CN1741814A - 修饰的钠尿化合物、缀合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了修饰的钠尿化合物及其缀合物。特别地，提供了hBNP的缀合物形式，所述缀合物包括至少一个附着到其上的修饰部分。所述修饰的钠尿化合物缀合物保持刺激cGMP产生、结合到NPR－A受体的活性，并且在一些实施方案中与非修饰的对应钠尿化合物相比具有提高了的在循环中的半衰期。可制备用于心脏状况特别是充血性心力衰竭的治疗和/或疗法的口服、肠胃外、皮下和静脉内形式的化合物和缀合物。也公开了包含具有各种长度和构型的寡聚结构的修饰部分。也公开了具有不同于天然序列的氨基酸序列的所述钠尿化合物的类似物。

Description

修饰的钠尿化合物、缀合物及其应用
1.与相关申请的交叉引用
本申请基于并且要求2002年11月26日提交的美国临时申请序号60/429,151的优先权，其全部内容此处引用作为参考。
2.政府资助声明
本发明在由NIH Grant#1 R43 HL074529-01资助研究项目下获得政府资助。美国政府对本发明拥有一定的权利。
3.发明领域
本发明涉及钠尿化合物缀合物和各种钠尿化合物和它们在治疗充血性心脏病和与此相关的状况中的用途的领域。例如，本发明的组合物提供具有药理学活性的钠尿试剂和前体药物，所述钠尿试剂和前体药物可用于配制适合口服、经鼻、静脉内或皮下施用的制剂。本发明也提供了制备钠尿化合物缀合物、化合物和包含它们的制剂的方法以及使用这些缀合物和化合物的方法。如例子显示，所述钠尿化合物缀合物包含钠尿肽，所述钠尿肽包含NPR-A结合基元、至少一个修饰部分缀合位点，并且还包括至少一个附着于所述修饰部分缀合位点的修饰部分。在一些实施例方案中，所述化合物缀合物保留了天然钠尿肽的药理学活性并且具有增强的特征，例如提高的生物利用率、增强的对蛋白酶解活性的抗性和/或在血流中延长的活性。在其它实施方案中，所述化合物缀合物以可水解的前体药物提供，所述可水解的前体药物可能在相对于天然钠尿肽的前体药物形式中具有降低的药理学活性，并且一旦前体药物在体内水解，活性钠尿化合物就释放出来。
本发明也涉及重组肽和蛋白以及制备这些重组肽和蛋白的方法的领域。特别地，此处公开钠尿肽和蛋白的类似物。本发明的钠尿化合物类似物在一些实施方案中被描述为具有至少一个相对于对应的钠尿肽的天然序列取代的氨基酸的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的钠尿化合物类似物可能被描述为具有天然脑型钠尿肽(BNP)、特别是人BNP(hBNP)、尿舒张肽、犬脑钠尿肽(cBNP)、心房钠尿肽(ANP)、特别是人ANP(hANP)、树眼镜蛇属钠尿肽(DNP)或C-型钠尿肽(CNP)、特别是人CNP(hCNP)的药理学活性。
4.发明背景
心血管疾病在美国构成了无论性别或种族的死亡的头号原因。在这些疾病中，充血性心力衰竭(CHF)是仅有的一个流行趋势增加的疾病(Massie和Shah 1997；Packer和Cohn 1999)。根据AmericanHeart Association，从1979年到1999年，由CHF造成的医院出院人数和死亡人数都上升了大致2.5倍。目前，大约5百万美国人已经被诊断为患有CHF，并且每年有大约550,000新发病例(AmericanHeart Association 2001)。这个威胁生命的状况伴随着巨大的财政影响。事实上，它造成单个最大的医疗保险开支(Kayser 2002)。治疗CHF的直接和间接费用据估计已高达560亿美元(Hussar 2002)。治疗HF的住院开支超过治疗各种形式癌症加在一起的开支的二倍(O’Connell和Bristow 1994)。
CHF是造成死亡的常见原因，伴随着用于治疗的间接高费用，并且具有高死亡率。一旦患者已被诊断为患有CHF，一年期死亡率是大约20％(American Heart Association 2001)。因同种状况再住院的概率非常高，并且近年来已经进行了数个关于再住院的研究(Chin和Goldman 1997；Krumholz，Parent等人，1997；Krumholz，Chen等人，2000)。在一年诊断期内再住院率超过35％是一般的(Tsuchihashi，Tsutsui等人，2000)。这种经常的反复导致多次紧急护理就诊和病人住院治疗(Krumholz，Parent等人，1997)。多次住院治疗和不充足的治疗方法表明了那些患有CHF的患者目前所面临的状况。
近来随机性的研究显示基于家庭的介入可潜在地减少再住院率，延长存活时间和提高患有CHF的患者的生活质量(Stewart，Marley等人，1999)。在着眼于社会经济因素的独立研究中，Tsuchihashi等人得出结论认为为了降低死亡率和降低涉及CHF的总体费用需要门诊病人和基于家庭的护理两者(Tsuchihashi，Tsutsui等人，2001)。很明显，在这个增长的市场上极其需要可用于基于门诊病人的具有广泛应用的新治疗法。
脑型钠尿肽(BNP)是一种参与心血管、肾脏和内分泌体内稳态的肽家族的成员。它于1988年被发现(Sudoh，Kangawa等人，1988)，几乎在心房钠尿肽(ANP)发现后十年被发现。尽管它首先是从猪脑中分离出来，但因其对血管平滑肌和内皮细胞上的受体的活性而闻名。BNP是由心脏产生的内源性肽。首先其以前BNP原(prepro-BNP)形式产生并且随后经两次截短变成活性形式，形成具有一个二硫键的32个氨基酸的肽。
如图1所示，BNP与细胞表面的一种膜结合蛋白钠尿肽受体A(NPR-A)相结合。这种结合触发细胞溶胶中由鸟苷酸环化酶催化的cGMP合成。正是通过此第二信使，BNP实现其相关的心血管、肾脏、内分泌方面的作用。可通过几种不同的方式完成对BNP的调控。结合到NPR-A并刺激cGMP产生的BNP分子可从循环中排除，但存在其他不引发响应而排除BNP的方式。最普通的排除方式是通过结合清除受体钠尿肽受体C(NPR-C)。与NPR-C结合后，肽被摄入细胞然后被酶促切割。第二种主要的清除方式是被中性内肽酶(NEP)降解，这是一种细胞表面的膜结合酶。最后，小部分的BNP经肾脏过滤排除。
在正常条件下，小量的BNP在心房和心室中产生。但是，当心失代偿过程中心室被拉伸时，产生的BNP量有很大增加。虽然心房也参与，但心室成为主要的产生位点。心脏产生BNP来响应在CHF发作的失代偿过程中发生的心室拉伸。BNP的功能包括尿钠增多、利尿、舒张血管和降低舒张血压。这些作用通过一种第二信使——环鸟苷酸(cGMP)的作用来引发。当BNP和定位在血管、肾脏和肺脏内皮细胞表面的膜结合受体钠尿肽受体A(NPR-A)相互作用时，就触发产生cGMP。伴随CHF的严重程度增加，血浆中的BNP浓度也增加。尽管有增加，但BNP的有益作用在严重CHF中会减弱，因此提高了在明显的(overt)CHF中相对缺乏状态的可能性。同时，由于目前用于测量血浆BNP浓度的测定不能特异性地区分前BNP原和其成熟形式，所以这种激素原可能在明显的CHF中没有被完全加工为其成熟形式。因此，心脏能产生的BNP量被压制或前BNP原不能充分转化为活性形式，从而降低了BNP的有利作用。由于其在心脏病发作时较早产生，所以BNP作为一种诊断标志来检测发生CHF的高危患者显得很重要(Yamamoto，Burnett等人，1996；McDonagh，Robb等人，1998；Richards，Nicholls等人，1998；Nagaya，Nishikimi等人，2000；Kawai，Hata等人，2001；Maisel，Krishnaswamy等人，2002；McNairy，Gardetto等人，2002)。
BNP通过几种途径发挥减轻心失代偿的功能。正如其名称的寓意，BNP引起钠的排泄和尿排出量的增加，由此减轻充血。BNP也可作为一种血管舒张剂发挥功能，其作用因几种其他作用而增强，这些功能中最显著的是BNP在干扰肾素-血管紧张肽-醛固酮系统(RAAS)时发挥的作用。它引起对肾素的抑制，所述肾素是血管收缩肽血管紧张肽产生中的一个关键酶。它抑制沿血管组织排列的上皮细胞的过度生长，这种生长若不加抑制，能很大地减少血液流动。BNP发挥功能来减轻心失代偿的最后一种途径是其松弛性作用。它能改善心室心肌的放松，引起较低的舒张血压。
使用肽作为药物存在现实的局限。消化道和血流的蛋白酶解是使用肽治疗的一个主要障碍。非内源肽面临的另一个困难是免疫原性。由于这些问题，制药企业采取的方法是运用医药化学生成非肽的小分子。尽管这一方法取得了成功，但它昂贵、费时，就药物代谢动力学和毒性来说，充满不确定性。而且，鉴定对肽受体具有激动剂活性的有机小分子已被证明是极具挑战性的。
虽然对“聚乙二醇化的(PEGylated)”蛋白的使用到目前已成分确立，但这些蛋白被局限在可注射的使用中。本发明提供了能口服的多肽缀合物，比如人脑型钠尿肽(hBNP)。特别的，本发明提供包含与治疗充血性心力衰竭的制剂中的治疗性肽和蛋白连接结合的PEG的缀合物。这些制剂发挥保护hBNP免受蛋白水解酶作用的功能，由此使这一试剂可有效地用作人钠尿肽受体A的一种激动剂。正是由于这种激动剂活性，使cGMP的产生提高。
2001年8月，hBNP(天然肽)被FDA以商品名Natrecor(脑利钠肽(Nesiritide))批准治疗急性充血性心力衰竭。Natrecor是十二年中第一个被批准用于治疗CHF的药物。它通过在48小时中静脉内连续输注进行施用。由于此药昂贵且需住院治疗，所以Natrecor仅对最急性的病例使用。尽管有如此的花费和不方便，Natrecor仍被认为比一些其他治疗措施便宜，这是因为其减少了患者在重症监护病房中耗费的时间。
当前，大约500万美国人患有CHF，且每年有超过55万的新病例报告(American Heart Association，2001)。目前，治疗CHF的直接费用远远超过200亿美元(American Heart Association，2001)。随着当今诊断程序可用来检测心脏损伤发生之前心力衰竭的发生，对具有扩展的用途的且能在门诊病人或基于家庭的环境中使用的药物存在很大的需求。
5.发明概述
本发明广泛包含几种天然存在的钠尿肽、蛋白、类似物以及这些钠尿肽的化学缀合物的变体和修饰形式，它们比其天然存在的对应物有一个或多个优点。作为举例，一些此类优点包括增加的对蛋白酶解降解的抗性、在血流中较长的持续时间和/或改进的穿过细胞膜障碍的能力。
根据本发明的某些实施方案，钠尿化合物缀合物包含钠尿化合物，此化合物包括钠尿蛋白受体A结合基元(NPR-A)、至少一个修饰部分缀合位点以及至少一个附着于所述修饰部分缀合位点上的修饰部分。利用附着在作为缀合物一部分的钠尿化合物上的修饰部分，钠尿化合物缀合物相对在此描述的不包括修饰部分的天然钠尿化合物来说，具有修饰的亲水特征。通过举例和非限制性的方式，且正如在此处更充分描述的，修饰部分可以采用具有任何大小、形状、取代和构型的寡聚物形式。
在某些情况下，与相应非缀合形式的天然钠尿化合物相比，钠尿化合物缀合物的特征至少部分在于其被提高的对酶降解(比如蛋白酶解)的抗性。与相应的非缀合钠尿化合物相比，这些化合物缀合物进一步的特征在于保留了治疗上显著的生物活性百分比，比如cGMP刺激活性。经体外测量确定，这种保留的cGMP刺激活性可以进一步描述为至少30％、40％、50％、60％、70％、90％、95％或甚至最高为99％的非缀合合形式钠尿肽的cGMP活性。相对非修饰(非缀合)的钠尿化合物，本发明中含一个修饰部分的钠尿化合物缀合物改进的特征的其他实例包括钠尿化合物穿过GI管道并进入血流的能力被提高；钠尿化合物的亲水性、疏水性或两亲性被提高；钠尿化合物在水环境或有机溶剂中的溶解度被提高；钠尿化合物穿过细胞膜的能力被提高；钠尿化合物穿过血—脑屏障的能力被提高；钠尿化合物靶向特定受体、细胞、组织或器官的能力被提高；以及改善的钠尿化合物的药物代谢动力学特征。在优选的实施方案中，钠尿化合物中有生物活性的试剂成分的降解要比非修饰(非缀合)的生物活性钠尿化合物慢，在约为pH2时为小于约2小时。例如，在有血浆、蛋白酶、肝脏匀浆物、酸性条件和/或碱性条件下，钠尿化合物的钠尿化合物成分作为钠尿化合物缀合物的成分时要比非缀合的钠尿化合物更稳定。
本发明的钠尿肽缀合物可诱导与天然肽相关的抗高血压的、心血管的、肾脏的和/或内分泌作用。在某些实施方案中，对钠尿肽的修饰可保护肽，比如hBNP，免遭蛋白酶解作用，并促进肽通过肠壁送递到体循环，从而导致尿钠增多、利尿和/或血管舒张。本发明的钠尿肽缀合物因此可以作为口服制剂有效送递(而不必在医院机构中进行数日的连续静脉内输注)。这一优点有望通过使得能够自我施用来减少与其他CHF治疗相关的医院费用，尽管自我施用迄今尚未实现，但有望将钠尿肽(特别是hBNP)的治疗用途拓展到包括早期(比如，1类)和慢性CHF以及急性CHF。本发明的一个优选实施方案是非免疫原性的肽缀合物，它具有提高的对降解酶类的抗性，适于口服送递和通过肠上皮转运。
本发明也提供了几种制备钠尿化合物缀合物的方法。比如，这些修饰部分可以采用线性和分支的PEG或其他聚合结构。
6.定义
除非有其他的定义，这里使用的所有技术上的和科学上的术语都和本发明所属领域中普通技术人员通常所了解的意思相同。在本发明说明书中所用的术语仅仅旨在描述特殊的实施方案，而不意欲限制本发明。标题使用是考虑到读者的便利，也不意欲限制本发明。所有这里提到的出版物、专利申请、专利和其他文献的完整内容都在此处引用作为参考，本文以商标名提及的任何标注商标的药物的包装插页也在此处引用作为参考。
单数形式“a”、“an”和“the”意欲也包括复数形式，除非上下文中另有明确的说明。
正如在此处所阐明的说明书和权利要求中所用的，下列术语具有如下所述的含义：
本文的“氨基酸”定义为任何天然存在、人工的或合成的L或D立体异构形式的氨基酸，除非另有限定。“残基”这个术语与“氨基酸”术语可互换使用，且经常指明其在给定的氨基酸序列中具有某一特殊位置。
在本公开内容中使用的所有氨基酸缩写都是United StatesPatent and Trademark Office认可的，如在37C.F.R.§1.822(b)中所阐明的。下列单字母氨基酸名称在本发明的说明书中使用。Xaa用来指示一个未知的或尚未指明的氨基酸。在此提供的结构中，特定残基上的整数表明残基的位置序号。如下文所述，残基序号与单字母氨基酸命名法结合使用，以指明例如hBNP和ANP的钠尿肽类似物中发生取代的某一残基。
因此，例如，当一种突变型hBNP是通过精氨酸(R)取代野生型hBNP中残基位置序号第3位的赖氨酸(K)而合成时，就使用“BNPK3R”或“hBNP(1-32)K3R”的命名法。如下面所示例的，多重取代用同样的形式表示，并用逗号将每一个取代分开。
术语“hBNP(1-32)K3R，K14R，K27R”指示一个三重突变型hBNP，其具有上述的hBNP序列，且其中在第3位残基由精氨酸取代赖氨酸(即K3R)、在第14位残基由精氨酸取代赖氨酸(即K14R)和在第27位残基由精氨酸取代赖氨酸(即K27R)。其他的突变型用类似的方式来定义。
术语“hBNP(1-32)K3R，K14R”指示一个二重突变型，即hBNP的第3位和14位残基的赖氨酸被精氨酸所取代。
A＝ala＝丙氨酸     L＝leu＝亮氨酸      nle＝正亮氨酸
R＝arg＝精氨酸     K＝lys＝赖氨酸      cha＝环己基丙氨酸
N＝asn＝天冬酰胺   M＝met＝甲硫氨酸    A*＝har＝高精氨酸(hemoarg inine)
D＝asp＝天冬氨酸   F＝phe＝苯丙氨酸    orn＝鸟氨酸
C＝cys＝半胱氨酸   P＝pro＝脯氨酸      pen＝青霉胺
Q＝gln＝谷氨酰胺   S＝ser＝丝氨酸      phg＝苯基甘氨酸
E＝glu＝谷氨酸     T＝thr＝苏氨酸      mpa＝巯基丙酸
G＝gly＝甘氨酸     W＝trp＝色氨酸      a＝ala*＝D丙氨酸
H＝hrs＝组氨酸     Y＝tyr＝酪氨酸      C*＝高半胱氨酸(hemocysteine)
I＝ile＝异亮氨酸   V＝val＝缬氨酸
“两亲的”是指可同时在水和脂质中溶解的能力，且术语“两亲的部分”和“亲水脂分子”是指两亲的和/或在附着到多肽或非多肽药物上后，提高所形成的缀合物的两亲性的部分，比如PEG-脂肪酸寡聚物，糖脂肪酸寡聚物。
“生物活性”是指某试剂具有治疗的或药理学的活性，比如激动剂、部分激动剂或拮抗剂。
这里所说的“有效剂量”是指没有毒性但能提供所期望的治疗效果的足够量。正如下面所指出的，根据年龄、受试者的总体状况、所治疗状况的严重程度、所施用的特定有生物活性的试剂等等情况，所需的准确量在受试者之间有变化。任何单个病例中的适当“有效”量，可由本领域的普通技术人员参考相关教科书、文献和/或通过常规实验来确定。
“可水解的”是指在生理条件下能被水解的分子键。
“亲水的”是指溶解于水的能力，且术语“亲水的部分”或“亲水物”是指亲水的和/或在附着到另一化学实体后，能提高该化学实体亲水性的部分。实例包括，但不局限于糖和聚亚烷基部分，如聚乙二醇。
“亲脂的”是指具有对脂肪的亲和力，比如在脂肪和脂肪组织中积累的化学制剂，具有溶解于脂质的能力和/或穿透生物膜、与生物膜相互作用和/或穿过生物膜的能力，且术语“亲脂的部分”或“亲脂物(lipophile)”是指亲脂的和/或附着到另一化学实体后，能提高该化学实体亲脂性的部分。
“低碳烷基”是指含有1-6个碳原子、取代或未取代的烷基部分。
“单分散的”是指化合物的混合物，该混合物中大约100％的化合物有相同的分子量。
根据本发明，关于某组合物的某一成分，比如盐、载体、赋形剂或稀释剂是“药物可接受的”，即指该成分和该组合物的其他成分是相容的，表现为该成分可以和本发明的钠尿化合物缀合物组合，而不会消除生物活性试剂的生物活性，且适用于在此提供的受试者，而没有过度的不利副作用(比如毒性、刺激和变态反应)。当某药物组合物的副作用风险超过其所提供的益处时，此副作用就是“过度的”。药物可接受成分的实例包括，但不局限于任何标准的药物载体，比如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳剂)、微乳剂和各种湿润剂。
“聚(亚烷基)二醇”是指直链或分支的聚(亚烷基)二醇聚合物，比如聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇；同时包括聚(亚烷基)二醇的单烷基醚。在特定的实施方案中，聚(亚烷基)二醇是聚乙二醇或“PEG”。术语“PEG单体”是指单个聚乙二醇的单位，即，-(CH2CH2O)-。
“前体药物”是指可以用化学方法衍生出来的生物活性剂，当施用到受试者中时，前体药物被代谢后即产生生物活性剂。
这里所用的“治疗”或“进行治疗”是指能对遭受疾病折磨的受试者有利的任何类型的治疗，包括改善受试者状况(比如改善一个或多个症状)、延缓状况的发展、阻止或延缓疾病的发作、增强正常的生理功能等。
7.附图简述
图1——说明BNP的作用方式和调控。
图2——用三级缀合方法使寡聚物活化与缀合的代表性方案。第一级，修饰部分是不可水解的；第二级，修饰部分是微聚乙二醇化的(micropegylated)；第三级，修饰部分是可完全水解的。
图3——作为hBNP或hBNP缀合物浓度的函数的HAEC细胞中环鸟苷酸的产生。(■＝天然的，▲＝BN-002，＝BN-021，◆＝BN-022，●＝BN-024)
图4——BNP和BNP缀合物胰蛋白酶消化。(-●-＝时间(分钟)对％BN D1，·●·＝时间(分钟)对％BN D2，＝时间(分钟)对％BN D2，＝时间(分钟)对％BN034 D1，■＝时间(分钟)对％BN034 D2)
图5——大鼠中口服给药后各个时间hBNP缀合物的血浆水平。(■＝BN-002，▲＝BN-021，◆＝BN-022，●＝BN-024)
8.发明祥述
根据本发明的某些实施方案，钠尿化合物缀合物包含钠尿化合物，此化合物包括钠尿肽受体A的结合基元(NPR-A)、至少一个修饰部分缀合位点以及至少一个附着到该修饰部分缀合位点的修饰部分。利用附着在作为缀合物一部分的该钠尿化合物上的修饰部分，钠尿化合物缀合物相对在此描述的不包括修饰部分的天然钠尿化合物来说，具有修饰的亲水特征。通过举例和非限制性的方式，且正如在此处更充分描述的，修饰部分可以采用具有任何大小、形状、取代和构型的寡聚物形式。
8.1钠尿化合物
本发明的钠尿化合物缀合物包括钠尿化合物，该化合物含有钠尿肽受体(如NPR-A)的结合位点和用来偶联修饰部分的缀合位点。
8.1.1天然钠尿肽
钠尿化合物具有选自多种物种中的任何一种(比如人、犬和大鼠)的天然钠尿肽(如ANP、BNP、CNP或DNP、尿舒张肽)的氨基酸序列。优选的天然钠尿肽是人BNP、大鼠BNP、犬BNP或hANP。天然序列意欲包括钠尿肽原和前肽原。
8.1.2钠尿化合物类似物
钠尿化合物也可以是天然钠尿肽的有生物活性的类似物(钠尿类似物)。比如，有生物活性类似物可以是具有截短、缺失、插入、取代、置换、侧链延伸和融合蛋白或前述的组合的天然钠尿化合物，其不消除原始化合物的生物学活性。优选地，类似物将包括天然的或人工的NPR-A的结合基元，且将保留一些或全部结合NPR-A的活性。
钠尿多肽类似物可通过各种方法得到。例如，在不消除相互作用结合能力的前提下，天然钠尿肽结构中的某些氨基酸可以被取代为其他氨基酸。正如本领域所描述的，在一些情况下，这种修饰导致对NPR-A的亲和力相对于对清除受体NPR-C的亲和力提高，从而使半衰期延长。
优选地，类似物包含钠尿分子结合基元，比如NPR-A结合基元。
例如，钠尿肽可由如下序列来定义：
          CFGRXMDRISSSSGLGC(SEQ ID NO 2)其中，X是化合物，比如为氨基酸残基，包含修饰部分缀合位点。在某些实施方案中，X包含可由修饰部分附着的氨基酸。比如，X可包含氨基酸Lys或Cys，其上可附着修饰部分。在另一实施方案中，X可以不是Lys；这些实施方案中，非缀合的肽也是本发明的一个方面，其中X是精氨酸或/和其他非赖氨酸的氨基酸，其上可生成一个缀合位点。适合这些实施方案的一个可选结构是：
                  CFGRX1MDRIX2GLGC，
其中X1是赖氨酸，X2是1-4个氨基酸。X2可以是S、SS、SSS、SSSS、K、KS、KSS或KSSS。当K被包括作为X2或X2序列的部分时，即是一个修饰部分缀合位点。
例如，钠尿化合物可以有如下结构：
      X1-CFGRX3MDRISSSSGLGC-X2(SEQ ID NO.__)
其中X1和X2至少有一个要存在，X1是1-10个氨基酸的肽，其中X2是1-6个氨基酸的肽，且其中X3不能是赖氨酸，比如是精氨酸。例如，X1包含全部的hBNP N-末端1-10个氨基酸残基序列或此序列的C末端片段。在一个实施方案中，X1包含SPZ1MVQGSG-(SEQ ID NO：)，SPZ1MVQG、SPZ1MVQ、SPZ1MV、SPZ1M、SPZ1、PZ1MVQGSG、Z1MVQGSG，其中Z1是赖氨酸或精氨酸。当Z1是赖氨酸时，就可提供修饰部分缀合位点。在另一实施方案中，X2包含全部的hBNP C-末端1-6个氨基酸残基序列或此序列的N-末端片段。在一实施方案中，X2是序列Z2VLRRH(SEQ IDNO：)、Z2VLRR( )、Z2VLR( )、Z2VL、K、R、RVLRR( )、RVLR( )、RVL、RV或R，其中Z2可以是赖氨酸或精氨酸。当Z2是赖氨酸时，就可提供修饰部分缀合位点。当Z1是赖氨酸时，Z2不能是赖氨酸；当Z2是赖氨酸时，Z1不能是赖氨酸。可选择地，X1和X2可以是从任何钠尿肽得到的其N-末端和C-末端的尾部氨基酸序列。在某些实施方案中，N-末端和/或C-末端尾序列是存在的，但并不特定地是hBNP的N-末端和C-末端尾序列或其任何片段。应当理解，非缀合的钠尿化合物也是本发明的一个方面。
在一个实施方案中，钠尿化合物类似物包含氨基酸序列：
    X1MVQGSGC1FGRX2MDRISSSSGLGC2X3(SEQ ID NO.__)
其中，X1、X2和X3各自独立地选自Lys和除Lys之外的氨基酸；其中X1、X2和X3中至少有一个是Lys，且X1、X2和X3中至少有一个是非Lys的氨基酸；且
C1和C2是半胱氨酸，可以通过二硫键偶联。应当理解，非缀合的肽类似物也是本发明的一个方面。
在一个实施方案中，X1、X2和X3中至少有一个是Arg。在另一个实施方案中，X1是Lys，X2是Arg，且X3是Arg。这个实施方案也可以包含一个这里所描述的氨基酸序列，N-末端指向X1，和/或C-末端指向X3。例如，当N-末端尾序列存在时，其可以是S-或SP-，且当C-末端尾序列存在时，其可以是-VLRRH、-VLRR、-VLR、-VL或-V。在某些实施方案中，N-末端和/或C-末端尾序列是存在的，但并不特定地是hBNP的N-末端和C-末端尾序列或其片段。
在另一个实施方案中，钠尿肽类似物包含氨基酸序列：
        CFGRX1MDRISSSSGLGCX2(SEQ ID NO：)
其中，X1和X2至少有一个是包含修饰部分缀合位点的氨基酸，此位点和修饰部分相偶联，另一个则是任何其他的氨基酸或非缀合的Lys。在一个实施方案中，X1是Lys，其侧链与修饰部分相偶联，而X2是另一个氨基酸，比如Gly或Arg。可选择地，X2是Lys，其侧链与修饰部分相偶联，而X1是另一个氨基酸，比如Gly、Arg或一个非Lys氨基酸。在另一个实施方案中，X1是Lys，其侧链与修饰部分相偶联，而X2是一个非缀合的Lys。可选择地，X2是Lys，其侧链与修饰部分相偶联，而X1是一个非缀合的Lys。应当理解，非缀合的肽也是本发明的一个方面。
实际上，任何钠尿肽都可以根据本发明进行修饰。作为示例，可作为适合的候选物进行修饰的肽/蛋白在PCTUS0217567中有描述，此专利特此引入作为参考。例如，BNP在天然序列中包含Lys残基，这些残基可优选作为寡聚物的缀合位点。在本发明的某些实施方案中，其中BNP是天然的肽，从该肽的结合区域去除任何缀合位点或去除某个结合位点，都是需要的。当需要一个寡聚物不附着在该肽序列的特定Lys残基时，该Lys可以用另一氨基酸，比如精氨酸来置换。例如，在这一区域与不可水解的寡聚物缀合对活性有损害，虽然申请人曾惊奇地发现在Lys14的缀合导致显著量的保留的活性。因此，用具有相似化学性质但不易缀合的氨基酸将这些缀合位点置换是需要的。例如，在hBNP序列中，Lys14可以用Arg来取代，从而对天然BNP而言，有利于该肽在肽序列的Lys3进行缀合。可选择氨基酸取代以用一个不易缀合的氨基酸来置换Lys。
在某些情况中，需要添加另外的缀合位点。例如，在某些实施方案中，一个带正电荷的氨基酸残基被Lys残基置换，比如，在ANP肽(天然序列)中，Arg27可被Lys所置换。
可以选择添加缀合位点的突变，从而使突变和缀合并不消除所得的肽缀合物的活性，特别是其对NPR-A的亲和力。在一种实施方案中，钠尿化合物被定义为这样的天然hBNP氨基酸序列，其具有一个或多个Lys残基被插入到hBNP序列中间、和/或添加在hBNP序列的某一端、和/或一个或多个天然Lys残基被缺失或被保守性取代所置换。这种取代或插入优选地是钠尿肽的一个或多个尾部氨基酸序列。
在某些实施方案中，缀合位点可以被插入、置换或添加，其位置可在N-末端尾部或靠近N-末端尾部，比如在N-末端氨基酸尾部序列中插入或取代，优选地是在N-末端，或在从N-末端算起的1、2、3、4或5位的氨基酸，或者可选择地，或是从N-末端Cys算起N-末端方向的1、2、3、4、5、6、7、8、或9位氨基酸，所述N-末端Cys构成生成环的Cys桥的一部分。在优选的实施方案中，钠尿化合物被定义为带有选自Lys3→Arg、Lys14→Arg；Arg30→Lys和Lys27→Arg的一个或多个突变的天然hBNP序列，所述的一个或多个突变不能消除钠尿肽化合物的生物活性。添加一个以上的修饰部分，比如寡聚物，可以改善酶稳定性和/或提高吸收。
许多钠尿肽类似物包括天然钠尿肽的环成分，比如hBNP的Cys10-Cys26，其中Cys10和Cys26通过一个二硫键偶联而形成一个环。在某些情况中，此环可以包含与天然序列不同的氨基酸的取代、缺失和/或插入，只要所述取代、缺失和/或插入不会消除天然序列的活性。这种改变的环序列的例子可见于Schoenfelda等人的文章，“Mutationsin B-type natriuretic peptide mediating receptor-Aselectively”，FEBS Letters 413(1997)263-267，其完整公开内容在此处引用作为参考，描述了与受体-C(NPR-C)相比可优选结合钠尿肽受体-A(NPR-A)的BNP的变体(美国专利6,525,022和美国专利6,028,055)。作为例子，钠尿环可包含带有一个或多个保守性取代的天然环，这种取代并不消除该环的促尿钠排泄活性，比如，在某些情况中，该环具有天然环的序列(如hBNP的天然环)，同时有1、2、3、4、5、6、7或8个保守性取代。在另一实施方案中，该环通过去除一组不会消除生物活性的氨基酸而被缩短。在一实施方案中，肽类似物含有hBNP的Cys10-Cys26环，其中Lys14被Gly或Arg所置换。在另一实施方案中，该环的SSSS成分被改变或缺失。
另外，钠尿肽环或天然环的类似物可包含N-末端尾巴和/或C-末端尾巴，如天然钠尿肽的尾巴，例如，hBNP1-9和hBN(P2)7-32。这些尾巴是不会消除生物活性的单个氨基酸或肽。在某些情况中，这些尾巴可以包含与天然序列不同的氨基酸的取代、缺失和/或插入，只要所述取代、缺失和/或插入不会消除天然序列的有利活性。在一实施方案中，一个或多个尾巴基于天然序列，但截短了一个或多个氨基酸。例如，当N-末端尾巴存在时，其可以选自如下hBNP片段：8-9、7-9、6-9、5-9、4-9、3-9、2-9和1-9；以及一个或多个Lys残基被Gly或Arg残基置换的任何前述片段。类似地，当C-末端尾巴存在时，其可以选自hBNP片段27-28、27-29、27-30、27-31和27-32；以及一个或多个Lys残基被Gly或Arg残基置换的任何前述hBNP片段。优选的环+尾巴钠尿肽的例子包括hBNP片段1-29、hBNP片段1-26、以及一个或多个Lys残基被Gly或Arg残基置换的任一前述hBNP片段。
除了前述的类似物，适合在本发明中使用的各种类似物已在本领域描述过。例如，1992年5月19日授权的美国专利5,114,923(其完整公开内容在此处引用作为参考)描述了一个具有促尿钠排泄活性的肽，其式为R1-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2，其中R1选自(H)、Gly-、Ser-Gly-、Gly-Ser-Gly-、Gln-Gly-Ser-Gly-、Val-Gln-Gly-Ser-Gly-、Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-、Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-、Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-、Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-和R3-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-，其中R3是人类蛋白1-99位的102个氨基酸的序列或其C-末端部分，而R2是(OH)、NH2、NHR’，或者其中修饰部分’和修饰部分”独立地是低碳烷基(1-4C)，或R2是Lys、Lys-Val、Lys-Val-Leu、Lys-Val-Leu-Arg、Lys-Val-Leu-Arg-Arg、Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His、或其酰胺(NH2、NHR’或NR’修饰部分”)。
1990年2月2日授权的美国专利4,904,763(其完整公开内容在此处引用作为参考)也描述了适用于本发明的钠尿肽类似物，如X-Cysphe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu GlyCys Lys Val Leu Arg Arg His-OH，其中X是H、H-Gly-Ser-Gly-或H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly。
1990年2月27日授权的美国专利4,904,763(其完整公开内容在此处引用作为参考)描述了其他适用于本发明的钠尿肽类似物，包括X-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Y(其中两个半胱氨酸有二硫键桥连)，其中X表示H或H-Asp-Ser-Gly-，Y表示-Asn-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr-OH、-Asn-Val-Leu-Arg-Arg-OH、-Asn-Val-Leu-Arg-Tyr-OH、-Asn-Val-Leu-Arg-OH、-Asn-Val-Leu-OH或Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH或其盐。另一组类似物适用于1989年12月14日公开的PCT Publication No.WO8912069。
适用于本发明的另一组钠尿肽类似物在2003年6月12日公开的美国专利公开No.20030109430中有描述，该专利的完整公开内容在此处引用作为参考。该公开内容描述了有促尿钠排泄活性的肽，其式为：R1-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg/Lys-Leu/Met-Asp-Arg-Ile-Lys-Met-Gly/Ser-Ser-Leu/Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2，其中R1选自：(H)、Gly-、Ser-Gly-、Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-、Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-、Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-、Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-、Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-、Pro-Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-、Ser-Pro-Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly-、或猪、犬或人BNP天然上游序列的10-109个氨基酸的序列、或其复合；R2是(OH)、NH2或NR’R”，其中R’和R”独立地是低碳烷基(在此为1-4C)、或是Asn/Lys、Asn/Lys-Val、Asn/Lys-Val-Leu、Asn/Lys-Val-Leu-Arg、Asn/Lys-Val-Leu-Arg-Arg/Lys、Asn/Lys-Val-Leu-Arg-Arg/Lys-Tyr/His、或其酰胺(NH2或NR’R”)。前提是如果该式是R1-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2且R1是Asp-Ser-Gly-，则R2不能是Asn-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr。
还有另一组类似物在1997年11月26日授权的Scios，欧洲专利EP0542863B1中描述，该专利描述了一个融合蛋白，其从N-末端至C-末端包含：一个大约10-大约50kDa的载体蛋白，该载体蛋白不含有作为Staph V8切割位点的Glu残基或Asp-Gly序列；包含位于所述载体C-末端的Glu残基或Asp-Gly序列的Staph V8切割位点；和；和一个融合在所述切割位点的不包含Staph V8切割位点的肽，其中所述的融合蛋白有大约8.0或更大的PI(等电点)。此专利也描述了一个6-20个氨基酸的N-末端前导序列的用途。
其他适用于本发明的钠尿肽类似物在2002年7月4日公开的Daiichi的美国专利公开No.20020086843中描述(其完整公开内容在此处引用作为参考)，该专利描述一个生理活性多肽X-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH(其中两个半胱氨酸被桥连)，其中X是H、H-Gly-Ser-Gly-或H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-。
在实现这些取代中，要考虑氨基酸的亲水指数。在赋予多肽相互作用的生物功能中，亲水氨基酸指数的重要性在本领域是众所周知的。普遍认为，氨基酸的相对亲水特征对所得到的多肽的二级结构有贡献，进而限定该蛋白与其他分子的相互作用。每一个氨基酸根据其疏水性和电荷特征被赋予了一个如下的亲水指数：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰氨(-3.5)、Lys(-3.9)和Arg(-4.5)。正如将被本领域技术人员所了解的，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或分值的其他氨基酸所取代，并依然能产生具有相似生物活性的多肽，即依然能获得一个生物功能上等价的多肽。在进行这些改变的过程中，亲水指数在各自±2范围内的氨基酸进行取代是优选的，特别优选在各自±1范围内的取代，最优选在各自±0.5范围内的取代。
本领域所知道的是，相似氨基酸的取代可以根据亲水性而有效地进行。美国专利4,554,101(其完整公开内容在此处引用作为参考)提出，蛋白最大的局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸亲水性所控制的)和该蛋白的生物特性相关联。正如美国专利4,554,101所详述的，氨基酸残基被赋予了下列亲水性值：Arg(+3.0)、Lys(±3.0)、天冬氨酸(±3.0±1)、谷氨酸(±3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。如本领域技术人员所了解的，一个氨基酸可以被另一个有相似亲水性值的氨基酸所取代，且仍能获得生物学的等价物，特别是免疫学上的等价多肽。在这些改变中，亲水性值在各自±2范围内的氨基酸进行取代是优选的，特别优选在各自±1范围内的取代，最优选在各自±0.5范围内的取代。
如上所述，氨基酸取代/插入可根据氨基酸侧链取代基的相对相似性来进行，比如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑前述各种特征进行的示例性的取代(即可相互交换但不显著改变多肽生物活性的氨基酸)对本领域的技术人员来说众所周知的，且包括，例如，Arg和Lys、谷氨酸和天冬氨酸、丝氨酸和苏氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺、及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
正如本领域技术人员将要了解的，钠尿肽(比如BNP)类似物可通过各种公认的肽合成技术来制备，包括，但不局限于，标准的(溶液)方法、固相方法、半合成方法和重组DNA方法。
8.1.3多-BNP肽
钠尿化合物可以是多重肽(multipeptide)，即在序列上含有两个或更多个钠尿化合物单位，并任选在钠尿化合物单位之间包含间隔序列。化合物也可任选地在钠尿肽化合物的一端或两端包含前导序列和/或延伸序列(extention sequence)。例如，通过举例和非限制性的方式，且不加限制，每一个多重肽的结构和/或式都具有以下结构：NP-[NP]n、NP-[间隔序列-NP]n、前导序列-[间隔序列-NP]n、前导序列-[间隔序列-NP]n-延伸序列，其中
NP-[NP]n；
NP-[间隔序列-NP]n；
前导序列-NP-[NP]n；
前导序列-NP-[间隔序列-NP]n；
前导序列-[间隔序列-NP]n；
前导序列-[间隔序列-NP]n-延伸序列；
前导序列-NP-[间隔序列-NP]n-延伸序列；
其中
n可以是，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
NP是钠尿肽或钠尿肽类似物；
间隔序列可以，例如，是酶切割位点，优选地是NP内没有的酶降解位点，或优选地是NP内没有的化学切割位点，且所述间隔序列可在化学缀合过程中封闭多重肽中NP的N-末端，并提高多重肽在细胞质或细胞介质中的溶解度；
前导序列可以，例如，是单个氨基酸、氨基酸序列、肽(比如前导肽或信号肽)或蛋白；且可选择前导序列用来封闭N-末端防止其缀合，有助于多重肽的纯化(比如，(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu-可以被酶混合物：V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)和内切蛋白酶(Asp-N)所切割)，提高溶解度和/或有助于从细胞排泄(比如Ala-Asp-Gly-Glu)；且前导序列优选地能通过酶或化学切割从多重肽上切割；
延伸序列可以，例如，是单个氨基酸、氨基酸序列、肽(比如前导肽或信号肽)或蛋白；且可选择延伸序列用来封闭C-末端防止其缀合，有助于多重肽的纯化(比如，(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu)，提高溶解度，和/或有助于从细胞排泄(比如，Ala-Asp-Gly-Glu-可以被酶混合物：V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)和内切蛋白酶(Asp-N)所切割)；且延伸序列优选地能通过酶或化学切割从多重肽上切割。
前导序列可以，例如，是导致细胞排泄BNP的信号肽、或前前导序列、或在融合配偶体蛋白之前或之后的前前导序列；且前导序列可在化学缀合过程中封闭多重肽中NP的N-末端，和/或有助于多重肽在细胞质或细胞介质中的溶解度；和
延伸序列可以，例如，是有助于多重肽纯化或有助于多重肽在细胞质和细胞介质中的溶解度的肽。
在一个实施方案中，间隔序列是Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg，前导序列是Glu-Gly-Asp-Arg-Arg，延伸序列是(His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg。在这个实施方案中，NP可以使用胰蛋白酶和羧肽酶B的酶混合物而释放。
在一个实施方案中，间隔序列是Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-Arg-Arg，前导序列是Glu-Gly-Asp-Arg-Arg，延伸序列是(His)6-AAA-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg，其中AAA是氨基酸序列，长度为3-40个氨基酸残基，优选地是3-15个。在这个实施方案中，NP可以使用胰蛋白酶和羧肽酶B的酶混合物而释放。
在另一个实施方案中，间隔序列是Arg-Gly-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg，前导序列是Glu-Gly-Asp-Pro-Arg，延伸序列是(His)6-Glu-Gly-Asp-Pro-Arg。在这个实施方案中，NP可以使用凝血酶和羧肽酶B的酶混合物而释放。
在另一个实施方案中，间隔序列是Ala-Arg-Gly-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg，前导序列是Glu-Gly-Asp-Pro-Arg，延伸序列是(His)6-Glu-Gly-Asp-Pro-Arg。在这个实施方案中，NP可以使用凝血酶和羧肽酶A的酶混合物而释放。
在另一实施方案中，间隔序列是Met-Met，前导序列是Met-Met，且延伸序列是(His)6-AAA-Met-Met，其中AAA是长度为3-40个氨基酸残基的任何氨基酸序列。在这个实施方案中，NP可以使用CNBr而释放。
在另一实施方案中，间隔序列是Asp-Asp-Ala-Gly-Glu，前导序列是Ala-Asp-Gly-Glu，且延伸序列是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu。在这个实施方案中，NP可以使用V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)和内切蛋白酶Asp-N的酶混合物而释放。
在另一实施方案中，间隔序列是Glu-Ala-Gly-Glu，前导序列是Ala-Asp-Gly-Glu，且延伸序列是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu。在这个实施方案中，NP可以使用V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)释放来产生一个新颖的NP类似物NP-Glu。
在另一实施方案中，间隔序列是Glu-Glu，前导序列的C-末端是Glu-Gly-Asp-Ala，且延伸序列是Glu-Gly-Asp-Ala-(His)6-Glu。其中C-末端与一个融合配偶体(一个合适的，例如可用肠激酶切割的融合蛋白)相连接。在这个实施方案中，NP可以使用V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)释放来产生一个新颖的NP类似物NP-Glu。
在另一实施方案中，间隔序列是Glu-Glu，前导序列是Ala-Asp-Gly-Glu，且延伸序列是(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu，其中N-末端与一个融合配偶体(一个合适的，例如可用肠激酶切割的融合蛋白)相连接。在这个实施方案中，NP可以使用V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)释放来产生一个新颖的NP类似物NP-Glu。
在另一实施方案中，间隔序列是Glu-Glu，前导序列的C-末端是Glu-Gly-Asp-Ala，且延伸序列是Glu-Gly-Asp-Ala-(His)6-Glu，且C-末端与一个融合配偶体(一个合适的融合蛋白)相连接。在这个实施方案中，NP可以使用V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)释放来产生一个新颖的NP类似物NP-Glu。
在另一实施方案中，间隔序列是Glu-Glu，前导序列是Ala-Asp-Gly-Glu，且延伸序列是Glu-(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu，其中N-末端与一个融合配偶体(一个合适的融合蛋白)相连接。在这个实施方案中，NP可以使用V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)释放来产生一个新颖的NP类似物NP-Glu。
8.2修饰部分
修饰部分是修饰钠尿化合物(比如BNP肽化合物)的部分，并为化合物提供所期望的特性，如在此所描述的。例如，修饰部分可以降低钠尿化合物在各种环境(如GI管道和/或血流)中的降解速率，从而使被修饰形式的钠尿化合物在这些环境中要比没有修饰部分的化合物降解的少。优选的修饰部分是那些能使钠尿化合物缀合物保留亲体钠尿化合物生物活性在治疗上显著的百分比的部分。
8.2.1影响稳定性、溶解度和/或生物活性的部分
如在此描述的，有许多能附着到钠尿化合物上以形成钠尿化合物缀合物的部分，其可以修饰亲体钠尿化合物的稳定性、溶解度和/或生物活性。实例包括亲水性的聚合物或寡聚物、两亲性的聚合物或寡聚物和亲脂性的聚合物或寡聚物。
聚合物(或短链寡聚物)可以在其主链上包括弱的或可降解的键。例如，聚(亚烷基)二醇可包括可水解的不稳定键，如丙交酯、乙交酯、碳酸酯、酯、氨基甲酸酯等，其均易于水解。这就使聚合物可切割成低分子量的片段。这种聚合物的实例在例如授予Hubbell等人的美国专利No.6,153,211中有描述。
代表性的亲水性、两亲性和亲脂性的聚合物和寡聚物在下面详细描述。
8.2.2亲水性部分
如本领域技术人员所了解的，亲水性部分可以是各种亲水性部分，包括，但不局限于聚(亚烷基)二醇部分、其他亲水性聚合物、糖部分、聚山梨酸酯部分、和它们的组合。
8.2.2.1聚(亚烷基)二醇部分
聚(亚烷基)二醇是带有重复烷撑二醇单位的化合物。在某些实施方案中，所有单体是相同的(例如，聚乙二醇或聚丙二醇)。在别的实施方案中，亚烃基单位是不同的(例如，乙二醇和丙二醇的共聚物(polyethylene-co-propylene glycol)，或PLURONICS)。聚合物可以是无规共聚物(比如，环氧乙烷和1，2-环氧丙烷是共聚合的)或分支的或接枝的共聚物。
聚乙二醇，或PEG，是优选的聚(亚烷基)二醇，且可用于生物学应用中，这是因为它有高度适合需要的特性，且通常被食品药品管理局(Food and Drug Administration)认为是安全的(GRAS)。PEG具有式-(CH2CH2O)n-，其中n的范围可以从大约2到大约4000或更大。PEG一般是无色、无味、水溶性的或水可混合性的(依赖于其分子量)、热稳定的、化学上惰性的、水解稳定的和通常情况下无毒的。PEG也是生物相容的，一般是不会在体内引起免疫反应的。本发明优选的PEG部分包括选自下列按优选程度增加的顺序所示范围内的许多PEG亚单位，即2-50、2-40、2-30、2-20、2-15、2-10。在某些实施方案中，修饰部分包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚单位。
PEG可是单分散的(如申请人以前在美国专利申请Nos.09/873,731和09/873,797中所描述的，此二者均于2001年6月4日提出申请，其完整公开内容在此处引用作为参考)，或多分散的，如市场上一般供应的。单分散的意味着此聚(亚烷基)二醇有单一的分子量，或相对狭窄的分子量范围。使用相对低分子量、单分散聚合物的一个优点是能形成易于定义的缀合物分子，这有助于可再生的合成和FDA的批准。
PEG可以是在每一末端都带有羟基的线性聚合物(在被缀合到钠尿化合物的剩余部分之前)。PEG也可是烷氧基PEG，如甲氧基-PEG(或mPEG)，其中一个末端是相对惰性的烷氧基团，而另一个末端是羟基(其偶联到钠尿化合物上)。PEG也可以是分支的，其在某实施方案中用R(-PEG-OH)m来表示，其中R代表中心的(一般是多羟基的)核心试剂，如季戊四醇或丙三醇；而m代表臂的数目。每一个分支可不同，且可以由醚和/或酯封端。臂的数目m可以为3-100或更大，一个或多个末端的羟基基团可被偶联到钠尿化合物的剩余部分或进行化学修饰。其他分支的PEG包括那些由式(CH3O-PEG-)pR-Z所代表的，其中p等于2或3，R代表中心的核心如Lys或丙三醇，Z代表一个容易进行化学活化的基团如羧基。另一分支形式，即有侧链的PEG沿PEG主链(不包括或包括PEG链端部)都有活性基团，比如羧基。分叉的PEG可用式PEG(-LCHX2)n来表示，这是分支PEG的另一类形式，其中L是连接基团，X是已活化的末端基团。术语聚乙二醇或PEG代表或包括所有形式的线性或分支PEG，而聚(亚烷基)二醇或PEG包括所有形式的线性或分支PEG。
8.2.2.2糖部分
这里描述的钠尿化合物也包括糖部分，正如为本领域技术人员所熟知的。一般的，糖部分是至少有一个蔗糖基团的碳水化合物产物。代表性的糖部分包括，但不局限于丙三醇部分、单-、二-、三-和寡糖，和多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖树胶。具体的单糖包括C6和以上(优选地是C6-C8)的糖，如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖和景天庚酮糖；二糖和三糖包括带有两个或三个单糖单位的部分(优选地是C5-C8)，如蔗糖、纤维二糖、麦芽糖、乳糖和棉子糖。使用糖部分的缀合描述在美国专利5,681,811、5,438,040和5,359,030中，它们的完整公开内容在此处引用作为参考。
8.2.2.3聚山梨酸酯部分
正如本领域技术人员所了解的，聚山梨酮酯部分可以是各种聚山梨酸酯部分，包括，但不局限于山梨酸酯和从聚氧乙烯衍生生的聚山梨酸酯。使用聚山梨酸酯部分的缀合描述在美国专利5,681,811、5,438,040和5,359,030中，它们的完整公开内容在此处引用作为参考。
8.2.2.4生物可相容的水可溶解的多阳离子部分
在某些实施方案中，可以使用生物相容的水溶性聚阳离子聚合物。生物相容的水溶性聚阳离子聚合物包括，例如，任何附着有质子化杂环作为侧基的聚合物。“水溶性的”表示整个聚合物在20-37℃温度之间、在含水溶液(比如缓冲盐溶液或添加有少量有机溶剂作为助溶剂的缓冲盐溶液)之中是可溶解的。在某些实施方案中，聚合物自身单独在含水溶液中并不是足够可溶的，但通过与水溶性的聚合物如PEG链接枝可使其溶于溶液。实例包括在聚合物主链或聚合物侧链上含有氨基基团的多胺，如聚-L-Lys和其他由天然或合成氨基酸或氨基酸混合物组成的带正电荷的聚氨基酸，包括聚(D-Lys)、聚鸟氨酸、聚(Arg)和聚(组氨酸)，以及非肽多胺如聚氨苯乙烯、聚氨基丙烯酸酯、聚(氨基丙烯酸N-甲酯)、聚(氨基丙烯酸N-乙酯)、聚(氨基丙烯酸N，N-二甲酯)、聚(氨基丙烯酸N，N-二乙酯)、聚氨基甲基丙烯酸酯、聚(氨基甲基丙烯酸N-甲酯)、聚(氨基甲基丙烯酸N-乙酯)、聚(氨基甲基丙烯酸N，N-二甲酯)、聚(氨基甲基丙烯酸N，N-二乙酯)、聚乙烯亚胺，季胺聚合物，如聚(氯化N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯)(poly(N，N，N-trimethylaminoacrylate chloride))、聚(氯化甲基丙烯酰胺基丙基三甲基铵)(poly(methyacrylamidopropyltrimethyl ammonium chloride))，和天然的或合成的多糖如脱乙酰壳多糖。
8.2.2.5其他亲水性的部分
其他亲水性的聚合物也可使用。实例包括聚氧乙烯化多元醇，如聚氧乙烯化丙三醇、聚氧乙烯化山梨糖醇和聚氧乙烯化葡萄糖；聚乙烯醇(“PVA”)；葡聚糖；基于碳水化合物的聚合物等。聚合物可以是均聚物或无规或嵌段共聚物，和基于上述直链或分支聚合物单体的三元共聚物。
合适的其他聚合物的特殊例子包括，但不局限于聚噁唑啉、双官能聚(丙烯酰吗啉)(poly(acryloylmorpholine))(“PAcM”)和聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)。PVP和聚噁唑啉都是本领域众所周知的聚合物，其制备对熟练的技术人员应该是显而易见的。PAcM及其合成与用途描述在美国专利5,629,384和5,631,322中，它们的完整公开内容在此处引用作为参考。
8.2.3生物粘附性的(bioadhesive)聚阴离子部分
某些亲水性聚合物表现出潜在有用的生物粘附性质。这种聚合物的实例可见于，例如，授予Mathiowitz等人的美国专利No.6,197,346。这些带有羧基基团的聚合物(例如聚丙烯酸)表现出生物粘附性质，且也易于和这里描述的钠尿化合物缀合。在降解时可暴露羧酸基团的可快速生物侵蚀的聚合物，如丙交酯-乙交酯共聚物(poly(lactide-co-glycolide))、聚酐和聚原酸酯，也是有生物粘附性的聚合物。这些聚合物可用来将钠尿化合物送递到胃肠道。当聚合物降解时，它们能暴露羧酸基团而使其紧密粘附在胃肠道，也有助于钠尿化合物缀合物的送递。
8.2.4亲脂性的部分
在某些实施方案中，修饰部分包含亲脂性的部分。正如本领域技术人员所了解的，亲脂性的部分可以是各种亲脂性的部分，包括，但不局限于烷基部分、链烯基部分、炔基部分、芳基部分、芳烷基部分、烷芳基部分、脂肪酸部分、adamantantyl和胆甾烯基和亲脂聚合物和/或寡聚物。
烷基部分可以是饱和的或不饱和的、线性的、分支的或环状的烃链。在某些实施方案中，烷基部分至少有1、2、3或更多的碳原子。在其他实施方案中，烷基部分是一个线性的、饱和或不饱和的烷基部分，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子。实例包括饱和线性烷基部分如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基；饱和分支的烷基部分如异丙基、仲丁基、叔丁基、2-甲基丁基、叔戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基己基、2-丙基戊基；且从上述饱和烷基部分衍生来的不饱和烷基部分包括，但不局限于乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基。在其他实施方案中，烷基部分是低碳烷基部分。在其他实施方案中，烷基部分是一个C1-C3的低碳烷基部分。在一些实施方案中，修饰部分特别地不是由烷基部分组成的、或特别地不是由低碳烷基部分组成的、或特别地不是由烷部分组成的、或特别地不是由低碳烷部分组成的。
烷基基团可以不被取代，或者被一个或多个取代基所取代且这些取代基优选地不会干扰缀合物合成的方法或者不会消除缀合物的生物活性。潜在受干扰的官能团可以用保护基团适当地封端，以使官能团不受干扰。每一个取代基可以任选地用其他的无干扰性的取代基来取代。术语“无干扰性”将取代基表征为具有如下特征，即按照本发明的方法，它不会不利地影响需要进行的任何反应。
脂肪酸部分可以是各种脂肪酸部分，包括天然的或合成的、饱和的或不饱和的、线性的或分支的脂肪酸部分。在某些实施方案中，脂肪酸部分至少有2、3、4或更多的碳原子。在其他实施方案中，脂肪酸部分有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个碳原子。
当修饰部分是芳基环时，该环可以由亲核官能团(如OH、SH或NHR’)官能化，所述基团的位置使其能与氨基甲酸酯部分以分子内方式进行反应，并有助于其水解。在某些实施方案中，亲核基团用一个能在体内被水解或能被降解的保护基团来保护，以致于当保护基团被去保护时，有助于缀合物的水解和亲体钠尿化合物的释放。
8.2.5两亲性部分
在某些实施方案中，修饰部分包括两亲性部分。许多聚合物和寡聚物是两亲性的。这些常是包含亲水性和亲脂性部分的嵌段共聚物、分支的共聚物或接枝共聚物，它们可呈现寡聚物和/或聚合物的形式，如直链的、分支的或接枝的聚合物或共聚物。
所说的亲水性聚合物或寡聚物可包括这里所描述的任何亲脂性和亲水性部分的组合。这些聚合物或寡聚物一般包含至少一个活性官能团，例如，卤素(halo)、羟基、胺、硫羟基、磺酸、羧酸、异氰酸酯、环氧、酯等，它们经常是在聚合物的末端。这些活性官能团可被用来附着亲脂性的线性或分支的链状烷基、链烯基、炔基、芳烷基或烷芳基，或亲脂性的聚合物或寡聚物，由此提高亲水性聚合物或寡聚物的亲脂性(进而赋予它们总的两亲性)。
亲脂性基团可以，例如，由单-或二羧酸、或适当的地方，由羧酸的活性等价物如酐或酰基氯衍生而来。亲脂性基团的合适前体的实例为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、三甲基乙酸、己酸、辛酸、庚酸、癸酸、壬酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸、ceratic acid、廿九烷酸、异十八烷酸、异壬酸、2-乙基己酸、油酸、蓖麻油酸、亚油酸、亚麻酸、芥酸、大豆脂肪酸、亚麻子脂肪酸、脱氢蓖麻脂肪酸、松浆油脂肪酸、桐油脂肪酸、向日葵脂肪酸、红花脂肪酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酐、正邻苯二甲酸酐(orthophthalic anhydride)、对苯二酸、间笨二酸、己二酸、壬二酸、癸二酸、四氢邻苯二甲酸酐(tetrahydrophthalicanhydride)、六氢邻苯二甲酸酐(hexahydrophthalic anhydride)、丁二酸和聚烯烃羧酸。
末端的亲脂性基团不必是等价的，即，形成的共聚物可以包含相同的或不同的末端亲脂性基团。亲脂性基团可以由多于一个的如上所定义的单官能或双官能的烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳烷基或烷芳基基团衍生出来。
8.2.5.1 PEG/烷基修饰部分
修饰部分可以是这样一个直链或分支的聚合物部分，其包含有一个或多个直链或分支的聚(亚烷基)二醇部分和/或一个或多个直链或分支的、有取代的或未取代的烷基部分。但是，在某些实施方案中，修饰部分特别地不能由烷基部分组成，而在其他实施方案中，修饰部分特别地不能由烷部分组成。聚(亚烷基)二醇部分在某些实施方案中包括2-25个聚(亚烷基)二醇亚单位，更优选是2-20个，理想的是2-15个。聚(亚烷基)二醇部分在某些实施方案中包含PEG。烷基部分在某些实施方案中优选的是2-20个碳原子，更优选地是2-15个，更优选地是2-10个。烷基部分优选地是烷部分。
修饰部分可以，例如，有如下式：
Figure A20038010917900501
(式I)
其中，每一个C是独立选择的，是含有m个碳的烷基部分，且m是1-20，优选地是2-15，更优选地是2-10；且每一个PAG是独立选择的，是含有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，且n是2-25，优选地是2-18，更优选地是2-16；每一个X是独立选择的，是将PAG偶联接到C的连接部分，且优选地是-C-、-O-、-C(O)-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-。关于式I和III，且在某些实施方案中，Cm-X部分并不存在，且PAGn部分以-OH部分或-OCH3部分封端。例如，PAG可以是甲氧基封端的或羟基封端的PEG，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个亚单位。
应当理解，式II的寡聚物自身是本发明的一个方面。该寡聚物可以，例如，作为仲醇或已活化寡聚物被提供。应当理解，式I的寡聚物自身是本发明的一个方面。该寡聚物可以，例如，作为伯醇或已活化寡聚物被提供，且可用来缀合除BNP之外的生物活性化合物，如胰岛素、降钙素、干扰素、生长激素等。修饰部分可以，例如，具有下式：
(式II)其中，每一个C是独立选择的，是含有m个碳的烷基部分，且m是1-20，优选地是2-15，更优选地是2-10；每一个PAG是独立选择的，是含有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，且n是2-25，优选地是2-18，更优选地是2-16；X是-O-或-NH-；每一个o是独立选择的，且是1-15，优选地是1-13，更优选地是1-9，更优选地是1-6。应当理解，式II的寡聚物自身是本发明的一个方面。该寡聚物可以，例如，作为伯醇或已活化寡聚物被提供，且可用来缀合除BNP之外的生物活性化合物，如胰岛素、降钙素、干扰素、生长激素等。
修饰部分可以，例如，有下式：
(式III)
其中，每一个C是独立选择的，是含有m个碳的烷基部分，且m是1-20，优选地是1-15，更优选地是1-10；每一个PAG是独立选择的，是含有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，且n是2-25，优选地是2-18，更优选地是2-16；每一个X是独立选择的，是将PAG偶联到C的连接部分，且优选地由-C-、-O-、-C(O)-、-NH-、-NHC(O)-或-C(O)NH-组成；每一个o是独立选择的，且是1-15，优选地是1-13，更优选地是1-9，更优选地是1-6。应当理解，式I的寡聚物自身是本发明的一个方面。该寡聚物可以，例如，作为羧酸或已活化寡聚物被提供。关于式I和III，在某些实施方案中，Cm-X部分并不存在，PAGn部分以一个-OH部分或-OCH3部分封端。例如，PAG可以是甲氧基封端的或羟基封端的PEG，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个亚单位。
应当理解，式III的寡聚物自身是本发明的一个方面。该寡聚物可以，例如，作为伯醇或已活化寡聚物被提供，且可用来缀合除BNP之外的生物活性化合物，如胰岛素、降钙素、干扰素、生长激素等。
根据本发明的实施方案，缀合物的药物学特征，如亲水性/亲脂性，可通过调整PEG单体的数目、烷基链的类型和长度、PEG-肽键的性质和缀合位点的数目而改变。PEG-肽键的确切性质可被改变，从而使其在生理pH下或在血浆中对水解作用是稳定的和/或敏感的。
8.2.6盐形成部分
在某些实施方案中，修饰部分包含盐形成部分。正如本领域技术人员所了解的，盐形成部分可以是各种适合的盐形成部分，包括，但不局限于羧酸盐和铵。在某些实施方案里，其中修饰部分包含盐形成部分，钠尿化合物缀合物以盐的形式提供。正如本领域技术人员所了解的，在这些实施方案中，钠尿化合物缀合物与合适的药物可接受的抗衡离子相结合，这些抗衡离子包括，但不局限于阴离子如氯、溴、碘、磷酸根、乙酸根、碳酸根、硫酸根、甲苯磺酸根和甲磺酸根(mesylate)，或阳离子如钠、钾、钙、锂和铝。
修饰部分可包括任何亲水性部分、亲脂性部分、两亲性部分、盐形成部分和它们的组合。在优选的实施方案中，修饰部分可以选自：(CH2CH2O)pCH3，其中p是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；(CH2)qCH3，其中q是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；CH2CH2(OCH2CH2)rOH，其中r是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；C(CH2OH)3；CH(CH2OH)2；C(CH3)3；CH(CH3)2；CH2CH2(OCH2CH2)sC(O)(CH2)tCH3，其中s是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，t是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20；和(CH2CH2O)yC(O)(CH2)zCH3，其中y是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，z是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
用于特定目的的修饰部分的上述实例旨在阐明本发明，无论如何都不能看作是限制性的。本领域的技术人员将认识到，用于进行缀合以获得特定的官能度的合适部分在此处所公开和请求保护的化学缀合机制范围内是可能的。因此，可以根据这里公开的本发明的原理来选择和运用额外的部分。
8.3缀合策略
本发明的钠尿化合物缀合物相对于相应的非缀合钠尿化合物缀合物具有不同水平的生物活性。在某些实施方案中，钠尿化合物保留了非修饰形式的一些或全部活性，但由于诸如修饰部分的缀合程度、分子上缀合位点的选择和修饰部分的选择的因素，它对体内的降解较不敏感，因而，具有被提高的血浆半衰期。例如，本发明的钠尿化合物可被修饰，以在钠尿化合物结构的1、2、3、4、5、或更多个位点上包括修饰部分，所述位点为适合促进所述修饰部分在其上结合的合适附着(即修饰部分缀合)位点。作为实例，这种适合的缀合位点可包含氨基酸残基，如Lys氨基酸残基。
例如，在许多实施方案中，生物活性剂部分地是通过结合到受体的活性位点来发挥功能的。通常，当一个官能团如氨基酸残基被修饰后，试剂就不再结合到活性位点。例如，在BNP的情况中，肽有特殊的结合NPR-A的亲和力。依赖于钠尿肽分子被修饰以含有修饰性基团的位点，BNP具有的对受体的亲和力可以相同，或被降低。在某些实施方案中，钠尿化合物缀合物的活性低于天然非缀合的钠尿化合物，但相对于非缀合钠尿化合物缀合物保持改进的特征，如增高的对蛋白酶解的抗性和血浆半衰期或穿过细胞膜的能力。可以预想，例如，当期望钠尿化合物的长期释放时，降低的活性是优选的。
在某些实施方案中，钠尿化合物缀合物是单缀合物。在其他实施方案中，钠尿化合物缀合物是多缀合物，如双缀合物、三缀合物、四缀合物、五缀合物等。钠尿化合物上修饰部分的数目仅仅受限于钠尿化合物上缀合位点的数目。在另外的实施方案中，本发明的钠尿化合物缀合物是有一-、二-、三-、四-和/或五个修饰部分的缀合物的混合物。例如，在某些实施方案中，有生物活性的钠尿化合物是hBNP，在其32个天然氨基酸的序列中，有4个优选的缀合位点，包括N末端、Lys3、Lys14和Lys27。发明人的工作涉及在N-末端、Lys3、Lys14或Lys27缀合的单缀合物，和在Lys3/Lys14和Lys3/Lys27缀合的双缀合物，以之作为制备hBNP和相关钠尿肽及类似物的高度优选的策略。
修饰部分优选地是共价偶联到钠尿化合物上的。修饰部分上的多于一个的部分可以被共价偶联到钠尿化合物上。偶联可以采用可水解的或不可水解的键或二者的混合物(即在不同的缀合位点有不同的键)。
在某些实施方案中，钠尿化合物用可水解的键(例如，酯、碳酸酯或氨基甲酸酯的键)偶联到修饰部分。可水解偶联的使用将提供作为前体药物的钠尿化合物缀合物。当钠尿化合物-修饰部分的缀合物无活性时(即缀合物缺乏通过钠尿化合物的主要作用机理来影响身体的能力)，如当修饰部分缀合位点在钠尿化合物的结合区域内时，前体药物的方法是所期望的。可水解偶联的使用也可提供一种定时释放(time-release)或控释的作用，从而在给定的时段中当一个或多个修饰部分从其各自的钠尿化合物—修饰部分缀合物上被切割下来以提供活性药物时施用钠尿化合物。
在其他实施方案中，钠尿化合物用不可水解的键(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚键)偶联到修饰部分。当需要让钠尿化合物—修饰部分的缀合物在血流中循环更长的时间时(优选地至少2小时)，不可水解键的使用将是优选的。以不可水解的方式把钠尿化合物共价偶联到修饰部分的键一般选自共价键、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分组成的群组。
在另外的实施方案中，可以使用部分前体药物的方法，其中修饰部分有一部分可以被水解。例如，美国专利6,309,633(其完整公开内容在此处引用作为参考)描述了包含亲水性和亲脂性成分的部分，其中亲脂性成分在体内水解而产生微聚乙二醇化的缀合物。
多于一个的修饰部分(即大量的修饰部分)可被偶联到钠尿化合物。这些大量的修饰部分优选地是相同的。但是，应当理解，大量的修饰部分可以是相互不同的，或者，作为替代，这些大量修饰部分的一些可以是相同的，而另一些可以是不同的。当大量的修饰部分被偶联到钠尿化合物时，优选地是将一个或多个修饰部分用可水解键偶联到钠尿化合物，并将一个或多个修饰部分用不可水解键偶联到钠尿化合物。可选择地，将大量修饰部分偶联到钠尿化合物的所有键是可水解的，但可水解的程度不同，这样，例如，一个或多个修饰部分在体内通过水解可以很快地从钠尿化合物上除去，而一个或多修饰部分在体内通过水解可以较慢地从钠尿化合物上除去。
所述修饰部分可以通过药物的各亲核残基偶联到钠尿化合物上，所述亲核残基包括，但不局限于亲核羟基官能团和/或氨基官能团。例如可在丝氨酸和/或酪氨酸残基上见到亲核羟基官能团，并且例如可以在组氨酸和/或赖氨酸残基、和/或在一个或多个多肽的N末端上见到亲核氨基官能团。当修饰部分与钠尿肽的N末端偶联时，偶联优选地形成伯胺。
8.4合成缀合物
在下列实施例中描述了作为例子的合成。可以根据已知的原理控制反应条件(例如，选择的摩尔比、溶剂混合物和/或pH)。例如，通过将反应溶液的pH值保持在低于赖氨酸的pKa值，就可抑制与赖氨酸的氨基官能团的缀合。
可通过使用例如HPLC来分开或分离所述钠尿化合物缀合物混合物，以提供钠尿化合物缀合物，例如单-、双-、三缀合物。具体分离的缀合物的缀合程度(例如，所分离的分子是否是单-、双-或三-缀合物)可通过使用本领域技术人员熟悉的各种技术进行确定和/或证实，所述技术包括，但不限于质谱法。可通过使用本领域技术人员了解的各种技术对具体的缀合物结构(例如，Lys3、Lys14、Lys27或hBNP单缀合物的N-末端)进行确定和/或证实，所述技术包括，但不限于序列分析、肽作图、选择性酶切割和/或内肽酶切割。
通过例如使钠尿化合物与合适的封端剂例如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反应可封闭钠尿化合物上的一个或多个活性位点。例如，当希望在多肽的一个或多个N末端形成具有修饰部分的不饱和钠尿化合物缀合物(即不是所有亲核残基都被缀合的缀合物)时，这个方法是优选的。在如此封端之后，基本上单分散性的封端的钠尿化合物混合物可以和基本上单分散性的活化的修饰部分混合物进行反应，以提供具有与一个或多个亲核残基偶联的修饰部分和具有与其它亲核残基偶联的封端部分的钠尿化合物缀合物混合物。在缀合反应之后，如本领域技术人员所理解的，所述钠尿化合物修饰部分缀合物可以解封。如果需要，则如上所述将钠尿化合物缀合物混合物分离以提供钠尿化合物缀合物混合物。可选择地，所述钠尿化合物修饰部分缀合物的混合物可在解封前进行分离。
在本发明令人惊奇的方面，本发明人揭示了使用具有与钠尿化合物相邻(即位于所述钠尿化合物和PEG部分之间)的烷基部分的PEG烷基部分来合成hBNP缀合物，所述合成在特别想要的Lys3缀合位点形成了优选的缀合。于是，一个方面，本发明提供了优选地在Lys3缀合hBNP的方法，所述方法包括活化PEG-烷基寡聚物的烷基成分和将活化的PEG烷基寡聚物偶联到hBNP。
8.5药物组合物
可制备包括此处描述的钠尿化合物缀合物药物组合物。这种组合物通常包括与药物可接受的载体组合或混合的修饰的钠尿化合物。当然，所述载体必需在与药物组合物中其它任何成分相容的这种意义上是可接受的，并且不应当对患者有害。所述载体可以是固体或液体的或两者，并且优选地与所述前体药物一起制备为单位剂量制剂，例如，片剂，所述制剂可含有按重量计算大约0.01或0.5％到大约95或99％的钠尿化合物缀合物。所述药物组合物可通过任何熟知的药剂学技术制备，所述技术包括，但不限于混合成分、任选地包含一种或多种辅助成分。
根据本发明实施方案的药物组合物包括那些适合口、直肠、鼻、局部、吸入(例如通过气雾剂)、口腔(例如舌下)、阴道、肠胃外(例如皮下、肌内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括呼吸道表面)和通过皮肤施用的组合物，尽管在任何给定情况下最合适的途径将依赖于被治疗状况的特性和严重程度以及所使用的具体前体药物的特性。
适合于口服施用的药物组合物将以分离的单位提供，例如，胶囊、扁胶剂(cachet)、锭剂(lozenge)或片剂，其各含有预定量的所述前体药物；作为粉末或颗粒提供；作为含水或不含水液体的溶液或悬浮液提供；或作为水包油或油包水乳剂提供。通过任何合适的药剂学方法制备这些制剂，所述方法包括将前体药物与合适的载体(所述载体可含有一种或多种如上面提到的辅助成分)结合起来的步骤。总的说来，根据本发明实施方案的药物组合物可通过以下方法制备，即，均一和紧密地将前体药物和液体或精细分离的固体载体或与两者混合，接着，如果必要，使所得的混合物成型。例如，通过对含有前体药物和任选地一种或多种辅助成分的粉末或颗粒施压或模塑可制备片剂。可通过在合适的机器中挤压自由流动形式的所述混合物来制备挤压的片剂，所述混合物如任选地与粘合剂、滑润剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂混合的粉末或颗粒。可通过在合适的机器中对用惰性液态粘合剂湿润的粉末状化合物进行模塑来制备模塑的片剂。
适合于口腔(舌下)施用的药物组合物包括锭剂，所述锭剂包含配制于调味的基质(通常是蔗糖和阿拉伯树胶或西黄蓍胶)中的前体药物；和软锭剂(pastille)，所述软锭剂包含配制于惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中的前体药物。
根据本发明实施方案适合于肠胃外施用的药物组合物包括前体药物的无菌含水和不含水的注射液，所述制剂优选地与预期受体的血液等渗。这些制剂含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使所述组合物与预期受体血液等渗的溶质。含水和不含水的无菌悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。所述组合物可保存在单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，以及在冷冻干燥的(冻干的)条件下贮存，只需紧在使用前添加无菌液体载体，如注射用盐水或水。临时注射液和悬浮液可由前面描述的无菌粉末、颗粒和片剂等制备。例如，可以在密封容器中提供包含单位剂量形式前体药物的可注射的、稳定的、无菌组合物。所述前体药物可以以冻干的形式提供，所述冻干形式的前体药物能够用合适的药物可接受的载体重建，以形成适合将其注射入受试者的液体组合物。所述单位剂量形式一般包含大约10mg到大约10g的前体药物。当所述前体药物基本上是非水溶性的，可使用足够量的的生理学可接受的乳化剂将所述前体药物在含水载体中进行乳化。一种这类有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。
适合于对皮肤局部应用的药物组合物优选地采用软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油的形式。所使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、经皮的增强剂和其两种或更多种的组合。
适合于经皮施用的药物组合物可以以分离的贴剂形式存在，所述贴剂适合于与受体的表皮保持延长时间的紧密接触。适合于经皮施用的组合物也可以通过离子电渗疗法(参见，例如，PharmaceuticalResearch 3(6)：318(1986))进行送递并通常采取任选的前体药物缓冲水溶液形式。合适的制剂包括柠檬酸盐或bis\tris缓冲液(pH6)或乙醇/水，且含有0.1到0.2M的活性成分。
8.6施用和治疗方法
相对于未修饰(非缀合)的生物学活性的钠尿化合物，本发明的钠尿化合物缀合物和药物制剂表现出一个或更多的改善的特征，修饰部分的加入可保护所述生物学活性钠尿化合物在各种环境(例如胃肠道(GI管道)中免受降解，于是在这样的环境中其在未修饰形式中的降解比在不存在修饰部分情况时的降解少。特别地，本发明的某种修饰形式可以以如下剂量口服施用，所述剂量最终在体循环中提供药物学可接受量的生物学活性钠尿化合物。这就是说，足够量的钠尿化合物可在GI管道里保存下来并且进入血流，这样所述生物学活性钠尿化合物以足以触发cGMP产生的药理学活性量全身存在。优选地，相对于将口服施用的非缀合钠尿化合物向血流的送递，修饰部分的加入在口服施用后提高了口服施用的非缀合钠尿化合物向血流的送递。更优选地，将口服施用的钠尿化合物缀合物的活性化合物向血流的送递的提高至少是将口服施用的非缀合的亲体生物学活性钠尿化合物的送递的2倍。然而更优选地，将口服施用的钠尿化合物缀合物的活性化合物向血流的送递的提高至少为将口服施用的未修饰(非缀合)的生物学活性钠尿化合物向血流的送递的3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400或500倍。于是，相对于施用未修饰的生物学活性的钠尿化合物，施用本发明的钠尿化合物缀合物可提供更高的生物学活性钠尿化合物的生物利用率。口服途径施药(而不是在医院机构中进行数日连续静脉内输注)可以减少与其它CHF治疗相关的住院费用和/或拓宽hBNP对包括早期和慢性CHF以及急性CHF的治疗用途。
于是，一方面本发明提供了治疗疾病状况的方法，即通过向需要治疗的受试者施用治疗有效量的本发明钠尿化合物缀合物，所述疾病状况对用钠尿肽化合物进行的治疗敏感。所述钠尿化合物缀合物可合适地通过多种途径施用，包括例如肠胃外的和肠途径。优选途径的例子包括口服、皮下、舌下、口腔、鼻、静脉内和肌内。
几种方法可用于使用本发明的钠尿化合物缀合物来治疗心力衰竭。例如，可以想象所述钠尿化合物缀合物可以是以单一治疗方式提供，优选地仅以口服剂型提供。可选择地，所述钠尿化合物缀合物可以作为组合治疗的一部分与更多传统治疗剂一起使用。目前使用的药物的主要分类包括如下：
利尿剂—减轻与CHF相关的心脏的流体积累和结果导致的扩张。
血管舒张剂—扩张动脉和静脉，允许增加血液流动。
正性肌力药—增加心肌的收缩力。
毛地黄药物—增加心脏收缩力并降低心搏率。
血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂—抑制血管收缩的血管紧张肽II在其合成的最后阶段产生。
血管紧张肽受体阻断剂(ARB’s)--允许产生血管紧张肽，但抑制其动脉活性。
钙通道阻断剂—抑制钙内向通量，引起血管和平滑肌舒张。
硝酸盐—舒张平滑肌并扩张静脉和动脉。
β-阻断剂—阻断儿茶酚胺作用，导致对心脏压力降低和较低的收缩力和速率。
一些钠尿化合物缀合物的优点首先相对于治疗CHF的其它方法并且与其未修饰形式的钠尿肽的目前用途进行比较来考虑，这些未修饰形式的钠尿肽是连续输注的。本发明的口服钠尿化合物缀合物表现出促尿钠排泄和利尿性质，所述性质可期望用来通过除去钠和过多的水分以减轻充血。目前通过利尿剂和钾的补充来实现这类功能。本发明的钠尿化合物缀合物预期具有血管和心肌驰缓剂的性质，所述性质目前通过使用血管舒张剂、钙通道阻断剂和硝酸盐实现。本发明的钠尿化合物缀合物预期抑制肾素—血管紧张肽—醛固酮系统(RAAS)，目前使用ACE抑制剂和ARB’s抑制该系统。此外，所述钠尿化合物缀合物预期没有与正性肌力药和毛地黄药物相关的负作用和突然死亡的风险。所述钠尿化合物缀合物具有几组心血管药物的许多(如果不是全部的话)优点，同时具有减少量的或没有常规治疗的负作用。
本发明的钠尿化合物缀合物也具有优于NATRECOR(脑利钠肽，由Scios，Inc.，Sunnyvale，CA制备)的优点。一些优点归因于根据本发明实施方案的两亲性分子寡聚物提供的增强的药物代谢动力学特征。例如，与非缀合肽相比，对蛋白酶(例如NEP)降解的抗性可导致更长的循环半衰期。一个显著的优点源于BNP或ANT与这类口服送递的寡聚物缀合的能力。例如，NATRECOR通过在48小时内连续输注给药，并且具有每剂很高的费用再加上住院费用。而根据本发明实施方案的口服hBNP化合物缀合物可以以总体较低的成本给药，并且对基于门诊的病人是可以利用的而且可以自我施用。与局限于最急性CHF病例的住院病人的应用相反，根据本发明实施方案的口服缀合物可用于那些遭受逐步发作的慢性CHF患者。施用的方便性、减少的对医院资源的要求和/或较低的成本支持所述钠尿化合物缀合物应作为预防性治疗的用途，用于处于心力衰竭高风险的患者的自我施用(例如在家里)。因而，根据本发明实施方案的hBNP化合物缀合物的口服制剂预期具有许多(如果不是全部的话)Natrecor的益处，具有提高的药学代谢动力学特征、更容易的施用、降低的住院治疗费用、适应症扩展到包括慢性CHF，和/或用于早期心血管疾病的优点。
采用或倾向于采用亲体钠尿化合物的受试者可选择地(或另外地)采用此处描述的钠尿化合物制剂。例如，患有常规地使用肠胃外施用的钠尿化合物例如NATRECOR治疗的病症的患者可用此处描述的有效量的修饰形式的所述试剂进行治疗。有利地，这类试剂以前只通过注射施用或静脉内施用，而钠尿化合物可通过吸入或更优选地口服施用。
在一个实施方案中，本发明提供了将生物学活性剂送递入受试者的方法，其中所述生物学活性剂是作为本发明修饰的钠尿化合物的成分口服施用的，一部分所述口服施用的钠尿化合物在GI管道内完整地保存下来并穿过肠壁进入血流，并且在离开GI管道后，一些或全部所述钠尿化合物在体内水解产生药物可接受量的生物学活性剂。水解作用可例如发生在血流里或在肝脏里。在这个方法中，相对于对应的口服施用的非缀合的生物学活性剂，修饰形式的钠尿化合物增强了口服施用的生物学活性剂的口服生物利用率。
任何在本发明范围内使用的促尿钠排泄剂的有效量会在试剂与试剂之间和患者与患者之间有所变化，并且将依赖于例如年龄、患者状况和送递途径的因素。这些剂量可根据本领域技术人员熟知的常规药理学方法进行确定。通常建议，大约0.1到大约50mg/kg的剂量将具有治疗效果，所有重量均基于患者的体重进行计算。在较高水平时考虑到的毒性将限制静脉内剂量于较低的水平，例如最高为大约10mg/kg，所有重量均基于活性基质的重量进行计算。大约10mg/kg到大约50mg/kg的剂量可用于口服施用。通常，大约0.5mg/kg到5mg/kg的剂量可用于肌内注射。施用频率通常是每天1、2或3次或控制状况所必需的次数。治疗持续时间依赖于被治疗状况的类型，且可能长达患者终生。
根据本发明受治疗的合适治疗受试者包括但不限于鸟类和哺乳动物受试者，优选地是哺乳动物。根据本发明的哺乳动物包括，但不限于犬、猫、牛、公山羊、马、绵羊、猪、啮齿类动物(例如大鼠和小鼠)、兔类动物、灵长类动物、人类等，并且包括在子宫内的哺乳动物。根据本发明的任何需要治疗的哺乳动物受试者都是合适的。优选的是人类受试者。人类两性和在发育任何阶段(即新生儿、婴儿、幼年、青春期、成人期)的患者都可根据本发明进行治疗。
根据本发明举例说明的鸟类包括鸡、鸭、火鸡、鹅、鹌鹑、野鸡、平胸类鸟(如鸵鸟)和驯养鸟类(如鹦鹉和金丝雀)，并且包括在卵内的(in ovo)鸟。
8.7测定
本发明的钠尿肽类似物可诱导与天然肽相关的心血管、肾脏和/或内分泌作用。基于细胞的测定可用来显示哪个缀合物是导致适当的cGMP生产的人类钠尿肽受体A的特异激动剂。生物化学测定可用于显示哪个缀合物提供适当的抗蛋白水解酶的保护。体内实验可用来显示哪个缀合物提供想要的生物利用率。最重要的缀合物可在已确立的狗的模型上进行测试。可在大鼠和狗身上对预期的候选物进行详细的药物代谢动力学、药物动力学和毒性研究。根据本发明实施方案的BNP缀合物将用于治疗早期的、慢性的和急性的充血性心力衰竭。
可在体外对本发明的新肽和新缀合物对人钠尿肽受体A(NPR-A)的激动剂活性进行检验。BNP的血管舒张剂、促尿钠排泄剂和利尿剂的性质归因于第二信使，环GMP(cGMP)。cGMP的产生由鸟苷酸环化酶完成，该酶是当BNP与NPR-A结合时就会活化的酶。可在内源性表达NPR-A的人类主动脉内皮细胞培养物中测量cGMP的生产。因而，本发明的钠尿化合物缀合物和钠尿肽类似物的相对活性可通过这些细胞内cGMP生产的水平来确定。
可对本发明缀合物增强的对蛋白酶的抗性进行检验。一般地，用消化酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶处理口服送递的药物。在使用肽药物的情况下，这些酶尤其会产生问题。然而，已显示肽缀合物能增加对这些酶的抗性。消化酶混合物可用来检验本发明的hBNP缀合物和其它缀合物增加的对消化道蛋白酶的抗性。钠尿化合物缀合物优选地比对应的非缀合的钠尿化合物更不易受蛋白酶解的降解，即缀合物降解得比对应的非缀合化合物更慢。
可对所述缀合物的口服生物利用率进行检验。例如可在大鼠体内检验所述缀合物的口服生物利用率。可通过口服管饲法向胃肠道施用所述缀合物，并且应用可获得的放射免疫测定法测定血流中hBNP缀合物的存在。根据本发明实施方案的缀合物优选地可以是口服和/或经口可获得的，即可通过口服和/或经口途径送递治疗上显著量的缀合物。
所述缀合物可保留一些或所有天然钠尿肽(例如hBNP)的活性并外加口服施用的益处。这样的化合物可以降低与急性CHF的治疗相关的费用和/或将这种治疗剂的应用扩展到包括早期和和慢性CHF。
在一方面，本发明提供了产生数据的方法，所述方法包括测定钠尿化合物、测定本发明的钠尿化合物缀合物或一系列这样的钠尿化合物缀合物，并且汇集来自这类测定的数据。因此应当理解所述数据本身以及这些数据的应用还组成了本发明的另一个实施方案。
8.8寡聚修饰部分
本发明还提供了几种PEG线性的和分支的、胺的、微聚乙二醇化的和烷基PEG修饰部分。例如，本发明提供了化合物，所述化合物具有式：
Figure A20038010917900621
(式IV)
其中各C是独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，且m是1-20；且各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；各X是独立地选择的，并且是连接部分。可选择地，C、m、X、PAG和n如上面在式I中所描述。关于式I和III，在某些实施方案中缺少所述Cm-X部分，并且所述PAGn部分以-OH部分或-OCH3部分封端。例如，所述PAG可以是甲氧基封端的或羟基封端的PEG，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个亚单位。
本发明另一个实施方案中提供了具有下式的化合物：
Figure A20038010917900631
(式V)
其中各C是独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，并且m是1-20；和各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；各X是独立地选择的，并且是连接部分。可选择地，C、m、X、PAG和n如上面在式I中所描述。关于式I和III，在某些实施方案中缺少所述Cm-X部分，并且所述PAGn部分以-OH部分或-OCH3部分封端。例如，所述PAG可以是甲氧基封端的或羟基封端的PEG，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个亚单位。
而在另一个方面，本发明提供了具有下式的化合物：
Figure A20038010917900632
(式VI)
在这个化合物中，PAG是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；X是O或N；各o是独立地选择的，并且是1-15。可选择地，PAG、m和X如上面式II中所描述。
本发明也提供了具有下式的化合物：
Figure A20038010917900633
(式VII)
PAG是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；X是O或N；各o是独立选择的，并且是1-15。可选择地，PAG、m和X如上面式II中所描述。
在另一个实施方案中，提供了具有下式的化合物：
Figure A20038010917900641
(式VIII)
其中各C独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，而且m是1-20；并且各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；各X是独立地选择的，并且是连接部分，并且o是1-15。可选择地，C、m、PAG、X和n如上面式III中所描述。
本发明也提供了具有下式的化合物：
(式IX)
其中各C是独立选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，而且m是1-20；并且各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；各X是独立地选择的，并且是连接部分，o是1-15。可选择地，C、m、PAG、X和n如上面式III中所描述。
本发明也提供了几种用于制备此处公开的修饰部分的方法。提供了制备具有下式的化合物的方法：
(式IV)
其中C、m、X、PAG和n如上面式I中所描述。这个方法描述为包括在碱和溶剂存在的情况下将式为
                    Cm-X-PAGn-OH
的化合物与式为
Figure A20038010917900651
的化合物进行反应，以产生产物“a”：
Figure A20038010917900652
在路易斯酸和溶剂存在的情况下将产物与式为：
                    Cm-X-PAGn-OH
的化合物反应，以产生：
Figure A20038010917900653
其中C、m、X、PAG和n如上面式I中所定义。Cl可用另外的卤素例如Br取代。通过例子显示，所述碱进一步被定义为NaH，而所述溶剂进一步被定义为四氢呋喃。这个方法中所使用的路易斯酸也进一步被定义为BF3OEt2。
也公开了制备下式的化合物的本发明的另一个方法：
Figure A20038010917900654
(式V)
其中C、m、X、PAG和n如上面式I中所定义。该方法进一步被定义为包括使产物：
和对硝基氯甲酸酯或碳酸二琥珀酰亚胺酯反应的步骤，其中C、m、X、PAG和n如上面所定义。
而本发明的另一个实施方案提供于制备具有下式的化合物的方法中：
Figure A20038010917900662
其中PAG、n、X和o如上面式II中所定义。该方法进一步描述为包括使式为
Figure A20038010917900663
且其中o如上面式I中所定义的化合物和式为
                    HO-PAGn-X
且其中X是-NH或-OH的化合物在溶剂中反应，以生成式为
的化合物的步骤，其中PAG、n、X和o如上面式II中所定义。
本发明还提供了制备式为：
(式VII)的化合物的方法，其中PAG、n、X和o如上面式II中所定义。该方法被描述为包括使用活化剂例如碳酸二琥珀酰亚胺酯、对硝基氯甲酸酯、光气和N-羟基琥珀酰亚胺活化产物
的步骤，其中PAG、n、X和o如上面式II中所定义。
1.而另一个本发明的实施方案提供了制备式为：
Figure A20038010917900673
(式VIII)的化合物的方法，其中C、m、PAG、n和o如上面式III中所定义。该方法被描述为包括在溶剂中有碱存在的情况下将此处鉴定为上述式IV的产物与式为：
Figure A20038010917900674
的化合物反应的步骤，其中o如上面式III中所定义。在这个方法优选的实施方案中，所述碱是K2CO3，并且所述溶剂是含水溶剂和/或有机溶剂。
2.此外，本发明进一步提供了制备式为：
Figure A20038010917900681
(式IX)的化合物的方法，其中C、m、PAG、n和o如上面式III中所定义。所述方法通常包括将根据制备上述式VIII的方法产生的化合物与活化剂例如N-羟基琥珀酰亚胺进行反应。
9.实施例
下面的实施例已被包括在本发明的说明模型中。在用来示范实践本发明最佳模式的技术和方法方面描述了下面实施例的某些方面。根据本发明公开的内容和在本发明相关领域内已知的总体技术水平，本领域技术人员将理解到下列实施例意在仅作为例子，并且可应用许多变化、修饰和替代而不背离本发明范围。
9.1活化PEG-烷基修饰部分(碳酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯2-[2-(2-{2-[2-(2-十六烷基氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙酯(II)
将六甘醇单十六烷基醚，I(0.202g，0.4mmol)溶解在乙腈(5mL)中，并且加入碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC，0.157g，0.6mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.12g、1.2mmol)，并在10分钟后所述反应混合物变清。在室温(RT)下搅拌反应物过夜。搅拌大约16小时后，将所述粗反应物蒸发至干燥，然后溶解在饱和碳酸氢钠(10mL)中，用乙酸乙酯(2×20mL)洗涤，通过MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，EtOAc/甲醇，10∶1)纯化所述粗产物混合物，以产生0.258g(81％)油状标题化合物II。ESI MS：m/e 648.84(M+H)+。
9.2合成分支的PEG胺修饰部分(碳酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯2-[2-(2-己基-癸酰基氨基)-乙氧基]-乙酯(IV))
将亚硫酰(二)氯(5.5gm，46.6mmol)在30分钟时间内逐滴加入到溶于100mL四氯化碳中的2-己基癸酸I(10gm，38.9mmol)溶液中。加入完成后，将所述反应混合物回流3小时。反应完成后，通过蒸馏除去四氯化碳，并且将反应混合物浓缩以获取粗制酰基氯。通过分馏纯化所述粗制酰基氯以获得清澈液体状的II(10.1gm，91％)。ESIMS：m/e 275.87(M+H)+。
将2-己基-癸酰氯II(750mg，2.74mmol)在30分钟时间内逐滴加入到冷却的溶于10ml二氯甲烷中的2-(2-氨基-乙氧基)-乙醇(575g，5.47mmol)溶液中。加入完成后，将反应混合物的温度增加到25℃。在室温下搅拌反应物过夜。搅拌大约20小时后，用1N HCl酸化所述粗制反应物并且用10ml水进行稀释。然后用二氯甲烷提取反应混合物。接着用1N盐酸、水洗涤有机层，通过MgSO4干燥，过滤并浓缩。用急骤层析法(硅胶，梯度洗脱：2-5％甲醇的三氯甲烷溶液)纯化粗制材料，以产生902mg(96％)白色固体状的单分散性化合物III。ESIMS：m/e 344.54(M+H)+。
将单分散性分支的C16-PEG2III(200mg，0.58mmol)溶解在乙腈(5mL)和碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC，0.224g，0.87mmol)中。然后将三乙胺(0.118g，1.17mmol)逐滴加入，10分钟后反应混合物变清。在室温下搅拌反应物过夜。搅拌大约16小时后，蒸发粗制反应物至干燥，然后溶解在饱和碳酸氢钠(10mL)中，用乙酸乙酯(2×20mL)洗涤，通过MgSO4干燥并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，EtOAc/甲醇，10∶1)纯化残留物，以产生0.206g(74％)油状IV(0.206g，74％得率)。ESI MS：m/e485.63(M+H)+。
Figure A20038010917900701
9.3合成和活化PEG-烷基修饰部分(16-(2-{2-[2-(2-{2-(2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-十六烷酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯)
将H2SO4(1.5mL，31.25mmol)加入到单分散性16-溴-十六烷酸(15.3g，45mmol)的乙醇(300mL)溶液中，并且搅拌反应物48小时。用水稀释粗制反应物混合物，并用二氯甲烷(2×300mL)提取。用水(300mL)、饱和碳酸氢钠(2×300mL)、水(300mL)洗涤有机层，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥，以获得白色固体II(16.03g，98％得率)。
将叔丁醇钾(3.1g，27.5mmol，以小部分在大约30分钟内)加入到单分散性七甘醇单甲基醚(8.51g，25mmol)的THF(250mL)溶液中。然后搅拌反应混合物1小时，接着将溶解在THF(90mL)中的II(10g，27.5mol)逐滴加入并搅拌反应混合物过夜。通过Celite(用约200mL二氯甲烷洗涤)过滤所述粗制反应混合物，并且蒸发至干燥以提供油状物。用急骤层析法(硅胶，梯度洗脱：2-5％甲醇的三氯甲烷溶液)纯化粗制油以获取清澈黄色油状物IV，2.48g(16％)。
将1N NaOH(50.0mL)、25mL甲醇、25mL乙醇加入到单分散性化合物IV(2.22g，3.56mmol)的油中，并搅拌反应混合物24小时。浓缩、酸化(pH约为2)所述粗制反应混合物，用氯化钠饱和并用二氯甲烷(3×75mL)洗涤。合并有机层，用饱和氯化钠洗涤，用MgSO4干燥，并且蒸发至干燥以提供白色固体状单分散性化合物V。用急骤层析法(硅胶，乙酸乙酯)纯化粗制固体以获取V，858mg(40％)。
将单分散性mPEG7-C16-酸V(324mg，544mmol)溶解在15ml无水二氯甲烷中，然后溶解在N-羟基琥珀酰亚胺(94mg，816mmol)和1-乙基-3-(3’-二甲氨基丙基)碳二亚胺中。加入HCl(EDCI·HCl，156mg，816mmol)的无水二氯甲烷溶液。搅拌反应物24小时，然后用1N盐酸、水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。用急骤层析法(硅胶，梯度洗脱：2-5％甲醇的三氯甲烷溶液)纯化粗制材料，以提供单分散性活化的清澈油状物MPEG7-C16 VI(290mg，77％)。
9.4活化PEG-烷基修饰部分(12-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-十二烷酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯)
将单分散性mPEG7-C12-酸I(500mg，0.78mmol)溶解在20ml无水二氯甲烷中，然后溶解在N-羟基琥珀酰亚胺(160mg，1.39mmol)和1-乙基-3-(3’-二甲氨基丙基)碳二亚胺中。加入HCl(EDCI·HCl，233mg，1.390mmol)的无水二氯甲烷溶液。搅拌反应物24小时，然后用1N盐酸、水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。用急骤层析法(硅胶，梯度洗脱：2-5％甲醇的三氯甲烷溶液)纯化粗制材料以提供单分散性活化的清澈油状物MPEG7-C16 VI(370mg，62％)。
Figure A20038010917900731
9.5合成PEG修饰部分(碳酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯2-甲氧基-乙酯)
将单分散性分支的MPEG1 I(200mg，2.63mmol)溶解在乙腈(20mL)中，并加入碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC，II，1.00g，3.94mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.399g，3.94mmol)，并且10分钟后反应混合物变清。在室温下搅拌反应物过夜。搅拌约16小时后，蒸发粗制反应物至干燥，然后溶解在饱和碳酸氢钠(20mL)中，用乙酸乙酯(2×50mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，EtOAc/MeOH，10∶1)提供固体III(0.346g，60％得率)。ESI MS：m/e 218.09(M+H)+。
Figure A20038010917900741
9.6合成可水解的微聚乙二醇化的修饰部分(己酸2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙酯)
将单分散性分支的C6-PEG1 I(100mg，0.625mmol)溶解在乙腈(10mL)中，并加入碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC，II，0.240g，0.936mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.095g，0.936mmol)，并且10分钟后反应混合物变清。在室温下搅拌反应物过夜。搅拌约16小时后，将粗制反应物蒸发至干燥，然后溶解在饱和碳酸氢钠(10mL)中，用乙酸乙酯(2×20mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，EtOAc/MeOH，10∶1)提供白色固体III(0.146g，78％得率)。ESIMS：m/e 302.29(M+H)+。
Figure A20038010917900742
9.7合成线性mPEG修饰部分(碳酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙酯)
将单分散性分支的MPEG2 I(470mg，3.91mmol)溶解在乙腈(20mL)中，并加入碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC，II，1.50g，5.87mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.594g，5.87mmol)，并且10分钟后反应混合物变清。在室温下搅拌反应物过夜。搅拌约16小时后，将粗制反应物蒸发至干燥，然后溶解在饱和碳酸氢钠(20mL)中，用乙酸乙酯(2×50mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，EtOAc/MeOH，10∶1)提供固体III(0.632g，62％得率)。ESIMS：m/e 262.23(M+H)+。
9.8合成可水解的微聚乙二醇化的修饰部分(十二烷酸2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙氧基]-乙酯)
将单分散性分支的C12-PEG2 I(200mg，0.69mmol)溶解在乙腈(10mL)中，并加入碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC，II，0.265g，1.035mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.104g，1.035mmol)，并且10分钟后反应混合物变清。在室温下搅拌反应物过夜。搅拌约16小时后，将粗制反应物蒸发至干燥，然后溶解在饱和碳酸氢钠(10mL)中，用乙酸乙酯(2×20mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，EtOAc/MeOH，10∶1)提供油状III(0.247g，83％得率)。ESI MS：m/e 430.50(M+H)+。
Figure A20038010917900761
9.9合成线性PEG修饰部分(碳酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙酯)
将单分散性分支的MPEG3 I(200mg，1.21mmol)溶解在乙腈(20mL)中，并加入碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC，II，0.468g，1.82mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.184g，1.82mmol)，并且10分钟后反应混合物变清。在室温下搅拌反应物过夜。搅拌约16小时后，将粗制反应物蒸发至干燥，然后溶解在饱和碳酸氢钠(20mL)中，用乙酸乙酯(2×50mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，EtOAc/MeOH，10∶1)提供固体III(0.206g，55％得率)。ESI MS：m/e 306.11(M+H)+。
Figure A20038010917900762
9.10合成可水解的微聚乙二醇化的修饰部分(己酸2-2{-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酯)
将单分散性分支的C6-PEG3 I(200mg，0.80mmol)溶解在乙腈(20mL)中，并加入碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC，II，0.309g，1.209mmol)。然后逐滴加入三乙胺(0.122g，1.209mmol)，并且10分钟后反应混合物变清。在室温下搅拌反应物过夜。搅拌约16小时后，将粗制反应物蒸发至干燥，然后溶解在饱和碳酸氢钠(10mL)中，用乙酸乙酯(2×20mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，EtOAc/MeOH，10∶1)以提供油状III(0.203g，64％得率)。ESI MS：m/e 390.40(M+H)+。
Figure A20038010917900771
9.11合成苯甲基清除可水解的寡聚物(6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸4-(4-硝基-苯氧基羰基氧基甲基)-苯酯)
将叔丁醇钾(3.64g，32.4mmol)溶解在250ml THF中。加入溶解在10mL THF中的MPEG6醇(9.58g，32.3mmol)。搅拌溶液2小时。将从商业购得的6-羟基-己酸乙酯制备的甲磺酸酯(7.0g，29.4mmol)溶解在15mL THF中并且加入到PEG溶液中。在室温下搅拌反应物过夜。用25mL MeOH结束反应并且通过短的Celite垫过滤。在真空中浓缩滤液并且用急骤层析法(EtOAc/2％MeOH)纯化残留物，以获得3.19g(25％)的I。ESI MS：m/e 461.07(M+Na)+。
为了水解乙酯，用35mL 1N NaOH处理1.1g(2.51mmol)的I。6小时后，初始的混浊混合物已逐渐变成清辙的黄色溶液。所述混合物用氯化钠饱和并用浓盐酸酸化直至pH为2。用100mL二氯甲烷提取溶液。用Na2SO4干燥有机物，真空过滤且浓缩以提供0.80g(78％)羧酸II。ESI MS：m/e 411.07(M+H)+，433.10(M+Na)+。
将羧酸III(0.80g，1.95mmol)溶解在16mL二氯甲烷里并且置于N2里。然后向所述溶液中加入0.486g(2.5mmol)EDC和0.288g(2.5mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。5小时后，再加入0.2g EDC和0.12g NHS以促使反应完成。当TLC表示没有未反应的羧酸剩余时，将所述混合物用60mL二氯甲烷稀释并且用1N HCl(1×100mL)、冷水(2×100mL)和盐水(3×100mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机物，在真空中过滤并浓缩以产生0.71g(71％)的III。ESI MS：m/e 508.17(M+H)+，530.07(M+Na)+。
将4-羟基苯甲醇(2.93g，3.6mmol)和2.98g(24.4mmol)DMAP溶解在120mL无水二氯甲烷中。将化合物III(1.2g，2.37mmol)溶解在另外的40mL二氯甲烷中并加入。在室温下搅拌反应物过夜。用1N盐酸(2×200mL)和盐水(2×200mL)洗涤所述混合物。用Na2SO4干燥有机物，过滤并蒸发至干燥。通过急骤层析法(硅胶，EtOAc/10％MeOH)纯化残留物以获得0.701g(58％)的寡聚物IV。ESI MS：539.10m/e(M+Na)+。
将寡聚物IV(0.562g，1.09mmol)溶解在15mL无水二氯甲烷中。将0.23mL(1.64mmol)TEA和0.329g(1.64mmol)对硝基苯基氯甲酸酯加入到该溶液中。在室温下搅拌反应物过夜。然后进一步用15mL二氯甲烷稀释所述混合物并用15mL 1N HCl洗涤之后又用15mL水洗涤。用MgSO4干燥有机物，过滤并浓缩至干燥。通过急骤层析法(硅胶，梯度洗脱：3/1 EtOAc/己烷-EtOAc)纯化粗产物以获得504mg(74％)的活化寡聚物。ESI MS：m/e 682.72(M+H)+，704.72(M+Na)+。
9.12合成芳基氨基甲酸酯可水解的修饰部分(碳酸4-(6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己氧基)-苯酯4-硝基-苯酯)
将MPEG6醇(10.0g，33.7mmol)溶解于40mL无水二氯甲烷中，并将获得的溶液在冰浴中冷却到0℃。加入TEA(5.64mL，40.5mmol)，然后逐滴加入3.13mL(40.5mmol)甲基磺酰氯。于0℃搅拌反应物30分钟，然后从冰浴中移开，使其回到室温并搅拌过夜。用更多的二氯甲烷稀释所述反应混合物并用饱和碳酸氢钠和水洗涤。用MgSO4干燥有机物，在真空中过滤并浓缩以提供12.4g(98％)MPEG6甲磺酸酯，I。
用6.311g二醇(53.41mmoL)和180mL无水THF制备1，6-己二醇溶液。将所述溶液冷却到0℃，并置于N2气氛中。将叔丁醇钾(5.966g，53.41mmol)加入到所述溶液中并搅拌获得的混合物1小时。将溶于30mL THF的I(10.0g，26.7mmol)加入到所述混合物中。将所有物质在0℃下进一步搅拌30分钟，然后使其回到室温并且搅拌过夜。通过Celite过滤所述反应混合物。用二氯甲烷漂洗Celite并用水洗涤。用Na2SO4干燥有机物，过滤并蒸发至干燥。用急骤层析法(硅胶，CHCl3/10％MeOH)进行纯化。一些材料进一步用制备型TLC(EtOAc/10％MeOH)纯化。组合的产量是3.923g(37％)的II。
将II(3.923g，9.89mmol)溶解在16mL无水二氯甲烷溶液中，并将所得溶液冷确到0℃，并置于N2中。加入三乙胺(1.65g，11.9mmol)，然后逐滴加入0.92mL(11.9mmol)甲基磺酰氯。将所述反应物于0℃下进一步搅拌30分钟，然后使其回到室温并且搅拌过夜。用更多的二氯甲烷稀释所述反应混合物并用饱和碳酸氢钠和水洗涤。用MgSO4干燥有机物，在真空中过滤并浓缩以提供4.25g(91％)甲磺酸酯III。
在含有50mL无水THF的烧瓶中溶解5.001g(24.97mmol)4-苄氧基苯酚。加入叔丁醇钾(1.202g，9.989mmol)，并在室温下在惰性气氛中搅拌所得混合物1小时。加入溶于20mL THF中的3.950g(8.324mmol)III的溶液。再过18小时后，用10mL MeOH猝灭整个混合物并通过短的Celite垫过滤。在真空下浓缩所述滤液并通过急骤层析法(硅胶，EtOAc/MeOH 20∶1)纯化残留物以提供1.584g(33％)化合物IV。ESI MS：m/e 579.16(M+H)+，601.14(M+Na)+。
将化合物IV(0.683g，1.18mmol)溶解在20mL MeOH中。向该溶液中加入溶于MeOH中的136mg 5％的Pd/C淤浆。所述整个混合物放于H2下并搅拌直至TLC确定所有起始材料都已消耗。然后通过Celite过滤所述混合物，并将所述滤液蒸发至干燥以产生412mg(71％)的V。ESIMS：m/e  511.09(M+Na)+。
将所述寡聚物V(0.605g，1.09mmol)溶解在15mL无水二氯甲烷中。向该溶液中加入0.23mL(1.64mmol)TEA和0.329g(1.64mmol)对硝基苯基氯甲酸酯。在室温下搅拌反应物过夜。然后进一步用15mL二氯甲烷稀释所述混合物，并用15mL 1N HCl洗涤，接着用15mL水洗涤。用MgSO4干燥有机物，过滤并浓缩至干燥。通过急骤层析法(硅胶，梯度洗脱：3/1EtOAc/己烷-EtOAc)纯化粗制产物，以获得491mg(75％)活化的寡聚物。ESI MS：m/e 654.71(M+H)+，675.71(M+Na)+。
Figure A20038010917900811
9.13活化寡聚物部分的方法
本实施例描述了使本发明寡聚物部分可能被活化的方法。
9.13.1方法I-用DSC活化
将烷基-PEG-OH，I(0.4mmol，1当量)溶解在乙腈(5mL)中，并加入碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC，0.6mmol，1.5当量)。然后逐滴加入三乙胺(1.2mmol，1.5当量)，并且在10分钟后所述反应混合物变清。在室温下搅拌反应物过夜。搅拌约16小时后，将粗制反应物蒸发至干燥然后溶解于饱和碳酸氢钠(10mL)中，用乙酸乙酯(2×20mL)洗涤，MgSO4干燥并蒸发至干燥。用柱层析(硅胶，EtOAc/MeOH，10∶1)提供所述活化的寡聚物II。
9.13.2方法II：用NHS活化
将MPEG-烷基-酸，I(0.544mmol，1.0当量)溶解在15mL无水二氯甲烷中，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.816mmol，1.5当量)和1-乙基-3-(3’-二甲氨基丙基)碳二亚胺。HCl(EDCI·HCl，0.816mmol，1.5当量)的无水二氯甲烷溶液。将所述反应物搅拌数小时，然后用1N盐酸、水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过急骤层析法(硅胶，梯度洗脱：2-5％甲醇的CHCl3溶液)纯化粗材料以提供活化的MPEG-烷基-酸II。
Figure A20038010917900822
9.14用分支的PEG(6-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-1-(2-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基甲基)-乙氧基羰基氨基]-己酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯)
1.将四甘醇单甲基醚(14.0g，67mmol)溶解在四氢呋喃(90mL)中，并逐份地加入NaH(1.77g，74mmol)，并将反应物搅拌2小时。然后逐滴加入表氯醇(26.3mL，0.34mol)并在室温下搅拌所述反应物48小时。用Celite过滤所述粗制反应混合物并用二氯甲烷(250mL)洗涤。用水(2×250mL)洗涤滤液，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯)提供清澈油状的1(10.15g，57％得率)。
Figure A20038010917900831
2.将四甘醇单甲基醚(7.96g，0.038mmol)和1(10.1，0.038mol)溶解在二氯甲烷(100mL)中，并加入BF3OEt2(0.48mL，0.0038mol)。在室温下搅拌反应物过夜。用二氯甲烷(200mL)稀释粗制反应物，用饱和碳酸氢钠(300mL)、水(300mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)提供清澈油状的2(4.5g，25％得率)。
3.将4-硝基氯甲酸酯(2.87g，14.3mmol)和2(4.5g，9.5mmol)溶解在二氯甲烷(45mL)中。搅拌10分钟后，加入TEA(2.1mL，15mmol)并且在室温下搅拌反应物过夜。用二氯甲烷(130mL)稀释粗制反应物，用1M盐酸(175mL)、水(175mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)提供微黄色油状的3(2.38g，40％得率)
Figure A20038010917900833
4.将6-氨基己酸(0.126g，0.96mmol)和碳酸钾(0.221g，1.6mmol)溶解在水(DI，5mL)中。然后将3(0.5g，0.8mmol)溶解在THF(0.7mL)中并逐滴加入。在室温下搅拌所述反应物过夜。用水(20mL)稀释粗制反应物，用HCl酸化至pH约为1，用二氯甲烷(2×25mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，CHCl3/MeOH，15∶1)提供清澈油状的4(0.428g，85％得率)。
5.使用方法II活化：4(0.40g，0.64mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.088g，0.77mmol)，EDCI(0.16g，0.83mmol)和二氯甲烷(5mL)。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)提供清澈油状的5(0.320g，69％得率)。
9.15合成线性PEG-烷基修饰部分(碳酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-己氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酯)
1.将三甘醇(30g，0.2mmol)溶解在NaOH溶液(8g溶于8mL水中)中并搅拌10分钟。然后加入苄基氯(7ml，0.062mol)，并将所述反应混合物加热到100℃并搅拌过夜。用饱和氯化钠(500mL)稀释粗制反应物，用二氯甲烷(2×400mL)洗涤，用MgSO4干燥有机层，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)提供淡黄色油状的1(9.87g，67％得率)。
Figure A20038010917900843
2.向1(9.87g，0.041mol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入TEA(7.1mL，0.054mol)。然后将所述溶液在冰浴中冷确到0℃，然后逐滴加入溶解于二氯甲烷(10mL)中的甲基磺酰氯(3.9mL，0.049mol)。在0℃下搅拌所述反应物0.5小时然后在室温下搅拌4小时。用Celite过滤所述粗制反应物，用二氯甲烷(100mL)洗涤，用饱和碳酸氢钠(150mL)、水(150mL)洗涤滤液，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥，以提供黄色油状的2(11.06g，85％得率)。
3.将三甘醇(7.32g，0.038mol)溶解在四氢呋喃(140mL)中并在半小时内逐份地加入NaH，并再搅拌所述反应物1小时。然后将2(6.0g，0.019mol)溶解在二氯甲烷(20mL)中并逐滴加入，并在室温下搅拌所述反应物过夜。用Celite过滤所述粗制反应物，用二氯甲烷洗涤并蒸发至干燥。将所得的油状物溶解在二氯甲烷中(150mL)，用水(150mL)、饱和碳酸氢钠(150mL)、水(150mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)提供淡黄色油状的3(3.83g，49％得率)
4.以如2相同的方式制备：己醇(6.2mL，0.05mol)，甲基磺酰氯(4.6mL，0.058mol)，TEA(8.6mL，0.065mol)和二氯甲烷(60mL)提供黄色油状的4(7.8g，86％得率)。
Figure A20038010917900853
5.向3(5.45g，0.13mol)的四氢呋喃(160mL)溶液中加入叔丁醇钾(1.60g，0.0144mol)，并搅拌所述反应物1.5个小时。然后将溶解在四氢呋喃(20mL)中的4(2.59g，0.0144mol)逐滴加入并搅拌反应物过夜。用Celite过滤所述粗制反应物，用二氯甲烷洗涤，并且蒸发至干燥。将所得的油状物溶解在乙酸乙酯(150mL)中，用水(2×150mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯)提供淡黄色油状的5(2.40g，36％得率)。
6.向5(2.4g，4.8mmol)的乙酸乙酯(16mL)溶液中加入存在于活性炭上的10wt％(1.0g)的钯，并用隔膜将反应容器密封。然后用针将含H2的气球插入到隔膜中并在室温下搅拌反应物过夜。用Celite过滤所述粗制反应物，用乙酸乙酯洗涤，并蒸发至干燥以提供清澈油状的6(1.61g，82％得率)。
Figure A20038010917900861
7.将光气溶液(15mL 20％光气的甲苯溶液)冷却到-10℃，并将溶解在甲苯(5mL)中的6(1.60g，3.9mmol)逐滴加入。在-10℃下搅拌所述反应物0.5小时然后在室温下搅拌4小时。将光气和甲苯蒸馏完并且将所得油状物在真空下干燥以提供淡黄色油状的7。
Figure A20038010917900862
8.用方法II活化：7(1.65g，0.79mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.437g，3.8mmol)，TEA(2.7mL，3.8mmol)和二氯甲烷(10mL)。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/MeOH，15∶1)以提供清澈油状的8(1.06g，57％得率)。
9.16合成分支的烷基-PEG-烷基(6-[2-(2-{2-[2-(2-庚氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-1-(2-{2-[2-(2-庚氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基甲基)-乙氧基羰基氨基]-己酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯)
Figure A20038010917900863
1.以实施例9.15中显示的相同方式制备：己醇(18mL，0.15mol)、甲基磺酰氯(12.3mL，0.16mol)，TEA(25mL，0.18mol)和二氯甲烷(180mL)提供黄色油状的1(23.1g，85％得率)。
Figure A20038010917900864
2.将四甘醇(50.5g，0.26mol)溶解在四氢呋喃(350mL)中，并在0.5小时内逐份地加入叔丁醇钾(29.2g，0.26mol)。再搅拌所述反应物1小时，然后加入溶于THF(50mL)中的1(23.0g，0.13mol)。在室温下搅拌所述反应物过夜。用Celite过滤所述粗制反应物，用二氯甲烷洗涤，并且蒸发至干燥。将所得的油状物溶解在二氯甲烷(300mL)中，用水(2×300mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯)提供清澈油状的2(18.51g，51％得率)。
Figure A20038010917900871
3.逐份地向2(10.0g，36mmol)的四氢呋喃(60mL)溶液中加入NaH(0.95g，40mmol)，并将反应物搅拌0.5小时。然后逐滴地加入表氯醇(14.1mL，0.34mol)，并在室温下搅拌反应物48小时。用Celite过滤所述粗制反应物，用二氯甲烷洗涤，并且蒸发至干燥。将所得的油状物溶解在二氯甲烷(200mL)中，用饱和氯化钠(200mL)、饱和碳酸氢钠(200mL)、水(200mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/己烷，10∶1)提供清澈油状的3(5.46g，45％得率)。
4.向2(4.54g，16mmol)和3(5.46，16mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入BF3OEt2(0.48g，0.0038mol)。在室温下搅拌反应物过夜。用二氯甲烷(50mL)稀释所述粗制反应物，用饱和碳酸氢钠(100mL)、水(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/MeOH，10∶1)提供清澈油状的4(2.40g，24％得率)。
Figure A20038010917900873
5.将4-硝基氯甲酸酯(1.18g，5.8mmol)和4(2.4g，3.9mmol)溶解在二氯甲烷(25mL)中。搅拌10分钟后，加入TEA(0.89g，6.4mmol)并在室温下搅拌反应物过夜。用二氯甲烷(75mL)稀释所述粗制反应物，用1M盐酸(100mL)、水(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯)提供淡黄色油状的5(1.04g，34％得率)。
Figure A20038010917900881
6.将6-氨基己酸(0.157g，1.2mmol)和碳酸钾(0.276g，2.0mmol)溶解在水(DI，8mL)中。然后将5(0.80g，1.0mmol)溶解在THF(1.0mL)中并逐滴加入。当加入3和加入乙醇(2mL)时形成了油滴，并在室温下搅拌所述反应物过夜。用水(30mL)稀释粗制反应物，用HCl酸化至pH约为1，用二氯甲烷(2×35mL)洗涤，用MgSO4干燥有机层，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/MeOH，20∶1)提供清澈油状的6(0.720g，46％得率)。
Figure A20038010917900882
7.用方法II活化：6(0.356g，0.46mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.063g，0.55mmol)，EDCI(0.115g，0.6mmol)和二氯甲烷(3mL)。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯)提供清澈油状的7(0.180g，45％得率)。
9.17合成糖-PEG-烷基修饰部分2，2-二甲基-丙酸4，5-二-(2，2-二甲基-丙酰氧基)-6-(2，2-二甲基-丙酰氧基甲基)-3-{6-[2-(2-{2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基)-乙氧基]-己酰氨基}-四氢-吡喃-2-基酯)
1.以实施例9.15显示的相同方式制备：6-羟基己酸乙酯(8.0g，0.05mol)，甲基磺酰氯(4.6mL，0.06mol)，TEA(10mL，0.072mol)和二氯甲烷(32mL)提供黄色油状的1(11.5g，93％得率)。
2.将四甘醇(19.1g，0.098mol)溶解在四氢呋喃(190mL)中，并在0.5小时内逐份地加入NaH(1.69g，0.071mol)。另外再搅拌所述反应物1小时，然后加入溶解在四氢呋喃(10mL)中的1(23.0g，0.13mol)。在室温下搅拌所述反应物过夜。用Celite过滤所述粗制反应物，用二氯甲烷洗涤，并且蒸发至干燥。将所得的油状物溶解在二氯甲烷(200mL)中，用饱和氯化钠(200mL)、水(200mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/MeOH，25∶1)提供清澈油状的2(1.60g，10％得率)。
Figure A20038010917900892
3.将溶解于1M NaOH(6mL)中的2(1.60g，4.7mmol)的溶液在室温下搅拌2小时。用饱和氯化钠(24mL)稀释所述粗制反应物，酸化至pH约为2，用二氯甲烷(2×30mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥以提供清澈油状的3(1.08g，73％得率)。
Figure A20038010917900893
4.将2，3，4，6-四-O-三甲基乙酰-β-D-吡喃半乳糖基胺(0.836g，1.6mmol)和3(0.50g，1.6mmol)溶解在二氯甲烷(8mL)中。然后加入EDCI(0.368g，1.92mmol)，并在室温下搅拌所述反应物过夜。搅拌过夜后，由于反应不完全所以加入EDCI(0.368g，1.92mmol)并在室温下搅拌所述反应物过夜。用二氯甲烷(22mL)稀释粗制反应物，用1M盐酸(30mL)、水(30mL)、饱和氯化钠(30mL)洗涤，用MgSO4干燥，并蒸发至干燥。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯/MeOH)提供粘滞油状的4(0.397g，31％得率)。
Figure A20038010917900901
5.使用方法I活化：4(0.397g，0.50mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.063g，0.60mmol)、TEA(0.10mL，0.75mmol)和乙腈(4mL)。通过柱层析(硅胶，乙酸乙酯)提供粘滞油状的5(0.256g，56％得率)。
9.18可水解的、不可水解的和聚乙二醇化的钠尿缀合物
本实施例用以展示提供了钠尿化合物缀合物的本发明的用途，所述钠尿化合物缀合物实际上已被修饰，以包括所有种类的寡聚物部分，特别是不可水解的寡聚物、微聚乙二醇化的寡聚物和可水解的寡聚物。
使用缀合在所述肽的不同位置的各种寡聚物来合成本发明的hBNP。具有最佳性状(对受体的激动剂活性、对蛋白酶解的抗性和口服生物利用率)组合的缀合物已成为用于更广泛的体内检验的主要候选者。
天然hBNP购自有合同关系的肽合成公司。用于缀合的两亲性寡聚物来自供给的寡聚物和来自专门设计和合成用以缀合hBNP的寡聚物。所述缀合依据图2说明的三级缀合策略。首先检验第1级寡聚物。因为与第1级寡聚物的充分缀合会减少活性，所以研究了与第2级寡聚物的三缀合物和四缀合物。因为第2级寡聚物不有效，所以估计了两种前体药物缀合物(第3级寡聚物)。
第一级缀合物是不可水解的。对于这级的缀合物，所施用的药物物质(即所述缀合物)是在受体起作用的物质。换句话说，所述寡聚物和其与肽的附着从服药开始到清除药物的期间都保持完整。这些寡聚物通常由烷基部分和PEG部分组成。为了使所述寡聚物促使所述缀合物能够口服和抵抗蛋白酶解的效力最大化，可以改变烷基和PEG部分的长度和交换其次序。也可以操纵缀合的程度(例如单-、双缀合)。一些能提供落在所述第一级范围内的缀合物的寡聚物以及提供所述缀合物的方法描述于Ekwuribe的美国专利号5,359,030；Ekwuribe的美国专利号5,438,040；Ekwuribe的美国专利号5,681,811；Ekwuribe的美国专利号6,191,105；1999年12月31日提交的美国申请号09/474，915；1999年12月13日提交的美国申请号09/459,443和2001年6月4日提交的美国申请号09/873,797，此处引用其公开全文作为参考。
第二级缀合物是微聚乙二醇化的。对于这级缀合物，一旦所述缀合物进入血流，寡聚物的烷基部分就将被切割。当缀合发生在所述钠尿肽的与受体NPR-A结合所必需的区域内时，这些缀合物是非常有用的。在这种情况下，所述第一级寡聚物可能有益于稳定和运送，但可能损害活性。第二级缀合物减少或消除了这个问题。所述两亲性寡聚物通过消化道时保持完整性并且增强了在十二指肠上部的吸收。一旦进入循环，所述烷基部分就被切割。于是，当其到达受体时，只有更小的寡聚物附着到循环的肽上。在一些实施方案中，减少的位阻会导致在受体的增强的活性。一些能提供落在这第二级范围内的缀合物的寡聚物以及提供所述缀合物的方法描述于Ekwuribe的美国专利号6,309,633；2001年12月19日提交的美国申请号10/018,879，此处引用其公开全文作为参考。
第三级缀合物是完全可水解的。对于这级缀合物，一旦所述缀合物被吸收，整个寡聚物就将被切割。象第二级那样，当缀合发生在结合所必需的区域内时，这些缀合物将特别有用。然而，如果所述微聚乙二醇化的缀合物仍不能保留足够的活性，那么第三级缀合物将完全消除所述寡聚物干扰受体结合的可能性。在这种情况下，缀合物保持完整地穿过消化道。一旦所述缀合物被吸收，所述寡聚物就被切割，于是在循环中释放天然肽。
缀合hBNP。用N-羟基琥珀酰亚胺(肽化学中的通用活化基团)活化两亲性寡聚物(C6PEG7)的羧基基团。一旦活化，所述寡聚物就会附着到存在于含水或DMSO溶液中的肽上。hBNP有4个缀合位点：3个Lys残基和N末端。通过改变反应的化学计量、可控制缀合程度(单-、双-等)。通过改变反应条件可改变产物分布。因为用于缀合的优选的位点是通过活性测定发现的，所以通过改变化学计量和反应条件可获得优选的想要的缀合物合成。
PEG-烷基寡聚物的选择。通过改变烷(疏水性的)和PEG(亲水性的)成分的相对长度，可改善所述缀合物的两亲性和溶液结构。PEG部分在溶液中是非常柔韧的并且在对酶的抗性中起着重要作用。烷基部分可增强在肠内的吸收和/或促使与细胞膜的相互作用。当靶是细胞表面上膜结合的蛋白例如NPR-A时，所述后一个特性将非常重要。因而，寡聚物的选择可决定所述缀合物在酶稳定性和口服生物利用率方面的有效性。
纯化hBNP缀合物。在具有异丙醇/水(0.1％三氟乙酸)制备的梯度溶剂系统的制备型HPLC柱(C-18)上纯化反应混合物。将所述溶剂蒸发，并冻干以获得干燥产物。通过反相HPLC和质谱法确定所述缀合物的纯度。
9.18.1第1级寡聚物：不可水解的
合成超过30个利用不可水解的寡聚物(第1级)的缀合物。对于这级缀合物，施用的药物物质是充当受体的物质。换句话说，从服药开始到清除期间，所述寡聚物和其与肽的附着保持完整。肽作图实验揭示在hBNP上附着寡聚物的位点。通过改变加入反应中的寡聚物的量，可以改变产物的分布。形成的主要单缀合物是缀合在Lys3的；主要的双缀合物在Lys3和Lys4上附着有寡聚物。通过改变反应条件，三缀合物和/或四缀合物可作为唯一的产物形成。三缀合物的特征在于寡聚物附着在Lys3、Lys14和Lys27上。四缀合物在N末端加上第四个缀合。首先分离所有可获得的单、双、三和四缀合物并在体外检测其活性。根据活性数据，当使用第1级寡聚物时，Lys3单缀合物是主要的。
9.18.2第2级寡聚物：微聚乙二醇化的
根据理论合成8个使用微聚乙二醇化(第2级)的缀合物，所述理论是：因为Lys14和Lys27在(或靠近)BNP的结合部分上，所以这些位点的微聚乙二醇缀合将使所述肽能更全面地缀合并且仍保留活性。所述两亲性寡聚物保持完整地穿过消化道并且增强了在十二指肠上部的吸收。一旦进行循环，所述烷基部分就被切割。因此，当其到达受体时，只有更小的寡聚物附着在循环的肽上。在切割所述烷基基团之前和之后合成这级三和四缀合物。甚至在切割烷基基团后，附着在BNP的3或4个位点上的小PEG单位对活性仍是有害的(在下一部分显示数据)，尽管这些缀合物保持着治疗学上显著程度的活性。
9.18.3第3级寡聚物：可水解的寡聚物
合成8个使用完全可水解的寡聚物(第3级)的缀合物。对于这级缀合物，所述缀合物保持完整地穿过消化道。一旦所述缀合物被吸收，所述寡聚物就被切割，从而在循环中释放出天然肽。与第2级一样，当缀合发生在结合所必需的区域内时，这些缀合物将会有用。然而，在微聚乙二醇化的缀合物仍不能保持活性的情况下，所述第3级缀合物将完全消除所述寡聚物干扰受体结合的可能性。单、双、三和四缀合物由这级寡聚物制备。三和四缀合物较不稳定。对两种缀合物进行了检验。
在具有用异丙醇/水(0.1％三氟乙酸)制备的梯度溶剂系统的制备型HPLC柱(C-18)上纯化所述反应混合物。将所述溶剂蒸发，并冻干以获得干燥粉末。通过反相HPLC和质谱法确定所述缀合物的纯度。
在测定中对天然BNP进行检查以提供天然的、野生型hBNP肽的活性测量值。所使用的天然hBNP肽从1-32位的氨基酸序列为SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH，(SEQ ID NO：)，其中C10和C26通过二硫键相连成键。表1提供了29个构建体的结果和结构。对所述BNP缀合物的EC50和Emax进行估量，并且将这些值同那些天然肽在相同实验条件下获得的值进行比较。表1提供了与不具有寡聚物部分的天然BNP(1-32aa)比较的数据。所述结果显示了优选的单缀合物BNP，所述单缀合物BNP包括在Lys3上包括第1级修饰部分的单缀合物BNP(BNP-002)和在Lys14或Lys27上包括在第2级修饰部分的单缀合物BNP。
所述单-1、单-2、单-3和单-4都是所述BNP的单缀合物，并且以它们以从HPLC中洗脱的顺序进行标记。在下列表中，所述单-1BNP是指在BNP的Lys-3位残基上包括所示的修饰部分(寡聚物结构)的BNP肽缀合物。从HPLC上共同洗脱出来的单-2和单-3是Lys-14和Lys-27的混合物。所述双缀合物通常以混合物的形式获得，所述混合物紧密结合在一起从HPLC上洗脱下来。主要的双缀合物是Lys-3/Lys-14和Lys-3/Lys-27。主要的三缀合物是在Lys-3、Lys-14和Lys-27缀合的。鉴定为“单-4”的产物包含在BNP肽的N末端的修饰部分(寡聚物)。所述“单-1”包含缀合在BNP肽的Lys-3上的修饰部分。所述“单-2”包含缀合在BNP肽的Lys-14上或Lys-27上的修饰部分(寡聚物)。
表1
Figure A20038010917900961
9.19钠尿肽候选物——尿舒张肽、树眼镜蛇属钠尿肽(DNP)和犬钠尿肽
可以预期本发明的缀合技术可应用于许多不同钠尿肽和这些肽的类似物以用来构建任何数目的不同生物活性钠尿肽缀合物实施方案，所述钠尿肽缀合物具有保持的药理学活性、增强的细胞膜通透性和/或蛋白酶抗性。除了此处几个实施例中描述的hBNP外，这些候选肽以部分列表的方式包括肽、肽片段和完整肽，以及从下列生物等价的肽/蛋白集合中制备和/或分离的多构建体肽。在本发明实施方案中的制剂中以及在药物制剂中包含这些构建体和其保守取代构建体落在本发明范围内，所述药物制剂以与至少一个此处所限定的用于治疗充血性心力衰竭的修饰部分缀合的形式含有所述构建体。这些肽拥有易于与修饰缀合部分作用的结构。
1. 尿舒张肽(在N末端具有4个额外残基的hANP)
TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFX1Y(SEQ ID NO：)
所述氨基酸T确定了修饰部分缀合位点。在上述序列中，X1是赖氨酸或除精氨酸以外的氨基酸。当此处X1是赖氨酸时，就提供了第二个修饰部分缀合位点。
2. 犬钠尿肽(犬NP)
犬BNP为缀合物的生产提供天然的优点。在环状区域不存在缀合位点。缀合位点存在于N-和C-末端尾部。这些性质将使缀合物不会大量失去活性。其也应该会导致更小的产物分布，从而导致更高的得率和更容易纯化。
SPX1MMHX2GGCFGRRLDRIGSLSGLGCNVLRX3Y(SEQ.ID.NO：)
氨基酸位点X1、X2和X3提供修饰部分缀合位点。在这个中性肽中，所有3个肽的位点都可用来与修饰部分缀合。从氨基酸10(C)到氨基酸26(C)被确认为环状区域。可以想象在3、14或27位的任何2个或所有3个氨基酸可被除了Lys外的其它残基例如Arg取代。
3.树眼镜蛇属钠尿肽(DNP)
EVX1YDPCFGHX2IDRINHVSNLGCPSLRDPRPNAPSTSA(SEQ ID NO.)
氨基酸位点X1和X2是修饰部分缀合位点。在这个例子中，X1和X2都是氨基酸Lys。在一些实施方案中，X1是Arg或X2是Arg。所述N末端也是缀合位点。优选地，当X1是赖氨酸时，X2是精氨酸(或除赖氨酸之外的氨基酸)。任选地，所述肽可在N末端包含进一步的缀合位点。
4.C型钠尿肽(CNP)
GLSK1GCFGLK2LDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：)
氨基酸位点K1和K2是修饰部分缀合位点。在这个例子中，K1和K2都是氨基酸Lys。然而，所述肽的类似物可在该肽这些位点的任一个或同时两个位点上用Arg(R)代替Lys。任选地，所述肽可在N末端包含进一步的缀合位点。
5.ANP(人类)(大鼠)(猪)
SLRRSSCFGGRXDRIGAQSGLGCNSFRY(SEQ ID NO.：)
在这个例子中，X是Met(M)或Ile(I)，并且其中修饰部分缀合位点在N末端，或R改变为K以提供修饰部分位点。
9.20对人钠尿肽受体A(NPR-A)的激动剂活性
BNP的血管舒张剂、促尿钠排泄剂和利尿剂性质归因于第二信使，环GMP(cGMP)。cGMP的产生由鸟苷酸环化酶来完成，所述酶是当BNP结合到位于内皮细胞表面的钠尿肽受体A(NPR-A)时活化的酶。对缀合物刺激表达钠尿肽受体-A(NPR-A)的人主动脉内皮细胞(HAEC)产生cGMP的能力进行评估，所述缀合物具有不可水解的(第1级)或微聚乙二醇化的(第2级)寡聚物。对于微聚乙二醇化的组，检测附着有和没有附着烷基部分的缀合物。在本测定中不评估具有完全可水解的寡聚物(第3级)的缀合物，因为最终在循环中释放的化合物是天然肽。
使用不可水解的(第1级)寡聚物的三和四缀合物活性较低。因此，制备并检验使用微聚乙二醇化的(第2级)寡聚物的三和四缀合物。表2显示来自于这些第2级寡聚物在体外产生的数据。
表2：使用第二级寡聚物的hBNP缀合物的体外活性
  hBNP或hBNP缀合物   缀合程度   平均EC50(nM)   平均Emax(％)
  天然的hBNP   无   236(+/-)120   100
  BN-007   三   ＞10,000   ＜20
  BN-008   四   ＞10,000   ＜20
BN-010 四 ＞10,000 ＜20
  BN-013   四   ＞10,000   ＜20
  BN-014   三   ＞10,000   26.5
  BN-015   四   ＞10,000   ＜20
  BN-016   四   ＞10,000   24.6
  BN-018   四   ＞10,000   ＜20
图3显示对各种使用第1级寡聚物的Lys-3缀合物的活性曲线。表2中4种缀合物显示具有与天然形式BNP肽(表3)中获得的活性最为接近的平均Emax和平均平均EC50，于是在其它测定中进行进一步评估。
表3：hBNP缀合物的体外活性
  化合物   平均EC50(nM)   平均Emax(％)   n
  天然的hBNP   236(+/-)120   100   25
  BN-002   387(+/-)171   102   5
  BN-021   355(+/-)140   90   5
  BN-022   364(+/-)99   79   5
  BN-024   296(+/-)172   87   6
用于cGMP筛选的原代HAEC购自Clonetics。在实验前一天将细胞涂布在12孔板上。在实验当天，在37℃下用0.5mM IBMX预温育细胞10分钟以抑制磷酸二酯酶。将检验化合物加入细胞，在37℃下再温育60分钟，并且通过裂解细胞停止温育以测量cGMP。使用基于ELISA的cGMP试剂盒测量cGMP生产(CatchPoint-cyclic GMP FluorescentAssay Kit，catalog#R8074，Molecular Devices Corp，Sunyvale，CA)。该试剂盒通过在96孔形式上的竞争性免疫测定测量cGMP。将细胞裂解物加入到有涂层的微量培养板中，接着加入抗cGMP抗体和辣根过氧化物酶(HRP)-cGMP缀合物。将板在室温下温育2小时，接着进行4次洗涤。加入底物溶液并对每个孔里的荧光强度进行定量。所述荧光信号强度随着cGMP水平的不断升高而降低。在各实验中将天然hBNP作为正对照进行测定。
9.21 BNP缀合物和增加的对蛋白酶的抗性
在各种蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶存在的情况下检验在体外具有活性的所述钠尿化合物的稳定性。用在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶存在的情况下所述化合物缀合物的半衰期来确定这些与蛋白酶缀合的化合物的稳定性。于是，几种在这些测定中评估的缀合物具有比天然hBNP更长的半衰期，例如，参见图4。
在37℃下将缀合物和酶一起温育2-120分钟。通过加入1∶1的1％三氟乙酸(TFA)：异丙醇猝灭溶液停止消化作用。在各实验中将所述hBNP缀合物的消化与天然hBNP的消化进行比较。通过HPLC分析对保留在各样品中的亲体化合物的量进行定量。
9.22 BNP缀合物和口服生物利用率
在大鼠中对在体外具有活性的所述缀合物进行其口服生物利用率的检验。将所述缀合物通过口服管饲法施用于胃肠道，并用可获得的放射性免疫测定方法测定存在于血流中的hBNP缀合物。用于检测hBNP的抗体是特异性的；与大鼠BNP的交叉反应性小于1％。因此，由内源性大鼠BNP造成的交叉反应性和干扰是不足道的。
将成年雄性体重约为250g的大鼠用于确定hBNP和hBNP缀合物的口服生物利用率。将大鼠禁食过夜并随意提供自来水(除了施药前2小时到施药后1小时期间内不给水)。
施药前，对大鼠称重并按体重将其分配到不同施药组以使各施药组中的体重基本一致。每个时间点使用5只大鼠。缀合物以液态脂肪酸制剂按2.5mg/kg的剂量施用。在施药后5、15、30和60分钟收取血液样品。收集用于所有施药实验的中央静脉血液并离心。将血浆样品在-80℃下冻存以作分析。
用专门用于定量确定血浆中的人BNP的可商购的免疫放射分析(IRMA)(SHIONORIATMBNP，catalog#127024，Shionogi & Co.，Ltd，Osaka，日本)来测量血浆中hBNP缀合物的浓度。从服药的大鼠中抽取血液到涂覆有EDTA的塑料聚对苯二甲酸乙二酯(PET)血液收集管中，并在冷冻(2-8℃)离心机中以1600-2000×g速度离心5分钟。将样品于-80℃在不结霜的冰箱中贮存在塑料管中直至分析。将500μl的样品用于IRMA。将100μl的样品和200μl的125I-BNP试剂和涂覆有抗BNP抗体的珠子加入管中。将各管涡旋并在不摇动状态下于2-8℃下温育18到22个小时。然后从管中吸出样品并用2.0mL洗涤溶液(缓冲液+0.05％NaN3)洗涤管然后再吸出。反复进行洗涤过程并将管内内容物吸出。用γ计数器计数各管剩余的放射性。所述放射性与样品中hBNP和hBNP缀合物浓度成正比。为了精确地定量hBNP缀合物样品，因而使得在hBNP缀合物和天然分子之间的抗体识别有差异，从获自合适的hBNP缀合物的标准曲线来确定浓度。
在施药后5分钟(图5)，所述四种给大鼠服用的缀合物都可在循环中检测到。这四种缀合物是BNP-002、BNP-021、BNP-022和BNP-024。
9.23制备肽结构上的双缀合物、单缀合物和三缀合物聚合物修饰
本实施例提供以展示本发明在生成所选择的生物活性肽的多缀合物形式中的应用。通过例子，本发明将描述人钠尿肽hBNP的单缀合物、双缀合物和三价缀合物形式。
缀合hBNP的实验流程：
通过相同的用于缀合hBNP的方法来与寡聚物附着。一个不同的方面是将加入更多的活性寡聚物(1-10当量；优选地3-5当量)。
赖氨酸位于所述序列的尾部。在蛋白酶存在的情况下，多个缀合位点可能将提供更大的稳定性。在环中缺少缀合位点对在NPR-A结合基元的结合是有利的。
9.24合成hBNP两亲性寡聚物缀合物
通过使用不同大小和化学组成的两亲性寡聚物，可以改变肽缀合物例如hBNP缀合物的吸收和分配性质。将缀合物筛选用来确定哪个缀合物保持天然肽的活性并显示增强的对酶的抗性。具有想要的性状(例如，对受体的激动剂活性、对蛋白酶解的抗性和口服生物利用率)组合的缀合物成为首选的进行更广泛体内检验的候选物。
9.24.1缀合BNP的一般方法
单缀合物hBNP使用位点Lys3或Lys14，或Lys27，或所述肽的N末端。
方法I：制备单缀合物
将h-BNP(1当量)溶解于DMSO(1ml/35mg h-BNP)中。将所述活化的寡聚物(1.1当量)溶解于最小量的THF中并且加入到h-BNP的DMSO溶液中。用HPLC监控所述反应。通过取出50μl反应物并将其稀释于含有0.1％TFA的500μl的水中来制备用于HPLC监控的样品。反应进行45分钟。如果反应物没有立即进行纯化，则将它们冷冻直至进行纯化。
方法II：制备多缀合物
将h-BNP(1当量)溶解于DMSO(1ml/35mg h-BNP)中。一旦h-BNP溶解，就加入TEA(120当量)并且搅拌所述溶液5分钟。然后将活化的寡聚物(2.2当量用于双缀合物，4当量用于三缀合物，5当量用于四缀合物)溶解于最小量的THF中并且加入到h-BNP的DMSO溶液中。用HPLC监控所述反应。通过取出50μl反应物并将其稀释于含有0.1％TFA的500μl的水中来制备用于HPLC监控的样品。反应进行45分钟。如果反应物没有立即进行纯化，则将它们冷冻直至进行纯化。
双缀合物hBNP使用位于hBNP上的位点Lys3和Lys14，或Lys3和Lys27。
三缀合物hBNP使用位点Lys3，Lys14和Lys27。
9.25钠尿化合物类似物
本实施例提供以展示本发明在提供用于本发明实践中的各种形式的生物活性BNP样肽和其肽片段的应用。这些变异形式或类似物的特征在于在对应的天然肽/蛋白上天然存在的氨基酸被一个或多个突变氨基酸替代。
1.hBNP类似物—单独的环状区域
CFGRXMDRISSSSGLGC-(SEQ ID NO.1)
其中X是除了Lys外的氨基酸，或X是精氨酸或甘氨酸。
2.hBNP类似物-3Arg或除了Lys的氨基酸
-SPRMVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC-X2-(SEQ ID NO.)
其中X2长度是1-10个氨基酸，优选地1-6个氨基酸。在一些实施方案中，X2是KVLRRH、KVLRR、KVLR、KVL、KV、K、RVLRRH、RVLRR、RVLR、RVL、RV或R。
3.hBNP类似物-3突变位点；3Arg、14Arg、27Arg
SPX1MVQGSG-CFGRX2MDRISSSSGLGC-X3VLRRH(SEQ ID NO.)
其中X1是Lys或除了Lys之外的氨基酸，X2是除了Lys之外的氨基酸，且X3是Lys或除了Lys之外的氨基酸。在一些实施方案中，X1、X2和X3独立地是Arg或Gly。在其它实施方案中，X1是Lys，X2和X3独立地是Arg或Gly。在优选的实施方案中，X1、X2和X3中至少有一个是Lys。
4.hBNP类似物-14和27Arg，和末端修饰位点X1。
X1SPKMVQGSG-CFGRX2MDRISSSSGLGC-X3VLRRH-(SEQ ID NO.)
其中X1是C末端修饰位点(Ser)；且其中X2和X3是除了Lys外的氨基酸。在一些实施方案中X2和X3独立地是Arg或Gly。在其它实施方案中，X2是Arg且X3是Lys。
5.hBNP类似物-14Arg
(所有片段，其中一个或两个尾部都最多缩短到环部)
X1---CFGRRMDRISSSSGLGC-X2(SEQ ID NO.1)
其中X1长度是1-10个氨基酸，优选地1-9个氨基酸，且其中X2长度是1-10，优选地1-6个氨基酸。X1可包括SPKMVQGSGC、PKMVQGSGC、KMVQGSGC、MVQGSGC、VQGSGC、QGSGC、GSGC、SGC、GC、C、SPK、SPKM、SPKMV、SPKMVQ、SPKMVQ、KMVQ、KMV、KMVQG、KMVQGS、KMVQGSG或KMVQGSGC。X2可以包括KVLRRH、KVLRR、KVLR、KVL、KV、K、RVLRRH、RVLRR、RVLR、RVL、RV或R。
6.hBNP 1-29类似物-3Arg或除Lys外的氨基酸
SPX1MVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC-KVL(SEQ ID NO.)
其中X1是Arg，或除Lys外的氨基酸。
7.hBNP1-26类似物-3Arg或除Lys外的氨基酸
SPX1MVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC(SEQ ID NO.)
其中X1是Arg、Gly或除Lys外的另外氨基酸。
8.hBNP类似物-截短的C末端尾部Lys 14Arg，27Arg，或除Lys外的氨基酸
X1-CFGRRMDRISSSSGLGC-RVLRRH(SEQ ID NO：)
其中X1长度是1-10个氨基酸，优先地1-9个氨基酸。X1可包括SPKMVQGSGC、PKMVQGSGC、KMVQGSGC、MVQGSGC、VQGSGC、QGSGC、GSGC、SGC、GC或C。
9.hBNP类似物-Lys 14Arg或除Lys外的氨基酸
-CFGRX1MDRIX2GLGC-(SEQ ID NO._)
其中X1是Arg或除Lys外的氨基酸，且X2是1-4个氨基酸。在一些实施方案中，X2是SSSS、SSS、SS、S、KSSS、KSS或KS。
10.hBNP类似物-Arg 30Lys或其它具有相似电荷的等同氨基酸
SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVRX1RH(SEQ ID NO.)
其中X1是Lys或除Arg外的氨基酸。
11.hBNP类似物-27Arg或除Lys外的氨基酸
SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGC X1VLRRH(SEQ ID NO.)
其中X1是Arg或除Lys外的氨基酸。
12.hBNP的延伸形式
—SPKMVQGSG-CFGRKMDRISSSSGLGC-KVLRRH-X2(SEQ ID NO.)
X2是Lys、Cys或Lys+Xaan，其中n是1-100、1-50或1-10，且Xaa是任何氨基酸或独立选择的氨基酸组，或未知氨基酸。
13.hBNP的缺失突变类似物
-CFGRX1MDRIX2GLGC-(SEQ ID NO.)
其中X1是Arg或除Lys外的氨基酸，且其中X2是1-4个氨基酸，例如SSSS、SSS、SS、S、KSSS、KSS或KS。
14.hBNP类似物—受体特异性
SPZ1MVQGSG-CFGRZ2MDRISSSSX1X2X3C
其中Z1是精氨酸或除了赖氨酸外的氨基酸，且其中Z2是精氨酸或除了赖氨酸外的氨基酸，其中X1是Gly Met Leu、Phe、Ile或其保守替代，其中X2是Leu、Trp、Tyr和Phe或其保守替代，且其中X3是Gly、Arg或其保守替代。在另一个这个类似物的实施方案中，Z1是赖氨酸且Z2是精氨酸或除了赖氨酸外的氨基酸。
15.ANP类似物
KCFKGKNDRX1KX2QSGLX3C-NSFKY
其中X1是T、a、R、H、P、E；
其中X2是K、N-甲基、Arg、S、D或P；
其中X3是Arg、K、Y、F、S、P、Orn、Har、Har、对脒基苯基Ala、I、除了Gly以外的带正电荷的任何其它氨基酸或Try。
9.26天然BNP和BNP前肽的重组产物和生产BNP缀合物的前肽方法
口服施用途径需要大量供应BNP肽。由于高成本和与提供BNP的合成方法相关的供应量的限制，重组技术将优选地用来制备缀合的BNP肽。此处描述用于提供用来生产所述缀合物的肽的重组技术。
9.26.1重组技术的选择
目的是选择高表达重组技术，所述重组技术已知用来表达无糖基化的小蛋白(＞10,000K)并且将所述肽以可溶性的形式分泌以易于分离。
使用基于大肠杆菌(E.coli)的表达系统(U.S.5,114,923，Seilhamer等人，此处引用作为参考)以生产大量用于批准的药物Natrecor的BNP。大肠杆菌细菌系统在过去数十年中在单链蛋白重组生产方面的应用众所周知并且在工业上得到很好的应用。所述大肠杆菌系统总体说来是用于实验室使用的较简单的系统。已经发展出许多新的具有高细胞密度的大肠杆菌系统以提供高产量的蛋白表达。然而，一般地，因为基于大肠杆菌的系统倾向于将蛋白以其不溶性形式分泌入内含体和倾向于不正确的折叠(在半胱氨酸残基间的不正确二硫键)，因此其在使用上存在限制。这些限制经常导致高成本的商品，必需进行昂贵的下游加工步骤将所述蛋白从内含体中分离出来，并重新将不正确折叠的蛋白折叠成其天然状态。
9.27构建蛋白原(BNP原)序列
所述钠尿化合物也可以是在序列上具有两个或更多个钠尿化合物单位的多重肽，并任选地在所述钠尿化合物单位之间包含间隔序列，并且所述构建体也可任选地在钠尿肽化合物的任一端或两端包含前导序列和/或延伸序列。例如，不限制所述多重肽，对任何特定的构建体，所述多重肽可具有以下结构：
NP-[NP]n；
NP-[间隔序列-NP]n；
前导序列-NP-[NP]n；
前导序列-NP-[间隔序列-NP]n；
前导序列-[间隔序列-NP]n；
前导序列-[间隔序列-NP]n-延伸序列；
前导序列-NP-[间隔序列-NP]n-延伸序列；
其中
n可以是，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；NP是钠尿肽或钠尿肽类似物；
间隔序列可以是例如不存在于NP中的酶降解位点(例如，Asp-Asp-Ala-Gly-Glu)；
前导序列可以，例如，是单个氨基酸、氨基酸序列、肽(比如前导肽或信号肽)或蛋白；且可选择前导序列用来封闭N-末端防止其缀合，有助于多重肽的纯化(比如，(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu-可以被酶混合物：V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)和内切蛋白酶(Asp-N)所切割)，提高溶解度和/或有助于从细胞排泄(比如Ala-Asp-Gly-Glu)；且前导序列优选地能通过酶或化学切割从多重肽上切割；
延伸序列可以，例如，是单个氨基酸、氨基酸序列、肽(比如前导肽或信号肽)或蛋白；且可选择延伸序列用来封闭C-末端防止其缀合，有助于多重肽的纯化(比如，(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu)，提高溶解度，和/或有助于从细胞排泄(比如，Ala-Asp-Gly-Glu-可以被酶混合物：V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)和内切蛋白酶(Asp-N)所切割)；且延伸序列优选地能通过酶或化学切割从多重肽上切割。
在另一实施例中，酶降解位点，优选地不存在于NP中的酶降解位点(例如，Glu-Ala-Gly-Glu)。在这个构建体中的前导序列也可以是用于使细胞分泌BNP的信号肽，例如Ala-Asp-Gly-Glu。也可包括可用于所述构建体中的“延伸序列”，所述延伸序列有助于纯化多重肽(例如，(His)6-Ala-Asp-Gly-Glu)。可用于切割所述肽缀合物的酶是V8蛋白酶(内切蛋白酶Glu-C)。所得产物是NP-Glu。
本发明也提供了前-X-多肽(pro-X-polypeptide)，其中X是钠尿肽。所述BNP的前-X-多肽可设计为携带有作为前部分(Promoiety)并且可通过酶切割位点连接到BNP序列的前导肽。用选择的重组技术可设计出编码作为前-BNP肽表达的肽的基因序列。也可选择所述前部分以帮助来自发酵方案的更有效的纯化。前BNP肽可在表达后与所述寡聚物缀合，然后通过选择的流动的或固定的酶切割所述前部分以提供BNP缀合物，所述BNP缀合物可通过常规的层析方法更容易地、高得率地纯化。在前部分和BNP序列之间包含了特异性酶切割位点以使前部分可被酶切割以产生所述BNP序列。
前-BNP模型的合成
所述前BNP构建体将用合成的具有BNP序列和额外的特异性氨基酸的前BNP模型来估计。这个合成的模型将与寡聚物缀合并且用特异性酶切割以监控BNP-寡聚物缀合物的产生。
前BNP的设计
所述前导序列(前部分)可包括具有基于所述合成的模型的特异性酶切割序列的小肽。其它功能性氨基酸序列也可插入到前导序列/间隔序列中以允许容易地纯化所述前BNP蛋白。所述前导序列也可作为所述前部分以保护N末端在缀合期间免受不想要的修饰，并且可通过特异性酶处理进行切割。在前导肽序列中也可包括其它性质以允许容易地作为前BNP或前BNP寡聚物缀合物进行分离。所述前导肽也可附着到所述BNP序列的C末端。所述前导肽也可设计为使得已知的融合蛋白能够附着。
构建前BNP和重组体发育的表达系统
前BNP的表达
在用于插入到选择的重组技术的表达基因序列或表达盒中的BNP的N末端或/和C末端提供功能性特异性前导序列。也可将已知的融合蛋白(Gaken等人，2000)的表达序列插入到存在于其中一个构建体的所述表达基因中。使用已确立的方法，可以监控细胞中成功转化所表达的基因。所述阳性转基因分离物或细胞也可被分离出来并且培养，用以估量设计的蛋白的表达。可纯化表达的蛋白并进行测序。然后可以估计所述纯化的前BNP构建体。可表征选择的细胞系并且选择出来用于将来的选择应用。
9.28前多重肽的生产
构建具有胰蛋白酶和羧肽酶-B切割间隔序列和用His标记的前导肽的前五肽BNP-1。
根据下式前导序列-NP-[间隔序列-NP]n可提供全长前五肽BNP-1的编码序列，其中：
间隔序列是Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-Pro-Arg，
前导序列是Glu-Gly-Asp-Arg-Arg，
延伸序列是(His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg；
NP是hBNP。
在这个实施方案中，使用胰蛋白酶和羧肽酶B混合物可释放所述NP。
(a)质粒构建体
使用标准分子生物学技术，构建表达前五肽BNP-1[(His)6-Glu-Gly-Asp-Arg-Arg.)-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP-Arg-Arg-Asp-Ala-Glu-Asp-BNP]氨基酸序列的质粒。质粒对于所使用的宿主细胞(如大肠杆菌)是密码子最优化的。
编码该多重肽序列的DNA片段是通过合成装配的，从前导序列之后开始，并且将切割位点按在所述His标志的3’/BNP序列的5’的顺序添加。用标准技术从聚丙烯酰胺凝胶纯化该序列的cDNA。通过限制性内切酶分析确定所述质粒结构。
(b)表达和细胞回收
用充足的营养培养所述表达前五肽BNP-1的大肠杆菌细胞，以产生所述前多重肽。通过破裂细胞接着离心、切向过滤(tangentialfiltration)/超滤、匀浆和溶解内含体以从细胞中回收所述(His)6标志前五肽BNP。
(c)通过亲和层析从溶解的内含体中分离所述前五肽BNP-1。
制备HiTrp螯合(chelating)(Ni2+)HP柱(AmershamBioscience)，并且用10倍柱体积的蒸馏水洗涤所述柱以除去贮存溶液，用金属离子溶液(NiSO4，0.1M)给柱带上电荷，并用蒸馏水洗涤除去未结合的金属离子。将内含体溶解后过滤的溶液加在这个柱子上并用10倍柱体积的biding缓冲液(20mM磷酸缓冲液，pH7.4，含0.5M氯化钠和20mM咪唑)洗涤，使用线性梯度10倍柱体积的洗脱缓冲液(20mM磷酸缓钠，pH7.4，含0.5M氯化钠和0.5M咪唑)洗脱柱子接着用另外2倍体积的100％的洗脱缓冲液洗脱柱子。这个方法通过与柱的Ni2+亲和力螯合作用从来自细胞回收样品的其它成分中纯化(His)6标志五肽。通过RP-HPLC方法分析，所述五肽的纯度＞30％。
(d)纯化和分析：
然后进一步通过用C-18制备型HPLC纯化所述五肽，以达到纯度＞75％。纯化的五肽通过ES/MS分析进行分析且提供了前五肽BNP-1预期分子量的M+1离子峰。所述材料的微量测序用于确认所述多重肽的氨基酸序列。
9.29从前五肽BNP-1中生产多个单位的Lys-3BNP缀合物
(a)五肽的缀合物
将前五肽BNP-1(3.20×10-4mmol)溶解在5mL DMSO中。向所述溶液中加入45μl三乙胺。在加入活化的PEG7-己基寡聚物(19.6×10-4mmol)的乙醇溶液之前允许搅拌所述溶液5分钟。在所述反应已进行到HPLC分析表明所述前多重肽已经消耗时(或前多重肽的浓度不再降低)，通过加入0.5mL 50％的含水乙酸溶液终止所述反应。然后将反应混合物进行加工，并交换为100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)。预期这个混合物的主要组成部分是在各BNP单位的Lys3缀合的多重肽。
(b)酶混合物将寡聚物缀合的前五肽BNP-1切割成缀合的BNP单位
通过HPLC分析来自实施例2(a)中所述产物混合物的Tris-盐酸溶液的等分试样以确定此处所述多肽的浓度。在100mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.6)中制备胰蛋白酶(TPCK处理的；来自牛胰腺)溶液。在100mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.6)中制备羧肽酶B(来自猪胰腺)溶液。
然后将所述粗制混合物(1mol当量)与胰蛋白酶(1.39×10-3mol当量)和羧肽酶B(4.56×10-4mol当量)反应。30分钟后，通过加入1％三氟乙酸的乙腈溶液终止反应。加工反应的产物混合物并通过HPLC进行分析。用保留时间(对比参考标准的时间)和质谱分析确定同一性。所述反应的预期产物是Lys3己基-PEG7-缀合的BNP，Lys14己基-PEG7-寡聚物-缀合的BNP，Lys27己基-PEG7-寡聚物-缀合的BNP，二己基-PEG7-寡聚物缀合的BNP，Des Arg-His BNP和Des Arg-His己基-PEG7-寡聚物-缀合的(Lys3或Lys14或Lys27)BNP。该混合物的主要成分是Lys3-己基-PEG7-缀合的BNP。
9.30从粗制缀合混合物中纯化前五肽BNP-1缀合物
使用反相HPLC分离从实施例2(b)描述的所述缀合反应中获得的各主要产物。用商业购得的C18固定相装填柱子(1.0cm内径×25cm长度)，已知所述C18固定相用来分离多肽和蛋白，然后整合入HPLC系统中。用包含75％流动相A(含0.1％三氟乙酸的水)和25％流动相B(含0.1％三氟乙酸的乙腈)的洗脱缓冲液平衡所述系统。将来自实施例21(a)中所述产物混合物的Tris-盐酸溶液加在柱上，并使用梯度洗脱液将主要产物分离和洗脱出来，在所述梯度洗脱液中乙腈成分的百分比在120分钟内从25％增加到55％。收集级分并通过HPLC进行分析以确定此处所述产物的同一性和纯度。将各产物的共同级分汇集在一起，并通过旋转蒸发去除溶剂。通过HPLC和质谱法确定各产物峰的同一性和纯度。所述预期的产物由3个多重肽的单缀合物(在各BNP单位的Lys3或Lys14或Lys27上缀合)、3个多重肽的双缀合物(在Lys3 & Lys14或Lys14 & Lys27或Lys27 & Lys3上缀合)、1个多重肽的三缀合物(在Lys3、Lys14和Lys27上缀合)和1个多重肽的四缀合物(在前导肽的N末端、Lys3、Lys14和Lys27上缀合)组成。
9.31从酶混合物切割的前五肽BNP-1的分离缀合物中制备Lys3-己基-PEG7-寡聚物缀合的BNP
将用实施例3中描述的方法获得的所述缀合物，即单缀合的Lys3-己基-PEG7-寡聚物前五肽BNP-1，溶解在100mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.6)中，并用HPLC分析所得溶液以确定此处多肽的浓度。在100mMTris-盐酸缓冲液(pH7.6)中制备胰蛋白酶(TPCK处理的；来自牛胰腺)溶液。在100mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.6)中制备羧肽酶B(来自猪胰腺)溶液。然后使所述粗制混合物(1mol当量)与胰蛋白酶(1.39×10-3mol当量)和羧肽酶B(4.56×10-4mol当量)反应。30分钟后，通过加入1％三氟乙酸的乙腈溶液终止反应。加工产物并用HPLC进行分析。用保留时间(对比参考标准的时间)和质谱分析确定同一性。所述反应的预期产物分别是使用的各缀合物。例如，单缀合的Lys3-己基-PEG7-寡聚物缀合的前五肽BNP-1用以提供Lys3-己基-PEG7-寡聚物缀合的BNP-1和Des Arg-His Lys3-己基-PEG7-寡聚物缀合的BNP。
参考书目
以下参考文献在此处全文引入作为参考：
American Heart Association(2001). 2002 Heart and Sttroke Statistical Update，Dallas，TX，American Heart Association.
Anderson，W.R.，N.Ekwuribe，A.Ansari，T.M.Harris and D.Surguladze(1999).″Structure activity relationship assessment of conjugatedenkephalins in centrally mediated analgesia.″ Soc.for Neuroscience.
Abstracts 25((1))：180.
Association，A.H.(2001). 2002 Heart and stroke statistical update.Dallas，TX，American Heart Association.
Chin，M.H.and L.Goldman (1997).″Correlates of early hospital readmissionor death in oatients with congestive heart failure.″ Am J Cardiol79(12)：1640-4.
Ekwuribe，N.Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions，deliveryand diagnostic formulations comprising the same，and method ofmaking and using the same.US5681811.
Ekwuribe，N.，M.Ramaswamy，H.S.Allaudeen and J.S.Rajagopalan(1999).
″Oral insulin delivery：hydrolysable amphiphilic oligomer conjugatesprolong glucose reduction.″ Proceed.Intl.Symp.Control Release Bioactive Materials，Abstracts：240.
Gaken et.al.，(2000) Gene Therany，7：1979-1985.
Hussar，D.A.(2002).″New drugs of 2001.″ J Am Pharm Assoc(Wash)42(2)：227-63；quiz 263-6.
Kawai，K.，K.Hata，H.Takaoka，H.Kawai and M.Yokoyama(2001).
″Plasma brain natriuretic peptide as a novel therapeutic indicator inidiopathic dilated eardiomyopathy during beta-blocker therapy：apotential of hormone-guided treatment.″ Am Heart J 141(6)：925-32.Kayser，S.R.(2002).″The use of nesiritide in the management of acutedecompensated heart failure.″ Prog Cardiovasc Nurs 17(2)：89-95.
Krishnan，B.R.，M.Ramaswamy，J.S.Rajagopalan，W.R.Anderson，H.S.Allaudeen，S.Myung and N.Ekwuribe (1999).″Oral delivery ofcalcitonin by conjugation with amphiphilic oligomers.″ Proceed.Intl.
Symp.Control Release Bioactive Materials.Abstracts：43.
Krumholz，H.M.，Y.T.Chen，Y.Wang，V.Vaccarino，M.J.Radford and R.I.Horwitz(2000).″Predictors of readmission among elderly survivors ofadmission with heart failure.″ Am Heart J 139(1Pt1)：72-7.
Krumholz，H.M.，E.M.Parent，N.Tu，V.Vaccarino，Y.Wang，M.J.Radfordand J.Hennen (1997).″Readmission after hospitalization forcongestive heart failure among Medicare beneficiaries.″ Arch Intern Med 157(1)：99-104.
Maisel，A.S.，P.Krishnaswamy，R.M.Nowak，J.McCord，J.E.Hollander，P.Duc，T.Omland，A.B.Storrow，W.T.Abraham，A.H.Wu，P.Clopton，P.G.Steg，A.Westheim，C.W.Knudsen，A.Perez，R.Kazanegra，H.C.Herrmann and P.A.McCullough (2002).″Rapidmeasurement of B-type natriuretic peptide in the emergency diagnosisof heart failure.″ N Engl J Med 347(3)：161-7.
Massie，B.M.and N.B.Shah (1997).″Evolving trends in the epidemiologicfactors of heart failure：rationale for preventive strategies andcomprehensive disease management.″ Am Heart J 133(6)：703-12.
McDonagh，T.A.，S.D.Robb，D.R.Murdoch，J.J.Morton，I.Ford，C.E.Morrison，H.Tunstall-Pedoe，J.J.McMurray and H.J.Dargie(1998).″Biochemical detection of left-ventricular systolic dysfunction.″ Lancet351(9095)：9-13.
McNairy，M.，N.Gardetto，P.Clopton，A.Garcia，P.Krishnaswamy，R.Kazanegra，M.Ziegler and A.S.Maisel (2002).″Stability of B-typenatriuretic peptide levels during exercise in patients with congestiveheart failure：implications for outpatient monitoring with B-typenatriuretic peptide.″ Am Heart J 143(3)：406-11.
Nagaya，N.，T.Nishikimi，M.Uematsu，T.Satoh，S.Kyotani，F.Sakamaki，M.Kakishita，K.Fukushima，Y.Okano，N.Nakanishi，K.Miyatake and K.Kangawa (2000).″Plasma brain natriuretic peptide as a prognosticindicator in patients with primary pulmonary hypertension.″Circulation 102(8)：865-70.
O′Connell，J.B.and M.R.Bristow (1994).″Economic impact of heart failurein the United States：time for a different approach.″ J Heart Lung Transplant 13(4)：S 107-12.
Packer，M.and H.M.Cohn(1999).″Consensus recommendations for themanagement of chronic heart failure.On behalf of the membership ofthe advisory council to improve outcomes nationwide in heart failure.″Am J Cardiol 83(2A)：1A-38A.
Remingtons，The Science and Practice of Pharmacy (9th Edition，1995)
Richards，A.M.，M.G.Nicholls，T.G.Yandle，C.Frampton，E.A.Espiner，J.G.Turner，R.C.Buttimore，J.G.Lainchbury，J.M.Elliott，H.Ikram，I.G.Crozier and D.W.Smyth(1998).″Plasma N-terminal pro-brainnatriuretic peptide and adrenomedullin：new neurohormonal predictorsof left ventricular function and prognosis after myocardial infarction.″Circulation 97(19)：1921-9.
Stewart，S.，J.E.Marley and J.D.Horowitz(1999).″Effects of amultidisciplinary，home-based intervention on unplanned readmissionsand survival among patients with chronic congestive heart failure：arandomised controlled study.″ Lancet 354(9184)：1077-83.
Sudoh，T.，K.Kangawa，N.Minamino and H.Matsuo(1988).″A newnatriuretic peptide in porcine brain.″ Nature 332(6159)：78-81.
Sudoh，T.，et.al.，(1989)， Biophys.Res.Com.，159(3)：1427-1433.
Sudoh，T.，et.al.，(2002)，U.S.Patent Application U.S.2002/0086843A，EPO542,863B1(1997)
Tsuchihashi，M.，H.Tsutsui，K.Kodama，F.Kasagi，S.Setoguchi，M.Mohr，T.Kubota and A.Takeshita(2001).″Medical and socioenvironmentalpredictors of hospital readmission in patients with congestive heartfailure.″ Am Heart J 142(4)：E7.
Yamamoto，K.，J.C.Burnett，Jr.，M.Jougasaki，R.A.Nishimura，K.R.Bailey，Y.Saito，K.Nakao and M.M.Redfield (1996).″Superiority ofbrain natriuretic peptide as a hormonal marker of ventricular systolicand diastolic dysfunction and ventricular hypertrophy.″ Hypertension28(6)：988-94.
U.S Patent No.5,674,710-Seilhamer et.al.
U.S Patent No 6,034,231-Tanaka，et.al.
U.S Patent No 2003/0069186Al -Bumett，Jr.，et.al.
U.S Patent No.6,492,560B2-Wilbur et.al.
U.S Patent No 6,013,630-Shimkets，et.al.
U.S Patent No.6,586,396-Seilhamer，et.al.
U.S.Patent No.6,525,022-Lowe，et.al.
U.S.Patent No.6,028,055-Lowe，et al.
U.S.Patent No 5,114,923-Seilhamer et.al.
PCTUS0217567

Claims (181)

1.钠尿化合物缀合物，其包括：
(a)生物学活性钠尿化合物，其包括：
(i)钠尿分子NPR-A结合位点；和
(ii)至少一个修饰部分缀合位点；和
(b)至少一个附着到所述修饰部分缀合位点上的修饰部分；
其中所述钠尿化合物缀合物展示出一个或多个优点，所述优点选自相对于对应的非缀合的钠尿化合物增强的对酶降解的抗性、增强的生物利用率和延长的作用持续时间。
2.权利要求1的钠尿化合物缀合物，所述缀合物进一步被定义为相对于所述对应的非缀合的钠尿化合物保持有cGMP刺激活性的治疗性显著百分比。
3.权利要求1的钠尿化合物缀合物，所述缀合物进一步被定义为保持有至少30％的所述对应的非缀合的钠尿化合物的cGMP刺激活性。
4.权利要求1的钠尿化合物缀合物，所述缀合物进一步被定义为保持有至少50％的所述对应的非缀合的钠尿化合物的cGMP刺激活性。
5.权利要求1的钠尿化合物缀合物，所述缀合物进一步被定义为保持有至少70％的所述对应的非缀合的钠尿化合物的cGMP刺激活性。
6.权利要求1的钠尿化合物缀合物，所述缀合物进一步被定义为保持有至少90％的所述对应的非缀合的钠尿化合物的cGMP刺激活性。
7.权利要求1的钠尿化合物缀合物，所述缀合物进一步被定义为比所述对应的非缀合的钠尿化合物的亲水性更高。
8.权利要求1的钠尿化合物缀合物，所述缀合物进一步被定义为比所述对应的非缀合的钠尿化合物的两亲性更高。
9.权利要求1的钠尿化合物缀合物，所述缀合物进一步被定义为比所述对应的非缀合的钠尿化合物的亲脂性更高。
10.权利要求9的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分不由烷基部分组成。
11.权利要求1的钠尿化合物缀合物，所述缀合物进一步被定义为比所述对应的非缀合的钠尿化合物更能抵抗蛋白酶降解。
12.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含序列：
A1PX1MVQGSGCFGRX2MDRISSSSGLGCX3VLR(SEQ ID NO._)
其中A1是钠尿肽天然存在的氨基酸或氨基酸组，
X1、X2和X3独立地选自Lys、Arg和Gly，并且X1、X2和X3中至少有一个是Lys。
13.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包括脑钠尿肽、心房钠尿肽、C型钠尿肽或树眼镜蛇属钠尿肽的肽或生物活性的肽片段。
14.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含：
(a)氨基酸序列
X1-C1FGRX2MDRISSSSGLGC2-X3(SEQ ID NO：)
其中
X1是任选地存在的，并且在存在时是具有1-10个氨基酸的氨基酸序列；
X2是Gly、Arg或Lys；和
X3是任选地存在的，并且在存在时是具有1-10个氨基酸的氨基酸序列；
(b)C1和C2-之间的二硫键，以形成环。
15.权利要求14的钠尿化合物缀合物，其中X1是Arg或Gly。
16.权利要求14的钠尿化合物缀合物，其中X1选自：
(a)Lys；
(b)Gly；
(c)Arg；
(d)SG-(SEQ ID NO._)、GSG-(SEQ ID NO._)、QGSG-(SEQ IDNO._)、VQGSG-(SEQ ID NO._)、MVQGSG-(SEQ ID NO._)、PKMVQGSG-(SEQID NO._)和SPKMVQGSG-(SEQ ID NO._)；
(e)包含有选自Lys到Gly和Lys到Arg的取代的(d)的hBNP片段；
(f)包含有选自Gly到Lys和Arg到Lys的取代的(d)的hBNP片段；
(g)包含有插入的Lys的(d)的hBNP片段；
(h)钠尿肽的N-末端尾部和N-末端尾部的C-末端片段；
(i)包含有选自Lys到Gly和Lys到Arg的取代的(h)的N-末端尾部和C-末端片段；
(j)包含有选自Gly到Lys和Arg到Lys的取代的(h)的N-末端尾部和C-末端片段；
(k)包含有插入的Lys的(h)的N-末端尾部和C-末端片段。
17.权利要求14的钠尿化合物缀合物，其中X3选自：
(a)Lys；
(b)Gly；
(c)Arg；
(d)hBNP片段KV(SEQ ID NO._)、KVL(SEQ ID NO._)、KVLR(SEQID NO._)、KVLRR(SEQ ID NO._)和KVLRRH(SEQ ID NO._)；和
(e)包含有选自Lys到Gly和Lys到Arg的取代的(d)的hBNP片段；
(f)包含有选自Gly到Lys和Arg到Lys的取代的(d)的hBNP片段；
(g)包含有插入的Lys的(d)的hBNP片段；
(h)钠尿肽的C-末端尾部和C-末端尾部的N-末端片段；
(i)包含有选自Lys到Gly和Lys到Arg的取代的(h)的C-末端尾部和C-末端尾部的N-末端片段；
(j)包含有选自Gly到Lys和Arg到Lys的取代的(h)的C-末端尾部和C-末端尾部的N-末端片段；
(k)包含有插入的Lys的(h)的C-末端尾部和C-末端尾部的N-末端片段。
18.权利要求14的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含序列，所述序列选自：
(a)SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVL(SEQ ID NO._)；
(b)SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGC(SEQ ID NO._)；和
(c)包含有选自Lys到Gly和Lys到Arg的取代的(a)或(b)的片段。
19.权利要求14的钠尿化合物缀合物，其中X1包含来自hBNP的N-末端的1-9个氨基酸残基序列。
20.权利要求14的钠尿化合物缀合物，其中X1包含SPX3MVQGSG(SEQ ID NO：)，和其中X2包含修饰部分缀合位点。
21.权利要求14的钠尿化合物缀合物，其中X3包含来自hBNP的C-末端的1-6个氨基酸残基序列。
22.权利要求14的钠尿化合物缀合物，其中X3包含KVLRRH(SEQ.ID.NO：)、KVLRR()、KVLR()、KVL、KV或K。
23.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含天然的hBNP序列(SEQ ID NO._)，所述hBNP序列具有一个或多个选自Lys3Arg、Lys14Arg、Arg30Lys、Lys27Arg和Arg31Lys的突变。
24.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含天然的hBNP序列(SEQ ID NO._)，所述hBNP序列具有一个或多个插入或缺失。
25.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含天然的hBNP氨基酸序列(SEQ ID NO._)和N-末端或C-末端Lys。
26.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其进一步被定义为：
(a)含有包含两个或更多个编码钠尿化合物的氨基酸序列的多重肽；
(b)任选地在各组或相邻的钠尿化合物编码序列之间包含间隔序列；
(c)任选地在所述多重肽的任何一端或两端包含有延伸序列，所述延伸序列包含一个或多个氨基酸。
27.权利要求26的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿肽单位各包含hBNP(SEQ ID NO._)或其生物学活性类似物、片段或片段类似物。
28.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物由天然BNP组成。
29.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物由天然hBNP组成。
30.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物由天然ANP组成。
31.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物由犬的BNP组成。
32.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物由尿舒张肽组成。
33.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物由DNP组成。
34.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含氨基酸序列：
X1MVQGSGCFGRX2MDRISSSSGLGCX3(SEQ ID NO.-)
其中X1、X2和X3各独立地选自：Lys、Gly和Arg，前提是X1、X2和X3中至少有一个是Arg或Gly。
35.权利要求34的钠尿化合物缀合物，其中所述序列包括：
(a)从N末端到X1的选自SPK、PK和K的延伸序列；和/或
(b)从C末端到X3的选自-VLRRH(SEQ ID NO：)、-VLRR(SEQID NO：)、-VLR、-VL和-V的延伸序列。
36.权利要求34的钠尿化合物缀合物，其中X1是Lys，X2是Arg和X3是Arg。
37.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含氨基酸序列：
CFGRX1MDRISSSSGLGCX2(SEQ ID NO.：)
其中X1和/或X2包含与所述修饰部分偶联的修饰部分缀合位点。
38.权利要求37的钠尿化合物缀合物，其中X1包含偶联到所述修饰部分的Lys。
39.权利要求37的钠尿化合物缀合物，其中X2包含偶联到所述修饰部分的Lys。
40.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分缀合位点包含选自天然或非天然的氨基酸侧链、所述钠尿化合物的N-末端和所述钠尿化合物的C-末端的部分。
41.权利要求40的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分缀合位点是Lys侧链。
42.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物缀合物只包含一个修饰部分。
43.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中：
(a)所述钠尿化合物包含Lys3到Cys26的hBNP片段和将所述片段的Cys10偶联到Cys26(SEQ ID NO._)的二硫键；
(b)与所述钠尿化合物在Lys3(SEQ ID NO._)偶联的单一修饰部分。
44.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含Cys10到Cys26的hBNP片段和将Cys10偶联到Cys26的二硫键，其中所述钠尿化合物是包含在所述片段的Lys14上偶联的单一修饰部分的单缀合物。
45.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含Cys10到Lys27的hBNP片段(SEQ ID NO._)，其中所述钠尿化合物是包含在所述片段的Lys27上偶联的单一修饰部分的单缀合物。
46.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含Cys10到His32的hBNP片段和将所述片段的Cys10偶联到Cys26的二硫键，其中所述钠尿化合物是包含在所述片段的Lys27上偶联的单一修饰部分的单缀合物。
47.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物包含Cys10到Cys26的hBNP片段和将Cys10偶联到Cys26的二硫键，其中所述钠尿化合物是包含在所述钠尿化合物的N-末端上偶联的单一修饰部分的单缀合物。
48.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中：
(a)所述钠尿化合物由hBNP氨基酸序列组成；且
(b)所述钠尿化合物缀合物是双缀合物，其包括：
(i)在hBNP氨基酸序列的Lys3上与所述钠尿肽偶联的修饰部分；和
(ii)在hBNP氨基酸序列的Lys14上与所述钠尿肽偶联的修饰部分。
49.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中：
(a)所述钠尿化合物是hBNP；和
(b)所述钠尿化合物是双缀合物，其包含：
(i)在hBNP氨基酸序列的Lys3上与所述钠尿肽偶联的修饰部分；
(ii)在hBNP氨基酸序列的Lys27上与所述钠尿肽偶联的修饰部分。
50.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述钠尿化合物序列包含N-末端尾部，且所述修饰部分与位于N-末端尾部的氨基酸偶联。
51.权利要求50的钠尿化合物缀合物，其中所述N-末端尾部由钠尿肽的N-末端尾部天然序列或钠尿肽的N-末端尾部的C-末端片段组成。
52.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分具有式：
Figure A2003801091790008C1
(式I)
其中：
各C是独立地选择的，并且是具有m个碳原子的烷基部分，并且m是1-20；和
各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
各X是独立地选择的，并且是连接部分。
53.权利要求52的钠尿化合物缀合物，其中m是1-18。
54.权利要求52的钠尿化合物缀合物，其中m是1-16。
55.权利要求52的钠尿化合物缀合物，其中n是2-20。
56.权利要求52的钠尿化合物缀合物，其中n是2-15。
57.权利要求52的钠尿化合物缀合物，其中n是2-10。
58.权利要求52的钠尿化合物缀合物，其中各X独立地选自-C-、-O-、-C(O)-、-NH-、-NHC(O)-和-C(O)NH-。
59.权利要求52的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分使得所述钠尿化合物比对应的非缀合的钠尿化合物的亲脂性更高。
60.权利要求52的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分使得所述钠尿化合物比对应的非缀合的钠尿化合物的亲水性更高。
61.权利要求52的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分使得所述钠尿化合物比对应的非缀合的钠尿化合物的两亲性更高。
62.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分具有式：
(式II)
PAG是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
X是O或N；和
各o是独立地选择的，并且是1-15。
63.权利要求62的钠尿化合物缀合物，其中n是2-20。
64.权利要求62的钠尿化合物缀合物，其中n是2-15。
65.权利要求62的钠尿化合物缀合物，其中n是2-10。
66.权利要求62的钠尿化合物缀合物，其中各o是独立地选择的，并且是1-13。
67.权利要求62的钠尿化合物缀合物，其中各o是独立地选择的，并且是1-9。
68.权利要求62的钠尿化合物缀合物，其中各o是独立地选择的，并且是1-6。
69.权利要求62的钠尿化合物缀合物，其中各X是-O-。
70.权利要求62的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分使得所述钠尿化合物比对应的非缀合的钠尿化合物的亲脂性更高。
71.权利要求62的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分使得所述钠尿化合物比对应的非缀合的钠尿化合物的亲水性更高。
72.权利要求62的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分使得所述钠尿化合物比对应的非缀合的钠尿化合物的两亲性更高。
73.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分具有式：
Figure A2003801091790009C2
(式III)
各C是独立地选择的，并且是具有m个碳原子的烷基部分，并且m是1-20；和
各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
各X是独立地选择的，并且是连接部分；
o是1-15。
74.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中m是1-18。
75.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中m是1-16。
76.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中n是2-20。
77.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中n是2-15。
78.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中n是2-10。
79.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中o是1-13。
80.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中o是1-9。
81.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中o是1-6。
82.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中各X独立地选自-C-、-O-、-C(O)-、-NH-、-NHC(O)-和-C(O)NH-。
83.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分使得所述钠尿化合物比对应的非缀合的钠尿化合物的亲脂性更高。
84.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分使得所述钠尿化合物比对应的非缀合的钠尿化合物的亲水性更高。
85.权利要求73的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分使得所述钠尿化合物比对应的非缀合的钠尿化合物的两亲性更高。
86.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分包括线性的或分支的聚(亚烷基)二醇部分。
87.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分包括与烷基部分偶联的糖部分。
88.权利要求87的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分进一步包括糖部分。
89.权利要求86的钠尿化合物缀合物，其中所述聚(亚烷基)二醇部分包含聚乙二醇部分。
90.权利要求86的钠尿化合物缀合物，其中所述聚(亚烷基)二醇部分具有2-25个聚(亚烷基)二醇亚单位。
91.权利要求86的钠尿化合物缀合物，其中所述聚(亚烷基)二醇部分具有2-20个聚(亚烷基)二醇亚单位。
92.权利要求86的钠尿化合物缀合物，其中所述聚(亚烷基)二醇部分具有2-15个聚(亚烷基)二醇亚单位。
93.权利要求86的钠尿化合物缀合物，其中所述聚(亚烷基)二醇部分具有2-10个聚(亚烷基)二醇亚单位。
94.权利要求86的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分进一步包含线性的或分支的烷基部分。
95.权利要求94的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分进一步包含糖部分。
96.权利要求94的钠尿化合物缀合物，其中所述烷基部分具有1-20个碳原子。
97.权利要求94的钠尿化合物缀合物，其中所述烷基部分具有1-18个碳原子。
98.权利要求94的钠尿化合物缀合物，其中所述烷基部分具有1-16个碳原子。
99.权利要求94的钠尿化合物缀合物，其中所述烷基部分是通过接头从所述聚(亚烷基)二醇部分中分离出来的，所述接头选自-C-、-O-、-C(O)-、-NH-、-NHC(O)-和-C(O)NH-。
100.权利要求94的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分使得所述钠尿化合物比对应的非缀合的钠尿化合物的亲脂性更高。
101.权利要求94的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分包含将所述聚(亚烷基)二醇部分偶联到所述烷基部分上的键，所述键在体内是可水解的。
102.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分包含偶联到所述钠尿化合物上的线性的或分支的聚(亚烷基)二醇部分和在相对于钠尿化合物而言较远的位点偶联到聚(亚烷基)二醇部分的线性的或分支的烷基部分。
103.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分包含偶联到所述钠尿化合物上的线性的或分支的烷基部分和在相对于钠尿化合物而言较远的位点偶联到所述烷基部分的线性的或分支的聚(亚烷基)二醇部分。
104.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分选自表1中的寡聚物部分。
105.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分通过在体内可水解的键偶联到所述钠尿化合物上。
106.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分通过在血流中可水解的键偶联到所述钠尿化合物上。
107.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分通过在体内不能水解的键偶联到所述钠尿化合物上。
108.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分通过在血流中不能水解的键偶联到所述钠尿化合物上。
109.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分通过选自酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺、醚和胺的键偶联到所述钠尿化合物上。
110.权利要求1的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分在体内可水解，从而产生聚乙二醇化的钠尿化合物。
111.权利要求110的钠尿化合物缀合物，其中所述修饰部分在体内可水解，从而产生聚乙二醇化的钠尿化合物，所述钠尿化合物含有一个或多个具有1-6个PEG单位的PEG部分。
112.包含权利要求1的钠尿化合物缀合物的药物制剂。
113.权利要求112的药物制剂，它被配制成用于选自肠、肠胃外、口服、皮下、舌下、口腔、经鼻、静脉内和肌内的送递途径。
114.治疗以过量水平的细胞外流体为特征的状况的方法，所述方法包括给需要治疗的受试者施用药学可接受量的权利要求1的钠尿化合物缀合物。
115.权利要求114的方法，其中所述状况包括充血性心力衰竭。
116.权利要求114的方法，其中所述状况包括慢性充血性心力衰竭。
117.权利要求114的方法，其中所述状况包括急性充血性心力衰竭。
118.权利要求114的方法，其中所述所述钠尿化合物缀合物是自我施用的。
119.权利要求114的方法，其中所述所述钠尿化合物缀合物是口服施用的。
120.权利要求114的方法，其中所述所述钠尿化合物缀合物是通过以下途径施用的，所述施用途径选自肠、肠胃外、口服、皮下、舌下、口腔、经鼻内、静脉内和肌内。
121.权利要求114的方法，其中所述状况是高血压。
122.制备权利要求1的所述钠尿化合物缀合物的方法，所述方法包括：
(a)缀合包含二个或更多个钠尿化合物单位的所述钠尿肽多重肽；
(b)切割所述钠尿肽多重肽以产生钠尿化合物缀合物；
(c)氧化切割的钠尿化合物缀合物，以在所述钠尿化合物缀合物内形成一个或多个二硫键。
123.权利要求122的方法，其中所述钠尿化合物包含Cys10到Cys26的hBNP(SEQ ID NO._)且步骤122(c)在Cys10和Cys26之间产生二硫键。
124.制备权利要求1的所述钠尿化合物缀合物的方法，所述方法包括：
(a)制备包含二个或更多个钠尿化合物单位的多重肽钠尿化合物；
(b)切割所述钠尿肽多重肽以产生钠尿肽化合物；
(c)缀合钠尿化合物以产生钠尿化合物缀合物；
(d)氧化切割的钠尿化合物缀合物，以在所述钠尿化合物缀合物内形成一个或多个二硫键。
125.权利要求124的方法，其中所述钠尿化合物包含Cys10到Cys26的hBNP(SEQ ID NO._)且步骤122(c)在Cys10和Cys26之间产生二硫键。
126.制备权利要求1的所述钠尿化合物缀合物的方法，所述方法包括：
(a)制备包含二个或更多个钠尿化合物单位的所述多重肽钠尿化合物；
(b)切割所述钠尿肽多重肽以产生钠尿化合物；
(c)氧化切割的钠尿化合物，以在所述钠尿化合物内形成一个或多个二硫键；和
(d)缀合所述钠尿化合物。
127.修饰的多钠尿肽原缀合物，其包括：
(a)至少一个具有修饰部分缀合位点和NPA-A结合位点的钠尿肽单位；
(b)至少一个修饰部分，所述修饰部分附着到至少一个所述钠尿肽单位的所述修饰部分缀合位点；
(c)前导序列；和
(d)酶促可切割的间隔序列，所述间隔序列将前导序列偶联到第一个钠尿肽缀合物。
128.包含氨基酸序列的钠尿肽类似物，所述氨基酸序列具有至少一个修饰部分缀合位点、NPR-A结合区域和与天然钠尿肽氨基酸序列相比较时至少一个取代的Lys残基，其中所述取代的Lys残基不是氨基酸修饰部分缀合位点。
129.权利要求128的钠尿肽类似物，其中所述一个或多个取代的Lys残基包括选自：Lys3Gly、Lys3Arg、Lys14Gly、Lys14Arg、Lys27Gly或Lys27Arg的取代。
130.权利要求128的钠尿肽类似物，其包含结构：
SPKMVQGSGCFGRX1MDRISSSSGLGCX2VLRRH(SEQ ID NO：)
其中X1是Lys并且X2是除了Lys以外的氨基酸，或X1是Lys并且X2是除了Lys以外的氨基酸，或X1和X2是除了Lys以外的氨基酸。
131.权利要求130的钠尿肽类似物，其中X1是Lys并且X2是Arg或Gly，或X1是Lys并且X2是Arg或Gly，或X1和X2是独立选择的并且是Arg或Gly。
132.钠尿肽类似物，其包含结构：
CFGRX1MDRISSSSGX2GC(SEQ ID NO：)
其中X1是不包含缀合位点的氨基酸，而X2是包含修饰部分缀合位点的氨基酸。
133.权利要求132的钠尿肽类似物，其中X1是Arg且X2是Lys。
134.钠尿肽类似物，其具有结构：
X1-CFGRX3MDRISSSSGLGC-X2(SEQ ID NO：)
其中X1是具有1-10个氨基酸的氨基酸序列，X2是具有1-10个氨基酸的氨基酸序列，且X3是除了Lys以外的氨基酸。
135.权利要求134的钠尿肽类似物，其中X3是Arg或Lys。
136.权利要求134的钠尿肽类似物，其中X1是SPY1MVQGSG(SEQID NO：)，其中Y1包含修饰部分缀合位点。
137.权利要求134的钠尿肽类似物，其中X1选自：
(a)钠尿肽的N-末端尾部和N-末端尾部的C-末端片段；
(b)包含选自Lys到Gly和Lys到Arg的取代的(a)的N-末端尾部和C-末端片段；
(c)包含选自Gly到Lys和Arg到Lys的取代的(a)的N-末端尾部和C-末端片段；
(d)包含插入的Lys的(a)的N-末端尾部和C-末端片段。
138.权利要求134的钠尿肽类似物，其中X2是Y2VLRRH(SEQ.ID.NO：)，其中Y2是除了Lys以外的氨基酸。
139.权利要求138的钠尿肽类似物，其中Y2是Arg。
140.权利要求134的钠尿肽类似物，其中X2选自：
(a)钠尿肽的C-末端尾部和C-末端尾部的N-末端片段；
(b)包含选自Lys到Gly和Lys到Arg的取代的137(a)的C-末端尾部和C-末端尾部的N-末端片段；
(c)包含选自Gly到Lys和Arg到Lys的取代的137(a)的C-末端尾部和C-末端尾部的N-末端片段；
(d)包含插入的Lys的137(a)的C-末端尾部和C-末端尾部的N-末端片段。
141.钠尿肽类似物，其具有结构：
X1-CFGRX3MDRIGLGC-X2(SEQ ID NO：)
其中X1是1-9个氨基酸的肽，X2是1-6个氨基酸的肽，且X3是除了Lys以外的氨基酸。
142.权利要求140的钠尿肽类似物，其中X3是Arg或Gly。
143.权利要求142的钠尿肽类似物，其中X1是SPY1MVQGSG(SEQID NO：)，其中Y1包含修饰部分缀合位点。
144.权利要求142的钠尿肽类似物，其中X2是Y2VLRRH(SEQ IDNO：)，其中Y2是除了Lys以外的氨基酸。
145.权利要求144的钠尿肽类似物，其中Y2是Arg。
146.权利要求144的钠尿肽类似物，其中X3是Arg，X1是序列SPKMVQGSG(SEQ ID NO：)，且X2是序列RVL。
147.钠尿肽类似物，其具有结构：X1-CFGRX3MDRIX4GLGC-X2，其中
(a)X1是1-10个氨基酸的氨基酸序列；
(b)X2是1-10个氨基酸的氨基酸序列；
(c)X4是1-10个氨基酸的氨基酸序列；和
(d)X3是除了Lys以外的氨基酸。
148.权利要求147的钠尿肽类似物，其中X1和X2都不是钠尿肽的天然序列。
149.权利要求147的钠尿肽，其中X3是Arg或Gly。
150.权利要求147的钠尿肽，其中X1是SPY1MVQGSG(SEQ IDNO：_)，其中Y1包含修饰部分缀合位点。
151.权利要求147的钠尿肽类似物，其中X2是Y2VLRRH(SEQ IDNO：_)，其中Y2是除了Lys以外的氨基酸。
152.权利要求151的钠尿肽类似物，其中Y2是Arg。
153.包含Lys14Arg或Lys14Gly的取代的hBNP类似物。
154.包含Lys27Arg或Lys27Gly的取代的hBNP类似物。
155.包含Lys3Arg或Lys3Gly的取代的hBNP类似物。
156.钠尿化合物缀合物，其包括：
(a)钠尿化合物，其包括：
(i)钠尿分子NPR-A结合位点；和
(ii)至少一个修饰部分缀合位点；和
(b)至少一个附着到所述修饰部分缀合位点的修饰部分；
其中相对于相应的非缀合的钠尿化合物，所述钠尿化合物保持治疗性显著百分比的cGMP刺激活性。
157.钠尿化合物缀合物，其包括：
(a)钠尿化合物，其包括：
(i)钠尿分子NPR-A结合位点；和
(ii)至少一个修饰部分缀合位点；和
(b)至少一个附着到所述修饰部分缀合位点的修饰部分；
其中所述钠尿化合物缀合物保持至少50％的对应的非缀合的钠尿化合物的cGMP刺激活性。
158.钠尿化合物缀合物，其包括：
(a)钠尿化合物，其包括：
(i)钠尿分子NPR-A结合位点；和
(ii)至少一个修饰部分缀合位点；和
(b)至少一个附着到所述修饰部分缀合位点的修饰部分；
其中所述钠尿化合物缀合物比对应的非缀合的钠尿化合物的亲水性更高。
159.钠尿化合物缀合物，其包括：
(a)钠尿化合物，其包括：
(i)钠尿分子NPR-A结合位点；和
(ii)至少一个修饰部分缀合位点；和
(b)至少一个附着到所述修饰部分缀合位点的修饰部分；
其中所述钠尿化合物缀合物比对应的非缀合的钠尿化合物的两亲性更高。
160.钠尿化合物缀合物，其包括：
(a)钠尿化合物，其包括：
(i)钠尿分子NPR-A结合位点；和
(ii)至少一个修饰部分缀合位点；和
(b)至少一个附着到所述修饰部分缀合位点的修饰部分；
其中所述钠尿化合物缀合物比对应的非缀合的钠尿化合物的亲脂性更高，其中至少一个修饰部分不由烷基部分组成。
161.化合物，其具有式：
Figure A2003801091790017C1
(式IV)
其中
各C是独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，并且m是1-20；和
各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
各X是独立地选择的，并且是连接部分。
162.化合物，其具有式：
Figure A2003801091790018C1
(式V)
其中
各C是独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，并且m是1-20；和
各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
各X是独立地选择的，并且是连接部分。
163.化合物，其具有式：
(式VI)
PAG是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
X是O或N；和
各o是独立地选择的，并且是1-15。
164.化合物，其具有式：
Figure A2003801091790018C3
(式VII)
PAG是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
X是O或N；和
各o是独立地选择的，并且是1-15。
165.化合物，其具有式：
Figure A2003801091790019C1
(式VIII)
各C是独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，并且m是1-20；和
各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
各X是独立地选择的并且是连接部分；
o是1-15。
166.化合物，其具有式：
Figure A2003801091790019C2
(式IX)
各C是独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，并且m是1-20；和
各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
各X是独立地选择的，并且是连接部分，
o是1-15。
167.制备化合物的方法，所述化合物具有式：
(式IV)
其中
各C是独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，并且m是1-20；和
各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
各X是独立地选择的，并且是连接部分；
所述方法包括：
(a)使式为：
                   Cm-X(-PAGn-OH
的化合物与式为：
Figure A2003801091790020C1
的化合物反应，其中X2是卤化物，并且其中所述反应在碱和溶剂存在的情况下进行，以产生：
Figure A2003801091790020C2
和
(b)使(a)的所述产物与式为：
                   Cm-X-PAGn-OH的化合物在路易斯酸和溶剂存在的情况下反应，以产生：
168.权利要求167的方法，其中所述碱是NaH并且所述溶剂是四氢呋喃。
169.权利要求167的方法，其中路易斯酸是BF3OEt2。
170.制备化合物的方法，所述化合物具有式：
(式V)
其中
各C是独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，并且m是1-20；和
各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
各X是独立地选择的并且是连接部分；
所述方法包括使权利要求0的产物与对硝基氯甲酸酯或碳酸二琥珀酰亚胺酯反应。
171.制备化合物的方法，所述化合物具有式：
其中
PAG是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
X是O或N；和
各o是独立地选择的，并且是1-15；
所述方法包括：
使式为：
Figure A2003801091790021C3
且其中o如上面所定义的化合物与式为：
                        HO-PAGn-X
且其中X是-NH或-OH的化合物在溶剂中反应，以产生式为
Figure A2003801091790022C1
的化合物。
172.制备化合物的方法，所述化合物具有式：
Figure A2003801091790022C2
(式VII)
其中
PAG是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
X是O或N；和
各o是独立地选择的，并且是1-15；
所述方法包括用活化剂活化权利要求170的产物，所述活化剂选自：碳酸二琥珀酰亚胺酯、对硝基氯甲酸酯、光气和N-羟基琥珀酰亚胺。
173.制备化合物的方法，所述化合物具有式：
Figure A2003801091790022C3
(式VIII)
其中
各C是独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，并且m是1-20；和
各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
各X是独立地选择的，并且是连接部分；
各o是1-15；
所述方法包括：
使权利要求0的所述产物与式为：
Figure A2003801091790023C1
的化合物在溶剂中在存在碱的情况下反应。
174.权利要求173的方法，其中所述碱是K2CO3，并且所述溶剂是含水溶剂和/或有机溶剂。
175.制备化合物的方法，所述化合物具有式：
Figure A2003801091790023C2
(式IX)
其中
各C是独立地选择的，并且是具有m个碳的烷基部分，并且m是1-20；和
各PAG是独立地选择的，并且是具有n个亚单位的聚(亚烷基)二醇部分，并且n是2-25；
各X是独立地选择的，并且是连接部分；
o是1-15；
所述方法包括使根据权利要求1的方法产生的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺反应。
176.钠尿肽类似物，其包含结构：
SPX1MMHX2SGCFGRRLDRIGSLSGLGCNVLRX3Y
其中X1是Lys、Arg或His、X2是Lys、Arg、His，且X3是Arg或His。
177.权利要求176的钠尿肽类似物，所述钠尿肽类似物包含缀合到S残基的修饰部分。
178.钠尿肽类似物，其包含结构：
SPZ1MVQGSG-CFGRZ2MDRISSSSX1X2X3C
其中Z1是Arg或除了Lys之外的氨基酸，且其中Z2是Arg或除了Lys之外的氨基酸，其中X1是Gly、Met、Leu、Phe、Ile或其保守取代，其中X2是Leu、Trp、Tyr、Phe或其保守取代，且其中X3是Gly和Arg或其保守取代。
179.权利要求178的钠尿肽类似物，其中Z1是Lys，且Z2是除Lys以外的氨基酸。
180.钠尿肽类似物，其包含结构：
KCFKGKNDRX1KX2QSGLX3C-NSFKY
其中X1是T、a、R、H、P、T、E；
其中X2是K、N-甲基、Arg、S、D、P；
其中X3是Arg、K、Y、F、S、P、Orn、Har、Har、对脒基苯基Ala、I、除了Gly之外的任何其它具有正电荷的氨基酸或Try。
181.权利要求178或180的钠尿肽，所述钠尿肽进一步被定义为包含钠尿肽缀合物，包含与其中的一个或多个Lys残基缀合的修饰部分。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110278941A (zh) * 2019-07-11 2019-09-27 西安国际医学中心有限公司 一种含有钠尿肽的离体心脏保护液
CN111848776A (zh) * 2020-08-31 2020-10-30 江苏璟泽生物医药有限公司 聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法
CN111978390A (zh) * 2020-08-31 2020-11-24 上海景泽生物技术有限公司 聚乙二醇修饰的rhBNP及其用途
CN114316020A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 南京岚煜生物科技有限公司 一种bnp重组蛋白及其制备方法和应用

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7524635B2 (en) * 2003-04-17 2009-04-28 Biosite Incorporated Methods and compositions for measuring natriuretic peptides and uses thereof
AU2003268531A1 (en) 2002-09-06 2004-03-29 University Of South Florida Materials and methods for treatment of allergic diseases
WO2004022579A2 (en) * 2002-09-06 2004-03-18 University Of South Florida Cellular delivery of natriuretic peptides
US20080214437A1 (en) * 2002-09-06 2008-09-04 Mohapatra Shyam S Methods and compositions for reducing activity of the atrial natriuretic peptide receptor and for treatment of diseases
US7648962B2 (en) 2002-11-26 2010-01-19 Biocon Limited Natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof
CA2504287A1 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Nobex Corporation Natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof
PT1660047E (pt) 2003-08-13 2014-02-27 Biocon Ltd Formulação de dosagem sólida de sais de ácidos gordos em micropartículas para agentes terapêuticos
EP1727556A2 (en) * 2004-02-17 2006-12-06 University Of South Florida Materials and methods for treatment of inflammatory and cell proliferation disorders
DK2348114T3 (en) 2004-04-21 2018-09-03 Alexion Pharma Inc BONE DELIVERY CONJUGATES AND PROCEDURE TO USE IT FOR TARGETING PROTEINS AGAINST BONE
DE602005026014D1 (de) 2004-07-15 2011-03-03 Univ Queensland Proteinartige verbindungen und anwendungen davon
WO2006076471A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
US7300494B2 (en) * 2005-02-24 2007-11-27 Hamilton Sundstrand Corporation On-board inert gas generation system with compressor surge protection
ES2554713T3 (es) 2005-04-07 2015-12-22 Cardiorentis Ag Uso de un péptido natriurético para tratar insuficiencia cardiaca
US7767784B2 (en) 2005-07-29 2010-08-03 Nektar Therapeutics Methods for preparing polymeric reagents and compositions of polymeric reagents
US7803901B2 (en) 2005-09-16 2010-09-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Polypeptides with natriuresis activity
WO2007047834A2 (en) * 2005-10-18 2007-04-26 Biocon Limited Oral peptide conjugates for metabolic diseases
CA2647146A1 (en) 2006-03-30 2007-10-11 Palatin Technologies, Inc. Linear natriuretic peptide constructs
BRPI0709427A2 (pt) 2006-03-30 2011-07-12 Palatin Technologies Inc "construto cìclico, composição farmacêutica e uso de um composto
EP2051585A4 (en) * 2006-04-28 2010-06-02 Univ South Florida MATERIALS AND METHODS OF SUPPRESSING INFLAMMATION THROUGH INHIBITION OF THE VORHOF RECEPTOR FOR NATRIURETIC PEPTIDES
DK2687223T3 (en) 2006-05-30 2017-10-23 Mayo Foundation Detection and treatment of dementia
EP2687223B1 (en) 2006-05-30 2017-07-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting and treating dementia
US8486412B2 (en) 2006-06-01 2013-07-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Immunity to folate receptors
WO2008088582A2 (en) 2006-08-04 2008-07-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials related to trail isoforms
EP2295445A1 (en) 2006-09-08 2011-03-16 Mayo Foundation for Medical Education and Research Aquaretic and natriuretic polypeptides lacking vasodilatory activity
BRPI0811052A2 (pt) 2007-04-12 2015-01-27 Univ Minnesota Composições de proteção de isquemia/reperfusão e métodos de uso.
KR20080098216A (ko) * 2007-05-04 2008-11-07 한미약품 주식회사 캐리어 물질을 이용한 나트륨 배설 펩타이드 약물 결합체
CL2008003476A1 (es) 2007-11-21 2009-08-14 Biomarin Pharm Inc Variante del peptido natriuretico de tipo c (cnp); composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar una displasia del esqueleto o un trastorno de la musculatura lisa vascular.
WO2009156481A1 (en) * 2008-06-25 2009-12-30 Ascendis Pharma As Pegylated bnp
EP2334334A1 (en) 2008-09-19 2011-06-22 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of nesiritide peptides
US20110166063A1 (en) 2008-09-19 2011-07-07 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
CA2758581C (en) 2009-05-20 2022-06-14 Biomarin Pharmaceutical Inc. Variants of c-type natriuretic peptide
US20120108514A1 (en) 2009-07-09 2012-05-03 University Of Iowa Research Foundation Long acting atrial natriuretic peptide (la-anp) and methods for use thereof
CN102470163B (zh) 2009-07-23 2016-06-15 Igisu株式会社 皮肤外用剂组合物
SG10201503080XA (en) 2010-04-27 2015-06-29 Agency Science Tech & Res Eif4e binding peptides
WO2012013597A1 (de) * 2010-07-28 2012-02-02 Justus-Liebig-Universität Giessen Stoffe und deren verwendung zur beeinflussung natriuretischer peptidrezeptoren
US9266939B2 (en) 2010-12-27 2016-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
US20120277155A1 (en) 2011-02-25 2012-11-01 Medtronic, Inc. Therapy for kidney disease and/or heart failure
US20140072557A1 (en) 2011-02-28 2014-03-13 National Cerebral And Cardiovascular Center Medicinal agent for suppressing malignant tumor metastasis
US10184942B2 (en) 2011-03-17 2019-01-22 University Of South Florida Natriuretic peptide receptor as a biomarker for diagnosis and prognosis of cancer
US9233143B2 (en) 2011-08-19 2016-01-12 National Cerebral And Cardiovascular Center Medicinal agent for preventing exacerbation of malignant tumor, comprising combination of natriuretic peptide receptor GC-A and GC-B agonists
CN103906761B (zh) 2011-08-30 2016-12-21 梅约医学教育与研究基金会 利钠多肽
EP2750697A4 (en) 2011-09-02 2015-03-25 Medtronic Inc CHIMERIC NATRIURETIC PEPTIDE COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
KR20140084201A (ko) 2011-10-19 2014-07-04 알렉시온 파마 홀딩 알칼리성 포스파타제 및/또는 나트륨이뇨 펩티드를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법
US9611305B2 (en) 2012-01-06 2017-04-04 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cardiovascular or renal diseases
WO2013138850A1 (en) * 2012-03-19 2013-09-26 Madeleine Pharmaceuticals Ρτy Ltd Method of producing a recombinant peptide
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
TW201442721A (zh) 2013-01-23 2014-11-16 Daiichi Sankyo Co Ltd 糖鏈修飾心房利尿鈉肽
WO2016007873A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating craniosynostosis
WO2016090251A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
CA2973883A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
AU2016272282A1 (en) * 2015-05-29 2018-01-25 Igisu Co., Ltd. Cyclic peptide, and medicine, external preparation and cosmetic each containing said cyclic peptide
RU2745528C2 (ru) 2015-08-17 2021-03-26 Алексион Фармасьютикалз, Инк. Производство щелочных фосфатаз
US11229686B2 (en) 2015-09-28 2022-01-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Reduced frequency dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
WO2017074466A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating craniosynostosis in a patient
CA3007987C (en) * 2016-01-08 2023-08-29 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with low npr-c binding
CA3008017C (en) 2016-01-08 2024-01-02 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with reduced side-effects
SG11201805028RA (en) 2016-01-08 2018-07-30 Ascendis Pharma Growth Disorders As Controlled-release cnp agonists with increased nep stability
CA3007979C (en) 2016-01-08 2023-12-19 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs with carrier attachment at the ring moiety
NZ743488A (en) * 2016-01-08 2023-02-24 Ascendis Pharma Growth Disorders As Controlled-release cnp agonists with low initial npr-b activity
CA3007976C (en) 2016-01-08 2023-09-26 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs with large carrier moieties
EP3426286A4 (en) 2016-03-08 2019-12-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING HYPOPHOSPHATASE IN CHILDREN
CA3019726A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating muscle weakness with alkaline phosphatases
WO2017173395A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults
WO2017214130A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Metal impact on manufacturing of alkaline phosphatases
JP7018933B2 (ja) 2016-08-18 2022-02-14 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 気管気管支軟化症の治療方法
US10307398B2 (en) 2016-09-20 2019-06-04 Regents Of The University Of Minnesota Resuscitation composition and methods of making and using
CA3037448A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Combination therapy with controlled-release cnp agonists
US11072642B2 (en) 2016-11-09 2021-07-27 Mayo Foundation For Medical Education And Research MANP analogues
JP7126270B2 (ja) * 2017-03-22 2022-08-26 ファーマイン コーポレイション Ｎｐｒａアゴニスト、組成物およびその使用
AU2018243320A1 (en) 2017-03-31 2019-10-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia (HPP) in adults and adolescents
CN111432836A (zh) 2017-09-05 2020-07-17 转矩医疗股份有限公司 治疗性蛋白质组合物及其制备和使用方法
KR20210031848A (ko) 2017-09-05 2021-03-23 토크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 가역적 링커 및 이의 용도
EP3770143A4 (en) 2018-03-20 2021-12-22 NOF Corporation BRANCHIFIED SINGLE-DISPERSED POLYETHYLENE GLYCOL, INTERMEDIATE AND ASSOCIATED PRODUCTION PROCESS
US11913039B2 (en) 2018-03-30 2024-02-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method for producing recombinant alkaline phosphatase
KR102022118B1 (ko) * 2019-01-07 2019-09-18 주식회사 아스트로젠 중추신경계 질환의 예방 또는 치료용 세린 유도체 화합물
WO2023039392A1 (en) * 2021-09-07 2023-03-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for determining pgc target dosage

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4044196A (en) * 1972-03-30 1977-08-23 Bayer Aktiengesellschaft Crosslinked copolymers of α,β-olefinically unsaturated dicarboxylic anhydrides
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
EP0083367A1 (en) * 1981-07-02 1983-07-13 WALTON, Alan G. Glycosaminoglycan drug complexes
EP0092918B1 (en) 1982-04-22 1988-10-19 Imperial Chemical Industries Plc Continuous release formulations
US4569794A (en) * 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
US5037741A (en) * 1986-08-18 1991-08-06 The Coca Cola Company Enzymatic method for the synthesis and separation of peptides
JP2544929B2 (ja) * 1987-06-17 1996-10-16 第一化学薬品 株式会社 新規生理活性ペプチド
US5114923A (en) 1988-05-31 1992-05-19 California Biotechnology Inc. Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides
CA1339210C (en) * 1988-05-31 1997-08-05 John Lewicki Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides
JP2539665B2 (ja) * 1988-06-20 1996-10-02 日本臓器製薬株式会社 神経疾患治療剤
JP2561513B2 (ja) 1988-07-04 1996-12-11 塩野義製薬株式会社 γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体
JPH0720857B2 (ja) 1988-08-11 1995-03-08 テルモ株式会社 リポソームおよびその製法
IT1229514B (it) 1989-01-30 1991-09-03 Farmhispania S A A Montme Glicoconiugati anfifilici sintetici per impiego neurologico.
US20020086843A1 (en) 1989-03-01 2002-07-04 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Physiologically active polypeptide and DNA
DK0385476T4 (da) 1989-03-01 1999-12-20 Shionogi & Co Fysiologisk aktivt polypeptid og DNA
US5342940A (en) * 1989-05-27 1994-08-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same
JP3394040B2 (ja) 1989-06-23 2003-04-07 ジェネンテック・インコーポレーテッド ナトリウム排泄増加性蛋白質受容体ｂの組成物および合成法および使用法
US5108568A (en) * 1989-07-07 1992-04-28 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Controlled method of reducing electrophoretic mobility of macromolecules, particles or cells
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
SE8904407L (sv) 1989-12-29 1991-06-30 Qingpingfeng Medikament foer behandling av hjaertsvikt
IE912365A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
US5202239A (en) 1990-08-07 1993-04-13 Scios Nova Inc. Expression of recombinant polypeptides with improved purification
JP3026354B2 (ja) 1990-09-27 2000-03-27 壽之 松尾 ヒトｃｎｐ遺伝子及び前駆体蛋白
US5853746A (en) 1991-01-31 1998-12-29 Robert Francis Shaw Methods and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage or bone using functional barrier
ATE253639T1 (de) 1991-08-19 2003-11-15 Daiichi Suntory Pharma Co Ltd Verfahren zur herstellung von peptiden
JP2665850B2 (ja) * 1991-11-14 1997-10-22 塩野義製薬株式会社 ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体
GB9211686D0 (en) 1992-06-03 1992-07-15 Medisinsk Innovation A S Chemical compounds
WO1995028952A1 (de) 1992-12-09 1995-11-02 Haemopep Pharma Gmbh Verwendung der brain natriuretic peptide (bnp), phosphoryliertes urodilatin, phosphoryliertes cdd/anp sowie deren kombinationen
US6191105B1 (en) * 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5512459A (en) * 1993-07-20 1996-04-30 Bionebraska, Inc. Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides
WO1995006467A1 (en) 1993-08-28 1995-03-09 The University Of Sheffield Treatment of laminitis
US6525022B1 (en) 1993-11-12 2003-02-25 Genentech, Inc. Receptor specific atrial natriuretic peptides
US6037145A (en) 1994-09-07 2000-03-14 Suntory Limited Process for production of protein
EP0721105B1 (en) * 1994-12-09 1999-05-12 Shionogi & Co., Ltd. Sandwich immunoassay for N-peptide
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
EP0856026A1 (en) 1995-10-19 1998-08-05 Receptagen Corporation Discrete-length polyethylene glycols
PT914344E (pt) * 1996-03-04 2005-10-31 Scios Inc Ensaio e reagentes para a quantificacao de hbnp
ATE493141T1 (de) 1996-03-22 2011-01-15 Stryker Corp Verfahren zur verbesserten funktionellen erholung der motorischen koordiination, der sprache oder der sinneswahrnehmung nach trauma oder ischämie des zns
AU4816497A (en) 1996-10-22 1998-05-15 Genentech Inc. Receptor specific brain natriuretic peptide (bnp)
US6028055A (en) 1996-10-22 2000-02-22 Genetech, Inc. Receptor selective BNP
WO1998045329A1 (en) 1997-04-04 1998-10-15 Novo Nordisk A/S Natriuretic peptide derivatives
GB9716790D0 (en) 1997-08-07 1997-10-15 Creative Peptides Sweden Ab Recombinant DNA molecules comprising multimeric copies of a gene sequence and expression thereof
US20040005669A1 (en) * 1997-08-07 2004-01-08 Stefan Stahl Recombinant expression of insulin C-peptide
US6013630A (en) 1997-08-21 2000-01-11 Curagen Corporation Atrial natriuretic factor mutants and ischemic stroke
DE69830668T3 (de) 1997-10-24 2011-07-14 Shionogi & Co., Ltd. Verfahren zur inhibierung des abbaus von natriuretischen peptiden und verbesserte methode zum bestimmen der natriuretischen peptide
US6495514B1 (en) * 1998-01-21 2002-12-17 Mercer University Method for reducing inflammation and inducing an analgesic effect and compounds thereof
JP4394279B2 (ja) * 1998-03-09 2010-01-06 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ 酵素加水分解に対する傾向が減少した薬理学的に活性なペプチド複合体
US6117644A (en) * 1998-06-04 2000-09-12 Ottawa Heart Institute Research Corporation Predicting and detecting cardiac allograft rejection
US6703381B1 (en) * 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
SE9802946D0 (sv) 1998-09-02 1998-09-02 Europrofil Ab Förfarande och listarrangemang för att täcka skarvar eller skapa övergångar i samband med ytbeläggningar
JP3799465B2 (ja) * 1998-09-28 2006-07-19 参天製薬株式会社 ナトリウム利尿ペプチドを有効成分とする涙液分泌促進または角結膜障害治療用点眼剤
ES2180511T3 (es) 1999-01-26 2003-02-16 Lilly Co Eli Formulaciones monodispersas de analogos de insulina acilados hexamericos.
EP1623994A3 (en) * 1999-05-17 2008-07-16 ConjuChem Biotechnologies Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
AU5043900A (en) 1999-05-24 2000-12-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Adenovirus vectors encoding brain natriuretic peptide
US6309633B1 (en) * 1999-06-19 2001-10-30 Nobex Corporation Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same
KR100345214B1 (ko) * 1999-08-17 2002-07-25 이강춘 생체적합성 고분자가 수식된 펩타이드의 비점막 전달
US6610043B1 (en) * 1999-08-23 2003-08-26 Bistech, Inc. Tissue volume reduction
US6713454B1 (en) * 1999-09-13 2004-03-30 Nobex Corporation Prodrugs of etoposide and etoposide analogs
US6541508B2 (en) * 1999-09-13 2003-04-01 Nobex Corporation Taxane prodrugs
US7127290B2 (en) 1999-10-01 2006-10-24 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac rhythm management systems and methods predicting congestive heart failure status
US6638906B1 (en) * 1999-12-13 2003-10-28 Nobex Corporation Amphiphilic polymers and polypeptide conjugates comprising same
US6407211B1 (en) 1999-12-17 2002-06-18 Mayo Foundation For Medical Education And Research Chimeric natriuretic peptides
JP4237375B2 (ja) * 2000-03-31 2009-03-11 アスビオファーマ株式会社 虚血性疾患の処置又は予防に用いる医薬組成物
EP1642885B1 (en) * 2000-08-29 2009-11-11 Biocon Limited Use of a pharmaceutical composition containing a para-aminophenyl acetic acid derivative for treating inflammatory conditions of the gastrointestinal tract
US7060675B2 (en) * 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US6867183B2 (en) * 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US20030219734A1 (en) * 2001-04-13 2003-11-27 Biosite Incorporated Polypeptides related to natriuretic peptides and methods of their identification and use
US7632647B2 (en) 2001-04-13 2009-12-15 Biosite Incorporated Use of B-type natriuretic peptide as a prognostic indicator in acute coronary syndromes
FR2823993B1 (fr) * 2001-04-27 2003-06-20 Rhodia Chimie Sa Dispersion colloidale aqueuse stable, son procede de preparation
ATE458199T1 (de) * 2001-05-04 2010-03-15 Biosite Inc Diagnostische marker der akuten koronaren syndrome und ihre verwendungen
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US6828297B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) * 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) * 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6737913B2 (en) * 2001-06-15 2004-05-18 Silicon Laboratories, Inc. Differential mode circuitry and method of calibrating same without matched external current sources
US7030082B2 (en) * 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
US7312192B2 (en) * 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6913903B2 (en) * 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7196059B2 (en) * 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
DK1430082T3 (da) 2001-09-07 2010-01-18 Biocon Ltd Fremgangsmåde til syntese af insulinpolypeptid-oligomer-konjugater og proinsulinpolypeptid-oligomerkonjugater samt fremgangsmåde til syntese deraf
WO2003081246A1 (en) * 2002-03-18 2003-10-02 Scios Inc. Treatment of congestive heart failure with natriuretic peptide and a diuretic
AU2003246500A1 (en) 2002-07-31 2004-02-16 Conjuchem Biotechnologies Inc. Long lasting natriuretic peptide derivatives
US20040152769A1 (en) 2002-11-09 2004-08-05 Ekwuribe Nnochiri Nkem Modified carbamate-containing prodrugs and methods of synthesizing same
CA2504287A1 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Nobex Corporation Natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof
US20060198819A1 (en) * 2003-08-08 2006-09-07 Novo Nordisk Healthcare A/G Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110278941A (zh) * 2019-07-11 2019-09-27 西安国际医学中心有限公司 一种含有钠尿肽的离体心脏保护液
CN111848776A (zh) * 2020-08-31 2020-10-30 江苏璟泽生物医药有限公司 聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法
CN111978390A (zh) * 2020-08-31 2020-11-24 上海景泽生物技术有限公司 聚乙二醇修饰的rhBNP及其用途
CN111978390B (zh) * 2020-08-31 2022-10-14 上海景泽生物技术有限公司 聚乙二醇修饰的rhBNP及其用途
CN114316020A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 南京岚煜生物科技有限公司 一种bnp重组蛋白及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2010201455A1 (en) 2010-05-06
EP1569683A2 (en) 2005-09-07
PL377813A1 (pl) 2006-02-20
WO2004047871A2 (en) 2004-06-10
CA2504287A1 (en) 2004-06-10
AU2003297583A1 (en) 2004-06-18
SG159387A1 (en) 2010-03-30
HK1087327A1 (en) 2006-10-13
BR0316560A (pt) 2005-10-04
US7662773B2 (en) 2010-02-16
EP1569683B1 (en) 2010-03-03
AU2003297583B2 (en) 2010-01-14
CN100558398C (zh) 2009-11-11
ATE459370T1 (de) 2010-03-15
WO2004047871A3 (en) 2005-03-17
US20040203081A1 (en) 2004-10-14
JP2006515579A (ja) 2006-06-01
DE60331584D1 (de) 2010-04-15

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