CN1741817A - 丙型肝炎病毒密码子优化的非结构ns3/4a融合基因 - Google Patents

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Abstract

本发明的各方面涉及密码子－优化的丙型肝炎病毒(HCV) NS3/4A基因的产生。实施方案包括所述NS3/4A基因、所述基因的片段、所述核酸编码的HCV肽、编码所述HCV肽的核酸、针对所述肽的抗体、含有所述核酸和肽的组合物，以及制备和使用前述组合物的方法，包括但不限于治疗和预防HCV感染的诊断法和药物。

Description

丙型肝炎病毒密码子优化的非结构NS3/4A融合基因
发明领域
本发明各方面涉及新的丙型肝炎病毒(HCV)NS3/4A基因的产生，该基因已经被密码子优化以在人体中表达。实施方案包括密码子优化的NS3/4A基因、所述基因编码的HCV肽、编码所述HCV肽的核酸、针对所述肽的抗体、含有所述核酸和肽的组合物，以及制备和使用前述组合物的方法，该方法包括但不限于用于治疗和预防HCV感染的诊断法和药物。
发明背景
病毒是细胞内寄生生物，需要宿主细胞的生物化学机器进行复制和增殖。所有病毒颗粒都含有某种遗传信息，其编码病毒结构蛋白和酶。遗传物质可以是DNA或者RNA，为双链或者单链形式( Virology，Fields编著，第三版，Lippencott-Raven publishers，72-83页(1996))。病毒核酸被称作壳体的蛋白质外壳围绕(Id.)。在某些病毒中，壳体被含有脂质膜的另一层围绕，该层称作被膜(Id.83-95)。
典型的病毒生命周期以通过病毒颗粒粘附到细胞表面受体和病毒壳体的内化感染宿主细胞开始(Id.103)。因此，病毒的宿主范围局限于表达合适的细胞表面受体的细胞。一旦内化，病毒颗粒就解装配并且其核酸被转录、翻译或者复制(Id.)。此时，病毒可以经历裂解性复制，其中形成新的病毒颗粒并且从受感染的细胞释放该病毒颗粒(Id.105-11)。流感病毒是在感染宿主细胞后立即经历裂解性复制的病毒的典型实例(Id.1369-85)。
备选地，病毒可以进入潜伏期，其称为溶原状态，其中基因组经复制但是如果有也是很少的病毒蛋白被实际上表达并且不形成病毒颗粒(Id.219-29)。疱疹病毒如EB病毒是在宿主细胞中建立潜伏感染的病毒的典型实例(Id.229-34)。最后，为了病毒扩散，病毒必须退出溶原状态并进入裂解期。在裂解期期间释放的病毒颗粒感染同一个体的其他细胞或者可以传染另一个体并且在该个体建立新的感染。
因为病毒生命周期包括细胞内和细胞外阶段，所以体液和细胞介导的免疫防御系统对于抗击病毒感染都是重要的(Id.467-73)。针对病毒蛋白的抗体可以阻断病毒颗粒与其细胞受体的相互作用或者干扰内化或者释放过程(Id.471)。能够干扰病毒生命周期的抗体被称作中和抗体。
在细胞内复制期间，产生病毒蛋白(其对于宿主细胞是外来的)并且这些蛋白的一些在偶联到呈递于受感染的细胞上的主要组织相容性复合体(MHC)分子后被细胞蛋白酶消化(Id.350-58)。因此，在病毒复制和扩散到邻近细胞之前，受感染的细胞就被T-淋巴细胞、巨噬细胞或者NK-细胞识别并杀死(Id.468-70)。此外，病毒核酸，尤其作为双链RNA的存在引起受感染的细胞关闭其翻译机器并产生通常所说的干扰素的抗病毒信号分子(Id.376-79)。
然而，病毒已经进化了逃避宿主的免疫防御系统的多种方法。例如，通过建立潜伏(即，溶原性)，病毒不进入裂解期并避免了体液免疫应答系统(Id.224)。在潜伏期，产生很少的病毒蛋白并且受感染的细胞将它们受感染状态的证据呈递给周围的淋巴细胞和巨噬细胞的能力最小(Id.225-26)。此外，某些病毒蛋白，尤其在潜伏期期间产生的那些病毒蛋白，进化出多肽序列，这些序列不能被有效呈递给细胞介导的免疫防御系统(Levitskaya等，Nature 375：685-88(1995))。最后，某些病毒可以例如，通过防止MHC分子的表面表达(Fruh等，J.Mol.Med.75：18-27(1997))或者通过破坏干扰素信号传递(Fortunato等，Trends Microbiol.8：111-19(2000))主动干扰受感染宿主的免疫应答。
尤其能逃避的是肝炎病毒，它们不被分类为一个家族但是基于它们感染肝脏细胞的能力分类。丙型肝炎病毒(HCV)属于单链RNA病毒的黄病毒科( Virology，如前，945-51页)。HCV基因组长约9.6kb，并且编码至少10种多肽(Kato，Microb.Comp.Genomics，5：129-151(2000))。该基因组RNA经翻译成单一一种多蛋白，其随后经病毒和细胞蛋白酶切割产生功能多肽(Id.)。该多蛋白被切割成三种结构蛋白(核心蛋白、E1和E2)、功能未知的p7、和6种非结构(NS)蛋白(NS2、NS3、NS4A/B、NS5A/B)(Id.)。NS3编码丝氨酸蛋白酶，其负责病毒成熟所需的一些蛋白质水解事件(Kwong等，Antiviral Res.，41：67-84(1999))，NS4A作为NS3蛋白酶的辅因子(Id.)。NS3还表现出NTP酶活性，并且具有体外RNA解旋酶活性(Kwong等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，242：171-96(2000))。
HCV感染通常从急性发展到慢性期( Virology，如前，1041-47页)。急性感染的特征是肝脏组织和外周血液中高病毒复制和高病毒负荷(Id.1041-42)。在约15％受感染的个体中急性感染被患者的免疫防御系统清除；在另外85％个体中病毒建立慢性、持久的感染(Lawrence，Adv.Intern.Med.，45：65-105(2000))。在慢性期期间，在肝脏中发生复制，并且可以在外周血液中检测到一些病毒( Virology，如前，1042页)。
对于建立持久感染关键的是进化出逃避宿主免疫防御系统的策略。HCV作为单链RNA病毒，在其基因组的复制和转录中表现出高突变率(Id.1046)。因此，已经注意在裂解期产生的抗体很少中和慢性感染期期间产生的病毒株(Id.)。尽管似乎HCV不干扰抗原加工和在MHC-I分子上的呈递，但是病毒NS5A蛋白可以通过抑制PKR蛋白激酶而参与干扰素信号传递的抑制(Tan等，Virology，284：1-12(2001))。
受感染的宿主产生针对HCV病毒的体液和细胞免疫应答，但是在多数情况下该应答不能防止该慢性病的建立。急性期后，受感染的患者产生抗病毒抗体，包括针对被膜蛋白E1和E2的中和抗体(Id.1045)。该抗体应答在慢性感染期间持续(Id.)。在慢性感染的患者中，肝脏还被CD8+和CD4+淋巴细胞浸润(Id.1044-45)。此外，受感染的患者产生作为对病毒感染的早期应答的干扰素(Id.1045)。可能最初针对感染的免疫应答的活力决定了该病毒将被清除或者感染将发展到慢性期((Pape等，J.Viral.Hepat.，6增刊1：36-40(1999))。尽管有其他人的努力，但是对用于预防和治疗HCV感染的有效免疫原和药物的需求是显然的。
发明概述
发现了一种新的HCV分离物。从感染HCV的患者克隆并测序了HCV基因组的一种新的NS3/4A片段(SEQ.ID.NO.：1)。发现该序列与最接近的HCV序列仅有93％同源性。实施方案包含、组成为或者组成基本上为该肽(SEQ.ID.NO.：2)或者其含有SEQ.ID.NO.：2的至少3-50个氨基酸的任一数目的连续氨基酸(例如，3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸)的片段、编码这些分子的核酸、含有所述核酸的载体，和含有所述载体、核酸或者肽的细胞。发现NS3/4A核酸、其片段和相应肽是免疫原性的。因此，优选的实施方案包括疫苗组合物和免疫原制剂，它们含有、组成为或者组成基本上为SEQ.ID.NO.：2的HCV肽或者其含有SEQ.ID.NO.：2的至少3-50个氨基酸的任一数目的连续氨基酸(例如，3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸)的片段(例如SEQ.ID.NOs.：14和15)或者编码所述肽或片段的核酸。
还产生了NS3/4A肽的突变体并且发现其是免疫原性的。某些突变体是NS3/4A肽的截短形式(例如，SEQ.ID.Nos：12和13)，其他的缺少蛋白质水解切割位点(例如，SEQ.ID.Nos：3-11)。这些肽(例如，SEQ.ID.NOs.：3-13)和含有SEQ.ID.NOs.：3-13中任何一个的至少3-50个氨基酸的任一数目的连续氨基酸(例如，3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸)的片段(例如SEQ.ID.NOs.：15-26)、编码这些分子的核酸、含有所述核酸的载体，和含有所述载体、核酸或者肽的细胞是本发明的实施方案。尤其优选的实施方案是疫苗组合物或者免疫原制剂，它们含有、组成为或者组成基本上为SEQ.ID.NOs.：3-11中的至少一种HCV肽或者含有SEQ.ID.NOs.：3-13中任何一个的至少3-50个氨基酸的任一数目的连续氨基酸(例如，3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸)的片段(例如SEQ.ID.NOs.：16-26)或者编码所述肽或者片段的核酸。
另外的实施方案包括NS3/4A编码核酸或者相应肽，该核酸或者相应肽含有对最经常用于人中的密码子优化的序列。密码子优化的NS3/4A核酸序列(coNS3/4A)的核酸序列在SEQ.ID.NO.：35中提供，而所述核酸序列编码的肽在SEQ.ID.NO.：36中提供。该核酸和相应NS3/4A肽不对应于任何公知的HCV序列或基因组。发现密码子-优化的NS3/4A编码核酸在核苷酸位置3417-5475的区域内与HCV-1仅79％同源并且含有总共433个不同的核苷酸。该密码子优化的核酸序列所编码的NS3/4A肽与HCV-1仅98％同源并且含有共15个不同氨基酸。发现该密码子优化的核酸产生更高的NS3表达水平并且关于体液和细胞应答与天然NS3/4A基因相比更具免疫原性。
人HepG2细胞的瞬时转染表明当使用CMV启动子时，与wtNS3/4A基因相比，coNS3/4A基因得到的NS3水平高11倍。还表明NS4A的存在增强了Semliki Forest病毒(SFV)的表达。通过用聚合酶链式反应分离作为SpeI-BStB1片段的wtNS3/4A基因，将其插入pSFV10Enh的SpeI-BStB1位点中制备了含有野生型NS3/4A的SFV构建体，其中pSFV10Enh含有壳体的34个氨基酸长的翻译增强子序列，接着是FMDV2a切割肽。用二-辅助RNA系统将重组RNA包装到rSFV颗粒中。密码子优化和SFV复制酶介导的mRNA扩增都导致免疫原性提高，这通过更高水平的NS2-特异抗体证明。该提高的免疫原性还导致细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的更快引发。因为HCV是非-细胞裂解病毒，所以通过用表达NS3/4A的同基因肿瘤细胞体内刺激来评估经引发的CTL应答的功能性。肿瘤保护免疫性的引发需要内源产生免疫原和CD8+CTLs，但是独立于B细胞和CD4+T细胞。该模型证实了通过密码子优化和mRNA扩增可以更快地体内活化NS3/4A特异肿瘤抑制免疫。最后，注射肿瘤后6到12天后使用基因枪将coNS3/4A基因治疗接种显著减小了体内肿瘤生长。密码子优化和mRNA扩增有效增强了NS3/4A的总的免疫原性。从而，这些方法之一或者两种在基于NS3/4A的HCV基因疫苗中是优选的。
因此，本发明的方面包括组合物，其含有、组成为或者组成基本为SEQ.ID.NO.：35的序列提供的核酸序列和/或SEQ.ID.NO.：36的序列提供的肽序列。优选实施方案例如，包括含有、组成为或组成基本上为SEQ.ID.NO.：35或者其互补序列的至少12-2112个核苷酸的任一数目的连续核苷酸(例如，12-15、15-20、20-30、30-50、50-100、100-200、200-500、500-1000、1000-1500、1500-2079、或1500-2112个连续核苷酸)的组合物。优选实施方案还包括含有、组成为或组成基本上为SEQ.ID.NO.：35或者其互补序列的至少12-2112个核苷酸的任一数目的连续核苷酸(例如，SEQ.ID.NO.：35的至少3、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个连续氨基酸)。另外的实施方案包括含有、组成为或组成基本上为编码SEQ.ID.NO.：36或者其片段，即SEQ.ID.NO.：36的至少3-50个氨基酸的任一数目的连续氨基酸(例如，3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或50个连续氨基酸)的序列。其他实施方案包括含有、组成为或组成基本上为SEQ.ID.NO.：36或者其片段，即SEQ.ID.NO.：36的至少3-50个氨基酸的任一数目的连续氨基酸(例如，3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或50个连续氨基酸)的序列。
还提供了制备和使用此处提供的组合物的方法。除了制备具体化的核酸和肽的方法，其他实施方案包括制备可用于治疗和预防HCV感染的免疫原和/或疫苗组合物的方法。例如，通过将佐剂(adjuvant)与如上描述的肽或者核酸抗原(例如，HCV肽或者HCV核酸)混合，从而配制单一组合物(例如，疫苗组合物)来实施某些方法。优选方法包括将利巴韦林与本文中公开的HCV基因或者抗原混合。
使用本文描述的组合物的优选方法包括对需要针对HCV的免疫应答的动物提供足量本文中描绘的一种或多种核酸或者肽实施方案。例如，通过一种方法，鉴定了需要对HCV的免疫应答的动物(例如，处于HCV感染的危险中或者已经感染HCV的动物，如人)并且为所述动物提供一定量的NS3/4A(SEQ.ID.NO.：2或SEQ.ID.NO.：36)、突变NS3/4A(SEQ.ID.NOs.：3-13)、其片段(例如，SEQ.ID.NOs.：14-26)或者编码所述分子的核酸，该用量足够增强或者促进对肝炎病毒抗原的免疫应答。通过鉴定需要对HCV的有效免疫应答的动物并为所述动物提供组合物实施另外的方法，其中所述组合物含有包含存在于SEQ.ID.NOs.：2-27或SEQ.ID.NO.：36上的抗原或者表位的肽或者编码所述肽的核酸。尤其优选的方法包括鉴定需要对HCV的免疫应答的动物并为所述动物提供组合物，该组合物含有一定量的HCV抗原(例如，NS3/4A(SEQ.ID.NO.：2或SEQ.ID.NO.：36))、突变NS3/4A(SEQ.ID.NOs.：3-13)、含有SEQ.ID.NO.：2或SEQ.ID.NO.：36的至少3-50个氨基酸的任一数目的连续氨基酸(例如，3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或50个连续氨基酸)的片段(例如，SEQ.ID.NOs.：14-26)或者编码一种或多种这些分子的核酸，该用量足够增强或者促进针对所述抗原的免疫应答。在一些实施方案中，上面描述的组合物还含有一定量的利巴韦林，其提供辅助效果。
在还有更多实施方案中，例如，用基因枪将此处描述的HCV核酸(例如，SEQ.ID.NO.：35或者其片段，如上述)施用于需要针对HCV的免疫应答的哺乳动物受试者。在一些实施方案中，在用基因枪递送前，一定量的利巴韦林与DNA免疫原混合。在其他实施方案中，在DNA接种相同部位或附近施用利巴韦林稍前或稍后通过基因枪提供DNA免疫原。
附图简述
图1显示了第一次肌内免疫后作为时间的函数，H-2d小鼠中针对NS3的抗体效价。菱形表示用NS3/4A-pVAX免疫的小鼠中的抗体效价，正方形表示用NS3-pVAX免疫的小鼠中的抗体效价。
图2显示了NS3/4A-pVAX1(4μg)或MSLF1-pVAX1(4μg)的一次基因枪免疫赋予的体内保护。用各自质粒免疫小鼠并且14天后用表达NS3/4A的SP2/0细胞系攻击小鼠(约106个细胞/小鼠)。刺激后6天每天通过皮肤测量肿瘤大小并且将数据作图。
图3显示了NS3/4A-pVAX1(4μg)或MSLF1-pVAX1(4μg)的两次基因枪免疫赋予的体内保护。在第0周和第4周用各自质粒免疫小鼠并且，最后免疫14天后，用表达NS3/4A的SP2/0细胞系攻击小鼠(约106个细胞/小鼠)。刺激后6天每天通过皮肤测量肿瘤大小并且将数据作图。
图4显示了NS3/4A-pVAX1(4μg)或MSLF1-pVAX1(4μg)的三次基因枪免疫赋予的体内保护。在第0周、第4周和第8周用各自质粒免疫小鼠并且，最后免疫14天后，用表达NS3/4A的SP2/0细胞系攻击小鼠(约106个细胞/小鼠)。刺激后6天每天通过皮肤测量肿瘤大小并且将数据作图。
图5A显示了作为靶标与效应物比率的函数的SP2/0靶细胞的特异CTL-介导的裂解的百分数。将磷酸盐缓冲盐水(PBS)用作对照免疫原。
图5B显示了作为靶标与效应物比率的函数的SP2/0靶细胞的特异CTL-介导的裂解的百分数。将质粒NS3/4A-pVAX用作免疫原。
图6A显示了用肽包被的RMA-S细胞刺激的幼稚脾T细胞的应答。从C57/BL6小鼠得到幼稚脾T细胞。
图6B显示了用肽包被的RMA-S细胞再刺激的幼稚脾T细胞的应答。从被提供单次4μg剂量MSLF1-pVAX1的C57/BL6小鼠得到脾T细胞。
图6C显示了用肽包被的RMA-S细胞再刺激的脾T细胞的应答。从被提供单次4μg剂量NS3/4A-pVAX1的C57/BL6小鼠得到脾T细胞。
图6D显示了用肽包被的RMA-S细胞刺激的幼稚脾T细胞的应答。从C57/BL6小鼠得到幼稚脾T细胞。
图6E显示了用肽包被的RMA-S细胞再刺激的脾T细胞的应答。从被提供两个4μg剂量MSLF1-pVAX1的C57/BL6小鼠得到脾T细胞。
图6F显示了用肽包被的RMA-S细胞再刺激的脾T细胞的应答。从被提供两次4μg剂量NS3/4A-pVAX1的C57/BL6小鼠得到脾T细胞。
图6G显示了用表达NS3/4A的EL-4细胞刺激的幼稚脾T细胞的应答。从C57/BL6小鼠得到幼稚脾T细胞。
图6H显示了用表达NS3/4A的EL-4细胞再刺激的脾T细胞的应答。从被提供单次4μg剂量MSLF1-pVAX1的C57/BL6小鼠得到脾T细胞。
图6I显示了用表达NS3/4A的EL-4细胞再刺激的脾T细胞的应答。从被提供单次4μg剂量NS3/4A-pVAX1的C57/BL6小鼠得到脾T细胞。
图6J显示了用表达NS3/4A的EL-4细胞刺激的幼稚脾T细胞的应答。从C57/BL6小鼠得到幼稚脾T细胞。
图6K显示了用表达NS3/4A的EL-4细胞再刺激的脾T细胞的应答。从被提供两次4μg剂量MSLF1-pVAX1的C57/BL6小鼠得到脾T细胞。
图6L显示了用表达NS3/4A的EL-4细胞再刺激的脾T细胞的应答。从被提供两次4μg剂量NS3/4A-pVAX1的C57/BL6小鼠得到脾T细胞。
图7显示了当共同施用单剂1mg利巴韦林时，通过平均终点效价确定的对10和100μg重组丙型肝炎病毒(HCV)非结构3蛋白(NS3)的体液应答。
图8显示了当共同施用单剂0.1、1.0或10mg利巴韦林时，通过平均终点效价确定的对20μg重组丙型肝炎病毒(HCV)非结构3蛋白(NS3)的体液应答。
图9显示了通过体外回忆应答确定的单剂1mg利巴韦林对NS3-特异的淋巴结增殖应答的影响。
图10显示了在10只H-2d小鼠组中通过基因枪用4μgNS3/4A-pVAX1和coNS3/4A-pVAX1免疫或者皮下注射107个wtNS3/4A-SFV颗粒引发的平均NS3-特异抗体应答(a)。所有小鼠都在第0周和第4周免疫。以平均终点抗体效价(±SD)给出值。所示(b)为用wtNS3/4A-pVAX1肌内施用或者coNS3/4A-pVAX1肌内施用或者通过基因枪(gg)和皮下施用wtNS3/4A-SFV的5只小鼠组的IgG亚类模式。以平均终点抗体效价(±SD)给出值。“**”符号表示“p＜0.01”的统计学差异，“*”符号表示p＜0.05的差异，NS(不显著)表示无统计学差异(曼—惠特尼，Mann-Whitney)。还给出了通过将针对NS3的IgG2a抗体的平均终点效价除以针对NS3的IgG1抗体的平均终点效价所得效价比值。高比值(＞3)表示类似Th1的应答，低比值(＜0.3)表示类似Th2的应答，而1的三倍差异(0.3到3)内的值表示混合Th1/Th2应答。
图11显示了使用负荷肽的H-2Db：Ig融合蛋白对NS3/4A-特异的CD8+T细胞的前体频率的流式细胞术定量。在a)中显示了用基因枪用wtNS3-pVAX1、wtNS3/4A-pVAX1、或coNS3/4A-pVAX1两次免疫的5只小鼠的平均％NS3-特异的CD8+T细胞。“*”符号表示p＜0.05的差异，NS(不显著)表示无统计学差异(曼-惠特尼)。还显示了来自上面所列组(e、f和h)的代表性个别小鼠，以及来自用coNS3/4A-pVAX1(b)或wtNS3/4A-SFV(c)免疫一次的个别小鼠的原始数据。在(d)和(g)中，给出了来自不同实验的未经免疫的对照小鼠。在(i)和(j)中，分析前用NS3-肽再刺激脾细胞5天。共收集了150,000-200,000个数据点并且在每个点图中在圆括号中指出了对H-2Db：Ig染色的CD8+细胞的百分数。
图12显示了通过wtNS3-pVAX1、wtNS3/4A、和coNS3/4A质粒的基因枪免疫或者wtNS3/4A-SFV颗粒的皮下注射在H-2b小鼠中引发体外可检测的CTLs。5到10只一组的H-2b小鼠被免疫一次(a)或两次(b)。特异裂解百分数对应于用NS3-肽包被的RMA-S细胞((a)和(b)中的上图)或者表达NS3/4A的EL-4细胞(a和b中的下图)所得特异裂解百分数减去用未负荷的或者未转染的EL-4细胞所得裂解百分数。效应物与靶标(E∶T)细胞比率为60∶1、20∶1和7∶1。每行指出一只小鼠。
图13显示了通过基因枪免疫引发的肿瘤抑制性免疫应答的特异性(图(a))。10只C57BL/6小鼠组未经处理或者每两个月用4μgcoNS3/4A-pVAX1免疫一次。最后免疫2周后，用亲本EL-4细胞系或者106个表达NS3/4A的EL-4细胞皮下注射小鼠。在肿瘤注射后第6、7、10、11、12和14天通过皮肤测量肿瘤大小。在(b)中，在用基因枪用coNS3/4A-pVAX1质粒免疫两次的10只C57BL/6小鼠的组中确定体内功能效应细胞群体。在两组中，用表达NS3/4A的EL-4细胞系刺激之前1周或者刺激期间通过施用单克隆抗体耗竭CD4+或CD8+T细胞。在肿瘤注射后第5、6、8、11、13、14和15天通过皮肤测量肿瘤大小。值以平均肿瘤大小±标准误给出。“**”符号表示“p＜0.01”的统计学差异，“*”符号表示p＜0.05的差异，NS(不显著)表示无统计学差异(通过ANOVA比较曲线下面积)。
图14显示了对单次免疫后不同免疫原引发HCV NS3/4A-特异的肿瘤抑制应答的能力的评价。10只C57BL/6小鼠组未经处理或者用所指出的免疫原免疫(在(a)、(b)、(c)、(g)、和(h)中用基因枪施用4μg DNA；在(d)中皮下施用107个SFV颗粒；在(e)中皮下施用CFA中的100μg肽；在(f)中皮下施用20μg rNS3)。最后免疫2周后，用106个表达NS3/4A的EL-4细胞皮下注射小鼠。肿瘤注射后在第6到19天通过皮肤测量肿瘤大小。以平均肿瘤大小±标准误给出值。在(a)到(e)中，在每个图中描绘了来自通过基因枪用空pVAX质粒免疫的组的平均数据作为阴性对照。在(f)到(h)中阴性对照为未免疫的小鼠。还给出了从使用曲线下面积和ANOVA将对照与每条曲线的统计学比较得到的p值。
图15显示了基因枪递送的wtNS3/4A-pVAX1和coNS3/4A-pVAX1质粒在引发肿瘤抑制性免疫应答中的比较效率。10只BALB/c小鼠组未经处理或者用4μg质粒每月、每两个月或三个月免疫一次。最后免疫后两周，用106个表达NS3/4A的SP2/0细胞皮下注射小鼠。在肿瘤注射后第6、8、10、11、12、13、和14天通过皮肤测量肿瘤大小。值以平均肿瘤大小±标准误给出。“**”符号表示“p＜0.01”的统计学差异，“*”符号表示p＜0.05的差异，NS(不显著)表示无统计学差异(通过ANOVA比较的曲线下面积值)。
图16显示了用基因枪以coNS3/4A质粒治疗接种的效果。用106个NS3/4A-EL4细胞接种10只C57BL/6小鼠组。一组在刺激前2周已经用基因枪用4μg coNS3/4ADNA免疫(阳性对照)，一组在肿瘤接种后6天用以相同的方式免疫，一组在肿瘤接种后12天免疫。一组未经免疫(阴性对照)。在肿瘤注射后第6、10、11、12、13、14、18、19、和20天通过皮肤测量肿瘤大小。值以平均肿瘤大小±标准误给出。“**”符号表示“p＜0.01”的统计学差异，“*”符号表示p＜0.05的差异，NS(不显著)表示无统计学差异(通过ANOVA比较的曲线下面积值)。
发明详述
从感染HCV的患者克隆了对应于HCV的NS3/4A结构域的一种新的核酸和蛋白质(SEQ.ID.NO.：1)。Genebank检索揭示所克隆的序列与HCV序列具有最大的同源性但是与最接近的HCV相关序列(登记号AJ278830)仅有93％同源性。该新的肽(SEQ.ID.NO.：2)和其至少3-50中的任一数目的连续氨基酸(例如，长为3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸)的片段(例如，SEQ.ID.NOs.：14和15)、编码这些分子的核酸、含有所述核酸的载体，和具有所述载体、核酸或者肽的细胞是本发明的实施方案。还发现NS3/4A基因(SEQ.ID.NO.：1)和相应肽(SEQ.ID.NO.：2)在体内都是免疫原性的。
产生了新的NS3/4A肽的突变体。发现截短的突变体(例如，SEQ.ID.NOs.：12和13)和缺少蛋白水解切割位点的突变体(SEQ.ID.NOs.：3-11)在体内也是免疫原性的。这些新肽(SEQ.ID.NOs.：3-13)和其至少3-50的任一数目的连续氨基酸(例如，长为3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸)的片段(例如，SEQ.ID.NOs.：16-26)、编码这些分子的核酸、具有所述核酸的载体，和具有所述载体、核酸或者肽的细胞也是本发明的实施方案。
还产生了编码NS3/4a的密码子优化的核酸并且发现其也是免疫原性的。对SEQ.ID.NO.：1的核酸分析了密码子用法并将该序列与最常用于人细胞中的密码子比较。因为HCV是人病原，所以出乎意料地发现该病毒还没有进化到使用最经常发现编码人蛋白的密码子(例如，优选的人密码子)。对总共435个核苷酸置换以产生密码子-优化的合成NS3/4A核酸。该密码子-优化的核酸序列(SEQ.ID.NO.：36)所编码的NS3/4A肽与HCV-1具有98％同源性并且含有共15个不同的氨基酸。
发现密码子优化的核酸(MSLF1或coNS3/4A)(SEQ.ID.NO.：35)在体外比天然NS3/4A更有效地翻译并且用含有MSLF1的构建体免疫的小鼠比用含有野生型NS3/4A的构建体免疫的小鼠产生明显更多的NS3/4A特异抗体。此外，发现用含有MSLF1的构建体免疫的小鼠比用含有野生型NS3/4A的构建体免疫的小鼠更有效地引发NS3-特异的CTLs并且显示出更好的体内肿瘤抑制免疫应答。
上面描述的肽和核酸可用作免疫原，其可以单独或者与佐剂联合施用。优选实施方案包括含有一种或多种上述核酸和/或肽与或没有佐剂的组合物。即，用或者不用佐剂制备此处描述的一些组合物并且这些组合物含有、组成为或者组成基本上为NS3/4A肽(SEQ.ID.NO.：2或SEQ.ID.NO.：36)或者其至少3-50之间的任一数目的连续氨基酸(例如长为3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸)的片段(例如，SEQ.ID.NOs.：14和15)或者编码这些分子的一种或者几种的核酸(例如，SEQ.ID.NO.：35或者其片段，该片段为至少12-2112之间的任一数目的连续核苷酸(例如，长12-15、15-20、20-30、30-50、50-100、100-200、200-500、500-1000、1000-1500、1500-2079、或1500-2112个连续核苷酸)。用或者不用佐剂制备其他组合物并且该组合物含有、组成为或者组成基本上为一种或多种NS3/4A突变肽(SEQ.ID.NOs.：3-13)和其至少3-50之间的任一数目的连续氨基酸(例如长为3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸)的片段。
还发现含有利巴韦林和抗原(例如，一种或多种前面描述的HCV肽或核酸)增强和/或促进动物对该抗原的免疫应答。即，发现利巴韦林是一种非常有效的“佐剂”，为了本公开的目的，佐剂指能够增强或者促进对特定抗原的免疫应答的物质。通过针对所述抗原的免疫介导的保护、针对该抗原产生的抗体的效价，和增殖性T细胞应答的增加来表明利巴韦林的佐剂活性。
因此，含有利巴韦林和一种或多种文中描述的肽或核酸的组合物(例如，疫苗和其他药物)是本发明的实施方案。这些组合物可根据利巴韦林的量、利巴韦林的形式，以及HCV核酸或肽的序列而变。
本发明的实施方案还包括制备和使用上面的组合物的方法。一些方法包括制备编码NS3/4A、密码子优化的NS3/4A、突变NS3/4A的核酸、其至少9-100之间的任一数目的连续核苷酸(例如，长为9、12、15、18、21、24、27、30、50、60、75、80、90、或100个连续核苷酸)、对应于所述核酸的肽、含有所述核酸的构建体，和含有所述组合物的细胞的方法。然而，优选的方法涉及制备疫苗组合物或者免疫原性制剂的方法，该疫苗组合物或者免疫原性制剂含有、组成为或者组成基本上为新近发现的NS3/4A片段、密码子-优化的NS3/4A、或者NS3/4A突变体(例如，截短突变体或者缺少蛋白水解切割切点的突变体)，或者其片段或者编码如上述的这些分子的一种或多种的核酸。用文中描述的方法使用的优选片段包括SEQ.ID.NOs.：12-27和SEQ.ID.NO.：35的含有至少30个连续核苷酸的片段。可通过提供佐剂(例如，利巴韦林)、提供HCV抗原(例如，含有HCV抗原的肽，如((SEQ.ID.NOs.：2-11或36)或其片段如SEQ.ID.NOs.：12-26或者编码一种或多种所述肽的核酸)、并将所述佐剂与所述抗原混合以便配制上述组合物，该组合物可用于增强或者促进受试者中对所述抗原的免疫应答。
还提供了增强或者促进动物(包括人)中对抗原的免疫应答的方法。例如，通过鉴定需要对HCV的免疫应答的动物并对所述动物提供含有上面的一种或多种核酸或者肽和一定量的佐剂的组合物，该用量有效增强或者促进针对该抗原/表位的免疫应答，可以实施这些方法。在一些实施方案中，抗原和佐剂单独地而不是在单一混合物中施用。优选地，在该情况下，佐剂在施用抗原短时间前或者短时间后施用。优选方法包括为该需要的动物提供利巴韦林和NS3/4A(例如，SEQ.ID.NO.：2)、密码子优化的NS3/4A(例如，SEQ.ID.NO.：36)、突变NS3/4A(例如SEQ.ID.NOs.：3-13)、这些分子的含有至少3-50的任一数目的连续氨基酸(例如，长为3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸)或者编码任何一种或多种所述分子的核酸。
其他实施方案涉及治疗和预防HCV感染的方法。通过一种方法，用含有此处描述的一种或多种HCV核酸或肽的免疫原制备用于治疗和/或预防HCV感染的药物。通过另一种方法，鉴定了需要预防和/或治疗HCV感染的药物的个体并且为所述个体提供药物，该药物含有利巴韦林和HCV抗原，如NS3/4A(例如，SEQ.ID.NO.：2)、密码子优化的NS3/4A(例如，SEQ.ID.NO.：36)、突变NS3/4A(例如SEQ.ID.NOs.：3-13)、这些分子的含有至少3-50的任一数目的连续氨基酸(例如，长为3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸)或者编码任何一种或多种所述分子的核酸。
下面的章节讨论新NS3/4A基因的发现、密码子优化的NS3/4A基因、NS3/4A突变体的产生，和所述核酸和其相应肽的表征。
NS3/4A、NS3/4A突变体，和密码子优化的NS3/4A
从感染HCV的患者克隆了对应于HCV的NS3/4A结构域的新的核酸和蛋白质(SEQ.ID.NOs.：1和2)。Genebank检索揭示所克隆的序列与HCV序列具有最大的同源性但是与最接近的HCV相关序列(登记号AJ278830)仅有93％同源性。还产生了该新的NS3/4A肽的截短突变体和缺少蛋白水解切割位点的NS3/4A突变体(以及相应核酸)。此外，产生了人密码子优化的NS3/4A核酸和肽。发现这些新的肽和编码所述肽的核酸是强免疫原，其可以与佐剂混合从而制备组合物，该组合物诱导接受者以提供针对HCV的免疫应答。在下面的实施例中描述了新的NS3/4A基因的克隆和多种NS3/4A突变体的产生和密码子优化的NS3/4A基因。
                      实施例1
使用聚合酶链式反应(PCR)从HCV-感染患者(HCV基因型1a)的血清扩增NS3/4A序列。根据标准方案(Chen M等，J.Med.Virol.43：223-226(1995))从血清提取总RNA、实施cDNA合成和PCR。用反义引物“NS4KR”(5′-CCG TCT AGA TCA GCA CTC TTC CAT TTC ATC-3′(SEQ.ID.NO.：28))启动cDNA合成。从该cDNA扩增HCV的2079个碱基对DNA片段，其对应于氨基酸1007到1711，包含NS3和NS4A基因。将高保真性聚合酶(Expand High Fidelity PCR，Boehringer-Mannheim，Mannheim，德国)与“NS3KF”引物(5′-CCT GAA TTC ATG GCG CCT ATC ACG GCC TAT-3′(SEQ.ID.NO.：29)和NS4KR引物一起使用。NS3K引物含有EcoRI限制酶切割位点和起始密码子并且引物NS4KR含有XbaI限制酶切割位点和终止密码子。
然后对扩增的片段测序(SEQ.ID.NO.：1)。序列比较分析揭示从基因型1a的病毒株扩增了该基因片段。用NCBI网址对Genbank数据库进行计算机BLAST检索揭示最接近的HCV同源物在核苷酸序列中具有93％同一性。
然后将所扩增的DNA片段用EcoRI和XbaI消化，并插入到用相同酶消化的pcDNA3.1/His质粒(Invitrogen)。然后用EcoRI和XbaI消化NS3/4A-pcDNA3.1质粒并用QiaQuick试剂盒(Qiagen，Hamburg，德国)纯化插入片段，并将该插入片段连接到EcoRI/XbaI消化的pVAX载体(Invitrogen)中以便产生NS3/4A-pVAX质粒。
通过从NS3/4A DNA缺失NS4A序列得到rNS3截短突变体。因此，用分别含有EcoRI和NotI限制位点的引物NS3KF和3′NotI(5′-CCA CGCGGC CGC GAC GAC CTA CAG-3′(SEQ.ID.NO.：30))PCR扩增NS3/4A-pVAX的NS3基因序列。然后将NS3片段(1850bp)连接到EcoRI和NotI消化的pVAX质粒以产生NS3-pVAX载体。质粒生长在BL21大肠杆菌(E.coli)细胞中。对质粒测序并通过限制酶切割验证并且结果正如基于原始序列所预期的。
表1描述了NS3/4A的蛋白质水解切割位点的序列，该切割位点称作NS3和SN4A之间的断点。以多种不同的方法突变该野生型断点序列以产生几种不同的NS3/4A断点突变体。表1还鉴定了这些突变体断点序列。表1中所列片段是优选的免疫原，其可以与或不与佐剂(例如，利巴韦林)掺入组合物中以施用于动物从而在所述动物中诱导对HCV的免疫应答。
                             表1
质粒                  所推导的氨基酸序列
*NS3/4A-pVAX          TKYMTCMSADLEVV TSTWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：14)
NS3/4A-TGT-pVAX       TKYMTCMSADLEVV TGTWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：16)
NS3/4A-RGT-pVAX       TKYMTCMSADLEVV RGTWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：17)
NS3/4A-TPT-pVAX       TKYMTCMSADLEVV TPTWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：18)
NS3/4A-RPT-pVAX       TKYMTCMSADLEVV RPTWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：19)
NS3/4A-RPA-pVAX       TKYMTCMSADLEVV RPAWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：20)
NS3/4A-CST-pVAX       TKYMTCMSADLEVV CSTWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：21)
NS3/4A-CCST-pVAX      TKYMTCMSADLEVC CSTWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：22)
NS3/4A-SSST-pVAX      TKYMTCMSADLEVS SSTWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：23)
NS3/4A-SSSSCST-pVAX   TKYMTCMSADSSSS CSTWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：24)
NS3A/4A-VVVVTST-pVAX  TKYMTCMSADVVVV TSTWVLVGGVL   (SEQ.ID.NO.：25)
NS5-pVAX              ASEDWC CSMSYTWTG             (SEQ.ID.NO.：27)
NS5A/B-pVAX           SSEDWC CSMWVLVGGVL           (SEQ.ID.NO.：26)
*NS3/4A片段的野生型序列是NS3/4A-pVAX。NS3/4A断点通过下划线标识，其中P1位对应于第一个Thr(T)，P1’位对应于NS3/4A-pVAX序列的下一个氨基酸。在野生型NS3/4A序列中，NS3蛋白酶在P1和P1’位之间切割。
为了改变NS3和NS4A之间的蛋白质水解切割位点，用QUICKCHANGETM诱变试剂盒(Stratagene)按照生产商的推荐诱变NS3/4A-pVAX质粒。例如，为了产生“TPT”突变，使用引物5′-CTGGAGGTCGTCACGCCTACCTGGGTGCTCGTT-3′(SEQ.ID.NO.：31)和5′-ACCGAGCACCCAGGTAGGCGTGACGACCTCCAG-3′(SEQ.ID.NO.：32)扩增质粒，得到NS3/4A-TPT-pVAX。例如，为了产生“RGT”突变，使用引物5′-CTGGAGGTCGTCCGCGGTACCTGGGTGCTCGTT-3′(SEQ.ID.NO.：33)和5′-ACCGAGCACCCAGGTACC-GCGGACGACCTCCAG-3′(SEQ.ID.NO.：34)扩增该质粒，得到NS3/4A-RGT-pVAX。对所有诱变的构建体测序以验证已经做出了正确的突变。质粒在感受态BL21大肠杆菌中生长。
关于人细胞中最通常使用的密码子对前面分离的序列和序列独特的NS3/4A基因(SEQ.ID.NO.：1)分析了密码子用法。共置换了435个核苷酸以优化人细胞的密码子用法。将该序列送到Retrogen Inc(6645 NancyRidge Drive，San Diego，CA 92121)并且为那里的工作人员提供关于产生全长合成的密码子优化的NS3/4A基因的指示。该密码子优化的NS3/4A基因在HCV-1参比株的核苷酸位置3417-5475之间的区域具有79％的序列同源性。共有433个核苷酸不同。在氨基酸水平上，与HCV-1株的同源性为98％并且共有15个氨基酸不同。
通过聚合酶链式反应(PCR)使用高保真性聚合酶(Expand High FidelityPCR，Boehringer-Mannheim，Mannheim，德国)扩增了HCV的全长密码子优化的2.1kb DNA片段，其对应于氨基酸1007到1711，包括NS3和NS4ANS3/NS4A基因片段。然后将该扩增子插入BamHI和XbaI消化的pVAX载体(Invitrogen，San Diego)，其产生MSLF1-pVAX(coNS3/4A-pVAX)质粒。对所有表达构建体测序。质粒在感受态BL21大肠杆菌中生长。用QiagenDNA纯化柱，根据生产商的使用说明(Qiagen GmbH，Hilden，FRG)纯化用于体内注射的质粒DNA。通过分光光度法(Dynaquant，Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)确定所得质粒DNA的浓度并将所纯化的DNA溶于浓度为1mg/ml的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
通过体外转录和翻译测定法分析了来自wtNS3/4A(野生型NS3/4A)和coNS3/4A质粒的NS3和NS3/4A蛋白质的表达。该测定法表明从所述质粒可以正确翻译该蛋白并且与wtNS3/4A质粒相比coNS3/4A质粒在更高的质粒稀释下给出可以检测的NS3和NS3/4A带。该结果提供了有力证据证明coNS3/4A质粒的体外翻译比wtNS3/4A更有效。为了更精确地比较水平，用wtNS3/4A和coNS3/4A质粒瞬时转染HepG2细胞。这些实验揭示当与wtNS3/4A质粒比较时，coNS3/4A产生了高11倍的NS3蛋白质表达水平，该表达水平通过光密度测定法和重组NS3的标准曲线确定。因为wtNS3/4A和coNS3/4A质粒大小相同，所以不大可能在质粒的转染效率之间存在任何主要差异。对coNS3/4A质粒转染并且SFV感染的BHK细胞的染色揭示如前面观察到的相似的核周核胞质分布，证明亚细胞定位没有改变。
一些核酸实施方案包括编码文中描述的HCV肽的核苷酸(SEQ.ID.NOs.：2-11或SEQ.ID.NO.：36)或者其含有至少3-50之间的任一数目的连续氨基酸(例如，长3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸)的片段(例如，SEQ.ID.NOs.：14和15)。某些实施方案例如，包括编码这些HCV肽的基因组DNA、RNA、和cDNA。HCV核苷酸实施方案不仅包括序列表中所示的DNA序列(例如，SEQ.ID.NO.：1或SEQ.ID.NO.：35)，而且包括编码序列表中所示的氨基酸序列的核苷酸序列(例如，SEQ.ID.NOs.：2-11或SEQ.ID.NO.：36)和在严格条件(例如，在0.5M NaHPO4，7.0％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中50℃下与滤器-结合的DNA杂交并在0.2X SSC/0.2％SDS中50℃下洗涤)下与序列表中所示的DNA序列杂交的任何核苷酸序列和在稍不严格的条件(例如，在0.5M NaHPO4，7.0％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中37℃下杂交并在0.2X SSC/0.2％SDS中37℃下洗涤)下与序列表中所示的DNA序列杂交的任何核苷酸序列。
本发明的核酸实施方案还包括上述序列的片段、修饰序列、衍生物和变体。所希望的实施方案，例如，包括所述新HCV序列或者其互补序列之一的至少25个连续碱基的核酸并且优选片段包括编码SEQ.ID.NO.：2或SEQ.ID.NO.：36的NS3/4A分子或者SEQ.ID.NOs.：3-13的突变NS3/4A分子的核苷酸或者其互补序列的至少25个连续碱基。
在这点上，文中描述的核酸实施方案可以具有SEQ.ID.NO.：1或SEQ.ID.NO.：35的约12到约2112个连续核苷酸中的任一数目的连续核苷酸。一些DNA片段，例如，包括具有SEQ.ID.NO.：1或SEQ.ID.NO.：35的至少12-15、15-20、20-30、30-50、50-100、100-200、200-500、500-1000、1000-1500、1500-2079、或1500-2112个连续核苷酸的核酸或者其互补序列。还可以通过置换、加入或者缺失改变这些核苷酸实施方案，只要所述改变不显著影响HCV核酸的结构或功能(例如，作为免疫原的能力)。由于核苷酸编码序列的简并性，例如，在某些实施方案中可以使用编码与SEQ.ID.NOs.：2-13或SEQ.ID.NO.：36中描绘的基本相同的HCV氨基酸序列的其他DNA序列。这些DNA序列包括，但不限于，编码所有或者部分HCV肽(SEQ.ID.NOs.：2-13)的核酸序列或者与该序列的所有或者部分互补的核酸，这些核酸已经通过用不同的密码子置换而改变，所述密码子编码该序列内的功能等价氨基酸残基，从而产生沉默变化，或者所述密码子编码该序列内功能上不等价的氨基酸残基，从而产生可检测的变化。因此，关于上面的修饰，本发明的核酸实施方案包括、组成为，或者组成基本上为编码SEQ.ID.NOs.：2-27或SEQ.ID.NO.：36的任一个的核酸。
通过使用上面描述的核酸序列，可以设计并通过寡核苷酸合成生产与这些分子互补的探针。所希望的探针包含SEQ.ID.NO.：1的核酸序列，其是该HCV分离物特有的。这些探针可用于筛选来自患者的cDNA从而分离HCV的天然来源，这些天然来源的某些可能自身就是新的HCV序列。筛选例如可以通过滤膜杂交或者通过PCR。通过滤膜杂交，经标记的探针优选含有(SEQ.ID.NO.：1)的核酸序列的至少15-30个碱基对，(SEQ.ID.NO.：1)是该NS3/4A肽所特有的。所用的杂交洗涤条件优选为中度严格到高度严格。杂交可以在0.5M NaHPO4，7.0％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mMEDTA，42℃下过夜进行，洗涤可以在0.2X SSC/0.2％SDS中42℃下进行。关于对这些条件的指导，见，例如，Sambrook等，1989， Molecular Cloning， A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press，N.Y.；和Ausubel等，1989，CurreNT Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y。
使用此处描述的核酸，也可以从感染HCV的患者分离HCV核酸(也见实施例1)。因此，从感染HCV的患者得到的RNA经反转录并使用PCR或者另一种扩增技术扩增所得cDNA。引物优选从NS3/4A序列(SEQ.ID.NO.：1)得到。
关于PCR技术综述，见Molecular Cloning to Genetic Engineering White，B.A.编者 Methods in Molecular Biolog 67：Humana Press Totowa(1997)和题为“PCR方法和应用”的出版物(1991，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。对于mRNA的扩增，本发明的范围包括将mRNA反转录成cDNA，然后实施PCR(RT-PCR)；或者对于两步使用一种酶，如美国专利号5,322,770中描述。另一种技术包括使用如Marshall R.L.等，(PCR方法和应用4：80-84，1994)所描述的逆转录酶不对称缺口连接酶链式反应(RT-AGLCR)。
简言之，按照标准方法分离RNA。对该RNA实施逆转录反应，使用对所扩增的片段的最5’末端特异的寡核苷酸引物作为第一条链合成的引物。然后用标准末端转移酶反应用鸟嘌呤对所得RNA/DNA杂交体“加尾(tailed)”。然后用RNA酶H消化该杂交分子，用poly-C引物引发第二条链合成。从而，容易分离所扩增片段上游的cDNA序列。关于可以使用的克隆策略的综述，见例如，Sambrook等，1989，如前。
在这些扩增步骤的每一步中，将所要扩增的序列的每一边上的引物加入适当制备的核酸样品以及dNTPs和热稳定的聚合酶，如Taq聚合酶、Pfu聚合酶或者Vent聚合酶中。使样品中的核酸变性并且引物特异杂交样品中的互补核酸序列。然后所杂交的引物延伸。此后，启动另一轮变性、杂交，和延伸。该循环重复多次以产生含有引物位点之间的核酸序列的扩增片段。PCR已经在一些专利中进一步描述，这些专利包括美国专利4,683,195、4,683,202和4,965,188。
选择引物以与该NS3/4A分子独特的(SEQ.ID.NO.：1)的核酸序列的一部分互补，从而允许引物之间的序列被扩增。优选地，引物可以是长为至少16-20、20-25、或25-30个核苷酸之间的任一数目。稳定杂交体形成取决于DNA的解链温度(Tm)。Tm取决于引物长度、溶液的离子强度和G+C含量。引物的G+C含量越高，解链温度越高，因为G:C对由三个氢键固定，而A:T对仅有两个氢键。文中描述的扩增引物的G+C含量优选为10％到75％，更优选35％到60％，最优选40％到55％。本领域技术人员通过经验可以确定特定组的测定条件下引物的适宜长度。
引物的间距与所要扩增的片段的长度有关。在此处描述的实施方案的背景中，携带编码HCV肽的核酸序列的扩增片段大小可以为至少约25bp到HCV基因组的完整长度。扩增片段通常为25-1000bp，优选50-1000bp的片段，高度优选100-600bp的片段。应当理解扩增引物可以是允许NS3/4A区域的特异扩增的任一序列并且可以，例如，包括修饰(如限制位点)以方便克隆。
可以对PCR产物亚克隆并测序以确保所扩增的序列代表HCV肽的序列。然后通过多种方法可以用该PCR片段分离全长cDNA克隆。例如，可以标记扩增片段并将其用于筛选cDNA文库，如噬菌体cDNA文库。备选地，通过筛选基因组文库，可以将经标记的片段用于分离基因组克隆。此外，利用从例如，分离自感染患者的RNA合成的cDNA可以构建表达文库。这样，使用标准抗体筛选技术联合针对HCV基因产物产生的抗体可以分离HCV基因产物(关于筛选技术，见，例如，Harlow，E.和Lane，编者，1988， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor)。
本发明的实施方案还包括(a)DNA载体，其含有前面的核酸序列和/或它们的互补序列(即，反义)的任一种；(b)DNA表达载体，其含有与指导该核酸表达的调节元件有效结合的任一种前面的核酸序列；和(c)基因工程化宿主细胞，其含有与调节元件有效结合的任一种前面的核酸序列，该调节元件指导编码序列在宿主细胞中的表达。这些重组构建体能够在宿主细胞中自主复制。备选地，重组构建体可以整合到宿主细胞的染色体DNA中。这种重组多核苷酸通常含有由于人为操作的半合成或者合成来源的HCV基因组或者cDNA多核苷酸。因此，提供了含有这些序列和其互补序列的重组核酸，所述序列不是天然存在的。
尽管可以使用编码HCV肽的核酸或者具有与HCV基因互补的序列的核酸，如在自然中出现的这些核酸，但是这些核酸将通常例如通过缺失、置换或者插入而被改变，并且可以伴随着不存在于人中的序列。本文中，调节元件包括，但不限于，诱导型和非诱导型启动子、增强子、操纵基因和本领域中技术人员公知的其他元件，这些元件驱动并调节表达。这些调节元件包括，但不限于，巨细胞病毒hCMV立即早期基因、SV40腺病毒的早期或晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、噬菌体A的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子，和酵母接合因子的启动子。
此外，可以将重组HCV肽-编码核酸序列和它们的互补序列改造以修饰它们的加工或者表达。例如，并且不作为限制，此处描述的HCV核酸可以与启动子序列和/或核糖体结合部位组合，或者可以将信号序列插入HCV肽-编码序列的上游，从而允许分泌该肽并从而方便收获或生物利用度。此外，可以在体外或者体内突变给定的HCV核酸，以产生和/或破坏翻译、启动，和/或终止序列，或者在编码区产生变异和/或形成新的限制位点或者破坏现有的限制位点，或者促进进一步体外修饰。(见实施例1)。可以使用本领域中公知的用于诱变的任一技术，包括但不限于，体外定点诱变(Hutchinson等，J.Biol.Chem.，253：6551(1978))。使用分子生物学中常规技术可以操作上述编码HCV肽的核酸以便产生表达HCV肽的重组构建体。
此外，编码其他蛋白质或者其他蛋白质的结构域的核酸可以与编码HCV肽的核酸连接从而产生融合蛋白。编码融合蛋白的核苷酸可以包括，但不限于，全长NS3/4A序列(SEQ.ID.NO.：2或SEQ.ID.NO.：36)、突变NS3/4A序列(例如，SEQ.ID.NOs.：3-11)或者融合到不相关的蛋白质或者肽的NS3/4A序列的肽片段，所述不相关蛋白质或肽为例如，聚组氨酸、血凝素、酶、荧光蛋白、或者发光蛋白，如下面讨论。
发现构建体“NS3/4A-pVAX”在体内比构建体“NS3-pVAX”显著更具免疫原性。令人惊奇地，还发现含有密码子优化的NA3/4A的构建体(“MSLF1-pVAX”)在体内比NS3/4A pVAX更具免疫原性。下面的实施例描述了这些实验。
                        实施例2
为了确定体液免疫应答是否由NS3-pVAX和NS3/4A-pVAX载体引起用Qiagen DNA纯化系统，根据生产商的使用说明纯化实施例1中描述的表达构建体并将纯化的DNA载体用于免疫4到10只Balb/c小鼠组。如以前描述的(Davis等，Human Gene Therapy 4(6)：733(1993))将质粒直接注射到再生的胫骨前(TA)肌。简言之，用溶于0.9％无菌NaCl中的50μl/TA0.01mM心脏毒素(Latoxan，Rosans，法国)肌内注射小鼠。5天后，用含有rNS或者DNA的50μl PBS注射每个TA肌。
从Mllegard丹麦，Charles River Uppsala，瑞典，或者B&K Sollentuna瑞典的饲养设施得到自交小鼠系C57/BL6(H-2b)、Balb/C(H-2d)、和CBA(H-2k)。所有小鼠都是雌性的并且在4-8周龄时使用。为了监视体液应答，所有小鼠都在每个第四周接受50μl/TA的质粒DNA强化注射。此外对某些小鼠施用重组NS3(rNS3)蛋白质，该蛋白质是纯化的，如文中所描述。对接受rNS3的小鼠免疫不超过两次。所有小鼠都每月抽血两次。
用酶免疫吸附测定法(EIAs)检测鼠NS3-特异抗体的存在。这些测定法基本上如所描述的实施(Chen等，Hepatology 28(1)：219(1998))。简言之，将溶于50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)的1μg/ml rNS3在4℃过夜被动吸附到96孔微量滴定板(Nunc，Copenhagen，丹麦)。通过将板与含有PBS、2％山羊血清和1％牛血清白蛋白的稀释缓冲液在37℃温育1小时使板封闭。然后将以1∶60开始的小鼠血清的连续稀释液在所述板上温育1小时。通过偶联碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG(Sigma Cell Products，SaintLouis，MO)，然后加入底物pNPP(1片/5ml 1M二乙醇胺缓冲液与0.5mMMgCl2)检测结合的鼠血清抗体。通过加入1M NaOH终止反应并在405nm处读吸光度。
4周后，用NS3/4A-pVAX免疫4/5的小鼠产生了NS3抗体，而用NS3-pVAX免疫的1/5的小鼠产生了抗体(图1)。6周后，NS3/4A-pVAX免疫的4/5的小鼠产生了高水平(＞104)NS3抗体(平均水平10800±4830)并且一只小鼠的效价为2160。尽管用NS3-pVAX免疫的所有小鼠都产生了NS3抗体，但是没有一只产生的水平与NS3/4A-pVAX构建体产生的水平一样高(平均水平1800±805)。NS3/4A融合构建体引起的抗体水平比NS3-pVAX在六周诱导的水平显著更高(平均秩7.6对3.4，p＜0.05，曼-惠特尼秩和检验，p＜0.01，Students t-检验)。从而，用NS3-pVAX或NS3/4A-pVAX免疫都导致产生NS3-特异的抗体，但是含有NS3/4A的构建体是更有效的免疫原。
进行类似实验以比较NS3/4A-pVAX和MSLF1-pVAX构建体的免疫原性。然而，为了更好地类似人中的接种方案，用基因枪将质粒递送到10只小鼠组。简言之，根据生产商(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)提供的方案将质粒DNA连接到金颗粒。免疫前，剃光注射部位并根据生产商的方案实施免疫。每次注射剂量含有4μg质粒DNA。在第0、4和8周实施免疫。
发现MSLF1基因比天然NS3/4A基因更具免疫原性，因为在第二次和第三次免疫后2周用MSLF1-pVAX构建体免疫的小鼠中NS3-特异抗体显著更高(表2)。这些结果证实密码子优化的MSLF1-pVAX是比NS3/4A-pVAX更有效的B细胞免疫原。
                              表2
  免疫原   周   注射次数   平均NS3效价   SD   曼—惠特尼
  NS3/4A   2   1   0   0   NS
  MSLF1   2   1   0   0
  NS3/4A   6   2   0   0   p＜0.0002
  MSLF1   6   2   2484   3800
  NS3/4A   10   3   60   0   p＜0.0001
  MSLF1   10   3   4140   4682
下面的实施例提供了更多证据证明MSLF-1(coNS3/4a产生强烈免疫应答。
                       实施例2A
为了检验三种不同的NS3基因的内在免疫原性，将BALB/c(H-2d)小鼠组用下面的载体免疫：wtNS3/4A(野生型NS3/4a)、coNS3/4A(密码子优化的NS3/4a或MSLF-1)、或wtNS3/4A-SFV(野生型NS3/4A，从SFV表达得到)。用基因枪施用4μg DNA剂量并皮下(s.c)注射107SFV颗粒剂量。4周后强化小鼠。用wtNS3/4A-SFV免疫的小鼠在第一次注射后已经产生了抗体，表明wtNS3/4A-SFV具有有效免疫原性(图10)。第二次免疫后2周，用coNS3/4A或wtNS3/4A-SFV载体免疫的小鼠已经产生了平均抗体水平大于103(图10)。相比，用wtNS3/4A质粒免疫的小鼠在6周时没有一只产生可以检测的NS3-特异抗体(图10)。从而，密码子优化和通过SFV的mRNA扩增都导致NS3/4A基因的增加的B细胞免疫原性。
为了间接比较wtNS3/4A、coNS314A、和wtNS3/4A-SFV免疫引发的T细胞应答的T辅助细胞1(Th1)和Th2偏斜，分析了NS3-特异的IgG1(Th2)和IgG2a(Th1)抗体的水平(图10)。不管鼠单元型如何，用rNS3与或不与佐剂免疫的小鼠中IgG2a/IgG1的比值总是＜1，表明这是Th2-占优势的应答。相反，用含有wtNS3(野生型NS3)、wtNS3/4A、或coNS3/4A的质粒免疫的小鼠具有Th1-偏斜的Th-细胞应答，这通过IgG2a/IgG1比值＞1来证明(图10)。从而，密码子优化不改变IgG亚类分布。当用基因枪用NS3/4A基因免疫BALB/c小鼠时，亚类比表明是混合的Th1/Th2应答(图10)。应该指出与天然质粒相比，密码子优化的质粒不显示出B细胞体外刺激能力增加，表明没有丧失或者导入主要免疫刺激基序。
用SFV免疫引起了Th1-或者类似混合的Th1/Th2同种型分布。wtNS3/4A-SFV免疫后，抗-NS3IgG2a/IgG1-比值在不同实验之间为2.4到20，证明类似Th1的应答。这与使用SFV载体的前面的经验相似，在该前面的实验中观察到Th1-偏斜的IgG亚类分布。
下面的实施例描述了为了确定突变NS3/4A肽而实施的实验，该突变NS3/4A肽缺少蛋白质水解切割位点，可以引起对NS3的免疫应答。
                       实施例3
为了检验NS3/4A的增强的免疫原性可以仅归因于NS4A的存在，或者是否必须在SN3/4A接头切割NS3/4A融合蛋白，实施了另一组实验。在第一个实验中，在Balb/c小鼠中比较了NS3-pVAX、NS3/4A-pVAX、和突变NS3/4A构建体的免疫原性。如上描述的在周0免疫小鼠，2周后，从所有小鼠取血并在1∶60的血清稀释液下确定针对NS3的抗体的存在(表3)。在第4周对小鼠再次取血。如表3中所示，所有构建体都诱导了免疫应答；突变构建体，例如，NS3/4A-TGT-pVAX载体与NS3-pVAX载体相当(4/10对0/10；NS，Fisher精确检验)。然而，NS3/4A-pVAX载体比突变构建体更有效。
                          表3
  第一次免疫后的周数   一次100μg肌内免疫后对各自免疫原的抗体应答者编号
  NS3-pVAX   野生型NS3/4A-pVAX   突变实例NS3/4A-TGT-pVAX
  2   0/10   17/20   4/10
  4   0/10(＜60)   20/20(2415±3715)55％＞10310％＞104   10/10(390±639)50％＞10210％＞103
在感染的慢性期期间，HCV在肝细胞中复制，并在肝脏内扩散。抗击慢性和持久性病毒感染的一种主要因子是细胞-介导的免疫防御系统。CD4+和CD8+淋巴细胞在HCV感染的慢性期期间渗入肝脏，但是它们不能够清除病毒或者防止肝脏损伤。此外，持久性HCV感染与肝细胞癌(HCC)的发作有关。下面的实例描述了所实施的实验，这些实验用于确定NS3、NS3/4A、和MSLF1构建体是否能够引起针对N3的T-细胞介导的免疫应答。
                       实施例4
为了研究上面描述的构建体是否能够引起针对NS3的细胞介导的免疫应答，实施体内肿瘤生长测定。为此，制备了用NS3/4A基因稳定转染的SP2/0肿瘤细胞系(SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞系(H-2d))。SP2/0细胞保持在补加10％胎牛血清(FCS；Sigma Chemicals，St.Louis，MO)、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、1mM非必需氨基酸、50μM β-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠(GIBCO-BRL，Gaithesburgh，MD)的DMEM培养基中。通过BglII消化将含有NS3/4A基因的pcDNA3.1质粒线性化。将共5μg线性化质粒DNA与60μg转染试剂(Superfect，Qiagen，德国)混合并将混合物加入35mm盘中SP2/0细胞的50％汇合层。根据生产商的方案实施转染步骤。
通过有限稀释克隆经转染的细胞并且14天后通过加入800μg遗传霉素(G418)/ml完全DMEM培养基进行选择。用PCR或者RTPCR和/或捕获EIA使用针对NS3的单克隆抗体鉴定稳定表达NS3/4A的SP2/0克隆。基本上如下实施鼠NS3抗体检测的所有EIAs。简言之，将50mM碳酸钠缓冲液(pH 9.6)中的1μg/ml rNS3(在大肠杆菌中产生的重组NS3蛋白，对PBS过夜透析，并无菌过滤)在4℃被动过夜吸附到96孔微量滴定板(Nunc，Copenhagen，丹麦)。然后通过将板与含有PBS、2％山羊血清和1％牛血清白蛋白的稀释缓冲液在+37℃温育1小时使板封闭。然后将以1∶60开始的小鼠血清的连续稀释液在所述板上温育1小时。通过偶联碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG(Sigma Cell Products，Saint Louis，Missouri USA)，然后加入底物pNPP(1片/5ml 1M二乙醇胺缓冲液与0.5mM MgCl2)检测结合的鼠血清抗体。通过加入1M NaOH终止反应。在405nm处读吸光度。
然后在Balb/c小鼠中评估SP2/0和NS3/4A-SP2/0细胞系的体内生长动力学。在小鼠的右侧腹皮下注射2×106个肿瘤细胞。每天通过皮肤确定肿瘤的大小。两种细胞系的生长动力学相当。例如，在任何时间点两种细胞系之间平均肿瘤大小都不相异(见表4)。
                                                                     表4
  小鼠ID   肿瘤细胞系                                       在所指示的时间点最大体内肿瘤大小
  5   6   7   8   11   12   13   14   15
  1   SP2/0   1.6   2.5   4.5   6.0   10.0   10.5   11.0   12.0   12.0
  2   SP2/0   1.0   1.0   2.0   3.0   7.5   7.5   8.0   11.5   11.5
  3   SP2/0   2.0   5.0   7.5   8.0   11.0   11.5   12.0   12.0   13.0
  4   SP2/0   4.0   7.0   8.0   10.0   13.0   15.0   16.5   16.5   17.0
  5   SP2/0   1.0   1.0   3.0   4.0   5.0   6.0   6.0   6.0   7.0
  组平均值   1.92   3.3   5.0   6.2   9.3   10.1   10.7   11.6   12.1
  6   NS3/4A-SP2/0   1.0   2.0   3.0   3.5   4.0   5.5   6.0   7.0   8.0
  7   NS3/4A-SP2/0   2.0   2.5   3.0   5.0   7.0   9.0   9.5   9.5   11.0
  8   NS3/4A-SP2/0   1.0   2.0   3.5   3.5   9.5   11.0   12.0   14.0   14.0
  9   NS3/4A-SP2/0   1.0   1.0   2.0   6.0   11.5   13.0   14.5   16.0   18.0
  10   NS3/4A-SP2/0   3.5   6.0   7.0   10.5   15.0   15.0   15.0   15.5   20.0
  组平均值   1.7   2.7   3.7   5.7   9.4   10.7   11.4   12.4   14.2
  组平均值之间student’s t-检验的p值   0.7736   0.6918   0.4027   0.7903   0.9670   0.7986   0.7927   0.7508   04623
下面的实施例描述了为了确定用NS3/4A构建体免疫的小鼠是否已经产生了针对NS3的T细胞免疫应答而进行的实验。
                       实施例5
为了确定NS3/4A免疫是否引起了T-细胞应答，测定了经免疫的小鼠免疫防御系统攻击表达NS3的肿瘤细胞系的能力。以前(Encke等，J.Immunol.161：4917(1998))已经详细描述了检验Balb/c小鼠中SP2/0骨髓瘤细胞系的肿瘤生长的体内抑制方案。该模型中肿瘤生长的抑制取决于细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的引发。在第一组实验中，每隔一月用100μgNS3-pVAX或100μg NS3/4A-pVAX对10只小鼠组肌内免疫5次。最后免疫2周后，将2×106个SP2/0或者NS3/4A-SP2/0细胞注射到每只小鼠的右侧腹。2周后，处死小鼠并测量最大肿瘤大小。在NS3-pVAX免疫的小鼠中平均SP2/0和NS3/4A-SP2/0肿瘤大小之间没有差异。(见表5)。
                                  表5
  小鼠ID   免疫原   剂量(μg)   肿瘤细胞系   肿瘤生长   最大肿瘤大小(mm)
  1   NS3-pVAX   100   SP2/0   是   5
  2   NS3-pVAX   100   SP2/0   是   15
  3   NS3-pVAX   100   SP2/0   否   -
  4   NS3-pVAX   100   SP2/0   是   6
  5   NS3-pVAX   100   SP2/0   是   13
  组总和   4/5   9.75±4.992
6 NS3-pVAX 100 NS3/4A-SP2/0 是 9
7 NS3-pVAX 100 NS3/4A-SP2/0 是 8
8 NS3-pVAX 100 NS3/4A-SP2/0   是 7
  9   NS3-pVAX   100   NS3/4A-SP2/0   否   -
  10   NS3-pVAX   100   NS3/4A-SP2/0   否   -
  3/5   8.00±1.00
注释：统计分析(StatView)：对最大肿瘤大小的student’s t检验。认为p值＜0.05是显著的。
最大直径的不成对t检验
分组变量：列1
假定差异：0
行排除：NS3DNA-肿瘤-001213
  平均差异   DF   t-值   P-值
  NS3-sp2，NS3-spNS3   1.750   5   0.58   0.584
最大直径的组信息
分组变量：列1
行排除：NS3DNA-肿瘤-001213
  计数   平均值   方差   标准差   标准误
  NS3-sp2   4   9.750   24.917   4.992   2.496
  NS3-spNS3   3   8.000   1.000   1.000   0.57
为了分析施用不同的含有NS3的组合物是否影响细胞介导的免疫应答的引发，用PBS、rNS3、对照DNA，或者NS3/4A构建体免疫小鼠，并确定肿瘤大小，如上述。NS3/4A构建体能够引起T-细胞应答，其足够导致肿瘤大小的统计学显著的减小(见表6)。
                                            表6
  小鼠ID   免疫原 剂量(μg)   肿瘤细胞系   抗-NS3 肿瘤生长 最大肿瘤尺寸(mm)
  1   NS3-pVAX 10   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   12.0
  2   NS3-pVAX 10   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   20.0
  3   NS3-pVAX 10   NS3/4A-SP2/0   60   +   18.0
  4   NS3-pVAX 10   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   13.0
  5   NS3-pVAX 10   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   17.0
  (组平均值)   60   5/5   16.0±3.391
  6   NS3-pVAX 100   NS3/4A-SP2/0   2160   +   10.0
  7   NS3-pVAX 100   NS3/4A-SP2/0   ＜60   -   -
  8   NS3-pVAX 100   NS3/4A-SP2/0   ＜60   -   -
  9   NS3-pVAX 100   NS3/4A-SP2/0   360   -   -
  10   NS3-pVAX 100   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   12.5
  (组平均值)   1260   2/5   11.25±1.768
  11   NS3/4A-pVAX 10   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   10.0
  12   NS3/4A-pVAX 10   NS3/4A-SP2/0   ＜60   -   -
  13   NS3/4A-pVAX 10   NS3/4A-SP2/0   ＜60   -   -
  14   NS3/4A-pVAX 10   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   13.0
  15   NS3/4A-pVAX 10   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   13.5
  组平均值   ＜60   3/5   12.167±1.893
  16   NS3/4A-pVAX 100   NS3/4A-SP2/0   60   +   10.0
  17   NS3/4A-pVAX 100   NS3/4A-SP2/0   360   -   -
  18   NS3/4A-pVAX 100   NS3/4A-SP2/0   2160   +   8.0
  19   NS3/4A-pVAX 100   NS3/4A-SP2/0   2160   +   12.0
  20   NS3/4A-pVAX 100   NS3/4A-SP2/0   2160   +   7.0
  组平均值   1380   4/5   9.25±2.217
  36   p17-pcDNA3 100   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   20.0
  37   p17-pcDNA3 100   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   7.0
  38   p17-pcDNA3 100   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   11.0
  39   p17-pcDNA3 100   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   15.0
  40   p17-pcDNA3 100   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   18.0
  组平均值   ＜60   5/5   14.20±5.263
  41   rNS3/CFA 20   NS3/4A-SP2/0   ＞466560   +   13.0
  42   rNS3/CFA 20   NS3/4A-SP2/0   ＞466560   -   -
  43   rNS3/CFA 20   NS3/4A-SP2/0   ＞466560   +   3.5
  44   rNS3/CFA 20   NS3/4A-SP2/0   ＞466560   +   22.0
  45   rNS3/CFA 20   NS3/4A-SP2/0   ＞466560   +   17.0
  组平均值   466560   4/5   17.333±4.509
  46   PBS -   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   10.0
  47   PBS -   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   16.5
  48   PBS -   NS3/4A-SP2/0   60   +   15.0
  49   PBS -   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   21.0
  50   PBS -   NS3/4A-SP2/0   ＜60   +   15.0
  51   PBS -   NS3/4A-SP2/0   ＜60   -   -
  组平均值   60   5/6   15.50±3.937
注释：统计分析(StatView)：对最大肿瘤大小的student’s t-检验。认为p值＜0.05是显著的。
最大直径的不成对t检验
分组变量：组
假定差异：0
                                         平均差异                      DF          t-值                    P-值
    2.950     5     .739     .4933
    2.033     6     .628     .5532
    -1.800     8     -.643     .5383
    4.950     7     1.742     .1250
    -1.300     8     -.442     .6700
    -3.133     6     -.854     .4259
    -.917     3     -.542     .6254
    -4.750     5     -1.811     .1299
    2.000     4     1.092     .3360
    -4.250     5     -1.408     .2183
    -6.083     3     -1.744     .1795
    -3.833     6     -1.763     .1263
    2.917     5     1.824     .1277
    -3.333     6     -1.344     .2274
    -5.167     4     -1.830     .1412
    6.750     7     3.416     .0112
    .500     8     .215     .8350
    -1.333     6     -.480     .6480
    -6.250     7     -2.814     .0260
    -8.083     5     -3.179     .0246
    -1.833     6     -.607     .5662
p17-sp3-4，NS3-100-sp3-4p17-sp3-4，NS3/4-10-sp3-4p17-sp3-4，NS3-10-sp3-4p17-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4p17-sp3-4，PBS-sp3-4p17-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3-100-sp3-4，NS3/4-10-sp3-4NS3-100-sp3-4，NS3-10-sp3-4NS3-100-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4NS3-100-sp3-4，PBS-sp3-4NS3-100-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，NS3-10-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，PBS-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3-10-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4NS3-10-sp3-4，PBS-sp3-4NS3-10-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3/4-100-sp3-4，PBS-sp3-4NS3/4-100-sp3-4，rNS3-sp3-4PBS-sp3-4，rNS3-sp3-4
下面的实施例描述了其他实验，这些实验用于确定肿瘤尺寸的减小是否可以归因于产生了NS3-特异的T-淋巴细胞。
                       实施例6
在下一组实验中，再次在NS3/4A-pVAX免疫的Balb/c小鼠中评估了SP2/0或NS3/4A-SP2/0肿瘤生长的抑制。在用NS3/4A-pVAX质粒免疫的小鼠中，与未转染的SP2/0细胞的生长相比，NS3/4A-SP2/0肿瘤细胞的生长被显著抑制(见表7)。从而，NS3/4A-pVAX免疫引起CTLs，其抑制体内表达NS3/4A的细胞的生长。
                                        表7
  小鼠ID   免疫原  剂量(μg)   肿瘤细胞系   肿瘤生长   最大肿瘤大小(mm)
  11   NS3/4A-pVAX   100   SP2/0   否   -
  12   NS3/4A-pVAX   100   SP2/0   是   24
  13   NS3/4A-pVAX   100   SP2/0   是   9
  14   NS3/4A-pVAX   100   SP2/0   是   11
  15   NS3/4A-pVAX   100   SP2/0   是   25
  4/5   17.25±8.421
16 NS3/4A-pVAX 100 NS3/4A-SP2/0 否 -
17 NS3/4A-pVAX 100 NS3/4A-SP2/0 是 9
18 NS3/4A-pVAX 100 NS3/4A-SP2/0 是 7
19 NS3/4A-pVAX 100 NS3/4A-SP2/0 是 5
20 NS3/4A-pVAX 100 NS3/4A-SP2/0 是   4
  4/5   6.25±2.217
注释：统计分析(StatView)：对最大肿瘤大小的student’s t检验。认为p值＜0.05是显著的。
最大直径的不成对t检验
分组变量：列1
假定差异：0
行排除：NS3DNA-肿瘤-001213
  平均差异   DF   t-值   P-值
  NS3-sp2，NS3/4-spNS3   11.000   6   2.526   0.044
最大直径的组信息
分组变量：列1
行排除：NS3DNA-肿瘤-001213
  计数   平均值   方差   标准差   标准误
  NS3-sp2   4   17.250   70.917   8.421   4.211
  NS3-spNS3   4   6.250   4.917   2.217   1.109
在另一组实验中，在MSLF1-pVAX免疫的Balb/c小鼠中评价表达NS3/4A的SP2/0肿瘤生长的抑制。简言之，用基因枪以不同免疫原(4μg质粒)在第0、4、8、12和16周免疫小鼠组。最后免疫后两周，在小鼠的右侧腹皮下注射2×106个表达NS3/4A的SP2/0细胞。在第7、11和13天通过皮肤测量肿瘤大小以监视肿瘤生长的动力学。计算平均肿瘤大小并用曼-惠特尼非-参数检验对组进行比较。在第14天处死所有小鼠。
仅一次免疫后，就观察到肿瘤抑制应答(见图2和表8)。两次免疫后，NS3/4A-pVAX和MSLF1-pVAX质粒都引起了肿瘤抑制应答(见图3和表9)。然而，与天然NS3/4A基因相比，用MSLF1基因免疫的小鼠中肿瘤显著更小。3次注射后，两种质粒都有效引起相当的肿瘤抑制应答(见图4和表10)。这些实验证明MSLF-1基因在体内激活肿瘤抑制性免疫应答中比NS3/4A-pVAX更有效。
                            表8
  组   MSLF1-pVAX1   NS3/4A-pVAX1   未免疫的
  MSLF1-pVAX1   -   N.S.   p＜0.05
  NS3/4A-pVAX1   N.S.   -   p＜0.05
  未免疫的   p＜0.05   p＜0.05   -
                          表9
  组   MSLF1-pVAX1   NS3/4A-pVAX1   未免疫的
  MSLF1-pVAX1   -   p＜0.05   p＜0.01
  NS3/4A-pVAX1   p＜0.05   -   p＜0.01
  未免疫的   p＜0.01   p＜0.01   -
                          表10
  组   MSLF1-pVAX1   NS3/4A-pVAX1   未免疫的
  MSLF1-pVAX1   -   N.S.   p＜0.01
  NS3/4A-pVAX1   N.S.   -   p＜0.01
  未免疫的   p＜0.01   p＜0.01   -
下面的实施例描述了为了分析多种含有NS3的组合物在引起针对NS3的细胞介导的应答中的效率而进行的实验。
                     实施例7
为了确定NS3-特异T细胞是否由NS3/4A免疫引起，使用了体外T细胞介导的肿瘤细胞裂解测定法。该测定法以前已经详细描述(Sallberg等，J.Virol.71：5295(1997))。在第一组实验中，用100μg NS3/4A-pVAX肌内免疫5只Balb/c小鼠组3次。最后注射两周后，处死小鼠并收获脾细胞。建立用3×106个脾细胞和3×106个NS3/4A-SP2/0细胞的再刺激培养。5天后，用NS3/4A-SP2/0或SP2/0细胞作为靶标实施标准Cr51-释放测定法。将特异裂解百分数计算为NS3/4A-SP2/0细胞的裂解和SP2/0细胞裂解的比值。使用效应物/靶标比值为20∶1，用NS3/4A-pVAX免疫的小鼠在4/5受试小鼠中显示出超过10％的特异裂解(见图5A和5B)。
在下一组实验中，比较了对MSLF1-pVAX和NS3/4A-pVAX的T细胞应答。由于以前已经作出了H-2b-限制的NS3表位，所以在C57/BL6小鼠中评价两种质粒引发体外可检测的CTLs的能力。用这两种质粒免疫小鼠组并用肽包被的表达H-2b的RMA-S细胞或者表达NS3/4A的EL-4细胞在体外检测CTLs。简言之，在含有5U/ml重组鼠IL-2(mIL-2；R&DSystems，Minneapolis，MN)的终体积为12ml的25-ml烧瓶中实施体外刺激5天。再刺激培养物含有共40×106个免疫脾细胞和表达NS3/4A蛋白的2×106个放射的(10,000rad)同基因SP2/0细胞。体外刺激5天后，实施标准51Cr释放测定法。收获效应细胞并在总体积为200μl的96孔U型底部板中实施4小时的51Cr测定法。用20μl51Cr5mCi/ml)对总共1×106个靶细胞标记1小时然后在PBS中洗涤3次。使用5×103个51Cr-标记的靶细胞/孔以40∶1、20∶1和10∶1的效应物∶靶标(E∶T)比值确定细胞毒性活性。
备选地，肽免疫后12天从C57BL/6小鼠收获脾细胞并将其重悬在补加10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、1mM非必需氨基酸、50μMβ-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中。在总体积为12ml，含有25×106个脾细胞和25×106个经放射的(2,000rad)同基因脾细胞的25ml烧瓶中实施体外刺激5天。在0.05μM NS3/4A H-2Db结合肽(序列GAVQNEVTL SEQ.ID.NO.：37)或对照肽H-2Db肽(序列KAVYNFATM SEQ.ID.NO.：38)的存在下实施再刺激。5天后，实施51Cr释放测定法。在51Cr标记前在+37℃下用50μM肽脉冲RMA-S靶细胞1.5小时，然后在PBS中洗涤3次。收获效应细胞并如所描述的实施4小时51Cr测定法。使用5×103个51Cr-标记的靶细胞/孔以60∶1、20∶1和7∶1的E∶T比值确定细胞毒性活性。通过这些测定法，确定与NS3/4A-pVAX载体相比，MSLF1基因引起更高水平的体外裂解活性(见图6A-6L)。用表达肽包被的H-2B的RMA-S细胞和表达NS3/4A的EL-4细胞都得到了相似结果。
用流式细胞术得到的另外的证据证明密码子优化的MSLF1基因比天然NS3/4A基因更有效地引起NS3-特异的CTLs。用重组可溶性二聚体小鼠H-2Db：Ig融合蛋白对来自NS3/4A DNA免疫的小鼠的脾细胞体外染色分析NS3/4A-肽特异的CD8+T细胞的频率。此处描述的许多单克隆抗体和MHC：Ig融合蛋白都从BDB Pharmingen(San Diego，CA)购买：抗-CD16/CD32(Fc-blockTM，克隆2.4G2)、FITC偶联的抗-CD8(克隆53-6.7)，FITC偶联的抗-H-2Kb(克隆AF6-88.5)、FITC偶联的抗-H-2Db(克隆KH95)、重组体可溶的二聚体小鼠H-2Db：Ig、PE偶联的大鼠-α小鼠IgG1(克隆X56)。
将重悬在100μl PBS/1％FCS(FACS缓冲液)中的约2×106个脾细胞与1μg/106个细胞的Fc-封闭抗体在冰上温育15分钟。然后将细胞与在十4℃预载640nM过量NS3/4A衍生肽(序列GAVQNEVTL SEQ.ID.NO.：37)48小时的2μg/106个细胞的H-2Db：Ig或者与2μg/106个细胞的未装载H-2Db：Ig融合蛋白在冰上温育1.5小时。然后将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次并重悬在含有10μl/100μl PE偶联的大鼠-α小鼠IgG1二级抗体的100μl FACS缓冲液中并在冰上温育30分钟。然后将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次并与1μg/106个细胞的FITC偶联的α-小鼠CD8抗体温育30分钟。然后将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次并重悬在含有0.5μg/ml PI的0.5ml FACS缓冲液中。在FACS Calibur(BDB)上获得来自每种样品的约200,000个事件并从分析中排除死细胞(PI阳性细胞)。
通过FACS分析定量特异CTLs的优点是其在分析前绕过了CTLs的体外扩增的可能的不利之处。用负荷NS3-肽的二价H-2Db：Ig融合蛋白分子对NS3-特异CTLs的直接体外定量揭示两次免疫后密码子优化的MSLF-1基因已经有效引发NS3-特异的CTLs，而最初的NS3/4A不引发(表)。因此，与最初的NS3/4A基因相比，优化的MSLF-1基因有效引发NS3-特异CTLs，其具有更高频率并且在所有检验的参数方面具有更好的功能性。下面的实施例提供了更多证据证明密码子优化的NS3/4A有效引发NS3特异的细胞毒性T细胞。
                         实施例7A
最初，确定了通过基因枪免疫使用wtNS3、wtNS3/4A和coNS3/4A表达质粒可以引发的NS3-特异CTLs的频率。与wtNS3基因相比coNS3/4A质粒引起更高的NS3-特异CTL的前体频率，加强了NS4A的重要性(图11)。当直接体外分析时，在wtNS3/4A和coNS3/4A表达质粒之间没有注意到CTL前体频率的统计学差异(图11)。用coNS3/4A质粒或者wtNS3/4A-SFV的单次免疫在免疫两周内引起了约1％肽-特异CTLs(图11)。通过用NS3-肽体外再刺激5天证实了NS3-特异CTLs检测的特异性，通过该再刺激观察到用coNS3/4A基因免疫后高前体频率(图11)。
为了直接比较不同载体引起的NS3-特异CTLs的体外裂解活性，一次或两次免疫后实施标准51Cr-释放测定法。对装载NS-肽的表达H-2Db的RMA-S细胞和稳定表达NS3/4A的EL-4细胞都测定体内引起的CTLs的裂解活性。一剂后，coNS3/4A质粒和wtNS3/4A-SFV载体显然比wtNS3/4A质粒在引起裂解NS3-肽包被的靶细胞的CTLs中更有效(图12)。从而，NS3/4A基因的密码子优化或者mRNA扩增增强了CTL引发事件。当使用表达NS3/4A的EL-4细胞时差异较不明显，这可能是因为该测定法较不灵敏(图12)。两次免疫后，所有NS3/4A载体似乎都以相似的效率引起NS3-特异的CTLs(图12)。然而，与仅含有wtNS3基因的质粒相比，具有任一种含有NS3/4A的载体的两次免疫在引发NS3-特异的CTLs中明显更有效(图12)，这与CTL前体分析和前面的观察完全一致。从而，NS3/4A基因的密码子优化或者mRNA扩增更快速地引发NS3-特异的CTLs。
本领域技术人员认识到用SP2/0骨髓瘤细胞在BALB/c小鼠中或者用EL-4淋巴瘤细胞在C57BL/6小鼠中分析体内肿瘤生长的抑制代表体内功能HCV-特异的免疫应答(见Encke J等，J Immunol 161：4917-4923(1998))。以前已经描述了稳定表达NS3/4A的SP2/0细胞系(见Frelin L等，GeneTher 10：686-699(2003))并且如下描述的表征了表达NS3/4A的EL-4细胞系。
为了证实使用表达NS3/4A的EL-4细胞系抑制肿瘤生长完全依赖于NS3/4A特异免疫应答，进行了对照实验。将10只C57BL/6小鼠组不免疫，或者用coNS3/4A质粒免疫两次。最后免疫后两周，通过皮下注射106个天然EL-4或者表达NS3/4A的EL-4细胞(NS3/4A-EL-4)攻击小鼠。保护需要NS3/4A特异的免疫应答，因为仅被免疫的小鼠受到保护而抗NS3/4A-EL4细胞系的生长(图13)。从而，该H-2b受限模型的行为类似于SP2/0H-2d受限模型。
用重组NS3蛋白质免疫证明在保护防止肿瘤生长中NS3/4A-特异的B细胞和CD4+T细胞都不具有关键重要性。从coNS3/4A质粒免疫的H-2b小鼠的脾细胞体外耗竭CD4+或CD8+T细胞证明CD8+T细胞是51Cr释放测定中的主要效应细胞。为了确定体内功能抗肿瘤效应细胞群体，在用NS3/4A-EL-4肿瘤细胞系刺激之前一周或者期间用coNS3/4A质粒免疫的小鼠中CD4+或CD8+T细胞被选择性耗竭。通过流式细胞术分析揭示85％的CD4+和CD8+T细胞分别被耗竭。该实验揭示CD4+T细胞的体内耗竭对肿瘤免疫性没有重要影响(图13)。相反，CD8+T细胞的体内耗竭显著降低了肿瘤免疫性(p＜0.05，ANOVA；图13)。从而，如所预期的，在肿瘤生长抑制的体内模型中，NS3/4A-特异的CD8+CTLs似乎在效应物阶段上是主要的保护细胞。
然后用肿瘤刺激模型评估不同免疫原在引起体内针对NS3/4A-EL-4肿瘤细胞的保护性免疫中是多么有效。为了确保研究引发事件的有效性，所有小鼠都被免疫仅一次。我们发现与体外CTL数据完全一致的是，与用空pVAX质粒免疫相比，仅含有NS3/4A的载体能够快速引起保护性免疫应答(p＜0.05，ANOVA；图14)。然而，这取决于NS4A而独立于密码子优化或者mRNA扩增，表明使用基因免疫，可以很容易地保护C57BL/6小鼠抵抗肿瘤生长。
为了进一步阐明体内引发保护性CD8+CTL应答的先决条件，进行了另外的实验。首先，用NS3-来源的CTL肽免疫的C57BL/6小鼠不受针对NS3/4A-EL-4肿瘤生长的保护(图14)。其次，用佐剂中的重组NS3免疫不提供针对肿瘤生长的保护(图14)。NS3-来源的CTL肽在C57BL/6小鼠中有效引发CTLs，佐剂中的rNS3引起高水平NS3-特异的T辅助细胞。从而，似乎需要NS3/4A的内源产生以在体内引发保护性CTLs。为了进一步表征引发事件，使用基因枪将B细胞组(μMT)或CD4缺陷的C57BL/6小鼠用coNS3/4A基因免疫一次，并在两周后刺激(图14)。因为两种谱系都受到针对肿瘤生长的保护，所以我们断定B细胞和CD4+T细胞对于引发体内功能性NS3/4A-特异的CTLs都不是需要的(图14)。总之，C57BL/6小鼠中体内肿瘤保护性NS3/4A-特异的CTLs的引发需要NS4A和该免疫原的内源表达。在C57BL/6小鼠中，引发较不依赖于基因递送途径或者辅助细胞，如B细胞或者CD4+T细胞。coNS3/4A DNA质粒的体内功能性CTL的引发独立于CD4+T辅助细胞这一事实可以有助于解释引发所发生的速度。
使用NS3/4A-EL-4细胞系在C57BL/6小鼠中的重复实验已经表明用NS3/4A基因第一次免疫后已经得到了针对肿瘤生长的保护，独立于密码子优化或者mRNA扩增。而且，两次注射后，针对NS3/4A-EL-4肿瘤生长的免疫性甚至被进一步增强，但是仅当存在NS4A时。从而，该模型因此不足够灵敏以揭示不同免疫原的内在免疫原性的微小差异。
为了更好地比较wtNS3/4A和coNS3/4A DNA质粒的免疫原性，在H-2d小鼠中进行了另外的实验，其中对于肿瘤保护免疫性似乎需要至少两次免疫。重要的是记起在BALB/c小鼠中用NS3/4A基因基因枪免疫后所得的IgG亚类分布表明类似混合的Th1/Th2应答。从而，倾向Th2-的BALB/c小鼠品系中类Th2的免疫途径(基因枪)可能损害引发体内有效CTL应答的能力。
使用基因枪对10只BALB/c小鼠组用4μg各自DNA质粒免疫1、2或3次(图15)。最后注射后两周攻击小鼠。因此，这些实验提供了更多证据证明coNS3/4A质粒比野生型质粒更快地引发体内功能性NS3/4A-特异的肿瘤抑制免疫性(图15)。与wtNS3/4A质粒相比，两剂coNS3/4A引发了显著更好的NS3/4A-特异性肿瘤抑制免疫性(p＜0.05，ANOVA；图15)。三剂后，肿瘤抑制免疫性相同。从而，上面的数据证实NS3/4A基因的密码子优化更快地引起NS3-特异的CTLs。
如文中所阐明的，NS3/4A基因可用作疫苗。尽管已经确定NS3/4A快速引发体内功能性CTLs，接着分析了肿瘤细胞注射后治疗免疫的效果。将10只C57BL/6小鼠组用106个NS3/4A-EL-4肿瘤细胞刺激。肿瘤刺激后，一组在第六天用4μg coNS3/4A透皮免疫，另一组在第12天免疫。治疗接种后，与未免疫的对照组相比，两组都具有明显更小的肿瘤(分别p＜0.01，ANOVA；图16)。这证明该疫苗快速引发CTLs，其能够归巢并渗入表达NS3/4A的肿瘤。从而，使用coNS3/4A质粒的基因枪免疫也作为治疗性疫苗。即，接种表达NS3/4A的肿瘤的肿瘤细胞后6到12天使用coNS3/4A基因的基因枪免疫显著抑制肿瘤生长。总之，通过具有密码子优化的基因的基于DNA的免疫或者通过SFV复制子的mRNA扩增产生了在体内有功能的HCVNS3-特异免疫应答的快速引发。通过使用这些方法，可以制备非常有效的疫苗以治疗或者预防慢性HCV感染。下一个实施例更详细地描述用于文中描述的实验中的一些材料和方法。
                    实施例7B
小鼠
近交BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)小鼠从供应商(Mllegard，Denmark)得到。B细胞(μMT)缺陷小鼠由瑞典Karolinska Institutet的Karin Sandstedt博士友情提供。CD4缺陷C57BL/6小鼠从Microbiology andTumorbiology Centre，Karolinska Institutet的饲养机构得到。所有小鼠都是雌性并且在实验开始时为4-8周龄。
重组NS3ATP酶/解旋酶结构域蛋白
重组NS3(rNS3)蛋白由Darrell L.Peterson，Department of Biochemistry，Commonwealth University，VA友情提供。本领域中已经描述了在大肠杆菌中产生重组NS3蛋白(不包括NS4A)。使用前，将rNS3蛋白对PBS过夜透析并无菌过滤。
产生合成的密码子优化的(co)NS3/4A基因
根据人细胞中最通常使用的密码子对前面分离的序列和所测序的特异wtNS3/4A基因分析了密码子用法。共置换了435个核苷酸以对人细胞优化密码子用法。将该序列送到Retrogen Inc(San Diego，CA)以产生全长合成的coNS3/4A基因。coNS3/4A基因与HCV-1参比株的3417-5475位核苷酸区域具有79％的序列同源性。总共有433个核苷酸不同。在氨基酸水平上，与HCV-1株的同源性为98％(15个氨基酸不同)。
HCV基因型1b的全长密码子优化的2.1kb DNA片段对应于氨基酸1007到1711，包括NS3和NS4A。将NS3/NS4A基因片段插入BamHI和XbaI消化的pVAX载体(Invitrogen，San Diego)以产生coNS3/4A-pVAX质粒。对该表达构建体测序以确保正确序列和读框。通过体外转录和翻译测定法分析了蛋白质表达。质粒生长在感受态TOP10大肠杆菌(Invitrogen)中。使用Qiagen DNA纯化柱根据生产商的使用说明(Qiagen GmbH，Hilden，FRG)纯化用于体内注射的质粒DNA。通过分光光度法(Dynaquant，Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)确定所得质粒DNA的浓度。将纯化的DNA以1mg/ml的浓度溶于无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
体外翻译测定
为了确保wtNS3/4A和coNS3/4A基因是完整的并且可以被翻译，用原核T7偶联的网织红细胞裂解物体系(TNT；Promega，Madison，WI)实施了体外转录测定。为了比较这两种质粒的翻译效率，在加入到TNT测定前将输入DNA的量在连续稀释液中稀释(6ng到1ng)。
瞬时转染
通过标准方案瞬时转染HepG2细胞。简言之，将HepG2细胞在转染前涂布在2.5cm2孔(0.5×106)中的DMEM培养基中。用Fugene 6转染试剂(Roche)将2μg每种质粒DNA构建体(wtNS3/4A和coNS3/4A)转染到HepG2细胞中。转染后，将HepG2细胞温育24-48小时。
蛋白质样品制备和分析
通过免疫沉淀然后通过SDS-PAGE分析细胞裂解物。简言之，在RIPA缓冲液(0.15M NaCl，50mM Tris，1％Triton-X 100，1％脱氧胆酸钠和1％SDS)中裂解瞬时转染的HepG2细胞。用蛋白质A琼脂糖和抗-NS3多克隆抗体在4℃过夜免疫沉淀细胞裂解物。将经洗涤的沉淀重悬在SDS样品缓冲液中，在100℃下加热5分钟之后在4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上进行SDS-PAGE分析并电转移到硝酸纤维素膜上。
NS3蛋白质表达的分析
通过使用化学发光-连接的蛋白质印迹试剂盒(WesternBreeze；Invitrogen)根据生产商的方案进行NS3蛋白质的检测。通过使用NS3-特异的多克隆抗体检测NS3蛋白质表达并且将其定量为化学发光信号。使用GeneGnome(Syngene，Cambridge，UK)检测化学发光信号。在GeneGnome上实施化学发光蛋白质印迹的定量并计算来自每种蛋白质的强度单位并将其与rNS3的标准曲线比较。
Semliki forest病毒(SFV)载体
将幼仓鼠肾(BHK)-21细胞保持在完整BHK培养基中，其中该培养基补加5％FCS、10％胰蛋白
Figure A20038010920800471
磷酸肉汤、2mM谷氨酰胺、20mM Hepes和抗生素(链霉素10μg/ml和青霉素100IU/ml)。
通过PCR将wtNS3/4A基因分离为Spel-BStB1片段并将其插入pSFV10Enh的Spel-BstB1位点，pSFVl0Enh含有34个氨基酸长的壳体的翻译增强子序列，接着是FMDV 2a切割肽。用二-辅助RNA系统将重组RNA包装成rSFV颗粒。进行受感染的BHK细胞的间接免疫荧光以确定重组病毒原种的效价。
免疫荧光
根据标准技术使用Lipofectamine plus试剂(Invitrogen)用coNS3/4A-pVAX1瞬时转染BHK细胞或者通过rSFV感染BHK细胞。通过间接免疫荧光检测NS3细胞。
免疫方案
通过针头注射100μg编码一种或多种HCV蛋白质的质粒DNA免疫4-8周龄的雌性BALB/c(H-2d)或C57BL/6(H-2b)小鼠组(5-10只小鼠/组)。在胫骨前(TA)肌中肌内(i.m.)施用PBS中的质粒DNA。如文中所指出的，在DNA免疫前5天用溶于0.9％无菌盐NaCl中的50μL/TA 0.01mM心脏毒素(Latoxan，Rosans，法国)肌内注射小鼠。以四周的间隔强化小鼠。
对于基于基因枪的免疫，根据生产商(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)提供的方案将质粒DNA连接到金颗粒(1μm)。免疫前，剃光腹部注射部位并根据生产商的方案以500psi的氦气发射压实施免疫。每次注射剂量含有4μg质粒DNA。以每月的间隔用相同剂量强化小鼠。
对于rSFV颗粒免疫，用在PBS中稀释(终体积100μl)的1×107个病毒颗粒在尾根部皮下免疫小鼠。通过用在完全弗氏佐剂中以1∶1稀释的100μg肽在尾根部皮下免疫实施肽免疫。
用于检测鼠抗-HCV NS3抗体的ELISA
第一次免疫后通过从异氟醚麻醉的小鼠的后眼窝取血每两周或每四周收集用于抗体检测和同种型鉴定的血清。如前所述进行酶免疫测定。
细胞系
将SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞系(H-2d)保持在补加10％胎牛血清(FCS；Sigma Chemicals，St.Louis，MO)、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、1mM非必需氨基酸、50μMβ-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠(GIBCO-BRL，Gaithesburgh，MD)的DMEM培养基中。将稳定表达NS3/4A的SP2/0-Ag14细胞保持在800μg遗传霉素(G418)/ml完全DMEM培养基中。
EL-4淋巴瘤(H-2b)细胞保持在补加10％FCS、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠、1mM非必需氨基酸、50μMβ-巯基乙醇、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(GIBCO-BRL)的RPMI 1640培养基中。通过使用SuperFect(Qiagen GmbH，Hilden，FRG)转染试剂用线性化NS3/4A-pcDNA3.1质粒转染EL-4细胞产生稳定表达NS3/4A的EL-4细胞。根据生产商的方案实施转染步骤。所转染的细胞通过有限稀释克隆并加入800μg遗传霉素(G418)/ml完全RPMI 1640培养基进行选择。
将RMA-S细胞(瑞典Karolinska Institutet的Klas Krre教授馈赠)保持在补加5％FCS、2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中。所有细胞都生长在湿润的37℃，5％CO2培养箱中。
T细胞的体内耗竭
通过腹膜内注射纯化的杂交瘤上清液体内耗竭CD4和CD8 T细胞亚群。在肿瘤刺激前3、2、和1天和刺激后第3、6、10和13天注射了共0.4mg抗-CD4(克隆GK1.5)或者抗-CD8(克隆53-6.7)/小鼠/注射。在第0、3、6、10和13天的外周血单核细胞群体的流式细胞术分析表明85％CD4和CD8T细胞被耗竭。
用表达NS3/4A的肿瘤细胞体内刺激
根据Encke等，如前描述的方法实施用表达NS3/4A的SP2/0骨髓瘤或者EL-4淋巴瘤细胞系体内刺激经免疫的小鼠。简言之，如所描述的用不同的免疫原在周0、4和8免疫BALB/c或C57BL/6小鼠组。最后免疫2周后，用1×106个表达NS3/4A的SP2/0或者EL-4细胞在右侧腹皮下注射。在第6到20天通过皮肤测量肿瘤大小以确定肿瘤生长的动力学。用曲线下面积(AUC)比较两组小鼠中动态肿瘤发育。用方差分析(ANOVA)检验比较平均肿瘤大小。在第20天，处死所有小鼠。
为了检验疫苗的治疗效果，如上描述的用肿瘤细胞接种小鼠组。6或12天后，对小数免疫一次。从第6天到第20天监视肿瘤生长。
抗体和MHC：Ig融合蛋白
所有单克隆抗体和MHC：Ig融合蛋白都购自BDB Pharmingen(SanDiego，CA)：抗-CD16/CD32(Fc-blockTM，克隆2.4G2)、FITC偶联的抗-CD8(克隆53-6.7)、Cy-色素偶联的抗-CD4(克隆RM4-5)、FITC偶联的抗-H-2Db(克隆KH95)、重组体可溶的二聚体小鼠H-2Db：Ig、PE偶联的大鼠-α小鼠IgG1(克隆X56)。
NS3/4A-特异CTL活性检测
将来自DNA或者rSFV免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞重悬在补加10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、1mM非必需氨基酸、50μMβ-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠的完全RPMI 1640培养基中。在含有5U/ml重组鼠IL-2(mIL-2；R&D Systems，Minneapolis，MN，美国)的终体积为12m1的25-ml烧瓶中实施体外刺激5天。再刺激培养物含有共25×106个免疫脾细胞和表达NS3/4A蛋白的2.5×106个经放射的(10,000rad)同基因EL-4细胞。体外刺激5天后，实施标准51Cr释放测定法。收获效应细胞并在总体积为200μl的96孔U型底部板中实施4小时的51Cr测定法。用20μl51Cr(5mCi/ml)对总共1×106个靶细胞(表达NS3/4A的EL-4细胞)在+37℃标记1小时然后在PBS中洗涤3次。以60∶1、20∶1和7∶1的效应物∶靶标(E∶T)的比例将不同数目的效应物和51Cr-标记的靶细胞(5×103个细胞/孔)加入孔中。将效应物和靶标在+37℃下温育4小时后确定细胞裂解活性水平。收获100μl上清液并用γ-计数器测量放射活性。
从C57BL/6小鼠收获来自DNA或者rSFV免疫的小鼠的脾细胞并将其重悬在如前描述的完全RPMI 1640培养基中。简言之，通过将25×106个脾细胞和25×106个经放射(2,000rad)的同基因脾细胞混合实施体外刺激5天。在0.05μM NS3/4A H-2Db结合肽(序列GAVQNEVTL(Seq.Id.No.37))的存在下实施再刺激。再刺激后，用51Cr-标记的肽脉冲的RMA-S细胞作为靶标实施51Cr-释放测定法。以60∶1、20∶1和7∶1的E∶T比例确定细胞毒性活性。
根据下式表达结果：特异裂解百分数＝(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。实验释放是在效应细胞存在下靶细胞释放的平均计数/分钟。最大释放是用10％Triton X-100裂解靶细胞后释放的放射活性。自发释放是放射活性向靶细胞的培养基中的渗漏。
通过将效应物细胞与含有抗-CD4、或者抗CD-8、单克隆抗体的杂交瘤上清液(克隆RL 172.4；抗-CD4，和克隆31M；抗-CD8)在4℃温育30分钟实施体外T-细胞耗竭实验。然后在实施上述CTL测定前洗涤细胞并将其与补体(低毒性兔补体的1/20稀释液；Saxon，英国)在37℃温育1小时。
通过流式细胞术定量NS3/4A-特异CTLs
通过用如前描述的重组可溶性二聚体小鼠H-2Db：Ig融合蛋白对来自DNA和rSFV免疫的小鼠的脾细胞实施体外染色分析NS3-肽特异的CD8+T细胞频率。简言之，将脾细胞重悬在PBS/1％FCS(FACS缓冲液)并与Fc-封闭抗体温育。然后洗涤细胞并将其与预负荷NS3/4A衍生肽的H-2Db：Ig温育。之后，洗涤细胞并将其与PE-偶联的大鼠-α小鼠IgG1抗体、FITC偶联的α小鼠CD8抗体和Cy-色素(Chrome)α-小鼠CD4抗体温育。洗涤后，将细胞在含有碘化丙锭(PI)的FACS缓冲液中稀释。在FACS Calibur(BDB)上获得来自每种样品的约200,000个事件并在分析中排除死细胞(PI阳性细胞)。
统计分析
用Fisher氏精确检验进行频率分析并用曼-惠特尼U检验比较来自两个组的值。用曲线下面积(AUC)比较两个小鼠组中的动态肿瘤发展。用方差分析(ANOVA)比较AUC值。用StatView软件(5.0版)的Macintosh版实施计算。
下一章节描述了本发明的一些肽实施方案。
HCV肽
所具体化的HCV肽和其衍生物包括但不限于，含有基本上如序列表(SEQ.ID.NOs.：2-11和SEQ.ID.NO.：36)中所描述的氨基酸序列作为一级氨基酸序列的那些肽和SEQ.ID.NOs.：2-11和SEQ.ID.NO.：36的至少长四个氨基酸的片段(例如，SEQ.ID.NOs.：14-16)，其包含改变的序列，其中用功能等价的氨基酸残基代替该序列中的残基而导致沉默变化。SEQ.ID.NOs.：2-11和SEQ.ID.NO.：36的序列的优选片段为至少4个氨基酸并且含有所发现的NS3/4A肽唯一的氨基酸序列或者其突变体，该突变体包含经改变的序列，其中用功能等价的氨基酸残基代替该序列中的残基而导致沉默变化。HCV肽可以为例如，长度至少12-704个氨基酸(例如，长12-15、15-20、20-25、25-50、50-100、100-150、150-250、250-500和500-704个氨基酸的之间的任一数目)。
实施方案还包括与上面描述的那些肽基本上相同的HCV肽。即，在SEQ.ID.NOs.：2-11和SEQ.ID.NO.：36或者其片段内的一个和多个氨基酸被具有相似极性的作为功能等价物的另一氨基酸置换的HCV肽，该置换导致沉默改变。此外，HCV肽可以具有一个和多个氨基酸残基融合到SEQ.ID.NOs.：2-11和SEQ.ID.NO.：36或者其片段，只要该融合不显著改变HCV肽的结果和功能(例如，免疫原性性质)。该序列内用于置换的氨基酸可选自该氨基酸所属的类别的其他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸，和酪氨酸。因此，按照上述修饰，本发明的肽实施方案基本上由SEQ.ID.NOs.：2-27和SEQ.ID.NO.：36组成。
通过化学合成方法(如固相肽合成)使用本领域中公知的技术如Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1964)，Houghten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：51：32(1985)，Stewart和Young(固相肽合成，PierceChem Co.，Rockford，IL(1984)，和Creighton，1983，蛋白质：结构和分子原理.W.H.Freeman&Co.，N.Y所提出的方法制备此处描述的HCV肽。所合成的这些多肽在氨基末端可以有或者没有甲硫氨酸。用这些参考文献中提出的方法可以氧化化学合成的HCV肽以形成二硫键。
尽管可以化学合成此处描述的HCV肽，但是可以通过重组DNA技术更有效地产生这些多肽。这些方法可用于构建含有上述HCV核苷酸序列例如，和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术，和体内遗传重组。备选地，使用例如，合成仪可以化学合成编码HCV核苷酸序列的RNA。见，例如，Oligonucleotide Synthesis，1984，Gait，M.J.编者，IRL Press，Oxford中描述的技术。因此，一些实施方案涉及已经被改造而表达所具体化的HCV肽的细胞系。例如，产生一些细胞，这些细胞表达SEQ.ID.NOs.：2-11和SEQ.ID.NO.：36的HCV肽或者这些分子的片段(例如，SEQ.ID.NOs.：14-26)。
可以用多种宿主-表达载体系统表达具体化的HCV肽。适宜的表达系统包括，但不限于，微生物如细菌(例如，大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌(B.subtilis))，其经含有HCV核苷酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或者粘粒DNA表达载体转化；酵母(例如，酵母、毕赤酵母)，其用含有HCV核苷酸序列的重组酵母表达载体转化；昆虫细胞，其经含有HCV序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染；植物细胞系统，其经含有HCV序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或者重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化；或者哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3)，其含有重组表达构建体，该构建体含有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或者来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。
在细菌系统中，根据所要表达的HCV基因产物的计划用途可以有利地选择许多表达载体。例如，当将产生大量这种蛋白质以产生HCV肽的药物组合物或者产生针对HCV肽的抗体时，例如，指导容易纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体是所希望的。这些载体包括，但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.，2：1791(1983)，其中HCV编码序列可以单独连接到该载体中处于lacZ编码序列的框内从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye，Nucleic Acids Res.，13：3101-3109(1985)；Van Heeke&Schuster，J.Biol.Chem.，264：5503-5509(1989))；等等。pGEX载体也可用于表达外来多肽，其作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这些融合蛋白是可溶的并且可以从裂解的细胞纯化，该纯化为将该融合蛋白吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱。设计PGEX载体以包括凝血酶或者因子Xa蛋白酶切割位点从而所克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫系统中，用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为表达外来基因的载体。该病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将HCV编码序列单独克隆到该病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)中处于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。HCV基因编码序列的成功插入将导致多角体蛋白基因的失活和产生非-封闭的重组病毒(即，缺少多角体蛋白基因编码的蛋白质外壳的病毒)。然后用这些重组病毒感染草地夜蛾细胞，所插入的基因在所述细胞中表达(见，例如，Smith等，J.Virol.46：584(1983)；和Smith，美国专利号4,215,051)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。对于将腺病毒用作表达载体的情况，可以将目标HCV核苷酸序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚启动子和三联前导序列中。然后通过体外和体内重组可以将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。该病毒基因组的非必需区(例如，区域E1和E3)中的插入将导致重组病毒，其是存活的并且能够在受感染的宿主中表达HCV基因产物(见，例如，Logan&Shenk，Proc.NatL Acad.Sci.USA 81：3655-3659(1984))。所插入HCV核苷酸序列的有效翻译也需要特异启动信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。
然而，对于仅插入HCV编码序列的一部分的情况，可以提供外源翻译控制信号，可能包括ATG起始密码子。此外，起始密码子可以与所希望的编码序列的读框同相以确保完整插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以来自多种来源，可以是天然的和合成的。通过包括适宜的转录增强子元件、翻译终止子，等等可以增强表达的效率(见，Bittner等，Methods in Enzymol.，153：516-544(1987))。
此外，可以选择宿主细胞株系，其调节所插入序列的表达，或者以所希望的特定方式对基因产物修饰和加工。蛋白质产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能是重要的。不同宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特定机制。可以选择适宜的细胞系和宿主系统以确保所表达的外来蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有正确加工初步转录物、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括，但不限于，CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、和WI38。
为了长期、高产率地产生重组蛋白，优选稳定表达。例如，可以将稳定表达上述HCV肽的细胞系改造。与其使用含有复制的病毒来源的表达载体，不如用受到适宜的表达控制元件(例如，启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化部位，等)控制并具有可选择标记的DNA转化宿主细胞。导入外来DNA后，允许工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转移到选择培养基中。重组质粒中的可选择标记赋予对选择的抗性并且允许细胞将该质粒稳定整合到它们的染色体中并生长而形成转化灶，其又被克隆并扩大成细胞系。该方法可有利地用于工程化细胞系，该细胞系表达HCV基因产物。
可以使用许多选择系统，所述系统包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，等，Cell 11：223(1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026(1962))、和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy，等，Cell 22：817(1980))基因，这些基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。而且，抗代谢物抗性可用作下面基因的选择基础：dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567(1980)；O′Hare，等，Proe.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin，等，J.Mol.Biol.150：1(1981))；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre，等，Gene 30：147(1984))。
备选地，通过利用对所要表达的融合蛋白特异的抗体可以容易地纯化任何融合蛋白。例如，Janknecht等所描述的系统允许容易地纯化在人细胞系中表达的非变性的融合蛋白(Janknecht，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8972-8976(1991))。在该系统中，将目标基因亚克隆到牛痘重组质粒中从而该基因的可读框在翻译后融合到由六个组氨酸残基组成的氨基末端标记。将从重组牛痘病毒感染的细胞的提取物加到Ni2+氮川乙酸(nitriloaceticacid)-琼脂糖柱上并用含有咪唑的缓冲液选择性洗脱具有组氨酸-标记的蛋白。下面的实施例描述用于表达所具体化的核酸编码的HCV肽的方法。
                       实施例8
为了鉴定实施例1中描述的NS3/4A-pVAX、MSLF1-pVAX、和NS3/4A突变构建体，将质粒转录并体外翻译，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使所得多肽显现。用T7偶联的网织红细胞裂解物系统(Promega，Madison，WI)根据生产商的使用说明实施体外转录和翻译。在30℃用35S-标记的甲硫氨酸(Amersham International，Plc，Buckinghamshire，UK)实施表达构建体的所有体外翻译反应。将所标记的蛋白质通过12％SDS-PAGE分离并通过对X-光片(Hyper Film-MP，Amersham)曝光6-18小时显现。
体外分析揭示所有蛋白质都从它们的各自表达载体大量表达。rNS3构建体(NS3-pVAX载体)产生了约61kDa的单一肽，而突变构建体(例如TGT构建体(NS3/4A-TGT-pVAX)和RGT构建体(NS3/4A-RGT-pVAX))产生了约67kDa的单一多肽，其与从NS3/4A-pVAX构建体产生的未经切割的NS3/4A肽在分子量上相同。从经表达的NS3/4A肽产生的切割产物约为61kDa，其与从NS3-pVAX载体产生的rNS3在大小上相同。这些结果表明所表达的构建体是有功能的，NS3/4A构建体具有酶活性，rNS3产生了预计大小的肽，并且断点突变完全消除了NS3-NS4A接头处的切割。
为了比较NS3/4A-pVAX和MSLF1-pVAX质粒的翻译效率，将输入DNA的量连续稀释后加入测定。质粒的连续稀释揭示MSLF1质粒比野生型NS3/4A质粒在该质粒的更高稀释液中给出更强的带，证明从MSLF1质粒的体外转录和翻译更有效率。然后使用瞬时转染的Hep-G2细胞分析NS3/4A-pVAX和MSLF1质粒的蛋白质表达。得到类似结果，因为MSLF-1基因比天然NS3/4A基因提供了NS3的更有效率的表达。
含有具体化的HCV核酸和肽的序列、构建体、载体、克隆和其他物质可以为富集的或者分离的形式。本文中，“富集的”指该物质的浓度为其天然浓度的许多倍，例如，其天然浓度的至少约2、5、10、100和1000倍，有利地按重量计0.01％，优选按重量计至少约0.1％。还预计按重量计约0.5％和以上，例如，1％、5％、10％和20％的富集制备物。术语“分离的”要求该物质从其原始环境(例如如果其是天然存在的，则为天然环境)除去。例如，活的动物中存在的天然存在的多核苷酸不是分离的，但是与天然系统中某些或者所有共存的物质分离的该相同的多核苷酸是分离的。还有利的是所述序列为纯化的形式。术语“纯化的”不要求绝对纯度；而是，该术语旨在为相对定义。分离的蛋白质已经被常规地纯化到例如，通过考马斯染色的电泳均匀性。预计将起始物质或者天然物质纯化至少1个数量级，优选2或3个数量级，更优选4或5个数量级。
此处描述的HCV基因产物也可以在植物、昆虫和动物中表达从而产生转基因生物。具有HCV肽的所希望的转基因植物系统包括拟南芥、玉米、和衣藻。具有HCV肽的所希望的昆虫系统包括，但不限于，D.melanogaster和C.elegans。任一物种的动物包括，但不限于，两栖动物、爬行动物、鸟类、小鼠、仓鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、微猪、山羊、狗、猫，和非人灵长类，例如，狒狒、猴和黑猩猩也可用于产生具有具体化的HCV分子的转基因动物。这些转基因生物令人满意地表现出此处描述的HCV肽的种系转移。
本领域中任一公知的技术优选用于将HCV转基因导入动物中以产生转基因动物的生成系或者剔除或者置换现有的HCV基因。这些技术包括，但不限于多核微注射(Hoppe，P.C.和Wagner，T.E.，1989，美国专利号4,873,191)；种系的逆转录病毒介导的基因转移(Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 82：6148-6152(1985))；胚胎干细胞中的基因靶定；(Thompson等，Cell 56：313-321(1989))；胚胎的电穿孔(Lo，Mol Cell.Biol.3：1803-1814(1983)；和精子介导的基因转移(Lavitrano等，Cell57：717-723(1989))；也见Gordon，Transgenic Animal，Intl.Rev.Cytol.115：171-229(1989)。
合成或表达和分离或纯化HCV肽后，所分离或纯化的肽可用于产生抗体。根据上下文，术语“抗体”可以包括多克隆、单克隆、嵌合的、单链、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。识别HCV肽的抗体可以具有许多用途，包括但不限于，生物技术应用、治疗/预防应用，和诊断应用。
为了产生抗体，通过用HCV肽注射可以免疫多种宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠，和人，等等。根据宿主种类，可以用多种佐剂增加免疫学应答。这些佐剂包括，但不限于，利巴韦林、弗氏佐剂、矿物凝胶，如氢氧化铝，和表面活性物质，如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白，和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和Corynbacteriumparvum也可以是潜在有用的佐剂。
用于诱导特异抗体的肽可以具有由至少4个氨基酸，优选至少10到15个氨基酸组成的氨基酸序列。通过一种方法，编码NS3/4A的片段的一段短的氨基酸序列与另一蛋白如匙孔血蓝蛋白融合从而产生针对该嵌合分子的抗体。此外，对动物，优选包括人的哺乳动物使用组合物，该组合物含有利巴韦林和HCV肽(SEQ.ID.Nos.2-11和SEQ.ID.NO.：36)、其含有至少3-50之间的任一数目的连续氨基酸(例如，3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50个连续氨基酸)的片段(例如，SEQ.ID.NOs.：4-26)，或者编码一种或多种这些分子的核酸。尽管通过将对应于HCV肽的合成的3聚体、10聚体、和15聚体肽注射到小鼠产生能够特异识别HCV的抗体，但是通过使用如上面描述制备的重组HCV肽可以产生更多样的抗体组。
为了产生针对HCV肽的抗体，从经转染或转化的细胞分离基本上纯的肽。将最终制备物中肽的浓度例如通过在Amicon滤器装置上浓缩调节到几微克/ml的水平。然后可以如下制备针对目标肽的单克隆或多克隆抗体。
通过任一技术可以制备针对HCV肽的单克隆抗体，该技术通过培养物中的连续细胞系产生抗体分子。这些技术包括，但不限于最初由Koehler和Milstein(Nature 256：495-497(1975))描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunol Today 4：72(1983))；Cote等，Proc Natl Acad Sci80：2026-2030(1983)，和EBV-杂交瘤技术Cole等， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss Inc，New York N.Y，77-96页(1985)。此外，可以使用为了产生“嵌合抗体”而开发的技术，该技术为将小鼠抗体基因与人抗体基因剪接而得到具有适宜的抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等，Proc Natl Acad Sci 81：6851-6855(1984)；Neuberger等，Nature312：604-608(1984)；Takeda等，Nature 314：452-454(1985))。备选地，可以将为了产生单链抗体描述的技术(美国专利号4,946,778)用于产生HCV-特异的单链抗体。通过如Orlandi等，Proc Natl Acad Sci 86：3833-3837(1989)，和Winter G.和Milstein C；Nature 349：293-299(1991)中公开的在淋巴细胞群体中诱导体内产生或者通过筛选重组免疫球蛋白文库或者高度特异结合试剂组也可以产生抗体。
还可以产生含有HCV肽的特异结合位点的抗体片段。例如，这些片段包括，但不限于，F(ab’)2片段，其可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生，和Fab片段，其可通过还原F(ab’)2片段的二硫键产生。备选地，可以构建Fab表达文库以允许快速和容易地鉴定具有所希望的特异性的单克隆Fab片段(Huse W.D.等，Science 256：1275-1281(1989))。
通过一种方法，可以如下制备针对HCV肽的单克隆抗体。简言之，在数周内用几微克所选的蛋白质或者从其衍生的肽反复接种小鼠。然后处死小鼠，分离脾脏的抗体生产细胞。在聚乙二醇的存在下，脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，通过将该系统在含有氨基蝶呤的选择培养基(HAT培养基)上生长破坏过多的未融合的细胞。将成功融合的细胞稀释并将稀释液的等分试样置于微量滴定板的孔中，培养物在该孔中继续生长。通过用免疫测定方法，如最初由Engvall，E.，Meth.Enzymol.70：419(1980)描述的ELISA，和其衍生方法检测孔的上清液中的抗体以鉴定抗体生产克隆。可以将所选择的阳性克隆扩大并收获它们的单克隆抗体产生备用。单克隆抗体生产的详细方法在Davis，L.等， Basic Methods in Molecular BiologyElsevier，New York.章节2l-2中描述。
通过用所表达的蛋白或者上述从该蛋白质衍生的肽免疫适宜的动物可以制备含有针对单一蛋白的异源表位的抗体的多克隆抗血清，所述肽蛋白质或者肽可以未经修饰或者经修饰以增强免疫原性。有效多克隆抗体的产生受到与抗原和宿主种类有关的许多因素的影响。例如，小分子比寡合物的免疫原性低并需要使用载体和佐剂。而且，宿主动物对接种的部位和剂量的应答不同，抗原剂量不足或者过量都可导致低效价抗血清。在多个皮下部位施用的抗原的小剂量(ng水平)似乎更有效。兔的有效免疫方案可以在Vaitukaitis，J.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.33：988-991(1971)中发现。
以规则的间隔实施加强注射，当抗血清的抗体效价开始下降时收获抗血清，其中通过例如在琼脂中针对抗原的已知浓度的双免疫扩散半定量地确定抗体效价。见，例如，Ouchterlony，O.等，19章： Handbook of Experimental Immunology D.Wier(编者)Blackwell(1973)。抗体的平台浓度通常为0.1到0.2mg/ml血清(约12μM)。通过制备如Fisher，D.，第42章： Manual of Clinical Immunology，第二版(Rose和Friedman，编者)Amer.Soc.For Microbiol.，Washington，D.C.(1980)所描述的竞争结合曲线确定抗血清对抗原的亲和力。根据任一方案制备的抗体制剂可用于定量免疫测定中，其确定生物样品具有抗原的物质的浓度；所述抗体制剂还被半定量或者定性地使用(例如，在诊断实施方案中鉴定生物样品中HCV的存在)。下面的章节描述上面描述的一些核酸和肽可以怎样用于诊断中。
诊断实施方案
通常，根据使用基于核酸还是蛋白质的测定法对具体化的诊断法分类。某些诊断测定法检测从患者得到的样品中存在或者不存在所具体化的HCV核酸序列，而其他测定法鉴定从患者所得生物样品中是否存在具体化的HCV肽。此外，还具体化试剂盒的生产，该试剂盒结合试剂和此处描述的方法，允许快速检测和鉴定HCV。这些诊断试剂盒可以包括，例如，具体化的核酸探针或者抗体，其特异检测HCV。这些试剂盒的检测组分将通常与一种或多种下面的试剂联合提供。将通常提供能够吸收或者结合DNA、RNA或者蛋白质的支持体。可以利用的支持体包括硝酸纤维素、尼龙或者衍生尼龙膜，其特征是具有带正电荷的取代基的阵列。在这些试剂盒中可以提供一种或多种限制酶、对照试剂、缓冲剂、扩增酶，和非人多核苷酸，类小牛-胸腺或者鲑精DNA。
有用的基于核酸的诊断法包括，但不限于，直接DNA测序、DNA印迹分析、点印迹分析、核酸扩增，和这些方法的组合。这些分析的起点是从自被怀疑患有HCV或者处于患HCV的危险中的患者所得的生物样品分离或者纯化的核酸。从该样品提取核酸并且该核酸可通过RT-PCR和/或DNA扩增使用对应于具体化的HCV核酸序列(例如，NS3/4A，(SEQ.ID.NO.：1))的侧翼区的引物扩增。
在一些实施方案中，与HCV序列特异杂交的核酸探针以有序阵列附着到支持体，其中核酸探针附着到该支持体的不同区域，这些区域不相互重叠。优选地，设计这种有序阵列是“可寻址的”，其中记录探针的不同位置并且可以作为测定方法的一部分接触这些位置。这些探针结合到支持体的不同的已知的位置中。关于每种核酸探针的精确定位的知识使得这些“可寻址的”阵列尤其用于结合测定法中。然后通过常规方法(例如，放射性或荧光)标记来自几种生物样品的制备物的核酸并将所标记的样品在允许杂交的条件下应用于阵列。
如果样品中的核酸与阵列上的探针杂交，那么在支持体上对应于该杂种的位置上检测到信号。因为每种经标记的样品的身份是已知的并且经标记的样品所应用的的支持体上的区域是已知的，所以可以快速确定多态性变体的存在。使用高通量诊断或者检测分析领域中技术人员公知的技术可以容易地将这些方法自动化。
此外，可以使用与上面给出的方法相反的方法。可以将生物样品中存在的核酸在支持体上排列以产生可寻址阵列。优选地，样品在支持体上不重叠的已知位置排列。通过将与编码HCV肽的核酸互补的经标记的核酸探针应用于阵列上对应于生物样品所排列的位置的位置上确定每种样品中HCV核酸的存在。因为升温样品的身份和其在阵列上的位置是已知的，所以可以容易地确定被HCV感染的患者。使用高通量诊断分析领域中技术人员公知的技术可以容易地将这些方法自动化。
可以使用本领域中公知的任一可寻址的阵列技术。多核苷酸阵列的一种具体的实施方案是通常所说的基因芯片TM，并且一般在美国专利5,143,854；PCT公开WO 90/15070和92/10092中描述。通常使用机械合成方法或者光指导的合成方法产生这些阵列，光指导的合成方法结合光刻方法和固相寡核苷酸合成(Fodor等，Science，251：767-777，(1991))。通过开发通常所称作的“极大规模固定化聚合物合成”(VLSPISTM)技术使得可能在固体支持体上固定寡核苷酸阵列，该所述技术中，通常将探针以高密度阵列固定在芯片的固体表面上。VLSPISTM技术的实例在美国专利5,143,854和5,412,087和PCT公开WO 90/15070、WO 92/10092和WO95/11995中提供，这些专利描述了通过诸如光指导的合成技术的技术形成寡核苷酸阵列的方法。在设计目标是提供固定在固态支持体上固定的核苷酸的阵列的策略中，开发了其他展示策略以将寡核苷酸阵列在芯片上排列和展示以试图最大化杂交模式和诊断信息。这些展示策略的实例在PCT公开WO 94/12305、WO 94/11530、WO 97/29212、和WO 97/31256中公开。
多种标记和偶联技术是本领域中技术人员公知的并且可用于多种核酸测定中。有几种方法可产生用于杂交或PCR的经标记核酸，这些方法包括，但不限于，寡标记、切口翻译、末端-标记，或者使用经标记核苷酸的PCR扩增。备选地，可以将编码HCV肽的核酸克隆到载体中以产生mRNA探针。这些载体是本领域中公知的，可通过商业途径得到，并且可用于通过加入适宜的RNA聚合酶如T7、T3或SP6和经标记的核苷酸体外合成RNA探针。许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway N.J.)、Promega(Madison Wis.)和U.S.Biochemical Corp(Cleveland Ohio)提供商业试剂盒和这些方法的方案。适宜的报道分子或标记包括那些放射性核素、酶、发荧光、化学发光的或生色试剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等等。
使用常规测定法和此处描述的实施方案也可以检测从患者得到的蛋白质样品中HCV肽的存在。例如，与所公开的HCV肽免疫反应的抗体可以用于筛选生物样品中HCV感染的存在。在优选实施方案中，将与具体化的HCV肽反应的抗体用于免疫沉淀来自生物样品的公开的HCV肽或者用于在蛋白质印迹或者免疫印迹上与从生物样品所得的蛋白质反应。有利的诊断实施方案还包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射分析(IRMA)和免疫酶测定(IEMA)，包括使用对所公开的HCV肽特异的单克隆和/或多克隆抗体的夹层测定法。代表性夹层测定法由David等在美国专利号4,376,110和4,486,530中描述。其他实施方案使用美国专利号5,290,678、5,604,105、5,710,008、5,744,358；和5,747,274中公开的免疫-条带技术。
在另一优选的基于蛋白质的诊断法中，此处描述的抗体附着到优选阵列中的支持体，其中许多抗体附着到支持体的不同区域，这些区域不相互重叠。与基于核酸的阵列一样，基于蛋白质的阵列是有序阵列，其被设计成“可寻址的”从而可以记录不同的位置并且可以作为测定步骤的一部分存取这些位置。这些探针结合不同的已知位置中的支持体。关于每种探针的精确位置的知识使得这些“可寻址的”阵列尤其可用于结合测定中。例如，可寻址的阵列可以包含具有几个区域的支持体，特异识别生物样品中存在的HCV肽的许多抗体探针结合到所述区域并区分此处鉴定的HCV的同种型。
通过一种方法，从生物样品得到蛋白质并将其通过常规方法(例如，放射性、比色或荧光)标记。然后将所标记的样品在允许结合的条件下应用于阵列。如果该样品中的蛋白质结合该阵列上的抗体探针，那么在支持体上对应于抗体-蛋白质复合体的位置的位置上检测到信号。因为每种经标记的样品的身份是已知的并且经标记的样品应用在支持体上的区域是已知的，所以可以容易地确定存在、浓度和/或表达水平。即，通过使用已知浓度的HCV肽的经标记的标准物，研究人员可以准确地确定受试样品中特定肽的蛋白质浓度并且还可以评估HCV肽的表达水平。也可以使用光密度法中的常规技术以更准确地确定HCV肽的浓度或表达水平。使用高通量诊断分析领域中技术人员公知的技术可以容易地将这些方法自动化。
在另一实施方案中，可以使用与上面给出的方法相反的方法。可以将生物样品中存在的蛋白质在支持体上排列以产生可寻址阵列。优选地，蛋白质样品在支持体上不重叠的已知位置排列。然后通过应用特异识别对HCV肽特异的表位的经标记的抗体探针确定每种样品中HCV肽的存在。因为生物样品的身份是已知的并且其在阵列上的位置是已知的，所以可以快速确定HCV肽的存在、浓度和/或表达水平。
即，通过使用已知浓度的HCV肽的经标记的标准，研究人员可以准确地确定样品中肽的浓度并且可以从该信息评估该肽的表达水平。也可以使用光密度法中的常规方法以更准确地确定HCV肽的浓度或表达水平。使用高通量诊断分析领域中技术人员公知的技术可以容易地将这些方法自动化。如上面详述，可以使用本领域中公知的可寻址的阵列技术。下一章节描述了更多的组合物，它们包括此处描述的HCV核酸和/或HCV肽。
含有HCV核酸或肽的组合物
本发明的实施方案还包括NS3/4A融合蛋白或者编码这些分子的核酸。例如，通过加入辅助氨基酸以形成“标记”可以方便重组蛋白质的产生和纯化。这些标记包括，但不限于，His-6、Flag、Myc和GST。标记可以加入到C-末端、N-末端或者NS3/4A氨基酸序列内。其他实施方案包括具有氨基或羧基末端截短，或者内部缺失或者具有加入到氨基或者羧基末端或者加入内部的另外的多肽序列的NS3/4A融合蛋白。其他实施方案包括NS3/4A融合蛋白，或者其经截短或者突变的形式，其中NS3/4A蛋白质水解切割位点的残基已经被置换。这些置换包括，但不限于，如下序列，其中P1’位点为Ser、Gly或者Pro，或者P1位置为Arg，或者P8到P4’序列为Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Val-Val-Thr-Ser-Thr-Trp-Val(SEQ.ID.NO.：15)。
其他实施方案涉及含有NS3/4A融合蛋白，或者其截短、突变或者修饰的形式的免疫原，该免疫原能够引起针对NS3的增强的免疫应答。该免疫原可以以基本上纯化的形式提供，这表示已经使该免疫原基本上无其他蛋白质、脂质、糖和该免疫原通常与之结合的其他化合物。
一些实施方案含有连接到支持体的至少一种HCV核酸或者HCV肽(例如，SEQ.ID.NOs.：1-27，35，或36)。优选地，生产这些支持体以产生多聚体试剂。该多聚体试剂以如此形式或者如此方式提供HCV肽或者核酸使得实现对该分子的足够亲和力。通过将所希望的分子连接到大分子支持体得到具有HCV核酸或者肽的多聚体试剂。“支持体”可以是载体、蛋白质、树脂、细胞膜、其壳体或者部分，或者用于连接或者固定这些分子的任何大分子结构。固体支持体包括，但不限于，反应盘的孔壁、试管、聚苯乙烯珠、磁珠、硝酸纤维素条、膜、微粒，如乳胶颗粒，动物细胞、Duracyte、人工细胞，和其他。HCV核酸或者肽也可以通过例如，共价键通过羟基、羧基或氨基和载体上的反应基团连接到无机载体，如二氧化硅材料(例如，硅胶、沸石、硅藻土或者胺化玻璃)。
在几种多聚体试剂中，大分子支持体具有疏水表面，其通过疏水非共价相互作用与HCV核酸或者肽的一部分相互作用。在一些情况中，支持体的疏水表面是聚合物如塑料或者任何其他聚合物，其中疏水基团已经被连接，如聚苯乙烯、聚乙烯或者聚乙烯。此外，HCV核酸或者肽可以共价结合载体，该载体包括蛋白质和/或寡糖/多糖(例如，纤维素、淀粉、糖原、脱乙酰壳多糖或胺化琼脂糖)。在这些后面的多聚体试剂中，分子上的反应基团，如羟基或者氨基被用于连接载体上的反应基团以产生共价键。另外的多聚体试剂包括具有其他反应基团的支持体，所述反应基团经化学活化从而附着到HCV核酸或者肽。例如，使用溴化氰活化的基质、环氧活化的基质、硫代或者硫代丙基凝胶、硝基苯基氯甲酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯键，或者环氧乙烷丙烯酸支持体(Sigma)。
希望用于身体(即用于预防或者治疗应用)的载体的生理的、无毒的和优选非免疫应答的。用于身体的适宜载体包括聚-L-赖氨酸、聚D，L-丙氨酸、脂质体、显示出所希望的HCV肽或者核酸的壳体，和Chromosorb(Johns-Manville Products，Denver Co.)。配体偶联的Chromosorb(Synsorb-Pk)已经在人体中试验用于预防溶血-尿毒症综合征并且据报导不导致不利的反应(Armstrong等，J.Infectious Diseases 171：1042-1045(1995))。对于一些实施方案，施用“裸露”的载体(即，缺少附着的HCV核酸或者肽)，其能够附着到生物的身体中的HCV核酸或者肽。通过该方法，设想了“前药型”疗法，其中裸露载体与HCV核酸或者肽分开施用并且一旦两者都存在于该生物的身体，该载体和HCV核酸或者肽就装配成多聚体复合体。
还预计在HCV核酸或者肽和支持体之间插入具有适宜长度的接头(例如，经工程化而类似λ噬菌体的柔性区域的“λ接头”)从而促使HCV肽、杂交体或者结合配偶体具有更大的柔性并从而克服支持体造成的任何空间位阻。通过在本公开中详述的测定法中筛选具有不同接头的HCV核酸或者肽可以确定适宜长度的接头，其允许最佳的细胞应答或缺少该应答。
还设想了含有一种以上类型的HCV核酸或者肽的复合支持体。“负荷支持体”可以是载体、树脂或者用于附着或者固定两种或多种不同的HCV核酸或者肽的任一大分子结构。如上面，还预期HCV核酸或者肽和支持体之间适宜长度的接头，如λ接头的插入，从而促进该分子的更大柔性并从而克服可能发生的任何空间位阻。通过在本公开中详述的测定法中筛选具有不同接头的HCV核酸或者肽可以确定适宜长度的接头，其允许最佳的细胞应答或缺少该应答。
在其他实施方案中，上面讨论的多聚体和复合支持体可以具有附着的多聚体HCV核酸或者肽从而分别产生“多聚体化的-多聚体支持体”和“多聚体化的-复合支持体”。例如，通过使用分子生物学中常规技术将两个或多个HCV核酸或者肽串联偶联可以得到多聚体化配体。HCV核酸或者肽的多聚体化形式对于许多应用是有利的，因为例如，能够得到具有更高亲和力的试剂。在组成多聚体化试剂的各自结构域之间插入接头或者间隔臂，如柔性λ接头，对于某些实施方案也是有益的。例如，在蛋白质结合结构域之间插入适宜长度的λ接头可以促进该分子中更大的柔性并可以克服空间位阻。类似地，在多聚体化HCV核酸或者肽和支持体之间插入接头可以促进更大柔性和限制支持体造成的空间位阻。通过在本公开中详述的测定法中筛选HCV核酸或者肽可以确定接头的适宜长度。
实施方案还包括疫苗组合物和免疫原制剂，所述组合物和制剂含有NS3/4A融合蛋白，或者其截短或突变的形式，和任选地，佐剂。下一章节更详细地描述了这些组合物的某些。
疫苗组合物和免疫原制剂
预期含有、组成为或者组成基本为具体化的HCV核酸或者HCV肽或者两者(例如，SEQ.ID.NOs.：1-27，35或36的一种或多种)的疫苗组合物和免疫原制剂。这些组合物通常含有佐剂，但是不一定需要佐剂。许多此处描述的核酸和肽当以纯净的形式施用时作为免疫原。可以根据盖仑药剂学的常规方法生产此处描述的组合物(例如，HCV免疫原和含有佐剂如利巴韦林的疫苗组合物)以产生用于施用于动物，例如包括人的哺乳动物的药用试剂。
多种基于核酸的疫苗是公知的并且预期这些组合物和免疫治疗方法可以通过与利巴韦林再配制而增强(见，例如，美国专利号5,589,466和6,235,888)。例如，通过一种方法，将编码此处描述的一种HCV肽的基因(例如，SEQ.ID.NO.：1或SEQ.ID.NO.：35)克隆到表达载体中，当导入受试者时该表达载体能够表达该多肽。该表达载体以与佐剂(例如，利巴韦林)混合或者与佐剂(例如，利巴韦林)联合施用于受试者。例如，佐剂(例如，利巴韦林)在表达载体稍后施用于相同部位。备选地，编码目标HCV多肽抗原的RNA与利巴韦林混合或者与佐剂(例如，利巴韦林)联合提供于受试者。
当抗原是DNA(例如，DNA疫苗组合物制剂)时，可以使用适宜的启动子包括猿病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)如HIV长末端重复(LTR)启动子、Moloney病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)，如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及来自人基因如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白的启动子。用于某些实施方案，特别用于产生人的基因疫苗的多腺苷酸化信号的实例包括但不限于，SV40多腺苷酸化信号和LTR多腺苷酸化信号。具体地，使用SV40多腺苷酸化信号，其在pCEP4质粒(Invitrogen，San DiegoCalif.)中，被称为SV40多腺苷酸化信号。
除了基因表达所需的调节元件，基因构建体中还可以包括其他元件。这些另外的元件包括增强子。增强子可以包括但不限于：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子，如来自CMV、RSV和EBV的增强子。可以为基因构建体提供哺乳动物复制原点以便保持该构建体在染色体外并且在细胞中产生该构建体的多个拷贝。来自Invitrogen(San Diego，CA)的质粒pCEP4和pREP4含有EB病毒复制原点和核抗原EBNA-1编码区，其产生高拷贝附加型复制而不整合。可以使用所有DNA形式，不管其复制或者非-复制，所述DNA不整合到基因组并且是可表达的。优选地，基因疫苗含有利巴韦林和编码NS3/4A、NS3的核酸或者其片段或突变体(SEQ.ID.NOs.：2-26和36)。下面的实施例描述了适于用于人的基因疫苗的制备。
                     实施例9
设计HCV表达质粒以表达NS3/4A肽(SEQ.ID.NO.：2或SEQ.ID.NO.：36)。通过酶除去NS3/4A-pVAX或MSLF1-pVAX的NS3/4A编码序列，并将分离的片段插入质粒A中从而该片段处于CMV启动子和RSV增强子元件的转录控制下(见，Pachuk等的美国专利号6,235,888)。质粒主链A长为3969个碱基对；其含有用于在大肠杆菌中复制的PBR复制原点和卡那霉素抗性基因。将插入片段如NS3/4A或者密码子优化的NS3/4A克隆到多接头区，其将插入片段置于启动子和多腺苷酸化信号之间并与启动子和多腺苷酸化信号操作性连接。所克隆的插入片段的转录处于CMV启动子和RSV增强子元件的控制下。在克隆位点的3’存在SV40多聚A信号，其提供了多腺苷酸化信号。然后通过将约0.5-500mg，例如0.5-1μg、1-2μg、2-5μg、5-10μg、10-20μg、20-50μg、50-75μg、75-100μg、100-250μg、250μg-500μg之间的任一量的构建体与约0.1-10mg，例如约0.1mg-0.5mg、0.5mg-1mg、1mg-2mg、2mg-5mg、或5mg-10mg之间任一量的利巴韦林混合制备含有NS3/4A的疫苗组合物或者免疫原制剂。
所述疫苗组合物可以用于在哺乳动物(例如，小鼠或兔)中产生抗体或者可以肌内注射到人以产生抗体，其中人为优选受到HCV病毒慢性感染的人。接受者优选以4周间隔接受该混合物的三次免疫加强。到第三次加强，对HCV特异的抗体效价将显著增加。此外，此时，所述受试者将经历针对NS3的增强的抗体和T-细胞介导的免疫应答，这可以通过EIA所检测的NS3特异抗体的增加的部分，和通过RT-PCR所检测的病毒负荷的减少来证明。
还预期含有此处描述的一种或多种HCV肽的疫苗组合物。优选地，所具体化的肽疫苗含有利巴韦林和NS3/4A、NS3或者其片段或者突变体(例如，SEQ.ID.NOs.：2-26和36)。下面的实施例描述了制备含有NS3/4A融合蛋白和佐剂的疫苗组合物。
                      实施例10
为了产生带标记的NS3/4A构建体，通过酶除去NS3/4A-pVAX或MSLF1-pVAX的NS3/4A编码序列，并将所分离的片段插入Xpress载体(Invitrogen)中。Xpress载体允许产生具有短的N-末端前导肽的重组融合蛋白，该前导肽具有对二价阳离子的高亲和性。使用镍-螯合树脂(Invitrogen)，可以一步纯化重组蛋白并随后通过用肠激酶切割除去前导肽。优选的载体是pBlueBacHis2 Xpress。pBlueBacHis2 Xpress载体是一种杆状病毒表达载体，其含有多个克隆位点、氨苄西林抗性基因，和lac z基因。因此，将所消化的氨苄西林片段克隆到pBlueBacHis2 Xpress载体并感染SF9细胞。然后根据生产商的使用说明分离或纯化表达蛋白。然后通过约0.1-500mg任一量，例如，1-5μg、5-10μg、10-20μg、20-30μg、30-50μg、50-100μg、100-250μg、或者250-500μg的rNS3/4A与约0.1-10mg之间任一量，例如0.1mg-0.5mg、0.5mg-1mg、1mg-2mg、2mg-5mg、或者5mg-10mg利巴韦林混合制备含有NS3/4A的疫苗组合物。
所述疫苗组合物可用于在哺乳动物(例如，小鼠或兔)中产生抗体或者可以肌内注射到人以产生抗体，其中人优选为慢性感染HCV病毒的人。接受者优选以4周间隔接受该混合物的三次免疫加强。到第三次加强，对HCV特异的抗体效价将显著增加。此外，此时，所述受试者将经历针对NS3的增强的抗体和T-细胞介导的免疫应答，这可以通过EIA所检测的NS3特异抗体的增加的部分，和通过RT-PCR所检测的病毒负荷的减少来证明。
含有一种或多种具体化的HCV核酸或肽的组合物可以含有其他成分，包括，但不限于，佐剂、结合剂、赋形剂，如稳定剂(用以促进长期保存)、乳化剂、增稠剂、盐、防腐剂、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂，等等。这些组合物适于动物的治疗，可以作为预防措施避免疾病或者病症或者作为治疗剂以治疗已经患有疾病或病症的动物。
还可以存在许多其他成分。例如，佐剂和抗原可以与常规赋形剂(例如，药学上可接受的有机或者无机载体物质，它们适于肠胃外、经肠(例如，经口)或者局部应用，不与佐剂和/或抗原产生有害反应)。适宜的药学上可接受的载体包括，但不限于，水、盐溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、糖，如乳糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油一酸酯和甘油二酸酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮，等等。更多的适宜载体在Remmington′s Pharmaceutical Sciences，第15版，Easton：Mack PublishingCompany，1405-1412页和1461-1487(1975)和The National Formular XIV，第14版，Washington，American Pharmaceutical Association(1975)中描述。
此处描述的基因构建体尤其可以与试剂一起配制或者联合施用，相对于缺乏所述试剂时施用相同的基因疫苗所发生的细胞对该基因构建体的吸收和/或表达，该试剂增加细胞对该基因构建体的吸收和/或表达。这些试剂和将它们与基因构建体联合施用的方案在1994年1月26日提交的PCT专利申请序列号PCT/US94/00899中描述。这些试剂的实例包括：CaPO4、DEAE葡聚糖、阴离子脂质、细胞外基质-活性酶、皂甙、凝集素、雌激素化合物和甾族激素、羟基化低级链烃基化合物、二甲亚砜(DMSO)、脲、和苯甲酸酯酰替苯胺、脒类、氨基甲酸乙酯和其盐酸盐，如局部麻醉剂家族的那些成员。此外，基因构建体被封装在脂质/聚阳离子复合物中或者与脂质/聚阳离子复合物联合施用。
可以将此处描述的组合物消毒并且如果希望，与辅助剂混合，所述辅助剂为例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、增香和/或芳香物质和不与佐剂或抗原起有害反应的物质。
具体制剂施用的有效剂量和方法可以基于每个患者和疾病的类型和阶段，以及本领域中技术人员公知的其他因素而变。通过标准药理学方法在细胞培养物或者实验动物中确定疫苗的治疗功效和毒性，例如，ED50(50％群体的治疗有效剂量)。从细胞培养测定法和动物研究所得数据可用于配制用于人使用的一系列剂量。疫苗的剂量优选处于循环浓度的范围内，该循环浓度包括ED50并且没有毒性。根据佐剂衍生物和HCV抗原的类型、所用的剂型、患者的敏感性、和给药途径，剂量在该范围内内变动。
因为许多佐剂(包括利巴韦林)已经上市数年，所以许多剂型和给药途径是公知的。在此处描述的实施方案的上下文中可以提供所有公知的剂型和给药途径。优选地，可以认为有效增强动物中对抗原的免疫应答的佐剂的量是足够在动物中实现约0.25-12.5μg/ml，优选约2.5μg/ml的血清水平的任一量。在一些实施方案中，根据将被施用疫苗的动物的体重确定佐剂的量。因此，具体制剂中佐剂的量可以是约0.1-6.0mg/kg体重之间的任何量。即，某些实施方案具有的佐剂量对应于约0.1-1.0mg/kg、1.1-2.0mg/kg、2.1-3.0mg/kg、3.1-4.0mg/kg、4.1-5.0mg/kg、5.1和6.0mg/kg动物体重之间任何量。更通常地，此处描述的一些组合物含有约0.25mg-2000mg之间任何量的佐剂。即，某些实施方案具有约250μg、500μg、1mg、25mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g、1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g、和2g佐剂。
本领域技术人员将理解疫苗或者免疫原制剂中抗原的量可以根据抗原的类型及其免疫原性而变。因此疫苗中抗原的量可以改变。不过，作为一般指导，此处描述的组合物可以含有约0.25-2000mg之间任何量的此处所讨论的HCV抗原。例如，抗原的量可以为约0.25mg-5mg、5-10mg、10-100mg、100-500mg、直至2000mg。优选地，当HCV抗原是核酸时所述抗原的量为0.1μg-1mg，理想地，1μg-100μg，优选5μg-50μg，最优选7μg、8μg、9μg、10μg、11μg-20μg，当所述抗原是肽时为1μg-100mg，理想地，10μg-10mg，优选100μg-1mg，更优选200μg、300μg、400μg、500μg、600μg，或者700μg-1mg。
在本文描述的一些方法中，由每个以上考虑到所治疗的患者选择佐剂和/或HCV抗原的确切量。此外，佐剂的量可以加入到相同或者等价量的抗原或者与该抗原分开，并且这些量在具体接种方案期间可以调节以便在患者-特异和抗原-特异考虑方面提供足够的水平。在该情况中，可以考虑的患者-特异的和抗原-特异的因素包括，但不限于，患者的疾病状态的严重性、年龄、患者的体重、饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性、和对治疗的耐受性/应答。下一章节更详细地描述用作佐剂的利巴韦林。
利巴韦林
核苷类似物由于它们能够减少病毒复制而被广泛用于抗病毒治疗中(Hosoya等，J.Inf.Dis.，168：641-646(1993))。利巴韦林(1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-氨甲酰)是合成的鸟苷类似物，其已经被用于抑制RNA和DNA病毒复制(Huffman等，Antimicrob.Agents.Chemother.，3：235(1973)；Sidwell等，Science，177：705(1972))。已经表明利巴韦林是肌醇单磷酸(IMP)脱氢酶(IMPDH)的竞争性抑制剂，其将IMP转化成IMX(其然后被转化成GMP)。De Clercq，Anti viral Agents：characteristic activityspectrum depending on the molecular target with which they interact，Academic press，Inc.，New York N.Y.，1-55页(1993)。由于长期利巴韦林治疗，GTP的细胞内池被耗竭。
除了抗病毒活性，研究人员还观察到某些鸟苷类似物对免疫系统具有影响(美国专利号6,063,772和4,950,647)。已经表明利巴韦林抑制功能性体液免疫应答(Peavy等，J.Immunol.，126：861-864(1981)；Powers等，Antimicrob.Agents.Chemother.，22：108-114(1982))和肥大细胞分泌的IgE-介导的调节(Marquardt等，J.Pharmacol.Exp.Therapeutics，240：145-149(1987))。一些研究人员报导利巴韦林的每天口服治疗对人和小鼠具有免疫调节效果(Hultgren等，J.Gen.Virol.，79：2381-2391(1998)和Cramp等，Gastro.Enterol.，118：346-355(2000))。然而，当前对于利巴韦林对免疫系统影响的理解还处于初步阶段。如下面所公开的，发现利巴韦林是有效的佐剂。
实施例11
在第一组实验中，用10μg或100μg重组丙型肝炎病毒非结构3(rNS3)蛋白腹膜内或皮下(例如，在尾根部)免疫3到5只Balb/c小鼠组(BKUniversal，Uppsala，瑞典)。将rNS3溶于仅磷酸盐缓冲盐水(PBS)或者含有1mg利巴韦林(从ICN，Costa Mesa，CA得到)的PBS中。每次注射对小鼠注射共100μl总体积。
腹膜内免疫后2周和4周，通过后眼窝采样对所有小鼠取血。收集血清样品并分析针对rNS3的抗体的存在。为了确定抗体效价，实施酶免疫测定法(EIA)(见，例如，Hultgren等，J Gen Virol.79：2381-91(1998)和Hultgren等，Clin.Diagn.Lab.Inmunol.4：630-632(1997))。抗体水平记录为在405mn下光密度为未经免疫的小鼠的2倍以上的最高血清稀释。
接受在PBS中与1mg利巴韦林混合的10μg或100μg rNS3的小鼠总是显示出更高的NS3抗体水平。免疫后两周通过EIA检测的抗体效价在图7中显示。含有1mg利巴韦林和10μg或100μg rNS3的疫苗制剂总是比仅由rNS3组成的疫苗制剂诱导出显著更大的抗体效价。
在第二组实验中，将8只Balb/c小鼠组用含有0mg、1mg、3mg或10mg利巴韦林(Sigma)的100μl磷酸盐缓冲盐水溶液中的10或50μg rNS3腹膜内免疫。在第4、6和8周对小鼠取血并分离和冷冻血清。研究完成后，如上描述的检验血清中针对重组NS3的抗体水平。用Student’s t检验(参数分析)或曼-惠特尼(非-参数分析)和软件包StatView 4.5(AbacusConcepts，Berkely，CA)比较组间rNS3的平均抗体水平。在表11中提供了利巴韦林以三种剂量加入10μg rNS3时利巴韦林的佐剂效果。在表11中提供了利巴韦林以三种剂量加入50μg rNS3时利巴韦林的佐剂效果。接受不同的10μg或50μg rNS3和不同剂量的利巴韦林的小鼠中平均rNS3抗体效价的参数比较分别在表12和13中提供。接受不同的10μg或50μg rNS3和不同剂量的利巴韦林的小鼠中平均NS3抗体效价的非参数比较分别在表14-16中提供。所给的值代表重组rNS3的终点效价。
                          表11
  利巴韦林的量(mg/剂)   免疫原量(μg/剂)   小鼠ID   在所指示的周对rNS3的抗体效价
  周4   周6   周8
  无   10   5∶1   300   1500   1500
  无   10   5∶2   ＜60   7500   1500
  无   10   5∶3   ＜60   1500   300
  无   10   5∶4   60   1500   1500
  无   10   5∶5   ＜60   1500   nt
  无   10   5∶6   60   1500   1500
  无   10   5∶7   ＜60   7500   7500
  无   10   5∶8   300   37500   7500
  组平均效价(平均值±SD)   180±139   7500±12421   3042±3076
  1   10   6∶1   300   37500   37500
  1   10   6∶2   ＜60   1500   1500
  1   10   6∶3   300   37500   187500
  1   10   6∶4   300   37500   7500
  1   10   6∶5   60   nt   nt
  1   10   6∶6   ＜60   37500   7500
  1   10   6∶7   ＜60   37500   7500
  1   10   6∶8   300   7500   7500
  组平均效价(平均值±SD)   252±107   28071±16195   36642±67565
  3   10   7∶1   60   37500   7500
  3   10   7∶2   60   37500   37500
  3   10   7∶3   300   7500   7500
  3   10   7∶4   300   37500   7500
  3   10   7∶5   300   37500   37500
  3   10   7∶6   300   37500   37500
  3   10   7∶7   60   7500   7500
  3   10   7∶8   60   37500   37500
  组平均效价(平均值±SD)   180±128   30000±13887   22500±34637
  10   10   8∶1   300   37500   37500
  10   10   8∶2   300   37500   37500
  10   10   8∶3   ＜60   300   300
  10   10   8∶4   60   7500   7500
  10   10   8∶5   ＜60   300   300
  10   10   8∶6   ＜60   37500   37500
  10   10   8∶7   ＜60   7500   7500
  10   10   8∶8   ＜60   nt   nt
  组平均效价(平均值±SD)   220±139   18300±18199   18300±18199
                          表12
  利巴韦林的量(mg/剂)   免疫原量(μg/剂)   小鼠ID   在所指示的周对rNS3的抗体效价
  周4   周6   周8
  无   50   1∶1   60   7500   7500
  无   50   1∶2   60   7500   7500
  无   50   1∶3   60   7500   7500
  无   50   1∶4   ＜60   1500   300
  无   50   1∶5   300   37500   37500
  无   50   1∶6   60   7500   7500
  无   50   1∶7   60   37500   7500
  无   50   1∶8   -   -   -
  组平均效价(平均值±SD)   100±98   15214±15380   10757±12094
  1   50   2∶1   60   7500   7500
  1   50   2∶2   300   37500   7500
  1   50   2∶3   60   187500   7500
  1   50   2∶4   60   37500   187500
  1   50   2∶5   60   37500   7500
  1   50   2∶6   60   37500   37500
  1   50   2∶7   300   37500   7500
  1   50   2∶8   300   37500   37500
  组平均效价(平均值±SD)   150±124   52500±55549   37500±62105
  3   50   3∶1   60   37500   7500
  3   50   3∶2   300   37500   37500
  3   50   3∶3   300   37500   7500
  3   50   3∶4   60   37500   7500
  3   50   3∶5   300   37500   7500
  3   50   3∶6   60   37500   7500
  3   50   3∶7   -   7500   37500
  3   50   3∶8   1500   7500   37500
  组平均效价(平均值±SD)   387±513   30000±13887   18750±15526
  10   50   4∶1   300   7500   7500
  10   50   4∶2   300   37500   37500
  10   50   4∶3   60   7500   7500
  10   50   4∶4   60   7500   7500
  10   50   4∶5   60   1500   1500
  10   50   4∶6   60   7500   37500
  10   50   4∶7   -   7500   7500
  10   50   8∶8   60   37500   7500
  组平均效价(平均值±SD)   140±124   10929±11928   387±513
                                  表13
  组   周   平均值±SD   组   平均值±SD   分析   p值
  10μgNS3/无利巴韦林   4   180±139   10μgNS3/1mg利巴韦林   252±107   student’st检验   0.4701
  6   7500±12421   28071±16195   student’st检验   0.0156*
  8   3042±3076   36642±67565   student’st检验   0.2133
  10μgNS3/无利巴韦林   4   180±139   10μgNS3/3mg利巴韦林   180±128   student’st检验   1.000
  6   7500±12421   30000±13887   student’st检验   0.0042*
  8   3042±3076   22500±34637   student’st检验   0.0077*
  10μgNS3/无   4   180±139   10μgNS3/10mg   220±139   student’st检验   0.7210
  利巴韦林   利巴韦林
  6   7500±12421   18300±18199   student’st检验   0.1974
  8   3042±3076   18300±18199   student’st检验   0.0493*
                                   表14
  组   周   平均值±SD   组   平均值±SD   分析   p值
  50μgNS3/无利巴韦林   4   100±98   50μgNS3/1mg利巴韦林   150±124   student’st检验   0.4326
  6   15214±15380   52500±55549   student’st检验   0.1106
  8   10757±12094   37500±62105   student’st检验   0.2847
  50μgNS3/无利巴韦林   4   100±98   50μgNS3/3mg利巴韦林   387±513   student’st检验   0.2355
  6   15214±15380   30000±13887   student’st检验   0.0721
  8   10757±12094   18750±15526   student’st检验   0.2915
  50μg   4   100±98   50μg   140±   student’s   0.5490
  NS3/无利巴韦林   NS3/10mg利巴韦林   124   t检验
  6   15214±15380   10929±11928   student’st检验   0.5710
  8   10757±12094   15214±15380   student’st检验   0.5579
显著性水平：NS＝不显著；*＝p＜0.05；**＝p＜0.01；***＝p＜0.001
                                    表15
  组   周   平均值±SD   组   平均值±SD   分析   p值
  10μgNS3/无利巴韦林   4   180±139   10μgNS3/1mg利巴韦林   252±107   曼-惠特尼   0.4280
  6   7500±12421   28071±16195   曼-惠特尼   0.0253*
  8   3042±3076   36642±67565   曼-惠特尼   0.0245*
  10μgNS3/无利巴韦林   4   180±139   10μgNS3/3mg利巴韦林   180±128   曼-惠特尼   0.0736
  6   7500±12421   30000±13887   曼-惠特尼   0.0050**
  8   3042±   22500±   曼-惠   0.0034**
  3076   34637   特尼
  10μgNS3/无利巴韦林   4   180±139   10μgNS3/10mg利巴韦林   220±139   曼-惠特尼   0.8986
  6   7500±12421   18300±18199   曼-惠特尼   0.4346
  8   3042±3076   18300±18199   曼-惠特尼   0.2102
                                  表16
  组   周   平均值±SD   组   平均值±SD   分析   p值
  50μgNS3/无利巴韦林   4   100±98   50μgNS3/1mg利巴韦林   150±124   曼-惠特尼   0.1128
  6   15214±15380   52500±55549   曼-惠特尼   0.0210*
  8   10757±12094   37500±62105   曼-惠特尼   0.1883
  50μgNS3/无利巴韦林   4   100±98   50μgNS3/3mg利巴韦林   387±513   曼-惠特尼   0.1400
  6   15214±15380   30000±13887   曼-惠特尼   0.0679
  8   10757±12094   18750±15526   曼-惠特尼   0.2091
  50μgNS3/无利巴韦林   4   100±98   50μgNS3/10mg利巴韦林   140±124   曼-惠特尼   0.4292
  6   15214±15380   10929±11928   曼-惠特尼   0.9473
  8   10757±12094   15214±15380   曼-惠特尼   0.6279
显著性水平：NS＝不显著；*＝p＜0.05；**＝p＜0.01；***＝p＜0.001
上面的数据表明利巴韦林促进或者增强了对HCV抗原或者HCV表位的免疫应答。用含有少至1mg利巴韦林和10μg rNS3抗原的疫苗组合物免疫后引起了针对rNS3的有效免疫应答。上面的数据还证明足够促进对抗原的免疫应答的利巴韦林的量对于25-30g Balb/c小鼠为每次注射约1到3mg。然而，应该认识到这些量仅用于指导而绝不应该被解释为对本发明范围的限制。不过，含有约1到3mg剂量利巴韦林的疫苗组合物诱导的免疫应答比不存在利巴韦林时引起的免疫应答高12倍以上。从而，利巴韦林对动物的体液免疫应答具有显著的佐剂效果，从而，增强或促进了对该抗原的免疫应答。下面的实施例描述了为了更好地理解增强或者促进对抗原的免疫应答所需的利巴韦林的量而进行的实验。
                          实施例12
为了确定足够提供佐剂效果的利巴韦林剂量，进行了下面的实验。在第一组实验中，将小鼠组(每组3只)仅用20μg rNS3或者20μg rNS3和0.1mg、1mg或10mg利巴韦林的混合物免疫。然后通过EIA确定针对该抗原的抗体水平。对在周1和3时的平均终点效价作图并在图8中显示。发现利巴韦林提供的佐剂效果根据所提供的利巴韦林的剂量而具有不同的动力学。例如，发现在第一周而不是第三周甚至低剂量(＜1mg)利巴韦林也增强抗体水平，而发现更高剂量(1-10mg)在第三周增强抗体水平。
还进行了另一组实验。在这些实验中，用含有多种量的利巴韦林和rNS3的疫苗组合物注射小鼠组并监视这些动物中的IgG应答。疫苗组合物含有约100μl磷酸盐缓冲盐水溶液和20μg rNS3与0.1mg、1.0mg或10mg利巴韦林(Sigma)或者无利巴韦林。在第六周对小鼠取血并通过前述EIA确定rNS3-特异的IgG水平。如表17中所示，对于25-30g小鼠，在每次注射1到10mg的剂量范围内对持续抗体水平的佐剂效果最明显。
                          表17
  免疫原   与免疫原混合的利巴韦林的量(mg)   小鼠ID   在所示周的rNS3IgG的终点效价
  第1周   第2周   第3周
  20μgrNS3   无   1   60   360   360
  20μgrNS3   无   2   360   360   2160
  20μgrNS3   无   3   360   2160   2160
  平均   260±173   960±1039   1560±1039
  20μgrNS3   0.1   4   2160   12960   2160
  20μgrNS3   0.1   5   60   60   60
  20μgrNS3   0.1   6   ＜60   2160   2160
  1110±1484   5060±6921   1460±1212
  20μgrNS3   1.0   7   ＜60   60   12960
  20μgrNS3   1.0   8   ＜60   2160   2160
  20μgrNS3   1.0   9   360   2160   2160
  平均   360   1460±1212   5760±6235
  20μgrNS3   10.0   10   360   12960   77760
  20μgrNS3   10.0   11   ＜60   2160   12960
  20μgrNS3   10.0   12   360   2160   2160
  平均   360   5760±6235   30960±40888
在第三组实验中，研究了首次和加强注射后利巴韦林的佐剂效果。在这些实验中，对小鼠两次腹膜内注射疫苗组合物，该疫苗组合物含有10μg rNS3与或不与利巴韦林并如前监视针对该抗原的IgG亚类应答。因此，在第0和4周用仅含有10μg重组NS3，与或不与0.1或1.0mg利巴韦林(Sigma)的100μl磷酸盐缓冲盐水免疫小鼠。在第六周对小鼠取血并通过如前描述的EIA确定NS3-特异的IgG亚类。如表18中所示，在注射前向免疫原加入利巴韦林不改变NS3-特异的免疫应答中IgG亚类应答。从而，含有利巴韦林和抗原的疫苗组合物的佐剂效果不能通过Th1/Th2-平衡的偏移来解释。似乎另一种机理负责利巴韦林的佐剂效果。
                                           表18
  免疫原   与免疫原混合的利巴韦林的量(mg)   小鼠ID              所示NS3 IgG亚类的终点效价
  IgG1   IgG2a   IgG2b   IgG3
  10μgrNS3   无   1   360   60   ＜60   60
  10μgrNS3   无   2   360   ＜60   ＜60   60
  10μgrNS3   无   3   2160   60   ＜60   360
  平均   960±1039   60   -   160±173
  10μgrNS3   0.1   4   360   ＜60   ＜60   60
  10μgrNS3   0.1   5   60   ＜60   ＜60   ＜60
  10μgrNS3   0.1   6   2160   60   60   360
  860±1136   60   60   210±212
  10μgrNS3   1.0   7   2160   ＜60   ＜60   60
  10μgrNS3   1.0   8   360   ＜60   ＜60   ＜60
  10μgrNS3   1.0   9   2160   ＜60   ＜60   60
  平均   ±   -   -   60
该实施例中给出的数据进一步证明利巴韦林可以作为佐剂施用并且确定利巴韦林的剂量可以调节佐剂效果的动力学。下面的实施例描述了另一种测定法，实施该测定法是为了评估利巴韦林增强或者促进对抗原的免疫应答的能力。
                        实施例13
该测定法可以用任何利巴韦林衍生物或者利巴韦林衍生物的组合以确定特定疫苗制剂调节细胞免疫应答的程度。为了确定对含有利巴韦林的疫苗的CD4+T细胞应答，将小鼠组用PBS中的100μg rNS3或者PBS中的100μg rNS3和1mg利巴韦林皮下免疫。免疫后10天处死小鼠并且收获并引流它们的淋巴结。然后进行体外回忆测定(见，例如，Hultgren等，J GenVirol.79：2381-91(1998)和Hultgren等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.4：630-632(1997))。在培养96h时通过[3H]胸苷的掺入确定CD4+T细胞增殖的量。
如图9中所示，用与1mg利巴韦林混合的100μg rNS3免疫的小鼠比用PBS中的100μg rNS3免疫的小鼠具有更大的T细胞增殖应答。该数据进一步证明利巴韦林增强或者促进了细胞免疫应答(例如，通过促进T细胞的有效引发)。
进行另外的实验以证实利巴韦林增强对通过商业途径可得到的制剂的免疫应答。下面的实施例描述了利巴韦林与商业HBV疫苗制剂的联合使用。
                       实施例14
试验了利巴韦林与含有HBsAg和明矾的通过商业途径可得到的疫苗(Engerix，SKB)的两剂混合时利巴韦林的佐剂效果。约0.2μg或2μgEngerix疫苗与PBS或者PBS中的1mg利巴韦林混合并将混合物腹膜内注射到小鼠组(每组3只)。在第四周给予含有相同混合物的强化疫苗并在第6周取血。将血清样品从1∶60稀释到1∶37500并通过如上面描述的EIA试验稀释，只是将纯化的人HBsAg用作固相抗原。如表19中所示，含有利巴韦林的疫苗制剂增强了对2μg现有疫苗的应答，尽管该疫苗已经含有明矾。即，通过向亚优化的疫苗剂(即，单独不诱导可检测的抗体的剂)加入利巴韦林，抗体变得可以检测，这证明加入利巴韦林允许在疫苗制剂中含有更低的抗原量而不损害免疫应答。
                                              表19
  周                                    EIA中对HBsAg的终点抗体效价
               0.02μg Engerix                  0.2μg Engerix
  无利巴韦林   1mg利巴韦林   无利巴韦林   1mg利巴韦林
  #1   #2   #3   #1   #2   #3   #1   #2   #3   #1   #2   #3
  6   ＜60   ＜60   ＜60   ＜60   ＜60   ＜60   ＜60   ＜60   ＜60   300   60   ＜60
上面实验中所用的利巴韦林来自供应商(例如，Sigma和ICN)。可以与此处描述的实施方案使用的利巴韦林也可以从供应商得到或者合成。可以制备利巴韦林和/或抗原而进行或者不进行修饰。例如，可以将利巴韦林修饰或者衍生以得到更稳定的分子和/或更有效的佐剂。通过一种方法，通过将利巴韦林分子偶联到支持体如亲水聚合物(例如，聚乙二醇)可以增强利巴韦林的稳定性。
使用合理的药物设计和组合化学中的常规技术可以产生更多利巴韦林衍生物。例如，Molecular Simulations Inc.(MSI)，以及许多其他供应商提供的软件，其使得技术人员能够构建有机分子的组合文库。例如，C2.Analog Builder程序可以与MSI的Cerius2系列分子多样性软件整合以开发可以与此处描述的实施方案使用的利巴韦林衍生物(见，例如，http：//msi.com/life/products/cerius2/index.html)。
通过一种方法，将利巴韦林的化学结构记录在计算机可读介质上并通过一种或多种建模软件应用程序存取。C2.Analog Builder程序联合C2Diversity程序允许用户基于例如每个取代基的位置的R-基团的多样性产生非常大的虚拟文库。然后具有与虚拟文库中产生的建模的利巴韦林衍生物相同的结果的化合物可以使用常规化学制备或者可以从商业来源得到。
然后可以在测定法中筛选新近生产的利巴韦林衍生物，该测定法确定该分子的佐剂活性程度和/或其调节免疫应答的能力的程度。某些测定法可以包括虚拟药物筛选软件，如C2.Ludi。C2.Ludi是软件程序，其允许用户探索分子(例如，利巴韦林衍生物)的数据库与目标蛋白质(例如，RAC2或者另一种GTP结合蛋白质)的活性部位相互作用的能力。基于用虚拟药物筛选软件发现的所预测的相互作用，可以在常规测定法中将利巴韦林衍生物以优先顺序排列，所述测定法确定佐剂活性和/或分子调节免疫应答的程度。下面的章节提供了此处描述的组合物的使用方法的更详细解释。
使用疫苗组合物和免疫原制剂的方法
此处描述的实施方案的给药途径包括，但不限于，透皮、肠胃外、胃肠、透支气管和透肺泡。通过应用例如能够允许佐剂和HCV抗原渗透皮肤的霜剂、洗剂、凝胶剂等可以完成透皮施用。施用的肠胃外途径包括，但不限于电注射或者直接注射，如直接注射到中枢静脉线、静脉内、肌内、腹膜内、皮内，或者皮下注射。施用的胃肠途径包括，但不限于，摄入和直肠的。施用的透支气管或者透肺泡包括，但不限于，吸入，其可通过嘴或者鼻内。
适于透皮施用的含有佐剂和HCV抗原的组合物包括，但不限于，药学上可接受的悬浮剂、油剂、霜剂，和软膏剂，它们直接应用于皮肤或者掺入到保护性载体，如透皮装置(“透皮贴剂”)中。适宜的霜剂、软膏剂等的实例可以例如在Physician′s Desk Reference中发现。适宜的透皮装置的实例在例如，Chinen等的1989年4月4日颁发的美国专利号4,818,540中描述。
适于肠胃外施用的含有佐剂和HCV抗原的组合物包括，但不限于药学上可接受的无菌等渗溶液。这些溶液包括，但不限于，盐水、磷酸盐缓冲盐水溶液和油制剂，它们用于注射到中枢血管线、静脉内、肌内、腹膜内、皮内，或者皮下注射。
适于透支气管和透肺泡施用的含有佐剂和HCV抗原的组合物包括，但不限于，用于吸入的多种类型的气溶胶。适于这些组合物的透支气管和透肺泡施用的装置也是实施方案。这些装置包括，但不限于，喷雾器和蒸发器。当前可利用的喷雾器和蒸发器的许多形式可易于改造后递送含有利巴韦林和抗原的疫苗。
适于胃肠施用的含有佐剂和HCV抗原的组合物包括，但不限于，药学上可接受的用于摄入的粉剂、丸剂或液体剂和用于直肠施用的栓剂。
具体地，此处描述的基因构建体可以通过包括，但不限于常规注射器、无针头注射装置，或者“微发射物轰击基因枪”的方式施用。备选地，可以通过多种方法将基因疫苗导入从该个体分离的细胞。这些方法包括，例如，体外转染、电穿孔、微注射和微发射物轰击。基因构建体被细胞摄入后，将这些细胞再移植到该个体中。预期掺入基因构建体的非免疫原性细胞可以掺入到该个体中，即使被接种的细胞最初来自另一个个体。
根据一些实施方案，使用无针头注射装置对个体施用基因构建体。根据一些实施方案，使用无针头注射装置将基因构建体皮内、皮下和肌内地同时施用于个体。无针头注射装置是众所周知的并且容易得到。本领域技术人员按照本文的教导可以施用无针头注射装置将个体的细胞的遗传物质递送到所有组织。这些装置尤其用于将遗传物质递送到皮肤和肌肉细胞。在某些实施方案中，无针头注射装置可用于将含有DNA分子的液体推进到个体皮肤的表面。以足够的速度推进该液体从而当撞击皮肤时液体透过皮肤的表面，透入皮肤和下面的肌肉组织。从而，该同时皮内、皮下和肌内地施用该遗传物质。在某些实施方案中，无针头注射装置可用于将遗传物质递送到其他器官的组织以便将核酸分子导入该器官的细胞。
优选的实施方案涉及治疗或预防HCV感染的方法。在这些实施方案中，对需要的动物提供了HCV抗原(例如，肽抗原或者基于核酸的抗原，如本文描述(SEQ.ID.NOs.：1-27和35-36))和一定量的佐剂，其足够在所述动物中显示出佐剂活性。因此，通过使用当前可利用的诊断检验或者临床评估可以将动物鉴定为需要的动物。佐剂和抗原可以单独或者联合提供，并且对需要的动物还可以提供其他佐剂(例如，油、明矾，或者增强免疫应答其他试剂)。
本发明的其他实施方案包括通过对需要的动物提供一定量的佐剂(例如，利巴韦林)和SEQ.ID.NOs.：1-11和35-36的，或者其片段，优选SEQ.ID.NOs.：12-27的一种或多种来增强对HCV抗原的免疫应答的方法，其中所述佐剂有效增强所述免疫应答。在这些实施方案中，通过使用当前可利用的诊断检验或者临床评估鉴定需要对抗原的增强的免疫应答的动物。例如，通过一种方法，对未受感染的个体提供上述疫苗组合物，其用量足够引起针对NS3的细胞和体液免疫应答从而保护所述个体不受HCV的感染。在另一实施方案中，鉴定了HCV-感染的个体并提供了含有利巴韦林和NS3的疫苗组合物，其剂量足够引起针对NS3的细胞和体液免疫应答从而减小或者消除HCV感染。该个体可能处于感染的慢性或者急性期。在另一实施方案中，对患有HCV的HCV-感染的个体提供含有佐剂和NS3/4A融合基因的组合物，其剂量足够引起针对表达NS3的肿瘤细胞的细胞和体液免疫应答。
尽管参考实施方案和实施例描述了本发明，但是应该理解可以做出多种修改而不背离本发明的精神。因此，本发明仅被下面的权利要求所限制。
                                  序列表
<110>三肽公司
     马蒂·萨尔贝里
<120>丙型肝炎非结构NS3/4A融合基因
<130>TRIPEP.028QPC
<150>US 10/307,047
<151>2002-11-26
<160>38
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>2061
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>丙型肝炎病毒NS3/4A编码区
<400>1
atggcgccta tcacggccta tgcccagcag acaaggggcc ttttgggatg cataatcacc 60
agcttgaccg gccgggacaa aaaccaggtg gagggtgagg ttcagatcgt gtcaactgct 120
gcccagactt tcttggcaac ctgcattaac ggggtgtgtt ggactgtcta ccatggagcc 180
ggaacaagga ccattgcgtc acctaagggt cctgttatcc agatgtacac caatgtggac 240
caagacctcg taggctggcc cgctccccaa ggtgcccgct cattaacacc atgcacttgc 300
ggctcctcgg acctttacct ggtcacgagg cacgccgatg tcattcctgt gcgccgacgg 360
ggtgatggca ggggcagcct gctttcgccc cggcctatct cttacttgaa aggctcctcg 420
ggaggccctc tgctgtgccc cgcaggacat gccgtaggca tattcagagc cgcggtatgc 480
acccgtggag tggctaaggc ggtggacttc atccccgtag agagcttaga gacaaccatg 540
aggtccccgg tgttctcaga caactcctcc ccaccagcag tgccccagag ctaccaagtg 600
gcccacctgc atgctcccac cggcagcggt aagagcacca aggtcccggc cgcatacgca 660
gctcagggct acaaggtgct ggtgctcaac ccctccgttg ctgcaacaat gggctttggt 720
gcttacatgt ccaaggccca tgggattgat cctaacatca ggactggggt gaggacaatt 780
actactggca gcccgatcac gtattccacc tacggcaagt tccttgccga cggcgggtgt 840
tcagggggtg cttatgacat aataatttgt gacgagtgcc actccacgga tgcaacatcc 900
atcttgggca ttggcactgt ccttgaccaa gcagagaccg cgggggcgag actgactgtg 960
ctcgccaccg ctacccctcc gggctccgtc actgtgcccc atcctaacat cgaggaggtt 1020
gctctgtcca ctaccggaga gatccccttt tatggcaagg ctattcccct tgaagcaatt 1080
aaggggggga gacatctcat cttctgccac tcaaagaaga agtgcgacga gctcgccgca 1140
aaactggtcg cgttgggcgt caatgccgtg gcttactacc gcggccttga tgtgtccgtc 1200
atcccgacca gtggtgacgt tgtcgtcgtg gcaactgacg ccctcatgac cggctttacc 1260
ggcgacttcg attcggtgat agactgcaac acgtgtgtca cccagacagt cgacttcagc 1320
cttgacccta ccttcaccat tgagacaatc acgcttcccc aggatgctgt ctcccgtact 1380
caacgtcggg gtaggactgg cagagggaag ccaggcatct acagatttgt ggcaccgggg 1440
gagcgtcctt ctggcatgtt tgactcgtct gtcctctgcg agtgctatga cgcgggttgt 1500
gcttggtatg agcttacgcc cgccgagacc acagttaggc tacgagcata catgaacacc 1560
ccgggacttc ccgtgtgcca agaccatctt gaattttggg agggcgtctt tacgggtctc 1620
acccacatag acgcccactt cctatcccag acaaagcaga gtggggaaaa ccttccctat 1680
ctggtagcgt accaagccac cgtgtgcgct agagctcaag cccctccccc gtcgtgggac 1740
cagatgtgga agtgcttgat ccgtctcaag cccaccctcc atgggccaac acctctgcta 1800
tatagactgg gcgctgtcca gaatgaagtc accctgacgc acccagtcac caagtatatc 1860
atgacatgta tgtcggctga cctggaggtc gtcacgagta cctgggtgct cgttggcggc 1920
gttctggctg ctttggccgc gtattgccta tccacaggct gcgtggtcat agtaggtagg 1980
attgtcttgt ccggaaagcc ggcaatcata cccgacaggg aagtcctcta ccgggagttc 2040
gatgaaatgg aagagtgctg a                                           2061
<210>2
<211>686
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>2
Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly
 1               5                  10                  15
Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
        35                  40                  45
Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
    50                  55                  60
Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp
65                  70                  75                  80
Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
            100                 105                 110
Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
        115                 120                 125
Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys
145                 150                 155                 160
Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
                165                 170                 175
Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
            180                 185                 190
Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
    210                 215                 220
Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
            260                 265                 270
Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
        275                 280                 285
Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
    290                 295                 300
Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
                325                 330                 335
Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly
            340                 345                 350
Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
        355                 360                 365
Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
    370                 375                 380
Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val
385                 390                 395                 400
Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
                405                 410                 415
Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
            420                 425                 430
Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
        435                 440                 445
Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
    450                 455                 460
Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly
465                 470                 475                 480
Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
                485                 490                 495
Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
            500                 505                 510
Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
        515                 520                 525
His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
    530                 535                 540
Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr
545                 550                 555                 560
Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
                565                 570                 575
Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
            580                 585                 590
Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
        595                 600                 605
Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
    610                 615                 620
Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly
625                 630                 635                 640
Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
                645                 650                 655
Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp
            660                 665                 670
Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
        675                 680                 685
<210>3
<21l>686
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A
<400>3
Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly
 1               5                  10                  15
Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
        35                  40                  45
Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
    50                  55                  60
Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp
65                  70                  75                  80
Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
            100                 105                 110
Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
        115                 120                 125
Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys
145                 150                 155                 160
Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
                165                 170                 175
Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
            180                 185                 190
Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
    210                 215                 220
Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
            260                 265                 270
Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
        275                 280                 285
Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
    290                 295                 300
Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
                325                 330                 335
Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly
            340                 345                 350
Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
        355                 360                 365
Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
    370                 375                 380
Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val
385                 390                 395                 400
Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
                405                 410                 415
Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
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Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
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Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
    450                 455                 460
Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly
465                 470                 475                 480
Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
                485                 490                 495
Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
            500                 505                 510
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<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A
<400>4
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<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A
<400>10
Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly
 1               5                  10                  15
Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
        35                  40                  45
Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
    50                  55                  60
Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp
65                  70                  75                  80
Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
            100                 105                 110
Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
        115                 120                 125
Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys
145                 150                 155                 160
Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
                165                 170                 175
Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
            180                 185                 190
Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
    210                 215                 220
Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
            260                 265                 270
Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
        275                 280                 285
Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
    290                 295                 300
Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
                325                 330                 335
Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly
            340                 345                 350
Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
        355                 360                 365
Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
    370                 375                 380
Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val
385                 390                 395                 400
Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
                405                 410                 415
Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Ash Thr Cys
            420                 425                 430
Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
        435                 440                 445
Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
    450                 455                 460
Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly
465                 470                 475                 480
Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
                485                 490                 495
Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
            500                 505                 510
Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
        515                 520                 525
His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
    530                 535                 540
Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr
545                 550                 555                 560
Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
                565                 570                 575
Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
            580                 585                 590
Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
        595                 600                 605
Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
    610                 615                 620
Ser Ala Asp Leu Glu Val Ser Ser Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly
625                 630                 635                 640
Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
                645                 650                 655
Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp
            660                 665                 670
Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
        675                 680                 685
<210>11
<211>686
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A
<400>11
Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly
 1               5                  10                  15
Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
        35                  40                  45
Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
    50                  55                  60
Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp
65                  70                  75                  80
Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
            100                 105                 110
Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
        115                 120                 125
Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys
145                 150                 155                 160
Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
                165                 170                 175
Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
            180                 185                 190
Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
    210                 215                 220
Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
            260                 265                 270
Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
        275                 280                 285
Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
    290                 295                 300
Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
                325                 330                 335
Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly
            340                 345                 350
Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
        355                 360                 365
Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
    370                 375                 380
Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val
385                 390                 395                 400
Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
                405                 410                 415
Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
            420                 425                 430
Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
        435                 440                 445
Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
    450                 455                 460
Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly
465                 470                 475                 480
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                485                 490                 495
Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
            500                 505                 510
Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
        515                 520                 525
His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
    530                 535                 540
Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr
545                 550                 555                 560
Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
                565                 570                 575
Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
            580                 585                 590
Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
        595                 600                 605
Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
    610                 615                 620
Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly
625                 630                 635                 640
Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
                645                 650                 655
Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp
            660                 665                 670
Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
        675                 680                 685
<210>12
<211>632
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>丙型肝炎病毒NS3肽
<400>12
Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly
 1               5                  10                  15
Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
        35                  40                  45
Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
    50                  55                  60
Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp
65                  70                  75                  80
Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
            100                 105                 110
Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
        115                 120                 125
Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys
145                 150                 155                 160
Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
                165                 170                 175
Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
            180                 185                 190
Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
    210                 215                 220
Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
            260                 265                 270
Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
        275                 280                 285
Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
    290                 295                 300
Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
                325                 330                 335
Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly
            340                 345                 350
Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
        355                 360                 365
Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
    370                 375                 380
Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val
385                 390                 395                 400
Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
                405                 410                 415
Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
            420                 425                 430
Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
        435                 440                 445
Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
    450                 455                 460
Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly
465                 470                 475                 480
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                485                 490                 495
Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
            500                 505                 510
Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
        515                 520                 525
His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
    530                 535                 540
Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr
545                 550                 555                 560
Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
                565                 570                 575
Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
            580                 585                 590
Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
        595                 600                 605
Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
    610                 615                 620
Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr
625                 630
<210>13
<211>54
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>丙型肝炎病毒NS4A肽
<400>13
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<210>14
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<220>
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<400>14
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            20                  25
<210>15
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>15
Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val
 1               5                  10
<210>16
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>16
Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Gly
 1               5                  10                  15
Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
            20                  25
<210>17
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>17
Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Gly
 1               5                  10                  15
Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
            20                  25
<210>18
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>18
Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Pro
 1               5                  10                  15
Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
            20                  25
<210>19
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>19
Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Pro
 1               5                  10                  15
Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
            20                  25
<210>20
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>20
Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Arg Pro
 1               5                  10                  15
Ala Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
            20                  25
<210>21
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>21
Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Cys Ser
 1               5                  10                  15
Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
            20                  25
<210>22
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>22
Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Cys Cys Ser
 1               5                  10                  15
Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
            20                  25
<210>23
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>23
Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Ser Ser Ser
 1               5                  10                  15
Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
            20                  25
<210>24
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>24
Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser
 1               5                  10                  15
Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
            20                  25
<210>25
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS3/4A肽
<400>25
Thr Lys Tyr Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Val Val Val Val Thr Ser
 1               5                  10                  15
Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu
            20                  25
<210>26
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变丙型肝炎病毒NS5A/B肽
<400>26
Ser Ser Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Trp Val Leu Val Gly Gly
 1               5                  10                  15
Val Leu
<210>27
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>丙型肝炎病毒NS5肽
<400>27
Ala Ser Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly
 1               5                  10                  15
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆寡核苷酸
<400>28
ccgtctagat cagcactctt ccatttcatc                                  30
<210>29
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆寡核苷酸
<400>29
cctgaattca tggcgcctat cacggcctat                                  30
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆寡核苷酸
<400>30
ccacgcggcc gcgacgacct acag                                        24
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆寡核苷酸
<400>31
ctggaggtcg tcacgcctac ctgggtgctc gtt                              33
<210>32
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆寡核苷酸
<400>32
accgagcacc caggtaggcg tgacgacctc cag                              33
<210>33
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆寡核苷酸
<400>33
ctggaggtcg tccgcggtac ctgggtgctc gtt                               33
<210>34
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>克隆寡核苷酸
<400>34
accgagcacc caggtaccgc ggacgacctc cag                               33
<210>35
<211>2078
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密码子优化的丙型肝炎病毒NS3/4A编码区
<221>CDS
<222>(12)...(2072)
<400>35
gaattcgcac c atg gcc ccc atc acc gcc tac gcc cag cag acc cgc ggc   50
             Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly
              1               5                   10
ctg ctg ggc tgc atc atc acc agc ctg acc ggc cgc gac aag aac cag    98
Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln
     15                  20                  25
gtg gag ggc gag gtg cag atc gtg agc acc gcc gcc cag acc ttc ctg    146
Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu
 30                  35                  40                  45
gcc acc tgc atc aac ggc gtg tgc tgg acc gtg tac cac ggc gcc ggc    194
Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly
                 50                  55                  60
acc cgc acc atc gcc agc ccc aag ggc ccc gtg atc cag atg tac acc    242
Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr
             65                  70                  75
aac gtg gac cag gac ctg gtg ggc tgg ccc gcc ccc cag ggc gcc cgc    290
Ash Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg
         80                  85                  90
agc ctg acc ccc tgc acc tgc ggc agc agc gac ctg tac ctg gtg acc    338
Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr
     95                 100                 105
cgc cac gcc gac gtg atc ccc gtg cgc cgc cgc ggc gac ggc cgc ggc    386
Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly
110                 115                 120                 125
agc ctg ctg agc ccc cgc ccc atc agc tac ctg aag ggc agc agc ggc    434
Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly
                130                 135                 140
ggc ccc ctg ctg tgc ccc gcc ggc cac gcc gtg ggc atc ttc cgc gcc    482
Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala
            145                 150                 155
gcc gtg tgc acc cgc ggc gtg gcc aag gcc gtg gac ttc atc ccc gtg    530
Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val
        160                 165                 170
gag agc ctg gag acc acc atg cgc agc ccc gtg ttc agc gac aac agc    578
Glu Ser Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser
    175                 180                 185
agc ccc ccc gcc gtg ccc cag agc tac cag gtg gcc cac ctg cac gcc    626
Ser Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala
190                 195                 200                 205
ccc acc ggc agc ggc aag agc acc aag gtg ccc gcc gcc tac gcc gcc    674
Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala
                210                 215                 220
cag ggc tac aag gtg ctg gtg ctg aac ccc agc gtg gcc gcc acc atg    722
Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met
            225                 230                 235
ggc ttc ggc gcc tac atg agc aag gcc cac ggc atc gac ccc aac atc    770
Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile
        240                 245                 250
cgc acc ggc gtg cgc acc atc acc acc ggc agc ccc atc acc tac agc    818
Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser
    255                 260                 265
acc tac ggc aag ttc ctg gcc gac ggc ggc tgc agc ggc ggc gcc tac    866
Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr
270                 275                 280                 285
gac atc atc atc tgc gac gag tgc cac agc acc gac gcc acc agc atc    914
Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile
                290                 295                 300
ctg ggc atc ggc acc gtg ctg gac cag gcc gag acc gcc ggc gcc cgc    962
Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg
            305                 310                 315
ctg acc gtg ctg gcc acc gcc acc ccc ccc ggc agc gtg acc gtg ccc    1010
Leu Thr Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro
        320                 325                 330
cac ccc aac atc gag gag gtg gcc ctg agc acc acc ggc gag atc ccc    1058
His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro
    335                 340                 345
ttc tac ggc aag gcc atc ccc ctg gag gcc atc aag ggc ggc cgc cac    1106
Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His
350                 355                 360                 365
ctg atc ttc tgc cac agc aag aag aag tgc gac gag ctg gcc gcc aag    1154
Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys
                370                 375                 380
ctg gtg gcc ctg ggc gtg aac gcc gtg gcc tac tac cgc ggc ctg gac    1202
Leu Val Ala Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp
            385                 390                 395
gtg agc gtg atc ccc acc agc ggc gac gtg gtg gtg gtg gcc acc gac    1250
Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp
        400                 405                 410
gcc ctg atg acc ggc ttc acc ggc gac ttc gac agc gtg atc gac tgc    1298
Ala Leu Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys
    415                 420                 425
aac acc tgc gtg acc cag acc gtg gac ttc agc ctg gac ccc acc ttc    1346
Ash Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe
430                 435                 440                 445
acc atc gag acc atc acc ctg ccc cag gac gcc gtg agc cgc acc cag    1394
Thr Ile Glu Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln
                450                 455                 460
cgc cgc ggc cgc acc ggc cgc ggc aag ccc ggc atc tac cgc ttc gtg    1442
Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val
            465                 470                 475
gcc ccc ggc gag cgc ccc agc ggc atg ttc gac agc agc gtg ctg tgc    1490
Ala Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys
        480                 485                 490
gag tgc tac gac gcc ggc tgc gcc tgg tac gag ctg acc ccc gcc gag    1538
Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu
    495                 500                 505
acc acc gtg cgc ctg cgc gcc tac atg aac acc ccc ggc ctg ccc gtg    1586
Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val
510                 515                 520                 525
tgc cag gac cac ctg gag ttc tgg gag ggc gtg ttc acc ggc ctg acc    1634
Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr
                530                 535                 540
cac atc gac gcc cac ttc ctg agc cag acc aag cag agc ggc gag aac    1682
His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn
            545                 550                 555
ctg ccc tac ctg gtg gcc tac cag gcc acc gtg tgc gcc cgc gcc cag    1730
Leu Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln
        560                 565                 570
gcc ccc ccc ccc agc tgg gac cag atg tgg aag tgc ctg atc cgc ctg    1778
Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu
    575                 580                 585
aag ccc acc ctg cac ggc ccc acc ccc ctg ctg tac cgc ctg ggc gcc   1826
Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala
590                 595                 600                 605
gtg cag aac gag gtg acc ctg acc cac ccc gtg acc aag tac atc atg   1874
Val Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met
                610                 615                 620
acc tgc atg agc gcc gac ctg gag gtg gtg acc agc acc tgg gtg ctg   1922
Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu
            625                 630                 635
gtg ggc ggc gtg ctg gcc gcc ctg gcc gcc tac tgc ctg agc acc ggc   1970
Val Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly
        640                 645                 650
tgc gtg gtg atc gtg ggc cgc atc gtg ctg agc ggc aag ccc gcc atc   2018
Cys Val Val Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile
    655                 660                 665
atc ccc gac cgc gag gtg ctg tac cgc gag ttc gac gag atg gag gag   2066
Ile Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu
670                 675                 680                 685
tgc tga tctaga                                                    2078
Cys  *
<210>36
<211>686
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>密码子优化的丙型肝炎病毒NS3/4A编码区
<400>36
Met Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly
 1               5                  10                  15
Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly
            20                  25                  30
Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys
        35                  40                  45
Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr
    50                  55                  60
Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp
65                  70                  75                  80
Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
            100                 105                 110
Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Gly Arg Gly Ser Leu Leu
        115                 120                 125
Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys
145                 150                 155                 160
Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Leu
                165                 170                 175
Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro
            180                 185                 190
Ala Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr
    210                 215                 220
Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly
            260                 265                 270
Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile
        275                 280                 285
Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile
    290                 295                 300
Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn
                325                 330                 335
Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly
            340                 345                 350
Lys Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe
        355                 360                 365
Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala
    370                 375                 380
Leu Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val
385                 390                 395                 400
Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met
                405                 410                 415
Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys
            420                 425                 430
Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
        435                 440                 445
Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly
    450                 455                 460
Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly
465                 470                 475                 480
Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr
                485                 490                 495
Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
            500                 505                 510
Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp
        515                 520                 525
His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp
    530                 535                 540
Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr
545                 550                 555                 560
Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro
                565                 570                 575
Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr
            580                 585                 590
Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn
        595                 600                 605
Glu Val Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met
    610                 615                 620
Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly
625                 630                 635                 640
Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val
                645                 650                 655
Ile Val Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp
            660                 665                 670
Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys
        675                 680                 685
<210>37
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工肽，NS3/4A H-2D结合肽
<400>37
Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu
 1               5
<210>38
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工肽，H-2D控制肽
<400>38
Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met
 1               5
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.一种纯化或分离的核酸，其含有SEQ.ID.NO.：35的序列的至少30个连续核苷酸或者其互补序列。
2.权利要求1的纯化或分离的核酸，其中所述核酸含有SEQ.ID.NO.：35的序列。
3.权利要求1的纯化或分离的核酸，其中所述核酸由SEQ.ID.NO.：35的序列组成。
4.权利要求1的核酸，其含有至少50个连续核苷酸。
5.权利要求1的核酸，其含有至少100个连续核苷酸。
6.权利要求1的核酸，其含有至少200个连续核苷酸。
7.权利要求1的核酸，其含有至少500个连续核苷酸。
8.一种纯化或分离的核酸，其编码SEQ.ID.NO.：36的氨基酸序列。
9.含有权利要求1的核酸的载体。
10.含有权利要求1的核酸的细胞。
11.一种纯化或分离的肽，其含有SEQ.ID.NO.：36的序列的至少30个连续氨基酸。
12.一种纯化或分离的肽，其含有SEQ.ID.NO.：36的氨基酸序列。
13.一种纯化或分离的肽，其由SEQ.ID.NO.：36的氨基酸序列组成。
14.权利要求12的肽，其含有至少35个连续氨基酸。
15.权利要求12的肽，其含有至少40个连续氨基酸。
16.权利要求12的肽，其含有至少45个连续氨基酸。
17.权利要求12的肽，其含有至少50个连续氨基酸。
18.含有权利要求1、2、3、4、5、6、7或8的核酸和药学上可接受的载体的药物组合物。
19.权利要求18的药物组合物，其还含有佐剂。
20.权利要求19的药物组合物，其中所述佐剂是利巴韦林。
21.含有权利要求11、12、13、14、15、16或17中的任一种肽的药物组合物。
22.权利要求21的药物组合物，其还含有佐剂。
23.权利要求22的药物组合物，其中所述佐剂是利巴韦林。
24.一种制备免疫原制剂的方法，该方法包括：
提供利巴韦林；
提供SEQ.ID.NO.：35的核酸；和
将所述利巴韦林和所述核酸组合以便配制所述免疫原制剂。
25.一种制备免疫原制剂的方法，该方法包括：
提供利巴韦林；
提供SEQ.ID.NO.：36的肽；和
将所述利巴韦林和所述肽组合以便配制所述免疫原制剂。
26.一种制备免疫原制剂的方法，该方法包括：
提供利巴韦林；
提供SEQ.ID.NO.：35的核酸或者其长度为至少30个连续核苷酸的片段；和
将所述利巴韦林和所述核酸组合以便配制所述免疫原制剂。
27.一种制备免疫原制剂的方法，该方法包括：
提供利巴韦林；
提供SEQ.ID.NO.：36的核酸或者其长度为至少10个连续氨基酸的片段；和
将所述利巴韦林和所述核酸组合以便配制所述免疫原制剂。
28.一种改进的丙型肝炎病毒免疫原制剂，其中该改进包括含有SEQ.ID.NO.：35的序列的至少30个连续核苷酸的核酸。
29.权利要求28的免疫原制剂，其中所述改进包括由SEQ.ID.NO.：35的序列组成的核酸。
30.权利要求28的免疫原制剂，其中所述改进包括含有SEQ.ID.NO.：35的序列的核酸。
31.权利要求1的核酸在制备HCV抗病毒组合物中的应用。
32.权利要求12的肽在制备HCV抗病毒组合物中的应用。
33.含有权利要求1的核酸的组合物。
34.含有权利要求2的核酸的组合物。
35.含有权利要求3的核酸的组合物。
36.含有权利要求8的核酸的组合物。
37.含有权利要求11的肽的组合物。
38.含有权利要求12的核酸的组合物。
39.含有权利要求13的核酸的组合物。

Claims (36)

1.一种纯化或分离的核酸，其含有SEQ.ID.NO.：35的序列的至少9个连续核苷酸，用于HCV抗病毒药物。
2.权利要求1的纯化或分离的核酸，其中所述核酸含有SEQ.ID.NO.：35的序列。
3.权利要求1的纯化或分离的核酸，其中所述核酸由SEQ.ID.NO.：35的序列组成。
4.权利要求1的核酸，其含有至少12个连续核苷酸。
5.权利要求1的核酸，其含有至少18个连续核苷酸。
6.权利要求1的核酸，其含有至少21个连续核苷酸。
7.权利要求1的核酸，其含有至少24个连续核苷酸。
8.一种纯化或分离的核酸，其编码SEQ.ID.NO.：36的氨基酸序列。
9.含有权利要求1的核酸的载体。
10.含有权利要求1的核酸的细胞。
11.一种纯化或分离的肽，其含有SEQ.ID.NO.：36的序列的至少9个连续氨基酸。
12.一种纯化或分离的肽，其含有SEQ.ID.NO.：36的氨基酸序列，用于HCV抗病毒药物。
13.一种纯化或分离的肽，其由SEQ.ID.NO.：36的氨基酸序列组成，用于HCV抗病毒药物。
14.权利要求12的肽，其含有至少12个连续氨基酸。
15.权利要求12的肽，其含有至少15个连续氨基酸。
16.权利要求12的肽，其含有至少18个连续氨基酸。
17.权利要求12的肽，其含有至少21个连续氨基酸。
18.含有权利要求1的核酸和药学上可接受的载体的药物组合物。
19.权利要求18的药物组合物，其还含有佐剂。
20.权利要求19的药物组合物，其中所述佐剂是利巴韦林。
21.含有权利要求11或12的肽中任何一种的药物组合物。
22.权利要求21的药物组合物，其还含有佐剂。
23.权利要求22的药物组合物，其中所述佐剂是利巴韦林。
24.一种增强对丙型肝炎抗原的免疫应答的方法，该方法包括：
鉴定需要增强对丙型肝炎抗原的免疫应答的动物；和
为所述动物提供含有利巴韦林和SEQ.ID.NO.：35的核酸的组合物。
25.一种增强对丙型肝炎抗原的免疫应答的方法，该方法包括：
鉴定需要增强对丙型肝炎抗原的免疫应答的动物；和
为所述动物提供含有利巴韦林和SEQ.ID.NO.：36的肽的组合物。
26.一种增强对丙型肝炎抗原的免疫应答的方法，该方法包括：
鉴定需要增强对丙型肝炎抗原的免疫应答的动物；和
为所述动物提供含有利巴韦林和SEQ.ID.NO.：35的至少9个连续核酸的组合物。
27.一种增强对丙型肝炎抗原的免疫应答的方法，该方法包括：
鉴定需要增强对丙型肝炎抗原的免疫应答的动物；和
为所述动物提供含有利巴韦林和SEQ.ID.NO.：36的肽或者其长度至少为10个连续氨基酸的片段的组合物。
28.一种制备免疫原制剂的方法，该方法包括：
提供利巴韦林；
提供SEQ.ID.NO.：35的核酸；和
将所述利巴韦林和所述核酸组合以便配制所述免疫原制剂。
29.一种制备免疫原制剂的方法，该方法包括：
提供利巴韦林；
提供SEQ.ID.NO.：36的肽；和
将所述利巴韦林和所述肽组合以便配制所述免疫原制剂。
30.一种制备免疫原制剂的方法，该方法包括：
提供利巴韦林；
提供SEQ.ID.NO.：35的核酸或者其长度为至少25个连续核苷酸的片段；和
将所述利巴韦林和所述核酸组合以便配制所述免疫原制剂。
31.一种制备免疫原制剂的方法，该方法包括：
提供利巴韦林；
提供SEQ.ID.NO.：36的核酸或者其长度为至少10个连续氨基酸的片段；和
将所述利巴韦林和所述核酸组合以便配制所述免疫原制剂。
32.一种改进的丙型肝炎病毒免疫原制剂，其中该改进包括含有SEQ.ID.NO.：35的序列的至少9个连续核苷酸的核酸。
33.权利要求32的免疫原制剂，其中所述改进包括由SEQ.ID.NO.：35的序列组成的核酸。
34.权利要求32的免疫原制剂，其中所述改进包括含有SEQ.ID.NO.：35的序列的核酸。
35.权利要求1的核酸在制备HCV抗病毒药物中的应用。
36.权利要求12的肽在制备HCV抗病毒药物中的应用。
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