，2.76-3.12(8H，m)，3.56(3H，s)，3.93-4.03(1H，m)，4.40-4.58(2H，m)，5.00(2H，s)，6.68(1H，br.t)，7.18-7.44(16H，m)，7.84-7.90(2H，m)，8.19(1H，d，J＝7.7Hz)
LC/MS：732.4(M+H+)，754.4(M+Na+)
(d)制备MTX-α-PhePhe-NH-C2H4-NH-Boc(化合物1d)
将化合物1c(348mg，0.476mmol)混悬在10mL甲醇和10mL四氢呋喃中，然后向其中加入33mg 10％钯碳，接着在氢气氛下室温搅拌1.5小时。从反应混合物中滤除催化剂，接着减压浓缩。将该剩余物、4-[N-(2，4-二氨基-6-蝶啶基甲基)-N-甲氨基]苯甲酸(197mg，0.547mmol)和HOBT(76mg，0.499mmol)溶于4mL N-甲基吡咯烷酮(NMP)，然后在搅拌和冰冷却下向其中加入N-甲基吗啉(NMM，55μL，0.499mmol)和EDC(105mg，0.547mmol)，接着室温搅拌4天。将5％碳酸氢钠溶液加到反应溶液中，用硅胶柱色谱(洗脱溶剂：二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)和胺硅凝胶(amine silica gel)(NH-DM1020，100-200目，购自Fuji Silysia Chemical Ltd.)柱色谱(洗脱溶剂：二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)纯化生成的沉淀物，得到362mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.35(9H，s)，1.78-1.94(2H，m)，2.23(2H，m)，2.69-3.10(8H，m)，3.22(3H，s)，3.55(3H，s)，4.27-4.52(3H，m)，4.79(2H，s)，6.63(2H，br.s)，6.70(1H，br.t)，6.82(2H，d，J＝8.9Hz)，7.06-7.25(10H，m)，7.46(1H，br.s)，7.66-7.88(5H，m)，8.06-8.17(2H，m)，8.56(1H，s)
LC/MS：905.5(M+H+)
(e)制备MTX-α-PhePhe-NH-C2H4-NH2(化合物1)
在冰冷却下向化合物1d(360mg，0.398mmol)加入5mL三氟乙酸，接着搅拌1小时。减压浓缩反应溶液，接着用胺硅胶柱色谱(洗脱溶剂：二氯甲烷∶甲醇＝100∶10，两次)纯化剩余物，得到275mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.80-1.96(2H，m)，2.20-2.28(2H，m)，2.45(2H，t，J＝6.6H z)，2.70-3.10(6H，m)，3.22(3H，s)，3.55(3H，s)，4.26-4.52(3H，m)，4.79(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.7Hz)，7.06-7.21(10H，m)，7.46(1H，br.s)，7.65-7.73(3H，m)，7.85(1H，d，J＝8.1Hz)，8.08-8.16(2H，m)，8.56(1H，s)
LC/MS：805.3(M+H+)
实施例1-2
制备4，7，10-三氧杂-13-[N-[N-[N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰基]-α-(O5-甲基谷氨酰基)]苯丙氨酰基]苯丙氨酰基氨基]十三烷胺：MTX-α-PhePhe-NH-C10H20O3-NH2(化合物2)
(a)制备Cbz-Phe-NH-C10H20O3-NH-Boc(化合物2a)
将N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸(Cbz-Phe：852mg，2.85mmol)、N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺(760mg，2.37mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(HOBT：363mg，2.37mmol)溶于6mL二甲基甲酰胺(DMF)，然后在搅拌和冰冷却下向其中加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC：546mg，2.85mmol)，接着室温搅拌2天。向反应溶液中加入乙酸乙酯，接着在用硫酸钠干燥以前用10％柠檬酸水溶液、5％碳酸氢钠溶液和饱和盐水溶液洗涤，减压浓缩，接着用硅胶柱色谱纯化所得剩余物(洗脱溶剂：二氯甲烷∶甲醇＝100∶3)，得到1.35g标题化合物的油状物质。
1H-NMR(270MHz，CDCl3)：δ1.43(9H，s)，1.56-1.74(4H，m)，3.06(2H，d，J＝6.8Hz)，3.17-3.58(16H，m)，430-4.39(1H，m)，4.98(1H，br)，5.08(2H，s)，5.50(1H，br)，6.40(1H，br)，7.16-7.32(10H，m)
LC/MS：624.3(M+Na+)
(b)生产Cbz-PhePhe-NH-C10H20O3-NH-Boc(化合物2b)
将化合物2a(1.35g，2.24mmol)溶于12mL甲醇，然后向其中加入200mg 10％钯碳，接着在氢气氛下室温搅拌4小时。从反应混合物中滤除催化剂，接着减压浓缩。将该剩余物、Cbz-Phe(1.07g，3.57mmol)和HOBT(514mg，3.36mmol)溶于10mL DMF，然后在搅拌和冰冷却下向其中加入EDC(688mg，3.59mmol)，接着室温搅拌2天。向反应溶液中加入乙酸乙酯，然后在用硫酸钠干燥以前用10％柠檬酸水溶液、5％碳酸氢钠溶液和饱和盐水溶液洗涤。减压浓缩，接着用硅胶柱色谱纯化所得剩余物(洗脱溶剂：二氯甲烷∶甲醇＝100∶3)。向其中加入正己烷，生成白色沉淀，然后过滤收集该沉淀，得到1.56g标题化合物。
1H-NMR(270MHz，CDCl3)：δ1.43(9H，s)，1.60-1.78(4H，m)，2.96-3.60(20H，m)，4.42-4.59(2H，m)，4.96-5.07(3H，m)，5.41(1H，br.d)，6.39(1H，br)，6.73(1H，br.d)，7.08-7.31(15H，m)
LC/MS：771.3(M+Na+)
(c)生产Cbz-Glu(OMe)PhePhe-NH-C10H20O3-NH-Boc(化合物2c)
将化合物2b(500mg，0.668mmol)溶于10mL甲醇，然后向其中加入150mg 10％钯碳，接着在氢气氛下室温搅拌1天。从反应混合物中滤除催化剂，接着减压浓缩。将该剩余物、N-苄氧羰基-L-谷氨酸-γ-甲酯(Cbz-Glu(OMe)：217mg，0.734mmol)和HOBT(102mg，0.668mmol)溶于5mL DMF，然后在搅拌和冰冷却下向其中加入EDC(141mg，0.734mmol)，接着室温搅拌16小时。向反应溶液中加入乙酸乙酯，在用硫酸钠干燥前，用10％柠檬酸水溶液、5％碳酸氢钠溶液和饱和盐水溶液洗涤。减压浓缩，接着用硅胶柱色谱纯化所得剩余物(洗脱溶剂：二氯甲烷∶甲醇＝100∶5)。向其中加入正己烷，生成白色沉淀，然后过滤收集该沉淀，得到529mg标题化合物。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.36(9H，s)，1.50-1.85(6H，m)，2.20(2H，t，J＝7.9Hz)，2.70-3.10(8H，m)，3.25-3.48(12H，m)，3.56(3H，s)，3.93-4.02(1H，m)，4.20-4.60(2H，m)，5.00(2H，s)，6.77(1H，br.t)，7.10-7.45(16H，m)，7.82(1H，br.t，J＝6.1Hz)，7.91(1H，d，J＝7.9Hz)，8.22(1H，d，J＝7.9Hz)
LC/MS：914.3(M+Na+)
(d)制备MTX-α-PhePhe-NH-C10H20O3-NH-Boc(化合物2d)
将化合物2c(514mg，0.576mmol)混悬在30mL甲醇中，然后向其中加入100mg 10％钯碳，接着在氢气氛下室温搅拌1.5小时。从反应混合物中滤除催化剂，接着减压浓缩。将该剩余物、4-[N-(2，4-二氨基-6-蝶啶基甲基)-N-甲氨基]苯甲酸(281mg，0.864mmol)和HOBT(132mg，0.864mmol)溶于5mL DMF，然后在搅拌和冰冷却下向其中加入EDC(166mg，0.864mmol)，接着室温搅拌2天。将5％碳酸氢钠溶液加入反应溶液，并用胺硅胶(NH-DM1020，100-200目，购自Fuji Silysia Chemical Ltd.)柱色谱(洗脱溶剂：第一次洗脱，二氯甲烷∶甲醇＝100∶7；第二次洗脱，氯仿∶甲醇＝100∶4)纯化生成的沉淀，得到415mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.36(9H，s)，1.48-1.61(4H，m)，1.81-1.92(2H，m)，2.24(2H，t，J＝7.9Hz)，2.70-3.10(8H，m)，3.22(3H，s)，3.25-3.47(12H，m)，3.54(3H，s)，4.25-4.50(3H，m)，4.79(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.76-6.83(3H，m)，7.06-7.24(10H，m)，7.45(1H，br.s)，7.67-7.80(4H，m)，7.86(1H，d，J＝8.1Hz)，8.09(1H，d，J＝7.4Hz)，8.15(1H，d，J＝8.1Hz)，8.56(1H，s)
LC/MS：1087.5(M+Na+)
(e)制备MTX-α-PhePhe-NH-C10H20O3-NH2(化合物2)
在冰冷却下向化合物2d(413mg，0.388mmol)加入3mL三氟乙酸，接着搅拌40分钟。减压浓缩反应溶液，接着用胺硅胶柱色谱(洗脱溶剂：二氯甲烷∶甲醇＝100∶7，两次)纯化剩余物，得到344mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.49-1.95(4H，m)，1.81-1.92(2H，m)，2.24(2H，t，J＝7.9Hz)，2.70-3.10(8H，m)，3.22(3H，s)，3.25-3.47(12H，m)，3.54(3H，s)，4.25-4.50(3H，m)，4.79(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.76-6.83(3H，m)，7.06-7.24(10H，m)，7.45(1H，br.s)，7.83(1H，br.t，J＝5.8Hz)，8.01(1H，d，J＝7.9Hz)，8.09(1H，d，J＝7.1Hz)，8.15(1H，d，J＝7.8Hz)，8.56(1H，s)
LC/MS：965.5(M+H+)
实施例1-3
制备MTX-α-PhePhe-NH-C10H20O2-NH2(化合物3)
通过与实施例1-2的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-4，9-二氧杂-1，12-十二烷二胺代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到221mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.47-1.60(8H，m)，1.80-1.95(2H，m)，2.20-2.29(2H，m)，2.60(2H，t)，2.70-3.10(6H，m)，3.22(3H，s)，3.25-3.50(8H，m)，3.54(3H，s)，4.25-4.49(3H，m)，4.79(2H，s)，6.60(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.4Hz)，7.06-7.20(10H，m)，7.45(1H，br.s)，7.65(1H，br.s)，7.70(2H，d)，7.73(1H，br.t)，7.83(1H，d)，8.10(1H，d)，8.11(1H，d)，8.55(1H，s)
LC/MS：949.5(M+H+)
实施例1-4
制备MTX-α-PhePhe-NH-C8H16O2-NH2(化合物4)
通过与实施例1-2的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-4，7-二氧杂-1，10-癸烷二胺代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到407mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.50-1.57(4H，m)，1.85-1.91(2H，m)，2.21-2.28(2H，m)，2.60(2H，t)，2.70-3.13(6H，m)，3.22(3H，s)，3.25-3.45(8H，m)，3.55(3H，s)，4.27-4.49(3H，m)，4.79(2H，s)，6.60(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.8Hz)，7.07-7.21(10H，m)，7.43(1H，br.s)，7.69(1H，br.s)，7.71(2H，d，J＝8.8Hz)，7.75(1H，br.t)，7.85(1H，d)，8.08(1H，d)，8.13(1H，d)，8.56(1H，s)
LC/MS：921.4(M+H+)
实施例1-5
制备MTX-α-PhePhe-NH-C6H12O2-NH2(化合物5)
通过与实施例1-2的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-3，6-二氧杂-1，8-辛烷二胺代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到148mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.81-1.91(2H，m)，2.20-2.25(2H，m)，2.61-2.64(2H，t)，2.70-2.97(6H，m)，3.22(3H，s)，3.27-3.47(8H，m)，3.55(3H，s)，4.27-4.47(3H，m)，4.79(2H，s)，6.62(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.7Hz)，7.06-7.25(10H，m)，7.46(1H，br.s)，7.67(1H，br.s)，7.71(2H，d，J＝8.6Hz)，7.85(1H，d)，7.92(1H，br.t)，8.07(1H，d)，8.15(1H，d)，8.56(1H，s)
LC/MS：893.6(M+H+)
实施例1-6
制备MTX-α-PhePhe-NH-C4H8O-NH2(化合物6)
通过与实施例1-2的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-3-氧杂-1，5-戊烷二胺代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到52mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.84-1.92(2H，m)，2.20-2.27(2H，m)，2.60-2.64(2H，t)，2.71-2.99(6H，m)，3.22(3H，s)，3.25-3.45(4H，m)，3.54(3H，s)，4.27-4.50(3H，m)，4.79(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.4Hz)，7.05-7.21(10H，m)，7.45(1H，br.s)，7.65(1H，br.s)，7.70(2H，d.J＝8.6Hz)，7.84(1H，d)，7.91(1H，br.t)，8.07(1H，d)，8.15(1H，d)，8.55(1H，s)
LC/MS：849.4(M+H+)
实施例1-7
制备MTX-α-PhePhe-NH-C5H10-NH2(化合物7)
通过与实施例1-1的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-1，5-戊烷二胺代替N-叔丁氧羰基-1，2-乙二胺，得到148mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.16-1.56(6H，m)，1.81-1.97(2H，m)，2.21-2.29(2H，m)，2.69-3.06(6H，m)，3.23(3H，s)，3.55(3H，s)，4.25-4.50(3H，m)，4.80(2H，s)，6.65(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.6Hz)，7.08-7.24(10H，m)，7.50(1H，br.s)，7.60-7.89(5H，m)，8.10-8.16(2H，m)，8.55(1H，s)
LC/MS：847.4(M+H+)
实施例1-8
制备MTX-α-PhePhe-Lys-OMe(化合物8)
通过与实施例1-2的方法相类似的方法，用N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸甲酯代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到178mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.25-1.34(4H，m)，1.56-1.69(2H，m)，1.75-1.90(2H，m)，2.18-2.25(2H，br.t)，2.50-2.60(2H，m)，2.65-3.07(4H，m)，3.22(3H，s)，3.54(3H，s)，3.60(3H，s)，4.15-4.60(4H，m)，4.79(2H，s)，6.63(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.7Hz)，7.00-7.25(10H，m)，7.45(1H，br.s)，7.62(1H，br.s)，7.69(2H，d，J＝8.6Hz)，7.80(1H，d)，8.05(1H，d)，8.16(1H，d)，8.30(1H，d)，8.56(1H，s)
LC/MS：905.4(M+H+)
实施例1-9
制备MTX-α-PheGly-NH-C10H20O3-NH2(化合物9)
除了在实施例1-2(a)步骤中用N-苄氧羰基甘氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸以外，用与实施例1-2相同的方法，得到528mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.51-1.64(4H，m)，1.84-1.94(2H，m)，2.21-2.30(2H，m)，2.55(2H，t，J＝6.3Hz)，2.78-2.92(1H，m)，3.03-3.76(17H，m)，3.22(3H，s)，3.55(3H，s)，4.26-4.52(2H，m)，4.79(2H，s)，6.63(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.7Hz)，7.11-7.24(5H，m)，7.47(1H，br.s)，7.62-7.72(4H，m)，8.04-8.16(2H，m)，8.28(1H，br.t)，8.56(1H，s)
LC/MS：875.5(M+H+)
实施例1-10
制备MTX-α-PheGly-NH-C10H20O2-NH2(化合物10)
通过与实施例1-9的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-4，9-二氧杂-1，12-十二烷二胺代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到300mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.47-1.50(4H，m)，1.54-1.60(4H，m)，1.82-1.95(2H，m)，2.25-2.28(2H，m)，2.58(2H，t，J＝6.6Hz)，2.82-2.87(1H，m)，3.02-3.07(3H，m)，3.22(3H，s)，3.25-3.41(8H，m)，3.55(3H，s)，3.55-3.63(2H，m)，4.28-4.47(2H，m)，4.79(2H，s)，6.60(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.8Hz)，7.09-7.18(5H，m)，7.45(1H，br.s)，7.59(1H，br.t)，7.66(1H，br.s)，7.70(2H，d，J＝8.8Hz)，8.02(1H，d)，8.08(1H，d)，8.26(1H，br.t)，8.56(1H，s)
LC/MS：859.3(M+H+)
实施例1-11
制备MTX-α-PheGly-NH-C8H16O2-NH2(化合物11)
通过与实施例1-9的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-4，7-二氧杂-1，10-癸烷二胺代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到300mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.53-1.62(4H，m)，1.82-1.92(2H，m)，2.20-2.27(2H，m)，2.50-2.60(2H，t)，2.81-2.86(1H，m)，2.97-3.08(3H，m)，3.22(3H，s)，3.25-3.47(8H，m)，3.55(3H，s)，3.55-3.73(2H，m)，4.24-4.47(2H，m)，4.79(2H，s)，6.60(2H，br.s)，6.81(2H，d)，7.12-7.21(5H，m)，7.45(1H，br.s)，7.60(1H，br.t)，7.63(1H，br.s)，7.69(2H，d)，8.03(1H，d)，8.10(1H，d)，8.28(1H，br.t)，8.56(1H，s)
LC/MS：831.3(M+H+)
实施例1-12
制备MTX-α-PheGly-NH-C6H12O2-NH2(化合物12)
通过与实施例1-9的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-3，6-二氧杂-1，8-辛烷二胺代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到181mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.83-1.92(2H，m)，2.21-2.27(2H，m)，2.60-2.65(2H，t)，2.75-3.10(2H，m)，3.22(3H，s)，3.23-3.46(10H，m)，3.55(3H，s)，3.55-3.75(2H，m)，4.25-4.52(2H，m)，4.79(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.6Hz)，7.10-7.20(5H，m)，7.45(1H，br.s)，7.63-7.72(4H，m)，8.00(1H，d)，8.10(1H，d)，8.27(1H，br.t)，8.56(1H，s)
LC/MS：803.4(M+H+)
实施例1-13
制备MTX-α-PheGly-NH-C4H8O-NH2(化合物13)
通过与实施例1-9的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-3-氧杂-1，5-戊烷二胺代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到318mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.82-1.95(2H，m)，2.22-2.27(2H，m)，2.59-2.64(2H，t)，2.73-3.15(2H，m)，3.23(3H，s)，3.25-3.38(6H，m)，3.55(3H，s)，3.46-3.77(2H，m)，4.23-4.51(2H，m)，4.79(2H，s)，6.62(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.6Hz)，7.10-7.17(5H，m)，7.47(1H，br.s)，7.63-7.75(4H，m)，8.02(1H，d)，8.11(1H，d)，8.27(1H，br.t)，8.56(1H，s)
LC/MS：759.3(M+H+)
实施例1-14
制备MTX-α-PhePro-NH-C10H20O3-NH2(化合物14)
除了在实施例1-2(a)步骤中用N-苄氧羰基-L-脯氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸以外，用与实施例1-2相同的方法，得到382mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1,49-2.03(10H，m)，2.19-2.30(2H，m)，2.55(2H，t，J＝6.6Hz)，2.62-3.69(21H，m)，3.55(3H，s)，4.28-4.38(1H，m)，4.63-4.75(1H，m)，4.79(2H，s)，6.60(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.6Hz)，7.14-7.29(5H，m)，7.47(1H，br.s)，7.66-7.72(4H，m)，7.94-8.10(2H，m)，8.56(1H，s)
LC/MS：915.3(M+H+)
实施例1-15
制备MTX-α-PheβAla-NH-C10H20O3-NH2(化合物15)
除了在实施例1-2(a)步骤中用N-苄氧羰基-β-丙氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸以外，用与实施例1-2相同的方法，得到180mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.52-1.62(4H，m)，1.78-1.95(2H，m)，2.16-2.22(4H，m)，2.56(2H，t，J＝7.3Hz)，2.71-3.48(21H，m)，3.55(3H，s)，4.10(2H，br.s)，4.21-4.30(1H，m)，4.38-4.49(1H，m)，4.80(2H，s)，6.59(2H，br.s)，6.83(2H，d，J＝8.6Hz)，7.10-7.21(5H，m)，7.43(1H，br.s)，7.65-7.74(3H，m)，7.83-7.89(2H，m)，7.96(1H，br.t)，8.08(1H，d，J＝6.8Hz)，8.56(1H，s)
LC/MS：889.5(M+H+)
实施例1-16
制备MTX-α-PheβAla-NH-C2H4-NH2(化合物16)
除了在实施例1-1(a)步骤中用N-苄氧羰基-β-丙氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸以外，用与实施例1-1相同的方法，得到194mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.80-1.94(2H，m)，2.18-2.26(4H，m)，2.54(2H，t，J＝6.1Hz)，2.74-3.08(6H，m)，3.23(3H，s)，3.55(3H，s)，4.24-4.48(2H，m)，4.80(2H，s)，6.59(2H，br.s)，6.83(2H，d，J＝8.4Hz)，7.13(5H，s)，7.45(1H，br.s)，7.65-7.86(5H，m)，7.96(1H，br.t)，8.09(1H，d，J＝6.8Hz)，8.56(1H，s)
LC/MS：729.3(M+H+)
实施例1-17
制备MTX-α-Phe-NH-C10H20O3-NH2(化合物17)
除了省略实施例1-2(b)步骤以外，用与实施例1-2相同的方法，得到496mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ1.49-1.59(4H，m)，1.82-1.89(2H，m)，2.19-2.27(2H，m)，2.55(2H，t，J＝7.2Hz)，2.73-3.10(4H，m)，3.23(3H，s)，3.17-3.48(12H，m)，3.55(3H，s)，4.21-4.28(1H，m)，4.38-4.45(1H，m)，4.80(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.83(2H，d，J＝9.3Hz)，7.11-7.20(5H，m)，7.46(1H，br.s)，7.66(1H，br.s)，7.73(2H，d，J＝9.0Hz)，7.83(1H，t)，7.92(1H，d，J＝8.4Hz)，8.12(1H，d，J＝7.5Hz)，8.56(1H，s)
LC/MS：818.4(M+H+)
实施例1-18
制备MTX-α-Ile-NH-C10H20O3-NH2(化合物18)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-异亮氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到562mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ0.76-0.80(6H，m)，0.99-1.10(1H，m)，1.36-1.45(1H，m)，1.49-1.73(5H，m)，1.88-2.07(2H，m)，2.33-2.38(2H，m)，2.55(2H，t，J＝6.6Hz)，2.98-3.48(14H，m)，3.21(3H，s)，3.56(3H，s)，4.05-4.13(1H，m)，4.40-4.48(1H，m)，4.78(2H，s)，6.60(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.4Hz)，7.46(1H，br.s)，7.66-7.72(3H，m)，7.98(1H，br.t)，8.12(1H，d，J＝7.6Hz)，8.56(1H，s)
LC/MS：784.4(M+H+)
实施例1-19
制备MTX-α-Ile-NH-C2H4-NH2(化合物19)
通过与实施例1-18的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-1，2-乙二胺代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到320mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ0.76-0.80(6H，m)，0.96-1.08(1H，m)，1.34-1.48(1H，m)，1.62-1.70(1H，m)，1.85-2.03(2H，m)，2.36(2H，t，J＝7.8Hz)，2.95-3.08(2H，m)，3.21(3H，s)，3.56(3H，s)，4.06-4.12(1H，m)，4.38-4.45(1H，m)，4.78(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.83(2H，d，J＝9.0Hz)，7.43(1H，br.s)，7.64-7.72(4H，m)，7.92(1H，t，J＝5.7Hz)，8.12(1H，d，J＝7.5Hz)，8.57(1H，s).
LC/MS：624.2(M+H+)
实施例1-20
制备MTX-α-Glu(OMe)-NH-C10H20O3-NH2(化合物20)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-谷氨酸-γ-甲酯代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到600mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.50-2.03(8H，m)，2.24-2.31(2H，t)，2.34-2.40(2H，t)，2.49-2.57(2H，t)，2.97-3.52(14H，m)，3.21(3H，s)，3.53(3H，s)，3.55(3H，s)，4.15-4.36(2H，m)，4.78(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.7Hz)，7.46(1H，br.s)，7.67(1H，br.s)，7.72(2H，d，J＝8.6Hz)，7.84(1H，br.t)，7.95(1H，d)，8.14(1H，d)，8.55(1H，s)
LC/MS：814.4(M+H+)
实施例1-21
制备MTX-α-Glu(OMe)-NH-C2H4-NH2(化合物21)
通过与实施例1-20的方法相类似的方法，用N-叔丁氧羰基-1，2-乙二胺代替N-叔丁氧羰基-4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，得到283mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.71-2.09(4H，m)，2.28(2H，t，J＝7.6Hz)，2.39(2H，t，J＝7.6Hz)，2.53(2H，t，J＝6.1Hz)，2.99-3.05(2H，m)，3.21(3H，s)，3.54(3H，s)，3.56(3H，s)，4.14-4.36(2H，m)，4.79(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.6Hz)，7.43(1H，br.s)，7.65-7.79(4H，m)，7.95(1H，d，J＝7.8Hz)，8.14(1H，d，J＝6.9Hz)，8.56(1H，s)
LC/MS：654.1(M+H+)
实施例1-22
制备MTX-α-Tyr-NH-C10H20O3-NH2(化合物22)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-酪氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到133mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.51-1.62(4H，m)，1.85-1.95(2H，m)，2.23-2.31(2H，m)，2.51-2.58(2H，t)，2.63-2.91(2H，m)，2.95-3.16(2H，m)，3.22(3H，s)，3.27-3.54(12H，m)，3.56(3H，s)，4.22-4.35(2H，m)，4.79(2H，s)，6.57(2H，d，J＝8.1Hz)，6.61(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.7Hz)，6.92(2H，d，J＝8.1Hz)，7.47(1H，br.s)，7.67-7.88(5H，m)，8.13(1H，d)，8.55(1H，s)
LC/MS：834.4(M+H+)
实施例1-23
制备MTX-α-Trp-NH-C10H20O3-NH2(化合物23)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-色氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到171mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.50-1.61(4H，m)，1.84-1.97(2H，m)，2.23-2.32(2H，m)，2.50-2.56(2H，t)，2.92-3.15(4H，m)，3.22(3H，s)，3.29-3.45(12H，m)，3.55(3H，s)，4.29-4.49(2H，m)，4.78(2H，s)，6.64(2H，br.s)，6.80(2H，d)，6.92(1H，t)，7.04(1H，t)，7.10(1H，s)，7.26(1H，d)，7.44(1H，br.s)，7.51(1H，d)，7.65(1H，br.s)，7.69(2H，d)，7.82(1H，br.t)，7.93(1H，d)，8.10(1H，d)，8.55(1H，s)，10.80(1H，s)
LC/MS：857.5(M+H+)
实施例1-24
制备MTX-α-Ser-NH-C10H20O3-NH2(化合物24)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-丝氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到416mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ1.50-1.63(4H，m)，1.90-2.08(4H，m)，2.39(2H，t，J＝7.8Hz)，2.55(2H，t，J＝6.6Hz)，3.05-3.48(16H，m)3.21(3H，s)，3.56(3H，s)，4.13-4.20(1H，m)，4.33-4.41(1H，m)，4.78(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝9.0Hz)，7.44(1H，br.s)，7.66-7.80(5H，m)，8.19(1H，d，J＝6.9Hz)，8.56(1H，s)
LC/MS：758.4(M+H+)
实施例1-25
制备MTX-α-Leu-NH-C10H20O3-NH2(化合物25)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-亮氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到283mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ0.80-0.87(6H，d)，1.43-1.64(7H，m)，1.90-2.06(2H，m)，2.34-2.30(2H，t)，2.53-2.58(2H，t)，3.04-3.08(2H，m)，3.21(3H，s)，3.33-3.47(12H，m)，3.56(3H，s)，4.19-4.37(2H，m)，4.78(2H，s)，6.62(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.7Hz)，7.45(1H，br.s)，7.64-7.85(5H，m)，8.10(1H，d)，8.55(1H，s)
LC/MS：784.4(M+H+)
实施例1-26
制备MTX-α-Val-NH-C10H20O3-NH2(化合物26)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-缬氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到590mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ0.79(6H，d，J＝6.8Hz)，1.52-1.59(4H，m)，1.85-2.04(3H，m)，2.33-2.35(2H，t)，2.56-2.58(2H，t)，2.93-3.55(14H，m)，3.21(3H，s)，3.56(3H，s)，4.03-4.08(1H，m)，4.42-4.47(1H，m)，4.78(2H，s)，6.62(2H，br.s)，6.82(2H，d，J＝8.7Hz)，7.45(1H，br.s)，7.61-7.72(4H，m)，7.98(1H，br.t)，8.13(1H，d)，8.56(1H，s)
LC/MS：770.4(M+H+)
实施例1-27
制备MTX-α-His-NH-C10H20O3-NH2(化合物27)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-组氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到81mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ1.49-1.58(4H，m)，1.90-2.04(2H，m)，2.39(2H，t，J＝6.6Hz)，2.55(2H，t，J＝6.9Hz)，2.83(2H，m)，3.02(2H，m)，3.16-3.47(12H，m)，3.23(3H，s)，3.57(3H，s)，4.22(1H，m)，4.32(1H，m)，4.80(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.72(1H，s)，6.84(2H，d，J＝8.4Hz)，7.10-7.70(5H，m)，7.77(2H，d，J＝8.7Hz)，8.36(1H，br)，8.57(1H，s)
LC/MS：808.3(M+H+)
实施例1-28
制备MTX-α-Pro-NH-C10H20O3-NH2(化合物28)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-脯氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到683mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.58(4H，dd，J＝6.5Hz，J＝12.8Hz)，1.69-2.10(6H，m)，2.44(2H，t，J＝7.7Hz)，2.60(2H，t，J＝6.8Hz)，2.91-3.75(19H，m)，3.57(3H，s)，4.18-4.25(1H，m)，4.61-4.72(1H，m)，4.77(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.80(2H，d，J＝8.7Hz)，7.44(1H，br.s)，7.69-7.80(4H，m)，8.15(1H，d，J＝7.1Hz)，8.55(1H，s)
LC/MS：768.3(M+H+)
实施例1-29
制备MTX-α-βAla-NH-C10H20O3-NH2(化合物29)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-β-丙氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到230mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.49-1.62(4H，m)，1.79-2.02(2H，m)，2.21(2H，t，J＝6.9Hz)，2.32(2H，t，J＝7.3Hz)，2.56(2H，t，J＝6.6Hz)，3.00-3.61(19H，m)，3.55(3H，s)，4.29-4.38(1H，m)，4.78(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.6Hz)，7.43(1H，br.s)，7.61-7.91(3H，m)，7.72(2H，d，J＝8.6Hz)，8.02(1H，d，J＝7.8Hz)，8.55(1H，s)
LC/MS：742.4(M+H+)
实施例1-30
制备MTX-γ-PhePhe-NH-C10H20O3-NH2(化合物30)
通过与实施例1-2的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-谷氨酸-α-甲酯代替N-苄氧羰基-L-谷氨酸-γ-甲酯，得到312mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.49-1.60(4H，m)，1.76-1.98(2H，m)，2.09-2.20(2H，m)，2.56(2H，t，J＝6.6Hz)，2.62-3.16(6H，m)，3.21(3H，s)，3.27-3.48(12H，m)，3.59(3H，s)，4.27-4.53(3H，m)，4.78(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.6Hz)，7.16-7.23(10H，m)，7.48(1H，br.s)，7.68-7.74(3H，m)，7.83(1H，br.t)，8.01(1H，d，J＝7.9H z)，8.10(1H，d，J＝7.8Hz)，8.36(1H，d，J＝6.8Hz)，8.55(1H，s)
LC/MS：965.5(M+H+)
实施例1-31
制备MTX-γ-PhePhe-NH-C6H12O2-NH2(化合物31)
通过与实施例1-5的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-谷氨酸-α-甲酯代替N-苄氧羰基-L-谷氨酸-γ-甲酯，得到80mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.75-1.97(2H，m)，2.08-2.17(2H，m)，2.59-2.62(2H，t)，2.58-3.05(6H，m)，3.22(3H，s)，3.15-3.52(8H，m)，3.59(3H，s)，4.23-4.52(3H，m)，4.78(2H，s)，6.63(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.7Hz)，7.11-7.21(10H，m)，7.44(1H，br.s)，7.65(1H，br.s)，7.70(2H，d)，7.94-8.12(3H，m)，8.35(1H，d)，8.55(1H，s)
LC/MS：893.5(M+H+)
实施例1-32
制备MTX-γ-PhePhe-NH-C4H8O-NH2(化合物32)
通过与实施例1-6的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-谷氨酸-α-甲酯代替N-苄氧羰基-L-谷氨酸-γ-甲酯，得到49mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.73-1.97(2H，m)，2.08-2.18(2H，m)，2.60-2.65(2H，t)，2.59-3.02(6H，m)，3.21(3H，s)，3.13-3.44(4H，m)，3.59(3H，s)，4.25-4.53(3H，m)，4.78(2H，s)，6.63(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.7Hz)，7.09-7.25(10H，m)，7.43(1H，br.s)，7.66(1H，br.s)，7.72(2H，d，J＝8.4Hz)，7.95-8.10(3H，m)，8.36(1H，d)，8.55(1H，s)
LC/MS：849.5(M+H+)
实施例1-33
制备MTX-γ-PheGly-NH-C10H20O3-NH2(化合物33)
通过与实施例1-9的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-谷氨酸-α-甲酯代替N-苄氧羰基-L-谷氨酸-γ-甲酯，得到693mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.50-1.68(4H，m)，1.80-2.02(2H，m)，2.12-2.27(2H，m)，2.55(2H，t，J＝6.4Hz)，2.71-2.79(1H，m)，2.96-3.14(3H，m)，3.22(3H，s)，3.38-3.74(12H，m)，3.59(3H，s)，4.28-4.48(2H，m)，4.79(2H，s)，6.62(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.4Hz)，7.14-7.28(5H，m)，7.47(1H，br.s)，7.63-7.73(4H，m)，8.19(1H，d，J＝7.6Hz)，8.29-8.36(2H，m)，8.56(1H，s)
LC/MS：875.4(M+H+)
实施例1-34
制备MTX-γ-Phe-NH-C10H20O3-NH2(化合物34)
通过与实施例1-17的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-谷氨酸-α-甲酯代替N-苄氧羰基-L-谷氨酸-γ-甲酯，得到480mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ1.49-1.58(4H，m)，1.79-2.00(2H，m)，2.10-2.27(2H，m)，2.55(2H，t，J＝6.9Hz)，2.69-2.93(2H，m)，2.96-3.12(2H，m)，3.22(3H，s)，3.26-3.48(12H，m)，3.59(3H，s)，4.25-4.33(1H，m)，4.38-4.46(1H，m)，4.79(2H，s)，6.62(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.7Hz)，7.10-7.24(5H，m)，7.44(1H，br)，7.70(1H，br)，7.72(2H，d，J＝8.7Hz)，7.95(1H，t)，8.10(1H，d，J＝8.1Hz)，8.35(1H，d，J＝6.9Hz)，8.56(1H，s)
LC/MS：818.4(M+H+)
实施例1-35
制备MTX-γ-Glu(OMe)-NH-C10H20O3-NH2(化合物35)
通过与实施例1-20的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-L-谷氨酸-α-甲酯代替N-苄氧羰基-L-谷氨酸-γ-甲酯，得到438mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.52-2.06(8H，m)，2.22-2.30(4H，m)，2.53-2.58(2H，t)，3.03-3.15(2H，m)，3.22(3H，s)，3.25-3.54(12H，m)，3.56(3H，s)，3.61(3H，s)，4.13-4.40(2H，m)，4.79(2H，s)，6.63(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.6Hz)，7.44(1H，br.s)，7.67(1H，br.s)，7.72(2H，d，J＝8.4Hz)，7.90(1H，br.t)，7.99(1H，d)，8.37(1H，d)，8.56(1H，s)
LC/MS：814.5(M+H+)
实施例1-36
制备MTX-α-D-Phe-D-Phe-NH-C10H20O3-NH2(化合物36)
通过与实施例1-2的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-D-苯丙氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到313mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.40-1.59(4H，m)，1.74-1.83(2H，m)，2.04-2.11(2H，m)，2.56-2.58(2H，t)，2.59-3.12(6H，m)，3.21(3H，s)，3.17-3.51(12H，m)，3.55(3H，s)，4.24-4.44(3H，m)，4.78(2H，s)，6.62(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.6Hz)，7.10-7.26(10H，m)，7.45(2H，m)，7.64(1H，br.s)，7.72(2H，d，J＝8.4Hz)，8.18(2H，m)，8.43(1H，d)，8.55(1H，s)
LC/MS：965.6(M+H+)
实施例1-37
制备MTX-γ-D-Phe-D-Phe-NH-C10H20O3-NH2(化合物37)
通过与实施例1-30的方法相类似的方法，用N-苄氧羰基-D-苯丙氨酸代替N-苄氧羰基-L-苯丙氨酸，得到85mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.51-1.61(4H，m)，1.74-2.02(2H，m)，2.11-2.16(2H，m)，2.54-2.59(2H，t)，2.62-3.12(6H，m)，3.22(3H，s)，3.25-3.53(12H，m)，3.60(3H，s)，4.31-4.46(3H，m)，4.79(2H，s)，6.61(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.6Hz)，7.08-7.26(10H，m)，7.44(1H，br.s)，7.66-7.77(4H，m)，8.06(2H，m)，8.36(1H，d)，8.56(1H，s)
LC/MS：965.6(M+H+)
实施例1-38
制备MTX-α-AsnPhePhe-NH-C10H20O3-NH2(化合物38)
通过与实施例1-2的方法相类似的方法，根据常规的肽合成方法延伸肽链，得到145mg标题化合物的黄色粉末。
1H-NMR(270MHz，DMSO-d6)：δ1.52-1.59(4H，m)，1.87-2.02(2H，m)，2.32-3.48(24H，m)，3.22(3H，s)，3.55(3H，s)，4.24-4.56(4H，m)，4.79(2H，s)，6.60(2H，br.s)，6.81(2H，d，J＝8.6Hz)，7.04-7.75(17H，m)，8.07-8.26(4H，m)，8.56(1H，s)
LC/MS：1079.5(M+H+)
实施例1-39
制备MTX-α/γ-GlyPheLeuGly-NH-C10H20O3-NH2(化合物39)
通过与实施例1-2的方法相类似的方法，根据常规的肽合成方法延伸肽链，得到723mg标题化合物的黄色粉末。用LC/MS分析证实了在纯化过程中发生的异构作用生成了α和γ的混合物(α∶γ＝3∶1)(化合物39)。
LC/MS：1045.7(M+H+)
实施例2-1
制备MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA
将由溶于特纯水和四氢呋喃(THF)等量混合物(20ml)中的3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)(0.125mmol)和在实施例1-1中得到的化合物1(0.031mmol)组成的溶液加到由THF(10ml)加到透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)中形成的混悬液中，然后向其中加入由溶于特纯水和THF等量混合物(10ml)中的三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(0.094mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌。搅拌开始后30分钟加入由溶于特纯水(10ml)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.125mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌20小时。将0.09N氢氧化钠水溶液(220ml)加到反应溶液中，接着在5℃下搅拌3.5小时。向该溶液中加入1N盐酸(20ml)进行中和，向其中进一步加入由溶于特纯水(45ml)的氯化钠(9g)组成的溶液，接着在离心分离沉淀之前逐滴加入乙醇(600ml)进行乙醇沉淀。将沉淀物溶于特纯水(40ml)得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用透明质酸作为标准品通过凝胶过滤技术测得其分子量为约1,950,000。当通过测量紫外吸收(259nm)计算时，所得缀合物的MTX缀合率是2.1％。
将溶于特纯水(160mL)的氯化钠(6g)加到以上水溶液中，然后向其中逐滴加入乙醇(400mL)进行乙醇沉淀，接着离心分离沉淀。将沉淀物溶于特纯水(500mL)，然后在用0.45μm过滤器(Stervex HV：Millipore)过滤以前向其中加入氯化钠(15g)，然后向滤液中无菌地逐滴加入乙醇(1000mL)进行乙醇沉淀，接着在真空干燥以前通过过滤收集沉淀物。将该沉淀物溶于磷酸盐缓冲液(2mM磷酸钠，154mM氯化钠，pH 7.2)(40mL)，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用透明质酸作为标准品通过凝胶过滤技术测得其分子量为约1,860,000。当通过测量紫外吸收(259nm)计算时，所得缀合物的MTX缀合率是2.1％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.83(m)，2.01(br.s)，2.13(m)，2.49(m)，2.68(m)，2.95(m)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.56(br.s)，3.71(br.s)，3.82(br.s)，4.16(t)，4.46(br.s)，4.54(br.d)，4.88(d)，4.99(d)，6.63(d)，6.87-7.11(m)，7.73(d)，8.69(s)
实施例2-2
制备MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA
用与实施例2-1的方法相类似的方法，将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与实施例1-1中得到的化合物1(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,280,000和1.9％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,180,000和1.9％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.84(m)，2.01(br.s)，2.13(m)，2.49(t)，2.68(m)，2.95(m)，3.36(br.d)，3.51(br.d)，3.56(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.16(t)，4.46(br.d)，4.55(br.d)，4.88(d)，4.98(d)，6.63(d)，6.87-7.13(m)，7.74(d)，8.70(s)
实施例2-2’
制备MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA
用与实施例2-1类似的方法，将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与实施例1-1中得到的化合物1(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,190,000和2.2％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,060,000和2.3％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.83(m)，2.01(br.s)，2.14(m)，2.52(m)，2.70(m)，2.96(m)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.16(t)，4.46(br.s)，4.55(br.s)，4.87(d)，4.97(d)，6.66(d)，6.88-7.09(m)，7.72(d)，8.69(s)
实施例2-3
制备MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA
将由溶于特纯水和四氢呋喃(THF)等量混合物(20ml)中的3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)(0.125mmol)和在实施例1-1中得到的化合物1(0.008mmol)组成的溶液加到由THF(10ml)加到透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)中形成的混悬液中，然后加入由溶于特纯水和THF等量混合物(10ml)中的三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(0.118mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌。搅拌开始后30分钟加入由溶于特纯水(10ml)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.125mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌20小时。将0.09N氢氧化钠水溶液(220ml)加到反应溶液中，接着在5℃下搅拌3.5小时。向该溶液中加入1N盐酸(20ml)进行中和，向其中进一步加入由溶于特纯水(45ml)的氯化钠(9g)组成的溶液，接着在离心分离沉淀之前逐滴加入乙醇(600ml)进行乙醇沉淀。将沉淀物溶于特纯水(40ml)得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用透明质酸作为标准品通过凝胶过滤技术测得其分子量为约2,320,000。当通过测量紫外吸收(259nm)计算时，所得缀合物的MTX缀合率是0.6％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,170,000和0.5％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ2.01(br.s)，2.52(m)，2.69(m)，2.95(m)，3.34(br.d)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.16(t)，4.46(br.s)，4.55(br.s)，6.66(d)，6.87-7.10(m)，7.72(d)，8.69(s)
实施例2-4
制备MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA
将由溶于特纯水和四氢呋喃(THF)等量混合物(20ml)中的3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)(0.125mmol)和在实施例1-1中得到的化合物1(0.015mmol)组成的溶液加到由THF(10ml)加到透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)中形成的混悬液中，然后向其中加入由溶于特纯水和THF等量混合物(10ml)中的三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(0.110mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌。搅拌开始后30分钟加入由溶于特纯水(10ml)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.125mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌20小时。将0.09N氢氧化钠水溶液(220ml)加到反应溶液中，接着在5℃下搅拌3.5小时。向该溶液中加入1N盐酸(20ml)进行中和，向其中进一步加入由溶于特纯水(45ml)的氯化钠(9g)组成的溶液，接着在离心分离沉淀之前逐滴加入乙醇(600ml)进行乙醇沉淀。将沉淀物溶于特纯水(40ml)得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用透明质酸作为标准品通过凝胶过滤技术测得其分子量为约2,320,000。当通过测量紫外吸收(259nm)计算时，所得缀合物的MTX缀合率是1.1％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,230,000和1.1％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.84(m)，2.01(br.s)，2.13(m)，2.52(m)，2.70(m)，2.96(m)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.16(t)，4.46(br.s)，4.55(br.s)，6.66(d)，6.88-7.09(m)，7.72(d)，8.69(s)
实施例2-5
制备MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA
将由溶于特纯水和四氢呋喃(THF)等量混合物(20ml)中的3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)(0.125mmol)和在实施例1-1中得到的化合物1(0.020mmol)组成的溶液加到由THF(10ml)加到透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)中形成的混悬液中，然后向其中加入由溶于特纯水和THF等量混合物(10ml)中的三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(0.105mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌。搅拌开始后30分钟加入由溶于特纯水(10ml)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.125mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌20小时。将0.09N氢氧化钠水溶液(220ml)加到反应溶液中，接着在5℃下搅拌3.5小时。向该溶液中加入1N盐酸(20ml)进行中和，向其中进一步加入由溶于特纯水(45ml)的氯化钠(9g)组成的溶液，接着在离心分离沉淀之前逐滴加入乙醇(600ml)进行乙醇沉淀。将沉淀物溶于特纯水(40ml)得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用透明质酸作为标准品通过凝胶过滤技术测得其分子量为约2,270,000。当通过测量紫外吸收(259nm)计算时，所得缀合物的MTX缀合率是1.4％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,090,000和1.3％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.84(m)，2.01(br.s)，2.13(m)，2.49(t)，2.68(m)，2.95(m)，3.36(br.s)，3.51(br.s)，3.56(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.16(t)，4.46(br.s)，4.55(br.d)，4.88(d)，4.98(d)，6.63(d)，6.87-7.13(m)，7.74(d)，8.70(s)
实施例2-6
制备MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA
将由溶于特纯水和四氢呋喃(THF)等量混合物(20ml)中的3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)(0.125mmol)和在实施例1-1中得到的化合物1(0.063mmol)组成的溶液加到由THF(10ml)加到透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)中形成的混悬液中，然后向其中加入由溶于特纯水和THF等量混合物(10ml)中的三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(0.063mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌。搅拌开始后30分钟加入由溶于特纯水(10ml)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.125mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌20小时。将0.09N氢氧化钠水溶液(220ml)加到反应溶液中，接着在5℃下搅拌3.5小时。向该溶液中加入1N盐酸(20ml)进行中和，向其中进一步加入由溶于特纯水(45ml)的氯化钠(9g)组成的溶液，接着在离心分离沉淀之前逐滴加入乙醇(600ml)进行乙醇沉淀。将沉淀物溶于特纯水(40ml)得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用透明质酸作为标准品通过凝胶过滤技术测得其分子量为约2,050,000。当通过测量紫外吸收(259nm)计算时，所得缀合物的MTX缀合率是3.9％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,910,000和3.8％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.84(m)，2.02(br.s)，2.15(m)，2.53(t)，2.70(m)，2.96(m)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.16(t)，4.46(br.s)，4.55(br.s)，4.89(s)，4.96(d)，6.66(d)，6.87-7.10(m)，7.72(d)，8.68(s)
实施例2-7
制备MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA
将由溶于特纯水和四氢呋喃(THF)等量混合物(20ml)中的3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)(0.125mmol)和在实施例1-1中得到的化合物1(0.125mmol)组成的溶液加到由THF(10ml)加到透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)中形成的混悬液中，然后向其中加入特纯水和THF的等量混合物(10ml)，接着在5℃下搅拌。搅拌开始后30分钟加入由溶于特纯水(10ml)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.125mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌20小时。将0.09N氢氧化钠水溶液(220ml)加到反应溶液中，接着在5℃下搅拌3.5小时。向该溶液中加入1N盐酸(20ml)进行中和，向其中进一步加入由溶于特纯水(45ml)的氯化钠(9g)组成的溶液，接着在离心分离沉淀之前逐滴加入乙醇(600ml)进行乙醇沉淀。将沉淀物溶于特纯水(40ml)得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用透明质酸作为标准品通过凝胶过滤技术测得其分子量为约1,970,000。当通过测量紫外吸收(259nm)计算时，所得缀合物的MTX缀合率是4.5％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,740,000和4.4％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.83(m)，1.93(m)，2.02(br.s)，2.14(m)，2.53(t)，2.69(m)，2.95(m)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.16(t)，4.46(br.s)，4.55(br.d)，4.87(d)，4.95(d)，6.67(d)，6.87-7.10(m)，7.71(d)，8.68(s)
实施例2-8
制备MTX-α-PhePhe-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-2中得到的化合物2(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,110,000和1.6％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,980,000和1.4％。
实施例2-9
制备MTX-α-PhePhe-NHC10H20O2NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-3中得到的化合物3(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,830,000和1.8％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,550,000和1.7％。
实施例2-10
制备MTX-α-PhePhe-NHC8H16O2NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-4中得到的化合物4(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,890,000和1.6％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,620,000和1.6％。
实施例2-11
制备MTX-α-PhePhe-NHC6H12O2NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-5中得到的化合物5(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,920,000和1.9％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,620,000和2.0％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.77-1.85(m)，2.02(br.s)，2.16-2.24(m)，2.51(m)，2.66(m)，2.92(m)，3.00(m)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.72(br.s)，3.83(br.s)，4.20(m)，4.46(br.s)，4.55(br.s)，6.68(d)，6.95-7.18(m)，7.76(d)，8.72(s)
实施例2-12
制备MTX-α-PhePhe-NHC4H8ONH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-6中得到的化合物6(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,720,000和2.0％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,490,000和1.9％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.77-1.84(m)，2.01(br.s)，2.20-2.28(m)，2.49(m)，2.64(m)，2.93(m)，3.00(m)，3.35(br.s)，3.52(br.s)，3.58(br.s)，3.73(br.s)，3.83(br.s)，4.20(t)，4.47(br.s)，4.55(br.s)，4.92(d)，5.06(d)，6.64(d)，6.94-7.19(m)，7.77(d)，8.73(s)
实施例2-13
制备MTX-α-PhePhe-NHC5H10NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-7中得到的化合物7(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,140,000和1.4％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,960,000和1.2％。
实施例2-14
制备MTX-α-PhePhe-Lys-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-8中得到的化合物8(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,890,000和1.4％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,720,000和1.4％。
实施例2-15
制备MTX-α-PheGly-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-2中得到的化合物2(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约830,000和1.4％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约800,000和1.4％。
实施例2-16
制备MTX-α-PheGly-NHC10H20O3NH-HA
将由溶于特纯水和四氢呋喃(THF)等量混合物(20ml)中的3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)(0.125mmol)和在实施例1-2中得到的化合物2(0.009mmol)组成的溶液加到由THF(10ml)加到透明质酸钠(500mg，分子量：约800,000)中形成的混悬液中，然后向其中加入由溶于特纯水和THF的等量混合物(10ml)中的三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(0.116mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌。搅拌开始后30分钟加入由溶于特纯水(10ml)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.125mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌20小时。将0.09N氢氧化钠水溶液(220ml)加到反应溶液中，接着在5℃下搅拌3.5小时。向该溶液中加入1N盐酸(20ml)进行中和，向其中进一步加入由溶于特纯水(45ml)的氯化钠(9g)组成的溶液，接着在离心分离沉淀之前逐滴加入乙醇(600ml)进行乙醇沉淀。将沉淀物溶于Otsuka生理盐水(40ml)得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用透明质酸作为标准品通过凝胶过滤技术测得其分子量为约830,000。当通过测量紫外吸收(259nm)计算时，所得缀合物的MTX缀合率是0.5％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约810,000和0.5％。
实施例2-17
制备MTX-α-PheGly-NHC10H20O3NH-HA
将由溶于特纯水和四氢呋喃(THF)等量混合物(20ml)中的3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)(0.125mmol)和在实施例1-2中得到的化合物2(0.125mmol)组成的溶液加到由THF(10ml)加到透明质酸钠(500mg，分子量：约800,000)中形成的混悬液中，然后向其中加入特纯水和THF的等量混合物(10ml)，接着在5℃下搅拌。搅拌开始后30分钟加入由溶于特纯水(10ml)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.125mmol)组成的溶液，接着在5℃下搅拌20小时。将0.09N氢氧化钠水溶液(220ml)加到反应溶液中，接着在5℃下搅拌3.5小时。向该溶液中加入1N盐酸(20ml)进行中和，向其中进一步加入由溶于特纯水(45ml)的氯化钠(9g)组成的溶液，接着在离心分离沉淀之前逐滴加入乙醇(600ml)进行乙醇沉淀。将沉淀物溶于特纯水(40ml)得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用透明质酸作为标准品通过凝胶过滤技术测得其分子量为约770,000。当通过测量紫外吸收(259nm)计算时，所得缀合物的MTX缀合率是3.4％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约760,000和3.4％。
实施例2-18
制备MTX-α-PheGly-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-9中得到的化合物9(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,990,000和1.5％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,860,000和1.4％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.59(m)，1.78(m)，1.90-1.95(m)，2.02(br.s)，2.13-2.23(m)，2.99-3.14(m)，3.28(s)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.26(t)，4.46(br.s)，4.54(br.s)，4.92(s)，6.93(d)，7.13-7.20(m)，7.66(d)，8.69(s)
实施例2-19
制备MTX-α-PheGly-NHC10H20O2NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-10中得到的化合物10(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,440,000和1.8％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.49(m)，1.60(m)，1.76(m)，2.01(br.s)，2.09-2.15(m)，2.20-2.28(m)，2.99-3.09(m)，3.10-3.17(m)，3.33(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.30(m)，4.46(br.s)，4.55(br.d)，4.97(s)，6.91(d)，7.13(m)，7.17-7.21(m)，7.67(d)，8.73(s)
实施例2-20
制备MTX-α-PheGly-NHC8H16O2NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-11中得到的化合物11(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,730,000和1.6％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,500,000和1.6％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.64(m)，1.78(m)，2.01(br.s)，2.09-2.17(m)，2.24(m)，3.01(m)，3.08(m)，3.16(m)，3.34(br.s)，3.51(br.s)，3.56(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.31(m)，4.46(br.s)，4.54(br.s)，4.97(s)，6.91(d)，7.11(m)，7.14-7.21(m)，7.67(d)，8.72(s)
实施例2-21
制备MTX-α-PheGly-NHC6H12O2NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-12中得到的化合物12(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,500,000和2.3％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,390,000和2.3％。
实施例2-22
制备MTX-α-PheGly-NHC4H8ONH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-13中得到的化合物13(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,560,000和2.0％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,400,000和2.2％。
实施例2-23
制备MTX-α-PhePro-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-14中得到的化合物14(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,660,000和1.6％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,520,000和1.6％。
实施例2-24
制备MTX-α-PheβAla-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-15中得到的化合物15(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,520,000和1.5％。
实施例2-25
制备MTX-α-PheβAla-NHC2H4NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-16中得到的化合物16(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,090,000和2.3％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,980,000和2.3％。
实施例2-26
制备MTX-α-Phe-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-17中得到的化合物17(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,130,000和1.7％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,790,000和1.7％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.63(m)，1.79(m)，2.02(br.s)，2.20(m)，2.28(m)，3.08(m)，3.10-3.20(m)，3.31(s)，3.35(br.s)，3.52(br.s)，3.56(br.s)，3.72(br.s)，3.84(br.s)，4.28(t)，4.47(br.s)，4.54(br.s)，4.97(s)，6.94(d)，7.06(t)，7.13(d)，7.67(d)，8.73(s)
实施例2-27
制备MTX-α-Ile-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-18中得到的化合物18(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,920,000和1.7％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,620,000和1.7％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ0.84(t)，0.89(d)，1.18(m)，1.47(m)，1.78(m)，1.83-1.90(m)，2.02(br.s)，2.36(m)，3.24(s)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.63(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.09(d)，4.45(br.s)，4.55(br.s)，4.93(s)，6.92(d)，7.72(d)，8.68(s)
实施例2-28
制备MTX-α-Ile-NHC2H4NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-19中得到的化合物19(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,310,000和2.1％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,020,000和2.1％。
实施例2-29
制备MTX-α-Glu-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-20中得到的化合物20(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,010,000和1.5％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,830,000和1.5％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ 1.57(m)，1.77(m)，2.02(br.s)，2.25(m)，2.37(t)，3.24(s)，3.25(s)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.56(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)， 4.13(m)，4.22(m)，4.36(m)，4.46(br.s)，4.55(br.s)，4.91(s)，6.94(d)，7.76(d)，8.66(s)， 8.68(s)
注意：加下划线的部分是较弱的信号。从这些信号中推论它是α-和γ-异构体的混合物。
实施例2-30
制备MTX-α-Glu-NHC2H4NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-21中得到的化合物21(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,260,000和2.1％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,060,000和2.1％。
实施例2-31
制备MTX-α-Tyr-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-22中得到的化合物22(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,900,000和1.6％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,760,000和1.7％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.63(m)，1.77(m)，2.02(br.s)，2.23-2.35(m)，2.95(m)，3.03-3.21(m)，3.34(br.s)，3.51(br.s)，3.58(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.28(m)，4.47(br.d)，4.54(br.s)，4.92(s)，6.58(d)，6.94(d)，7.66(d)，8.68(s)
实施例2-32
制备MTX-α-Trp-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-23中得到的化合物23(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,870,000和1.9％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,390,000和1.9％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.53(m)，1.74(m)，2.01(br.s)，2.09-2.15(m)，2.46(m)，2.85(m)，3.05(m)，3.35(br.s)，3.52(br.s)，3.58(br.s)，3.74(br.s)，3.83(br.s)，4.27(m)，4.48(br.d)，4.55(br.s)，6.83(d)，6.99(s)，7.05(s)，7.15(d)，7.43(d)，7.49(s)，8.74(s)
实施例2-33
制备MTX-α-Ser-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-24中得到的化合物24(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,860,000和1.7％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,650,000和1.7％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ 1.61(m)，1.76(m)，2.02(br.s)，2.38(t)， 2.51(m)，3.24(s)，3.25(s)，3.35(br.s)，3.50(br.s)，3.56(br.s)，3.58(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)， 4.28(m)，4.39(m)，4.46(br.s)，4.54(br.s)，4.91(s)，6.93(d)， 7.70 (d)，7.76(d)，8.66(s)， 8.68(s)
注意：加下划线的部分是较弱的信号。从这些信号中推论它是α-和γ-异构体的混合物。
实施例2-34
制备MTX-α-Leu-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-25中得到的化合物25(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,890,000和1.7％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,470,000和1.6％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ0.84(d)，0.89(d)，1.52-1.68(m)，1.72-1.83(m)，2.01(br.s)，2.45(t)，3.34(br.s)，3.50(br.s)，3.57(br.s)，3.72(br.s)，3.83(br.s)，4.28(m)，4.45(br.d)，4.54(br.s)，4.95(s)，6.91(d)，7.72(d)，8.69(s)
实施例2-35
制备MTX-α-Val-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-26中得到的化合物26(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,870,000和1.7％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,560,000和1.7％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ0.93(m)，1.78(m)，2.01(br.s)，2.11-2.19(m)，2.47(m)，3.24(s)，3.34(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.63(br.s)，3.72(br.s)，3.83(br.s)，4.02(d)，4.47(br.d)，4.54(br.s)，4.95(s)，6.91(d)，7.72(d)，8.69(s)
实施例2-36
制备MTX-α-His-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-27中得到的化合物27(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,910,000和1.2％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,620,000和1.2％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.70(m)，1.79(m)，2.01(br.s)，2.23-2.36(m)，3.13-3.22(m)，3.26(s)，3.34(br.s)，3.50(br.s)，3.56(br.s)，3.61(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.33(t)，4.46(br.d)，4.54(br.s)，4.96(s)，6.92(d)，7.30(s)，7.73(d)，8.57(s)，8.70(s)
实施例2-37
制备MTX-α-Pro-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-28中得到的化合物28(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,670,000和1.5％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,520,000和1.6％。
实施例2-38
制备MTX-α-βAla-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-29中得到的化合物29(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,910,000和1.7％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,430,000和1.7％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.60(m)，1.67(m)，1.79(m)，2.01(br.s)，2.42(m)，2.47(m)，3.09(t)，3.14(t)，3.34(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.73(br.s)，3.82(br.s)，4.47(br.s)，4.54(br.d)，4.96(s)，6.92(d)，7.73(d)，8.70(s)
实施例2-39
制备MTX-γ-PhePhe-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-30中得到的化合物30(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,090,000和1.5％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,880,000和1.5％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.52(m)，1.81(m)，2.02(br.s)，2.16-2.29(m)，2.60(m)，2.76(m)，2.99(m)，3.07(m)，3.18-3.26(m)，3.32(s)，3.35(br.s)，3.52(br.s)，3.56(br.s)，3.66(br.s)，3.73(br.s)，3.84(br.s)，4.15(t)，4.27(t)，4.36(m)，4.47(br.s)，4.55(br.d)，6.86(d)，6.92-6.99(m)，7.02-7.16(m)，7.79(d)，8.71(s)
实施例2-40
制备MTX-γ-PhePhe-NHC6H12O2NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-31中得到的化合物31(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,890,000和2.0％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,760,000和2.0％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ2.02(br.s)，2.15-2.24(m)，2.60(m)，2.74-2.83(m)，3.12-3.19(m)，3.20-3.23(m)，3.29(s)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.21(t)，4.26(t)，4.32(m)，4.46(br.s)，4.55(br.d)，6.84(s)，6.93(d)，7.00-7.13(m)，7.76(d)，8.64(s)
实施例2-41
制备MTX-γ-PhePhe-NHC4H8ONH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-32中得到的化合物32(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,960,000和2.1％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,800,000和2.1％。
实施例2-42
制备MTX-γ-PheGly-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-33中得到的化合物33(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,900,000和1.4％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,720,000和1.5％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.69(m)，1.79(m)，2.02(br.s)，2.19-2.26(m)，2.29(m)，2.66(m)，2.82(m)，3.13(m)，3.20(m)，3.29(s)，3.34(br.s)，3.51(br.s)，3.56(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)  4.16(t)，4.33(m)，4.46(br.s)，4.54(br.s)，4.94(d)，6.82(s)，6.99-7.08(m)，7.75(d)，8.68(s)
实施例2-43
制备MTX-γ-Phe-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-34中得到的化合物34(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,870,000和1.7％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,650,000和1.7％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.44(m)，1.80(m)，2.02(br.s)，2.31(m)，2.53(m)，2.68(m)，2.88(m)，3.01(m)，3.13(m)，3.18(m)，3.31(s)，3.35(br.s)，3.51(br.s)，3.58(br.s)，3.63(br.s)，3.72(br.s)，3.84(br.s)，4.02(t)，4.37(m)，4.47(br.s)，4.55(br.s)，4.86(d)，4.98(d)，6.76(d)，7.02-7.09(m)，7.78(d)，8.72(s)
实施例2-44
制备MTX-γ-Glu-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-35中得到的化合物35(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,790,000和1.6％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,490,000和1.7％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.61-1.71(m)，1.73-1.88(m)，2.01(br.s)，2.23(m)，2.32(t)，2.38-2.55(m)，3.07(m)，3.34(br.s)，3.51(br.s)，3.56(br.s)，3.73(br.s)，3.83(br.s)  4.15(m)，4.46(br.s)，4.55(br.s)，4.95(s)，6.91(d)，7.70(d)，8.71(s)
实施例2-45
制备MTX-α-D-Phe-D-Phe-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-36中得到的化合物36(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,480,000和1.4％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,350,000和1.4％。
实施例2-46
制备MTX-γ-D-Phe-D-Phe-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-37中得到的化合物37(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,600,000和1.4％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,410,000和1.3％。
实施例2-47
制备MTX-α-AsnPhePhe-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-38中得到的化合物38(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,100,000和1.3％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,780,000和1.2％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.60(m)，1.80(m)，2.02(br.s)，2.34(m)，2.54(m)，2.60-3.05(m)，3.35(br.s)，3.52(br.s)，3.57(br.s)，3.64(br.s)，3.72(br.s)，3.83(br.s)，4.28(m)，4.46(br.s)，4.55(br.s)，6.61(d)， 6.77(t)，6.82-7.36(m)， 7.76 (d)，7.80(d)，8.61(s)，8.64(s)
注意：加下划线的部分是较弱的信号。从这些信号中推论它是α-和γ-异构体的混合物。
实施例2-48
制备MTX-α/γ-GlyPheLeuGly-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约2,300,000)与在实施例1-39中得到的化合物39(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约2,060,000和1.4％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约1,850,000和1.3％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ0.72(d)，0.77(d)， 0.81(d)，1.32(m)，1.50(m)，1.67-1.82(m)，2.01(br.s)，2.23(m)，2.33(m)，2.75-3.03(m)，3.51(br.s)，3.58(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)，4.16-4.28(m)，4.46(br.s)，4.54(br.s)，6.85(d)，6.92-7.06(m)，7.75(d)， 7.78(d)，8.63(s)，8.65(s)
注意：加下划线的部分是较弱的信号。从这些信号中推论它是α-和γ-异构体的混合物。
实施例2-49
制备MTX-α-PhePhe-NHC10H20O3NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约320,000)与在实施例1-2中得到的化合物2(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约330,000和1.1％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.67(m)，1.79(m)，1.84-1.94(m)，2.02(br.s)，2.12-2.20(m)，2.59(m)，2.77(m)，2.91(m)，2.99(m)，3.12-3.25(m)，3.35(br.s)，3.49(br.s)，3.51(br.s)，3.57(br.s)，3.71(br.s)，3.83(br.s)  4.18(t)，4.45(br.d)，4.55(br.d)，4.88(d)，4.96(d)，6.76(d)，6.95-7.10(m)，7.72(d)，8.68(s)
实施例2-50
制备MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA
用与实施例2-1类似的方法将透明质酸钠(500mg，分子量：约340,000)与在实施例1-1中得到的化合物1(0.031mmol)反应，得到标题HA-MTX缀合物的水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约340,000和2.0％。
用与实施例2-1相同的方法纯化该水溶液，得到标题HA-MTX缀合物的无菌水溶液。用与实施例2-1相同的方法测得其分子量和其中的MTX缀合率分别为约340,000和1.9％。
1H-NMR(500MHz，D2O)：δ1.83(m)，2.01(br.s)，2.12(m)，2.52(t)，2.69(m)，2.95(m)，3.34(br.d)，3.49(br.d)，3.57(br.s)，3.70(br.s)，3.83(br.s)，4.16(t)，4.45(br.d)，4.54(br.d)，4.87(d)，4.96(d)，6.66(d)，6.88-7.09(m)，7.72(d)，8.68(s)
在以上实施例2-1到2-50中得到的本发明HA-MTX缀合物总结在下表中。
[表1-1]
  缀合位置(α/γ) 含肽链的接头            水溶液             无菌水溶液
MTX缀合率(％)   缀合物分子量(道尔顿) MTX缀合率(％) 缀合物分子量(道尔顿)
实施例2-1 α -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- 2.1 1.95×106 2.1 1.86×106
  实施例2-2   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  1.9   2.28×106   1.9   2.18×106
实施例2-2’ α -Phe-Phe-NH-C2H4-NH- 2.2 2.19×106 2.3 2.06×106
  实施例2-3   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  0.6   2.32×106   0.5   2.17×106
  实施例2-4   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  1.1   2.32×106   1.1   2.23×106
  实施例2-5   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  1.4   2.27×106   2.3   2.09×106
  实施例2-6   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  3.9   2.05×106   3.8   1.91×106
  实施例2-7   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  4.5   1.97×106   4.4   1.74×106
实施例2-8 α -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH 1.6 2.11×106 1.4 1.98×106
  实施例2-9   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O2-NH-   1.8   1.83×106   1.7   1.55×106
  实施例2-10   α   -Phe-Phe-NH-C8H16O2-NH-   1.6   1.89×106   1.6   1.62×106
  实施例2-11   α   -Phe-Phe-NH-C6H12O2-NH-   1.9   1.92×106   2.0   1.62×106
  实施例2-12   α   -Phe-Phe-NH-C4H8O-NH-   2.0   1.72×106   1.9   1.49×106
  实施例2-13   α   -Phe-Phe-NH-C5H10-NH-   1.4   2.14×106   1.2   1.96×106
  实施例2-14   α   -Phe-Phe-Lys-   1.4   1.89×106   1.4   1.72×106
  实施例2-15   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-   1.4   0.83×106   1.4   0.80×106
  实施例2-16   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-   0.5   0.83×106   0.5   0.81×106
  实施例2-17   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-   3.4   0.77×106   3.4   0.76×106
[表1-2]
  实施例2-18   α   -Phe-Gly-NH-C10H20O3-NH-   1.5   1.99×106   1.4   1.86×106
  实施例2-19   α   -Phe-Gly-NH-C10H20O2-NH-   NT   NT   1.8   1.44×106
  实施例2-20   α   -Phe-Gly-NH-C8H16O2-NH-   1.6   1.73×106   1.6   1.50×106
  实施例2-21   α   -Phe-Gly-NH-C6H12O2-NH-   2.3   1.50×106   2.3   1.39×106
  实施例2-22   α   -Phe-Gly-NH-C4H8O-NH-   2.0   1.56×106   2.2   1.40×106
  实施例2-23   α   -Phe-Pro-NH-C10H20O3-NH-   1.6   1.66×106   1.6   1.52×106
  实施例2-24   α   -Phe-βAla-NH-C10H20O3-NH-   NT   NT   1.5   1.52×106
  实施例2-25   α   -Phe-βAla-NH-C2H4-NH-   2.3   2.09×106   2.3   1.98×106
  实施例2-26   α   -Phe-NH-C10H20O3-NH-   1.7   2.13×106   1.7   1.79×106
  实施例2-27   α   -Ile-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.92×106   1.7   1.62×106
实施例2-28 α -Ile-NH-C2H4-NH- 2.1 2.31×106 2.1 2.02×106
  实施例2-29   α   -Glu-NH-C10H20O3-NH-   1.5   2.01×106   1.5   1.83×106
实施例2-30 α -Glu-NH-C2H4-NH- 2.1 2.26×106 2.1 2.06×106
  实施例2-31   α   -Tyr-NH-C10H20O3-NH-   1.6   1.90×106   1.7   1.76×106
  实施例2-32   α   -Trp-NH-C10H20O3-NH-   1.9   1.87×106   1.9   1.39×106
实施例2-33 α/γ -Ser-NH-C10H20O3-NH- 1.7 1.86×106 1.7 1.65×106
实施例2-34 α -Leu-NH-C10H20O3-NH- 1.7 1.89×106 1.6 1.47×106
  实施例2-35   α   -Val-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.87×106   1.7   1.56×106
  实施例2-36   α   -His-NH-C10H20O3-NH-   1.2   1.91×106   1.2   1.62×106
  实施例2-37   α   -Pro-NH-C10H20O3-NH-   1.5   1.67×106   1.6   1.52×106
  实施例2-38   α   -βAla-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.91×106   1.7   1.43×106
  实施例2-39   γ   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-   1.5   2.09×106   1.5   1.88×106
  实施例2-40   γ   -Phe-Phe-NH-C6H12O2-NH-   2.1   1.89×106   2.0   1.76×106
  实施例2-41   γ   -Phe-Phe-NH-C4H8O-NH-   2.1   1.96×106   2.1   1.80×106
[表1-3]
  实施例2-42   γ   -Phe-Gly-NH-C10H20O3-NH-   1.4   1.90×106   1.5   1.72×106
  实施例2-43   γ   -Phe-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.87×106   1.7   1.65×106
  实施例2-44   γ   -Glu-NH-C10H20O6-NH-   1.6   1.79×106   1.7   1.49×106
  实施例2-45   α   -Dphe-DPhe-NH-C10H20O3-NH-   1.4   1.48×106   1.4   1.35×106
  实施例2-46   γ   -Dphe-DPhe-NH-C10H20O3-NH-   1.4   1.60×106   1.3   1.41×106
实施例2-47 α/γ   -Asn-Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH- 1.3 2.10×106 1.2 1.78×106
实施例2-48 α/γ   -Gly-Phe-Leu-Gly-NH-C10H20O3-NH- 1.4 2.06×106 1.3 1.85×106
  实施例2-49   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-   NT   NT   1.1   0.33×106
  实施例2-50   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   2.0   0.34×106   1.9   0.34×106
实验实施例1
粘弹性测定
在37℃下，使用直径4cm的锥形物，通过CSL500应力-控制流变仪(购自Carri-Med Ltd.)，测量实施例2-1、2-8、2-18、2-27和2-29的透明质酸(分子量：1,900,000和800,000)和缀合物无菌溶液的粘弹性。图1显示，该缀合物具有介于分子量为800,000到1,900,000的透明质酸中间的粘弹性。
实验实施例2
对滑膜细胞的抗增殖作用
用人滑膜细胞(HFLS)检测本发明HA-MTX缀合物对TNF-α刺激诱导的细胞增殖的作用。类风湿性关节炎(RA)的主要损害发生在滑膜组织，作为一个特征，已知滑膜细胞异常增殖形成了肉芽组织(关节翳)，从而破坏关节软骨和骨。在骨关节炎(OA)中也观察到了继发性滑膜炎。OA在滑膜细胞增殖方面不像RA，没有显示出这样显著的改变，但滑膜炎成为了炎性症状例如关节积水、疼痛和发热的原因，以上这些是膝OA的特征(“Hone，kansetsu Shikkan(Bone and joint diseases)”ed.Nobuyuki Miyasaka，2003，Asakura Publishing Co.，Ltd.)。因此，抑制由炎性细胞因子TNF-α刺激的滑膜细胞增殖的化合物抑制了RA和OA的病理学症状进程，成为用于它们的治疗药。
实施例2(表2)的HA-MTX缀合物的无菌水溶液用作试验物质。使用的HFLS(CA40405，Lot Nos.1413和1493)购自Cell ApplicationsIns.。
在96孔板(Falcon)上以5,000细胞/孔接种HFLS，并在含5％FBS和1×Antibiotic-Antimycotic(GIBOC)的Iscove’s修饰的Dulbecco’s培养基(IMDM)中培养3小时。细胞粘附以后，加入各种浓度的TNF-α(最终浓度：10ng/mL)和各种HA-MTX缀合物，接着培养5天。培养结束前2天向细胞内加入37kBq/孔的[3H]-脱氧尿苷(MORAVEK)，接着用闪烁计数器测定[3H]-脱氧尿苷的摄取量(放射性)。通过用0.05％胰蛋白酶(trypsin)-0.2％EDTA分开细胞而回收细胞。
使用不添加任何试验物质培养的细胞组中的放射性作为对照，将各个实验中用各个试验物质测量的放射性计算为相对数值(对照的％)。由于每1mg/mL透明质酸中游离羧基浓度为2.49×10-3mol/L(1g/401/L；401是N-乙酰葡糖胺+葡萄糖醛酸的分子量)，通过用MTX缀合率乘以该数值，计算各个HA-MTX中的MTX浓度(对于MTX缀合率为1％的1mg/mL HA-MTX缀合物来说，MTX浓度是2.49×10-5mol/L)。通过4-四参数逻辑法(分析软件：GraphPad Prism 3.02)，使用得到的数值计算抑制细胞增殖的活性(IC50值)。
HFLS中HA-MTX缀合物的IC50值显示在表2中。
[表2-1]
表2：对TNF-α刺激的人滑膜细胞增殖的抑制作用
缀合位置 含肽链的接头 MTX缀合率(％) 缀合物分子量(道尔顿) IC50
  (α/γ)   (mol/L)
  实施例2-1   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  2.1   1.86×106   3.6E-07
  实施例2-2   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  1.9   2.18×106   1.4E-07
  实施例2-2’   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  2.3   2.06×106   7.2E-07
  实施例2-4   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  1.1   2.23×106   1.1E-05
  实施例2-5   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  1.3   2.09×106   1.1E-06
  实施例2-6   α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-  3.8   1.91×106   9.1E-08
  实施例2-8   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH  1.4   1.98×106   8.4E-07
  实施例2-9   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O2-NH-  1.7   1.55×106   1.3E-06
  实施例2-10   α   -Phe-Phe-NH-C8H16O2-NH-  1.6   1.62×106   1.2E-06
  实施例2-11   α   -Phe-Phe-NH-C6H12O2-NH-  2.0   1.62×106   2.5E-07
  实施例2-12   α   -Phe-Phe-NH-C4H8O-NH-  1.9   1.49×106   3.0E-07
  实施例2-13   α   -Phe-Phe-NH-C5H10-NH- 1.2   1.96×106   1.5E-06
  实施例2-14   α   -Phe-Phe-Lys-  1.4   1.72×106   1.5E-05
  实施例2-15   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-  1.4   0.80×106   4.8E-07
  实施例2-16   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-  0.5   0.81×106   1.3E-05
  实施例2-17   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-  3.4   0.76×106   1.3E-05
实施例2-18 α -Phe-Gly-NH-C10H20O3-NH- 1.4 1.86×106 9.2E-06
  实施例2-19   α   -Phe-Gly-NH-C10H20O2-NH-  1.8   1.44×106   5.4E-06
[表2-2]
  实施例2-20   α   -Phe-Gly-NH-C8H16O2-NH-   1.6   1.50×106   1.8E-05
  实施例2-21   α   -Phe-Gly-NH-C6H12O2-NH-   2.3   1.39×106   8.3E-07
  实施例2-22   α   -Phe-Gly-NH-C4H8O-NH-   2.2   1.40×106   3.0E-06
  实施例2-23   α   -Phe-Pro-NH-C10H20O3-NH-   1.6   1.52×106   1.2E-05
  实施例2-24   α   -Phe-βAla-NH-C10H20O3-NH-   1.5   1.52×106   3.5E-06
  实施例2-25   α   -Phe-βAla-NH-C2H4-NH-   2.3   1.98×106   2.9E-07
  实施例2-26   α   -Phe-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.79×106   1.7E-06
  实施例2-27   α   -Ile-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.62×106   3.1E-06
  实施例2-28   α   -Ile-NH-C2H4-NH-   2.1   2.02×106   1.2E-05
  实施例2-29   α   -Glu-NH-C10H20O3-NH-   1.5   1.83×106   8.4E-06
  实施例2-30   α   -Glu-NH-C2H4-NH-   2.1   2.06×106   5.4E-05
  实施例2-31   α   -Tyr-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.76×106   7.0E-06
实施例2-32 α -Trp-NH-C10H20O3-NH- 1.9 1.39×106 4.7E-06
  实施例2-33   α   -Ser-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.65×106   3.6E-05
  实施例2-34   α   -Leu-NH-C10H20O3-NH-   1.6   1.47×106   3.6E-06
  实施例2-35   α   -Val-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.56×106   1.1E-05
  实施例2-36   α   -His-NH-C10H20O3-NH-   1.2   1.62×106   1.7E-05
  实施例2-39   γ   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-   1.5   1.88×106   3.2E-06
  实施例2-42   γ   -Phe-Gly-NH-C10H20O3-NH-   1.5   1.72×106   1.4E-05
  实施例2-47   α/γ   -Asn-Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-   1.2   1.78×106   1.1E-06
  实施例2-48   α/γ   -Gly-Phe-Leu-Gly-NH-C10H20O3-NH-   1.3   1.85×106   1.3E-06
  实施例2-49   α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-   1.1   0.33×106   1.3E-05
  MTX单独   -   -   -   5.5E-08
表2表明，所检测的各个HA-TMX缀合物对TNF-α刺激增强的人滑膜细胞增殖有抑制作用。
实验实施例3
在mBSA-诱导的单关节炎模型中对膝关节肿胀的抑制作用
在甲基化牛血清白蛋白(mBSA)-诱导的大鼠单关节炎模型中，根据对膝关节肿胀的抑制作用，评价本发明的各个HA-MTX缀合物的体内滑膜炎-抑制作用。由于本实验实施例采用的mBSA-诱导的关节炎模型广泛用作抗原诱发性关节炎模型，并且已知会发展成滑膜炎(Sven E.Andersson，等人，The Journal of Rheumatology(1998)25：9，1772-7)，因此在该模型中观察到的体内膝关节肿胀-抑制作用可以令人信服地表示滑膜炎-抑制作用。体内抑制滑膜炎的本发明化合物作为伴随有滑膜炎(RA、OA等)的关节疾病治疗药是有用的。
所用的动物是LEW/Crj大鼠(6-周龄雄性，购自Charles RiverLaboratories Japan，Inc.)。在诱导关节炎前21和14天，向大鼠侧腹皮下注入0.5mL乳液，该乳液是用2mg/mL mBSA(Calbiochem)水溶液和等量Freund’完全佐剂(Difco)制备的。向右膝关节内施用50μL 2mg/mL的mBSA水溶液，诱导关节炎。左膝关节不处理，用作每个个体的对照。在诱导关节炎前1天和后7天，以50μL的量向右膝关节内各个施用各个试验物质(无菌水溶液)和对照药物透明质酸。
膝关节肿胀的测量包括用测径器测量两个膝关节的宽度，以确定膝关节肿胀时的左/右差异(右膝直径-左膝直径)。从刚诱导关节炎前到2周以后，以每周2次的频率测量各个膝关节的宽度，以计算随时间转变的AUC(曲线下面积的缩写；在此指的是关节肿胀随时间曲线下面积)。在每次测量时，计算AUC的平均值和标准差，以进行各个试验物质处理组和HA-处理组之间的非配对t-检验，如果概率水平低于5％，则判断存在显著差异。用SAS version 6.12(SAS InstituteJapan)进行统计学分析。另外，使用HA-处理组的AUC作为对照，由此作为相对数值(对照的％)，计算各个试验物质的AUC。
使用上述方法通过确定本发明HA-MTX缀合物的效力得到的结果显示在表3中。
[表3-1]
表3：在mBSA-诱导的单关节炎模型中HA-MTX缀合物对膝关节肿胀的抑制作用
缀合位置(α/γ) 含肽链的接头 MTX缀合率(％) 缀合物分子量(道尔顿)   AUC(对照的％)(平均值±SEM) P值
  实施例2-1  α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   2.1   1.86×106   48.5±5.3   P＜0.0001
  实施例2-2  α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   1.9   2.18×106   45.0±6.8   P＜0.0001
  实施例2-2’  α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   2.3   2.06×106   65.5±7.5   P＜0.005
  实施例2-3  α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   0.5   2.17×106   76.2±7.7   P＜0.05
  实施例2-4  α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   1.1   2.23×106   69.0±6.5   P＜0.005
  实施例2-5  α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   1.3   2.09×106   51.7±3.8   P＜0.0001
  实施例2-6  α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   3.8   1.91×106   41.6±7.6   P＜0.0001
  实施例2-7  α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   4.4   1.74×106   46.5±4.8   P＜0.0001
  实施例2-8  α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH   1.4   1.98×106   54.9±7.2   P＜0.005
  实施例2-10  α   -Phe-Phe-NH-C8H16O2-NH-   1.6   1.62×106   63.7±9.1   P＜0.05
  实施例2-13  α   -Phe-Phe-NH-C5H10-NH-   1.2   1.96×106   60.5±9.9   P＜0.01
  实施例2-14  α   -Phe-Phe-Lys-   1.4   1.72×106   54.3±7.4   P＜0.0005
  实施例2-17  α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-   3.4   0.76×106   56.1±8.2   P＜0.01
  实施例2-18  α   -Phe-Gly-NH-C10H20O3-NH-   1.4   1.86×106   61.5±4.7   P＜0.005
实施例2-20 α -Phe-Gly-NH-C8H16O2-NH- 1.6 1.50×106 65.3±9.6 P＜0.01
  实施例2-21  α   -Phe-Gly-NH-C6H12O2-NH-   2.3   1.39×106   47.4±8.8   P＜0.0005
  实施例2-27  α   -Ile-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.62×106   75.1±6.8   P＜0.05
  实施例2-28  α   -Ile-NH-C2H4-NH-   2.1   2.02×106   63.5±4.7   P＜0.005
  实施例2-29  α   -Glu-NH-C10H20O3-NH-   1.5   1.83×106   68.8±6.7   P＜0.005
[表3-2]
  实施例2-30  α   -Glu-NH-C2H4-NH-   2.1   2.06×106   58.3±7.4   P＜0.005
  实施例2-31  α   -Tyr-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.76×106   67.7±6.2   P＜0.005
  实施例2-38  α   -βAla-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.43×106   69.3±4.2   P＜0.001
  实施例2-41  α   -Phe-Phe-NH-C4H8O-NH-   2.1   1.80×106   67.1±8.3   P＜0.05
  实施例2-47  α/γ   -Asn-Phe-Phe-NH-C20H20O3-NH-   1.2   1.78×106   42.1±6.3   P＜0.001
实施例2-48 α/γ   -Gly-Phe-Leu-Gly-NH-C10H20O3-NH- 1.3 1.85×106 58.8±11.6 P＜0.05
表3中的结果显示，相对于HA-处理组，目前检测的各个HA-MTX缀合物显著抑制了关节炎模型中的膝关节肿胀。当关注与HA缀合的MTX的缀合率效果时，提示相对于HA-处理组，0.5到4.4％的MTX缀合率(实施例1到7)显著抑制了关节炎模型中的膝关节肿胀。
实验实施例4
为了证实本发明HA-MTX缀合物的有效性，根据实施例3的方法，比较下列各组对关节肿胀的抑制作用：1)实施例2-2制备的HA-MTX缀合物(无菌水溶液)处理组；2)含量等于HA-MTX缀合物中包含的MTX量的含MTX溶液处理组；和3)含量等于缀合物中包含的量的MTX和透明质酸(HA)混合物(HA+MTX)处理组。在该试验中，膝关节肿胀随时间的改变显示在图2中，其AUC显示在图3中。图2和3的结果证实了相对于MTX单独或MTX和HA混合物，HA-MTX缀合物对关节炎模型中的关节肿胀有显著强的抑制作用。因此，证实了MTX和HA缀合物显著提高了MTX的关节肿胀抑制作用。
上述结果显示，本发明的HA-MTX缀合物对TNF-α刺激的人滑膜细胞体外增殖有抑制作用，并且对体内发展关节炎模型的滑膜炎有减轻作用。进一步地，在关节炎模型中，无论是MTX单独或是HA和MTX混合物对滑膜炎都没有充分的减轻作用，然而HA-MTX缀合物却对滑膜炎表现出了强抑制作用。
实验实施例5
对胶原诱导的关节炎模型的作用
在广泛用作类风湿性关节炎(RA)模型的大鼠胶原诱导的关节炎模型(Kim等人，“Kansetsu geka(Articular surgery)”(1998)17(2)：111-21)中评价HA-MTX缀合物的体内滑膜炎-抑制作用。在该模型中抑制炎症的本发明化合物将对于治疗由RA代表的自身抗原诱导的免疫疾病有用。
所用的动物是DA/Slc大鼠(Japan SLC Inc.，11-周龄雌性)。将II型牛胶原(Collagen Gijutsu Kenshukai)溶于0.01mol/L乙酸水溶液，以提供1.5mg/mL浓度，然后向其中加入等量Freund’s不完全佐剂(Difco)，制备乳液。在每只大鼠背部的4个地方皮内施用该乳液，每个地方0.1mL，或总量0.4mL，以诱导关节炎。从致敏那天开始每5天一次仅向右膝关节内施用50μl各个试验物质(无菌水溶液)和对照药物透明质酸(HA)和盐水。左膝关节不经处理。另外，为了对照病理学模型，将盐水施用到没有诱导关节炎的(正常)动物右膝关节内。
用测径器测量两个膝关节的宽度，将它们与正常组宽度比较，观察到了膝关节肿胀的改变。从刚诱导关节炎前开始到23天以后，以每周2次的频率进行观察。测量结束时，计算膝关节宽度的平均值和平均值的标准误，以进行试验物质处理组和HA-处理组之间的非配对t-检验，如果概率水平小于5％，则判断存在显著差异。用SAS version8.02(SAS Institute Japan)进行统计学分析。
使用上述方法通过检测本发明HA-MTX缀合物的效力而获得的结果显示在表4中。
图4中的结果显示，与HA-处理组相比，本发明的HA-MTX缀合物显著抑制了胶原诱导的关节炎的关节肿胀宽度，其宽度随时间的改变几乎与正常组一样。另外，只有在其中已经施用了HA-MTX缀合物的部位(右膝)观察到了该作用，在未处理部位(左膝)没有观察到。从而证明了本发明化合物只有在用其治疗的部位可以发挥作用。
实验实施例6
在胶原酶-诱导的关节炎(OA)模型中对膝关节肿胀的抑制作用
在胶原酶-诱导的OA模型大鼠中评价HA-MTX缀合物的体内滑膜炎-抑制作用。胶原酶-诱导的OA模型是这样的模型，通过注射胶原酶到膝关节内，在软骨组织中直接消化胶原，从而在膝关节内诱导炎症的模型。该模型具有与人OA病理生理学相类似的组织病理学改变，例如关节软骨变性和滑膜炎，并且该模型对于评价OA治疗药是有用的(Takanori K，等人，Osteoarthritis and Cartilage(1998)6：177-86)。因此，在模型中抑制炎症和抑制其中软骨变性的本发明化合物将可用作OA治疗药。
所用的动物是SD/Crj大鼠(6-周龄雄性，购自Charles RiverLaboratories Japan，Inc.)。向右膝关节腔内施用50μL 1.5％胶原酶(Sigma)溶液诱导关节炎。左膝关节不经处理，用作各个个体的对照。在诱导关节炎前7天和1天每周1次以50μL的量将各个试验物质施用到右膝关节内。
膝关节肿胀的确定包括用测径器测量两个膝关节的宽度，以确定左/右差异(右膝直径-左膝直径)，这被定义为膝关节肿胀。从刚诱导关节炎前到2周以后，以每周2次的频率测量各个膝关节的宽度，从显示随时间转变的图计算AUC。每次测量时，计算AUC的平均值和平均值的标准误，以进行各个试验物质处理组和HA-处理组之间的非配对t-检验，并且如果概率水平小于5％，则判断存在显著差异。
使用上述方法通过检测本发明HA-MTX缀合物的效力而获得的结果显示在图5和表4中。HA-MTX缀合物典型的关节肿胀随时间的改变显示在图5中，所检测的试验物质的结果显示在表4中。
[表4]
表4：在胶原酶-诱导的关节炎(OA)模型中HA-MTX缀合物对膝关节肿胀的抑制作用
缀合位置(α/γ) 含肽链的接头 MTX缀合率(％) 缀合物分子量(道尔顿)   AUC(对照的％)(平均值±SEM) P值
  实施例2-1  α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   2.1   1.86×106   45.7±3.9   P＜0.0001
  实施例2-2  α   -Phe-Phe-NH-C2H4-NH-   1.9   2.18×106   48.9±3.7   P＜0.001
  实施例2-8  α   -Phe-Phe-NH-C10H20O3-NH-   1.4   1.98×106   54.8±5.9   P＜0.0001
  实施例2-18  α   -Phe-Gly-NH-C10H20O3-NH-   1.4   1.86×106   65.9±3.5   P＜0.0001
  实施例2-27  α   -Ile-NH-C10H20O3-NH-   1.7   1.62×106   82.6±5.2   P＜0.05
这些结果显示，相对于HA-处理组，在胶原酶-诱导的关节炎模型中，目前检测的各个HA-MTX缀合物显著抑制了关节肿胀。
实验实施例7
在胶原酶-诱导的关节炎(OA)模型中，对关节软骨破坏的抑制作用
如实施例6前部所述，已知胶原酶-诱导的OA模型对于评价OA治疗药是有用的。因此，在该模型中抑制炎症和在其中抑制软骨变性的化合物作为OA治疗药将是有用的。
所用动物是SD/Crj大鼠(6-周龄雄性，购自Charles RiverLaboratories Japan，Inc.)。向右膝关节腔内施用50μL 1.5％胶原酶(Sigma)溶液诱导关节炎。左膝关节不经处理，用作各个个体的对照。在诱导关节炎前7天和1天每周1次以50μL的量将各个试验物质或作为对照的盐水施用到右膝关节内。
为了评价膝关节软骨的破坏程度，诱导关节炎后28天取出右膝关节，使用扫描电子显微镜(SEM)在脚骨内踝中拍摄变性关节软骨图像。拍照以后进行双盲，接着从各个个体的SEM图像对关节软骨变性程度进行等级评定。固定数据以后，取消双盲，计算各组的等级平均数。在盐水处理组和试验物质处理组之间进行Wilcoxon秩和检验，并且如果概率水平小于5％，则判断存在显著差异。用SAS version 8.02(SASInstitute Japan)进行统计学分析。
使用上述方法通过检测本发明HA-MTX缀合物获得的结果显示在图6中。
图6的结果显示，在胶原酶-诱导的OA模型中，相对于盐水处理组，本发明的HA-MTX缀合物显著抑制了软骨变性。这些结果证明了在关节炎模型中，HA-MTX缀合物不仅可以抑制关节肿胀，而且可以抑制关节软骨破坏。因此，本发明的HA-MTX缀合物可用于治疗伴随有关节软骨变性或缺损的关节疾病。
                      工业实用性
本发明的HA-MTX缀合物提供了极好的关节疾病治疗药物，它具有非常规效果，它具有HA方面作为关节内治疗，并且只有在治疗过的关节中可以安全地发挥MTX的滑膜炎-抑制作用。

Claims (11)

1.透明质酸-甲氨蝶呤缀合物，其中，甲氨蝶呤通过含1到8个氨基酸的肽链的接头与透明质酸、透明质酸衍生物或其盐的羧基缀合。
2.根据权利要求1的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物，其中，接头包含由1到8个氨基酸组成的肽链和C2-20亚烷基二胺链，其中，亚烷基二胺链任选含有1到5个插入其中的氧原子和/或任选被羧基或C1-6烷氧羰基取代。
3.根据权利要求1或2的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物，其中，甲氨蝶呤的缀合率占透明质酸总羧基的0.5％到4.5％。
4.根据权利要求1到3任一项的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物，其中，透明质酸的分子量是600,000道尔顿或更高。
5.根据权利要求1到4任一项的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物，其中，与接头缀合的甲氨蝶呤用式(I)、(II)、(III)或(IV)表示：
[式1]
[式2]
Figure A2005800129630002C2
[式3]
[式4]
其中，R1和R2各自独立地是羟基、氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基或二-C1-6烷氨基；
L0是接头的缀合位置。
6.根据权利要求1到4任一项的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物，其中，含肽链的接头和与接头缀合的甲氨蝶呤用式(I’)或(II’)表示：
[式5]
Figure A2005800129630003C3
[式6]
Figure A2005800129630004C1
其中，R1和R2各自独立地是羟基、氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基或二-C1-6烷氨基；
L是式(X)表示的接头：
[式7]
Figure A2005800129630004C2
其中，Q1与其上结合的-NH-一起形成由1到8个氨基酸组成的肽链；肽链内包含的氨基酸残基各自独立地任选被一个或多个选自C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧羰基、甲酰基、C1-6烷基磺酰基和C6-10芳基磺酰基的基团取代或保护；肽链内包含的酰胺键各自独立地在氮原子上任选被一个或多个C1-6烷基和/或C1-6烷基羰基取代；并且残基内包含的羧基各自独立地任选转变成任选被一个或两个C1-6烷基取代的酰胺基；
R11和R12各自独立地是氢原子或C1-6烷基；
Q2是C2-20亚烷基，其中，亚烷基任选含有1到5个插入其中的氧原子和/或任选被羧基或C1-6烷氧羰基取代；和
[HA]代表与透明质酸的缀合位置，并且接头与透明质酸内包含的羧基形成酰胺键。
7.药物组合物，其包含权利要求1到6任一项的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物作为有效成分。
8.用于关节疾病的治疗药物，其包含权利要求1到6任一项的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物作为有效成分。
9.根据权利要求8的关节疾病治疗药物，它是用于关节内给药的局部制剂。
10.式(Va)或(Vb)化合物：
[式8]
Figure A2005800129630005C1
[式9]
Figure A2005800129630005C2
其中，R1和R2各自独立地是羟基、氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基或二-C1-6烷氨基；
L1是式(X’)表示的接头：
[式10]
Figure A2005800129630005C3
其中，Q1与其上结合的-NH-一起形成由1到8个氨基酸组成的肽链；肽链内包含的氨基酸残基各自独立地任选被一个或多个选自C1-6烷基、C1-6烷基羰基、C1-6烷氧羰基、甲酰基、C1-6烷基磺酰基和C6-10芳基磺酰基的基团取代或保护；肽链内包含的酰胺键各自独立地在氮原子上任选被一个或多个C1-6烷基和/或C1-6烷基羰基取代；并且残基内包含的羧基各自独立地任选转变成任选被一个或两个C1-6烷基取代的酰胺基；
R11和R12各自独立地是氢原子或C1-6烷基；和
Q2是C2-20亚烷基，其中，亚烷基任选含有1到5个插入其中的氧原子和/或任选被羰基或C1-6烷氧羧基取代。
11.制备权利要求1的透明质酸-甲氨蝶呤缀合物的方法，包括将权利要求10的式(Va)或(Vb)化合物与透明质酸反应，并且将透明质酸的羧基转变成N-取代的酰胺基的步骤。
CN2005800129632A 2004-03-05 2005-03-04 透明质酸/甲氨蝶呤化合物 Expired - Fee Related CN1946743B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP062616/2004 2004-03-05
JP2004062616 2004-03-05
JP2004167755 2004-06-04
JP167755/2004 2004-06-04
PCT/JP2005/003739 WO2005085294A1 (ja) 2004-03-05 2005-03-04 ヒアルロン酸−メトトレキサート結合体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1946743A true CN1946743A (zh) 2007-04-11
CN1946743B CN1946743B (zh) 2010-06-02

Family

ID=34921707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800129632A Expired - Fee Related CN1946743B (zh) 2004-03-05 2005-03-04 透明质酸/甲氨蝶呤化合物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8088916B2 (zh)
EP (1) EP1724287A4 (zh)
JP (1) JP4927536B2 (zh)
KR (1) KR101234476B1 (zh)
CN (1) CN1946743B (zh)
AU (1) AU2005219733C1 (zh)
CA (1) CA2559188C (zh)
HK (1) HK1102481A1 (zh)
TW (1) TWI359665B (zh)
WO (1) WO2005085294A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102164606A (zh) * 2008-09-30 2011-08-24 电气化学工业株式会社 光稳定化药物组合物
CN105324132A (zh) * 2013-08-29 2016-02-10 爱禾公司 糖胺聚醣化合物及其医药组合物与用途
CN111732675A (zh) * 2020-08-18 2020-10-02 山东华熙海御生物医药有限公司 透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物、制法及其应用
CN111821470A (zh) * 2020-09-01 2020-10-27 中南大学 包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物及其制备方法与应用
CN111868097A (zh) * 2018-03-21 2020-10-30 极致药物有限公司 司坦唑醇与透明质酸的缀合物
CN115444840A (zh) * 2022-09-15 2022-12-09 四川大学 一种前药、两性离子水凝胶及其制备方法、应用

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE450273T1 (de) * 2005-05-18 2009-12-15 Eurand Pharmaceuticals Ltd Proliferationshemmendes arzneimittel
US8354392B2 (en) * 2005-07-06 2013-01-15 Seikagaku Corporation Drug-introduced photo-crosslinked hyaluronic acid derived gel
JP5043364B2 (ja) * 2006-05-01 2012-10-10 生化学工業株式会社 多糖誘導体の製造方法
DE102006035083A1 (de) * 2006-07-28 2008-01-31 medac Gesellschaft für klinische Spezialgeräte mbH Proteinbindende Methotrexat-Derivate und diese enthaltende Arzneimittel
US9017712B2 (en) * 2010-07-12 2015-04-28 Shin Poong Pharmaceutical Co., Ltd. Filler composition for tissue reinforcement
CA2835819A1 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Genzyme Corporation Induction of immune tolerance using methotrexate
KR101445265B1 (ko) 2012-09-18 2014-09-30 포항공과대학교 산학협력단 히알루론산-핵산 접합체 및 이를 포함하는 핵산 전달용 조성물
WO2014056915A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 Ascendis Pharma A/S Diagnosis, prevention and treatment of diseases of the joint
KR101467076B1 (ko) * 2013-02-20 2014-12-02 성균관대학교산학협력단 히알루론산-메토트렉세이트 접합체를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법
KR101616623B1 (ko) * 2014-07-24 2016-04-29 연세대학교 산학협력단 양이온성 고분자가 결합된 소수성 약물 및 음이온성 고분자가 결합된 친수성 약물을 포함하는 나노입자
IT201700110784A1 (it) * 2017-10-03 2019-04-03 Fidia Farm Spa Composizioni farmaceutiche contenenti Acido Ialuronico e Carnosina e relativo uso
CN108888775A (zh) * 2018-07-24 2018-11-27 西北大学 一种透明质酸-甲氨蝶呤自组装纳米胶束及其制备方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0083367A1 (en) 1981-07-02 1983-07-13 WALTON, Alan G. Glycosaminoglycan drug complexes
US5554386A (en) * 1986-07-03 1996-09-10 Advanced Magnetics, Inc. Delivery of therapeutic agents to receptors using polysaccharides
JPH0689026B2 (ja) * 1987-08-06 1994-11-09 帝人株式会社 メソトレキセート誘導体およびその製造方法
JP2604930B2 (ja) 1990-12-14 1997-04-30 株式会社ディ・ディ・エス研究所 ヒアルロン酸およびコンドロイチン誘導体
CA2097589C (en) * 1990-12-19 1998-05-05 Lee Josephson Targeting of therapeutic agents using polysaccharides
US5902795A (en) * 1992-06-16 1999-05-11 Trustees Of Tufts College Oligosaccharides reactive with hyaluronan-binding protein and their methods of use
JP2527885B2 (ja) * 1992-09-02 1996-08-28 株式会社ディ・ディ・エス研究所 ヘパリン誘導体
WO1994013327A1 (en) 1992-12-15 1994-06-23 The Wellcome Foundation Limited Immunoreactive reagents employing dihydrofolate reductase
WO1994019376A1 (en) * 1993-02-26 1994-09-01 Drug Delivery System Institute, Ltd. Polysaccharide derivative and drug carrier
US6322815B1 (en) 1994-07-22 2001-11-27 W. Mark Saltzman Multipart drug delivery system
JP3001381B2 (ja) * 1994-09-16 2000-01-24 株式会社ディ・ディ・エス研究所 臓器移行性を有する多糖誘導体および薬物担体
JP4018181B2 (ja) * 1995-11-07 2007-12-05 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン誘導体およびその製造法
JPH11222425A (ja) * 1997-10-27 1999-08-17 Ss Pharmaceut Co Ltd 関節疾患治療用関節内投与製剤
TW577758B (en) 1997-10-27 2004-03-01 Ssp Co Ltd Intra-articular preparation for the treatment of arthropathy
EP1082963A4 (en) 1998-05-20 2004-03-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd MEDICINE FOR HYALURONIC ACID-ASSOCIATED JOINT DISEASES
WO2000064486A2 (en) 1999-04-28 2000-11-02 Vectramed, Inc. Enzymatically activated polymeric drug conjugates
IT1318403B1 (it) 2000-03-17 2003-08-25 Cooperativa Ct Ricerche Poly T Esteri polisaccaridici di n-derivati di acido glutammico.
JP2004292465A (ja) 2000-11-30 2004-10-21 Denki Kagaku Kogyo Kk ヒドロキサム酸誘導体とヒアルロン酸の結合体
EP1710257A4 (en) 2004-01-07 2011-03-23 Seikagaku Kogyo Co Ltd HYALURONIC ACID DERIVATIVE AND MEDICAMENT CONTAINING THEREOF
US7807675B2 (en) * 2004-04-02 2010-10-05 Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Hyaluronic acid-methotrexate conjugate
DE102005017196A1 (de) 2005-04-13 2006-10-19 Henkel Kgaa Pastenförmige Blondiermittel mit cyclischen Kohlensäureestern und Silikaten

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102164606A (zh) * 2008-09-30 2011-08-24 电气化学工业株式会社 光稳定化药物组合物
CN102164606B (zh) * 2008-09-30 2014-04-16 电气化学工业株式会社 光稳定化药物组合物
CN105324132A (zh) * 2013-08-29 2016-02-10 爱禾公司 糖胺聚醣化合物及其医药组合物与用途
CN110590971A (zh) * 2013-08-29 2019-12-20 爱禾公司 糖胺聚醣化合物及其医药组合物与用途
CN105324132B (zh) * 2013-08-29 2020-07-21 爱禾公司 糖胺聚醣化合物及其医药组合物与用途
CN111868097A (zh) * 2018-03-21 2020-10-30 极致药物有限公司 司坦唑醇与透明质酸的缀合物
CN111732675A (zh) * 2020-08-18 2020-10-02 山东华熙海御生物医药有限公司 透明质酸-氨基葡萄糖接枝共聚物、制法及其应用
CN111821470A (zh) * 2020-09-01 2020-10-27 中南大学 包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物及其制备方法与应用
CN111821470B (zh) * 2020-09-01 2022-08-12 中南大学 包载甲氨蝶呤的铁-鞣酸配合物及其制备方法与应用
CN115444840A (zh) * 2022-09-15 2022-12-09 四川大学 一种前药、两性离子水凝胶及其制备方法、应用
CN115444840B (zh) * 2022-09-15 2023-08-25 四川大学 一种前药、两性离子水凝胶及其制备方法、应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005085294A1 (ja) 2005-09-15
EP1724287A1 (en) 2006-11-22
AU2005219733B2 (en) 2010-05-06
US20070197465A1 (en) 2007-08-23
KR20070006798A (ko) 2007-01-11
TWI359665B (en) 2012-03-11
HK1102481A1 (en) 2007-11-23
CA2559188A1 (en) 2005-09-15
CA2559188C (en) 2013-01-08
JP4927536B2 (ja) 2012-05-09
CN1946743B (zh) 2010-06-02
EP1724287A4 (en) 2010-10-27
TW200533363A (en) 2005-10-16
AU2005219733C1 (en) 2010-12-16
AU2005219733A1 (en) 2005-09-15
US8088916B2 (en) 2012-01-03
KR101234476B1 (ko) 2013-02-18
JPWO2005085294A1 (ja) 2007-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1946743A (zh) 透明质酸/甲氨蝶呤化合物
CN1149210C (zh) 凝血酶抑制剂
CN1142935C (zh) 喜树碱化合物及其制备方法
CN1051083C (zh) 有免疫调节活性的新的取代嘌呤基衍生物
CN1255392C (zh) 作为血管生成抑制剂的秋水仙醇衍生物
CN1143859C (zh) 喜树碱衍生物及其制备方法
CN1930190A (zh) 透明质酸衍生物及含有其的药剂
CN1505617A (zh) 作为Met-AP2抑制剂的肽
CN1909930A (zh) 转谷氨酰胺酶介导的肽的接合
CN1918131A (zh) 新的谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂
CN1171118A (zh) 纤连蛋白粘附抑制剂
CN1925866A (zh) 细菌感染的治疗
CN1635832A (zh) 施用glp－1分子的方法
CN1871239A (zh) β－联蛋白/TCF激活转录的调节
CN1571796A (zh) 黑皮素受体配体
CN1767857A (zh) 聚合物－因子ⅷ部分共轭物
CN1434726A (zh) 包含高分子量聚环氧乙烷的多价平台分子
CN1541114A (zh) 大环金属配合物与生物分子之结合物及其在制备nmr诊断和放射诊断及放射治疗用剂中的应用
CN1351609A (zh) 低分子量补体蛋白酶抑制剂
CN1443173A (zh) 作为TAFIa抑制剂的取代的咪唑
CN1065874C (zh) 新的肽及其制备和应用
CN1533286A (zh) 大环金属配合物及其在制备与生物分子之结合物中的应用
JPWO2006095775A1 (ja) 水溶性ヒアルロン酸修飾物とｇｌｐ−１アナログの結合体
CN1829738A (zh) 新型胰岛素衍生物
CN1764655A (zh) 芳族砜异羟肟酸酯及其作为蛋白酶抑制剂的用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1102481

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1102481

Country of ref document: HK

ASS Succession or assignment of patent right

Free format text: FORMER OWNER: CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20101214

Address after: Tokyo, Japan

Patentee after: Denki Kagaku Kogyo K. K.

Address before: Tokyo, Japan

Co-patentee before: Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.

Patentee before: Denki Kagaku Kogyo K. K.

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20100602

Termination date: 20190304

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee